JP2006512043A - マウスの脱ユビキチン化プロテアーゼ遺伝子のヒト類似体 - Google Patents
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Abstract
Description
パク質は同定されていない。いくつかのユビキチンが介在するプロセスにおける機能障害は、悪性の形質転換などの病的状態を引き起こす。
体の標的化を引き起こす。また、Chen等は、IBキナーゼの活性化は、迅速な、誘導性のユビキチン化現象を必要とすることを実証している。このユビキチン化現象は、IBの特異的リン酸化に必須であり、その後のキナーゼ複合体のタンパク質分解を起こさない。Ste2およびIBキナーゼのユビキチン化は可逆的であり、恐らく特異的な脱ユビキチン化酵素の作用により生じるものと考えられる。
mDUB1、−2、−2Aのヒト類似体を同定するために、mDUB1(U41636)、mDUB2(NM_010089)、およびmDUB2A(AF3 93637)DNA配列を用いて、Ensembl blastサーチエンジン(http://www.ensembl.org/perl/blastview)を利用した、Ensemblの全長「ゴールデンパス(golden path)」(コンティグとして)に対して検索した。3種のmDUBは全て、第8染色体上に、2000を上回る高いスコア、e−87未満のプロバビリティで、コンティグAC083981、AF252831、AF228730、AF252830、AC068974を含む重要なアライメントを有する。ゲノム中の全ての相同遺伝子を探し当てるために、「ゴールデンパス」コンティグに対して検索するためにゲノムのアラインされた配列を用いてエグゾースト検索を行った。e−100未満のプロバビリティを有する重要なアライメントを有するコンティグがさらに2つ検索された:1つは第8染色体上のAC074340、もう1つは第4染色体上のAC022770である。
(hDUB4.1およびhDUB4.2)は、複数のエキソンを有するORFであり、このORFは最小限の配列同一性を有するポリペプチドのN末端部分が伸長している。しかしながら、5つの遺伝子全てで保存された最後のエキソンの近位に位置するイントロン領域中に、2,000超の塩基を含む保存された予測されるプロモーター配列が存在する。これらのORFのうち3つ(hDUB4.5、4.8、および8.2)は、ミトコンドリアを標的化する配列に典型的なN−末端インサートを有する。hDUB遺伝子は、ヒト染色体のマッピングされていない部分であるヒト染色体4P16にクラスターをなしている。
プライマーとしてランダムヘキサマーを用いたトータル細胞RNAからの逆転写(RT)プロトコール(TaqMan逆転写試薬(カタログ番号N808−0234)を使用)
トータルRNA1μgを、1×TaqManRT緩衝液ミックス100μl(5.5mMのMgCl2、0.5mMのdNTP、2.5μMのランダムヘキサマー、40Uのリボヌクレアーゼインヒビター、125UのMultiscribe逆転写酵素)中に調製。上下にピペッティングすることにより混合する。25℃で10分間(アニーリング工程)、48℃で30分間(逆転写)、および95℃で5分間(酵素の加熱不活性化)インキュベートする。サンプルを機械装置に4℃で放置してもよいし、その代わりに、−20℃で保存してもよい。少量の放射性dATP(またはdCTP)を取り込ませることによりcDNA合成の収率を測定することができる。このプロトコールにおけるRNAからcDNAへの変換の平均効率は、60〜80%である。
TaqManRT産物1μlを、1×マスターミックス12.5μl(アプライドバイオシステムズ,カタログ番号4304437(プライマーとプローブ以外の全ての必要な反応成分を含む)、0.9μMのフォワードプライマー、0.9μMのリバースプライマー、0.2μMのプローブ)に調製。上下にピペッティングすることにより混合する。コントロールとしてGADPHプライマー対とプローブを含むサンプルも調製した。サーマルサイクリングとリアルタイム増幅の検出をABI PRISM7900HT配列検出システムを用いて行った。PCRの対数期中に測定されたCt値に基づき、GADPHコントロールに対する相対値として標的遺伝子の量を得た。
プライマー4.1は、hDUB4.1に特異的であり、
プライマー4.2は、hDUB4.2、4.3、4.5および8.1をカバーし、
プライマー8.3は、hDUB 8.3および8.11をカバーし、
プライマー8.5は、hDUB 8.5に特異的であり、
プライマー8.6は、hDUB 8.6、8.7および8.8をカバーする。
以下のプライマーセットを用いて、1つのエキソンを含むhDUB4および8の530個アミノ酸オープンリーディングフレーム部分をヒトゲノムDNAからクローニングした:
N末端プライマー:5’−atggaggacgactcactct−3’(19mer)、
C末端プライマー:5’−ctggcacacaagcaga−3’(19mer)。
DUBが脱ユビキチン化酵素であるという確認は、これまでに同定されたユビキチン−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の脱ユビキチン化分析を用いて示すことができ、この分析は以前に文献で説明されている。簡単に言えば、野生型DUBのcDNA(アミノ酸1〜約500に相当する)とを含むcDNAに基づく、約1,500個のヌクレオチドのDUB断片をPCRにより生産し、これを、pGEX(ファルマシア)のグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)コーディング要素の下流にフレームを合わせて挿入する。pACYC184を基礎とするプラスミドからUb−Met−galを発現させる。プラスミドをMC1061Escherichia coliに指示通りに共形質転換させる。プラスミドを含むE.coli MC1061細胞を溶菌させ、ウサギ 抗gal抗血清(Cappel)、ウサギ抗GST抗血清(Santa Cruz)、およびECLシステム(アマシャム社)を用いて免疫ブロット法で分析する。インビトロでの脱ユビキチン化酵素の活性は、基質として市販のポリユビキチン化タンパク質を用いて精製hDUB融合タンパク質により示すことができる。
mDUB−1は、初めはIL−3誘導性の前初期遺伝子としてクローニングされた。同様に、mDUB−2は、IL−2誘導性の前初期遺伝子としてクローニングされた。我々は、様々なTaqMan分析により、ヒト臓器のRNAサンプルと、ヒト免疫細胞のRNAサンプルを用いて、これらの遺伝子の誘導性と細胞型特異的な発現を試験した。我々のデータによれば、hDUB発現は、リンパ球および顆粒球では観察されなかったが、数人のドナーから得られた新鮮なヒトPBMCではよく観察されることが示される。これは、発現が単球/マクロファージ(恐らくはNK細胞も)に限定されている可能性を強く示す。hDUB4およびhDUB8は、様々な炎症性のサイトカイン(例えばTNF−α、IL−1βなど)をアップレギュレートすることがわかっている刺激物質(LPSおよび/またはPHA)で刺激されたPBMCにおいてアップレギュレートされる。この発現の増加は、刺激後20〜24時間でほぼ完全にみられなくなり、すなわちこれは初期の遺伝子であることを示す。刺激後1.5時間で弱い発現のアップレギュレートしかみられないということは、刺激それ自体はhDUB4およびhDUB8をアップレギュレートしないが、刺激後2時間以内にアップレギュレートされるサイトカインは、hDUB4およびhDUB8のアップレギュレートに関与する可能性があることを示す。
これらのデータから、我々は、hDUB4とhDUB8は、mDUBサブファミリー(mDUB1、mDUB2、およびmDUB2Aを含む)に最も高い類似性を示す、DUBサブファミリーという脱ユビキチン化酵素の別個のサブファミリーのメンバーであることを提唱する。DUBサブファミリーメンバーは、その他のubpとは区別される別個の構造的特徴を有する。第一に、DUBサブファミリーメンバーは、約500〜550個のアミノ酸からなる比較的小さい酵素である。第二に、DUBサブファミリーメンバーは、CysドメインおよびHisドメインだけでなく、それらの一次アミノ酸配列にわたってアミノ酸の類似性を有する。例えば、DUBタンパク質は、リシンが豊富な領域(Lysドメイン)と、それらのカルボキシル末端の近辺にHVドメインを含む。
1. Baek, K. H., Mondoux, M. A., Jaster, R., Fire-Levin, E., and D'Andrea, A. D. (2001). DUB-2A, a new member of the DUB subfamily of hematopoietic deubiquitinating enzymes, Blood 98, 636-42.
2. Jaster, R., Baek, K. H., and D'Andrea, A. D. (1999). Analysis of cis-acting
sequences and trans-acting factors regulating the interleukin-3 response element of the DUB-1 gene, Biochim Biophys Acta 1446, 308-16.
3. Jaster, R., Zhu, Y., Pless, M., Bhattacharya, S., Mathey-Prevot, B., and D'Andrea, A. D. (1997). JAK2 is required for induction of the murine DUB-1 gene, Mol Cell Biol 17, 3364-72.
4. Migone, T. S., Humbert, M., Rascle, A., Sanden, D., D'Andrea, A., Johnston,
J. A., Baek, K. H., Mondoux, M. A., Jaster, R., Fire-Levin, E., ら (2001). The deubiquitinating enzyme DUB-2 prolongs cytokine-induced signal transducers and activators of transcription activation and suppresses apoptosis following cytokine withdrawal, Blood 98, 1935-41.
5. Zhu, Y., Carroll, M., Papa, F. R., Hochstrasser, M., and D'Andrea, A. D. (1996a). DUB-1, a deubiquitinating enzyme with growth-suppressing activity, Proc Natl Acad Sci U S A 93, 3275-9.
6. Zhu, Y., Lambert, K., Corless, C., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A., and D'Andrea, A. D. (1997). DUB-2 is a member of a novel family of cytokine-inducible deubiquitinating enzymes, J Biol Chem 272, 51-7.
7. Zhu, Y., Pless, M., Inhorn, R., Mathey-Prevot, B., and D'Andrea, A. D. (1996b). The murine DUB-1 gene is specifically induced by the betac subunit of interleukin-3 receptor, Mol Cell Biol 16, 4808-17.
Claims (11)
- hDUB4.1a、hDUB4.1b、hDUB4.2a、hDUB4.2b、hDUB4.3、hDUB4.4、hDUB4.5、hDUB4.6、hDUB4.7、hDUB4.8、hDUB4.9、hDUB4.10、hDUB4.11、hDUB8.1、hDUB8.2、hDUB8.3、hDUB8.5、hDUB8.6、hDUB8.7、hDUB8.8、hDUB8.9、hDUB8.10、および、hDUB8.11からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- hDUB4.1a、hDUB4.1b、hDUB4.2a、hDUB4.2b、hDUB4.3、hDUB4.4、hDUB4.5、hDUB4.6、hDUB4.7、hDUB4.8、hDUB4.9、hDUB4.10、hDUB4.11、hDUB8.1、hDUB8.2、hDUB8.3、hDUB8.5、hDUB8.6、hDUB8.7、hDUB8.8、hDUB8.9、hDUB8.10、および、hDUB8.11からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼであるポリペプチド。
- ポリヌクレオチドを、請求項1に記載のhDUBの阻害剤を同定するための分析に用いる、請求項1に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- ポリペプチドを、請求項2に記載のhDUBの阻害剤を同定するための分析に用いる、請求項2に記載のポリペプチドの使用方法。
- 請求項2に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して、炎症性サイトカインシグナル伝達を調節することにより炎症を減少させる方法。
- 請求項2に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して、リンパ球の増殖に関与するサイトカイン受容体シグナル伝達を変化させることにより自己免疫疾患を調節する方法。
- 請求項2に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して感染の際の免疫反応を調節する方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して炎症性サイトカインシグナル伝達を調節することにより炎症を減少させる方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して、リンパ球の増殖に関与するサイトカイン受容体シグナル伝達を変化させることにより自己免疫疾患を調節する方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して感染の際の免疫反応を調節する方法。
- レポーター遺伝子に操作可能に結合した、hDUB 4.1a、hDUB4.1b、hDUB4.2a、hDUB4.2b、hDUB4.3、hDUB4.4、hDUB4.5、hDUB4.6、hDUB4.7、hDUB4.8、hDUB4.9、hDUB4.10、hDUB4.11、hDUB8.1、hDUB8.2、hDUB8.3、hDUB8.5、hDUB8.6、hDUB8.7、hDUB8.8、hDUB8.9、hDUB8.10、および、hDUB8.11からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼの5’側に隣接するポリヌクレオチドを含むレポーター分析において、化合物を加え、ついでその化合物の効果を測定する、ヒト脱ユビキチン化プロテアーゼの調節因子を同定する方法。
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