JP2006510344A - 甲状腺の腫瘍及び新生物の新規な核酸配列及びタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
・翻訳産物と化合物を調製する段階と、
・翻訳産物の作用を体現する系において、翻訳産物と化合物とを接触させる段階と、
・化合物の影響下において翻訳産物の作用に何らかの変化が生じたか否かを決定する段階とを含むプロセスにより解決する。
・転写産物と化合物を調製する段階と、
・転写産物の作用を体現する系において、転写産物と化合物とを接触させる段階と、
・化合物の影響下において転写産物の作用に何らかの変化が生じたか否かを決定する段階とを含むプロセスにより解決する。
・過形成及び腫瘍の染色体転座部におけるブレークポイントを決定する段階と、
・ブレークポイント領域の両側の約400kbp、好ましくは約320kbp、好ましくは約150kbpの領域内にある遺伝子を決定する段階と、
・過形成細胞又は腫瘍細胞におけるこの遺伝子の翻訳/転写が、過形成でない細胞又は腫瘍でない細胞と比べて変化しているか否かを決定する段階と
を含むプロセスにより解決する。
甲状腺材料を、それぞれ本発明に係る核酸、ベクター、ポリペプチド、抗体、リボザイム及び細胞からなる群から選択される剤に接触させる段階と、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍が存在するか否かを決定する段階と
を含むプロセスにより解決する。
該プロセスが次の各段階、
・PCRを実施するための本発明のプライマーを調製する段階と、
・ヒト染色体2のバンド2p21−22から採取した核酸配列、又は本発明の核酸の内の一核酸を調製する段階と、
・核酸配列又は核酸をプライマーと混合する段階と、
・PCRを実施する段階と
を含むプロセスにより解決する。
それぞれ先の請求項の一項に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞、抗体、アンチセンス核酸、RNAi、プライマー及び/又は核酸プローブ、及び/又はリボザイム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一種の剤と、医薬的に許容される少なくとも一種の担体とを含む医薬組成物により解決する。
・候補化合物を調製する段階と、
・発現系及び/又は活性系を調製する段階と、
・候補化合物を発現系及び/又は活性系と接触させる段階と、
・候補化合物の影響下において、配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸又はこれらの誘導体、及び/又はこれらにコードされるポリペプチド、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従った配列を有するポリペプチド又はこれらの誘導体の発現及び/又は活性が変化しているか否かを決定する段階と
を含むプロセスにより解決する。
DRIP遺伝子のゲノム構成
DRIP遺伝子のゲノムサイズ
DRIP遺伝子の大きさは365186bpであり、全体を配列番号12に示す。表2に、エクソン及びイントロンのサイズと、特定のクローンに対するそれらの相対位置とを示す。
DRIP遺伝子はスプライス変異体を有する。最大の転写産物は6090bpである。本明細書に記載の配列には、可能性の或るCDが全て含まれている。エクソンのサイズは表2に示す。
2種のDRIP転写産物が存在する。配列番号11は、エクソン1〜エクソン38のcDNA転写産物を示す。配列番号16は、エクソン1〜26及びエクソン29〜38のDRIPcDNA転写産物のスプライス変異体を示す。図13は、DRIPmRNA構造の概略図である。
DRIP遺伝子は普遍的に発現する。発現に関するデータは、NCBIのUnigeneデータバンクにおいてクラスター番号Hs16063ホモサピエンスとして記載されている。この結果、例えば、Sageノーザン解析において腫瘍細胞株MCF7(乳腫細胞株)に強い発現が生じる。図11に示すノーザンブロットから明らかなように、膵臓及び精巣において発現が増強している。
DRIP遺伝子のオープンリーディングフレーム
DRIP遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)を図13に示すが、これは配列番号11及び配列番号16の中に見出される。このORFの開始位置及び終了位置は両配列番号についての記載において確認される。
実施例1においてより詳細に述べるが、甲状腺細胞株S325t/sv40には、染色体3(3pから3テロメア)の小さな断片を有する融合染色体der(2)が存在する。この融合染色体からDRIP融合タンパク質が生じるが、これを本明細書ではDRIPFUS1と表す。DRIP−FUS Iとそのスプライス変位体のmRNAの概略図を図14に示す。このmRNAを配列番号1、配列番号13、配列番号14に示し、このアミノ酸配列を配列番号6、配列番号7、配列番号2に示す。
配列番号1 DRIP−FUS Ibスプライス変異体mRNAのmRNA
配列番号2 DRIP−FUS Ibスプライス変異体、コード配列(CDS)、ひいては第1の融合タンパク質のアミノ酸配列、ここでそのDRIP部分はエクソン1〜28を含む
配列番号3 FUS I要素が染色体3上に置かれているゲノム配列範囲
配列番号4 FUS II要素が染色体7上に置かれているゲノム配列範囲
配列番号5 DRIPのコード配列(CDS)、ひいてはアミノ酸配列、DRIPはエクソン1〜38を含む
配列番号6 コード配列(CDS)、ひいては第1の融合タンパク質FUS Iのアミノ酸配列、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む
配列番号7 コード配列(CDS)、ひいては第1の融合タンパク質(FUSIa)のスプライス変異体のアミノ酸配列、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む
配列番号8 コード配列(CDS)、ひいては第2の融合タンパク質(FUS II)のアミノ酸配列、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む
配列番号9 甲状腺腫瘍からのDRIP−FUS IIa融合遺伝子のスプライス変異体mRNA
配列番号10 DRIP−FUS IIaタンパク質のスプライス変異体のアミノ酸配列、配列番号1〜2及び6〜10で表されるDRIPに関しては、DRIP部分はエクソン1〜28を含み、配列番号5のDRIP部分はエクソン1〜38を含む。
配列番号11 エクソン1〜38を含むDRIP−mRNA配列をここに示す
配列番号12 エクソン1〜38を含むDRIPのゲノム配列
配列番号13 DRIP−FUS I遺伝子のmRNA配列、この配列はDRIP遺伝子のエクソン1〜28、また同様に染色体3p25範囲由来のFUS IのエクソンI、Ia、及びIIを含む
配列番号14 DRIP−FUSI遺伝子のスプライス変異体のmRNA配列、この配列はDRIP遺伝子のエクソン1〜28、また同様に染色体3p25範囲由来のFUS IのエクソンIIを含む
配列番号15 DRIP−FUSII遺伝子のFUSI遺伝子mRNA配列、この配列はDRIP遺伝子のエクソン1〜28と染色体7p 15範囲由来のFUS IIのエクソンAとを含む
配列番号16 DRIPスプライス変異体のFUSI遺伝子mRNA配列、この配列はDRIP遺伝子のエクソン1〜26、29〜38を含む
配列番号17 FUSI遺伝子DRIPスプライス変異体のFUSI遺伝子コード配列(CDS)、従ってFUSI遺伝子アミノ酸配列、DRIPはエクソン1〜26、29〜38を含む
配列番号1は融合遺伝子DRIP−FUS Ib(スプライス変異体)を表す;t(2;20;3)(p21;ql 1.2;p25)を有する細胞系S325T/SV40において検出。
配列番号3は染色体3p25のゲノム配列を表すが、これは配列番号13と14による核酸内のDRIP配列に隣接して含まれている。この場合、ゲノム配列は染色体3p25のエクソンI及びエクソンIIの両者を含み、エクソンIは配列番号3の81174番目〜81291番目のヌクレオチド位置までを占め、エクソンIIは配列番号3の85616番目〜85873番目のヌクレオチド位置を占める。ゲノム構造はBACクローンRP11−167M22から選ばれた。
配列番号4は、第2融合遺伝子の一部である染色体7p15のFUS IIエクソンAとA1のゲノム配列範囲を表す。ゲノム配列はBACクローンRP111−370L16から得られた。エクソンAは配列番号4によるゲノム配列の7686番目〜8949番目の位置に対応する。
配列番号5はDRIPのコード配列(CDS)、ひいては対応するペプチドを表し、DRIPはエクソン1〜38を含む。この配列は合計で1953個のアミノ酸を含む。
配列番号6はコード配列(cds)、ひいては第1の融合タンパク質DRIP−FUS Iのアミノ酸配列を表し、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む。この配列は合計で1387個のアミノ酸を含む。
配列番号7はコード配列(CDS)、ひいては第1の融合タンパク質のスプライス変異体のアミノ酸配列を表し、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む。この配列は合計で1353個のアミノ酸を含む。
配列番号8はコード配列(CDS)、ひいては第2の融合タンパク質のアミノ酸配列を表し、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む。この配列は合計で1353個のアミノ酸を含む。
配列番号9は融合遺伝子DRIP−FUS IIa(スプライス変異体)を表す;t(2;7)(p21;pl5)を有する細胞系S533T/SV40において検出。配列の長さは5580bpである。
配列番号10はコード配列(CDS)、ひいては第2の融合タンパク質DRIP−FUSIIaのスプライス変異体のアミノ酸配列を表し、そのDRIP部分はエクソン1〜28を含む。この配列は合計で1366個のアミノ酸を含む。
配列番号11はエクソン1〜38を含むDRIPのmRNAを表す。mRNAの長さは6090bpである。オープンin−frame(ORF)は133番目から始まり5994番目の位置で終了する。mRNAの異なる場所でハイブリダイズする次のプライマーをmRNAの検出に用いることができる。
DRIPVRU1 5'ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3'
DRIPVRL2 5'TCAACATGCCGCTTCTGTTCTTGGAAGAGTTAA 3'
DRIPVRU3 5'TTTCCGGCAAAACCACATTCATGGGACACT 3'
DRIPVRL4 5'TACTGGGGCAGGCCTGGCACCTTGAAG 3'
DRIPVRU5 5'TGGCCGTCGTTGAAGTCCTCACCAGT 3'
DRIPVRL6 5'GCCAGCCGGACTTTGAGAGGAGACAGAAG 3'
DRIPVRU9 5'GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3'
DRIPVRL10 5'ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3'
DRIPVRL10 5'ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3'
DRIPVU11 5'CCTGCCCCAGTACCTCCAGAGCCTCAC 3'
DRIPVL12 5'GAACTCCTTTGGGGTCAGATGGACACAGTG 3'
DRIPVU13 5'ACTGCATGGACCCTGGTGAGTGGCT 3'
DRIPVL14 5'GCATGTGGTGGGAAATGACTTTGGAAG 3'
DRIPVU15 5'CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3'
DRIPVU16 5'AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3'
DRIPVRU17 5'GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3'
DRIPVU18 5'GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3'
DRIPVU19 5'AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3'
DRIPL20 5'CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3'
DRIPVL21 5'GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3'
DRIPVU22 5'GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3'
DRIPVU23 5'ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3'
DRIPVL24 5'AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3'
DRIPVU25 5'CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3'
DRIPVL26 5'ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3'
DRIPVU27 5'GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3'
DRIPVL28 5'ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3'
FOSTSWI14187 5'ATTTATGTTCAACATGTTTCCTGC 3'
RVSTSWI14187 5'TGCAGAATCGAGGCAGTTAA 3'
配列番号12は染色体2p21−22上のDRIP遺伝子のゲノム配列を表す。
DRIPVRU1 5'ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3'
DRIPVRL2 5'TCAACATGCCGCTTCTGTTCTTGGAAGAGTTAA 3'
DRIPVRU3 5'TTTCCGGCAAAACCACATTCATGGGACACT 3'
DRIPVRL4 5'TACTGGGGCAGGCCTGGCACCTTGAAG 3'
DRIPVRU5 5'TGGCCGTCGTTGAAGTCCTCACCAGT 3'
DRIPVRL6 5'GCCAGCCGGACTTTGAGAGGAGACAGAAG 3'
DRIPVRU7 5'CTGGCAAATTCCATGGTTCTGTCTTGAAGTGA 3'
DRIPVRL8 5'CAATGGAACCAGAACATGAAGCCAAGCAGTCT 3'
DRIPVRU9 5'GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3'
DRIPVRL10 5'ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3'
DRIPVU11 5'CCTGCCCCAGTACCTCCAGAGCCTCAC 3'
DRIPVL12 5'GAACTCCTTTGGGGTCAGATGGACACAGTG 3'
DRIPVU13 5'ACTGCATGGACCCTGGTGAGTGGCT 3'
DRIPVL14 5'GCATGTGGTGGGAAATGACTTTGGAAG 3'
DRIPVU15 5'CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3'
DRIPVU16 5'AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3'
DRIPVRU17 5'GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3'
DRIPVU18 5'GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3'
DRIPVU19 5'AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3'
DRIPL20 5'CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3'
DRIPVL21 5'GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3'
DRIPVU22 5'GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3'
DRIPVU23 5'ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3'
DRIPVL24 5'AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3'
DRIPVU25 5'CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3'
DRIPVL26 5'ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3'
DRIPVU27 5'GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3'
DRIPVL28 5'ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3'
DRIPVU29 5'TAGCATCCTGGACTAATTCAGCCATACAAG 3'
DRIPVU30 5'GACGGTGGAGCAGGTAAAAGAAATAGG 3'
DRIPVL31 5'GCAGCTGGGGAGTGTGGACAAC 3'
DRTPVU32 5'TAATTCATCAGCATTGCCAAGTAAGGATAG 3'
DRIPVL33 5'GGACATCAAA.AGGAGCTTCTCTACCAC 3'
DRIPVU34 5'AGTGGAGAGCGGGAGACGAATG 3'
DRIPVL35 5'AAGAATAGGATGGGGGTTGGTGAG 3'
DRIPVU36 5'AGCCTAACGGACAGCCTGAATGGGA 3'
FOSTSWI14187 5'ATTTATGTTCAACATGTTTCCTGC 3'
RVSTSWI14187 5'TGCAGAATCGAGGCAGTTAA 3'
配列番号13はDRIP−FUS I遺伝子のmRNA配列を含み、DRIP−FUS I遺伝子はDRIP遺伝子のエクソン1〜28と染色体3p25のエクソンI、Ia、及びIIを含む。
DRIPVRU1 5'ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3'
DRIPVRU9 5'GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3'
DRIPVRL10 5'ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3'
DRIPVU15 5'CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3'
DRIPVU16 5'AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3'
DRIPVRU17 5'GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3'
DRIPVU18 5'GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3'
DRIPVU19 5'AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3'
DRIPL20 5'CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3'
DRIPVL21 5'GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3'
DRIPVU22 5'GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3'
DRIPVU23 5'ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3'
DRIPVL24 5'AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3'
DRIPVU25 5'CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3'
DRIPVL26 5'ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3'
DRIPVU27 5'GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3'
DRIPVL28 5'ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3'
FUSVL01 5'TGCTTTGGGAGCCAGGTCACTGAGTTACTAC
FUSVL02 5'ACTGCTTTGGGAGCCAGGTCACTGAGT
FUSVL03 5'TCCAGGGAAATTCACTGCTTTGGGAGCCA
配列番号14はDRIP−FUSI遺伝子のスプライス変異体のmRNA配列を示し、t(2;20;3)(p21;qll.2;p25)を有する細胞系S325T/SV40において検出された。この配列は、染色体3p25のmRNA配列の4191番目〜4448番目の位置と共にDRIP遺伝子のエクソン1〜28とエクソンIIとを含む。このスプライス変異体は、配列番号13に関して記載したものと同一の細胞系から得られた。この場合、mRNAの長さは4448塩基である。配列番号13及び14による部分の核酸のゲノム配列は、DRIPによって各融合遺伝子に与えられたものであり、配列番号12に対して開示された範囲に対応する。
配列番号15は第2の融合遺伝子(本明細書においてはDRIP−FUS IIとも表示される)のmRNA配列を示し、まずDRIP遺伝子エクソン1〜28を含み、次いで#7pl5のエクソンAを含む。mRNAの長さは5454塩基であり、最初の4190塩基はDRIPのmRNAの最初の塩基に対応し、塩基4191〜5454は#7pl5のエクソンAに対応する。配列番号13に関して記載されたように、対応するプライマーはDRIP遺伝子のエクソン1〜28の検出のために好適である。次のプライマーを、次の配列番号16のヌクレオチド位置において#7p15に属する配列部分の検出のために用いることができる。
FUSIIL01 5'GGTAGCGGGAGCAATCACAAAACTGTAA
FUSIIL02 5'CTCTTCTTTTGATAGGACAGCCCTTGTTCTGA
FUSIIL03 5'GACCGCTTCTTGCAGAGGCTGAGAGTC
配列番号16はDRIPスプライス変異体のmRNA配列を示す。オープンin−frame(ORF)は133番目の位置から開始され、5772番目の位置で終了する。
2p21−異常を伴う甲状腺腺腫の分子遺伝学的検討
染色体領域2p21に関連した構造的異常は、良性甲状腺腫瘍の場合、細胞遺伝学的サブグループの特徴を示す。このブレ−クポイントを特定するために、2p21転座を有する良性甲状腺腫瘍から2種の細胞系を樹立した。FISHによる検討のため、これらの細胞系及び別の原発性腫瘍に対して18種のBACクローンを加えた。ブレ−クポイントは全て、約450kbの領域内にあることがわかった。
手術後、腫瘍組織片を2%抗生物質(200IU/mLペニシリン、200μg/mLストレプトマイシン)を含む滅菌Hank’s溶液中に固定せずに置いた。この腫瘍組織を機械的に細分化し、3〜4時間0.35%コラゲナーゼ(ゼルバ(Serva)、ドイツ国ハイデルベルグ)に組織を曝露して処理し、細胞を培養した。細胞を酵素溶液に添加し、この細胞浮遊液を遠心分離し、この細胞ペレットを20%ウシ胎仔血清及び2%抗生物質(20%ウシ胎仔血清及び2%抗生物質を含むアール塩を含むTC199、200IU/mLペニシリン、200μg/mLストレプトマイシン)を含む培地で培養した。「甲状腺の多形成腺腫」(pleomorphic adenoma of the thyroid gland)(ブラーディック(Bullerdiek)ら、1987)に記載の一方法により染色体調製を行った。核型はISCN(1995)に基づき記載した。
まず、樹立した細胞系両方を蛍光in situハイブリダイゼーションにより検討した。FISHの分析には、染色体バンド2p21にある18種のBACクローンを用いた。各BACについて、10種のGTG結合メタフェーズを分析した。両細胞系のブレークポイント領域をBACクローン339H12と1069E24間で狭めた後、これら細胞系の内の一の原発性腫瘍及び別の原発性腫瘍を試験した。FISHの分析結果から、実験した細胞系及び原発性腫瘍のブレークポイントはBACクローン339H12と1069E24の間にあることが分かる。
これまでの文献には、450の甲状腺過形成及び腺腫の細胞遺伝学的検討が報告されている。これら病変の約20%が染色体変化を示しており、これらは種々のサブグループに分けられる。19q13の変化は、構造的な染色体異常を伴う最大のサブグループを構成する(ベルグ(Belge)ら、1998)。染色体2のクローン性の異常も同様に頻繁に発見された。
Antonini P, Levy N, Caillou B, Venuat AM, Schlumberger M, Parmentier C, Bernheim A:「唯一の異常としての22トリソミーを含む数的異常は濾胞性甲状腺腺腫において繰り返す」(Numerical aberrations, including trisomy 22 as the sole anomaly, are recurrent in follicular thyroid adenomas.)Genes Chromosome Cancer 8:63-66 (1993)。
Belge G, Bruckmann S, Thode B, Bartnitzke S, Bullerdiek J:「第2染色体の短腕の欠損は良性甲状腺腫瘍の新しい細胞遺伝学的サブグループを特徴付ける。」(Deletions of the short arm of chromosome 2 characterize a new cytogenetic subgroup of benign thyroid tumors.)Genes Chromosome Cancer 16:149-151 (1996)。
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Knauff J A, Elisei R, Mochly-Rosen D, Liron T, Chen X N, Gonsky R, Korenberg J R, Fagin J A:「甲状腺細胞死におけるプロテインキナーゼCe(PKCe)の関与。甲状腺癌細胞系からクローニングされた切断型キメラPKCeは甲状腺細胞をアポトーシスから保護する。」(Involvement of protein kinase Ce(PKCe) in thyroid cell death. A truncated chimeric PKCe cloned from a thyroid cancer cell line protects thyroid cells from apoptosis.)J Biol Chem 274:23414-23425 (1999)。
Sozzi G, Miozzo T, Cariani TC, Bongarzone I, Pilotti S, Pierotti MA, Della Porta G:「濾胞性甲状腺腺腫におけるt(2;3)(q12−13;p24−25)」(A t (2; 3)(q12-13; p24-25) in follicular thyroid adenomas.)Cancer Genet. Cytogenet 64:38-41 (1992)。
Teyssier JR, Liautaud-Roger F, Ferre D, Patey M, Dufer J:「甲状腺腫瘍における染色体変化。DNA量、核型特徴及び臨床データとの関係」(Chromosomal changes in thyroid tumors. Relation with DNA content, karyotypic features, and clinical data.)Cancer Genet. Cytogenet 50:249-263 (1990)。
Wanschura S, Hennig Y, Deichert U, Schoenmakers EFPM, Van de Ven WJM, Bartnitzke S, Bullerdiek J:「子宮平滑筋腫に冒された12q14→q15ブレークポイント領域の分子細胞遺伝学的精密化」(Molecular-cytogenetic refinement of the 12ql4(R)q15 breakpoint region affected in uterine leiomyomas.)Cytogenet Cell Genst 71:131-135 (1995)。
各種原発性甲状腺腫瘍及び各種細胞系におけるDRIP及びDRIPをコードする核酸の検出
本実施例においては、次に説明するプライマーやRNA単離に関するプロセスを用いて、各種原発性甲状腺腫瘍及び各種細胞系におけるmRNAの発現をPCRにより確認し、これにより、データバンク配列の比較により見出されたイントロン/エクソンの境界を調べた。得られた配列の配列決定を行うことにより、驚くべきことに、各種融合遺伝子やそのスプライス変異体が見出された。これにより、対応する染色体転座の存在が判明した。
鋳型/マトリクス: cDNA(2μL)又はゲノムDNA(1μL)又はBAC−DNA(1ng)
10×PCRバッファー(−Mg)(ギブコBRL/インビトロジェン社(Invitrogen)):2μL
プライマー(up/low):1μL(液量10μmol)
dNTP’s:1μL
MgC12+(ギブコBRL/インビトロジェン社):0.6μL
taqポリメラーゼ(5U/μL)(ギブコBRL/インビトロジェン社):0.25μL
二回蒸留水:12.15μL添加(cDNAの場合)又は13.15μL添加(ゲノムDNAの場合)
サイクル:35回
MCF−7(ヒト乳腺癌)
No:DSM ACC 115
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)[ドイツ微生物培養細胞保存有限会社(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)]
HELA(ヒト子宮頚癌)
No:DSM ACC 57
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)
WRO
BAC 339H12
BAC 204D19
トリゾール処理(フード!;閉塞したピペット先端!)
I.細胞溶解
細胞培養瓶(Impfbank)から完全に培地を吸引する;フードをエタノール(70%)でを拭き取る;1.5mLの容器を準備する(滅菌容器、オートクレーブではない);細胞培養瓶に直接トリゾールを1mL添加する;上下にピペッティング操作を行い、細胞を浮遊させる;細胞浮遊液をピペットにて容器に移す;−80℃で細胞を保存する;使用済ピペットチップはオートクレーブ廃棄に処す;細胞培養瓶をフード下で風乾させる。
水浴を30℃に予熱する;遠心分離機を4℃に冷却する;細胞浮遊液を溶解し(次いで)室温で5分間インキュベートする;1mLのトリゾールに対しクロロホルムを200μL添加する;浮遊液を強く振とうする;水浴中30℃で2〜3分間インキュベートする;12000×g、4℃で15分間遠心する。
上層(RNA!)を滅菌した新しい1.5mL容器にピペットで移す;イソ−アミルアルコール(イソプロパノール)を500μL添加する;注意深く撹拌する;30℃の水浴で10分間インキュベートする;12000×g、4℃で10分間遠心する;次いで直ちにピペットで上清を取り除く;フェノールを廃棄する(!)
ペレットにエタノール(75%)を1mL添加し、簡単にボルテックスにかける;7500×g、4℃で5分間遠心する;次いで直ちピペットでに上清を取り除く;フェノールを廃棄する(!);フード下でペレットを室温で10分以上風乾する;水浴を55℃(又は60℃)にセットする。
ペレットのサイズによって、滅菌dH20(滅菌)を30〜50μL添加する;55℃、10分間水浴でインキュベーションする;次いで直ちにサンプルを氷上に置く;−80℃で保存する(又は濃度を測定する)。
プラスチックキュベットに滅菌dH20(60μL)を添加する;ブランク値を測定する;RNAを1μL加え混合する;濃度を測定する(260/280nm+quotient);RNAを−80℃で保存する。
FISHの実施方法については、キービッツら等により記載されている(キービッツT(Kievits T)、ドウワースJ.G.(Dauwerse J.G.)、ヴィガンJ.(Wiegant J.)、デウィリーP.(Devilee P.)、ブラウニングM.H.(Breuning M.H.)、コルネリゼC.J.(Cornelisse C.J.)、ファン・オメンG.J.B.(van Ommen G.J.B.)、ピアソンP.L.(Pearson P.L.):「非放射性in situハイブリダイゼーションによるコスミドの迅速なサブ染色体位置特定(Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization.)」Cytogenet Cell Genet.53:134−136(1990))。
鋳型名:APプライマー(ポリT+UAP−2部分配列)を用いた逆転写酵素反応後S533T/SV40細胞系の細胞の全RNAを精製して得られるcDNA
鋳型の説明:EIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCRから)
産物の長さ:201bp
DRIP−FUS1遺伝子検出のためのS325/TSV40の3’−RACE−RT−PCR条件
鋳型の説明:S325T/SV40(cDNA)
上流プライマー及び下流プライマーのタイプ並びに反応調製物は、S533/TSV40の3’−RACE−RT−PCRと同じ
鋳型の説明:EIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCRから)
産物の長さ: 201bp
(RACE−PCR DRIP−FUS1及びDRIP−FUS2)
I.
2×SSC内で5分間
脱プリン化(depurining)緩衝液で2×10分間
変性緩衝液で2×15分間
中和緩衝液で3×10分間
20×SSCで5分間
真空ポンプを少なくともブロッティング15分前に起動(暖気運転)
ワットマンフィルターとHybond−Nメンブレン(アマシャムファルマシアバイオテック社(Amersham Pharmacia Biotech))とを切り取る(ゲルより幾分大きく)
ブロッティング装置を組み立てる(モデル785真空ブロッター;バイオラッド社(Biorad))
真空を引く(5インチ/mmHg)
ゲルが吸引されたら直ちに、20×SSCをゆっくりと注ぐ
(ゲルのサイズ/密度により)1〜2時間ブロッティングする
10分毎にゲルを20×SSCで覆う
ブロット後:メンブレン上のゲルのポケットに鉛筆で印を付ける
メンブレン上にDNAを固定:Fluo−Link(バイオメトラ社(Biometra))でUVクロスリンク(設定0.4=40秒)
水浴中60℃で発現ハイブリダイジング溶液(クロンテック社(Clontech))を予熱
ハイブリダイジングオーブンを60℃に予熱
ガーゼ上にメンブレンを載せ、底部から巻き上げ、ハイブリダイジングボトル内に置く
5mLのExp−Hyb−溶液を添加
ハイブリダイジングオーブン内で60℃、30分間*プレハイブリダイズ
20分後*にプローブを変性:95℃、10分間(PCRブロック(バイオメトラ社)中)、終了後直ちにプローブを氷上に置く!
ザルスタット(Sarstedt)チューブにピペッティング:Exp−Hyb溶液5mL+プローブ2μL(80ng/μL)をボルテックスに付す
Exp−Hyb溶液+プローブをハイブリダイジングボトル中のメンブレンに置く
ハイブリダイジングオーブン内60℃で一夜ハイブリダイズする
調製:1)0.1×SSC/0.1%SDSをハイブリダイジングオーブンで60℃に予熱、2)緩衝液1 90mL+10%ブロッキング試薬10mLを混合して緩衝液1/1%ブロッキング試薬を作成、ザルスタットチューブ(ポイント27用)に10mLをピペッティング
2×SSC/0.1%SDSに室温で2×15分間
0.1×SSC/0.1%SDS(予熱済)で2×15分間
緩衝液1/0.3%Tween−20で5分間
緩衝液1/1%ブロッキング試薬で30分間
10mLの緩衝液1/1%ブロッキング試薬+1μLの抗dig−AP、FABフラグメント(150U/200μL;エンゾ(Enzo))で30分間
緩衝液1/0.3%Tween−20で2×15分間
緩衝液3で5分間
次の各成分を一緒に1.5mL容器にピペッティング
ミドルメンブレン:緩衝液3 1.5mL+CPD−Star 15μL(25mM;セルマークダイアグノースティクス社(Cellmark Diagnostics))
メンブレンをフィルムに載せ、3辺を接合
溶液をメンブレンに直接添加(DNA側)
気泡を抜いてフィルムを接合し、DNA側を上にしてオートラジオグラフィーカセットに載せる
メンブレンにHyperfilm−ECL(アマシャムファルマシアバイオテック社)を載せ、角をに印を付け、フィルムにメンブレンのポケットの印を付ける
10分間感光する
フィルムが濃くなるまでフィルムを現像浴中に放置する
フィルムを10分間定着浴中に放置する
水+氷酢酸でフィルムを10分間洗浄
乾燥キャビネットでフィルムを乾燥
脱プリン化緩衝液
0.25M HCl[20mL HCl(37%)]
2回蒸留水添加 >1000mL
0.5 NaOH[40g NaOH(Mw:40g/mol)]
1.5M NaCl[175.32g NaCl(Mw:58.44g/mol)]
2回蒸留水添加 >2000mL
pH7.4
1.5M NaCl[175.32g NaCl(Mw:58.44g/mol)]
0.5M Tris−HCl[157.6g Tris−HCl(Mw:157.6g/mol)]
pH7.4
3M NaCl[350.64g NaCl(Mw:58.44g/mol)]
0.3M クエン酸ナトリウム(Na)[176.46g クエン酸Na(Mw:294.1g/mol)]
2回蒸留水添加 >2000mL
pH7.0
0.1M マレイン酸[23.2g マレイン酸(Mw:116.07g/mol)]
0.15M NaCl[17.4g NaCl(Mw:58.44g/mol)]
15.8g NaOH[(Mw:40g/mol)]
2回蒸留水添加 >2000mL
pH7.5
2×SSC/0.1% SDS(1000mL)
100mL 20×SSC
5mL 20% SDS
2回蒸留水添加 >1000mL
5mL 20×SSC
5mL 20% SDS
2回蒸留水添加 >1000mL
緩衝液1[997mL 緩衝液1]
0.3% Tween20[3mL Tween20]
10%(W/V)ブロッキング試薬[25g ブロッキング試薬]
緩衝液1に[緩衝液1添加 >250mL]
0.1M Tris−HCl[15.76g Tris−HCl(Mw:157.6g/mol)]
0.1M NaCl[5.84g NaCl(Mw:58.44g/mol)]
2回蒸留水添加 >1000mL
pH9.5
0.4M NaOH(1000mL)
16g NaOH[(Mw:40g/mol)]
2回蒸留水添加 >1000mL
0.1×SSC[5mL 20×SSC]
0.1% SDS[5mL 20% SDS]
0.2M Tris−HCl[31.52g Tris−HCl(Mw:157.6g/mol)]
2回蒸留水添加 >1000mL
DRIP−又はDRIP−FUS PCR結果
産物の長さ:880bp
鋳型の説明:MCF−7(cDNA)
産物の長さ:130bp
鋳型の説明:BAC204D19(ゲノムDNA)
産物の長さ:505bp
鋳型の説明:HeLa(cDNA)
産物の長さ:505bp
鋳型の詳細:BAC204D19(ゲノムDNA)
産物の長さ:479bp
鋳型の詳細:DIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCRから)
産物の長さ: 201bp
鋳型の説明:MCF 7(cDNA)
産物の長さ:201bp
鋳型の詳細:S325T/SV40(cDNA)
産物の長さ:201bp
鋳型の説明:S533T/SV40(cDNA)
産物の長さ:201bp
鋳型の詳細:BAC 339H12(ゲノムDNA)
産物の長さ:981bp
鋳型の詳細:DIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCRから)
産物の長さ:370bp
鋳型の詳細:WRO(cDNA)
産物の長さ:1049bp
鋳型の詳細:MCF−7(cDNA)
産物の長さ:162bp
鋳型の詳細:DIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCRから)
産物の長さ:820bp
鋳型の詳細:WRO(cDNA)
産物の長さ:〜3.5kbp
注:増幅は次の2種のPCRを順次行った
鋳型の説明:DIL3500(cDNAクローン;DRIPVU16/DRIPVRL2を用いたPCR)
産物の長さ:560bp
鋳型の詳細:S533T/SV40(cDNA)
産物の長さ:699bp
鋳型の詳細:S533T/SV40(cDNA)
産物の長さ:1142bp
鋳型の説明:S325T/SV40(cDNA)
鋳型の詳細:S325T/SV40(cDNA)
産物の長さ:165bp(エクソンIを有しない);283bp(エクソンIを含む)
鋳型の詳細:BAC 339H12(ゲノムDNA)
産物の長さ:130bp
鋳型の詳細:HeLa(cDNA)
産物の長さ:130bp
鋳型の説明:WRO(cDNA)
産物の長さ:764bp
Claims (63)
- 過形成及び/又は腫瘍において発現が変化する核酸であって、配列番号1、3、4、9、11〜16及びこれら配列の断片からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする核酸。
- 腫瘍が、染色体アーム2p内に何らかの変化を有する各種上皮腫瘍及び染色体バンド2p21−22内に何らかの変化を有する各種腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の核酸。
- 過形成が甲状腺の各種過形成からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の核酸。
- 核酸は、配列番号1、9、13、14及び/又は15の核酸から選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸。
- 遺伝子コードの縮重がなければ請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸の内の一核酸と、特に、ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸。
- 先の請求項のいずれか一項に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
- プロモーター、ターミネーター及びエンハンサーからなる群から選択される少なくとも一種の要素を更に含むことを特徴とする、請求項7に記載のベクター。
- ベクターが発現ベクターであることを特徴とする、請求項7又は8に記載のベクター。
- 少なくとも一個のプロモーターが、ポリペプチドをコードする請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸の少なくとも一部分と共にin−frameで存在することを特徴とする、請求項7〜9に記載のベクター。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるポリペプチド、又は配列番号2、5〜8、10又は17に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
- 改変されていることを特徴とする、請求項11に記載のポリペプチド。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞(特に単離された細胞)。
- 請求項11又は12に記載のポリペプチドに対するものであることを特徴とする抗体。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸に対するものであることを特徴とする、請求項14に記載の抗体。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸に対するものであることを特徴とするリボザイム。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸の少なくとも一部分又はこれと実質的に相補的な核酸の少なくとも一部分を含むことを特徴とする、請求項18に記載のリボザイム。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の各種核酸配列の内の一配列と実質的に相補的な又は実質的に同一の配列を含むアンチセンス核酸。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の各種核酸の内の一核酸又はその一部と実質的に相補的又はこれと実質的に同一である配列を含むRNAiであって、好ましくはこのRNAiが、実質的に相補的又は実質的に同一である領域の長さが21〜23個のヌクレオチドである領域を含む、RNAi。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸の内の一核酸又はその一部と実質的に相補的又はこれと実質的に同一である核酸を含むプライマー又は核酸プローブであって、長さがヌクレオチド12〜32個、好ましくはヌクレオチド14〜28個、好ましくはヌクレオチド20〜28個であるプライマー及び/又は核酸プローブ。
- 先の請求項のいずれか一項に記載の核酸の翻訳産物の作用に影響を及ぼす化合物、特に前記作用を阻害する化合物を決定する方法であって、次の各段階、
・翻訳産物と化合物を調製する段階と、
・翻訳産物の作用を体現する系において、翻訳産物と化合物とを接触させる段階と、
・化合物の影響下において翻訳産物の作用に何らかの変化が生じたか否かを決定する段階と
を特徴とする方法。 - 先の請求項のいずれか一項に記載の核酸の転写産物の作用に影響を及ぼす化合物、特に前記作用を阻害する化合物を決定する方法であって、次の各段階、
・転写産物と化合物を調製する段階と、
・転写産物の作用を体現する系において、転写産物と化合物とを接触させる段階と、
・化合物の影響下において転写産物の作用に何らかの変化が生じたか否かを決定する段階と
を特徴とする方法。 - 系が、細胞発現系、無細胞発現系、化合物と翻訳産物の間の相互作用を測定するアッセイ及び化合物と転写産物の間の相互作用を測定するアッセイからなる群から選択されることを特徴とする、請求項21又は22に記載の方法。
- 過形成及び腫瘍の形成、特に甲状腺の過形成及び腫瘍の形成を担う遺伝子を決定する方法であって、次の各段階、
・過形成及び/又は腫瘍の染色体異常部におけるブレークポイントを決定する段階と、
・染色体アーム2p、好ましくは染色体バンド2p21−22のブレークポイント領域の両側400kbp、好ましくは150kbpの領域内にある遺伝子を決定する段階と、
・過形成細胞又は腫瘍細胞におけるこの遺伝子の翻訳/転写が、過形成でない細胞又は腫瘍でない細胞と比べて変化しているか否かを決定する段階と
を含む方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸及び/又は請求項16又は17に記載のリボザイム及び/又は請求項18に記載のアンチセンス核酸及び/又は請求項19に記載のRNAi及び/又は請求項20に記載の核酸プローブの、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍の診断、特にin vitroにおける診断及び/又は治療のための使用。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸及び/又は請求項16又は17に記載のリボザイム及び/又は請求項18に記載のアンチセンス核酸及び/又は請求項19に記載のRNAi及び/又は請求項20に記載の核酸プローブの、医薬を製造するため、特に、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を治療及び/又は予防するための医薬を製造するための使用。
- 請求項11〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍の診断、特にin vitroにおける診断及び/又は治療のための使用。
- 請求項11〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの、医薬の製造、特に、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を治療及び/又は予防するための医薬を製造するための使用。
- 請求項14〜15のいずれか一項に記載の抗体の、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍の診断、特にin vitroにおける診断及び/又は治療のための使用。
- 請求項14〜15のいずれか一項に記載の抗体の、医薬の製造、特に、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を治療及び/又は予防するための医薬を製造するための使用。
- 甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍の診断のためのキットであって、該キットが、それぞれ先の請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞、抗体、アンチセンス核酸、RNAi、リボザイム、プライマー及び/又は核酸プローブからなる群から選択される少なくとも一種の要素を含むことを特徴とするキット。
- 甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を検出するための方法であって、次の各段階、
・甲状腺材料を、それぞれ先の請求項のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、抗体、アンチセンス核酸、RNAi、リボザイム及び細胞からなる群から選択される剤に接触させる段階と、
・甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍が存在するか否かを決定する段階と
を特徴とする方法。 - 甲状腺材料が生体外に存在することを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 甲状腺材料が細胞学的調製物の一部であることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸又はその一部の、プライマー及び/又はプローブとしての使用。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸配列の一部分に実質的に相補的である或いは実質的に同一であることを特徴とする、核酸を提示する及び/又はスクリーニングする及び/又は検出するためのプライマー。
- 甲状腺腫瘍又は甲状腺腫において検出され得る配列を含む核酸を提示する方法であって、破壊ポイントを有する異常部が染色体バンド2p21−22に存在し、前記配列が少なくとも部分的に染色体バンド2p21−22内にあり、
該方法が次の各段階、
・PCRを実施するためのプライマー、特に請求項35に記載のプライマーを調製する段階と、
・ヒト染色体2のバンド2p21−22から採取した核酸配列又は請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸を調製する段階と、
・核酸配列又は核酸をプライマーと混合する段階と、
・PCRを実施する段階と
を含むことを特徴とする方法。 - 医薬組成物であって、
それぞれ先の請求項の一項に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞、抗体、アンチセンス核酸、RNAi、リボザイム、プライマー及び/又は核酸プローブ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一種の剤と、医薬的に許容される少なくとも一種の担体と
を含むことを特徴とする医薬組成物。 - 腫瘍及び過形成を治療及び/又は予防するための方法であって、先の請求項のいずれか一項に記載の核酸の発現変化の作用を阻害する化合物が患者に投与されることを特徴とする方法。
- 先の請求項のいずれか一項に記載の核酸の発現変化の作用を阻害する化合物の、医薬を製造するための使用。
- 医薬が、腫瘍及び/又は過形成、特に甲状腺の腫瘍及び/又は過形成を治療及び/又は予防するためのものであることを特徴とする、請求項40に記載の使用。
- 配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸又はこれらの誘導体、及び/又はこれらにコードされるポリペプチド又はこれらの誘導体の、医薬(特に甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍を治療するための医薬)を製造するための及び/又は診断剤(特に甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍の診断のための診断剤)を製造するための使用。
- ポリペプチドが、配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従ったアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項42に記載の使用。
- 核酸が、遺伝子コードの縮重がなければ、配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16の内の一配列に係る核酸とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項42又は43に記載の使用。
- 配列番号2、配列番号5〜8、10及び17からなる群から選択される配列を有するポリペプチド又はこれらの誘導体の、医薬(特に甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍を治療するための医薬)を製造するための及び/又は診断剤(特に甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍の診断のための診断剤)を製造するための使用。
- 甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を治療するための手段、及び/又は甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を診断するための診断剤をスクリーニングするための方法であって、次の各段階、
・候補化合物を調製する段階と、
・発現系及び/又は活性系を調製する段階と、
・候補化合物を発現系及び/又は活性系と接触させる段階と、
・候補化合物の影響下において、配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸又はこれらの誘導体、及び/又はこれらにコードされるポリペプチド、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従った配列を有するポリペプチド又はこれらの誘導体の発現及び/又は活性が変化しているか否かを決定する段階と
を含む方法。 - 候補化合物が化合物ライブラリーに含まれることを特徴とする、請求項46に記載の方法。
- 候補化合物がペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン、機能的核酸及び小分子からなる化合物群から選択されることを特徴とする、請求項46又は47に記載の方法。
- 機能的核酸が、アプタマー、アプタザイム、リボザイム、スピゲルマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びRNAiからなる群から選択されることを特徴とする、請求項48に記載の方法。
- 配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸又はこれらの誘導体、及び/又はこれらにコードされるポリペプチド又はこれらの誘導体、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従った配列を有するポリペプチド又はこれらの誘導体、及び/又は配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸の特に天然相互作用パートナー又はこれらの誘導体、及び/又はこれらにコードされるポリペプチド又はこれらの誘導体、及び/又はこれらをコードする核酸、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従った配列を有するポリペプチドの相互作用パートナー又はこれらの誘導体の、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍を診断するための診断剤を開発及び/又は製造するためターゲット分子としての、及び/又は甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を予防及び/又は治療するための医薬を開発及び/又は製造するためのターゲット分子としての使用。
- 医薬又は診断手段が、抗体、ペプチド、アンチカリン、小分子、アンチセンス分子、アプタマー、スピゲルマー及びRNAi分子からなる群から選択される剤を含むことを特徴とする、請求項50に記載の使用。
- 剤が、配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸又はこれらの誘導体と相互作用する、及び/又は特に天然相互作用パートナーをコードする核酸と、特にmRNA、ゲノム核酸又はcDNAと相互作用することを特徴とする、請求項51に記載の使用。
- 配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸によりコードされるペプチド又はこれらの誘導体と相互作用する、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従ったポリペプチドと相互作用する、及び/又はこれらの特に天然相互作用パートナーと相互作用するポリペプチドの、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍を診断するための診断手段を開発又は製造するための、及び/又は甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を予防及び/又は治療するための医薬を開発又は製造するための使用。
- ポリペプチドが、抗体及び結合ポリペプチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項53に記載の使用。
- 配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する核酸によりコードされるポリペプチド又はこれらの誘導体と相互作用する、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従ったポリペプチドと相互作用する、及び/又は特にこれらの天然相互作用パートナーと相互作用する核酸の、特に、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は甲状腺腫瘍を診断するための診断剤を開発又は製造するための、及び/又は甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、甲状腺腫瘍を予防及び/又は治療するための医薬を開発又は製造するための使用。
- 核酸が、アプタマー及びスピゲルマーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項55に記載の使用。
- 配列番号1、3、4、9及び配列番号11〜16からなる群から選択される配列を有する第二の核酸又はこれらの誘導体と相互作用する、及び/又は配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従った配列を有するポリペプチドの相互作用パートナーをコードする核酸と相互作用する第一の核酸の、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を予防及び/又は治療するための医薬を開発又は製造するための使用。
- 相互作用する第一の核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び/又はRNAiであることを特徴とする、請求項57に記載の使用。
- 第二の核酸がそのcDNA又はmRNAであることを特徴とする、請求項57又は58に記載の使用。
- 請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用に係る群から選択される少なくとも一種の剤と、医薬的に許容される少なくとも一種類の担体とを含む、特に、甲状腺機能障害及び/又は甲状腺過形成及び/又は各種腫瘍、特に甲状腺腫瘍を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
- 請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用に係る少なくとも一種の剤を含む、甲状腺の状態を特徴付けるためのキット。
- 配列番号2、配列番号5〜8、10或いは17に従ったアミノ酸配列又はその機能的断片を含むポリペプチド。
- 先の請求項のいずれか一項に記載の使用に従った、請求項62に記載のポリペプチドの使用。
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