JP2006500014A - Newer forms of interfering RNA molecules - Google Patents
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Abstract
本発明は2本鎖構造を含むリボ核酸であって、前記2本鎖構造が第1鎖および第2鎖を含み、この時第1鎖は連続ヌクレオチドの第1ストレッチを含み、そして前記第1ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、また前記第2鎖は連続ヌクレオチドの第2ストレッチを含み、このとき前記第2ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に同一であるものであり、そして前記2本鎖構造が平滑端を有するものであるリボ核酸に関する。The present invention is a ribonucleic acid comprising a double-stranded structure, wherein the double-stranded structure comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises a first stretch of contiguous nucleotides and the first strand The stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid, and the second strand comprises a second stretch of contiguous nucleotides, wherein the second stretch is at least partially identical to the target nucleic acid; The present invention also relates to a ribonucleic acid whose double-stranded structure has a blunt end.
Description
本発明は2本鎖構造が第1鎖および第2鎖を含むところの2本鎖構造物を含むリボ核酸であって、該第1鎖が連続するヌクレオチドである第1ストレッチ(stretch)を含み、そして前記第1ストレッチが標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、また該第2鎖が少なくとも標的核酸と少なくとも部分的に同一である連続するヌクレオチドである第2ストレッチを含んでなるリボ核酸、かかるリボ核酸の使用、かかるリボ核酸をそれぞれ含む細胞および生物、かかるリボ核酸を含有する組成物、かかるリボ核酸を含有する医薬組成物、ならびに標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。 The present invention relates to a ribonucleic acid comprising a double-stranded structure in which the double-stranded structure comprises a first strand and a second strand, comprising a first stretch in which the first strand is a continuous nucleotide. A ribonucleic acid comprising a second stretch, wherein the first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid and the second strand is a contiguous nucleotide at least partially identical to the target nucleic acid And the use of such ribonucleic acids, cells and organisms containing such ribonucleic acids, compositions containing such ribonucleic acids, pharmaceutical compositions containing such ribonucleic acids, and methods for inhibiting the expression of target genes.
RNA−媒介干渉法(RNA-mediated interference:RNAi)は発現を抑制する遺伝子に相同な配列を持つ2本鎖RNA(dsRNA)により引き起こされる転写後遺伝子サイレンシング(post-transcriptional gene silencing)メカニズムである(Fire(1999年)、Trends Genet 15、358〜63、Tuschlら(1999年)、Genes Dev 13、3191〜7、Waterhouseら(2001年)、Nature 411、834〜42、Elbashirら(2001年)、Nature 411、494〜8、レビューとしてはSharp(2001年)Genes Dev 15、485〜90、Barstead(2001年)、Curr Opin Chem Biol 5、63〜6を見よ)である。RNAiは植物(Baulcombe(1999年)、CUrr Opin Plant Biol 2、109〜13)、線虫(Montgomeryら(1998年)、Proc Natl Acad Sci USA 95、15502〜7)、ショウジョバエ(Kennerdellら(1998年)、Cell 95、1017〜26、Kennerdellら(2000年)、Nat Biotechnol 18、896〜8)を含む様々な生物での遺伝子機能の決定に広く用いられている。線虫のC.Elegansでは、ゲノムの約3分の1が既にRNAiによる機能分析にかけられている(Kim(2001年)、Curr Biol 11、R85〜7、Madedaら(2001年)、Curr Biol 11、171〜6)。 RNA-mediated interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing mechanism caused by double-stranded RNA (dsRNA) having a sequence homologous to a gene that suppresses expression. (Fire (1999), Trends Genet 15, 358-63, Tuschl et al. (1999), Genes Dev 13, 3191-7, Waterhouse et al. (2001), Nature 411, 834-42, Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494-8, see Sharp (2001) Genes Dev 15, 485-90, Barstead (2001), Curr Opin Chem Biol 5, 63-6 for reviews). RNAi is expressed in plants (Baulcombe (1999), CUrr Opin Plant Biol 2, 109-13), nematodes (Montgomery et al. (1998), Proc Natl Acad Sci USA 95, 15502-7), Drosophila (Kennerdell et al. (1998). ), Cell 95, 1017-26, Kennerdell et al. (2000), Nat Biotechnol 18, 896-8) and are widely used to determine gene function in various organisms. In the nematode C. Elegans, about one third of the genome has already been subjected to RNAi functional analysis (Kim (2001), Curr Biol 11, R85-7, Madeda et al. (2001), Curr Biol 11 171-6).
最近まで初期マウス発生(Wiannyら(2000年)、Nat Cell Biol 2、70〜5)を除き、一般にはRNAiは、ほ乳動物細胞に応用できなかった。ほ乳動物細胞へ21−ntの二本鎖をトランスフェクションすると遺伝子発現は妨害されるが、長鎖のdsRNAでよく起こる配列依存的なインターフェロン駆動性抗ウイルス反応は誘導されないことが見出され、分化したほ乳動物細胞でも新たに応用の可能性が出てきた(Elbashirら(2001年)、Nature 411、494〜8)。興味深いことに、これら小型の干渉RNAs(siRNAs)は長いdsRNAsの処理産物に似ており、分化したほ乳細胞には迂回メカニズムが存在している可能性が示唆されている。RNAseIIIファミリーの一つであり、初期dsRNA処理に必要なDicer複合体が同定されている(Bernsteinら(2001年)、Nature 409、363〜6、Billyら(2001年)、Proc Natl Acad Sci USA 98、14428〜33)。未修飾リボオリゴヌクレオチドを使用する際に経験する問題の一つは、これらが細胞内または血清含有培地においてさえ急速に分解することである(Wickstrom(1986年)、J Biochem Biophys Methods 13、97〜102、Gazenaveら(1987年)、Nucleic Acids Res 15、10507〜21)。それはトランスフェクションされたsiRNAが誘導する各ノックダウンが長期間維持されて表現系の変化を起こすか否かは、具体的な遺伝子機能および使用するアッセイシステムに依存している。 Until recently, except for early mouse development (Wianny et al. (2000), Nat Cell Biol 2, 70-5), generally RNAi was not applicable to mammalian cells. Transfection of mammalian cells with 21-nt duplex interferes with gene expression, but is found not to induce the sequence-dependent interferon-driven antiviral response that is common with long dsRNAs. The potential for new applications has also emerged in mammalian cells (Elbashir et al. (2001), Nature 411, 494-8). Interestingly, these small interfering RNAs (siRNAs) resemble the processed products of long dsRNAs, suggesting the possibility of a detour mechanism in differentiated mammalian cells. A Dicer complex that is a member of the RNAse III family and is required for early dsRNA processing has been identified (Bernstein et al. (2001), Nature 409, 363-6, Billy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98 14428-33). One of the problems experienced when using unmodified ribooligonucleotides is that they degrade rapidly in cells or even in serum-containing media (Wickstrom (1986), J Biochem Biophys Methods 13, 97- 102, Gazenave et al. (1987), Nucleic Acids Res 15, 10507-21). It depends on the specific gene function and the assay system used whether each knockdown induced by the transfected siRNA is maintained for a long period of time to cause a phenotypic change.
本発明の根本的課題は生細胞の様な生物化学的環境内に於いて安定かつ活性である合成干渉RNA分子を提供することである。 The fundamental problem of the present invention is to provide synthetic interfering RNA molecules that are stable and active in a biochemical environment such as living cells.
本発明の第1の局面では、この課題は2本鎖構造が第1鎖および第2鎖を含むことによる2本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第1鎖が連続するヌクレオチドの第1ストレッチを含み、そして上記第1ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第2鎖が少なくとも標的核酸と少なくとも部分的に同一である連続するヌクレオチドである第2ストレッチを含んでおり、また該2本鎖構造が平滑端部であるリボ核酸を提供することにより達成される。 In the first aspect of the present invention, this subject is a ribonucleic acid comprising a double-stranded structure by the double-stranded structure comprising the first strand and the second strand, wherein the first strand of the nucleotide in which the first strand is continuous. A second stretch comprising a stretch and wherein the first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid and the second strand is at least partially identical to the target nucleic acid. And is achieved by providing a ribonucleic acid wherein the double stranded structure is a blunt end.
第2の局面では、本発明の根本課題は第1鎖および第2鎖を含む2本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第1鎖が連続するヌクレオチドの第1ストレッチを含み、そして上記第1ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第2鎖が連続するヌクレオチドの第2ストレッチを含み、上記第2ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、該第1ストレッチおよび/または該第2ストレッチが18もしくは19ヌクレオチド長の長さを有するリボ核酸により解決される。 In a second aspect, the underlying problem of the present invention is a ribonucleic acid comprising a double stranded structure comprising a first strand and a second strand, the first strand comprising a first stretch of consecutive nucleotides, and The first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid and the second strand comprises a second stretch of contiguous nucleotides, the second stretch being at least partially identical to the target nucleic acid; The first stretch and / or the second stretch is resolved by a ribonucleic acid having a length of 18 or 19 nucleotides.
発明の第1局面によるリボ核酸の実施態様の1つでは、第1ストレッチおよび/または第2ストレッチの長さは18もしくは19ヌクレオチドを有する。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the first aspect of the invention, the length of the first stretch and / or the second stretch has 18 or 19 nucleotides.
発明の第1局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、2本鎖構造は2本鎖の両側部が平滑端である。 In a further embodiment of the ribonucleic acid according to the first aspect of the invention, the double stranded structure is blunt on both sides of the double stranded structure.
発明の第1局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、2本鎖構造は第1鎖の5’−末端および第2鎖の3’−末端により画定される2本鎖構造に平滑端を有する。 In a further embodiment of the ribonucleic acid according to the first aspect of the invention, the double stranded structure has a blunt end in the double stranded structure defined by the 5′-end of the first strand and the 3′-end of the second strand .
発明の第1局面および第2局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、2本鎖構造は第1鎖の3’−末端および第2鎖の5’−末端により画定される2本鎖構造に平滑端を有する。 In yet another embodiment of the ribonucleic acid according to the first and second aspects of the invention, the double stranded structure is defined by the 3′-end of the first strand and the 5′-end of the second strand. Has a smooth end.
第3の局面では、本発明の根本課題は第1鎖および第2鎖を含む2本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第1鎖が連続するヌクレオチドである第1ストレッチを含み、そして上記第1ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第2鎖が連続するヌクレオチドの第2ストレッチを含み、上記第2ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、さらに2本の鎖の少なくとも1本が5’−末端に少なくとも1ヌクレオチドの突出を有するものであるリボ核酸により解決される。 In a third aspect, the underlying problem of the present invention is a ribonucleic acid comprising a double stranded structure comprising a first strand and a second strand, comprising a first stretch wherein the first strand is a contiguous nucleotide; and The first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid and the second strand comprises a second stretch of contiguous nucleotides, and the second stretch is at least partially identical to the target nucleic acid Furthermore, it is solved by a ribonucleic acid in which at least one of the two strands has an overhang of at least 1 nucleotide at the 5′-end.
本発明の第3局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、突出はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む群より選択される少なくとも1つのヌクレオチドから成る。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the overhang consists of at least one nucleotide selected from the group comprising ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
本発明の第3局面によるリボ核酸のより好ましい実施態様では、ヌクレオチドは逆方向の塩基が脱落しているオリゴヌクレオチド、および2’−位置がNH2−修飾されているヌクレオチドを含む群から好ましくは選択される修飾を有する。 In a more preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the present invention, the nucleotide Oligonucleotides reverse base is missing, and 2'-position is NH 2 - preferably from the group comprising nucleotides being modified With selected modifications.
本発明の第3局面によるリボ核酸の好適実施態様では、鎖の少なくとも1本は3’−末端にリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドからなる少なくとも1ヌクレオチドの突出を有している。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, at least one of the strands has an overhang of at least one nucleotide consisting of ribonucleotides or deoxynucleotides at the 3'-end.
本発明の第3局面によるリボ核酸の別の好適実施態様では、第1ストレッチおよび/または第2ストレッチは18もしくは19ヌクレオチド長を有する。 In another preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the first stretch and / or the second stretch have a length of 18 or 19 nucleotides.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、2本鎖構造は17〜21ヌクレオチド、好ましくは18〜19ヌクレオチド長を有する。 In one embodiment of ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the double stranded structure has a length of 17-21 nucleotides, preferably 18-19 nucleotides.
本発明の第3局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、5’−端の突出は第2鎖にある。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the 5'-end overhang is in the second strand.
本発明の第3局面によるリボ核酸の好適実施態様では、第1鎖もまた突出を、好ましくは5’−末端に有している。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the first strand also has an overhang, preferably at the 5'-end.
本発明の第3局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、第1鎖の3’−末端は突出を含む。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the 3'-end of the first strand comprises an overhang.
本発明の第3局面によるリボ核酸の別の実施態様では、5’−末端の突出は第1鎖にある。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the 5'-end overhang is in the first strand.
その好適実施態様では、第2鎖も突出を、好ましくは5’−末端に含む。 In its preferred embodiment, the second strand also contains an overhang, preferably at the 5'-end.
本発明の第3局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、第1鎖の3’−末端は突出を含む。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the third aspect of the invention, the 3'-end of the first strand comprises an overhang.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、リボ核酸の少なくとも1ヌクレオチドが2’−位置に修飾を有しており、そして該修飾は好ましくはアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群から選択される。 In one ribonucleic acid embodiment according to any aspect of the invention, at least one nucleotide of the ribonucleic acid has a modification at the 2′-position, and the modification is preferably amino, fluoro, methoxy, alkoxy And selected from the group comprising alkyl.
第4の局面では、本発明の根本課題は2本鎖構造を含むリボ核酸であって、該2本鎖構造が第1鎖と第2鎖を含むものであり、該第1鎖が連続するヌクレオチドである第1ストレッチを含み、そして上記第1ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第2鎖が連続するヌクレオチドの第2ストレッチを含み、そして上記第2ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、
このとき
上記第1鎖および/または第2鎖は、2’−位置が修飾されている修飾ヌクレオチドの複数の群を含むものであり、また該鎖内に於いて各修飾ヌクレオチド群は片側部または両側部でヌクレオチドのフランキング群(flanking group)によりフランキングされており、ヌクレオチドのフランキング群を形成するフランキングヌクレオチドは未修飾ヌクレオチドか、または該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである、リボ核酸によって解決される。
In the fourth aspect, the fundamental problem of the present invention is a ribonucleic acid containing a double-stranded structure, wherein the double-stranded structure contains a first strand and a second strand, and the first strand is continuous. A first stretch that is nucleotides, and wherein the first stretch is at least partially complementary to a target nucleic acid and the second strand comprises a second stretch of consecutive nucleotides, and the second stretch comprises Is at least partially identical to the target nucleic acid,
In this case, the first strand and / or the second strand includes a plurality of groups of modified nucleotides modified at the 2′-position, and each modified nucleotide group in the strand is either one side or Flanked by a flanking group of nucleotides on both sides, and the flanking nucleotides forming the flanking group of nucleotides are unmodified nucleotides or nucleotides having modifications different from the modification of the modified nucleotides Some are solved by ribonucleic acid.
本発明の第4局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、リボ核酸は本発明の第1局面、第2局面または第3局面によるリボ核酸である。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the ribonucleic acid is a ribonucleic acid according to the first, second or third aspect of the invention.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第1鎖および/または第2鎖は前記複数の修飾ヌクレオチドを含む。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the first strand and / or the second strand comprises the plurality of modified nucleotides.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第1鎖は前記複数の修飾ヌクレオチド群を含む。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the first strand comprises the plurality of modified nucleotide groups.
本発明の第4局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、前記第2鎖は前記複数の修飾ヌクレオチド群を含む。 In still another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the present invention, the second strand comprises the plurality of modified nucleotide groups.
本発明の第4局面によるリボ核酸の好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの群および/またはフランキングヌクレオチドの群は、1〜10個のヌクレオチドを含む群より選択される数のヌクレオチドを含む。本明細書に記載の範囲に関しては、それぞれの範囲は、上記範囲を規定している2つの数字を含め、範囲の画定に用いたそれぞれの数字の間にある個々の整数を開示すると理解するものとする。従って上記の例では、群は1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチドおよび10ヌクレオチドを含む。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the group of modified nucleotides and / or the group of flanking nucleotides comprises a number of nucleotides selected from the group comprising 1 to 10 nucleotides. With respect to ranges described herein, each range is understood to disclose an individual integer between each number used to define the range, including the two numbers defining the range. And Thus, in the above example, the group comprises 1 nucleotide, 2 nucleotides, 3 nucleotides, 4 nucleotides, 5 nucleotides, 6 nucleotides, 7 nucleotides, 8 nucleotides, 9 nucleotides and 10 nucleotides.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別実施態様では、前記第1鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、前記第2鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに同一である。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the pattern of modified nucleotides on the first strand is identical to the pattern of modified nucleotides on the second strand.
本発明の第4局面によるリボ核酸の好適実施態様では、前記第1鎖のパターンは前記第2鎖のパターンに整合されている。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the pattern of the first strand is matched to the pattern of the second strand.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第1鎖のパターンは第2鎖のパターンに対し1以上の数のヌクレオチドによりシフトしている。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the present invention, the first strand pattern is shifted by one or more nucleotides relative to the second strand pattern.
本発明の第4局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、修飾はアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群より選択される。 In one embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the modification is selected from the group comprising amino, fluoro, methoxy, alkoxy and alkyl.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、2本鎖構造は平滑端である。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the double stranded structure is blunt ended.
本発明の第4局面によるリボ核酸の好適実施態様では、2本鎖構造は両側部が平滑端である。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the present invention, the double-stranded structure is blunt on both sides.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、2本鎖構造は第1鎖の5’−末端および第2鎖の3’−末端により画定される2本鎖構造の側部が平滑端である。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the double stranded structure is defined by the side of the double stranded structure defined by the 5′-end of the first strand and the 3′-end of the second strand. Smooth end.
本発明の第4局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、2本鎖構造は第1鎖の3’−末端および第2鎖の5’−末端により画定される2本鎖構造の側部が平滑端である。 In yet another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the double-stranded structure is defined by the 3′-end of the first strand and the 5′-end of the second strand, the side of the double-stranded structure. Is the smooth end.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、2本ある鎖の少なくとも1本が5’−末端に少なくとも1ヌクレオチドの突出を含む。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, at least one of the two strands comprises an overhang of at least 1 nucleotide at the 5'-end.
本発明の第4局面によるリボ核酸の好適実施態様では、突出は少なくとも1つのデオキシヌクレオチドから成る。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the overhang consists of at least one deoxynucleotide.
本発明の第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、少なくとも1本の鎖は3’−末端に少なくとも1つのヌクレオチドの突出を含む。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect of the invention, the at least one strand comprises an overhang of at least one nucleotide at the 3'-end.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の1つでは、2本鎖構造の長さは17〜21、より好ましくは18もしくは19塩基である。 In one embodiment of ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the length of the double stranded structure is 17-21, more preferably 18 or 19 bases.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第1鎖の長さ、および/または前記第2鎖の長さは互いに独立して約15〜約23塩基、17〜21塩基の範囲、および18もしくは19塩基を含む群から選択される。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to any aspect of the present invention, the length of the first strand and / or the length of the second strand is independent of each other from about 15 to about 23 bases, 17-21 Selected from the group comprising a range of bases and 18 or 19 bases.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、前記第1鎖と標的核酸との間の相補性は完全である。 In preferred embodiments of the ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the complementarity between the first strand and the target nucleic acid is perfect.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の1つでは、第1鎖と標的核酸との間に形成される二本鎖は少なくとも15ヌクレオチドを含み、そのとき上記2本鎖構造を形成する第1鎖と標的核酸の間に1個または2個の不一致がある。 In one embodiment of a ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the duplex formed between the first strand and the target nucleic acid comprises at least 15 nucleotides, then forming the double stranded structure There are one or two mismatches between the first strand and the target nucleic acid.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の1つでは、第1鎖と第2鎖は共にそれぞれ修飾型ヌクレオチド群の少なくとも1つ、および少なくとも1つのヌクレオチドのフランキング群とを含み、この時修飾ヌクレオチドの各群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、そしてヌクレオチドの各フランキング群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、第1鎖の修飾ヌクレオチドの各群は第2鎖上にあるヌクレオチドのフランキング群と整合しており、そして第1鎖の5’最末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群のヌクレオチドであり、第2鎖の3’最末端ヌクレオチドはヌクレオチドのフランキング群のヌクレオチドである。 In one ribonucleic acid embodiment according to any aspect of the invention, the first strand and the second strand each comprise at least one modified nucleotide group and at least one nucleotide flanking group, Wherein each group of modified nucleotides comprises at least one nucleotide, and each flanking group of nucleotides comprises at least one nucleotide, each group of modified nucleotides on the first strand comprising flanking nucleotides on the second strand In alignment with the group and the 5 ′ most terminal nucleotide of the first strand is the nucleotide of the modified nucleotide group and the 3 ′ most terminal nucleotide of the second strand is the nucleotide of the flanking group of nucleotides.
第4局面によるリボ核酸の好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの各群は単一ヌクレオチドより成り、そして/または各ヌクレオチドのフランキング群は単一ヌクレオチドから成る。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect, each group of modified nucleotides consists of a single nucleotide and / or the flanking group of each nucleotide consists of a single nucleotide.
第4局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第1鎖に於いては、ヌクレオチドのフランキング群を形成するヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドに対し3’方向に配置されている非修飾ヌクレオチドであり、第2鎖上に於いては、修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドはヌクレオチドのフランキング群を形成するヌクレオチドに対し5’方向に配置されている修飾ヌクレオチドである。 In a further embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect, in the first strand, the non-modified nucleotides forming the flanking group of nucleotides are arranged 3 ′ to the nucleotides forming the modified nucleotide group On the second strand, the nucleotides that form the modified nucleotide group are the modified nucleotides that are located 5 ′ to the nucleotide that forms the flanking group of nucleotides.
第4局面によるリボ核酸の別の実施態様では、第1鎖は8〜12、好ましくは9〜11の修飾ヌクレオチド群を含み、この時第2鎖は7〜11、好ましくは8〜10の修飾ヌクレオチド群を含む。 In another embodiment of the ribonucleic acid according to the fourth aspect, the first strand comprises 8-12, preferably 9-11 modified nucleotide groups, wherein the second strand is 7-11, preferably 8-10 modified. Includes nucleotide groups.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、標的遺伝子は構造遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、転写因子、運動因子、細胞周期因子、細胞周期インヒビター、酵素、成長因子、サイトカインおよび腫瘍サプレッサを含む群より選択される。 In a preferred embodiment of the ribonucleic acid according to any aspect of the present invention, the target genes include structural genes, housekeeping genes, transcription factors, motility factors, cell cycle factors, cell cycle inhibitors, enzymes, growth factors, cytokines and tumor suppressors. Selected from the group comprising.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第1鎖および第2鎖はリープ構造で連結している。 In a further embodiment of the ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the first strand and the second strand are linked in a leap structure.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、ループ構造は非核酸ポリマーを含む。 In preferred embodiments of ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the loop structure comprises a non-nucleic acid polymer.
非核酸ポリマーの好適実施態様はポリエチレングリコールである。 A preferred embodiment of the non-nucleic acid polymer is polyethylene glycol.
その別の実施態様では、ループ構造は核酸を含む。 In another embodiment thereof, the loop structure comprises a nucleic acid.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の1つでは、第1鎖の5’−末端は第2鎖の3−末端と連結している。 In one ribonucleic acid embodiment according to any aspect of the invention, the 5'-end of the first strand is linked to the 3-terminus of the second strand.
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第1鎖の3’−末端は第2鎖の5’−末端に連結している。 In further embodiments of the ribonucleic acid according to any aspect of the invention, the 3'-end of the first strand is linked to the 5'-end of the second strand.
第5局面では、本発明の根本課題は、標的の検証のために本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を使用することで解決される。 In a fifth aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by using a ribonucleic acid according to any aspect of the present invention for target validation.
第6の局面では、本発明の根本課題は、医薬の製造のために本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を使用することで解決される。 In a sixth aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by using a ribonucleic acid according to any aspect of the present invention for the manufacture of a medicament.
本発明の第6局面による使用の好適実施態様では、医薬は神経膠芽腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌および白血病、糖尿病、肥満、心臓血管病、ならびに代謝性疾患を含む群から選択される疾患または状態の治療のためのものである。 In a preferred embodiment of the use according to the sixth aspect of the invention, the medicament is glioblastoma, prostate cancer, breast cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer and leukemia, diabetes, obesity, cardiovascular disease, and metabolic For the treatment of a disease or condition selected from the group comprising the disease.
第7の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する細胞、好ましくはノックダウン細胞によって解決される。 In a seventh aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by a cell, preferably a knockdown cell, containing a ribonucleic acid according to any aspect of the present invention.
第8の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する生物体、好ましくはノックダウン生物体によって解決される。 In an eighth aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by an organism, preferably a knockdown organism, containing a ribonucleic acid according to any aspect of the present invention.
第9の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する組成物により解決される。 In a ninth aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by a composition containing ribonucleic acid according to any aspect of the present invention.
第10の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸、および医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物により解決される。 In a tenth aspect, the fundamental problem of the present invention is solved by a pharmaceutical composition comprising a ribonucleic acid according to any aspect of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
第11の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を標的遺伝子の発現を阻害するに十分な量で細胞内に導入することを含み、この場合標的遺伝子は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の標的遺伝子である、細胞内の標的遺伝子またはその誘導物の発現を阻害するための方法により解決される。 In an eleventh aspect, the fundamental problem of the present invention includes introducing the ribonucleic acid according to any aspect of the present invention into a cell in an amount sufficient to inhibit the expression of the target gene, wherein the target gene is It is solved by a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell or a derivative thereof, which is a target gene of ribonucleic acid according to any aspect of the invention.
本発明は、生物化学アッセイもしくは細胞環境の様な生物学的システムで一般的に見られる反応条件に於いて極めて特異的且つ活性であると同時に安定でもあるように小型の干渉RNAsを設計できるという驚くべき発見に基づいている。Tuschelら(国際特許出願WO 01/75164)の様な従来技術に記載の各種干渉RNAsは、21〜23ヌクレオチド長を有し、2本鎖RNAの3’末端が修飾されている。驚くべき事に、本明細書に於いて以後通常RNAiと呼ぶ小型干渉RNA(siRNA)を含めた干渉RNAの安定性に関する問題が、実際には従来考えられていた様なエクソヌクレアーゼによる攻撃というよりはエンドヌクレアーゼの攻撃に拠ることが発明者により見出された。この発見に基づいて発明者は本出願に係る幾つかの戦略を認知した。 The present invention allows the design of small interfering RNAs that are both highly specific and active while at the same time being stable in reaction conditions commonly found in biological systems such as biochemical assays or cellular environments. Based on amazing discoveries. Various interfering RNAs described in the prior art, such as Tuschel et al. (International Patent Application WO 01/75164) have a length of 21-23 nucleotides and are modified at the 3 'end of double stranded RNA. Surprisingly, the problem with the stability of interfering RNA, including small interfering RNA (siRNA), hereinafter referred to generally as RNAi in this specification, is actually more of an exonuclease attack than previously thought. Has been found by the inventor to be attacked by endonucleases. Based on this discovery, the inventor has recognized several strategies for this application.
従って本発明は、新規形態の干渉RNAに関する。RNAiは2本鎖構造を含むリボ核酸より成る。上記2本鎖構造は第1鎖および第2鎖から形作られる。上記第1鎖は、本明細書に於いては連続ヌクレオチド第1ストレッチとも呼ばれる連続するヌクレオチドのストレッチを含み、そしてこの第1ストレッチは標的核酸と少なくとも一部が相補的である。上記第2鎖もまた連続するヌクレオチドのストレッチを含み、このとき上記第2ストレッチは標的核酸と部分的に同一である。このリボ核酸の極めて基本的な構造を図1に概略的に示す。上記第1鎖および上記第2鎖は好ましく相互にハイブリダイズして2本鎖構造を形作る。ハイブリダイゼーションは一般的にはワトソンクリックの塩基対合により生ずる。しかし、発明のリボ核酸は上記2本鎖構造に対するその長さに関し必ずしも限定されない。RNAiを形成するそれぞれの鎖および鎖の各端部には、さらにヌクレオチドが付加されるだろう。第1ストレッチおよび第2ストレッチの具体的な配列によっては、ハイブリダイゼーションまたは塩基対合が完全もしくは完璧なものである必要はなく、即ち第1および第2ストレッチが不一致により塩基が100%対合しなくともよい。二本鎖内に1以上の不一致があってもよい。上記不一致は15、16または17個であることが好ましいぴったり合わさったヌクレオチドのストレッチの外側にある場合には、RNAi活性に影響しない。不一致により15個未満の連続したぴったり合わさったヌクレオチドのみ生ずる場合、問題の標的のmRNAのダウンレギュレーションに関するRNAi分子の活性は17個のぴったり合わさったヌクレオチド二本鎖に比べ低いのが一般的である。 The present invention thus relates to a novel form of interfering RNA. RNAi consists of ribonucleic acid containing a double-stranded structure. The double stranded structure is formed from a first strand and a second strand. The first strand includes a stretch of contiguous nucleotides, also referred to herein as a contiguous nucleotide first stretch, and the first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid. The second strand also includes a continuous stretch of nucleotides, where the second stretch is partially identical to the target nucleic acid. The very basic structure of this ribonucleic acid is schematically shown in FIG. The first strand and the second strand preferably hybridize to each other to form a double stranded structure. Hybridization generally occurs through Watson-Crick base pairing. However, the ribonucleic acid of the invention is not necessarily limited with respect to its length relative to the double-stranded structure. Additional nucleotides will be added to each strand and each end of the strand forming RNAi. Depending on the specific sequences of the first and second stretches, hybridization or base pairing need not be complete or perfect, i.e., the first and second stretches are mismatched so that the bases are 100% paired. Not necessary. There may be one or more mismatches in the duplex. The mismatch does not affect RNAi activity when it is outside of a stretch of closely aligned nucleotides, preferably 15, 16 or 17. If the mismatch only results in less than 15 contiguous contiguous nucleotides, the activity of the RNAi molecule for down-regulation of the target mRNA of interest is typically lower than for 17 contiguous nucleotide duplexes.
第1鎖の連続ヌクレオチド第1ストレッチは標的核酸に対し、より好ましくは標的核酸の一部に対し実質的に相補的である。ここで用いる相補的とは、好ましくは第1鎖のヌクレオチド配列が標的核酸配列もしくはその一部の核酸配列とハイブリダイゼーションすることを意味する。典型的には、標的核酸配列または標的核酸は、干渉リボ核酸の作用様態に応じて、単鎖RNA、より好ましくはmRNAである。かかるハイブリダイゼーションは最も一般的にはワトソンクリック塩基対合により生ずると思われるが、しかしそれに限定されるものではない。上記第1鎖および、より特には上記第1鎖の連続ヌクレオチドの第1ストレッチが標的核酸配列に対し相補的である程度は、最高100%、最低80%であり、好ましくは80〜100%、より好ましくは85〜100%、最も好ましくは90〜100%である。最適な相補性は95〜100%であろう。この意味に於いて相補性とは、上記ヌクレオチドの範囲が、例えばヌクレオチドの80〜100%が、明示した範囲が完全にワトソンクリック塩基対合することを意味する。本発明の一局面に於いては、上記ヌクレオチドの第1ストレッチと標的RNAとの間の相補性は18〜19ヌクレオチドでなければならず、たった17ヌクレオチドのストレッチでは、配列特異的突出が2つある場合でもRNAiを媒介するにおいて機能的でない。従って、二本鎖が19ヌクレオチドまたは塩基対の長さを有している場合は、最低17ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が相補的であり、2ヌクレオチドが不一致であることが許容される。20ヌクレオチドまたは塩基対より成る二本鎖の場合は、17ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の相補性が許容可能であり、機能的であろう。同じ事は、合計17の相補的ヌクレオチドまたは塩基対を有する21ヌクレオチドまたは塩基対の2本鎖にもあてはまる。基本的には、2本鎖、即ち2本鎖構造の長さに対し求められる相補性の強さは、ここに記載の2本鎖構造によるか、または第1鎖の第1ストレッチと標的核酸の複合体により形成される複合体の融点にも依存する。 The first stretch of contiguous nucleotides of the first strand is substantially complementary to the target nucleic acid, more preferably to a portion of the target nucleic acid. As used herein, complementary preferably means that the nucleotide sequence of the first strand hybridizes with the target nucleic acid sequence or a part of the nucleic acid sequence. Typically, the target nucleic acid sequence or target nucleic acid is a single stranded RNA, more preferably mRNA, depending on the mode of action of the interfering ribonucleic acid. Such hybridization is most commonly caused by Watson-Crick base pairing, but is not limited thereto. The degree to which the first strand, and more particularly the first stretch of contiguous nucleotides of the first strand, is complementary to the target nucleic acid sequence is at most 100%, at least 80%, preferably 80-100%, more Preferably it is 85 to 100%, and most preferably 90 to 100%. Optimal complementarity will be 95-100%. Complementarity in this sense means that the range of nucleotides described above is, for example, 80-100% of the nucleotides, and the specified range is completely Watson-Crick base paired. In one aspect of the invention, the complementarity between the first stretch of nucleotides and the target RNA must be 18-19 nucleotides, with only 17 nucleotide stretches having two sequence specific overhangs. In some cases it is not functional in mediating RNAi. Thus, if the duplex has a length of 19 nucleotides or base pairs, at least 17 nucleotides or nucleotide base pairs are complementary, and 2 nucleotides are allowed to be mismatched. In the case of a duplex consisting of 20 nucleotides or base pairs, complementation of 17 nucleotides or nucleotide base pairs will be acceptable and functional. The same is true for a 21 nucleotide or base pair duplex with a total of 17 complementary nucleotides or base pairs. Basically, the strength of complementarity required for the length of the double-stranded, ie double-stranded structure, depends on the double-stranded structure described here or the first stretch of the first strand and the target nucleic acid. It also depends on the melting point of the complex formed by this complex.
本発明のリボ核酸は全て、例えば国際特許出願WO99/32619、WO00/44895およびWO01/75164に記載されているようなRNA介在干渉を起こすこと、または関係することに好適であると理解すべきである。 It should be understood that all ribonucleic acids of the present invention are suitable for causing or relating to RNA-mediated interference as described, for example, in international patent applications WO 99/32619, WO 00/44895 and WO 01/75164. is there.
干渉リボ核酸分子を本発明に従い設計する場合の第1戦略は、標的核酸に対し相補的である18または19ヌクレオチドの最適長ストレッチを有することである。18または19ヌクレオチドの上記最適長が、使用するRNAiの2本鎖構造の長さそのものである場合も本発明の範囲内である。この長さの要件は、例えば国際特許出願WO01/75164のような先行技術の技術教示とは明らかに異なる。本発明および先行技術に記載されている、上記の特徴の長さ、即ち18または19ヌクレオチドの長さを持つ干渉リボ核酸と結びつき実現できるその他設計も、本発明の範囲内である。 A first strategy when designing interfering ribonucleic acid molecules according to the present invention is to have an optimal length stretch of 18 or 19 nucleotides that is complementary to the target nucleic acid. It is also within the scope of the present invention when the optimal length of 18 or 19 nucleotides is the length of the double-stranded structure of RNAi used. This length requirement is clearly different from prior art technical teachings such as, for example, International Patent Application WO 01/75164. Other designs that can be implemented in conjunction with interfering ribonucleic acids with the lengths of the features described above, ie, 18 or 19 nucleotides, described in the present invention and the prior art are also within the scope of the present invention.
干渉リボ核酸分子を設計する場合の第2の戦略は、第1鎖に、本明細書では自由5’OH−基とも呼ばれる自由5’ヒドロキシル基を有することである。自由5’−OH基とは、第1鎖を形成している最端のヌクレオチドが、修飾されない状態、特に末端修飾されていない状態で存在していることを意味する。典型的には、第2鎖の末端の5’−ヒドロキシ基もそれぞれ非修飾の様式で存在する。より好ましい実施態様では、第1鎖および第1ストレッチの3’−末端もそれぞれ非修飾型であり、本明細書では自由3’−OH基とも呼ばれる自由OH−基を提示しており、この時5’末端のヌクレオチドの設計は前記実施態様のいずれか1項に記載のものである。かかる自由OH−基は第2鎖および第2ストレッチの3’−末端にもそれぞれ存在するのが好ましい。本発明による前記リボ核酸分子の別実施態様では、第1鎖および第1ストレッチの3’−末端それぞれ、ならびに/または第2鎖および第2ストレッチの3’−末端それぞれは3’末端に末端修飾を有しても良い。 A second strategy when designing interfering ribonucleic acid molecules is to have a free 5 'hydroxyl group, also referred to herein as a free 5' OH-group, in the first strand. A free 5'-OH group means that the terminal nucleotide forming the first strand is present in an unmodified state, particularly in a non-terminally modified state. Typically, each 5'-hydroxy group at the end of the second strand is also present in an unmodified manner. In a more preferred embodiment, the first strand and the 3′-end of the first stretch are each also unmodified, presenting a free OH group, also referred to herein as a free 3′-OH group, The design of the 5 ′ terminal nucleotide is as described in any one of the above embodiments. Such free OH-groups are preferably also present at the 3'-ends of the second chain and second stretch, respectively. In another embodiment of said ribonucleic acid molecule according to the invention, the 3′-ends of the first strand and the first stretch respectively and / or the 3′-ends of the second strand and the second stretch respectively are terminally modified at the 3 ′ end. You may have.
本明細書では、用語自由5’OH−基及び3’OH−基は、ポリヌクレオチドの5’末端および3’末端それぞれにある各最端ヌクレオチドがOH−基であることも示している。かかるOH−基はヌクレオチドの糖部分より、より好ましくは5’OH−基の場合には5’位置より、3’OH−基の場合には3’位置より生ずるか、または各末端ヌクレオチドの糖部分に結合したリン酸基から生ずるだろう。リン酸基は原則的にはヌクレオチドの糖部分のいずれかの5’OH−基に結合する。好ましくは、リン酸基は自由5’OH−基の場合には糖部分の5’OH−基、および/または自由3’OH−基の場合には糖部分の3’OH−基に結合するが、これらについても本明細書では自由5’または3’OH基と呼ぶ。 As used herein, the terms free 5'OH-group and 3'OH-group also indicate that the most terminal nucleotide at each of the 5'-end and 3'-end of the polynucleotide is an OH-group. Such OH-groups originate from the sugar moiety of the nucleotide, more preferably from the 5 'position in the case of 5'OH-groups, from the 3' position in the case of 3'OH-groups, or the sugar of each terminal nucleotide. It will result from the phosphate group attached to the moiety. The phosphate group is in principle attached to any 5'OH-group of the sugar moiety of the nucleotide. Preferably, the phosphate group is attached to the 5'OH-group of the sugar moiety in the case of a free 5'OH-group and / or to the 3'OH-group of the sugar moiety in the case of a free 3'OH-group. However, these are also referred to herein as free 5 ′ or 3 ′ OH groups.
本明細書では、ここに開示したRNAiの設計のための戦略またはRNAiの実施態様により用いる場合、末端修飾という用語は第1および/または第2鎖の最端5’または3’ヌクレオチドに化学的実在が付加されることを意味する。かかる末端修飾の例としては、とりわけても欧州特許EP 0 586 520B1またはEP 0 618 925 B1に記載の如くに逆方向(デオキシ)脱塩基(abasics)、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、CN、CF、メトキシ、イミダゾール、カルボン酸塩、チオアート、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルキアリール(alkaryl)もしくはアラルキル、OCF3、OCN、O−、S−もしくはN−アルキル;O−、S−もしくはN−アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2、N3;ヘテロシクロアルキル;ヘテロシクロアルキアリール;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノまたは置換シリルを挙げることができるが、これらに限定されない。
As used herein, when used in accordance with the RNAi design strategies or RNAi embodiments disclosed herein, the term end modification is used to describe the most extreme 5 ′ or 3 ′ nucleotide of the first and / or second strand. It means that the reality is added. Examples of such terminal modifications include, inter alia, reverse (deoxy) abasics, amino, fluoro, chloro, bromo, CN, CF as described in
本明細書で使用する場合、アルキルまたは「アルキル」を含む用語は、1ないし12個、好ましくは1ないし6個、より好ましくは1ないし2個のC原子を含む炭素原子鎖を意味する。 As used herein, the term comprising alkyl or “alkyl” means a chain of carbon atoms containing 1 to 12, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 2 C atoms.
別の末端修飾はビオチン基である。かかるビオチン基は、第1鎖および/または第2鎖の最端5’または3’ヌクレオチド、あるいはその両端に結合するのが好ましいだろう。より好ましい実施態様では、ビオチン基はポリペプチドまたはタンパク質に結合する。ポリペプチドまたはタンパク質がその他前記末端修飾のいずれかを介して結合しているものも、本発明の範囲内である。ポリペプチドまたはタンパク質は本発明の核酸分子に更なる特徴を付与してもよい。わけてもポリペプチドまたはタンパク質は他の分子に対するリガンドとして作用してもよい。前記その他分子がレセプターの場合には、レセプターの機能および活性が結合リガンドにより活性化されてもよい。レセプターは内部化(internalization)インターナリゼーション活性を示してもよく、これによりリガンドに結合した発明核酸分子の効率的なトランスフェクションを可能にするだろう。発明の核酸分子に結合させるリガンドの例はVEGFであり、それに対応するレセプターはVEGFレセプターである。 Another terminal modification is a biotin group. Such a biotin group will preferably be bound to the extreme 5 'or 3' nucleotide of the first strand and / or the second strand, or to both ends thereof. In a more preferred embodiment, the biotin group binds to the polypeptide or protein. It is also within the scope of the present invention for the polypeptide or protein to be linked via any of the other terminal modifications. The polypeptide or protein may confer additional features to the nucleic acid molecules of the invention. In particular, the polypeptide or protein may act as a ligand for other molecules. When the other molecule is a receptor, the function and activity of the receptor may be activated by a binding ligand. The receptor may exhibit internalization internalization activity, which will allow efficient transfection of the inventive nucleic acid molecule bound to the ligand. An example of a ligand that binds to a nucleic acid molecule of the invention is VEGF and the corresponding receptor is the VEGF receptor.
様々な末端修飾を有する本発明のRNAiについて考え得る各種実施態様を次表1に示す。 Various possible embodiments of the RNAi of the present invention having various terminal modifications are shown in Table 1 below.
ここの開示した各種末端修飾は、リボ核酸のヌクレオチドのリボース部分に位置することが好ましい。より具体的には、末端修飾は修飾されるヌクレオチドが末端ヌクレオチドであることを前提として2’OH、3’OHおよび5’OHを含むが、これらに限定されずにリボース部分のいずれかのOH−基と結合するか、又は置換するものとする。逆方向脱塩基(inverted abasics)は、ヌクレオ塩基部分を有さないデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドである。この種の化合物は、特にSternbergerら、(2002)、Antisense.Nucl.Ac.Drug Dev、印刷中に記載されている。 The various terminal modifications disclosed herein are preferably located in the ribose portion of the nucleotide of the ribonucleic acid. More specifically, terminal modifications include, but are not limited to, any OH of the ribose moiety, provided that the modified nucleotide is a terminal nucleotide. -It shall be bound to or substituted with a group. Inverted abasics are nucleotides of either deoxyribonucleotides or ribonucleotides that do not have a nucleobase moiety. Such compounds are described in particular in Sternberger et al. (2002), Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev, printing.
いずれの前記末端修飾も表1に記載のRNAiの各種実施態様と結びつけて用いても良い。これに関連して、好ましくは末端修飾を有している、より好ましくは5’末端で有していることによりセンス鎖が不活性化されているここに記載のRNAiまたは実施態様は、特に有利である。この利点は、ここに記載のリボ核酸第2鎖に対応するセンス鎖の不活性化に起因するものであり、そうしない場合には細胞内にある無関係の単鎖RNAに干渉するだろう。それ故に、発現、およびより具体的には細胞のトランスクリプトームの翻訳パターンにより特異的に影響する。この効果はオフターゲット(off-target)効果とも呼ばれる。表1を見ると、実施態様7および8として描かれたこれら実施態様が上記の意味に於いて特に有利であるが、それは修飾によって−標的非特異的な−RNAi部分(第2鎖である)が不活性化され、その結果本発明のRNAiを用いて特定のリボ核酸およびタンパク質をそれぞれノックアウトする細胞または同様のシステムでの単鎖RNAと第2鎖との非特異的な相互作用を減らせるからである。
Any of the above terminal modifications may be used in combination with various embodiments of RNAi shown in Table 1. In this context, the RNAi or embodiments described herein, preferably having a terminal modification, more preferably having a sense strand inactivated by having at the 5 ′ end, are particularly advantageous. It is. This advantage is due to inactivation of the sense strand corresponding to the ribonucleic acid second strand described herein, otherwise it will interfere with irrelevant single-stranded RNA in the cell. Therefore, it specifically affects expression and more specifically the translational pattern of the cellular transcriptome. This effect is also called an off-target effect. Looking at Table 1, these embodiments depicted as
本発明に関する第3の戦略は2本鎖構造を含むリボ核酸を実現することであり、この場合の2本鎖構造は第1鎖と第2鎖とを含み、この時第1鎖は連続ヌクレオチドの第1ストレッチを含み、かつ前記第1ストレッチは少なくとも一部が標的核酸に対し相補的であり、そして第2鎖は連続ヌクレオチドの第2ストレッチを含み、この時前記第2ストレッチは少なくとも一部が標的核酸と同一であり、そして2本鎖構造の端部は平滑である。本記載と関連つけて用いる場合には、2本鎖構造という用語は二本鎖とも称される。従ってRNAiのこの設計は、例えば3’−突出を開示した国際特許出願WO 01/75164の中に明示されている、Tuschlらのものとは明らかに異なる。本明細書で用いる場合、突出とは一方の鎖の少なくとも一端が、共に2本鎖を形成しているもう一方の鎖、本明細書ではカウンター鎖とも呼ぶ鎖の対応する端部よりも長い2本鎖構造を表している。好ましくは、第1ストレッチは第1鎖と同一であり、第2ストレッチは第2鎖と同一である。 A third strategy for the present invention is to realize a ribonucleic acid containing a double-stranded structure, where the double-stranded structure comprises a first strand and a second strand, where the first strand is a continuous nucleotide Wherein the first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid and the second strand comprises a second stretch of contiguous nucleotides, wherein the second stretch is at least partially Are identical to the target nucleic acid, and the ends of the double-stranded structure are smooth. When used in connection with the present description, the term double stranded structure is also referred to as double stranded. This design of RNAi is therefore clearly different from that of Tuschl et al., E.g. specified in the international patent application WO 01/75164 which disclosed 3'-overhangs. As used herein, an overhang is at least one end of one strand that is longer than the corresponding end of the other strand that together form a double strand, also referred to herein as a counter strand. This represents a chain structure. Preferably, the first stretch is identical to the first strand and the second stretch is identical to the second strand.
平滑端を持つRNAiの有効性および各リボ核酸のそれぞれ第1もしくは第2鎖のいずれか、または両鎖の端部修飾の利点を考慮すると、両方の設計原理を組み合わせることが好ましい。換言すると、平滑端RNAiに表1に示したような末端修飾スキームを持たせることは、本発明の範囲内である。 Considering the effectiveness of RNAi with blunt ends and the advantages of either the first or second strand of each ribonucleic acid, or the end modification of both strands, it is preferable to combine both design principles. In other words, it is within the scope of the present invention to have blunt end RNAi have a terminal modification scheme as shown in Table 1.
本発明に関する第4の戦略は、リボ核酸の5’−末端に突出を持たせることである。より具体的には、かかる突出は原則的には本発明によるリボ核酸の第1鎖および第2鎖のいずれか、または両方に存在できる。前記突出の長さは、1ヌクレオチドと短いもの、および2ないし8ヌクレオチド長、好ましくは2、4、6または8ヌクレオチドである。5’突出が本明細書によるリボ核酸の第1鎖および/または第2鎖上にある場合も、本発明の範囲内である。突出を形成するヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその連続物でよい。 A fourth strategy for the present invention is to have an overhang at the 5'-end of the ribonucleic acid. More specifically, such overhangs can in principle be present in either or both of the first and second strands of the ribonucleic acid according to the invention. The overhangs are as short as 1 nucleotide and 2 to 8 nucleotides in length, preferably 2, 4, 6 or 8 nucleotides. It is also within the scope of the invention if the 5 'overhang is on the first and / or second strand of a ribonucleic acid according to the present description. The nucleotides that form the overhangs can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, or a sequence thereof.
突出は少なくとも1つデオキシリボヌクレオシドを含むことが好ましく、前記1つのデオキシリボヌクレオチドはその最5’末端にあるのが好ましい。発明のリボ核酸の各カウンター鎖の3’末端が突出、より好ましくはデオキシリボ核酸の突出を有しないことも本発明の範囲内である。この場合も、発明のリボ核酸は表1に関係し概要を示した末端修飾スキームおよび/またはここに概要を示した末端修飾を含んでもよい。 The overhang preferably comprises at least one deoxyribonucleoside, and the one deoxyribonucleotide is preferably at its 5 'end. It is also within the scope of the present invention that the 3 'end of each counter strand of the inventive ribonucleic acid has no overhang, more preferably no deoxyribonucleic acid overhang. Again, the ribonucleic acids of the invention may comprise the end modification scheme outlined in relation to Table 1 and / or the end modifications outlined here.
本出願の干渉リボ核酸の設計に関する第5の戦略は、少なくとも1つの鎖、より具体的には本発明のリボ核酸の連続ヌクレオチドのストレッチの1つの上に特定パターンの修飾ヌクレオチドを形成せしめることである。前記ヌクレオチドの修飾の種類は、ここに開示した干渉RNAを設計するために他の戦略と関係して論じたものと同一でもよく、そしてより具体的には末端修飾のために、または末端修飾としてここに記載した種類の修飾、例えば本出願によるリボ核酸を形成する少なくとも1ヌクレオチドのリボース部分での逆方向脱塩基、メトキシまたはアミノ等である。前記ヌクレオチドの修飾は本明細書記載のいずれかの形態の修飾でよく、より具体的には本明細書に末端修飾として記載される種類の修飾でよいが、いわゆる末端修飾は末端ヌクレオチドに局在する必要はないことに注意すべきである。むしろ修飾は末端ヌクレオチド以外に行う。かかる条件では、修飾は修飾ヌクレオチドのリボース部分に結合するのが好ましく、より更に好ましくはリボース部分の2’位置に結合する。 A fifth strategy for the design of interfering ribonucleic acids of the present application is to form a specific pattern of modified nucleotides on at least one strand, more specifically one of the contiguous stretches of ribonucleic acids of the present invention. is there. The type of nucleotide modification may be the same as discussed in connection with other strategies for designing the interfering RNAs disclosed herein, and more specifically for terminal modifications or as terminal modifications. Modifications of the type described here, such as reverse abasification at the ribose part of at least one nucleotide forming the ribonucleic acid according to the present application, methoxy or amino and the like. The nucleotide modification may be any form of modification described herein, and more specifically the type of modification described herein as a terminal modification, but the so-called terminal modification is localized to the terminal nucleotide. Note that there is no need to do. Rather, modifications are made at other than the terminal nucleotide. Under such conditions, the modification preferably binds to the ribose moiety of the modified nucleotide, and even more preferably binds to the 2 'position of the ribose moiety.
この戦略に従い設計されたリボ核酸も、ここに開示した他の設計戦略のいずれかにより、本出願のリボ核酸に付与される特徴を有することが、また本発明の範囲内である。従って、あるパターンの修飾ヌクレオチドを有する干渉リボ核酸は末端修飾を有し、末端修飾スキーム計画は平滑端であっても、または5’突出を有しても良く、あるいはこれら要素または特徴の2つ以上の組み合わせでもよい。 It is also within the scope of the present invention that ribonucleic acids designed according to this strategy also have the characteristics conferred on the ribonucleic acid of the present application by any of the other design strategies disclosed herein. Thus, interfering ribonucleic acids with a pattern of modified nucleotides have terminal modifications, and the terminal modification scheme may be blunt ended or have a 5 ′ overhang, or two of these elements or features A combination of the above may also be used.
末端修飾または修飾パターンとして表される前記修飾とは別に、リボ核酸の主鎖(backbone)についてヌクレオチド間に各種連結を形成せしめることで更に修飾してもよい。かかる各種連結としては、特に欧州特許EP 0 586 520 B1および欧州特許EP 0 618 925 B1に記載のものがある。本発明において特に興味深いものは、リボオリゴヌクレオチドに高いヌクレアーゼ耐性を付与することが示されているリボ核酸主鎖の内部修飾である。好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの修飾はヌクレオチドのリボース部分の2’−OH−基のメトキシル化である。
Apart from the above modifications expressed as terminal modifications or modification patterns, the backbone of ribonucleic acid may be further modified by forming various linkages between nucleotides. Examples of such various linkages include those described in
好適実施態様では両鎖、より具体的には第1ストレッチおよび第2ストレッチの両方が、前記鎖およびストレッチを形成するヌクレオチドにこの種の修飾が存在する。しかし、第1鎖および第1ストレッチそれぞれ、または第2鎖および第2ストレッチそれぞれ一方がこの特別なヌクレオチド修飾パターンを示す場合も、本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、修飾ヌクレオチド群またはヌクレオチドのフランキング群という用語は、1程度のヌクレオチド、即ち1以上のヌクレオチドを含むか、または表している。 In a preferred embodiment, both strands, more specifically both the first stretch and the second stretch, have this type of modification in the nucleotide forming the strand and the stretch. However, it is also within the scope of the present invention where either the first strand and the first stretch, respectively, or the second strand and the second stretch, respectively, exhibit this particular nucleotide modification pattern. As used herein, the term modified nucleotide group or nucleotide flanking group includes or represents about one nucleotide, ie, one or more nucleotides.
連続ヌクレオチドのストレッチを考える場合、ストレッチを形成するヌクレオチドは、単一ヌクレオチドまたは標準的なリン酸ジエステル結合を介して、または少なくとも一部がホスホロチオナート結合を介して相互に共有結合しているヌクレオチド群がかかる種類の修飾を示すような修飾パターンを取ってもよい。かかるヌクレオチド、またはここでは修飾ヌクレオチド群とも呼ばれるヌクレオチド群が前記ストレッチの5’−末端または3’−末端を形成しない場合には、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド群の修飾を持たないヌクレオチドの両側にヌクレオチドまたはヌクレオチド群が続く。しかしこの種のヌクレオチドまたはヌクレオチド群が別の修飾を有してもよいことに注意すべきである。この種のヌクレオチドまたはヌクレオチド群は、本明細書ではヌクレオチドのフランキング群ととも呼ばれる。修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド群それぞれのこの配列、および非修飾または異なる修飾が施されたヌクレオチド、あるいは非修飾または異なる修飾が成されたヌクレオチド群は1回、または複数回繰り返しても良い。好ましくは、配列は1回より多く繰り返す。より明瞭にすることを目的として、次にパターンについて、修飾ヌクレオチドの群または非修飾ヌクレオチドの群を一般的に参照しながら詳しく説明するが、この場合前記の各群は実際には1ヌクレオチド程度のヌクレオチドを含んでもよい。ここで用いる非修飾ヌクレオチドとは各ヌクレオチドまたはヌクレオチド群を形成しているヌクレオチドに前記修飾がないこと、あるいは修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド群のそれとは異なる修飾を有することを意味する。 When considering stretches of contiguous nucleotides, the nucleotides forming the stretch are covalently linked to each other via a single nucleotide or a standard phosphodiester bond, or at least partially via a phosphorothionate bond. Modification patterns may be taken such that the nucleotide group exhibits this type of modification. Nucleotides or nucleotides on either side of the nucleotide or nucleotides without modification of the nucleotide group if such nucleotides, or nucleotide groups, also referred to herein as modified nucleotide groups, do not form the 5'-end or 3'-end of the stretch The group continues. However, it should be noted that this type of nucleotide or group of nucleotides may have other modifications. This type of nucleotide or group of nucleotides is also referred to herein as a nucleotide flanking group. This sequence of each modified nucleotide or group of modified nucleotides, and nucleotides that have undergone unmodification or different modification, or groups of nucleotides that have undergone unmodification or different modification, may be repeated once or multiple times. Preferably, the sequence repeats more than once. For the sake of clarity, the pattern will now be described in detail with a general reference to groups of modified nucleotides or groups of unmodified nucleotides, where each group is actually about 1 nucleotide. Nucleotides may be included. As used herein, unmodified nucleotide means that the nucleotide forming each nucleotide or nucleotide group does not have the above-mentioned modification, or has a modification different from that of the modified nucleotide and nucleotide group.
非修飾ヌクレオチドが実際には修飾ヌクレオチドの修飾とは別の方法で修飾される非修飾ヌクレオチドの修飾が、前記非修飾ヌクレオチドを形成する各種ヌクレオチドまたはヌクレオチドの各種フランキング群に関し同一である場合も、または異なる場合さえも本発明の範囲内である。 Even if the modification of the unmodified nucleotide in which the unmodified nucleotide is actually modified by a method different from the modification of the modified nucleotide is the same for the various nucleotides or the various flanking groups of nucleotides that form the unmodified nucleotide, Or even different ones are within the scope of the present invention.
修飾および非修飾ヌクレオチドのパターンとしては、鎖またはストレッチの5’−末端ヌクレオチドがヌクレオチド修飾群から開始しても、またはヌクレオチドの非修飾群から開始してもよい。しかし、別の実施態様では、5’−末端ヌクレオチドがヌクレオチドの非修飾群で形成することも可能である。 As a pattern of modified and unmodified nucleotides, the 5'-terminal nucleotide of the strand or stretch may start from a nucleotide modified group or from an unmodified group of nucleotides. However, in another embodiment, the 5'-terminal nucleotide can be formed of an unmodified group of nucleotides.
この種のパターンを、干渉RNAの第1ストレッチもしくは第2ストレッチ、またはその両方で実現してもよい。siRNAの機能には、siRNA二本鎖の標的−相補的な鎖に5’リン酸基があることが必要であることに注意が必要であり、このことは細胞が自由5’OH(リン酸化できる)を介してsiRNAの真偽性をチェックし、そしてそのような真性siRNAのみを標的RNAの破壊に方向付けすることを示唆している(Nykanen,et al。(2001年)、Cell 107、309〜21)。 This type of pattern may be achieved with a first stretch or a second stretch of interfering RNA, or both. Note that the function of siRNA requires that the 5 ′ phosphate group be present in the target-complementary strand of the siRNA duplex, which means that the cell is free 5′OH (phosphorylated). The authenticity of siRNAs, and suggests directing only such genuine siRNAs to target RNA destruction (Nykanen, et al. (2001), Cell 107, 309-21).
第1ストレッチはある種類のパターンのヌクレオチド修飾および非修飾群、即ち修飾ヌクレオチド群およびヌクレオチドのフランキング群のパターンを示し、一方第2ストレッチはこの種類のパターンを示さないことが好ましい。これは第1ストレッチが、RNA干渉現象の基礎を成す標的−特異的分解プロセスにとって実際的により重要であり、かつ特異性の理由から第2ストレッチはRNA干渉の媒介において機能しないように化学的に修飾できる限りに於いて有用であろう。 Preferably, the first stretch shows a pattern of a certain type of nucleotide modified and unmodified group, ie a modified nucleotide group and a nucleotide flanking group, while the second stretch does not show this type of pattern. This is chemically more important so that the first stretch is practically more important for the target-specific degradation process underlying the RNA interference phenomenon and for reasons of specificity the second stretch does not function in mediating RNA interference. It will be useful as long as it can be modified.
しかし、第1ストレッチと第2ストレッチが共にこの種のパターンを有するものも本発明の範囲内である。修飾および非修飾のパターンは第1ストレッチおよび第2ストレッチの両方に対し同一であるのが好ましい。 However, it is also within the scope of the present invention that both the first stretch and the second stretch have this type of pattern. The modified and unmodified patterns are preferably the same for both the first stretch and the second stretch.
好適実施態様では、第2ストレッチを形成し、且つ第1ストレッチのヌクレオチドの修飾群に対応しているヌクレオチドの群もまた修飾されており、一方第2ストレッチの、または第2ストレッチを形成するヌクレオチドの非修飾群は第1ストレッチの、または第1ストレッチを形成するヌクレオチドの非修飾群に対応している。この可能性を図2Aに概略的に示した。さらには、第1ストレッチおよび第1鎖それぞれの修飾パターンが第2ストレッチおよび第2鎖それぞれの修飾パターンに対して位相シフトするものがある。好ましくは、第1鎖のヌクレオチドの修飾群が第2鎖のヌクレオチドの非修飾群と対応し、その逆もまた同じになるようにシフトするのが好ましい。この可能性を図2Bに示す。修飾のパターンの位相シフトが完全ではないが、図2に例示するように重複するものも、本発明の範囲内である。 In a preferred embodiment, the group of nucleotides forming the second stretch and corresponding to the modified group of nucleotides of the first stretch is also modified, while the nucleotides forming the second stretch or of the second stretch This unmodified group corresponds to the unmodified group of the first stretch or of the nucleotides forming the first stretch. This possibility is shown schematically in FIG. 2A. Furthermore, there is one in which the modification pattern of each of the first stretch and the first strand is phase-shifted with respect to the modification pattern of each of the second stretch and the second strand. Preferably, the modified group of first strand nucleotides corresponds to the unmodified group of second strand nucleotides and vice versa. This possibility is illustrated in FIG. 2B. Although the phase shift of the modification pattern is not perfect, it is also within the scope of the present invention to overlap as illustrated in FIG.
好適実施態様では、鎖およびストレッチそれぞれの末端にある第2ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドであるか、または非修飾ヌクレオチド群の先頭である。好ましくは、この非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの非修飾群は第1鎖および第2鎖それぞれの5’−末端に位置しており、より好ましくは第1鎖の5’−末端に位置する。更に好適な実施態様では、非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの非修飾群は第1鎖および第1ストレッチそれぞれの5’−末端に位置する。好適実施態様では、修飾および非修飾ヌクレオチドは1つずつ交互に配置するパターンを構成する。 In preferred embodiments, the second nucleotide at the end of each strand and stretch is an unmodified nucleotide or is the beginning of an unmodified nucleotide group. Preferably, the unmodified nucleotide or unmodified group of nucleotides is located at the 5'-end of each of the first and second strands, more preferably at the 5'-end of the first strand. In a more preferred embodiment, the unmodified nucleotide or unmodified group of nucleotides is located at the 5'-end of each first strand and first stretch. In a preferred embodiment, the modified and unmodified nucleotides constitute an alternating pattern.
本発明のこの局面に関する更に好適な実施態様では、問題の干渉リボ核酸は2本の鎖を含み、このとき2’−O−メチル修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチド、好ましくは2’−O−メチル修飾されていないヌクレオチドが両方の鎖に、交互になるように組み込まれており、即ち1ヌクレオチド毎に2’−O−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとなる。換言すると、第1鎖では1つの2’−O−メチル修飾ヌクレオチドの後に非修飾ヌクレオチドが続き、その次に2’−O−メチル修飾ヌクレオチドが続き、これを繰り返すことを意味している。2’−O−メチル修飾および非修飾から成る同一の配列が第2鎖にも存在しており、この時第1鎖の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドが第2鎖の非修飾ヌクレオチドと塩基対合し、その逆も同様になるような位相シフトがあることが好ましい。この特別な配置、即ち両鎖の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが塩基対合することは、短い干渉リボ核酸、即ち短い塩基対合2本鎖リボ核酸の場合には特に好ましいが、それは本発明を特定の理論と結びつけることを望むわけではないが、2’−O−メチル修飾ヌクレオチドが2塩基対合するとその間に特別な反発力が働き、かかる二本鎖、特に短い二本鎖を不安定にすると推定されるからである。前記特別な配置に関しては、アンチセンス鎖が5’端について2’−O−メチル修飾ヌクレオチドから開始し、従って第2ヌクレオチドが非修飾型の場合は、第3、第5、第7といったヌクレオチドは再び2’−O−メチル修飾されており、一方、第2、第4、第6、第8といったヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。この場合も特別な理論と結びつけることを望まないが、修飾を含まないとするアンチセンス鎖の5’末端にある第2、場合によっては第4、第6、第8および/または同様の位置は特別重要であるのに対し、5’最末端ヌクレオチド、即ちアンチセンス鎖の最初の5’末端ヌクレオチドはかかる修飾を示すものであり、アンチセンス鎖の第1、場合により第3、第5および同様の奇数位置は修飾されると考えられる。別の実施態様では、修飾および非修飾ヌクレオチドそれぞれの修飾および非修飾それぞれは、本明細書に記載のいずれのものでもよい。 In a further preferred embodiment relating to this aspect of the invention, the interfering ribonucleic acid in question comprises two strands, wherein 2′-O-methyl modified nucleotides and unmodified nucleotides, preferably 2′-O-methyl modifications. Unfinished nucleotides are incorporated alternately into both strands, ie, every nucleotide becomes 2'-O-methyl modified nucleotides and unmodified nucleotides. In other words, it means that in the first strand one 2'-O-methyl modified nucleotide is followed by an unmodified nucleotide, followed by a 2'-O-methyl modified nucleotide, and this is repeated. The same sequence consisting of 2'-O-methyl modified and unmodified is also present in the second strand, where the first strand 2'-O-methyl modified nucleotide is the base and the second strand unmodified nucleotide and base There is preferably a phase shift that matches and vice versa. This particular arrangement, ie, the base pairing of 2′-O-methyl modified nucleotides and unmodified nucleotides on both strands, is particularly true in the case of short interfering ribonucleic acids, ie short base-paired double-stranded ribonucleic acids. Although preferred, it is not desirable to link the present invention to a particular theory, but when 2'-O-methyl modified nucleotides are double base paired, there is a special repulsion between them, such double strands, especially short This is because the double strand is presumed to be unstable. With respect to the special configuration, if the antisense strand starts with a 2′-O-methyl modified nucleotide for the 5 ′ end, and thus the second nucleotide is unmodified, the third, fifth, seventh nucleotides are Again 2′-O-methyl modified, while the second, fourth, sixth and eighth nucleotides are unmodified nucleotides. Again, we do not wish to be bound by any particular theory, but the second, and possibly the fourth, sixth, eighth and / or similar positions at the 5 ′ end of the antisense strand that do not contain modifications are Of particular importance, the 5′-most nucleotide, ie the first 5′-terminal nucleotide of the antisense strand, is indicative of such a modification and is the first, optionally the third, fifth and the like of the antisense strand. The odd positions of are considered to be modified. In another embodiment, each modified and unmodified nucleotide of each modified and unmodified nucleotide can be any of those described herein.
これに限定されないが、発明のリボ核酸の、二本鎖とも呼ばれる2本鎖構造は、第1鎖および第2鎖それぞれによって、または連続ヌクレオチドの第1および第2ストレッチによって形成される。第1ストレッチおよび第2ストレッチそれぞれの長さは、典型的には約15〜約23、好ましくは約17〜21、より好ましくは18もしくは19塩基である。これに関連して、30ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは21ヌクレオチド未満の長さは、基本的にRNA干渉およびインターフェロン反応を示すことができ、インターフェロン反応を発生できる生物学的システムをもたらすことはない。その理由は、30塩基対より長い2本鎖RNAが結合し、プロテインキナーゼPKRおよび2’、5’−オリゴアデニニレート合成酵素を活性化した時に、ある種の細胞が大きな生理学的変化を被ったという観察に基づいている。活性化PKRはeIF2aのリン酸化を介して翻訳を停止、活性化2’,5’−ASはmRNAの分解を引き起こす。これら作用は、標的特異的な表現形のノックダウンの効果を無効にしてしまうため、標的の検証および動物モデルについては望ましくない。 Without being limited thereto, the double-stranded structure, also called double-stranded, of the inventive ribonucleic acid is formed by the first and second strands, respectively, or by the first and second stretches of contiguous nucleotides. The length of each of the first stretch and the second stretch is typically about 15 to about 23, preferably about 17 to 21, more preferably 18 or 19 bases. In this connection, a length of less than 30 nucleotides, preferably less than 21 nucleotides, can basically exhibit RNA interference and an interferon response, resulting in a biological system capable of generating an interferon response. Absent. The reason is that certain cells undergo major physiological changes when double-stranded RNA longer than 30 base pairs binds and activates protein kinase PKR and 2 ', 5'-oligoadenylate synthase. Is based on the observation that Activated PKR stops translation via phosphorylation of eIF2a, and activated 2 ', 5'-AS causes mRNA degradation. These effects are undesirable for target validation and animal models because they negate the effects of target-specific phenotypic knockdown.
本発明の干渉リボ核酸の設計に関する第6の戦略によれば、リボ核酸は2本鎖構造を含み、このとき2本鎖構造は第1鎖および第2鎖を含むものであって、第1鎖は連続ヌクレオチドの第1ストレッチを含み、そして前記第1ストレッチは少なくとも一部が標的核酸に対し相補的であり、そして第2鎖は連続ヌクレオチドの第2ストレッチを含み、前記第2ストレッチは少なくとも一部が標的核酸と同一であり、そして第1鎖の末端の1つと第2鎖の末端の1つがループ構造により連結している。 According to a sixth strategy for designing an interfering ribonucleic acid according to the present invention, the ribonucleic acid comprises a double-stranded structure, wherein the double-stranded structure comprises a first strand and a second strand, The strand includes a first stretch of contiguous nucleotides, and the first stretch is at least partially complementary to the target nucleic acid, and the second strand includes a second stretch of contiguous nucleotides, and the second stretch is at least A part is identical to the target nucleic acid, and one end of the first strand and one end of the second strand are connected by a loop structure.
実施態様の1つでは、ループ構造は非核酸ポリマーを含む。かかる非核酸ポリマーはポリエチレングリコールまたは同様のポリマーでもよい。非核酸ポリマーは、原則的にはポリヌクレオチドを含まず、そして連結する2本の鎖を実際に相互にハイブリダイゼーションさせることができるポリマーを含む群から選択されるだろう。かかるハイブリダイゼーションを可能にするために、相互にハイブリダイゼーションする2本のストレッチを連結する分子またはその部分は、分子が曲がれるようにして2本のストレッチが接近できるようにし、且つハイブリダイゼーション可能な3次元的に配置できる特定の分子構造または分子柔軟性を持たなければならない。この種の分子または分子部分は実際にはヒンジとして機能する。原則的には、この条件を満たす分子であればいずれの分子も本発明に用いることができるだろう。ポリエチレングリコール以外にはアミノ酸をベースとする分子を使用してもよい。この種のアミノ酸をベースとする分子はホモポリマーまたはヘテロポリマーのいずれでもよい。有用例は7個のグリシン残基から成るホモポリマーであり、これらグリシン残基は2本のストレッチを必用に応じて近接させてハイブリダイゼーションさせるのに必用なヒンジを生成できる。このグリシンをベースとするヒンジは、例えばGuan K.L.とDixon J.E.(1991年)、Anal Biochem.192、262に記載されている。別の実施態様では、ヒンジは当分野既知のクラウンエーテルにより形作られても良い。 In one embodiment, the loop structure comprises a non-nucleic acid polymer. Such non-nucleic acid polymers may be polyethylene glycol or similar polymers. The non-nucleic acid polymer will in principle be selected from the group comprising no polymer and a polymer that can actually hybridize the two strands that are linked together. In order to allow such hybridization, a molecule or portion thereof that connects two stretches that hybridize to each other can be bent so that the two stretches are accessible and hybridizable. It must have a specific molecular structure or molecular flexibility that can be dimensionally arranged. This type of molecule or molecular part actually functions as a hinge. In principle, any molecule that satisfies this condition could be used in the present invention. In addition to polyethylene glycol, amino acid-based molecules may be used. Such amino acid-based molecules may be either homopolymers or heteropolymers. A useful example is a homopolymer of 7 glycine residues, which can generate the hinge necessary to hybridize two stretches as close as necessary. This glycine-based hinge is described, for example, in Guan K.L. and Dixon J.E. (1991), Anal Biochem. 192, 262. In another embodiment, the hinge may be formed from crown ethers known in the art.
別実施態様では、ループは核酸を含む。本明細書で使用する場合、ElayadiとCorey(2001年)Curr Opin Investig Drugs.2(4):558〜61.総説;Orum and Wengel(2001)Curr Opin Mol Ther.3(3):239〜43;に記載されているLNA、およびPNAは核酸と見なされ、そしてループ形成ポリマーとして用いても良い。基本的には第1鎖の5’−末端は第2鎖の3’−末端と連結するだろう。あるいは、第1鎖の3’−末端が第2鎖の5’−末端に連結してもよい。前記ループ構造を形成しているヌクレオチドの配列は一般的には重要とは考えられていない。しかし、かかるループを形成するヌクレオチド配列の長さは立体上の理由から重要と思われている。従って必用とされるループ構造を形成するのに適当な最低長は4ヌクレオチドと考えられている。原則的には、ヒンジまたはハイブリダイゼーションする両ストレッチ間のヒンジまたは連結を形作るヌクレオチドの最大数に制限はない。しかし、ポリヌクレオチドが長くなるほど、二次および三次構造が形成されやすくなり、その結果ストレッチに求められる方向性に影響が出てくる。好ましくはヒンジを形成するヌクレオチドの最大数は約12ヌクレオチドである。上記いずれかの設計と上記6つの戦略とを組み合わせること、即ち2本の鎖をループ構造または同様の構造を通して折り返す(ループ)ことができる様に共有結合により連結することもまた本明細書の開示の範囲内である。 In another embodiment, the loop comprises a nucleic acid. As used herein, Elayadi and Corey (2001) Curr Opin Investig Drugs. 2 (4): 558-61. Review; Orum and Wengel (2001) Curr Opin Mol Ther. 3 (3): 239-43 LNAs and PNAs described in; are considered nucleic acids and may be used as loop-forming polymers. Basically, the 5'-end of the first strand will be linked to the 3'-end of the second strand. Alternatively, the 3'-end of the first strand may be linked to the 5'-end of the second strand. The sequence of nucleotides forming the loop structure is generally not considered important. However, the length of the nucleotide sequence forming such a loop appears to be important for steric reasons. Therefore, the minimum length suitable for forming the required loop structure is considered to be 4 nucleotides. In principle, there is no limit to the maximum number of nucleotides that form a hinge or linkage between hinges or both stretches that hybridize. However, the longer the polynucleotide, the easier it is to form secondary and tertiary structures, which in turn affects the directionality required for stretching. Preferably the maximum number of nucleotides forming the hinge is about 12 nucleotides. It is also possible to combine any of the above designs with the above six strategies, ie, to covalently link the two strands so that they can be folded (looped) through a loop structure or similar structure. Is within the range.
本発明者は驚くべきことにループをアンチセンス鎖、即ち本発明のリボ核酸の第1鎖の3’に配置すると、この種のRNAの活性がアンチセンス鎖の5’にループを配置した場合に比べ高くなることを見いだした。従って、アンチセンス鎖およびセンス鎖、即ちそれぞれ第1鎖および第2鎖に対する特別なループの配置が重要であり、従ってこのことは方向性が重要ではないという従来表明されていた考え方とは対照的である。しかし、このことは、ここに示す実験結果を考えれば真実ではないと考えられる。先行技術での理解は、RNAiがその間にループによらず連結されるRNAiが生成されるプロセッシングにかけられることを想定していた。しかし、たとえそうであっても、アンチセンスの3’に配置されたループを有する構造に明瞭に観察される活性増加を説明できない。この限りに於いては、この種の小型干渉RNAiの5’から3’方向における好ましい配置は、第2鎖−ループ−第1鎖である。各構築物は好適ベクターシステム内に組み込んでも良い。好ましくは、ベクターはRNAiの発現に関するプロモータを含む。好ましくは、各プロモータはpol IIIであり、より好ましくは、プロモータはGood et al.(1997年)Gene Ther、4、45〜54に記載のU6、H1、7SKプロモータである。 The inventor surprisingly placed the loop in the antisense strand, ie, 3 ′ of the first strand of the ribonucleic acid of the present invention, and the activity of this type of RNA placed the loop in 5 ′ of the antisense strand. I found it to be higher than Thus, the arrangement of special loops for the antisense and sense strands, i.e. the first and second strands, respectively, is important, and this is in contrast to the previously asserted notion that directionality is not important. It is. However, this is not true considering the experimental results shown here. Prior art understanding has assumed that RNAi is subjected to processing in which RNAi is generated that is linked in a loop-independent manner. However, even so, it cannot explain the increased activity clearly observed in structures with loops located 3 'to the antisense. In this regard, the preferred arrangement of this type of small interfering RNAi in the 5 'to 3' direction is second strand-loop-first strand. Each construct may be incorporated into a suitable vector system. Preferably, the vector contains a promoter for expression of RNAi. Preferably, each promoter is pol III, more preferably the promoter is a U6, H1, 7SK promoter as described in Good et al. (1997) Gene Ther, 4, 45-54.
干渉RNA、従ってmRNAの様なコーディングヌクレオチドのノックダウンもしくはノックアウトの概念の応用性が広範であるが故に、かかるRNAを生ずる遺伝子を、本発明のリボ核酸分子の何れかを用いその発現を修飾してもよい。このメカニズムは基本的かつ広く応用できるため、このメカニズムに基づいて、遺伝子のノックダウンまたはノックアウトを包含する応用を実現できる。好ましい応用は、発明のリボ核酸を標的の検証に使用することである。本明細書で使用する場合、標的の検証とはあるDNA、RNAまたはタンパク質分子が生物学的プロセスに直接関係していることを証明するためのステップをとることを包含している工程を意味し、好ましくは病気または標準的でない−原因的な−状態に関わるプロセスであり、従って好適な標的は新規の治療化合物の開発である。配列の相同性研究により遺伝子を標的のファミリーに分類することに成功している。病気に関して重要な役割を果たすものがこれら標的のどれであるか解明すること、続く医薬品開発に利用すべきものを解明するための厖大な作業は効率的に行う必用がある。それ故に遺伝子発現のノックダウンは50〜100%、好ましくは90%に下げて、表現形への有意な影響を調べる必用がある。その他の例では、遺伝子によっては、表現形の発生にせいぜい20%のノックアウトでも十分な場合がある。表現形は機能的RNAi分子を含む細胞を、機能的でないRNAi分子を含む細胞とを比較し画定できる。これにより、タンパク質の機能が一部のみ阻害された状態でも、有意な読み出しが保障されるだろう。一般的には、mRNAの減少と表現形の変化の大きさとの間に直線的な関連性はない。一部のタンパク質に関しては、タンパク質が約20%減少しただけでも表現形に大きな変化が生じるが、一方他の遺伝子およびRNAでは、それぞれ5ないし10%程度のタンパク質が残っていても観察される表現形は十分維持される。 Due to the wide applicability of the concept of knocking down or knocking out coding nucleotides such as interfering RNA and thus mRNA, the gene that produces such RNA can be modified in its expression using any of the ribonucleic acid molecules of the present invention. May be. Since this mechanism can be basically and widely applied, applications including gene knockdown or knockout can be realized based on this mechanism. A preferred application is to use the inventive ribonucleic acid for target validation. As used herein, target validation means a process that involves taking steps to prove that a DNA, RNA or protein molecule is directly involved in a biological process. , Preferably a process involving disease or non-standard-causal conditions, and thus a suitable target is the development of new therapeutic compounds. Sequence homology studies have successfully classified genes into target families. Elucidating which of these targets are those that play an important role in disease, and enormous work to elucidate what should be used for the subsequent drug development must be done efficiently. Therefore, knockdown of gene expression should be reduced to 50-100%, preferably 90%, to examine the significant effect on phenotype. In other examples, for some genes, no more than 20% knockout may be sufficient for phenotypic development. A phenotype can be defined by comparing cells containing functional RNAi molecules with cells containing non-functional RNAi molecules. This will ensure significant readout even when the protein function is only partially inhibited. In general, there is no linear relationship between mRNA loss and the magnitude of phenotypic change. For some proteins, a significant change in phenotype occurs even if the protein is reduced by only about 20%, whereas in other genes and RNA, the expression that is observed even if about 5 to 10% of the protein remains. The shape is well maintained.
本発明のリボ核酸分子の更なる用途は、医薬の製造への使用、または医薬としての使用である。かかる医薬は、遺伝子およびその産物が病気の発症、原因または進行と関係している、例えば癌の様な病気または状態の治療および/または予防のいずれかに使用できる。更に、かかる医薬は遺伝子産物の存在または過剰発現が病理学的表現形の原因である病気の処置にも用いることができる。好適実施態様では、病気は対応する生物学的に活性であるRNAiの適用または投与により機能を獲得することを特徴とし、そして処置される。ここに開示したリボ核酸を含む医薬により処置される病気または状態は、癌、心臓病、代謝疾患、皮膚疾患、炎症性疾患、免疫系障害、および自己免疫疾患を含む群から選択されてもよいだろう。各種形態の癌としては、固形癌および膠芽腫の様な造血系の腫瘍、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌および白血病を挙げられるが、これらに限定されない。代謝疾患としては肥満および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚疾患としては乾癬があげられるが、これに限定されない。 A further use of the ribonucleic acid molecules of the present invention is for use in the manufacture of a medicament or as a medicament. Such medicaments can be used either for the treatment and / or prevention of diseases or conditions, such as cancer, in which genes and their products are associated with the onset, cause or progression of the disease. Furthermore, such medicaments can also be used for the treatment of diseases where the presence or overexpression of gene products causes pathological phenotypes. In a preferred embodiment, the disease is characterized and treated by acquiring function by application or administration of the corresponding biologically active RNAi. The disease or condition treated by a medicament comprising a ribonucleic acid disclosed herein may be selected from the group comprising cancer, heart disease, metabolic disease, skin disease, inflammatory disease, immune system disorder, and autoimmune disease right. Various forms of cancer include, but are not limited to, hematopoietic tumors such as solid and glioblastoma, prostate cancer, breast cancer, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer and leukemia. Metabolic diseases include, but are not limited to obesity and diabetes. Skin diseases include, but are not limited to, psoriasis.
別の局面では、本発明のリボ核酸分子は診断、好ましくは上記の疾患および状態に関連して特定される病気の診断に用いられる。この様な診断は、細胞を含むことが好ましいサンプルに本発明のリボ核酸分子を適用したときの、サンプル発現パターンの変化を観察することに基づくだろう。かかるサンプルは前記の治療対象となる病気又は状態を罹っているか、またはそれに関する素因を有すると思われる被験者に由来する細胞を含むことが好ましい。 In another aspect, the ribonucleic acid molecules of the invention are used in diagnosis, preferably in the diagnosis of diseases identified in connection with the diseases and conditions described above. Such a diagnosis would be based on observing changes in the sample expression pattern when the ribonucleic acid molecule of the present invention is applied to a sample that preferably contains cells. Such a sample preferably comprises cells from a subject suspected of having or predisposed to the disease or condition to be treated.
本発明の核酸の更なる応用は、医薬的に活性な化合物のスクリーニングおよび/または最適化への使用である。後者は低分子等の候補薬物の効果をモニタリングまたは決定し、前記候補薬物が発揮する効果と、ここに開示した原則に基づき設計された特異的RNAi投与時に観察される効果とを比較するようにして行われる。こうすることでスクリーニング工程から標的外作用を有する候補薬物を排除でき、同時に同様または同一の表現系を作り出す候補薬物は有望なリード化合物と見なすことができ、場合によってはそれ自体が医薬的に活性な化合物であることもあるだろう。この方法では、高い特異性を有するRNAi分子は、候補薬物の測定に於けるゴールドスタンダードとして機能する。 A further application of the nucleic acids according to the invention is the use for screening and / or optimization of pharmaceutically active compounds. The latter monitors or determines the effect of a candidate drug such as a small molecule, and compares the effect exerted by the candidate drug with the effect observed upon administration of specific RNAi designed based on the principles disclosed herein. Done. This eliminates candidate drugs with off-target effects from the screening process, and at the same time, candidate drugs that produce similar or identical phenotypes can be considered promising lead compounds, and in some cases are pharmaceutically active in themselves. It may be a simple compound. In this method, RNAi molecules with high specificity function as gold standards in the measurement of candidate drugs.
別の局面では、発明はここに開示のリボ核酸を含有する細胞、好ましくはノックダウン細胞に関する。かかる細胞は単離された、または生体内に再度戻されないことが好ましい、組織内または器官内に含まれる細胞であることが好ましい。しかし、細胞は生体内に含まれるものでもよい。細胞は発明のリボ核酸による処置の対象となる病気または状態に関係する細胞であることが好ましい。この種のノックダウン細胞は、機能的な関連性を評価する、または下流の標的を決定するために、例えばmRNAもしくはタンパク質に基づく発現プロフィールを作製するのに使用してもよい。 In another aspect, the invention relates to cells, preferably knockdown cells, containing the ribonucleic acids disclosed herein. Such cells are preferably cells contained within a tissue or organ that are preferably isolated or not returned to the body. However, the cells may be contained in the living body. The cell is preferably a cell associated with the disease or condition to be treated with the inventive ribonucleic acid. This type of knockdown cell may be used to create an expression profile, eg, based on mRNA or protein, to assess functional relevance or to determine downstream targets.
別の局面では、発明はここに開示のリボ核酸を含む生物に関する。好ましくは、かかる生物は脊椎動物であり、より好ましくは該脊椎動物は哺乳動物である。ここでいう哺乳動物とは、とりわけてもサル、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、モルモット、ウサギ、マウス、ラットおよびヒトであるが、これらに限定されない。 In another aspect, the invention relates to an organism comprising the ribonucleic acid disclosed herein. Preferably, such an organism is a vertebrate, more preferably the vertebrate is a mammal. Mammals as used herein include, but are not limited to, monkeys, dogs, cats, goats, sheep, pigs, guinea pigs, rabbits, mice, rats and humans, among others.
さらに別の局面では、本発明は本発明のリボ核酸を含む組成物に関する。好ましくは、かかる組成物は陰性および陽性コントロールと有効なリボ核酸とを組み合わせた形態、または別々の形態で含んでいる。かかる組成物はさらに溶媒、好ましくは緩衝液を含んでも良い。 In yet another aspect, the present invention relates to a composition comprising the ribonucleic acid of the present invention. Preferably, such compositions comprise negative and positive controls and effective ribonucleic acid in combined form or in separate forms. Such a composition may further comprise a solvent, preferably a buffer.
別の局面では、本発明は本発明のリボ核酸および医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。医薬的に許容可能な担体は当業者公知であり、とりわけ希釈剤、緩衝剤等を含む。医薬組成物はさらに医薬的に活性な化合物を含んでも良い。本発明のリボ核酸分子を用いた処置の対象が病気または状態である場合、前記化合物は既に前記の病気または状態の処置に関連して用いられているものであることが好ましい。本発明のリボ核酸と、先行技術の前記病気および状態の処置に用いられている医薬の作用モードが異なる場合には、相乗効果が得られることもあるだろう。 In another aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a ribonucleic acid of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers are known to those skilled in the art and include, among others, diluents, buffers and the like. The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically active compound. When the subject of treatment with the ribonucleic acid molecule of the present invention is a disease or condition, it is preferred that the compound is already used in connection with the treatment of the disease or condition. A synergistic effect may be obtained if the mode of action of the ribonucleic acid of the present invention and the drugs used to treat the diseases and conditions of the prior art are different.
次に発明を、本発明のその他特徴、実施態様および利点を表す図面および実施例を参照しながら詳しく説明する。 The invention will now be described in detail with reference to the drawings and examples representing other features, embodiments and advantages of the invention.
合成二本鎖RNAi分子の用量反応
本実施例では、2本鎖RNAi分子の活性に及ぼすNH2末端保護基の影響を調べた。合成siRNAはBiospring(Frankfurt、Germany)より購入した。リボ−オリゴヌクレオチドを、RNaseを含まないTEに最終濃度50μMになるように懸濁した。2分子型siRNAの場合は、等量(100μM)を組み合わせて最終濃度を50μMとした。分子間二本鎖を形成する場合には、siRNAを50℃で2分間、アニーリング緩衝液(25mM NaCl;5mM MgCl2)の中でインキュベーションしてから室温まで冷却した。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン(Oligofectamine)、リポフェクタミン(Lipofectamine(Life Technologies))、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals、Inc.,CO)またはFuGene 6(Roche)といった各種カチオン性脂質を製造元指示書に従って使用し、96ウエルまたは10−cmプレートの中で(30〜50%集密度)行った。RNAi分子のトランスフェクションは、前もって無血清培地に5倍濃度で調製しておいたアニーリング済みRNAiと脂質との複合物を、完全培地中の細胞に加える形で実施した。トランスフェクション前、96ウエル形式でのトランスフェクションを行う15〜18時間前に、ウエル当たり2500個のHeLa細胞をプレーティングした。
The dose response this example synthetic double stranded RNAi molecules was investigated the effect of NH 2 -terminal protecting groups on the double-stranded RNAi molecules active. Synthetic siRNA was purchased from Biospring (Frankfurt, Germany). Ribo-oligonucleotides were suspended in TE without RNase to a final concentration of 50 μM. In the case of bimolecular siRNA, equal amounts (100 μM) were combined to give a final concentration of 50 μM. When intermolecular duplexes were formed, siRNA was incubated in annealing buffer (25 mM NaCl; 5 mM MgCl 2 ) for 2 minutes at 50 ° C. and then cooled to room temperature. Transfection uses various cationic lipids such as oligofectamine (Oligofectamine), lipofectamine (Lipofectamine (Life Technologies)), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., CO) or FuGene 6 (Roche) according to the manufacturer's instructions, Performed in 96-well or 10-cm plates (30-50% confluence). RNAi molecule transfection was performed by adding the complex of annealed RNAi and lipid, previously prepared in serum-free medium at a 5-fold concentration, to the cells in complete medium. Prior to transfection, 2500 HeLa cells were plated per well 15-18 hours prior to 96-well transfection.
全トランスフェクション容積は、96ウエルにプレーティングした細胞の場合は100μl、10cmプレートの細胞の場合には10mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて0.8〜1.2μg/mlであった;RNAi濃度は実験毎に表示する。 Total transfection volume was 100 μl for cells plated in 96 wells and 10 ml for cells in 10 cm plates. Final lipid concentration was 0.8-1.2 μg / ml depending on cell density; RNAi concentration is displayed for each experiment.
30分間、37℃で複合体を形成させた。複合体を細胞に加えて、脂質およびRNAiを最終的に1倍濃度にした。トランスフェクション後に実施する分析に応じ、即ちRNA分析の場合にはトランスフェクション24〜48時間後に、そしてウエスタンブロットによるタンパク質分析の場合にはトランスフェクション48〜72時間後に、細胞をタンパク質抽出用の標準的な細胞溶解緩衝液を用いて溶解するか(Klippel、A.、Escobedo、J.A.、Hirano、M.およびWilliams、L.T.(1994年).Mol Cell Biol 14、2675〜2685)、またはRAN単離キット(Invitek、Berlin(Germany))のRNA単離用変性緩衝液を用いて溶解した。 Complexes were allowed to form at 37 ° C. for 30 minutes. The complex was added to the cells to finally bring the lipid and RNAi to a 1-fold concentration. Depending on the analysis performed after transfection, ie, 24-48 hours after transfection in the case of RNA analysis, and 48-72 hours after transfection in the case of protein analysis by Western blot, the cells are standardized for protein extraction. Lysis using a suitable cell lysis buffer (Klippel, A., Escobedo, JA, Hirano, M. and Williams, LT (1994). Mol Cell Biol 14, 2675-2865) or RAN isolation kit ( Invitek, Berlin (Germany)) was used to lyse using a denaturing buffer for RNA isolation.
Taqman分析によるRNAレベルの相対量測定:
96ウエル内でトランスフェクションした細胞のRNAを、トランスフェクション24時間後にInvisorb RNA HTS96キット(InVitek GmbH、Berlin)を用いて単離、精製した。PTEN mRNA発現の阻害は、300nMのPTEN5’プライマーCACCGCCAAATTTAACTGCAGA、300nMのPTEN3’プライマーAAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGTおよび100nMのPTEN TaqmanプローブFam−TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA−Tamraを、40nMのβ−アクチン5’プライマーGTTTGAGACCTTCAACACCCCA、40nMのβ−アクチン3’プライマーGACCAGAGGCATACAGGGACAおよび100nMのβ−アクチンTaqmanプローブVic−CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG−Tamraと組み合わせて用いるリアルタイムRT−PCR(Taqman)分析により検出した。Aktプライマーおよびプローブは、Sternberger et al.(Sternberger、a.a.O)で決定されたものであり、製造元指示書(Applied Biosystem;Amplicon Setを使用)に従い使用した。前記プライマーおよびプローブはPrimer Express(Applied Biosystem)を用いて設計してもよい。反応は50μlで実施され、ABI PRISM 7700シーケンス検出装置(Applied Biosystems)を製造元の指示書に従い用いて、以下の条件で行った:48℃30分間、95℃10分間の後に95℃15秒および60℃1分間を40サイクル。
Relative RNA level measurement by Taqman analysis:
The RNA of cells transfected in 96 wells was isolated and purified 24 hours after transfection using Invisorb RNA HTS96 kit (InVitek GmbH, Berlin). Inhibition of PTEN mRNA expression was achieved by using 300 nM PTEN5 ′ primer CACCGCCCAAATTTAACTGCAGA, 300 nM PTEN3 ′ primer AAGGGTTTTGATAAGTTCTAGCCTTTGAGATACTACT40GA Detection by real-time RT-PCR (Taqman) analysis used in combination with the primer GACCAGAGGCATACAGGGACA and 100 nM β-actin Taqman probe Vic-CCATGTACTAGGCCATCCAGGCTGTG-Tamra It was. Akt primers and probes were determined by Sternberger et al. (Sternberger, aaO) and were used according to manufacturer's instructions (Applied Biosystem; using Amplicon Set). The primers and probes may be designed using Primer Express (Applied Biosystem). The reaction was performed in 50 μl and was carried out using an ABI PRISM 7700 sequence detector (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions under the following conditions: 48 ° C. for 30 minutes, 95 ° C. for 10 minutes followed by 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. 40 cycles of
RNAノックダウンは、非修飾および5’末端をNH2または逆方向脱塩基(inverted Abasics)基で修飾した21nt長のsiRNA二本鎖分子を、脂質担体濃度1.0μg/mlでトランスフェクションしたHeLa細胞をリアルタイムRT−PCR分析して行った。細胞密度は2000細胞/ウエルであった。3’−末端の修飾はRNA突出、アミノ基を持ったRNA−突出、またはDNA突出のいずれかであった。 RNA knockdown consisted of HeLa transfected with 21 nt long siRNA double-stranded molecules unmodified and modified with NH 2 or inverted Abasics group at the 5 ′ end at a lipid carrier concentration of 1.0 μg / ml. Cells were performed by real-time RT-PCR analysis. The cell density was 2000 cells / well. The modification at the 3′-end was either RNA overhang, RNA-overhang with amino groups, or DNA overhang.
細胞抽出物の調製およびイムノブロッティング.細胞を冷リン酸緩衝化生理食塩水で2回洗った後、4℃にて20mMのTris(pH7.5)、137mMのNaCl、15%(容積/容積)グリセロール、1%(容積/容積)Nonidet P-40、2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニン10mg/ml、20mMのロイペプチン、2mMベンズアミジン、1mMバナジウム酸ナトリウム、25mMβグリセロールリン酸、50mMのNaFおよび10mMのNaPPiを含有する溶解緩衝液内に溶解した。溶解物を14、000×g、5分間遠心分離にかけて清浄化し、等量のタンパク質を含有する小分けした細胞抽出物をウエスタンブロッティングによるタンパク質発現の分析にかけた:サンプルをSDS−PAGEで分離してからニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schull)に写し取った。ドライミルクを5%(重量/容積)含有するTBST緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%(容積/容積)Tween20、0.5%(重量/容積)アジ化ナトリウム)でフィルターをブロッキングした。各抗体を適当な希釈度でTBSTに加えた。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス−または抗ウサギ抗体(Transduction Laboratories)を用いてTBST中で検出し、洗浄後、SuperSignal West Dura(Pierce)またはECL(Amersham)化学発光基質(次項参照、Sternbergere al(2002)。Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. 印刷中)を用いて現像した。
Cell extract preparation and immunoblotting. Cells were washed twice with cold phosphate buffered saline followed by 20 mM Tris (pH 7.5), 137 mM NaCl, 15% (vol / vol) glycerol, 1% (vol / vol) at 4 ° C. In a lysis buffer containing Nonidet P-40, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, aprotinin 10 mg / ml, 20 mM leupeptin, 2 mM benzamidine, 1 mM sodium vanadate, 25 mM β-glycerol phosphate, 50 mM NaF and 10 mM NaPPi. Dissolved. Lysates were clarified by centrifugation at 14,000 xg for 5 minutes and aliquoted cell extracts containing equal amounts of protein were subjected to protein expression analysis by Western blotting: samples were separated by SDS-PAGE Copied on a nitrocellulose filter (Schleicher & Schull). TBST buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% (volume / volume)
抗体.マウスモノクローナル抗−p110抗体U3Aおよびマウスモノクローナル抗p85抗体N7Bについては報告されている(Klippel et al.、1994年、aaO)。ウサギポリクローナル抗−Aktおよび抗−ホスホAkt(S473)抗体はCell Signaling Technologyより得た。マウスモノクローナル抗−PTEN抗体はSanta Cruz Biotechnologyより得た。PTEN 53特異的アンチセンス分子、即ちgeneBlocは、Sternberg らが記載しており(Sternberger、上記)、以下の配列を有している(ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga)が、この場合小文字で書かれたヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、大文字で書かれたヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。このアンチセンス分子はTTを除いてRNAi1Aと同一である。 antibody. Mouse monoclonal anti-p110 antibody U3A and mouse monoclonal anti-p85 antibody N7B have been reported (Klippel et al., 1994, aaO). Rabbit polyclonal anti-Akt and anti-phospho Akt (S473) antibodies were obtained from Cell Signaling Technology. Mouse monoclonal anti-PTEN antibody was obtained from Santa Cruz Biotechnology. The PTEN 53-specific antisense molecule, geneBloc, has been described by Sternberg et al. (Sternberger, supra) and has the following sequence (ucuccuTTGTTTTCTGcuaacga), where the nucleotides written in lower case are ribonucleotides: Yes, nucleotides written in capital letters are deoxyribonucleotides. This antisense molecule is identical to RNAi1A except for TT.
結果は図3Aに示し、またPTENのmRNAを標的とする各RNAi分子を図3Bbに示した。小文字で書かれたヌクレオチドはリボヌクレオチドを表し、大文字でかかれたものはデオキシリボヌクレオチドを表す。用語NH2はリボヌクレオチドの3’−位置がアミノ基で修飾されていることを示す。本実施例および本明細書に開示する他実施例で用いるRNAi分子は、小型干渉RNA分子、siRNAと呼ぶこともある。本明細書内の図面では、上側の鎖が干渉RNA分子のアンチセンスまたは第1鎖であり、下側の鎖がセンスまたは第2鎖であることに注意する。 The results are shown in FIG. 3A, and each RNAi molecule targeting PTEN mRNA is shown in FIG. 3Bb. Nucleotides written in lower case represent ribonucleotides and those written in upper case represent deoxyribonucleotides. The term NH 2 indicates that the 3′-position of the ribonucleotide is modified with an amino group. The RNAi molecule used in this example and other examples disclosed herein may be referred to as a small interfering RNA molecule, siRNA. Note that in the drawings within this specification, the upper strand is the antisense or first strand of the interfering RNA molecule and the lower strand is the sense or second strand.
図3Aから明らかなように、アミノ修飾の様なアミノ末端修飾およびヌクレオチドの末端OH基の逆方向脱落塩基は、修飾がアンチセンス鎖の3’末端に位置する場合には非修飾端になる可能性がある(図8A;8Bも参照)。従って安定化またはその他特性(配送)を目的とした化学修飾は、それが3’OHに配置される場合;特に3’OHが突出するヌクレオチドに在る場合には許容され、活性を損なうことはないだろう。 As is apparent from FIG. 3A, an amino terminal modification such as an amino modification and a reverse drop base of the terminal OH group of a nucleotide can become an unmodified end when the modification is located at the 3 ′ end of the antisense strand. (See also FIGS. 8A; 8B). Thus, chemical modifications aimed at stabilization or other properties (delivery) are permissible when it is placed in the 3′OH; especially when the 3′OH is in an overhanging nucleotide and does not impair activity There will be no.
図3Cに示す実験については、上記と同様の条件が用いられた。RNAiの第1鎖および第2鎖は、リボース部分の3’−位置にあるNH2基、または前記位置にある逆方向脱塩基により修飾された。第1構築物はsiRNA−NH2(3A3B)として、第2鎖はsiRNA−iB(4A4B)としてデザインされた。両分子の配列を図3Bに示す。用語3A3Bは、干渉リボ核酸がアンチセンスとしての鎖3Aとセンス鎖としての鎖3Bとから成ることを意味している。比較のために、同様にPTEN mRNAを標的としたGB53と名付けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド(Steinberger et al. 上記)を作製した。後者の実験の詳細を以下説明する。
For the experiment shown in FIG. 3C, conditions similar to those described above were used. The first and second strands of RNAi were modified by the NH 2 group at the 3′-position of the ribose moiety or by reverse abasing at that position. The first construct was designed as siRNA-NH 2 (3A3B) and the second strand as siRNA-iB (4A4B). The sequence of both molecules is shown in FIG. 3B. The term 3A3B means that the interfering ribonucleic acid consists of
図3Cからわかる如く、図3Bに示す末端保護されたRNAi分子はPTENタンパク質のノックダウン成立に機能した。 As can be seen from FIG. 3C, the end-protected RNAi molecule shown in FIG. 3B functioned to establish knockdown of the PTEN protein.
本実施例より、両端保護基がRNAi分子にPTENタンパク質をノックダウンする活性を付与することがわかった。この阻害はアンチセンス構築物による阻害と同等に効果的であったが、より低濃度を使用したことから、既存の極めて強力なアンチセンス技術に比べても有利であることは明瞭である。 From this example, it was found that the protecting groups at both ends confer the activity of knocking down the PTEN protein to the RNAi molecule. Although this inhibition was as effective as inhibition with antisense constructs, it is clear that lower concentrations were used, which is advantageous over existing very powerful antisense technologies.
インビボ(in vivo)でのRNAi二本鎖活性に関する突出の必要性
実験手法は、干渉RNAi分子を標的とするPTEN mRNAの設計が異なる外は実施例1の説明と同じであった。結果は図4Aに用量反応曲線の形で示し、図4Bに図4Aに示したデータを得るのに用いた干渉RNAi分子の具体的な配列および修飾を示した。表記法は、例えばRNAi18はアンチセンス鎖としての鎖18Aと、センス鎖としての鎖18Bとから成ることを示すものである。
Necessity of overhang for RNAi duplex activity in vivo The experimental procedure was the same as described in Example 1 except that the design of PTEN mRNA targeting interfering RNAi molecules was different. The results are shown in FIG. 4A in the form of a dose response curve, and FIG. 4B shows the specific sequence and modification of the interfering RNAi molecule used to obtain the data shown in FIG. 4A. The notation indicates that, for example, RNAi18 is composed of
HeLa細胞内でPTEN mRNAをノックダウンする活性について、平滑端分子と、3’−突出(RNAi18)および5’−突出(RNAi30およびRNAi31)を持つ分子とを比較した。平滑端分子(RNAi28)および5’−突出を持つ分子の活性は、3’−突出を持つ分子の活性と同等であった。このことは、3’−突出がRNAi活性に必須ではないことを表している。 The activity of knocking down PTEN mRNA in HeLa cells was compared between blunt-end molecules and molecules with 3'-overhangs (RNAi18) and 5'-overhangs (RNAi30 and RNAi31). The activity of the blunt end molecule (RNAi28) and the molecule with 5'-overhang was comparable to that of the molecule with 3'-overhang. This indicates that 3'-overhang is not essential for RNAi activity.
インビボでのRNAi活性に関する干渉RNA分子二本鎖長の条件
実験方法は、干渉RNA分子がAkt1のmRNAを標的とする外は、実施例1に概要示したものと同様であった。RNAi分子の特異性を示すための陰性コントロールは、ここでもp110 mRNAであった。実験結果を図5Aに示し、図5Bには用いた干渉RNAi分子の詳細を示した。図7A、左パネルに示した別のsiRNA構築物についても同様の実験を実施したが、この場合不一致を矢印で示し、デオキシリボヌクレオチドは大文字で表した。表示量のsiRNA分子をトランスフェクションしたHeLa細胞でのAkt1 mRNA発現の阻害を図7Aの右パネルに示した。
Interfering RNA molecule duplex length conditions for RNAi activity in vivo The experimental method was similar to that outlined in Example 1 except that the interfering RNA molecule targeted Akt1 mRNA. The negative control to show the specificity of the RNAi molecule was again p110 mRNA. The experimental results are shown in FIG. 5A, and FIG. 5B shows details of the interfering RNAi molecule used. A similar experiment was performed with the other siRNA constructs shown in FIG. 7A, left panel, with mismatches indicated by arrows and deoxyribonucleotides capitalized. Inhibition of Akt1 mRNA expression in HeLa cells transfected with the indicated amounts of siRNA molecules is shown in the right panel of FIG. 7A.
各種RNAi分子をトランスフェクションしたHeLa細胞からのAkt RNAに関するTaqman分析からは、siRNAの2本鎖二本鎖分子が活性を示すには17塩基対より長くなくては成らず、一方17塩基対長以下の二本鎖分子は、配列特異的突出が付加されていても機能的でないことが示された。試験が成功した最短のRNAi分子は18〜19ヌクレオチドまたは塩基対長であった。RNAi51と称する干渉RNA分子51A/51Bの設計は、国際特許出願WO01/75164に記載されたものに対応することに注意。RNAi分子55A/55Bは17ヌクレオチドのストレッチを含み、Akt1 mRNAの分解に関する活性が明瞭に低下している。
From Taqman analysis of Akt RNA from HeLa cells transfected with various RNAi molecules, siRNA double-stranded molecules must be longer than 17 base pairs to be active, whereas 17 base pairs long The following double-stranded molecules were shown to be non-functional even with the addition of sequence-specific overhangs. The shortest RNAi molecule successfully tested was 18-19 nucleotides or base pairs long. Note that the design of the interfering
図7Aから明らかなように、19nt長の二本鎖は3’突出の性質(デオキシ−またはリボヌクレオチド)とは無関係にAkt1 mRNAレベルを極めて効率的に低下させた(分子1AB、2AB、3AB、4ABに比較して)。17ヌクレオチド長のsiRNA(分子5AB)はサイレンシング活性(silencing activity)の大きな低下を示し、活性siRNA二本鎖が少なくとも18ntまたはそれ以上でなければならないという上記見解が確認された。いずれの理論にも結びつけることなしに、この結果は2種類の条件により機械的に説明されるだろう。第1の条件はsiRNAのアンチセンスと標的mRNAとの間に最低18ntの塩基対合が必要であるというものであり、第2の条件はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)への取り込みに最低長のsiRNA二本鎖が必要であるというものである。この疑問に答えるために、野生型配列に対して1および2個の末端突然変異(CGおよびUA逆位)を有する19nt長のsiRNA二本鎖分子を合成した(分子6ABおよび7AB)。両分子は標的mRNAと15nt塩基ストレッチだけ対合する分子であるが、Akt1 mRNAレベル誘導には機能的であった。従って、アンチセンスsiRNAと標的mRNAとの塩基対合の長さではなく、二本鎖のそのものの長さが機能的siRNAの最低長を決定すると結論できるだろう。このことは、RISC複合体への取り込みに関しては、2本鎖螺旋の長さが重要決定因子であることを示唆している。二本鎖siRNA末端への不一致導入は、RNA干渉にほとんど影響しなかった。 As can be seen from FIG. 7A, the 19 nt long duplex reduced Akt1 mRNA levels very efficiently (molecules 1AB, 2AB, 3AB, regardless of the nature of the 3 ′ overhang (deoxy- or ribonucleotide)). Compared to 4AB). The 17 nucleotide long siRNA (molecule 5AB) showed a significant decrease in silencing activity, confirming the above view that the active siRNA duplex should be at least 18 nt or more. Without being bound to any theory, this result will be explained mechanically by two kinds of conditions. The first condition requires a minimum of 18 nt base pairing between the siRNA antisense and the target mRNA, and the second condition requires a minimum for incorporation into the RNA-induced silencing complex (RISC). A long siRNA duplex is required. To answer this question, 19nt long siRNA duplex molecules with 1 and 2 terminal mutations (CG and UA inversions) relative to the wild type sequence were synthesized (molecules 6AB and 7AB). Both molecules are molecules that pair with the target mRNA only by a 15 nt base stretch, but were functional in inducing Akt1 mRNA levels. Therefore, it can be concluded that the length of the duplex itself, rather than the length of base pairing between the antisense siRNA and the target mRNA, determines the minimum length of a functional siRNA. This suggests that the length of the double-stranded helix is an important determinant for incorporation into the RISC complex. Inconsistent introduction at the ends of double stranded siRNA had little effect on RNA interference.
上記実験結果を考慮すると、RNAiが媒介する最適な干渉に必要な最低の二本鎖長は、平滑端または5’−突出の様なRNAi分子に関するさらなる設計、あるいはここに開示したその他形態とは無関係に18または19ヌクレオチドであり、このことはRNAi分子に一般的に当てはまる。しかし、RNAi分子の特別な設計は前記分子に更に別の利点、例えば高い効率および高い安定性を付与することがあることを認識すべきである。 In view of the above experimental results, the minimum duplex length required for optimal RNAi-mediated interference is a further design for RNAi molecules such as blunt ends or 5′-overhangs, or other forms disclosed herein. Irrespective of 18 or 19 nucleotides, this is generally true for RNAi molecules. However, it should be recognized that the special design of the RNAi molecule may confer further advantages to the molecule, such as high efficiency and high stability.
インビボでのRNAiに関する標的−アンチセンス相同性条件
実験構成は実施例1に記載のものと同等であるが、この場合RNAiはAKt1特異的である。さらにPTEN特異的干渉RNA分子を設計し、陰性コントロールに用いた。結果は図6Aおよび図6Bに示した。図7Bに示す更に別のsiRNA分子を用いて、基本的には同一な実験を行い、その結果をそれぞれ図7B(右パネル)および図7Cに示した。
Target-antisense homology conditions for RNAi in vivo The experimental setup is equivalent to that described in Example 1, but in this case RNAi is AKt1-specific. Furthermore, a PTEN-specific interfering RNA molecule was designed and used as a negative control. The results are shown in FIGS. 6A and 6B. Basically, the same experiment was performed using another siRNA molecule shown in FIG. 7B, and the results are shown in FIG. 7B (right panel) and FIG. 7C, respectively.
機能的siRNA分子の最低二本鎖長が18または18ヌクレオチド以上であることを確定した後に、サイレンシング活性にとって標的mRNAとsiRNA間でどれだけの数のヌクレオチドが一致する必要があるか調べた。Akt1 RNAのTaqman分析で示される様に標的RNAに、この例ではAkt1に19〜15ヌクレオチドのストレッチが完全に一致していればRNAi活性の媒介に十分であった。PTEN特異的RNAi分子はAKt1のRNA量を下げなかったことから、この方法が特異的であることが確認された。鎖のいずれか一方または両方の端部にある1個または2個のヌクレオチド不一致が機能していることから、遺伝子サイレンシングにとっては標的mRNAとRNAi間に15ntの相同的ストレッチがあれば十分であることが示唆された。これらのデータより、非特異的遺伝子サイレンシング無関係な標的に非特異的に結合することによって偶然に起こり得ると結論できた。このことは、15〜17個塩基対が一致するストレッチは単一遺伝子に特異的ではなく、脊椎動物のゲノムまたはトランスクリプトゾームの複雑性とサイズとを考えると偶然起こりえるという理解に基づいている。前記実験とは別に、不一致の位置についても分析した。そのためにPTEN mRNAを標的とする19nt長の平滑siRNAを用いた。一方のsiRNA鎖の配列変化に合わせてもう一方の鎖も相補的に変更して補償し、二本鎖が破壊されないようにした。図7BおよびCそれぞれから分かる様に、分子中央に点突然変異を1個だけ持つsiRNAは、mRNAおよびタンパク質発現のレベルで使用するには能力において大きく譲歩していた。この結果は、RNA機構が二本鎖中心部での標的mRNAとsiRNA間の塩基対合が完全であるか、不完全であるかにより大きく異なることを示している。この標的およびsiRNA間が完全に相補的であることに強く依存することは、ショウジョウバエ系でのRNAi干渉については既に報告されていたが、HeLaの様なほ乳動物系での報告はなかった。 After determining that the minimum duplex length of a functional siRNA molecule was 18 or 18 nucleotides or more, it was examined how many nucleotides need to match between the target mRNA and siRNA for silencing activity. A perfect match of the 19-15 nucleotide stretch to the target RNA, in this example Akt1, as shown by Taqman analysis of Akt1 RNA was sufficient to mediate RNAi activity. PTEN-specific RNAi molecules did not reduce the amount of AKt1 RNA, confirming that this method is specific. A 15 nt homologous stretch between the target mRNA and RNAi is sufficient for gene silencing because one or two nucleotide mismatches at either or both ends of the strand are functional It has been suggested. From these data, it was concluded that nonspecific gene silencing can occur by chance by binding nonspecifically to unrelated targets. This is based on the understanding that stretches of 15-17 base pairs are not specific to a single gene, but can happen by chance given the complexity and size of the vertebrate genome or transcriptome. . Apart from the experiment, the location of the discrepancy was also analyzed. For that purpose, a 19 nt long blunt siRNA targeting PTEN mRNA was used. In accordance with the sequence change of one siRNA strand, the other strand was also complementarily changed to compensate so that the double strand was not broken. As can be seen from each of FIGS. 7B and C, siRNA with only one point mutation in the middle of the molecule was a big compromise in ability to use at the level of mRNA and protein expression. This result shows that the RNA mechanism varies greatly depending on whether the base pairing between the target mRNA and siRNA at the center of the double strand is complete or incomplete. The strong dependence on this target and siRNA being completely complementary has already been reported for RNAi interference in the Drosophila system, but not in mammalian systems such as HeLa.
この観察に基づいて、本発明は2つの方法によりsiRNAの標的外問題(off-target problem)を軽減している。第1はsiRNA分子の分子長を最低条件(18〜19nt)まで短くし、それにより標的外のものと相同になる機会を減らす方法である。第2は、センス鎖を不活性化することにより、センス鎖が無関係の標的RNAとが偶然に相補的になることによって望まないRNAサイレンシングが起こるのを防ぐことである(実施例6も参照せよ)。 Based on this observation, the present invention mitigates the off-target problem of siRNA by two methods. The first is a method of shortening the molecular length of the siRNA molecule to the minimum condition (18 to 19 nt), thereby reducing the chance of homology with an off-target. The second is to inactivate the sense strand to prevent undesired RNA silencing from happening by accidental complementation with an irrelevant target RNA (see also Example 6). )
血清中の修飾RNAi分子の安定性
オリゴヌクレオチドをヒト血清中で15分間および2時間インキュベーションし、未処理のコントロールと共に10%ポリアクリルアミドゲルにかけた。結果は図8Aに示した。使用した各種RNAi分子を図8Bに示し、詳しく説明した。
Stability of modified RNAi molecules in serum Oligonucleotides were incubated in human serum for 15 minutes and 2 hours and run on a 10% polyacrylamide gel with untreated controls. The results are shown in FIG. 8A. Various RNAi molecules used are shown in FIG. 8B and described in detail.
本実施例より、全ヌクレオチドが2’−O−メチル基で修飾されたRNA分子のRNAi二本鎖(RNAi分子79A79Bおよび28A28B)が血清中で高い安定性を有することが分かった。さらに平滑端二本鎖は突出を持つ二本鎖分子に比べより安定であることも示された。これより、末端保護(例えばiBまたはアミノ)は血清中の安定性を高めないと結論できるだろう。 From this example, it was found that RNAi duplexes (RNAi molecules 79A79B and 28A28B) of RNA molecules in which all nucleotides were modified with a 2'-O-methyl group had high stability in serum. It was also shown that blunt-ended duplexes are more stable than overhanging double-stranded molecules. From this it can be concluded that end protection (eg iB or amino) does not increase serum stability.
更に、本明細書出願以前の当該技術分野での理解とは逆に、RNAi分子の保護にとってはエクソヌクレアーゼよりもエンドヌクレアーゼがより重要であるとも結論できる。 Furthermore, contrary to the understanding in the art prior to the filing of this specification, it can also be concluded that endonucleases are more important than exonucleases for the protection of RNAi molecules.
上記を考慮すると、本明細書に開示した発明のRNAi分子の各種修飾または設計に加えて、更なるまたは追加のヌクレオチド修飾としてエンドヌクレアーゼ機能を阻害するためにRNAi分子の完全または部分的ホスホロチオアート主鎖を用いてもよいだろう。完全なホスホロチオアート主鎖とは、全てのヌクレオチドがホスホロチオアート基を持つものを意味し、部分的ホスホロチオアート主鎖とはRNAi分子を形成するヌクレオチドのうちホスホロチオアート修飾されているものが一部であることを意味する。この修飾はRNAi分子のさらなる設計とは無関係にRNAi分子の寿命を延長するのに好適である。これに関して、部分的または完全ホスホロチオアート修飾RNAiは、本発明の課題に従い、本明細書に開示する干渉RNA分子の設計に関する様々な戦略と結びついて、または当分野周知の設計と結びついて実現してもよい。 In view of the above, in addition to various modifications or designs of the RNAi molecules of the invention disclosed herein, the RNAi molecule may be fully or partially phosphorothioated to inhibit endonuclease function as a further or additional nucleotide modification. The art backbone may be used. A complete phosphorothioate backbone means that all nucleotides have a phosphorothioate group, and a partial phosphorothioate backbone means a phosphorothioate modification of nucleotides forming an RNAi molecule. Means that what is being done is part. This modification is suitable for extending the life of the RNAi molecule independently of further design of the RNAi molecule. In this regard, partially or fully phosphorothioate modified RNAi is realized in accordance with the subject of the present invention, in conjunction with various strategies for the design of interfering RNA molecules disclosed herein, or in conjunction with designs well known in the art. May be.
5’および3’末端のNH2末端保護基によるセンス鎖の不活性化
実験構成は実施例1に関連して記載したものと同等であるが、この場合の標的核酸配列はPTEN mRNAである。HeLa細胞濃度は2,000細胞/ウエルであった。PTENのRNAは、各種修飾RNAi分子トランスフェクション後にTaqmanアッセイにて分析した。用いた各種干渉RNA分子は図9Bに示し、実験結果は図9Aに示した。
Inactivation of the sense strand by NH 2 -terminal protecting groups at the 5 ′ and 3 ′ ends The experimental setup is equivalent to that described in connection with Example 1, but in this case the target nucleic acid sequence is PTEN mRNA. The HeLa cell concentration was 2,000 cells / well. PTEN RNA was analyzed by Taqman assay after transfection of various modified RNAi molecules. The various interfering RNA molecules used are shown in FIG. 9B, and the experimental results are shown in FIG. 9A.
図8Aに示した各種RNAi分子の用量反応曲線から分かるように、RNAi分子はセンス鎖、即ち第2鎖の両端がアミノ基で修飾されている時に機能する。特に効果的なRNAi分子は20A26B、18A26Bおよび28A26Bであった。最も低い活性はRNAi分子26A26Bに認められたが、この分子は二本鎖の4つの端部全てが端修飾されている分子である(Tuschlは18AB)。 As can be seen from the dose response curves of the various RNAi molecules shown in FIG. 8A, RNAi molecules function when the sense strand, ie, both ends of the second strand, are modified with amino groups. Particularly effective RNAi molecules were 20A26B, 18A26B and 28A26B. The lowest activity was found in RNAi molecule 26A26B, which is a molecule in which all four ends of the duplex are end-modified (Tuschl is 18AB).
しかしRNAi活性はアンチセンス鎖、即ち第1鎖が3’端のみ修飾され、5’端には自由OH基が残されている場合にも得られた(RNAi構築物22A26B;20A26B)。アンチセンス鎖が5’および3’両端についてアミノ基で修飾されている場合(26A26B)には活性はなかった。このことから、アンチセンス鎖のいずれかの端、より具体的にはアンチセンス鎖の5’端は修飾せずにそのまま残すべきであると結論した。更に、NH2端修飾を用いてセンス鎖を5’および3’端で不活性化でき、これにより不活性化されない場合に機能的であるセンス鎖が媒介する標的外作用を軽減することができ、その結果RNAi分子の特異性を大きく上昇させるので、標的評価ならびにRNAi分子の医薬使用にとって有利である。 However, RNAi activity was also obtained when the antisense strand, ie the first strand, was modified only at the 3 ′ end and a free OH group was left at the 5 ′ end (RNAi constructs 22A26B; 20A26B). There was no activity when the antisense strand was modified with amino groups at both the 5 'and 3' ends (26A26B). From this, it was concluded that either end of the antisense strand, more specifically, the 5 ′ end of the antisense strand should remain unmodified. Furthermore, NH 2 end modifications can be used to inactivate the sense strand at the 5 'and 3' ends, thereby reducing off-target effects mediated by the sense strand that are functional when not inactivated. As a result, the specificity of the RNAi molecule is greatly increased, which is advantageous for target evaluation and pharmaceutical use of the RNAi molecule.
本実験の結果を更に一般化したものを図9Cに示した。これによれば機能的に活性なRNAiは、アンチセンス鎖にアミノ修飾を有さないか、または、アンチセンス鎖の3’末端にのみアミノ修飾を有するものであり、一方アンチセンス鎖の両端がアミノ修飾されたものは機能的でなく、即ち標的mRNAをノックダウンしない。 A further generalization of the results of this experiment is shown in FIG. 9C. According to this, the functionally active RNAi has no amino modification in the antisense strand or has an amino modification only at the 3 ′ end of the antisense strand, while both ends of the antisense strand are Amino modifications are not functional, i.e. do not knock down the target mRNA.
エンドヌクレアーゼ保護に関するRNAi分子の2’−O−メチル修飾の影響
RNAノックダウンを再度示すために、図10Aに示すようなPTEN mRNAを標的としたRNAi二本鎖分子をトランスフェクションしたHeLa細胞にリアルタイムRT−PCR分析を行った。実験手法は基本的には実施例1に記載の手順に同じである。図10Aに示す、研究対象のRNAi分子の構造およびその用量反応は図10Cに示した。太字で示したヌクレオチドは2’−O−メチル修飾を有するヌクレオチドである。
Effect of 2'-O-methyl modification of RNAi molecules on endonuclease protection To demonstrate RNA knockdown again, real-time in HeLa cells transfected with RNAi double-stranded molecules targeting PTEN mRNA as shown in FIG. 10A RT-PCR analysis was performed. The experimental procedure is basically the same as the procedure described in Example 1. The structure of the RNAi molecule under study shown in FIG. 10A and its dose response are shown in FIG. 10C. Nucleotides shown in bold are nucleotides with 2′-O-methyl modifications.
図10Aに各種RNAi分子について示した用量反応曲線から、内部の2’−O−アルキル基がRNAi活性を下げることが示された。この種の2’−O−アルキル基は2’−O−メチルまたは2’−O−エチル基であることが好ましい。しかし非修飾ヌクレオチドと2’−O−アルキル修飾とを組み合わせ持つ分子は著しい活性を示した。同様に10Aに示すように、アンチセンス鎖が全て2’−O−メチル基で修飾されており、さらにセンス鎖が修飾されていない場合(後述する、例えばRNAi分子79A28B)には活性は認められなかった。図10Bに示すような、血清中で各種RNAi分子をインキュベーションするような安定性試験の結果から、2’−O−アルキル修飾がRNAiを分解に対し安定化することが分かった。しかしこの明確な有利な作用は、2’−O−アルキル修飾が一般にはノックダウン活性を低下させるという作用によって少なくとも在る範囲で相殺される。従ってRNAi分子の設計は安定性と活性とのバランスを取るものでなければならない、そしてこれには本出願で開示された各種設計原理を認識することが重要となる。 The dose response curves shown for FIG. 10A for various RNAi molecules showed that the internal 2'-O-alkyl group reduced RNAi activity. Such 2'-O-alkyl groups are preferably 2'-O-methyl or 2'-O-ethyl groups. However, molecules with a combination of unmodified nucleotides and 2'-O-alkyl modifications showed significant activity. Similarly, as shown in 10A, when the antisense strand is all modified with a 2′-O-methyl group and the sense strand is not further modified (described later, for example, RNAi molecule 79A28B), activity is recognized. There wasn't. From the results of a stability test, such as incubation of various RNAi molecules in serum, as shown in FIG. 10B, it was found that 2'-O-alkyl modification stabilizes RNAi against degradation. However, this distinct beneficial effect is counterbalanced at least to some extent by the effect that 2'-O-alkyl modifications generally reduce knockdown activity. Thus, the design of RNAi molecules must balance stability and activity, and it is important to recognize the various design principles disclosed in this application.
内部2’−O−メチル修飾のブロックが血清中でのRNAi分子の安定性に及ぼす影響
本試験に関する実験方法は、実際的には実施例1に記載の方法と同一であった。ここでもPTEN RNAは、各種用量のRNAi分子をトランスフェクションした密度2000細胞/ウエルのHeLa細胞にリアルタイムRT−PCRを行い分析した。RNAi分子を血清中で2時間インキュベーションし、10%ポリアクリルアミドゲルで分析した。本試験の結果を図11A〜11Cに示すが、図11Aは図11Cに示した各種RNAi分子の用量反応を表しており、図11Bは図11Cに示したRNAi分子の幾つかを用いた安定性試験の結果を示している。図11Cに太字で書かれたヌクレオチドは修飾を有するヌクレオチドであり、本例での修飾はリボース部分の2’−O−メチル修飾である。
Effect of internal 2′-O-methyl modification block on the stability of RNAi molecules in serum The experimental method for this study was practically identical to the method described in Example 1. Again, PTEN RNA was analyzed by real-time RT-PCR on HeLa cells at a density of 2000 cells / well transfected with various doses of RNAi molecules. RNAi molecules were incubated in serum for 2 hours and analyzed on a 10% polyacrylamide gel. The results of this study are shown in FIGS. 11A-11C, where FIG. 11A represents the dose response of the various RNAi molecules shown in FIG. 11C, and FIG. 11B is the stability using some of the RNAi molecules shown in FIG. 11C. The test results are shown. The nucleotides in bold in FIG. 11C are nucleotides with modifications, and the modification in this example is a 2′-O-methyl modification of the ribose moiety.
非修飾RNAi分子による用量依存的な阻害が見られた。さらに中心の9ヌクレオチドが2’−O−メチル修飾されるとRNAiは血清中で安定化し、そしてPTEN mRNAを分解に導く干渉現象を媒介する二本鎖活性を発揮できることが示された。センス鎖全体を修飾すると、RNAi分子は血清中で安定化し、特定の活性を発揮できた。 There was a dose-dependent inhibition by unmodified RNAi molecules. Furthermore, it has been shown that RNAi is stabilized in serum when the central 9 nucleotides are 2'-O-methyl modified and can exert double-stranded activity that mediates the interference phenomenon leading to degradation of PTEN mRNA. When the entire sense strand was modified, RNAi molecules were stabilized in serum and were able to exert specific activities.
5ヌクレオチドを2’−O−メチル修飾して交互にブロックすると、RNAi分子に血清中での安定性を付与し、そしてPTEN RNAに対する活性を発揮できることが、RNAi二本鎖を血清中で2時間インキュベーションしてから10%ポリアクリルアミドゲルにかけることで示された。図11Bから分かるように、鎖80Aおよび80Bを含む二本鎖は血清中で2時間インキュベーションすることで強く分解された。鎖82Aおよび82Bからなる二本鎖より、アンチセンス鎖を含む第1鎖の5’末端は5’−末端ヌクレオチドで修飾してはならないことが確認できた(82A82Bと逆向きの81A81Bとを比較する)。このことは、鎖86Aおよび86Bから成る二本鎖は、血清中で活性且つ安定するという結果からも確認される。アンチセンス鎖の5’末端に非修飾ブロックを持つ分子はより活性であり、このとき5’末端のOH基が誘導されていないことが好ましいということは注目に値する。
Blocking alternating 5 nucleotides with 2'-O-methyl can confer RNAi molecules in serum stability and exert activity against PTEN RNA. Incubation followed by running on a 10% polyacrylamide gel. As can be seen from FIG. 11B, the
ヌクレオチドの2’−O−メチル修飾について異なる修飾パターンを用い、更に実験を行った。その結果を図12A〜12Cに示し、本明細書の実施例9で詳しく説明する。 Further experiments were performed using different modification patterns for 2'-O-methyl modification of nucleotides. The results are shown in FIGS. 12A-12C and will be described in detail in Example 9 herein.
内部2’−O−メチル交互修飾がRNAi分子の血清中安定性に及ぼす影響
この種の試験の実施に関する実験構成は、実施例1および実施例8にそれぞれ記載した試験に関係し使用した構成と同一であり、今回も標的核酸はPTEN mRNAであった。HeLa細胞に図12Bに記載の各種RNAi分子をトランスフェクションし、PTEN RNAを対象に用量依存的に行ったリアルタイムRT−PCRを用いてRNAのノックダウンを実証した(図12A)。37℃、血清中、15分および2時間後の各種RNAi分子の安定性を図12Cに、各種RNAi分子の標的タンパク質としてのp110およびPTENに関するウエスタンブロットを図12Dに示すが、図12Cおよび図12Dの基礎となる両実験で試験したRNAi分子は同じものである。
Effect of internal 2′-O-methyl alternation modification on serum stability of RNAi molecule The experimental setup for carrying out this type of test is that used in connection with the tests described in Example 1 and Example 8, respectively. The target nucleic acid was PTEN mRNA again. HeLa cells were transfected with various RNAi molecules described in FIG. 12B, and RNA knockdown was demonstrated using real-time RT-PCR performed dose-dependently on PTEN RNA (FIG. 12A). The stability of various RNAi molecules after 15 minutes and 2 hours in serum at 37 ° C. is shown in FIG. 12C, and the western blot for p110 and PTEN as target proteins of various RNAi molecules is shown in FIG. 12D. The RNAi molecules tested in both experiments that underlie are the same.
図12Aおよび図12Cに示す通り、2’−O−メチル基で修飾されたヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドが交互に並ぶとRNAi分子は血清中で安定化すると同時に、標的mRNAに対する干渉について活性になった。RNAi二本鎖分子を血清中で15分間および2時間インキュベーションすると、非修飾二本鎖と5’−位置側の10ヌクレオチドが非修飾である二本鎖が分解されることが分かった。 As shown in FIGS. 12A and 12C, alternating alternation of 2′-O-methyl modified and unmodified nucleotides stabilized the RNAi molecule in serum and became active for interference with the target mRNA. . Incubation of RNAi duplex molecules in serum for 15 minutes and 2 hours was found to degrade unmodified duplexes and duplexes that are unmodified at the 5'-position of 10 nucleotides.
図12Bに示すRNAi分子には、様々な修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドのパターンが描かれている。RNAi分子94A1/94B1は修飾ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドによりフランキングされ、そして第1鎖の5’末端に非修飾ヌクレオチドが配置される構造を含んでいる。鎖94A2および94B2を含むRNAi分子は別の例で、第1鎖および第2鎖で修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドが反対側に配置されている。これとは逆に、鎖94A1および94B2を含むRNAi分子は、同じ修飾および非修飾ヌクレオチドのパターンを有する。しかしこの例では修飾ヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドと塩基対合を形成するように位相シフトされている。鎖94A1および94B1、ならびに鎖94A2および94B2を含む2種類のRNAi分子は互いに、前者では第1鎖が非修飾ヌクレオチドから開始し、そして対応する第2鎖の最初のヌクレオチド、即ち第2鎖の3’末端のヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドから始まるが、94A2および94B2を含むRNAi分子ではこの配置が逆になる点で異なる。
The RNAi molecule shown in FIG. 12B depicts various modified and unmodified nucleotide patterns. RNAi molecule 94A1 / 94B1 contains a structure in which modified nucleotides are flanked by modified nucleotides and an unmodified nucleotide is placed at the 5 'end of the first strand. The RNAi molecule comprising strands 94A2 and 94B2 is another example, with modified and unmodified nucleotides placed on opposite sides in the first and second strands. Conversely, RNAi molecules comprising strands 94A1 and 94B2 have the same modified and unmodified nucleotide pattern. However, in this example, the modified nucleotide is phase-shifted to form base pairing with the unmodified nucleotide. Two RNAi molecules comprising strands 94A1 and 94B1 and strands 94A2 and 94B2 each other, in the former, the first strand starts with an unmodified nucleotide and the first nucleotide of the corresponding second strand,
更に、図12Bに示した交互に修飾されるRNAi分子は、図12Dに示すようにPTENタンパク質ノックダウンの媒介に機能的であるが、第2鎖の5’末端および第2鎖の3’末端ヌクレオチドが修飾されていない場合(94A294B1および94A294B2参照)のみである。これらデータ全てから、最も安定および最も活性なRNAi分子は2’アルキル修飾と非修飾ヌクレオチド残基を交互に持つことが分かる。これら分子が、血清中で安定であり、取扱性が向上または容易である非修飾siRNA分子と比べた時に、よく似たmRNA低下を示すことに注意すべきである。 In addition, the alternately modified RNAi molecule shown in FIG. 12B is functional in mediating PTEN protein knockdown as shown in FIG. 12D, but the 5 ′ end of the second strand and the 3 ′ end of the second strand. Only when the nucleotide is not modified (see 94A294B1 and 94A294B2). From all these data it can be seen that the most stable and most active RNAi molecules have alternating 2 'alkyl modified and unmodified nucleotide residues. It should be noted that these molecules show a similar reduction in mRNA when compared to unmodified siRNA molecules that are stable in serum and easy to handle or improve.
内部修飾RNAi分子が媒介する機能的タンパク質ノックダウン
実験方法は実施例1で概要説明した方法と同様であった。
Functional protein knockdown mediated by internally modified RNAi molecules The experimental method was similar to that outlined in Example 1.
図12Bに示した交互修飾型RNAi分子をトランスフェクションした後様々な時点(48、72、96および120時間)で集めたHeLa細胞にウエスタンブロットを実施した。実験上の理由から、96時間の時点で細胞を二分割して、半分をプレーティングし直した。各種RNAi分子を合計40nM細胞に作用させた。細胞は実施例1記載のカチオン性脂質を用いて、72時間、連続してトランスフェクションした;続いてトランスフェクション剤なしにプレーティングし直した。 Western blots were performed on HeLa cells collected at various time points (48, 72, 96 and 120 hours) after transfection with the alternating modified RNAi molecule shown in FIG. 12B. For experimental reasons, the cells were divided in half at 96 hours and half were re-plated. Various RNAi molecules were allowed to act on a total of 40 nM cells. Cells were continuously transfected with the cationic lipid described in Example 1 for 72 hours; subsequently re-plated without transfection agent.
トランスフェクションはオリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、NC388、L8(Atugen、Berlin)といった各種カチオン性脂質を用いて、96ウエルまたは10−cmプレートの中で(30〜50%集密度)行い、RNAiを前もって5倍濃度で調製しておいたsiRNAと脂質との複合物の無血清培地液を完全培地中の細胞に加えることでトランスフェクションした。トランスフェクションの全容積は96ウエルにプレーティングした細胞の場合は100μlであり、10cmプレートの細胞では10mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて0.8〜1.2μg/mlであった;siRNAの濃度は実験毎に示す。 Transfection was performed in 96-well or 10-cm plates (30-50% confluence) using various cationic lipids such as oligofectamine, lipofectamine (Life Technologies), NC388, L8 (Atugen, Berlin). RNAi was transfected by adding a serum-free medium solution of a complex of siRNA and lipid previously prepared at a 5-fold concentration to cells in complete medium. The total transfection volume was 100 μl for cells plated in 96 wells and 10 ml for cells on 10 cm plates. The final lipid concentration was 0.8-1.2 μg / ml depending on cell density; siRNA concentrations are indicated for each experiment.
ウエスタンブロットの結果を図13に示す。この図から分かるように、94A2B1および94A2B2型の修飾RNAi分子は非修飾分子と同様に、持続的なPTENタンパク質ノックダウンを生じた。本実験では、図12でも観察された94A1B1および94A1B2型分子がタンパク質ノックダウンを示さないことも確認された。非修飾分子(80AB)には、細胞を連続的にトランスフェクションしない場合には、強力なタンパク質ノックダウンを長時間維持する能力はなかった。 The result of the Western blot is shown in FIG. As can be seen from this figure, 94A2B1 and 94A2B2 type modified RNAi molecules, like the unmodified molecules, produced sustained PTEN protein knockdown. In this experiment, it was also confirmed that the 94A1B1 and 94A1B2 type molecules observed in FIG. 12 did not show protein knockdown. The unmodified molecule (80AB) did not have the ability to maintain strong protein knockdown for long periods of time when cells were not continuously transfected.
RNAi分子の2’−O−メチル交互修飾による持続的PTENタンパク質ノックダウン
実験方法は、トランスフェクションを5時間後にトランスフェクション培地を新規培地と交換することで停止した以外は実施例10に概要を示した方法と同様であった。プロトコールを若干変更し、各RNAi分子の濃度が、実施例1に関し記載した1μgRNAi/mlカチオン脂質の保存液を用いて40nMになるようにした。トランスフェクション後5時間目に、培地を取り去り、新鮮なEMEMを加えた。72時間後に細胞を分割し、半分を溶解し、残り半分は新たにプレーティングしてから24時間後(トランスフェクション後96時間目)に溶解した。3種類のRNAi分子(80AB、94A1/B2、94A2/B1)を用いたウエスタンブロットの結果を図14に示す。陽性コントロールとして、未処理細胞を用いた。図14は72時間および96時間後それぞれのPTENの発現を示している。該各種RNAi分子の構造特性を考慮すると、図14からは、非修飾RNAi分子(例えば80AB)およびRNAi分子94A1B2に対し、92A2B1のような交互型分子では、細胞分割、再プレーティング後96時間においてもタンパク質ノックダウンが持続することが分かる。
Persistent PTEN protein knockdown by alternating 2'-O-methyl modification of RNAi molecules The experimental method is outlined in Example 10 except that transfection was stopped after 5 hours by replacing the transfection medium with a new medium. It was the same as that method. The protocol was slightly modified so that the concentration of each RNAi molecule was 40 nM using the 1 μg RNAi / ml cationic lipid stock solution described for Example 1. At 5 hours after transfection, the medium was removed and fresh EMEM was added. Cells were split after 72 hours, half were lysed and the other half was lysed 24 hours after fresh plating (96 hours after transfection). The results of Western blotting using three types of RNAi molecules (80AB, 94A1 / B2, 94A2 / B1) are shown in FIG. Untreated cells were used as a positive control. FIG. 14 shows the respective PTEN expression after 72 and 96 hours. Considering the structural characteristics of the various RNAi molecules, it can be seen from FIG. 14 that, in contrast to the unmodified RNAi molecule (for example, 80AB) and the RNAi molecule 94A1B2, the alternating molecule such as 92A2B1 is 96 hours after cell division and re-plating. It can also be seen that protein knockdown persists.
図15A(左パネル)に示したsiRNA構築物を用いて更に実験を行った。試験システムに加えられたsiRNA構築物の各種濃度でのPTEN/p110αmRNA分解比として表された結果から、一方または両方の鎖が2’−O−メチル残基から成るsiRNA分子はほ乳動物ではRNA干渉を誘導できないことが分かる(図15A、分子V2、V5、V6)。しかし鎖の一部でも修飾を受けると活性の低下はより小さくなった。興味深いことに、非修飾アンチセンス鎖(特に指示しない場合には、本明細書を通して上側の鎖を指す)および完全修飾センス鎖とを有する分子は、逆の型(図5A、分子V5およびV6)の分子に比べ顕著に活性が高かった。この結果は、siRNAのアンチセンス鎖がより重要であり、そして修飾に対し感受性であることを示唆している。PTEN mRNA誘導に最も効果的な分子は、5’末端を未修飾の状態、または両鎖共に交互の位置で修飾されている修飾ストレッチだけを有していた(図15A、分子V10、V12)。 Further experiments were performed using the siRNA construct shown in FIG. 15A (left panel). From the results expressed as PTEN / p110α mRNA degradation ratios at various concentrations of siRNA constructs added to the test system, siRNA molecules in which one or both strands consist of 2′-O-methyl residues do not interfere with RNA interference in mammals. It can be seen that it cannot be induced (FIG. 15A, molecules V2, V5, V6). However, when even a part of the chain was modified, the decrease in activity was smaller. Interestingly, molecules with an unmodified antisense strand (referring to the upper strand throughout the specification unless otherwise indicated) and a fully modified sense strand are in the opposite form (FIG. 5A, molecules V5 and V6). The activity was significantly higher than that of the other molecule. This result suggests that the antisense strand of siRNA is more important and sensitive to modification. The most effective molecule for PTEN mRNA induction had only the modified stretch that was unmodified at the 5 'end, or modified in alternating positions on both strands (Figure 15A, molecules V10, V12).
ヌクレアーゼ耐性を試験するために、様々な型のsiRNAを血清中でインキュベーションし、続いてPAAゲル電気泳動にかけた。結果を図15Bに示した(図15Bの右パネル、左パネルには各種配列を示している)。前述した通り、非修飾リボヌクレオチド型の平滑端siRNA分子は非常に速やかに分解されたのに対し、2’−O−メチルヌクレオチドで完全に置換されたものは、血清由来ヌクレアーゼに対し耐性を示した(図15B、分子ABとV1を比較)。部分的に2’−O−メチル修飾されたsiRNA分子も同様に、非修飾siRNAに比べ安定性が増していた。特に両鎖が交互に修飾されている分子は安定性が顕著に増加していた(図15B、分子V13、V14、V15およびV12)。より重要なことは、これら分子のうちの3種類をHeLa細胞内にトランスフェクションしたところ、図15C(長さ6、9および10)に示すようにPTENタンパク質の発現が明らかなダウンレギュレーションを受けたことである。このRNA干渉活性アッセイでは、予想外にもアンチセンス鎖の5’最末端のヌクレオチドより始まり、1つおきにヌクレオチドが修飾されている分子が好ましかった。アンチセンス鎖5’末端側2番目のヌクレオチドから修飾が開始する分子はより安定であったが、遺伝子サイレンシング活性は大きく低下していた(分子V13、V14)。この結果は、関係する酵素とsiRNA二本鎖内の特定ヌクレオチドとの間で極めて特異的な相互作用があることを示している。ここに示したデータをまとめると、siRNA二本鎖内の特に選ばれた位置の2’−O−メチル修飾はヌクレアーゼ耐性を高めることができ、RNAiを必ずしも完全には破壊しない。
To test for nuclease resistance, various types of siRNA were incubated in serum followed by PAA gel electrophoresis. The results are shown in FIG. 15B (various arrangements are shown on the right and left panels of FIG. 15B). As described above, unmodified ribonucleotide-type blunt-ended siRNA molecules were degraded very quickly, whereas those completely substituted with 2'-O-methyl nucleotides were resistant to serum-derived nucleases. (FIG. 15B, comparing molecules AB and V1). Partially 2'-O-methyl modified siRNA molecules were similarly more stable than unmodified siRNA. In particular, the molecules in which both chains were alternately modified had a markedly increased stability (FIG. 15B, molecules V13, V14, V15 and V12). More importantly, when three of these molecules were transfected into HeLa cells, PTEN protein expression was clearly down-regulated, as shown in FIG. 15C (
合成siRNAの安定性増加はインビボでの応用にとって重要な意味を持つが、特定の修飾が細胞培養系におけるタンパク質ノックダウンも促進するか分析した。そのためにHeLa細胞を各種PTEN特異的siRNAを用いて、6時間、一過的にトランスフェクションした。次に脂質siRNA複合体を洗い流し、48時間および120時間後にPTENタンパク質ノックダウンを分析した。siRNAのトランスフェクションを継続しないノックダウン実験は、その期間中にトランスフェクションしていない細胞が急速に増殖して極めて一過的なノックダウンを生じせしめることから複雑になるが、本発明者は記載の2’−O−メチル修飾により安定化したsiRNA分子を用いて、長期間のPTENタンパク質ノックダウンを実証できた。トランスフェクション後48時間の時点では、非修飾siRNA(AB)は最大のPTENタンパク質レベル減少を示したが、トランスフェクション後120時間の時点ではPTENタンパク質発現の減少は、2’−O−メチル交互修飾により安定化したsiRNAがより優れていた(図15D、レーン2とレーン5、6および7とを比較)。
Although increased stability of synthetic siRNAs has important implications for in vivo applications, it was analyzed whether specific modifications also promote protein knockdown in cell culture systems. For this purpose, HeLa cells were transiently transfected with various PTEN-specific siRNAs for 6 hours. The lipid siRNA complex was then washed away and PTEN protein knockdown was analyzed after 48 and 120 hours. Although knockdown experiments that do not continue with transfection of siRNA are complicated by the rapid growth of untransfected cells during that period, resulting in very transient knockdown, the inventor has described. Long-term PTEN protein knockdown could be demonstrated using siRNA molecules stabilized by a 2'-O-methyl modification of. At 48 hours post-transfection, unmodified siRNA (AB) showed the greatest reduction in PTEN protein levels, but at 120 hours post-transfection, the decrease in PTEN protein expression was 2′-O-methyl alternating modification. The siRNA stabilized by (Figure 15D, compare
この結果より、むしろ交互修飾の開始ヌクレオチド位置が重要である思われることも分かる。このことを詳細試験するために、2種類のsiRNAシリーズ、1つはキナーゼAkt1に特異的であり、もう一つはPI(3−)キナーゼの2つある触媒サブユニットの1つであるp110βに特異的であるものを追加合成した。具体的な構造を図16Aに示す。これより明らかなように、修飾されていないか、または1ヌクレオチドおきに2’−O−メチル修飾されている19nt長のsiRNA二本鎖のみを使用した。Akt1を標的に用いた時、平滑な非修飾siRNAで効果的なタンパク質ノックダウンならびにリン酸−Aktレベルが大きく低下するのが観察された(図16A、右パネル)。1ヌクレオチドおきに修飾された様々な型の分子では、1種類だけが効率的にRNAiを媒介した(図16A、分子V5)このsiRNA分子は最末端の5’および3’ヌクレオチドが修飾されたアンチセンス鎖を含んでいた。センス鎖は最末端位置が非修飾ヌクレオチドで始まるために、両鎖の修飾および非修飾リボヌクレオチドが向合う構造となる。予想通り、この分子もまた、図16Bに示すように(分子V5)血清由来ヌクレアーゼから保護された。 It can also be seen from this result that the starting nucleotide position of the alternating modification appears to be important. To test this in detail, two siRNA series, one specific to the kinase Akt1, and the other to p110β, one of the two catalytic subunits of the PI (3-) kinase, Additional ones that were specific were synthesized. A specific structure is shown in FIG. 16A. As is evident from this, only 19 nt long siRNA duplexes that were either unmodified or 2'-O-methyl modified every other nucleotide were used. When Akt1 was used as a target, an effective protein knockdown with a smooth unmodified siRNA and a significant reduction in phosphate-Akt levels were observed (FIG. 16A, right panel). For the various types of molecules modified every other nucleotide, only one type efficiently mediated RNAi (FIG. 16A, molecule V5). This siRNA molecule was modified with anti-terminal 5 ′ and 3 ′ nucleotides modified. It contained the sense strand. The sense strand has a structure in which the modified and unmodified ribonucleotides of both strands face each other because the most terminal position starts with an unmodified nucleotide. As expected, this molecule was also protected from serum-derived nucleases as shown in FIG. 16B (molecule V5).
興味深いことに、アンチセンス鎖の第2ヌクレオチドから修飾が始まる、極めて類似した19nt長のsiRNA分子(V4)は用いたアッセイではRNA干渉活性を示さなかった。アンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドがセンス鎖の修飾ヌクレオチドと向合っているV6型もまた、今回の実験で不活性であった。p110βに特異的である19nt長の同シリーズのsiRNA分子についても、図16Cに示す様に、この観察結果が確認された。さらに、同様の修飾siRNA分子(V5)が最も活性でることが、p110βレベルの低下によるP(I)−3キナーゼ活性の低下の指標である、Aktリン酸化の低下から示された。分子V6の活性が低いことは、21merのsiRNAを用いたPTENノックダウン実験で同構造体が活性を有していたことから、二本鎖の安定性の低下から説明できるだろう。対面する両鎖が2’−O−メチル修飾されると核酸二本鎖の安定性は低下するが、siRNA分子V4とV5の間の差は(図16BおよびC)は、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチド間の塩基対合数がおなじであることから、二本鎖の安定性の違いに拠るものではないだろう。活性のこの差は、標的mRNAの分解に関係する相互作用タンパク質に於ける特異条件に拠るものであろう。また、これら実験よりアンチセンス鎖の最末端ヌクレオチドを2’−OH−基位置で修飾すると、サイレンシング活性を大きく消失できることが分かる。 Interestingly, a very similar 19 nt long siRNA molecule (V4), starting from the second nucleotide of the antisense strand, showed no RNA interference activity in the assay used. Form V6, in which the modified nucleotide of the antisense strand faces the modified nucleotide of the sense strand, was also inactive in this experiment. This observation result was also confirmed for the siRNA molecules of the same series of 19 nt length specific to p110β, as shown in FIG. 16C. Furthermore, the same activity of the same modified siRNA molecule (V5) was shown by the decrease in Akt phosphorylation, which is an indicator of the decrease in P (I) -3 kinase activity due to the decrease in p110β level. The low activity of molecule V6 may be explained by the reduced stability of the double strand, since the structure was active in PTEN knockdown experiments using 21-mer siRNA. When both facing strands are 2′-O-methyl modified, the stability of the nucleic acid duplex decreases, but the difference between siRNA molecules V4 and V5 (FIGS. 16B and C) is similar to the modified nucleotide and unmodified Since the number of base pairs between nucleotides is the same, it may not depend on the difference in duplex stability. This difference in activity may be due to specific conditions in the interacting protein involved in target mRNA degradation. Also, these experiments show that silencing activity can be largely lost by modifying the most terminal nucleotide of the antisense strand at the 2'-OH-group position.
各種ループ構造がRNA干渉の媒介で機能する。RNAi分子、好ましくは自己相補的構造を持つ合成RNAi分子が標準の2本鎖siRNA分子と同様に効率的に遺伝子発現を阻害できるか試験するために、HeLa細胞にp110β特異的合成siRNAをトランスフェクションした。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、といった各種カチオン性脂質を用いて、96ウエルまたは10−cmプレートの中で(30〜50%集密度)行い、GeneBlocsは前もって5倍濃度で調製しておいたGBと脂質との複合物の無血清培地液を完全培地中の細胞に加えることでトランスフェクションした。トランスフェクションの全容積は96ウエルにプレーティングした細胞の場合は100μlであり、10cmプレートの細胞では10mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて0.8〜1.2μg/mlであった;siRNAの濃度は実験毎に示す。
Various loop structures function in mediating RNA interference. To test whether RNAi molecules, preferably synthetic RNAi molecules with self-complementary structures, can inhibit gene expression as efficiently as standard double-stranded siRNA molecules, transfection of p110β-specific synthetic siRNA into HeLa cells did. Transfection was performed in 96-well or 10-cm plates (30-50% confluence) using various cationic lipids such as oligofectamine and lipofectamine (Life Technologies), with
用量依存力価測定からは、リアルタイムPCR(Taqman)で分析した場合に、標準的な2分子型の2本鎖21merと対応する1分子型分子により達成されるmRNAノックダウンの効率に有意な差は示されなかった(図17A)。2種類のループ構造、(A)12ループおよびHIV由来のpAループも平行して試験したが、結果は同様であった。アンチセンス配列の相対的な位置とループ構造とを比較すると、アンチセンス配列がループに対し3’側に位置したときにノックダウン効率が向上した(図17B:構築物3A、3Bと4A、4Bを比較せよ)。 From dose-dependent titration, there is a significant difference in the efficiency of mRNA knockdown achieved by the standard bimolecular double-stranded 21mer and the corresponding single molecule when analyzed by real-time PCR (Taqman). Was not shown (FIG. 17A). Two types of loop structures, (A) 12 loops and pA loops derived from HIV were also tested in parallel with similar results. Comparing the relative position of the antisense sequence and the loop structure, knockdown efficiency was improved when the antisense sequence was located 3 ′ to the loop (FIG. 17B: constructs 3A, 3B and 4A, 4B Compare).
各種分子内ヘアピンループおよび分子内「バブル」の効果に関する試験
mRNAおよびタンパク質発現阻害に及ぼす各種ループ構造の影響を試験した。これら実験については、標的としてAkt1およびAkt2を選択した。実験方法は実施例12に記載の方法と同様であった。
Tests on the effects of various intramolecular hairpin loops and intramolecular “bubbles” The effects of various loop structures on mRNA and protein expression inhibition were tested. For these experiments, Akt1 and Akt2 were selected as targets. The experimental method was similar to the method described in Example 12.
図18Aおよび図18Bに示すAkt1 mRNAの減少、ならびに図18Cに示すAkt1タンパク質レベルの低下は、明らかに、試験したループ構造と完全に独立していた(分子5A、6A、7A、8Aを比較せよ)(試験したRNAi分子の構造は棒グラフの下に示している)。ループとしてポリエチレングリコールリンカー(PEG)の様な非生理学的構造を含む分子でさえAkt1の発現を効率的に下げたことから、ループのサイズおよびヌクレオチド配列は重要でないことが示された(図18A;分子8A)。Akt2特異的合成siRNA分子(9A)を用いて特異性をコントロールしたが、図15Aに示すようにAkt1レベルには影響しなかった。しかしこの分子は、Akt2の発現を効果的に抑制した(図18B;図18C)。ループ構造を持った自己相補的RNA分子は、生理学的ハイブリダイゼーション条件に於いてアニーリングし、1分子または2分子構造における2本鎖を形成する可能性がある(図18B、ループまたはバブル構造)。siRNA分子が、分子内ループまたは分子間「バブル」(図18Bに図示した)を採ることでその機能を発揮するのかという疑問に答えるために、それ自身に折り戻ることができない2つの分子をトランスフェクションした。これら構築物は同一分子内にAkt1−およびAkt2−特異的配列を含有しており(図18D、構築物10A、10B)、2分子型二本鎖(「バブル」)を形成するように制限されている。驚くべき事にこの分子は、両鎖をアニーリングした後トランスフェクションするとAkt1およびAkt2 mRNAのノックダウンだけでなくタンパク質のノックダウンも効率的に媒介した。
The decrease in Akt1 mRNA shown in FIGS. 18A and 18B and the decrease in Akt1 protein level shown in FIG. 18C was clearly completely independent of the loop structure tested (compare
現時点では、ループおよびバブル構造が実際にRNAプロセッシング酵素、例えばDicerの基質であるか否かについては不明である。Paddisonと共同研究者による最近の研究は、ヘアピン含有siRNAは2本鎖siRNAよりもDicer活性により依存的であることを示している。しかし、PEGリンカー分子を用いたRNA干渉活性を証明したこれらデータは、リンカーの配列は無関係であるらしいことを示している。 At present, it is unclear whether loops and bubble structures are actually substrates for RNA processing enzymes, such as Dicer. Recent studies by Paddison and coworkers show that hairpin-containing siRNAs are more dependent on Dicer activity than double-stranded siRNAs. However, these data, which demonstrated RNA interference activity using PEG linker molecules, indicate that the linker sequence appears to be irrelevant.
明細書、特許請求の範囲、および/または図面に開示した本発明の特徴は、単独または組み合わせた、様々な形での本発明実現化の素材とするものである。 The features of the invention disclosed in the description, the claims and / or the drawings are intended to make the invention a reality in various forms, either alone or in combination.
Claims (46)
前記第1鎖および/または前記第2鎖が2’−位置に修飾を有する修飾ヌクレオチドの複数の群を含み、鎖内の修飾ヌクレオチドの各群はヌクレオチドのフランキング群により片側または両側をフランキングされており、ヌクレオチドのフランキング群を形成しているフランキングヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドまたは前記修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドであることを特徴とするリボ核酸。 A double-stranded structure, wherein the double-stranded structure comprises a first strand and a second strand, the first strand comprising a first stretch of contiguous nucleotides, wherein the first stretch is at least partially with the target nucleic acid A ribonucleic acid that is complementary and the second strand comprises a second stretch of contiguous nucleotides, the second stretch being at least partially identical to the target nucleic acid,
The first strand and / or the second strand comprises a plurality of groups of modified nucleotides having modifications in the 2'-position, each group of modified nucleotides in the strand flanking one or both sides by a flanking group of nucleotides A ribonucleic acid, wherein the flanking nucleotides forming a flanking group of nucleotides are unmodified nucleotides or nucleotides having a modification different from the modification of the modified nucleotide.
前記修飾ヌクレオチドの各群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、そして前記ヌクレオチドの各フランキング群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み;
第1鎖の修飾ヌクレオチドの各群が第2鎖のヌクレオチドのフランキング群と整合し、この時
第1鎖の最末端5’ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群のヌクレオチドであり、
第2鎖の最末端3’ヌクレオチドがヌクレオチドのフランキング群のヌクレオチドである、
請求項1〜27のいずれか1項に記載のリボ核酸。 Both the first strand and the second strand each comprise at least one modified nucleotide group and at least one nucleotide flanking group;
Each group of modified nucleotides comprises at least one nucleotide and each flanking group of nucleotides comprises at least one nucleotide;
Each group of modified nucleotides in the first strand is aligned with the flanking group of nucleotides in the second strand, where the most terminal 5 ′ nucleotide of the first strand is a nucleotide in the modified nucleotide group;
The terminal 3 ′ nucleotide of the second strand is a nucleotide in the flanking group of nucleotides;
The ribonucleic acid according to any one of claims 1 to 27.
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