JP2006321890A - Purification method of chemical substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学物質の精製方法に関する。さらに詳しくは、化学物質に不純物として含まれているエンドトキシンの不活化や除去を効率的かつ簡便に行うことができる化学物質の精製方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying a chemical substance. More specifically, the present invention relates to a method for purifying a chemical substance that can efficiently and easily perform inactivation and removal of endotoxin contained as an impurity in the chemical substance.
エンドトキシンは、生体内における発熱性物質として知られており、生体に投与されると、体温が顕著に上昇したり、組織に炎症反応を生じるなどの悪影響を及ぼす。タンパク質や多糖類などの化学物質は、生体に対する安全性や生体内での分解・吸収性が良好であるため、医療用途に用いられている。しかし、その多くは、生物に由来のものであるため、高濃度でエンドトキシンを含有することがある。 Endotoxin is known as a pyrogenic substance in a living body, and when administered to a living body, it has adverse effects such as a significant increase in body temperature and an inflammatory reaction in tissues. Chemical substances such as proteins and polysaccharides are used for medical purposes because they are safe for living bodies and have good decomposition and absorption in vivo. However, many of them are derived from organisms and may contain endotoxins at high concentrations.
従来、医薬品、医療用具およびこれらの原料となる化学物質からエンドトキシンを除去したり、不活化させる方法が検討されている。その具体的な方法として、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換樹脂などを用いる吸着除去法、蒸留、限外濾過、逆浸透、ゲル濾過、荷電修飾膜などを用いる分離除去法、加熱分解、酸加水分解、アルカリ加水分解、酸化などを利用する不活化法などが知られている（例えば、非特許文献１参照）。 Conventionally, methods for removing or inactivating endotoxins from pharmaceuticals, medical devices, and chemical substances used as raw materials for these have been studied. Specific methods include, for example, adsorption chromatography using affinity chromatography, ion exchange resin, etc., distillation, ultrafiltration, reverse osmosis, gel filtration, separation and removal using a charge-modified membrane, thermal decomposition, acid hydrolysis, and the like. An inactivation method using decomposition, alkaline hydrolysis, oxidation, or the like is known (for example, see Non-Patent Document 1).
しかしながら、吸着除去法および分離除去法は、溶液物質に対する処理が簡便であるが、ゲル濾過や限外濾過による除去の際に化学物質の分子量分布の一部がエンドトキシンの分子量と一致するため、エンドトキシンのみを選択的に除去することが困難となることがある。 However, the adsorption removal method and the separation / removal method are easy to process for solution substances, but the endotoxin molecular weight distribution partially matches the molecular weight of endotoxin during removal by gel filtration or ultrafiltration. It may be difficult to selectively remove only.
また、化学物質が酸性多糖類などのアニオン性基を有する高分子化合物である場合には、その高分子化合物に含まれているエンドトキシンもアニオン性であるため、両者の吸着反応が競争的に進むことから、処理効率が極めて低くなる。 In addition, when the chemical substance is a polymer compound having an anionic group such as an acidic polysaccharide, the endotoxin contained in the polymer compound is also anionic, so that the adsorption reaction of the both proceeds competitively. As a result, the processing efficiency is extremely low.
このようなことから、吸着除去法および分離除去法は、いずれも、化学物質、特に高分子化合物、なかでも特に酸性多糖類に含まれているエンドトキシンを除去するのに不十分な方法である。 For this reason, both the adsorption removal method and the separation removal method are insufficient methods for removing endotoxins contained in chemical substances, particularly high molecular compounds, especially acidic polysaccharides.
一方、不活化法は、分解によってエンドトキシンを不活化させる方法であり、その不活化法には、過酸化水素や次亜塩素酸などの酸化剤で酸化処理する方法、高温の酸性溶液で処理する酸分解法、アルカリ溶液で処理するアルカリ分解法などがある。 On the other hand, the inactivation method is a method of inactivating endotoxin by decomposition, and the inactivation method includes a method of oxidizing with an oxidizing agent such as hydrogen peroxide or hypochlorous acid, or a high temperature acidic solution. There are an acid decomposition method, an alkali decomposition method of treating with an alkaline solution, and the like.
この不活化法によれば、エンドトキシンの活性部位であるリピドＡが分解されるものと思われる。しかし、この方法には、エンドトキシンを有効な量にまで不活化させるのには高濃度の処理剤を使用する必要があるため、エンドトキシンのみならず、所望の化学物質の分解も著しくなり、分子量の低下や官能基の分解などにより、化学物質本来の特性を損なうことがある。また、エンドトキシンが処理後の系から高度に除去された化学物質の精製物を簡便に取り出すことができていない。 According to this inactivation method, lipid A which is an active site of endotoxin is considered to be degraded. However, this method requires the use of a high concentration of treating agent to inactivate endotoxin to an effective amount, which results in significant degradation of not only endotoxin but also the desired chemicals, The original properties of chemical substances may be impaired due to degradation or functional group degradation. In addition, a purified chemical product from which endotoxin has been highly removed from the system after treatment cannot be easily removed.
したがって、近年、医用高分子化合物などの化学物質に不純物とて含まれているエンドトキシンを効率よく除去し、不活化させるとともに、当該化学物質の分解を抑制し、安全性に優れた精製物を簡便に取得しうる方法の開発が望まれている。 Therefore, in recent years, endotoxins contained as impurities in chemical substances such as medical polymer compounds can be efficiently removed and inactivated, and decomposition of the chemical substances can be suppressed, and purified products with excellent safety can be easily obtained. Development of a method that can be obtained in the future is desired.
本発明は、医用高分子化合物などの化学物質（粗製物）に含まれているエンドトキシンを効率よく不活化および除去することができ、さらにはその際における所望の化学物質の分解を抑制することもできる化学物質の精製方法を提供することを課題とする。 The present invention can efficiently inactivate and remove endotoxin contained in a chemical substance (crude product) such as a medical polymer compound, and further suppress the decomposition of a desired chemical substance at that time. It is an object to provide a method for purifying a chemical substance that can be produced.
本発明は、化学物質（ａ）を主成分として含有し、かつエンドトキシン（ｂ）を不純物として含有する粗製物と、化学物質（ａ）に対して非溶解性である液状物質（ｃ）とを塩基性条件下に接触させることを特徴とする化学物質の精製方法に関する。 The present invention comprises a crude product containing a chemical substance (a) as a main component and endotoxin (b) as an impurity, and a liquid substance (c) that is insoluble in the chemical substance (a). The present invention relates to a method for purifying a chemical substance, characterized by contacting under basic conditions.
本発明の化学物質の精製方法によれば、化学物質（粗製物）に含まれているエンドトキシンを簡便にかつ効率よく除去し、不活化させることができ、さらにはその際における該化学物質の分解を抑制することができるので、安全性に優れ、医用に適した化学物質（精製物）を得ることができる。得られた化学物質（精製物）は、例えば、創傷被覆材、創傷治療材、組織再生用材料、細胞培養材料などの細胞外マトリクスなどの用途に好適に使用することができる。 According to the method for purifying a chemical substance of the present invention, endotoxin contained in a chemical substance (crude product) can be easily and efficiently removed and inactivated, and further, the chemical substance is decomposed at that time. Therefore, a chemical substance (purified product) excellent in safety and suitable for medical use can be obtained. The obtained chemical substance (purified product) can be suitably used for applications such as an extracellular matrix such as a wound dressing material, a wound treatment material, a tissue regeneration material, and a cell culture material.
本発明の精製方法によれば、所望の化学物質（ａ）を主成分として含有し、かつエンドトキシン（ｂ）を不純物として含有する粗製物（以下、単に「粗製物」ということがある）と、化学物質（ａ）に対して非溶解性である液状物質（ｃ）とを塩基性条件下に接触させることにより、化学物質（ａ）の精製物を得ることができる。 According to the purification method of the present invention, a crude product containing the desired chemical substance (a) as a main component and containing endotoxin (b) as an impurity (hereinafter sometimes simply referred to as “crude product”), A purified product of the chemical substance (a) can be obtained by contacting the liquid substance (c) that is insoluble in the chemical substance (a) under basic conditions.
本発明で用いられる化学物質（ａ）としては、限定されるものではないが、高分子化合物、特に医薬品、医療用具やその原料で医用高分子化合物として用いられるものが好ましい。 The chemical substance (a) used in the present invention is not limited, but is preferably a polymer compound, in particular, a compound used as a medical polymer compound in pharmaceuticals, medical devices and their raw materials.
一般に、高分子化合物は、その製造方法やその由来から、合成高分子化合物および天然高分子化合物に分類される。それらの中でも、天然物由来の高分子化合物には生体適合性に優れたものが種々存在することから、このように生体適合性に優れた天然物由来の高分子化合物が医用分野において広く利用されている。 In general, polymer compounds are classified into synthetic polymer compounds and natural polymer compounds based on their production methods and their origins. Among them, there are various types of polymer compounds derived from natural products that are excellent in biocompatibility, and thus such polymer compounds derived from natural products that are excellent in biocompatibility are widely used in the medical field. ing.
一方、天然物由来の高分子化合物には、エンドトキシンが高濃度で含まれていることがあるので、本発明の精製方法は、このような天然物由来の高分子化合物に対して好適に用いることができる。 On the other hand, high molecular compounds derived from natural products may contain a high concentration of endotoxin. Therefore, the purification method of the present invention is preferably used for such natural compound-derived polymeric compounds. Can do.
天然物由来の高分子化合物としては、例えば、タンパク質、多糖類およびこれらの複合体などの水溶性高分子化合物が挙げられる。タンパク質の多くは、加熱や化学処理によって変性しやすく、また、多糖類の多くは、加熱や化学処理によって分解しやすい。本発明の精製方法は、このような化学処理や加熱によって変性や分解を受けやすい高分子化合物、特に多糖類などの天然物由来の高分子化合物に対して好適に用いことができる。 Examples of the polymer compound derived from a natural product include water-soluble polymer compounds such as proteins, polysaccharides, and complexes thereof. Many proteins are easily denatured by heating or chemical treatment, and many polysaccharides are easily degraded by heating or chemical treatment. The purification method of the present invention can be suitably used for such polymer compounds that are susceptible to modification and decomposition by chemical treatment or heating, particularly polymer compounds derived from natural products such as polysaccharides.
タンパク質としては、組成、起源、成因、溶解度などから分類される単純タンパク質（アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質など）、複合タンパク質（核タンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質など）、誘導タンパク質（ゼラチン、プロテオース、ペプトンなど）、分子形状から分類される繊維状タンパク質（コラーゲン、ケラチン、フィブロイン）、球状タンパク質などが挙げられる。これらのタンパク質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。 Proteins include simple proteins (albumins, globulins, prolamins, glutelins, histones, protamines, hard proteins, etc.) and complex proteins (nuclear proteins, glycoproteins, chromoproteins, phosphoproteins) classified by composition, origin, origin, solubility, etc. Etc.), derived proteins (gelatin, proteose, peptone, etc.), fibrous proteins classified by molecular shape (collagen, keratin, fibroin), globular proteins and the like. These proteins may be used alone or in combination of two or more.
多糖類としては、例えば、セルロース、アガロース、デンプンなどの単純多糖類、アルギン酸などのポリウロン酸類、カラギーナン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などのムコ多糖類（またはポリグリコサミン類）などが挙げられ、これらの多糖類は、それぞれ単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、多糖類は、生体適合性のある塩や誘導体であってもよい。これらのなかでは、化学処理や加熱によって分解されがたいアルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などの酸性多糖類、それらの塩およびそれらの誘導体、ならびにキチン、キトサンおよびそれらの塩または誘導体が好ましく、アルギン酸、ヒアルロン酸、それらの塩およびそれらの誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種がより好ましく、アルギン酸がさらに好ましい。 Examples of the polysaccharide include simple polysaccharides such as cellulose, agarose and starch, polyuronic acids such as alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, chitin, chitosan, mucopolysaccharides such as chondroitin sulfate, heparin and keratan sulfate (or polyglycosamine). These polysaccharides may be used alone or in admixture of two or more. The polysaccharide may be a biocompatible salt or derivative. Among these, acidic polysaccharides such as alginic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparin, and keratan sulfate, which are difficult to be decomposed by chemical treatment or heating, their salts and their derivatives, and chitin, chitosan and their salts or derivatives At least one selected from the group consisting of alginic acid, hyaluronic acid, salts thereof and derivatives thereof is more preferable, and alginic acid is more preferable.
また、本発明で用いられる化学物質（ａ）には、その使用目的に応じて種々の機能を付与するための官能基が導入されていてもよい。導入される官能基としては、特に制限はないが、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール類、ポリアルキレングリコール類から誘導される（ポリ）オキシアルキレン基、アミンから誘導される基、スルホン酸基、硫酸基、アミノ酸や生理活性ペプチドなどから誘導される基などが挙げられる。天然由来の高分子化合物などに官能基を導入する方法は、特に制限されず、官能基の導入に用いる化合物の種類に応じて適当な導入法を採用すればよい。 Moreover, the functional group for providing various functions may be introduce | transduced into the chemical substance (a) used by this invention according to the use purpose. The functional group to be introduced is not particularly limited. For example, alkylene glycols such as ethylene glycol and propylene glycol, (poly) oxyalkylene groups derived from polyalkylene glycols, groups derived from amines, sulfones Examples include groups derived from acid groups, sulfate groups, amino acids, bioactive peptides, and the like. The method for introducing a functional group into a naturally derived polymer compound or the like is not particularly limited, and an appropriate introduction method may be employed depending on the type of compound used for introducing the functional group.
本発明で用いられる化学物質（ａ）の分子量は、特に制限がなく、医用材料の使用目的などに合わせて適時選択すればよい。一般的には、分子量が１０００〜１０００万の範囲内にある高分子化合物が好ましく、そのなかでも水溶性の高分子化合物がより好ましい。 The molecular weight of the chemical substance (a) used in the present invention is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the purpose of use of the medical material. In general, a polymer compound having a molecular weight in the range of 1,000 to 10,000,000 is preferable, and a water-soluble polymer compound is more preferable.
なお、化学物質（ａ）は、溶解性、吸水性、生体内での分解性、膨潤性などを制御するために、架橋されていてもよい。 The chemical substance (a) may be cross-linked in order to control solubility, water absorption, in vivo decomposability, swellability, and the like.
本発明の精製方法に供される粗製物は、化学物質（ａ）を主成分として含有し、かつエンドトキシン（ｂ）を不純物として含有する。粗製物中の化学物質（ａ）およびエンドトキシンの各含有量は、粗製物が化学物質（ａ）を主成分として含有し、かつエンドトキシン（ｂ）を不純物として含有するのであれば特に限定されるものではないが、一般的には、粗製物における化学物質（ａ）の含有量が５０重量％以上、好ましくは６０〜１００重量％であり、エンドトキシンの含有量が１０００〜１００００００００ＥＵ／ｇ、好ましくは５０００〜１００００００ＥＵ／ｇであることが望ましい。 The crude product subjected to the purification method of the present invention contains the chemical substance (a) as a main component and endotoxin (b) as an impurity. Each content of chemical substance (a) and endotoxin in the crude product is particularly limited as long as the crude product contains chemical substance (a) as a main component and endotoxin (b) as an impurity. However, in general, the content of the chemical substance (a) in the crude product is 50% by weight or more, preferably 60 to 100% by weight, and the endotoxin content is 1000 to 100000000 EU / g, preferably 5000. It is desirable that it is ˜1000000 EU / g.
液状物質（ｃ）は、粗製物と塩基性条件下に接触させる際に、化学物質（ａ）に対して非溶解性を有するものである。 The liquid substance (c) is insoluble in the chemical substance (a) when it is brought into contact with the crude product under basic conditions.
本明細書において、液状物質（ｃ）が有する「非溶解性」とは、粗製物中の化学物質（ａ）が所定の塩基性条件下において液状物質（ｃ）と接触したときに完全には溶解することなく、その少なくとも一部が固体状態またはゲル状態で析出し得る程度に、化学物質（ａ）に対する溶解性が低いことを意味する。 In the present specification, the “non-solubility” of the liquid substance (c) means completely when the chemical substance (a) in the crude product comes into contact with the liquid substance (c) under a predetermined basic condition. It means that the solubility in the chemical substance (a) is low to such an extent that at least a part thereof can be precipitated in a solid state or a gel state without dissolving.
液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際に、化学物質（ａ）に対する液状物質（ｃ）の溶解性が低いほうが化学物質（ａ）の析出割合が高くなるため、固−液分離による化学物質（ａ）の回収率が高くなるので好ましい。ただし、液状物質（ｃ）との接触による化学物質（ａ）の精製の程度（すなわち、エンドトキシンを不活化させ、除去し得る程度）を高める点では、液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際に、液状物質（ｃ）が化学物質（ａ）をゲル状態で析出させる性質を有することが好ましい。 When the liquid substance (c) and the crude product are brought into contact with each other under basic conditions, the lower the solubility of the liquid substance (c) in the chemical substance (a), the higher the precipitation ratio of the chemical substance (a). This is preferable because the recovery rate of the chemical substance (a) by solid-liquid separation is increased. However, in order to increase the degree of purification of the chemical substance (a) by contact with the liquid substance (c) (that is, the degree to which endotoxin can be inactivated and removed), the liquid substance (c) and the crude product are treated with a base. It is preferable that the liquid substance (c) has a property of precipitating the chemical substance (a) in a gel state when contacting under the sexual condition.
化学物質（ａ）に対する液状物質（ｃ）の溶解性およびゲル形成能は、化学物質（ａ）の種類、接触処理条件などによって左右される。したがって、液状物質（ｃ）は、液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際に、化学物質（ａ）に対する溶解度の低さおよび膨潤度の高さを総合的に考慮して適宜選択して使用すればよい。一般に、液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際の液状物質（ｃ）に対する化学物質（ａ）の溶解度は、好ましくは１〜８０重量％、より好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは２〜３０重量％である。 The solubility and gel forming ability of the liquid substance (c) with respect to the chemical substance (a) depend on the type of the chemical substance (a), the contact treatment conditions, and the like. Therefore, when the liquid substance (c) is brought into contact with the crude substance under basic conditions, the low solubility and the high degree of swelling of the chemical substance (a) are comprehensively considered. Therefore, it may be appropriately selected and used. In general, the solubility of the chemical substance (a) in the liquid substance (c) when the liquid substance (c) and the crude product are brought into contact under basic conditions is preferably 1 to 80% by weight, more preferably 1 to 50%. % By weight, more preferably 2 to 30% by weight.
また、一般に、液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際の化学物質（ａ）の膨潤度は、エンドトキシン不活化・除去の効率、化学物質（ａ）の回収率等の観点から、好ましくは２００重量％以上、より好ましくは３００〜２００００重量％、さらに好ましくは５００〜１００００重量％である。 In general, the degree of swelling of the chemical substance (a) when the liquid substance (c) and the crude product are brought into contact with each other under basic conditions is the efficiency of inactivation / removal of endotoxin, the recovery rate of the chemical substance (a), etc. From this viewpoint, it is preferably 200% by weight or more, more preferably 300 to 20000% by weight, still more preferably 500 to 10,000% by weight.
なお、本明細書において、溶解度、膨潤度および回収率は、以下の方法によって算出されたときの値を意味する。すなわち、処理対象と同じ粗製物を、液状物質（ｃ）と粗製物とを塩基性条件下に接触させる際の条件と同じ条件（温度、他の媒体などの任意成分を含む化学組成、撹拌などの接触手段、処理時間などの条件）で、液状物質（ｃ）との接触処理に供し、化学物質（ａ）が固体状態またはゲル状態で析出した混合物を得、この混合物中で析出した化学物質（ａ）を液層から分離取得する。 In the present specification, the solubility, the degree of swelling, and the recovery rate mean values calculated by the following method. That is, the same crude product as the object to be treated is the same as the condition for bringing the liquid substance (c) and the crude product into contact with each other under basic conditions (temperature, chemical composition including optional components such as other media, stirring, etc. In a contact state with the liquid substance (c) under the condition of the contact means, treatment time, etc.) to obtain a mixture in which the chemical substance (a) is precipitated in a solid state or gel state, and the chemical substance deposited in this mixture (A) is separated and acquired from the liquid layer.
用いた粗製物中の化学物質（ａ）の重量をＷ0（ｇ）、混合物から分離取得された未乾燥の（析出がゲル状態の場合、ゲルの固相を構成する網目構造中に液体が保持されている）化学物質（ａ）の重量をＷ1（ｇ）、未乾燥の化学物質（ａ）を乾燥させた（析出がゲル状態の場合、ゲル中に保持されていた液体を除去し、固相のみとした後の）化学物質（ａ）の重量をＷ2（ｇ）としたとき、以下の式に基づいて、溶解度、膨潤度および回収率が算出される。 The weight of the chemical substance (a) in the used crude product is W0 (g), and the liquid is retained in the network structure constituting the solid phase of the gel, which is separated and acquired from the mixture (when the precipitate is in a gel state) The weight of the chemical substance (a) is W1 (g), and the undried chemical substance (a) is dried (if the precipitate is in a gel state, the liquid retained in the gel is removed and solidified. When the weight of the chemical substance (a) (after having only the phase) is W2 (g), the solubility, swelling degree and recovery rate are calculated based on the following formulas.
〔溶解度（重量％）〕＝［（Ｗ0−Ｗ2）／Ｗ0］×１００
〔膨潤度（重量％）〕＝（Ｗ1／Ｗ2）×１００
〔回収率（重量％）〕＝（Ｗ2／Ｗ0）×１００
[Solubility (wt%)] = [(W0−W2) / W0] × 100
[Swelling degree (% by weight)] = (W1 / W2) × 100
[Recovery rate (% by weight)] = (W2 / W0) × 100
本発明では、化学物質（ａ）の粗製物を塩基性条件下に液状物質（ｃ）と接触させることにより、粗製物中のエンドトキシンが不活化して除去され、化学物質（ａ）の精製物を取得することができるが、その精製操作は、
工程（１）：粗製物と液状物質（ｃ）とを塩基性条件下に混合し、
工程（２）：析出した化学物質（ａ）を分離する
ことによって行うことが、エンドトキシンに対する不活化・除去の効果に優れる点から好ましい。
In the present invention, by bringing the crude product of the chemical substance (a) into contact with the liquid substance (c) under basic conditions, endotoxin in the crude product is inactivated and removed, and a purified product of the chemical substance (a) is obtained. But the purification operation is
Step (1): The crude product and the liquid substance (c) are mixed under basic conditions,
Step (2): It is preferable to separate the deposited chemical substance (a) from the viewpoint of excellent inactivation / removal effect on endotoxin.
粗製物と液状物質（ｃ）との接触、好ましくは粗製物と液状物質（ｃ）との混合を塩基性条件下に行う方法としては、エンドトキシンに対する不活化効果および除去効率を高めることができ、かつ化学物質（ａ）に対する分解などの悪影響を少なくすることができる観点から、
方法（Ａ）：液状物質（ｃ）として、化学物質（ａ）に対して非溶解性であり、かつ塩基性化合物（ｄ）を含有する塩基性液状物質（ｃ−１）を使用し、前記工程（１）が粗製物を塩基性液状物質（ｃ−１）と混合することからなる工程である方法、または
方法（Ｂ）：前記工程（１）が、粗製物に対する液状物質（ｃ）の混合と塩基性化合物（ｄ）の混合とを、この順序または逆の順序で行うことからなる工程である方法
が好ましく、方法（Ａ）がより好ましい。
As a method of performing contact between the crude product and the liquid substance (c), preferably mixing the crude product and the liquid substance (c) under basic conditions, the inactivation effect on endotoxin and the removal efficiency can be enhanced. And from the viewpoint of reducing adverse effects such as decomposition on the chemical substance (a),
Method (A): As the liquid substance (c), a basic liquid substance (c-1) that is insoluble in the chemical substance (a) and contains the basic compound (d) is used. Process (1) is a process comprising mixing a crude product with a basic liquid substance (c-1), or method (B): The process (1) is a process for the liquid substance (c) for the crude product. A method which is a step comprising mixing and mixing the basic compound (d) in this order or the reverse order is preferred, and method (A) is more preferred.
また、粗製物は、液状物質（ｃ）との接触、好ましくは液状物質（ｃ）との混合をする際に、化学物質（ａ）に対して溶解性を有し、かつ液状物質（ｃ）に対して混和性を有する溶媒（ｅ）に粗製物を溶解させた溶液として用いることが、エンドトキシンに対する不活化効率を高める観点から好ましい。この場合、前記方法（Ａ）は、以下の方法（Ａ’）として表現され、また前記方法（Ｂ）は、以下の方法（Ｂ’）または（Ｂ”）として表現される。 The crude product is soluble in the chemical substance (a) when in contact with the liquid substance (c), preferably mixed with the liquid substance (c), and the liquid substance (c). It is preferable to use it as a solution in which a crude product is dissolved in a solvent (e) having a miscibility with respect to the endotoxin from the viewpoint of increasing the inactivation efficiency. In this case, the method (A) is expressed as the following method (A ′), and the method (B) is expressed as the following method (B ′) or (B ″).
方法（Ａ’）：前記工程（１）が、粗製物を溶媒（ｅ）に溶解させ、得られた溶液を塩基性液状物質（ｃ−１）と混合することからなる工程である方法。
方法（Ｂ’）：溶媒（ｅ）として、化学物質（ａ）に対して溶解性を有し、液状物質（ｃ）に対して混和性を有し、かつ塩基性化合物（ｄ）を含有する塩基性溶媒（ｅ−１）を使用し、前記工程（１）が、粗製物に対する塩基性溶媒（ｅ−１）の混合と液状物質（ｃ）の混合とを、この順序で行うことからなる工程である方法。
方法（Ｂ”）：前記工程（１）が、粗製物を溶媒（ｅ）に溶解させ、得られた溶液に対する液状物質（ｃ）の混合と塩基性化合物（ｄ）の混合を、この順序〔液状物質（ｃ）の混合および塩基性化合物（ｄ）の混合の順序〕でまたは逆の順序〔塩基性化合物（ｄ）の混合および液状物質（ｃ）の混合の順序〕で行うことからなる方法。
Method (A ′): The method wherein the step (1) comprises dissolving the crude product in the solvent (e) and mixing the resulting solution with the basic liquid substance (c-1).
Method (B ′): As solvent (e), soluble in chemical substance (a), miscible in liquid substance (c), and contains basic compound (d) Using the basic solvent (e-1), the step (1) comprises mixing the basic solvent (e-1) with the crude product and mixing the liquid substance (c) in this order. A method that is a process.
Method (B ″): In the step (1), the crude product is dissolved in the solvent (e), and the mixture of the liquid substance (c) and the basic compound (d) is mixed in this order [ Method of mixing in order of mixing liquid substance (c) and mixing of basic compound (d)] or in reverse order [mixing order of basic compound (d) and mixing of liquid substance (c)] .
なお、化学物質（ａ）に対する溶媒（ｅ）の溶解性は、必ずしも限られるものではないが、２０℃における溶媒（ｅ）に対する化学物質（ａ）の溶解度が、５０重量％以上であることが好ましい。 The solubility of the solvent (e) in the chemical substance (a) is not necessarily limited, but the solubility of the chemical substance (a) in the solvent (e) at 20 ° C. is 50% by weight or more. preferable.
液状物質（ｃ）としては、接触処理条件下における化学物質（ａ）に対する溶解性（化学物質（ａ）の溶解度）およびゲル形成能（化学物質（ａ）の膨潤度）を総合的に考慮して、貧溶媒および非溶媒の中から１種以上を使用することができ、また貧溶媒または非溶媒を１種以上の良溶媒と組み合わせて使用することもできる。なお、複数種類の溶媒を組み合わせて使用する場合には、エンドトキシンに対する不活化効果を高くし、また化学物質（ａ）の回収率を高くする観点から、相互に相溶して均一相を形成し得る組み合わせを選択することが好ましい。 As the liquid substance (c), comprehensively consider the solubility (solubility of the chemical substance (a)) and the gel forming ability (swelling degree of the chemical substance (a)) in the chemical substance (a) under the contact treatment conditions. In addition, one or more of poor solvents and non-solvents can be used, and the poor solvent or non-solvent can be used in combination with one or more good solvents. When a plurality of solvents are used in combination, they are compatible with each other to form a homogeneous phase from the viewpoint of increasing the inactivation effect on endotoxin and increasing the recovery rate of chemical substance (a). It is preferable to select a combination to obtain.
液状物質（ｃ）を構成する貧溶媒、非溶媒および良溶媒は、必ずしも限定されるものではないが、一般的には、水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ペンタノール、へキサノールなどのアルコール類；ヘキサン、へプタン、オクタン、シクロへキサンなどの脂肪族または脂環式の炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトンのようなケトン；エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、メチルエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル；四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素などの中から選択することができる。 The poor solvent, non-solvent and good solvent constituting the liquid substance (c) are not necessarily limited, but generally water; methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, pentanol, hexanol, etc. Alcohols; aliphatic or alicyclic hydrocarbons such as hexane, heptane, octane, cyclohexane; aromatic compounds such as benzene, toluene, xylene; acetone, ethyl methyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, isopropyl Ketones such as methyl ketone; ethers such as ethyl ether, propyl ether, isopropyl ether, methyl ethyl ether, methyl propyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; dimethyl sulfoxide Sulfoxide; N, N-amides such as dimethylformamide; methyl acetate, ethyl acetate, esters such as butyl acetate; carbon tetrachloride, chloroform, can be selected from among halogenated hydrocarbons such as dichloromethane.
液状物質（ｃ）を構成する貧溶媒、非溶媒および良溶媒の例の中では、エンドトキシンに対する不活化効果が高い観点から、アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましく、精製操作において化学物質（ａ）からの分離および除去が容易である点を加味すれば、炭素数１〜４の低級アルコールがより好ましく、精製された化学物質（ａ）中の残留量の低減が容易であり、かつ人体に対する毒性が低い点をさらに加味すれば、エタノール、プロパノールおよびイソプロピルアルコールからなる群より選ばれた少なくとも１種がより好ましい。 Among the examples of the poor solvent, non-solvent and good solvent constituting the liquid substance (c), the liquid substance (c) was selected from the group consisting of alcohol, N, N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide from the viewpoint of high inactivation effect on endotoxin. At least one kind is preferable, and in consideration of the point that separation and removal from the chemical substance (a) is easy in the purification operation, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms is more preferable, and the purified chemical substance (a) In view of the fact that it is easy to reduce the residual amount of the compound and has low toxicity to the human body, at least one selected from the group consisting of ethanol, propanol and isopropyl alcohol is more preferable.
上記のように、貧溶媒、非溶媒または良溶媒を複数種類で組み合わせて使用する場合、相互に相溶し得る組み合わせが好ましい。そのような組み合わせの例としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選ばれた２種以上の組み合わせが好ましく、水とメタノールとの組み合わせ、水とエタノールとの組み合わせ、水とプロパノールとの組み合わせ、または水とイソプロピルアルコールとの組み合わせがより好ましい。 As described above, when a plurality of poor solvents, non-solvents, or good solvents are used in combination, a combination that is compatible with each other is preferable. Examples of such combinations are preferably two or more combinations selected from the group consisting of water, methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide and N, N-dimethylformamide, and a combination of water and methanol. A combination of water and ethanol, a combination of water and propanol, or a combination of water and isopropyl alcohol is more preferable.
化学物質（ａ）が多糖類、タンパク質、それらの複合体、それらの塩もしくは誘導体などの水溶性高分子化合物である場合、液状物質（ｃ）を構成する貧溶媒、非溶媒または良溶媒としては、水混和性を有する有機化合物と水との組み合わせが、精製された化学物質（ａ）中における有機化合物の残留量を低減させやすいことから好ましい。水と組み合わせて使用される水混和性を有する有機化合物の好ましい例としては、アルコール、ジメチルスルホキシドおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１種の液状有機化合物が挙げられる。これらの水性混合液を使用した場合には、接触処理条件下において化学物質（ａ）をゲル状態で析出させることができる。このように、液状物質（ｃ）として、粗製物と液状物質（ｃ）とを塩基性条件下に接触させる際に、化学物質（ａ）をゲル状態で析出させる性質を有するものを用いた場合には、エンドトキシンの不活化・除去効果が特に優れるという利点がある。 When the chemical substance (a) is a water-soluble polymer compound such as a polysaccharide, protein, complex thereof, salt or derivative thereof, the poor solvent, non-solvent or good solvent constituting the liquid substance (c) A combination of water-miscible organic compound and water is preferable because the amount of residual organic compound in the purified chemical substance (a) can be easily reduced. Preferable examples of the water-miscible organic compound used in combination with water include at least one liquid organic compound selected from the group consisting of alcohol, dimethyl sulfoxide and N, N-dimethylformamide. When these aqueous mixtures are used, the chemical substance (a) can be precipitated in a gel state under the contact treatment conditions. As described above, when the liquid substance (c) has a property of precipitating the chemical substance (a) in a gel state when the crude substance and the liquid substance (c) are brought into contact with each other under basic conditions. Has the advantage that the endotoxin inactivation / removal effect is particularly excellent.
なお、貧溶媒、非溶媒または良溶媒を複数種組み合わせて使用する場合、液状物質（ｃ）における組成比は、上記のように、接触処理条件下における化学物質（ａ）に対する溶解性（化学物質（ａ）の溶解度）、化学物質（ａ）に対するゲル形成能（化学物質（ａ）の膨潤度）、溶媒相互の相溶性（均一相形成性）などを考慮して適宜選択すればよい。例えば、化学物質（ａ）がアルギン酸、ヒアルロン酸、それらの塩およびそれらの誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種の多糖類である場合、必ずしも限られるものではないが、水とアルコールとを、水／アルコールの重量比が好ましくは５／９５〜９５／５の範囲内、より好ましくは１０／９０〜８０／２０の範囲内、さらに好ましくは２０／８０〜７０／３０の範囲内となるように組み合わせることが望ましい。 In the case of using a combination of a plurality of poor solvents, non-solvents or good solvents, the composition ratio in the liquid substance (c) is the solubility (chemical substance) in the chemical substance (a) under the contact treatment conditions as described above. The solubility may be selected as appropriate in consideration of the solubility of (a), the gel-forming ability with respect to the chemical substance (a) (swelling degree of the chemical substance (a)), the compatibility between solvents (homogeneous phase-forming ability), and the like. For example, when the chemical substance (a) is at least one polysaccharide selected from the group consisting of alginic acid, hyaluronic acid, salts thereof, and derivatives thereof, water and alcohol are not necessarily limited. The water / alcohol weight ratio is preferably in the range of 5/95 to 95/5, more preferably in the range of 10/90 to 80/20, and even more preferably in the range of 20/80 to 70/30. It is desirable to combine them.
液状物質（ｃ）の使用量は、多すぎると化学物質（ａ）の回収率の低下、処理設備の大型化などを招き、逆に少なすぎるとエンドトキシンの不活化・除去効果の低下、析出物〔化学物質（ａ）〕の取扱性の低下、化学物質（ａ）の回収率の低下などを招くことから、これらの点を考慮して適宜設定すればよい。一般的には、化学物質（ａ）／液状物質（ｃ）の重量比は、必ずしも限定されるものではないが、好ましくは０．００１／１００〜５０／１００の範囲内、より好ましくは０．００５／１００〜４０／１００の範囲内、さらに好ましくは０．０１／１００〜５／１００の範囲内にあることが望ましい。 If the amount of the liquid substance (c) used is too large, the recovery rate of the chemical substance (a) will be reduced and the processing equipment will be enlarged. On the other hand, if the amount used is too small, the endotoxin inactivation / removal effect will be reduced. Since the handling of [chemical substance (a)] decreases and the recovery rate of chemical substance (a) decreases, it may be set appropriately in consideration of these points. In general, the weight ratio of the chemical substance (a) / liquid substance (c) is not necessarily limited, but is preferably in the range of 0.001 / 100 to 50/100, more preferably 0.00. It is desirable to be within the range of 005/100 to 40/100, more preferably within the range of 0.01 / 100 to 5/100.
液状物質（ｃ）を用いて塩基性条件下に粗製物を処理するのに要する時間〔化学物質（ａ）が液状物質（ｃ）を含む塩基性条件の系中に存在する時間〕は、短すぎるとエンドトキシンの不活化が不十分となり、また化学物質（ａ）の回収率が低下する傾向があり、逆に長すぎると化学物質（ａ）の分解を招く傾向があるため、これらの点を考慮して適宜設定すればよい。前記時間は、塩基性条件などに依存し、必ずしも限定されるものではないが、一般的には、５分〜５００時間の範囲内が好ましく、３０分〜２５０時間の範囲内がより好ましい。 The time required to treat the crude product under basic conditions using the liquid substance (c) [the time during which the chemical substance (a) is present in the basic condition system containing the liquid substance (c)] is short. If too much, the inactivation of endotoxin becomes insufficient, and the recovery rate of the chemical substance (a) tends to decrease. Conversely, if too long, the chemical substance (a) tends to be decomposed. It may be set as appropriate in consideration. The time depends on basic conditions and is not necessarily limited, but in general, it is preferably in the range of 5 minutes to 500 hours, and more preferably in the range of 30 minutes to 250 hours.
液状物質（ｃ）を用いて塩基性条件下で粗製物を処理する際の処理温度は、低すぎるとエンドトキシンの不活化効率が低下するとともに、液状物質（ｃ）などが凍結し処理が事実上困難となる可能性があり、逆に高すぎると化学物質（ａ）の分解を招く可能性があるため、これらの点を考慮して適宜設定すればよい。前記処理温度は、必ずしも限定されるものではないが、一般的には、液状物質（ｃ）の凝固点以上でかつ−１０〜１００℃の範囲内にあることが好ましく、該凝固点以上でかつ０〜５０℃の範囲内の温度にあることがより好ましく、該凝固点以上でかつ５〜４０℃の範囲内にあることがさらに好ましい。 If the treatment temperature when treating the crude product under the basic condition using the liquid substance (c) is too low, the inactivation efficiency of endotoxin is lowered, and the liquid substance (c) is frozen and the treatment is practically performed. It may be difficult, and on the contrary, if it is too high, the chemical substance (a) may be decomposed. Therefore, it may be set appropriately in consideration of these points. The treatment temperature is not necessarily limited, but in general, it is preferably not less than the freezing point of the liquid substance (c) and in the range of −10 to 100 ° C. More preferably, the temperature is in the range of 50 ° C., more preferably in the range of 5 to 40 ° C. above the freezing point.
塩基性化合物（ｄ）は、塩基性無機化合物および塩基性有機化合物のいずれであってもよく、これらの２種類以上を併用してもよい。塩基性無機化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどの金属水酸化物などが挙げられる。塩基性有機化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンなどのアルキルアミン；アニリン、メチルアニリンなどの芳香族アミン；エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどのヒドロキシアルキルアミンなどのアミンなどが挙げられる。また、塩基性化合物（ｄ）は、強塩基性化合物と弱酸との塩であってもよい。 The basic compound (d) may be either a basic inorganic compound or a basic organic compound, and two or more of these may be used in combination. Examples of the basic inorganic compound include metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and aluminum hydroxide. Examples of the basic organic compound include alkylamines such as methylamine, ethylamine, propylamine, butylamine, dimethylamine, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine, trimethylamine, triethylamine, tripropylamine; and aromatics such as aniline and methylaniline. Group amines; amines such as ethanolamine, diethanolamine, hydroxyalkylamines such as triethanolamine, and the like. The basic compound (d) may be a salt of a strong basic compound and a weak acid.
塩基性化合物（ｄ）の中では、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムが、塩基性が高いため、比較的少量でエンドトキシンに対する不活化効果を発揮しやすく、処理後の化学物質（ａ）への残留性が低く、水、水混和性有機化合物などに対する溶解性が良好であるので適用範囲が広いことなどから、好ましい。 Among the basic compounds (d), potassium hydroxide or sodium hydroxide is highly basic, so that it can easily exert an inactivating effect on endotoxin in a relatively small amount, and remains in the chemical substance (a) after the treatment. It is preferable because it has a low applicability and has good solubility in water, water-miscible organic compounds, and the like, and thus has a wide range of applications.
化学物質（ａ）の粗製物と接触させる際、塩基性化合物（ｄ）は、液状物質（ｃ）に含有させた状態で接触させてもよく、また液状物質（ｃ）とは別に接触させてもよい。 When contacting the crude product of the chemical substance (a), the basic compound (d) may be brought into contact with the liquid substance (c) or separately from the liquid substance (c). Also good.
塩基性化合物（ｄ）を液状物質（ｃ）に含有させた状態で用いる方法は、前記方法（Ａ）および（Ａ’）に該当する。本明細書において、塩基性化合物（ｄ）を含有する液状物質を「塩基性液状物質（ｃ−１）」というが、その構成成分を表現する場合、便宜上、液状物質（ｃ）および塩基性化合物（ｄ）の２成分に区別することがある。 The method of using the basic compound (d) in the state where the liquid substance (c) is contained corresponds to the methods (A) and (A ′). In the present specification, the liquid substance containing the basic compound (d) is referred to as “basic liquid substance (c-1)”. When the constituents are expressed, for convenience, the liquid substance (c) and the basic compound are used. A distinction may be made between two components (d).
また、塩基性化合物（ｄ）を液状物質（ｃ）とは別に使用する方法は、前記方法（Ｂ）、（Ｂ’）および（Ｂ”）に該当する。本明細書において、前記方法（Ｂ’）で使用される溶媒（ｅ）、すなわち塩基性化合物（ｄ）を含有する溶媒を「塩基性溶媒（ｅ−１）」というが、塩基性溶媒（ｅ−１）の構成成分を表現する場合、便宜上、塩基性化合物（ｄ）および溶媒（ｅ）の２成分に区別することがある。 The method of using the basic compound (d) separately from the liquid substance (c) corresponds to the methods (B), (B ′) and (B ″). In the present specification, the method (B The solvent (e) used in '), that is, the solvent containing the basic compound (d) is referred to as “basic solvent (e-1)”, but represents a component of the basic solvent (e-1). In some cases, for the sake of convenience, a distinction may be made between two components: a basic compound (d) and a solvent (e).
本発明の精製方法においては、塩基性化合物（ｄ）を用いたエンドトキシンの不活化処理が、液状物質（ｃ）を用いた化学物質（ａ）の析出処理（該処理はエンドトキシンの除去処理を兼ねる）と同時であってもよく〔前記方法（Ａ）および（Ａ’）〕、また、析出処理の前または後であってもよい〔前記方法（Ｂ）、（Ｂ’）および（Ｂ”）〕。 In the purification method of the present invention, the endotoxin inactivation treatment using the basic compound (d) is the chemical substance (a) precipitation treatment using the liquid substance (c) (this treatment also serves as the endotoxin removal treatment). ) [The above methods (A) and (A ′)] or before or after the precipitation treatment [the above methods (B), (B ′) and (B ″) ].
エンドトキシンに対する不活化・除去効果を高める観点から、化学物質（ａ）の粗製物と塩基性化合物（ｄ）とは、前記方法（Ａ）および（Ａ’）のように、液状物質（ｃ）と同時に混合するか、または前記方法（Ｂ’）の場合および前記方法（Ｂ”）において、塩基性化合物（ｄ）の混合と液状物質（ｃ）の混合をこの順序で行う場合のように、溶媒（ｅ）の存在下で液状物質（ｃ）の混合に先行して混合することが好ましい。エンドトキシンに対する不活化・除去効果の高さと化学物質（ａ）に対する悪影響の少なさとを良好に両立させることができる観点から、前記方法（Ａ）および（Ａ’）のように、塩基性化合物（ｄ）と液状物質（ｃ）とを同時に化学物質（ａ）の粗製物と混合することがより好ましい。 From the viewpoint of enhancing the inactivation / removal effect on endotoxin, the crude product of the chemical substance (a) and the basic compound (d) can be obtained from the liquid substance (c) as in the methods (A) and (A ′). In the case of the method (B ′) and the method (B ″), the basic compound (d) and the liquid substance (c) are mixed in this order. In the presence of (e), it is preferable to mix prior to mixing of the liquid substance (c), which achieves a good balance between a high inactivation / removal effect on endotoxin and a small adverse effect on the chemical substance (a). From the viewpoint of achieving the above, it is more preferable that the basic compound (d) and the liquid substance (c) are simultaneously mixed with the crude product of the chemical substance (a) as in the methods (A) and (A ′).
エンドトキシンに対する不活化・除去効果の高さと化学物質（ａ）に対する悪影響の少なさを特に良好に両立させることができる観点から、粗製物と塩基性化合物（ｄ）とが接触する系〔例えば、粗製物、塩基性化合物（ｄ）および液状物質（ｃ）からなる不均一混合物〔前記方法（Ａ）〕；粗製物、塩基性化合物（ｄ）および溶媒（ｅ）からなる溶液〔前記方法（Ｂ’）および（Ｂ”）〕；粗製物、塩基性化合物（ｄ）、液状物質（ｃ）および溶媒（ｅ）からなる不均一混合物〔前記方法（Ａ’）および（Ｂ”）〕中における塩基性化合物（ｄ）の濃度は、０．００００１〜０．１Ｎ（規定）であることが好ましく、０．０００１〜０．１Ｎであることがより好ましく、０．０００５〜０．０５Ｎであることがさらに好ましい。 From the standpoint that both the high inactivation / removal effect on endotoxin and the small adverse effect on the chemical substance (a) can be achieved particularly well, the system in which the crude product and the basic compound (d) are in contact [for example, crude product Product, basic compound (d) and liquid substance (c) heterogeneous mixture [method (A)]; crude product, basic compound (d) and solvent (e) solution [method (B ′ ) And (B ″)]; basicity in a heterogeneous mixture [the above methods (A ′) and (B ″)] consisting of a crude product, a basic compound (d), a liquid substance (c) and a solvent (e) The concentration of the compound (d) is preferably 0.00001 to 0.1N (normal), more preferably 0.0001 to 0.1N, and further preferably 0.0005 to 0.05N. preferable.
上記のとおり、液状物質（ｃ）との接触処理、好ましくは、混合処理に供する化学物質（ａ）の粗製物は、溶媒（ｅ）に溶解させた溶液の形態であってもよい〔前記方法（Ａ’）、（Ｂ’）および（Ｂ”）〕。溶媒（ｅ）としては、化学物質（ａ）に対して溶解性を有し、かつ液状物質（ｃ）に対して混和性を有するものであれば、特に限られることなく適宜選択することができ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。 As described above, the crude product of the chemical substance (a) subjected to the contact treatment with the liquid substance (c), preferably, the mixing treatment may be in the form of a solution dissolved in the solvent (e) [said method (A ′), (B ′) and (B ″)]. Solvent (e) is soluble in chemical substance (a) and miscible in liquid substance (c). If it is a thing, it can select suitably, without being specifically limited, 1 type can be used individually or in combination of 2 or more types.
溶媒（ｅ）としては、必ずしも限られるものではないが、一般的には、水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ペンタノール、へキサノールなどのアルコール類；ヘキサン、へプタン、オクタン、シクロへキサンなどの脂肪族または脂環式の炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトンなどのケトン；エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、メチルエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル；四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素などが挙げられ、これらは、それぞれ単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。 The solvent (e) is not necessarily limited, but in general, water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, pentanol, hexanol; hexane, heptane, octane, cyclohexane Aliphatic or alicyclic hydrocarbons such as xanthones; aromatic compounds such as benzene, toluene, xylene; ketones such as acetone, ethyl methyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, isopropyl methyl ketone; ethyl ether, propyl ether, Ethers such as isopropyl ether, methyl ethyl ether, methyl propyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; N, N-dimethylform Amides such as amides; Esters such as methyl acetate, ethyl acetate, and butyl acetate; Halogenated hydrocarbons such as carbon tetrachloride, chloroform, and dichloromethane. These may be used alone or in combination of two or more. You may use together.
化学物質（ａ）が多糖類、タンパク質、それらの複合体、それらの塩もしくは誘導体などの水溶性高分子化合物である場合、溶媒（ｅ）は、水を主体とするものが好ましい。 When the chemical substance (a) is a water-soluble polymer compound such as a polysaccharide, protein, complex thereof, salt or derivative thereof, the solvent (e) is preferably one mainly composed of water.
化学物質（ａ）が水溶性高分子化合物である場合、液状物質（ｃ）と溶媒（ｅ）の好ましい組み合わせは、液状物質（ｃ）がアルコール、ジメチルスルホキシドおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１種の液状有機化合物と水を含有する混合液であり、溶媒（ｅ）が水を主体とする溶媒である組み合わせである。この組み合わせの場合、処理によって水溶性高分子化合物をゲル状態で析出させることが可能となる。なお、本明細書において、「水を主体とする溶媒」とは、溶媒全量に対する水の割合が５０重量％以上であるものを意味する。 When the chemical substance (a) is a water-soluble polymer compound, a preferred combination of the liquid substance (c) and the solvent (e) is a group in which the liquid substance (c) is composed of alcohol, dimethyl sulfoxide and N, N-dimethylformamide. It is a mixed solution containing at least one liquid organic compound selected from water and water, and the solvent (e) is a combination mainly composed of water. In the case of this combination, the water-soluble polymer compound can be precipitated in a gel state by the treatment. In the present specification, the “solvent mainly composed of water” means that the ratio of water to the total amount of the solvent is 50% by weight or more.
溶媒（ｅ）の使用量は、多すぎると化学物質（ａ）の回収率の低下、処理設備の大型化などを招く傾向があることから、これらの点を考慮して適宜設定すればよい。溶媒（ｅ）の使用量は、必ずしも限定されるものではないが、一般的には、化学物質（ａ）の濃度が０．０１〜５０重量％の範囲内となるような量であることが好ましい。 If the amount of the solvent (e) used is too large, it tends to cause a reduction in the recovery rate of the chemical substance (a), an increase in the size of the processing equipment, and the like. The amount of the solvent (e) used is not necessarily limited, but in general, the amount is such that the concentration of the chemical substance (a) is in the range of 0.01 to 50% by weight. preferable.
化学物質（ａ）の粗製物を溶媒（ｅ）に溶解させた溶液と、液状物質（ｃ）とを塩基性条件下に接触させる場合、接触処理前にあらかじめフィルターで該溶液を濾過し、化学物質（ａ）の粗製物に含まれている不溶性異物、微生物またはその死髄などの不純物を除去しておくことが好ましい。フィルターの孔径は、除去すべき不純物の大きさなどに応じて適宜選択すればよいが、一般的には、１０μｍ以下が好ましく、０．５μｍ以下がより好ましく、０．２μｍ以下がさらに好ましい。また、これらのフィルターを組み合わせて用いることにより、不純物を大きな粒子径を有するものから順次取り除いてもよい。 When the solution obtained by dissolving the crude product of the chemical substance (a) in the solvent (e) and the liquid substance (c) are brought into contact with each other under basic conditions, the solution is filtered beforehand with a filter before the contact treatment, It is preferable to remove impurities such as insoluble foreign matter, microorganisms, or dead pulp contained in the crude material (a). The pore size of the filter may be appropriately selected according to the size of the impurities to be removed, but generally it is preferably 10 μm or less, more preferably 0.5 μm or less, and further preferably 0.2 μm or less. Further, by using these filters in combination, impurities may be sequentially removed from those having a large particle size.
本発明では、塩基性条件下の系は、化学物質（ａ）の粗製物、液状物質（ｃ）、塩基性化合物（ｄ）および、場合により、溶媒（ｅ）を含むが、本発明の効果に悪影響を実質的に及ぼさない限りにおいて、これら以外の成分を共存させてもよい。 In the present invention, the system under basic conditions includes a crude product of the chemical substance (a), a liquid substance (c), a basic compound (d), and optionally a solvent (e). Other components may be allowed to coexist as long as they are not adversely affected.
系は、固体状またはゲル状の析出物および液層部から構成されるが、系内に界面活性剤を共存させると、析出物〔化学物質（ａ）〕からのエンドトキシンの除去およびエンドトキシンの不活化をより効率的に行うことができるので、好ましい。 The system is composed of a solid or gel precipitate and a liquid layer part. When a surfactant is present in the system, endotoxin is removed from the precipitate [chemical substance (a)] and endotoxin is not present. Since activation can be performed more efficiently, it is preferable.
界面活性剤の種類には、特に制限がない。界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤が挙げられ、これらの中から任意に選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular in the kind of surfactant. Examples of the surfactant include nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, and any of these can be selected.
ノニオン性界面活性剤としては、例えば、高級アルコールアルキレンオキサイド付加物、アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物、脂肪酸アルキレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルアルキレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンアルキレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドアルキレンオキサイド付加物、油脂のアルキレンオキサイド付加物、ポリプロピレングリコールアルキレンオキサイド付加物などのポリアルキレングリコール型（ポリアルキレンオキサイド型）の界面活性剤；グリセロール脂肪酸エステル、ペンタエリスリトールの脂肪酸エステル、ソルビトールまたはソルビタンの脂肪酸エステル、ショ糖の脂肪酸エステル、多価アルコールのアルキルエーテル、アルカノールアミン類の脂肪酸アミドなどの多価アルコール型界面活性剤などが挙げられる。 Nonionic surfactants include, for example, higher alcohol alkylene oxide adducts, alkylphenol alkylene oxide adducts, fatty acid alkylene oxide adducts, polyhydric alcohol fatty acid ester alkylene oxide adducts, higher alkylamine alkylene oxide adducts, fatty acid amide alkylenes. Surfactant of polyalkylene glycol type (polyalkylene oxide type) such as oxide adduct, fat and oil alkylene oxide adduct, polypropylene glycol alkylene oxide adduct; glycerol fatty acid ester, pentaerythritol fatty acid ester, sorbitol or sorbitan fatty acid ester , Fatty acid esters of sucrose, alkyl ethers of polyhydric alcohols, fatty acid amides of alkanolamines What polyhydric alcohol type surfactants, and the like.
アニオン性界面活性剤としては、例えば、分子内に疎水性基として脂肪族または芳香族炭化水素基、フッ素原子またはシリコーン含有基を有し、親水性基としてスルホン酸基、リン酸基、カルボン酸基またはこれらの塩を含有する界面活性剤などが挙げられる。 Examples of the anionic surfactant include an aliphatic or aromatic hydrocarbon group, a fluorine atom or a silicone-containing group as a hydrophobic group in the molecule, and a sulfonic acid group, a phosphoric acid group or a carboxylic acid as a hydrophilic group. And a surfactant containing a group or a salt thereof.
カチオン性界面活性剤としては、例えば、分子内に疎水性基として脂肪族または芳香族炭化水素基、フッ素原子またはシリコーン含有基を有し、親水性基として１〜４級のアミンまたはこれらの塩の構造を有する基を含有する界面活性剤などが挙げられる。 Examples of the cationic surfactant include an aliphatic or aromatic hydrocarbon group, a fluorine atom or a silicone-containing group as a hydrophobic group in the molecule, and a primary to quaternary amine or a salt thereof as a hydrophilic group. And a surfactant containing a group having the following structure.
両性界面活性剤は、分子内にカチオン性基とアニオン性基を有する界面活性剤である。両性界面活性剤としては、例えば、アミノ酸型界面活性剤、ベタイン型界面活性剤、硫酸エステル型界面活性剤、スルホン酸塩型界面活性剤、リン酸エステル塩型界面活性剤などが挙げられる。 An amphoteric surfactant is a surfactant having a cationic group and an anionic group in the molecule. Examples of amphoteric surfactants include amino acid type surfactants, betaine type surfactants, sulfate ester type surfactants, sulfonate type surfactants, and phosphate ester type surfactants.
化学物質（ａ）が酸性多糖類などの酸性基を有する化合物である場合、析出した化学物質（ａ）への混入が少ない観点から、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤などの該酸性基とイオン的な結合を形成しない界面活性剤が好ましい。一方、化学物質（ａ）が塩基性基を有する場合、析出した化学物質（ａ）へ混入が少ない観点から、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤などの該塩基性基とイオン的な結合を形成しない界面活性剤が好ましい。 In the case where the chemical substance (a) is a compound having an acidic group such as an acidic polysaccharide, the acidic substance such as an anionic surfactant or nonionic surfactant is selected from the viewpoint of less mixing with the deposited chemical substance (a). A surfactant that does not form an ionic bond with the group is preferred. On the other hand, when the chemical substance (a) has a basic group, it is ionic with the basic group such as a cationic surfactant and a nonionic surfactant from the viewpoint of less contamination of the deposited chemical substance (a). Surfactants that do not form bonds are preferred.
界面活性剤の種類によっては、その化学構造中にアミド基、エステル基、エーテル基、炭化水素基などの基が存在することがある。塩基性条件下の処理において、これらの基が化学反応を受けないようにするためには、アミド基、エーテル基または炭化水素基を有する界面活性剤のように塩基性条件で安定性の高いものを使用することが好ましい。前記アニオン性界面活性剤の中では、アルキルスルホン酸塩型のアニオン性界面活性剤が好ましく、前記ノニオン性界面活性剤の中では、塩基性条件下に安定であるポリエチレンオキサイドアルキルエーテル型またはポリエチレンオキサイドアルキルフェニルエーテル型のノニオン性界面活性剤が好ましい。 Depending on the type of surfactant, groups such as an amide group, an ester group, an ether group, and a hydrocarbon group may exist in the chemical structure. In order to prevent these groups from undergoing chemical reactions in the treatment under basic conditions, those having high stability under basic conditions such as surfactants having an amide group, ether group or hydrocarbon group Is preferably used. Among the anionic surfactants, alkylsulfonate type anionic surfactants are preferable, and among the nonionic surfactants, polyethylene oxide alkyl ether type or polyethylene oxide which is stable under basic conditions. Alkyl phenyl ether type nonionic surfactants are preferred.
界面活性剤の量が多すぎると、分離取得された化学物質（ａ）の精製物中への界面活性剤の混入量が増加するため、精製物の洗浄が煩雑となる傾向がある。そのため、界面活性剤の好適量は、分離取得された化学物質（ａ）の精製物中に含有されるエンドトキシンおよび界面活性剤の量などを考慮して適宜設定すればよい。界面活性剤の量は、界面活性剤が有する界面活性、臨界ミセル濃度などによって左右されるので、必ずしも限られるものではないが、一般に、塩基性条件下の系〔化学物質（ａ）の粗製物、液状物質（ｃ）、塩基性化合物（ｄ）および、場合により、溶媒（ｅ）などを含む不均一混合物〕における濃度が０．００００１〜５重量％の範囲内となる量であることが好ましく、０．０００１〜１重量％の範囲内となる量であることがより好ましい。 If the amount of the surfactant is too large, the amount of the surfactant mixed into the purified product of the chemical substance (a) obtained by separation tends to increase, which tends to complicate the cleaning of the purified product. Therefore, a suitable amount of the surfactant may be appropriately set in consideration of the amount of endotoxin and surfactant contained in the purified product of the chemical substance (a) obtained by separation. The amount of the surfactant is not necessarily limited because it depends on the surface activity of the surfactant, the critical micelle concentration, etc., but in general, the system under the basic condition [the crude product of the chemical substance (a) The concentration in the heterogeneous mixture containing the liquid substance (c), the basic compound (d) and, optionally, the solvent (e) is preferably in an amount in the range of 0.00001 to 5% by weight. The amount is more preferably in the range of 0.0001 to 1% by weight.
界面活性剤を使用する場合、その添加方法は特に制限がない。その具体例として、以下の方法（ｉ）〜（iv）を挙げることができる。
方法（ｉ）：化学物質（ａ）の粗製物と接触させる前の液状物質（ｃ）に界面活性剤を添加しておく方法。
方法（ii）：化学物質（ａ）の粗製物に界面活性剤を添加しておく方法。
方法（iii）：化学物質（ａ）の粗製物と混合する前の溶媒（ｅ）に界面活性剤を添加しておく方法。
方法（iv）：化学物質（ａ）の粗製物を液状物質（ｃ）と接触させた後、析出が完了するまでの期間内に界面活性剤を添加する方法。
When a surfactant is used, there is no particular limitation on the addition method. Specific examples thereof include the following methods (i) to (iv).
Method (i): A method in which a surfactant is added to the liquid substance (c) before contact with the crude product of the chemical substance (a).
Method (ii): A method in which a surfactant is added to a crude product of the chemical substance (a).
Method (iii): A method of adding a surfactant to the solvent (e) before mixing with the crude product of the chemical substance (a).
Method (iv): A method of adding a surfactant within a period until the precipitation is completed after the crude product of the chemical substance (a) is brought into contact with the liquid substance (c).
前記界面活性剤の添加方法の中では、方法（ｉ）、（ii）または（iii）が、エンドトキシンの除去効率が高いことから好ましい。 Among the methods for adding the surfactant, the method (i), (ii) or (iii) is preferable because of its high endotoxin removal efficiency.
本発明の好ましい形態では、化学物質（ａ）の粗製物を塩基性条件下に液状物質（ｃ）と混合することにより化学物質（ａ）を析出させた後、析出した化学物質（ａ）を分離取得することにより、化学物質（ａ）の精製物が得られる。液状物質（ｃ）を用いた析出処理で得られる固−液の不均一混合物からの化学物質（ａ）の分離取得は適宜任意の方法で行うことができる。該混合物からの固体状態またはゲル状態の析出物の分離では、遠心分離、濾過、デカンテーションなどの固−液分離方法を採用するのが、エンドトキシンの除去効率に優れ、かつ簡便であることから好ましい。 In a preferred embodiment of the present invention, the chemical substance (a) is precipitated by mixing the crude product of the chemical substance (a) with the liquid substance (c) under basic conditions. By separating and obtaining, a purified product of the chemical substance (a) is obtained. The separation and acquisition of the chemical substance (a) from the solid-liquid heterogeneous mixture obtained by the precipitation treatment using the liquid substance (c) can be appropriately performed by any method. In the separation of the solid or gel precipitate from the mixture, it is preferable to employ a solid-liquid separation method such as centrifugation, filtration, decantation, etc. because of excellent endotoxin removal efficiency and simplicity. .
混合物からの析出物の分離取得時および／または分離取得後、析出物を、化学物質（ａ）に対する貧溶媒、非溶媒またはこれらと良溶媒との混合溶媒で洗浄することが好ましい。この洗浄により、使用した塩基性化合物（ｄ）および界面活性剤や、残留するエンドトキシンを効率よく除去することができる。 It is preferable to wash the precipitate with a poor solvent, a non-solvent for the chemical substance (a), or a mixed solvent of these with a good solvent at the time of separation and / or after separation and acquisition from the mixture. By this washing, the used basic compound (d), the surfactant, and the remaining endotoxin can be efficiently removed.
分離取得された析出物を、必要に応じて洗浄した後、乾燥することにより、液状物質（ｃ）などが除去された化学物質（ａ）の精製物が得られる。乾燥方法には特に制限がないが、エンドトキシンの不活化および化学物質（ａ）の熱安定性の観点から、できるだけ低い温度で乾燥することが好ましい。また、乾燥時にエンドトキシンによる汚染を避けるため、エンドトキシンやその由来となる菌を含む可能性のある外気と接触しない乾燥方法が好ましい。化学物質（ａ）の熱分解とエンドトキシンによる汚染を防止する観点から、低温で減圧乾燥することが好ましい。 The separated and obtained precipitate is washed as necessary and dried to obtain a purified product of the chemical substance (a) from which the liquid substance (c) and the like have been removed. Although there is no restriction | limiting in particular in a drying method, It is preferable to dry at temperature as low as possible from a viewpoint of inactivation of endotoxin and the thermal stability of chemical substance (a). Moreover, in order to avoid contamination with endotoxin during drying, a drying method that does not come into contact with the outside air that may contain endotoxin and bacteria that are derived from it is preferable. From the viewpoint of preventing thermal decomposition of the chemical substance (a) and contamination by endotoxin, it is preferable to dry under reduced pressure at a low temperature.
本発明の精製方法によれば、所望の化学物質（ａ）の粗製物のエンドトキシン含有量を５０ＥＵ／ｇ以下とすることができる。化学物質（ａ）が医用高分子化合物である場合、そのエンドトキシン含有量は、生体に対する安全性の観点から、５０ＥＵ／ｇ以下であることが好ましい。特に、体表面の粘膜と接する材料、体内に使用される材料、血液と接する材料などに用いられる医用高分子化合物では、エンドトキシン含有量が多いと組織表面に炎症を生じたり、発熱を生じることがあることから、医用高分子化合物におけるエンドトキシンの含有量は５０ＥＵ／ｇ以下であることが好ましく、４０ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、１０ＥＵ／ｇ以下であることがさらに好ましく、５ＥＵ／ｇ以下であることが特に好ましい。 According to the purification method of the present invention, the endotoxin content of the crude product of the desired chemical substance (a) can be 50 EU / g or less. When the chemical substance (a) is a medical polymer compound, the endotoxin content is preferably 50 EU / g or less from the viewpoint of safety to the living body. In particular, medical polymer compounds used for materials that come into contact with the mucous membrane on the body surface, materials that are used in the body, and materials that come into contact with blood may cause inflammation or fever on the tissue surface if the endotoxin content is high. Therefore, the content of endotoxin in the medical polymer compound is preferably 50 EU / g or less, more preferably 40 EU / g or less, still more preferably 10 EU / g or less, and 5 EU / g or less. It is particularly preferred that
また、医用高分子化合物を患者に使用される医療用具、医薬品などを対象とした医用材料として用いる場合、そのエンドトキシンの含有量は、その使用量や適用方法によっても異なるが、一般的に５０ＥＵ／ｇ以下であることが好ましい。医療用具や医薬品が粘膜と接したり、体内に使用される場合、血液に接する場合や血液流路に投与する場合などでは、その材料となる医用高分子化合物のエンドトキシンの含有量は１０ＥＵ／ｇ以下であることが好ましく、１ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、０．５ＵＥ／ｇ以下であることが特に好ましい。 In addition, when a medical polymer compound is used as a medical material for a medical device or a pharmaceutical used for a patient, the content of endotoxin varies depending on the amount used and the application method, but generally 50 EU / g or less is preferable. When a medical device or pharmaceutical is in contact with the mucous membrane, used in the body, in contact with blood, or administered to the blood flow path, the content of the endotoxin of the medical high molecular compound used as the material is 10 EU / g or less. It is preferable that it is 1EU / g or less, and it is especially preferable that it is 0.5UE / g or less.
医用高分子化合物を、シーラント、止血材などの高い粘稠性が要求される用途に用いる場合、医用高分子化合物としては、それを１％水溶液として２０℃で測定したときの粘度が５ｍＰａ・ｓ以上を示すものが好ましく、５０ｍＰａ・ｓ以上を示すものがより好ましく、１００ｍＰａ・ｓ以上を示すものがさらに好ましく、２００ｍＰａ・ｓ以上を示すものが特に好ましい。 When a medical polymer compound is used for applications requiring high viscosity such as sealants and hemostatic materials, the medical polymer compound has a viscosity of 5 mPa · s when measured as a 1% aqueous solution at 20 ° C. What shows the above is preferable, What shows 50 mPa * s or more is more preferable, What shows 100 mPa * s or more is more preferable, What shows 200 mPa * s or more is especially preferable.
本発明の精製方法によれば、エンドトキシンに対する不活化・除去の際における所望の化学物質（ａ）の分解を阻止し、軽減させることができる。したがって、本発明の精製方法は、そのような高粘度の医用高分子化合物の精製にも適用可能である。なお、前記粘度は、種々の方法で測定することができるが、本明細書においては、コーン・プレートタイプの回転粘度計を用いて、ずり速度１９２ｓ−１の条件で測定したときの値を採用する。 According to the purification method of the present invention, decomposition of a desired chemical substance (a) during inactivation / removal of endotoxin can be prevented and reduced. Therefore, the purification method of the present invention can also be applied to the purification of such a high viscosity medical polymer compound. The viscosity can be measured by various methods. In the present specification, a value measured using a cone-plate type rotational viscometer under the condition of a shear rate of 192 s −1 is adopted. To do.
以上説明したように、本発明の精製方法によれば、エンドトキシンの含有量が少なく、かつ高粘度を有する医用高分子化合物などに代表されるエンドトキシンの含有量が少ない化学物質（ａ）を容易に得ることができる。また、得られた医用高分子化合物は、医療用具や医薬品の原材料として有用であり、特に体内に使用し、粘膜や血液と接する用途、生体外において細胞などと接する用途などに適している。なかでも、本発明の精製方法で得られた医用高分子化合物は、止血材、シーラント、創傷被覆保護材、組織再生用材料、細胞培養材料などに適している。 As described above, according to the purification method of the present invention, a chemical substance (a) having a low endotoxin content and a low endotoxin content typified by a medical polymer compound having a high viscosity can be easily obtained. Obtainable. The obtained medical polymer compound is useful as a raw material for medical devices and pharmaceuticals, and is particularly suitable for use in the body and contact with mucous membranes and blood, contact with cells and the like in vitro. Among them, the medical polymer compound obtained by the purification method of the present invention is suitable for a hemostatic material, a sealant, a wound covering protective material, a tissue regeneration material, a cell culture material, and the like.
本発明の精製方法で得られるエンドトキシンの含有量が少なく、かつ医用材料として好適な高分子化合物の代表例としては、エンドトキシン含有量が５０ＥＵ／ｇ以下である多糖類が挙げられる。多糖類としては、例えば、アルギン酸、その塩およびその誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。 A typical example of a polymer compound having a low endotoxin content obtained by the purification method of the present invention and suitable as a medical material is a polysaccharide having an endotoxin content of 50 EU / g or less. Examples of the polysaccharide include at least one selected from the group consisting of alginic acid, a salt thereof, and a derivative thereof.
本発明の精製方法によって得られる高分子化合物などの化学物質（ａ）は、例えば、溶液として、医療用具や医薬品の原材料などの用途に用いることができる。これらの用途に好適な高分子化合物などの化学物質（ａ）の溶液の例としては、本発明の精製法によって得られる多糖類を含有し、エンドトキシン含有量が５０ＥＵ／ｍＬ以下であり、好ましくは３７℃における粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上である多糖類溶液が挙げられる。多糖類としては、例えば、アルギン酸およびその塩もしくは誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種を挙げることができる。 The chemical substance (a) such as a polymer compound obtained by the purification method of the present invention can be used, for example, as a solution for applications such as medical devices and pharmaceutical raw materials. Examples of solutions of chemical substances (a) such as polymer compounds suitable for these applications include polysaccharides obtained by the purification method of the present invention, and endotoxin content is 50 EU / mL or less, preferably A polysaccharide solution having a viscosity at 37 ° C. of 100 mPa · s or more is exemplified. Examples of the polysaccharide include at least one selected from the group consisting of alginic acid and a salt or derivative thereof.
医用高分子化合物の溶液に用いられる溶媒としては、使用目的などに応じて適宜選択することができるが、一般的には、水；エタノール、グリセリン、プロピレングリコールなどのアルコールなどが挙げられ、これらは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。医用高分子化合物の溶液における医用高分子化合物の濃度は、その用途によって異なるので一概に決定することができないが、３７℃における粘度が５ｍＰａ・ｓ以上となる条件下において、通常、０．０１〜５０重量％の範囲内が好ましく、０．１〜１０重量％の範囲内がより好ましい。なお、医用高分子化合物の溶液は、使用目的に応じて、等張化剤、緩衝剤などの任意成分を適宜含有していてもよい。 The solvent used in the solution of the medical polymer compound can be appropriately selected depending on the purpose of use, etc., but generally includes water; alcohols such as ethanol, glycerin, propylene glycol, etc. These can be used alone or in admixture of two or more. The concentration of the medical polymer compound in the solution of the medical polymer compound varies depending on its use and cannot be determined unconditionally. However, under a condition where the viscosity at 37 ° C. is 5 mPa · s or more, usually 0.01 to It is preferably within the range of 50% by weight, and more preferably within the range of 0.1 to 10% by weight. The medical polymer compound solution may appropriately contain optional components such as an isotonic agent and a buffering agent, depending on the purpose of use.
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to such examples.
以下の実施例または比較例における物性の測定方法は、以下のとおりである。
［溶解度、膨潤度および回収率］
各実施例および比較例において、遠心分離で得られた未乾燥の回収物の重量〔Ｗ１（ｇ）〕、使用した高分子化合物（多糖類）の乾燥重量〔Ｗ０（ｇ）〕および回収物の乾燥重量〔Ｗ２（ｇ）〕を求め、以下の式に基づいて、高分子化合物の溶解度、膨潤度および回収率を求めた。なお、比較例２では、中和後の真空乾燥で得られた回収物の重量をＷ２（ｇ）とした。
The measuring method of the physical property in the following examples or comparative examples is as follows.
[Solubility, degree of swelling and recovery]
In each Example and Comparative Example, the weight [W1 (g)] of the undried recovered material obtained by centrifugation, the dry weight [W0 (g)] of the polymer compound (polysaccharide) used, and the recovered material The dry weight [W2 (g)] was determined, and the solubility, swelling degree and recovery rate of the polymer compound were determined based on the following formula. In Comparative Example 2, the weight of the recovered material obtained by vacuum drying after neutralization was defined as W2 (g).
〔溶解度（重量％）〕＝〔（Ｗ０−Ｗ２）／Ｗ０〕×１００
〔膨潤度（重量％）〕＝（Ｗｌ／Ｗ２）×１００
〔回収率（重量％）〕＝（Ｗ２／Ｗ０）×１００
[Solubility (wt%)] = [(W0−W2) / W0] × 100
[Swelling degree (% by weight)] = (W1 / W2) × 100
[Recovery rate (% by weight)] = (W2 / W0) × 100
［エンドトキシンの含有量］
高分子化合物（多糖類）をエンドトキシンフリー水に溶解させ、適宜希釈し、ｐＨを６〜８に調整した後、エンドトキシンの含有量を測定した。測定の際、測定試薬としてLimulus ES-II Single Test Wako〔和光純薬工業（株）製、商品名〕および測定装置としてToxinometer ET-301〔和光純薬工業（株）製〕を用いて濁度法により測定した。
[Endotoxin content]
The polymer compound (polysaccharide) was dissolved in endotoxin-free water, diluted as appropriate, and the pH was adjusted to 6-8, and then the endotoxin content was measured. When measuring, turbidity using Limulus ES-II Single Test Wako (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a measuring reagent and Toxinometer ET-301 (produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a measuring device Measured by the method.
［溶液の粘度］
高分子化合物（多糖類）の１重量％水溶液を調製し、Ｅ型粘度計を用いて、２０℃での粘度を剪断速度１９２ｓ−１で測定した。
[Viscosity of solution]
A 1% by weight aqueous solution of a polymer compound (polysaccharide) was prepared, and the viscosity at 20 ° C. was measured at a shear rate of 192 s −1 using an E-type viscometer.
実施例１
１重量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｇを、水酸化ナトリウムを含有する水とエタノールとの混合液〔水／エタノール（重量比）＝４／２６〕に加えた。得られた混合溶液における水酸化ナトリウムの濃度は０．００８５Ｎ、アルギン酸ナトリウムの濃度は０．２５重量％であった。
Example 1
10 g of a 1% by weight aqueous sodium alginate solution was added to a mixed solution of water and ethanol containing sodium hydroxide [water / ethanol (weight ratio) = 4/26]. The concentration of sodium hydroxide in the obtained mixed solution was 0.0085 N, and the concentration of sodium alginate was 0.25% by weight.
得られた混合溶液において、アルギン酸ナトリウムは速やかにゲル状となった後、沈殿し、綿状となった。室温で４時間振盪した後、遠心分離し、上澄み液を除去した。沈殿物に水とエタノールの混合液〔水／エタノール（重量比）＝２／８〕２０ｍＬを加え、１０分間振盪した後、遠心分離し、上澄み液を除去することにより、沈殿物中の水酸化ナトリウムを除去した。この一連の洗浄操作を３回繰り返した後、エタノール２０ｍＬを加え、１０分間振盪後、遠心分離し、上澄み液を除去した。 In the obtained mixed solution, sodium alginate quickly became a gel and then precipitated and became cotton. After shaking at room temperature for 4 hours, the mixture was centrifuged and the supernatant was removed. 20 mL of a mixed solution of water and ethanol (water / ethanol (weight ratio) = 2/8) was added to the precipitate, shaken for 10 minutes, centrifuged, and the supernatant was removed to remove the hydroxyl in the precipitate. Sodium was removed. After repeating this series of washing operations three times, 20 mL of ethanol was added, shaken for 10 minutes, and then centrifuged to remove the supernatant.
得られた洗浄後の沈殿物を室温で真空乾燥した。処理条件、処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。 The resulting washed precipitate was vacuum dried at room temperature. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
実施例２
実施例１において、水酸化ナトリウムの濃度を０．０００８５Ｎに、また処理時間を７２時間に変更した以外は、実施例１と同様にして処理し、アルギン酸ナトリウムを得た。処理方法と処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Example 2
In Example 1, it processed similarly to Example 1 except having changed the density | concentration of sodium hydroxide into 0.00085N, and processing time into 72 hours, and obtained sodium alginate. Table 1 shows the treatment method, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
実施例３
実施例２において、１重量％アルギン酸ナトリウム水溶液中に、ノニオン性界面活性剤としてポリエチレンオキサイド・ラウリルエーテルを添加し、その濃度を０．０７５重量％に調整した以外は、実施例２と同様にして処理し、アルギン酸ナトリウムを得た。処理条件、処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Example 3
In Example 2, in the same manner as in Example 2 except that polyethylene oxide lauryl ether was added as a nonionic surfactant to a 1% by weight aqueous sodium alginate solution and the concentration was adjusted to 0.075% by weight. Treatment gave sodium alginate. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
実施例４
実施例３において、アルギン酸ナトリウムのグレードを変更した以外は、実施例３と同様にして処理し、アルギン酸ナトリウムを得た。処理方法と処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Example 4
In Example 3, except having changed the grade of sodium alginate, it processed like Example 3 and obtained sodium alginate. Table 1 shows the treatment method, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
実施例５
実施例３において、界面活性剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用いた以外は、実施例３と同様にして処理し、アルギン酸ナトリウムを得た。処理条件、処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Example 5
In Example 3, sodium alginate was obtained in the same manner as in Example 3 except that sodium lauryl sulfate was used as the surfactant. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
実施例６
実施例３において、高分子化合物としてヒアルロン酸ナトリウムを用いた以外は、実施例３と同様にして処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。処理条件、処理後のヒアルロン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Example 6
In Example 3, sodium hyaluronate was obtained in the same manner as in Example 3 except that sodium hyaluronate was used as the polymer compound. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium hyaluronate after the treatment, and the viscosity of the solution.
比較例１
実施例１において、水酸化ナトリウムを加えずに、処理時間を７２時間に調整した以外は、実施例１と同様にして処理した。処理条件、処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Comparative Example 1
In Example 1, the treatment was performed in the same manner as in Example 1 except that sodium hydroxide was not added and the treatment time was adjusted to 72 hours. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
比較例２
１重量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｇに水酸化ナトリウム水溶液３０ｇを加えて混合し、水酸化ナトリウム濃度を０．０８５Ｎに調整した。得られた均一混合液を室温で７２時間振盪し、水酸化ナトリウムと等モルの塩酸を加えて中和した後、室温で真空乾燥した。処理条件、処理後のアルギン酸ナトリウム中のエンドトキシンの含有量および溶液の粘度を表１に示す。
Comparative Example 2
30 g of sodium hydroxide aqueous solution was added to 10 g of 1 wt% sodium alginate aqueous solution and mixed to adjust the sodium hydroxide concentration to 0.085N. The obtained homogeneous mixture was shaken at room temperature for 72 hours, neutralized by adding sodium hydroxide and equimolar hydrochloric acid, and then vacuum-dried at room temperature. Table 1 shows the treatment conditions, the endotoxin content in the sodium alginate after the treatment, and the viscosity of the solution.
比較例３〜５
高分子化合物として、未処理のアルギン酸ナトリウムおよび未処理のヒアルロン酸ナトリウムの物性を調べた。その結果を表１に示す。
Comparative Examples 3-5
As polymer compounds, the physical properties of untreated sodium alginate and untreated sodium hyaluronate were examined. The results are shown in Table 1.
なお、表１中、高分子化合物および界面活性剤の各内容は、以下のとおりである。
〔高分子化合物〕
Ａ：アルギン酸ナトリウム〔紀文フードケミファ（株）製、商品名：ダックアルギンＮＳＰＨ２〕
Ｂ：アルギン酸ナトリウム〔紀文フードケミファ（株）製、商品名：ダックアルギンＮＳＰＬ〕
Ｃ：ヒアルロン酸ナトリウム〔紀文フードケミファ（株）製、商品名：ヒアルロン酸ＦＣＨ８０〕
In Table 1, the contents of the polymer compound and the surfactant are as follows.
[Polymer compound]
A: Sodium alginate [manufactured by Kibun Food Chemifa Co., Ltd., trade name: Duck Algin NSPH2]
B: Sodium alginate [manufactured by Kibun Food Chemifa Co., Ltd., trade name: Duck Algin NSPL]
C: Sodium hyaluronate [manufactured by Kibun Food Chemifa Co., Ltd., trade name: hyaluronic acid FCH80]
〔界面活性剤〕
PEG-Lauryl：ポリエチレンオキサイド(9)ラウリルエーテル〔ナカライテスク（株）製、難溶性タンパク研究用特製試薬〕
SDS:ラウリル硫酸ナトリウム〔和光純薬工業（株）製、生化学用試薬〕
[Surfactant]
PEG-Lauryl: Polyethylene oxide (9) Lauryl ether (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., special reagent for studying sparingly soluble proteins)
SDS: Sodium lauryl sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., biochemical reagent)
表１に示された結果から、各実施例の方法によれば、アルギン酸ナトリウムおよびヒアルロン酸ナトリウムに対して非溶解性（ゲル形成性）である水とエタノールの混合液中で塩基性化合物の存在下に処理をするという操作が採られているので、エンドトキシンの含有量が劇的に低下しており、アルギン酸ナトリウムまたはヒアルロン酸ナトリウムの分解による粘度の低下が小さいことがわかる。また、界面活性剤を添加した場合（実施例３〜６）には、更にエンドトキシンの含有量が低下することがわかる。 From the results shown in Table 1, according to the method of each example, the presence of a basic compound in a mixture of water and ethanol that is insoluble (gel-forming) with respect to sodium alginate and sodium hyaluronate. It is understood that the endotoxin content is drastically decreased because the treatment is performed underneath, and the decrease in viscosity due to decomposition of sodium alginate or sodium hyaluronate is small. Moreover, when surfactant is added (Examples 3-6), it turns out that content of endotoxin falls further.
一方、塩基性化合物を使用しない比較例１および非溶解性である水とエタノールの混合液を使用しない比較例２では、エンドトキシンの含有量が多く、エンドトキシンの不活化および除去効率が低いことがわかる。 On the other hand, in Comparative Example 1 in which no basic compound is used and in Comparative Example 2 in which a mixed solution of water and ethanol that is not soluble is used, it can be seen that the endotoxin content is high and the inactivation and removal efficiency of endotoxin is low. .
以上の結果から、本発明の精製方法は、被処理対象の高分子化合物などの化学物質を分解させたり、変性させたりすることなく、効率よくエンドトキシンを不活化させ、除去することができることがわかる。 From the above results, it can be seen that the purification method of the present invention can inactivate and remove endotoxin efficiently without decomposing or modifying a chemical substance such as a polymer compound to be treated. .
本発明の精製方法によって得られた化学物質の精製物は、生体に対して悪影響を及ぼすおそれのあるエンドトキシンの含有量が高度に低減されることから、各種医用材料として好適に使用することができる。 The purified product of the chemical substance obtained by the purification method of the present invention can be suitably used as various medical materials because the content of endotoxin that may adversely affect the living body is highly reduced. .
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