KR102155509B1 - Method for production collagen eliminated off flavor - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 버퍼 교환 방식을 이용하여 이취가 제거된 고수율의 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing high-yield collagen from which off-flavor has been removed, and more particularly, to a method for producing high-yield collagen from which off-flavor is removed using a buffer exchange method.
콜라겐은 동물성 소재에서 유래된 섬유 상의 구조 단백질로서 동물의 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 혈관 기타 결합 조직에 풍부하게 존재하며, 체단백질의 약 30% 이상을 차지한다. 콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원 섬유단백질과 달리 3중 나선구조의 형태로 존재하며, 트로포콜라겐(tropocollagen)을 기본단위로 한다. 구성 아미노산의 조성은 형태에 따라 다소 차이가 있으나, 일반적으로 글리세린, 프롤린 및 하이드록시프롤린이 주를 이룬다.Collagen is a fibrous structural protein derived from animal materials, and is abundantly present in animal skin, bones, cartilage, tendons, ligaments, blood vessels and other connective tissues, and accounts for about 30% or more of body protein. Collagen exists in the form of a triple helical structure, unlike myofibrillar protein, which has a double helical structure, and is based on tropocollagen. The composition of the constituent amino acids varies somewhat depending on the form, but in general, glycerin, proline and hydroxyproline dominate.
콜라겐의 구성비는 생체의 연령 변화에 따라 변화하는데, 연령이 증가함에 따라 콜라겐의 함량이 감소한다. 고령화에 따른 콜라겐 감소는 세포의 신진대사인 수분대사 조절에 영향을 주어 노화의 진행이 빨라지고, 각 조직 중의 수분함량을 감소시켜 결합조직의 원활함과 피부의 탄력도 없어진다. 그에 따라, 현대에는 콜라겐을 인체에 보충하여 피부노화를 방지하고 주름을 방지하는 다양한 제품들이 출시되고 있다.The composition ratio of collagen changes according to the age change of the living body, and the content of collagen decreases as the age increases. Collagen reduction with aging affects the regulation of water metabolism, the metabolism of cells, so that the progression of aging is accelerated and the moisture content in each tissue is reduced, so that the smoothness of the connective tissue and the elasticity of the skin are lost. Accordingly, in modern times, various products that supplement the human body with collagen to prevent skin aging and prevent wrinkles have been released.
특히, 콜라겐은 겔 형성, 보수성 및 유화안정성 등의 기능적 특성을 지니고 있어 기능성 식품소재로서도 중요하게 인식되고 있다.In particular, collagen is recognized as important as a functional food material as it has functional properties such as gel formation, water retention and emulsion stability.
위와 같은 배경하에, 대량으로 산업적으로 적합한 콜라겐을 생산하고자 다양한 콜라겐 추출방법이 연구 중에 있지만, 그 연구 결과가 미비한 실정이다. Under the above background, various collagen extraction methods are being studied to produce industrially suitable collagen in large quantities, but the research results are insufficient.
대한민국 공개특허 제10-2009-0105984호에서는, 눈다랑어 껍질에 아세트산을 처리하여 콜라겐을 추출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 기존의 콜라겐 추출 방법은 수율이 낮아 의료기기, 화장품 등을 생산하는 산업에서 활용이 어렵고 원료수급을 위한 비용이 극단적으로 지출되고, 콜라겐을 고수율로 제조하기 위한 용매로서 약산을 사용할 경우 이취가 심하게 발생하는 문제점이 있다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0105984 discloses a method of extracting collagen by treating bigeye skin with acetic acid. However, the conventional collagen extraction method is difficult to use in industries that produce medical devices and cosmetics due to its low yield, and the cost for supply and demand of raw materials is extremely expenditure, and when a weak acid is used as a solvent for producing collagen in high yield, it is difficult to use. There is a problem that occurs severely.
예컨대, 용매로 약산을 사용하여 제조된 콜라겐을 의료용 실 제품 등의 의료기기로 제조하는 경우, 제조업체에서 이취로 인한 리스크가 지속적으로 발생하는 단점이 있으며, 해당 의료기기를 병원에서 사용함에 있어 의사가 환자들에게 일일이 강한 취의 발생에 대해 설명해야 하는 어려움이 있다.For example, in the case of manufacturing collagen manufactured using a weak acid as a solvent into a medical device such as a medical seal product, there is a disadvantage that the risk of off-flavor from the manufacturer continues to occur, and when using the medical device in a hospital, the doctor There is a difficulty in explaining the occurrence of strong odors to patients one by one.
특히 초산을 용매로 콜라겐을 제조하는 경우 높은 콜라겐 수율을 나타내지만 악취로 인해 제품화 하는데 어려움이 많아 이를 해결하기 위한 연구가 필요한 실정이다.In particular, when collagen is prepared using acetic acid as a solvent, it shows a high collagen yield, but it is difficult to commercialize it due to odor, so research is needed to solve this problem.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 초산 또는 구연산 등의 단일 용매를 사용하여 콜라겐을 제조하는 기존방법에 비해 중간과정에서 초산을 다른 유기산 용매로 교환하는 버퍼 교환 방식을 사용한 경우 높은 수율은 유지하면서 이취는 제거된 콜라겐이 제조됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the present invention uses a buffer exchange method in which acetic acid is exchanged for another organic acid solvent in an intermediate process compared to the conventional method for producing collagen using a single solvent such as acetic acid or citric acid, and the high yield is The present invention was completed by confirming that collagen from which off-flavor was removed while maintaining was produced.
이에, 본 발명의 목적은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물(이물)을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별로 단계적으로 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화 나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수(농축)시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공하여 이취를 제거하고, 기존의 콜라겐 소재가 가지고 있는 문제점을 개선해 의료기기의 적용 폭을 넓히는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to (a) recover the collagen layer from which the fat has been removed by swelling the pigskin in an acetic acid solution; (b) stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme has been added to extract collagen, and pulverizing to recover the homogenized collagen extract; (c) recovering a collagen extract obtained by inactivating an enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) After adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme was inactivated and titrating the pH to 2.0-3.0 to prepare collagen in a solution state, the precipitate (foreign matter) was removed through centrifugation, and the supernatant containing collagen was added. Recovering; (e) filtration of the supernatant containing collagen was sequentially performed in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 μm, two steps with a pore size of 0.44 to 0.46 μm, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3 μm. Recovering the filtered collagen solution by performing three filtration processes in stages for each pore size; (f) applying negative pressure to the filtered collagen solution to perform primary concentration with buffer exchange; (g) the first concentrated concentrate is stirred under
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 콜라겐을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a collagen prepared by the above manufacturing method.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화 나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes the steps of: (a) swelling the pigskin in an acetic acid solution, thereby recovering the collagen layer from which the fat has been removed; (b) stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme has been added to extract collagen, and pulverizing to recover the homogenized collagen extract; (c) recovering a collagen extract obtained by inactivating an enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme is inactivated and titrating the pH to 2.0 to 3.0 to prepare collagen in a solution state, removing the precipitate through centrifugation, and recovering the supernatant containing collagen. ; (e) filtration of the supernatant containing collagen was sequentially performed in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 μm, two steps with a pore size of 0.44 to 0.46 μm, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3 μm. Recovering the filtered collagen solution by performing three filtration processes for each pore size; (f) applying negative pressure to the filtered collagen solution to perform primary concentration with buffer exchange; (g) the first concentrated concentrate is stirred under
본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 TFF 시스템을 이용하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the buffer exchange in step (f) may be performed using a TFF system.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 초산 용매를 구연산 용매로 교환하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the buffer exchange in step (f) may be to exchange the acetic acid solvent with the citric acid solvent.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (c)의 효소는 펩신일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the enzyme of step (c) may be pepsin.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (h)의 강산은 염산(HCl)일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the strong acid in step (h) may be hydrochloric acid (HCl).
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 콜라겐을 제공한다.In addition, the present invention provides a collagen produced by the above production method.
본 발명은 콜라겐의 제조방법에 있어 초산 또는 구연산 등의 단일 용매를 사용하는 기존 제조방법과 달리, 콜라겐 수율이 가장 높게 추출되는 용매인 초산을 사용하면서 농축단계에서 상대적으로 이취가 적은 구연산으로 대체하는 버퍼 교환 방식을 사용하여 이취가 제거된 높은 수율의 콜라겐을 제조하였으며, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐은 산을 처리한 콜라겐에 발생되는 단백질 변성 및 순도 저하의 화학적 문제점을 개선하고, 제조된 콜라겐의 이취가 현저히 줄어드는 효능이 있어 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기 등 다양한 분야에서 활용도가 높을 것으로 기대된다.The present invention uses acetic acid, which is a solvent extracted with the highest collagen yield, unlike the conventional manufacturing method using a single solvent such as acetic acid or citric acid. A high-yield collagen was prepared from which off-flavor was removed by using a buffer exchange method, and the collagen produced by the production method of the present invention improves the chemical problems of protein denaturation and purity decrease generated in acid-treated collagen, As it has the effect of remarkably reducing off-flavor of collagen, it is expected to be highly utilized in various fields such as 3D printer raw materials, regenerative medical raw materials, and medical devices related to heterogeneous organs.
도 1은 본 발명의 콜라겐 제조공정의 생산공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 제조공정에 따른 제 1 농축과정에서 용매를 각기 다르게 하였을 때 콜라겐의 수율을 나타낸 결과로서, M은 마커를 의미하며, 1은 초산을 용매로 사용한 경우, 2는 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환한 경우, 3은 아스코르브 산을 용매로 사용한 경우, 4는 염산을 용매로 사용한 경우, 5는 인산염을 용매로 사용한 경우, 6은 구연산을 용매로 사용한 경우의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 제조공정에 따른 제 1 농축과정에서 각기 다른 용매를 사용했을 때의 콜라겐 제조 수율 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows a production process diagram of the collagen production process of the present invention.
2 is a result showing the yield of collagen when different solvents are used in the first concentration process according to the manufacturing process of the present invention, where M represents a marker, 1 represents a case of using acetic acid as a solvent, 2 represents acetic acid to citric acid When the buffer is exchanged with 3, ascorbic acid is used as a solvent, 4 is hydrochloric acid is used as the solvent, 5 is phosphate is used as the solvent, and 6 is citric acid is used as the solvent.
3 shows the results of the collagen production yield when different solvents are used in the first concentration process according to the manufacturing process of the present invention.
본 발명에서는 초산의 이취를 제거하면서 고수율로 콜라겐을 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력하였고, 그 결과 초산 또는 구연산 등의 유기산을 단일 용매로 사용하여 콜라겐을 추출하는 것 보다 버퍼 교환 방식에 의해 용매를 교환하여 콜라겐을 제조하는 경우에 기존 콜라겐 제조방법에 비해 이취가 없고 콜라겐 수득율이 현저히 높은 콜라겐을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In the present invention, efforts have been made to develop a method for producing collagen in high yield while removing off-flavor of acetic acid, and as a result, the buffer exchange method is more effective than extracting collagen using an organic acid such as acetic acid or citric acid as a single solvent. In the case of preparing collagen by exchanging the solvent, the present invention was completed by confirming that collagen can be produced with no off-flavor and a significantly higher collagen yield compared to the existing collagen production method.
이에, 본 발명은 본 발명은 (a) 돈피를 초산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계; (d) 상기 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계; (e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계; (f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계; (g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화 나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및 (h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides the steps of recovering the collagen layer from which the fat has been removed by swelling the pig skin after immersing it in an acetic acid solution; (b) stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme has been added to extract collagen, and pulverizing to recover the homogenized collagen extract; (c) recovering a collagen extract obtained by inactivating an enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract; (d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme is inactivated and titrating the pH to 2.0 to 3.0 to prepare collagen in a solution state, removing the precipitate through centrifugation, and recovering the supernatant containing collagen. ; (e) filtration of the supernatant containing collagen was sequentially performed in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 μm, two steps with a pore size of 0.44 to 0.46 μm, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3 μm. Recovering the filtered collagen solution by performing three filtration processes for each pore size; (f) applying negative pressure to the filtered collagen solution to perform primary concentration with buffer exchange; (g) the first concentrated concentrate is stirred under
이하, 본 발명의 콜라겐 제조방법에 대해 각 단계별로 세분화해서 구체적으로 설명하기로 한다.Hereinafter, the collagen production method of the present invention will be described in detail by subdividing each step.
<(a) 단계 : 콜라겐 층 회수 단계><Step (a): Collagen layer recovery step>
등심돈피는 외피로부터 콜라겐층, 모공층 및 지방층으로 구분되며, 본 단계는 돈피를 유기산 용액에 담근 후 팽윤시킴으로써, 콜라겐 층을 제외한 모공층 및 지방층이 제거된 콜라겐층을 회수하는 과정이다. The sirloin pigskin is divided into a collagen layer, a pore layer, and a fat layer from the outer skin, and this step is a process of recovering the collagen layer from which the pore layer and the fat layer excluding the collagen layer are removed by swelling the pigskin after immersing it in an organic acid solution.
본 발명에서 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.The organic acid solution used in the present invention may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixed solution thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
본 단계의 수행조건은 단백질(콜라겐)의 변성을 막기위해 4℃의 냉장조건으로 수행하는 것이 바람직하며, 수행시간은 12~36시간인 것이 바람직하며, 24시간 정치시키는 것이 가장 바람직하다.In order to prevent denaturation of protein (collagen), the conditions for performing this step are preferably refrigerated at 4° C., the execution time is preferably 12 to 36 hours, and it is most preferable to let it stand for 24 hours.
본 단계에서 회수된 콜라겐 층은 상온에 방치하면 건조(변성)될 수 있으므로, 유기산 수용액에 넣어 냉장보관하는 것이 바람직하며, 유기산 수용액에 넣어 보관하는 중에 관찰되는 제거되지 않은 지방층 및 모공층은 추가적인 작업을 통해 완전히 제거 할 수 있다.The collagen layer recovered in this step can be dried (denatured) if left at room temperature, so it is preferable to put it in an aqueous organic acid solution and store it refrigerated.The unremoved fat layer and pore layer observed during storage by placing it in the organic acid aqueous solution are additional work. It can be completely removed through.
< (b) 단계 : 추출 및 균질화 단계 ><(b) step: extraction and homogenization step>
본 단계는 상기 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 유기산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화 시켜 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 과정이다.In this step, the collagen layer is stirred in an organic acid solution to which a proteolytic enzyme is added to extract collagen, pulverized and homogenized to recover the homogenized collagen extract.
본 단계에서 단백질 분해 효소는 통상적으로 단백질을 분해하는 효소에서 선택된 어떤 것도 사용할 수 있으나 펩신 인 것이 바람직하다. In this step, the proteolytic enzyme may be any one selected from enzymes that generally degrade proteins, but pepsin is preferred.
본 단계에서 추출된 콜라겐을 분쇄 및 균질화하는 과정은 콜라겐 층의 비율이 많아질 경우 균질화에 어려움이 발생 할 수 있기 때문에, 유기산 수용액과 콜라겐 층의 비율은 100 : 3 정도인 것이 바람직하다.In the process of pulverizing and homogenizing the collagen extracted in this step, since homogenization may be difficult when the ratio of the collagen layer increases, the ratio of the organic acid aqueous solution and the collagen layer is preferably about 100:3.
이때, 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.At this time, the organic acid solution to be used may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixed solution thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
< (c) 단계 : 단백질 분해효소 불활성화 단계 ><(c) step: protease inactivation step>
본 단계는 상기 균질화 된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 과정이다. This step is a process of recovering the collagen extract obtained by inactivating the enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract.
본 단계에서 수산화나트륨을 이용하여 pH를 5.5~8.5로 적정하는 것이 바람직하며, 단백질 분해효소를 불활성화시킴으로써, 다음 단계에 단백질 분해효소가 영향을 미치지 않도록 한 것이다.In this step, it is preferable to titrate the pH to 5.5 to 8.5 using sodium hydroxide, and by inactivating the protease, the protease does not affect the next step.
< (d) 단계 : 콜라겐 함유 상등액 제조 단계 ><(d) step: collagen-containing supernatant preparation step>
본 단계는 상기 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 유기산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 과정이다. 이때, 침전물을 이물질을 의미하고, 상등액은 콜라겐이 함유된 용액이다.In this step, an organic acid is added to the collagen extract in which the enzyme is inactivated, and the pH is adjusted to 2.0-3.0 to prepare collagen in a solution state, and then the precipitate is removed through centrifugation and the supernatant containing collagen is recovered. to be. At this time, the precipitate means a foreign substance, and the supernatant is a solution containing collagen.
이때, 사용하는 유기산 용액은 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 초산인 것이 바람직하다.At this time, the organic acid solution to be used may be any one selected from acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid, and a mixed solution thereof, but is not limited thereto, and acetic acid is preferable.
본 단계에서는 콜라겐이 용액 상태로 회수되는데, 원심분리를 통해 침전물을 버리고 상등액을 회수함으로써, 콜라겐이 함유된 용액을 수득할 수 있다. 본 단계를 통해 여과 및 정제과정의 효율을 상승시킬 수 있다.In this step, collagen is recovered in a solution state, and a solution containing collagen can be obtained by discarding the precipitate and recovering the supernatant through centrifugation. Through this step, the efficiency of the filtration and purification process can be increased.
< (e) 단계 : 여과 단계 ><(e) step: filtration step>
본 단계는 상기 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과를 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 과정이다.In this step, the supernatant was sequentially filtered in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 µm, two steps with a pore size of 0.44 to 0.46 µm, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3 µm. This is a process of recovering the filtered collagen solution by performing filtration once.
이때, 포어사이즈별 3단계의 여과과정을 통해, 콜라겐의 보이지 않는 이물과 병원체를 제거하고, 안전성을 높일 수 있다.At this time, through the three-step filtration process for each pore size, invisible foreign substances and pathogens of collagen can be removed and safety can be improved.
< (f) 단계 : 1차 농축 단계 ><(f) step: 1st concentration step>
본 단계는 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 과정이다.In this step, negative pressure is applied to the filtered collagen solution to perform primary concentration with buffer exchange.
본 단계의 1차 농축 과정은 TFF 시스템을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 버퍼교환은 농축과정에서 기존 콜라겐을 추출한 용매를 새로운 용매로 치환하는 과정으로 초산, 아스코르브산, 염산, 인산염, 구연산 및 이들의 혼합용액 중 선택되는 어느 하나의 용매를 다른 하나의 용매로 치환 할 수 있으나, 초산을 구연산으로 교환하는 것이 바람직하다.The first concentration process in this step can be performed using a TFF system, and the buffer exchange is a process of replacing the solvent extracted from the existing collagen with a new solvent during the concentration process, and acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, phosphate, citric acid and these One solvent selected from among the mixed solutions of may be substituted with another solvent, but it is preferable to exchange acetic acid with citric acid.
본 단계에서 버퍼 교환을 통해 기존 용매가 갖는 고수율은 유지하고, 새로운 용매의 치환으로 인한 이취 제거에 현저한 효과를 나타낸다.In this step, the high yield of the existing solvent is maintained through buffer exchange, and it has a remarkable effect on removing off-flavor due to the substitution of a new solvent.
< (g) 단계 : 2차 농축 단계 ><(g) step: 2nd concentration step>
본 단계는 상기 1차 농축한 농축액을 수산화 나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축하는 과정이다.In this step, the first concentrated concentrate is agitated under pH 2-7 conditions with sodium hydroxide to adjust the pH to 6.5-8.5, gelatinized (gel), and second concentrated.
본 단계에서 pH 조건에 의해 젤라틴화 정도에 차이가 나타나며, 본 단계에서 수행시간은 30~2시간 동안 교반하는 것이 바람직하나, 젤라틴화(반응)를 최대한으로 유도하기 위해 2시간 이상으로 장시간 교반을 진행할 수 있다.In this step, there is a difference in the degree of gelatinization depending on the pH condition, and in this step, it is preferable to stir for 30 to 2 hours, but in order to induce gelatinization (reaction) to the maximum, agitation for a long period of 2 hours or more is required. You can proceed.
< (h) 단계 : 탈수 및 균질화 단계 ><(h) step: dehydration and homogenization step>
본 단계는 상기 단계 (g) 후, 상기 단계 (g)에 의해 2차 농축된 농축액을 원심분리를 통해 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 과정이다.In this step, after the step (g), the concentrated solution secondly concentrated by the step (g) is dehydrated through centrifugation, and is homogenized by putting it in a strong acid.
본 단계에서 원심분리는 수분을 최소화 하기 위해 3회 진행하는 것이 바람직하며 원심분리를 통해 분리된 상층액은 폐기하고 콜라겐 펠렛만을 강산에 넣어 균질화를 진행한다. In this step, centrifugation is preferably performed three times to minimize moisture, and the supernatant separated through centrifugation is discarded and only the collagen pellets are added to strong acid to perform homogenization.
본 단계에서 강산은 pH 3 이하인 산을 이용할 수 있으며, 염산인 것이 바람직하다. In this step, an acid having a pH of 3 or less may be used as the strong acid, and hydrochloric acid is preferable.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail through the following examples and experimental examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples and experimental examples, and includes modifications of equivalent technical ideas.
실시예 1 : 버퍼 교환 방식을 이용한 콜라겐 제조방법Example 1: Collagen production method using a buffer exchange method
<(a) 단계 : 콜라겐 층 회수 단계><Step (a): Collagen layer recovery step>
본 단계는 돈피를 팽윤시킴으로써, 지방이 제거된 콜라겐층을 회수하는 단계이다. 등심돈피를 가로 3cm, 세로 20cm로 재단하여 세척한 후 pH 2.5의 4℃ 초산 용액에 침적시켜 4℃ 냉장조건으로 24시간 정치하여 반응시켰다. 이때, 시간이 경과할수록 초산의 양은 등심돈피로 흡수되어 감소하므로 약 8시간 마다 초산을 추가로 첨가하였다. 24시간 반응을 진행 후, 등심돈피가 팽윤여부를 확인하고, 2~3배 팽윤이 되었을 경우 더 이상 팽윤이 진행되지 않는다고 판단하여, 팽윤 과정을 중단하였다. 팽윤된 돈피를 동결보관 한 후, 15~25℃ 상온에서 10분간 해동시키고 칼과 도마를 이용하여 모공 및 지방을 제거하고 콜라겐층의 돈피를 수득하였다. 작업이 완료된 콜라겐 층 돈피는 초저온 냉동고에 보관하였다.This step is a step of recovering the collagen layer from which fat has been removed by swelling the pigskin. The sirloin pigskin was cut into 3cm in width and 20cm in length, washed, and then immersed in an acetic acid solution of pH 2.5 at 4℃, and allowed to stand for 24 hours in 4℃ refrigerated condition for reaction. At this time, as the time passed, the amount of acetic acid was absorbed and decreased by sirloin pigskin, so acetic acid was additionally added every 8 hours. After the reaction proceeded for 24 hours, it was checked whether the sirloin pigskin was swelled, and it was determined that the swelling did not proceed any more when the swelling was 2 to 3 times, and the swelling process was stopped. After freezing the swollen pigskin, it was thawed at room temperature at 15~25℃ for 10 minutes, and pores and fat were removed using a knife and a cutting board, and a collagen layer pigskin was obtained. The finished collagen layer pork skin was stored in a cryogenic freezer.
< (b) 단계 : 추출 및 균질화 단계 ><(b) step: extraction and homogenization step>
본 단계는 상기 콜라겐층에서 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계이다. 정제수에 초산을 첨가하여 pH를 2.5로 조절하고, 4℃에서 냉장보관 하였다. 분쇄 전, 초산 수용액 400ml를 담은 유리 비커에 펩신 15g을 넣고 완전 용해하였다. 초저온 냉동고에 보관중인 콜라겐 층 돈피 200g을 냉장 보관하였던 초산과 혼합하면서 믹서를 이용해 균질화시켰다. 이때, 돈피 200g에 초산 수용액 20L를 사용하였다. 균질화 과정 이후, 상기 돈피 25~30g 당 500ml의 초산 수용액을 이용하여 분쇄를 진행하였다. 육안으로 분쇄되지 않은 돈피가 없을 때까지 분쇄하고 분쇄액을 수득하였다. 미리 용해한 펩신을 수득한 분쇄액에 넣고, 교반기에서 4℃, 250RPM으로 24시간동안 추출(반응)시켜 균질화된 콜라겐 추출액을 회수 하였다.This step is a step of extracting and pulverizing collagen from the collagen layer to recover a homogenized collagen extract. Acetic acid was added to purified water to adjust the pH to 2.5, and stored refrigerated at 4°C. Before grinding, 15 g of pepsin was completely dissolved in a glass beaker containing 400 ml of an aqueous acetic acid solution. 200 g of collagen layer pigskin stored in a cryogenic freezer was homogenized using a mixer while mixing with acetic acid stored in the refrigerator. At this time, 20L of an aqueous solution of acetic acid was used for 200 g of pig skin. After the homogenization process, pulverization was performed using 500 ml of an aqueous solution of acetic acid per 25 to 30 g of pork skin. It was pulverized until there were no pig skins that were not crushed with the naked eye, and a pulverized liquid was obtained. Pre-dissolved pepsin was added to the obtained pulverized solution, and extracted (reacted) for 24 hours at 4° C. and 250 RPM in a stirrer to recover a homogenized collagen extract.
< (c) 단계 : 단백질 분해효소 불활성화 단계 ><(c) step: protease inactivation step>
본 단계는 상기 균질화 된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계이다. 상기 냉장보관된 콜라겐 추출액에 10M 수산화 나트륨을 첨가를 통해 pH를 7.0±1.5로 조정하고, pH조정이 완료된 후 3시간 동안 4℃ 냉장조건으로 교반을 진행하여 효소를 불활성화 시킨 후, 콜라겐 추출액을 회수하였다.This step is a step of recovering a collagen extract obtained by inactivating an enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract. The pH was adjusted to 7.0±1.5 by adding 10M sodium hydroxide to the refrigerated collagen extract, and after the pH adjustment was completed, stirring was performed at 4°C for 3 hours to inactivate the enzyme, and then the collagen extract was used. Recovered.
< (d) 단계 : 콜라겐 함유 상등액 제조 단계 ><(d) step: collagen-containing supernatant preparation step>
본 단계는 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 조절하여 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계이다. 효소 불활성화 완료 후, 초산을 첨가하여 pH를 2.5±0.5로 조정한 후 pH조정이 완료된 시점으로부터 3시간 동안 4℃의 냉장조건으로 교반을 진행하여 완전 용해 시켰다. 완전 용해된 콜라겐 용액을 Tubular 원심분리기를 이용하여 15,000RPM, 펌프 스피드 12 에서 1시간 동안 원심분리 하였다. 배출관을 통해 나오는 이물을 제거하고, 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하였다.In this step, acetic acid is added to the collagen extract in which the enzyme is inactivated to adjust the pH to make collagen in solution, and then the supernatant containing collagen is recovered through centrifugation. After completion of the enzyme inactivation, acetic acid was added to adjust the pH to 2.5±0.5, and then stirred under refrigerated conditions at 4° C. for 3 hours from the time the pH adjustment was completed to completely dissolve. The completely dissolved collagen solution was centrifuged for 1 hour at 15,000 RPM and a pump speed of 12 using a Tubular centrifuge. Foreign matter coming out through the discharge pipe was removed, and the supernatant containing collagen was recovered.
< (e) 단계 : 여과 단계 ><(e) step: filtration step>
본 단계는 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈별로 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계이다. 1차 여과를 위해 하우징(Housing)에 포어 사이즈 1.0㎛ 필터를 결합 후 멸균하였다. 하우징 필터의 용액 투입구에 T자 배관을 연결하고 멸균된 플렉스 튜브(Flex tube)와 압력 게이지를 연결하였다. 2차 여과를 위해 배출구에 연결된 T자 배관에 포어사이즈 0.45㎛ 캡슐 필터(Capsule Filter)와 압력게이지를 결합하였다. 3차 제균 여과를 위해 하우징과 포어 사이즈 0.2㎛ 필터를 결합 후 멸균하였다. 배출구에 연결된 T자 배관에 포어사이즈 0.2㎛ 필터와 압력게이지를 연결한다. 2차 여과 공정이 완료된 용액은 플렉스 튜브에 투입하고 U.F 펌프에 RPM 값을 입력하고 가동시킨다. 1.0㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 순으로 단계적으로 여과가 진행되며 여과가 완료된 후 하우징안에 들어있는 양 만큼의 초산 수용액을 투입하여 여과를 추가로 진행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하였다.This step is a step of recovering the filtered collagen solution by performing three filtration processes for each pore size of the supernatant containing collagen. For the primary filtration, a 1.0 μm pore size filter was attached to the housing and then sterilized. A T-shaped pipe was connected to the solution inlet of the housing filter, and a sterilized Flex tube and a pressure gauge were connected. For the secondary filtration, a pore size 0.45㎛ capsule filter and a pressure gauge were connected to the T-shaped pipe connected to the outlet. For the third sterilization filtration, the housing and pore size 0.2㎛ filter were combined and sterilized. Connect a pore size 0.2㎛ filter and a pressure gauge to the T-shaped pipe connected to the outlet. The solution after the secondary filtration process is put into the flex tube, and the RPM value is input into the U.F pump, and it is operated. Filtration was carried out step by step in the order of 1.0㎛, 0.45㎛, 0.2㎛, and after the filtration was completed, an aqueous solution of acetic acid as much as the amount contained in the housing was added to perform filtration further to recover the filtered collagen solution.
< (f) 단계 : 1차 농축 단계 ><(f) step: 1st concentration step>
본 단계는 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 버퍼교환과 함께 1차 농축을 수행하는 단계이다.In this step, negative pressure is applied to the filtered collagen solution to perform primary concentration with buffer exchange.
상기 단계 (e)의 0.2㎛ 하우징 필터 배출구에 연결되어 있는 호스를 TFF 시스템 수조(Reservior)에 연결하였다. 이때 수조에 공기압이 생기지 않도록 벤트 필터(vent filter)를 장착한다. 제균 여과가 완료된 용액이 수조에 투입되는지 확인하고, 수조에 4~5L가 채워지면 TFF 시스템을 가동하여 100kDa 이하인 분자량은 배출구로 버리고, 100kDa 이상인 분자량은 다시 수조로 모아서 순환 및 농축 공정을 진행한다. 1차 농축과정에서 초산은 벤트를 통해 빠져나가고 액상콜라겐은 수조에 다시 모아진다. 이때, 플렉스 튜브를 이용해 TFF 시스템에 구연산 공급라인을 수조와 연결하였다. 상기 연결을 통해TFF 시스템이 음압일 경우 구연산에서 수조에서 용매를 가져오도록 하였다. 농축이 진행되는 동안 벤트로 빠져나간 초산만큼 구연산을 공급라인을 통해 빨아들여 버퍼 교환이 발생하였다. 이때 초산이 감소되는 비율은 50%, 25%, 12.5%, 6.2%, 3.1%, 1.55%, 0.77%, 0.4%, 0.2%, 0.1%이며, 초산의 감소를 염두해 500ml로 10회 총 5L의 초산과 5L동량의 구연산의 버퍼 교환을 진행하였다.The hose connected to the 0.2㎛ housing filter outlet of step (e) was connected to the TFF system reservoir. At this time, a vent filter is installed so that air pressure does not occur in the water tank. Check that the solution after the sterilization and filtration is put into the water tank, and when 4-5L is filled in the water tank, the TFF system is operated to discard molecular weights less than 100kDa into the outlet, and the molecular weights greater than 100kDa are collected again into the water tank, and the circulation and concentration process proceed. In the first concentration process, acetic acid escapes through vents and liquid collagen is collected again in the water tank. At this time, the citric acid supply line was connected to the water tank to the TFF system using a flex tube. Through the above connection, when the TFF system was under negative pressure, citric acid was used to bring the solvent from the water bath. During the concentration, as much citric acid as acetic acid exited through the vent was sucked through the supply line, and buffer exchange occurred. At this time, the rate of reduction of acetic acid is 50%, 25%, 12.5%, 6.2%, 3.1%, 1.55%, 0.77%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, and 500ml total 5L 10 times with the reduction in acetic acid in mind. The buffer exchange between acetic acid and 5 L of citric acid was performed.
TFF 수조에서 구연산으로 버퍼 교환이 이루어지며 이취가 상당히 제거된 것을 확인하였다. 이취를 더 제거하기 위해서는 동량의 버퍼 교환 작업을 추가하여 2회 연속(총 10L)으로 농축단계를 진행하는 방식을 수행할 수 있다. 6배 농축을 통해 최종 농축량이 3~3.3L가 될 때까지 농축을 진행하여 1차 농축액을 회수하였다. It was confirmed that the buffer was exchanged with citric acid in the TFF water bath, and off-flavor was significantly removed. In order to further remove off-flavor, the same amount of buffer exchange operation may be added and the concentration step may be performed twice in a row (total of 10 L). Concentration was performed until the final concentration was 3 to 3.3 L through 6-fold concentration, and the first concentrate was recovered.
< (g) 단계 : 2차 농축 단계 ><(g) step: 2nd concentration step>
본 단계는 상기 1차 농축액에 수산화 나트륨을 이용하여 pH를 적정하고, 젤라틴화시키는 농축과정을 통해 2차 농축액을 회수하는 단계이다. 1차 농축이 완료된 용액을 클린벤치에서 10M의 NaOH를 사용하여 pH 7.5±1로 적정하였다. 이때, 적정을 위해서 pH를 2 내지 7의 구간으로 나눠 10분간 교반을 진행하였다. pH 구간별로 젤라틴화되는 정도에 차이가 발생하며 콜라겐에 특성상 pH 4 내지 7에서 응집이 발생되나, 세부적인 조정이 어렵기 때문에 pH4, pH5, pH6 및 pH7 등의 4개 구간으로 나눠 단계적으로 적정 후 반응(겔화)시키고 다시 적정 후 반응시키는 방식으로 pH 반응을 유도하였다. pH 적정이 완료된 후 1시간 동안 교반을 진행하였다. pH 적정이 완료된 후, 콜라겐이 젤라틴화 된 것을 확인한 후 4℃ 냉장조건에서 밤새도록 정치시켜 2차 농축액을 회수하였다.This step is a step of recovering the second concentrate through a concentration process in which the first concentrate is titrated with sodium hydroxide and gelatinized. The solution for which the first concentration was completed was titrated to pH 7.5±1 using 10M NaOH in a clean bench. At this time, for titration, the pH was divided into sections of 2 to 7 and stirred for 10 minutes. There is a difference in the degree of gelatinization for each pH section, and aggregation occurs at
< (h) 단계 : 탈수 및 균질화 단계 ><(h) step: dehydration and homogenization step>
본 단계는 상기 2차 농축액을 원심분리를 통해 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계이다. 클린벤치에서 멸균된 원심분리기 병에 농축공정이 완료된 용액을 같은무게로 소분하였다. 원심분리기를 6,000RPM, 30Min, 4℃로 설정하고 온도가 4℃가 되면 원심분리를 진행하였다. 수분을 최소화 하기 위해 원심분리를 총 3회 진행하였다. 원심분리기를 이용하여 콜라겐 펠렛(collagen pellet)을 분리하였다. 분리된 펠렛을 제외한 상층액은 폐기하고, 클린벤치에서 수득된 펠렛 4%의 양에 1M의 HCl을 넣고 spatula로 용해하였다. 펠렛이 완전 용해될 때 까지 육안으로 확인하면서 용해를 진행하였고, 이후 밀봉하여 4℃에서 냉장보관하였다. 최종 제품의 함량을 확인하고, 완제품을 무균상태에서 소분하여 포장하였다.This step is a step of dehydrating the secondary concentrate through centrifugation, and homogenizing it by putting it in a strong acid. The solution for which the concentration process was completed was subdivided into equal weights in a centrifuge bottle sterilized in a clean bench. The centrifuge was set to 6,000RPM, 30Min, 4°C, and when the temperature reached 4°C, centrifugation was performed. Centrifugation was performed three times in order to minimize moisture. Collagen pellets were separated using a centrifuge. The supernatant except for the separated pellets was discarded, and 1M HCl was added to the 4% amount of the pellets obtained from the clean bench and dissolved with a spatula. Dissolution was carried out while visually checking until the pellets were completely dissolved, and then sealed and stored refrigerated at 4°C. The content of the final product was checked, and the finished product was subdivided and packaged under aseptic conditions.
비교예 1 : 초산을 이용한 콜라겐 제조방법Comparative Example 1: Method for producing collagen using acetic acid
상기 실시예 1과 동일하게 하되, 상기 < (f) 단계 : 1차 농축 단계 >에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다. In the same manner as in Example 1, but in the <(f) step: primary concentration step>, collagen was prepared without buffer exchange.
비교예 2 : 아스코르브산을 이용한 콜라겐 제조방법Comparative Example 2: Method for producing collagen using ascorbic acid
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a)단계 내지 (h)단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 아스코르브산으로 하고 상기 < (f) 단계 : 1차 농축 단계 >에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다. In the same manner as in Example 1, except that the organic acid used in steps (a) to (h) is used as ascorbic acid, which has less off-flavor compared to acetic acid, and the <(f) step: first concentration step>, without buffer exchange Was prepared.
비교예 3 : 염산을 이용한 콜라겐 제조방법Comparative Example 3: Method for producing collagen using hydrochloric acid
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a)단계 내지 (h)단계에 사용된 유기산을 초산이 아닌 염산으로 하고 상기 < (f) 단계 : 1차 농축 단계 >에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다. In the same manner as in Example 1, except that the organic acid used in steps (a) to (h) was used as hydrochloric acid instead of acetic acid, collagen was prepared without buffer exchange in the <(f) step: first concentration step>.
비교예 4 : 인산염을 이용한 콜라겐 제조방법Comparative Example 4: Method for producing collagen using phosphate
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a)단계 내지 (h)단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 인산염으로 하고 상기 < (f) 단계 : 1차 농축 단계 >에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다. In the same manner as in Example 1, except that the organic acid used in steps (a) to (h) is a phosphate having less off-flavor compared to acetic acid, and collagen is prepared without buffer exchange in the <(f) step: first concentration step> Was prepared.
비교예 5 : 구연산을 이용한 콜라겐 제조방법Comparative Example 5: Method for producing collagen using citric acid
상기 실시예 1과 동일하게 하되, (a)단계 및 (h)단계에 사용된 유기산을 초산에 비해 이취가 적은 구연산으로 하고 상기 < (f) 단계 : 1차 농축 단계 >에서 버퍼 교환 없이 콜라겐을 제조하였다. In the same manner as in Example 1, the organic acid used in steps (a) and (h) was citric acid with less off-flavor compared to acetic acid, and collagen was prepared without buffer exchange in the <(f) step: first concentration step>. Was prepared.
실험예 1 : 콜라겐 수율 측정Experimental Example 1: Measurement of collagen yield
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 5로부터 회수한 수득물의 콜라겐 함량을 측정하여 비교하였다. The collagen content of the obtained products recovered from Example 1 and Comparative Examples 1 to 5 was measured and compared.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 초산을 용매로 사용한 경우에 가장 높은 콜라겐 수율을 나타냈으며, 초산을 100%로 가정하였을 때, 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환한 경우에 97.8%의 수율을, 아스코르브산을 용매로 사용한 경우 87.4%의 수율을 구연산을 용매로 사용한 경우 81.8%의 수율을, 인산염을 용매로 사용한 경우 79.1% 수율을, 염산을 용매로 사용한 경우 44.4%의 상대적인 수율을 확인하였다. As a result, as shown in FIGS. 2 and 3, when acetic acid was used as a solvent, the highest collagen yield was shown, and assuming that acetic acid was 100%, 97.8% of the buffer was exchanged from acetic acid to citric acid. The yield was 87.4% when using ascorbic acid as the solvent, 81.8% when using citric acid as the solvent, 79.1% when using phosphate as the solvent, and 44.4% when using hydrochloric acid as the solvent. Confirmed.
상기 결과로부터 구연산, 아스코르브산 등 단일 용매를 이용하여 콜라겐을 제조한 경우에 비해 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환하는 방식을 이용하여 콜라겐을 제조하였을 때, 우수한 제조 수율을 나타내는 것을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that when collagen was prepared using a method of exchanging the buffer from acetic acid to citric acid, compared to the case where collagen was prepared using a single solvent such as citric acid and ascorbic acid, excellent production yield was shown.
실험예 2 : 악취평가Experimental Example 2: odor evaluation
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 5로부터 제조된 콜라겐에서 발생하는 냄새를 평가하기 위하여 1L 용량의 봉지에 각 실시예 또는 비교예에서 제조된 콜라겐을 10ml 넣고, 패널 10명을 대상으로 하기 [표 1]에 나타난 바와 같은 기준으로 악취를 평가하고, 이의 평균값을 나타냈다.In order to evaluate the odor generated from the collagen prepared from Example 1 and Comparative Examples 1 to 5, 10 ml of the collagen prepared in each Example or Comparative Example were put in a 1 L volume bag, and 10 panelists were subjected to the following: The odor was evaluated according to the criteria shown in [Table 1], and the average value thereof was shown.
상기와 같은 기준으로 악취를 평가한 결과를 하기 [표 2]에 나타냈다.The results of evaluating the odor based on the above criteria are shown in Table 2 below.
(초산->구연산)Buffer exchange
(Acetic acid-> citric acid)
상기 실험예 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 콜라겐의 경우 악취가 거의 없었지만, 초산 또는 염산을 사용한 경우 악취 강도가 심한 것이 확인되었다. 상기 결과로부터 본 발명의 버퍼 교환 방식을 사용하는 경우에 악취 감소 효과가 현저하여 추가적인 공정으로 냄새를 제거하는 과정 없이 3D 프린터 원료, 재생의료 원료, 이종장기 관련 의료기기, 식품 또는 화장품 분야에서 직접적으로 사용 가능함이 확인되었다.As confirmed in Experimental Example 2, in the case of the collagen according to the present invention, there was almost no odor, but it was confirmed that the odor intensity was severe when acetic acid or hydrochloric acid was used. From the above results, in the case of using the buffer exchange method of the present invention, the odor reduction effect is remarkable, so it is directly in the field of 3D printer raw materials, regenerative medical raw materials, medical devices related to different organs, food or cosmetics without removing the odor through an additional process. It has been confirmed that it can be used.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above-described description of the present invention is for illustration purposes only, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it is possible to easily transform it into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting.
Claims (6)
(b) 상기 회수된 콜라겐층을 단백질 분해 효소를 첨가한 초산 수용액에 교반하여 콜라겐을 추출하고, 분쇄하여 균질화된 콜라겐 추출액을 회수하는 단계;
(c) 상기 균질화된 콜라겐 추출액에 수산화나트륨을 첨가하여 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액을 회수하는 단계;
(d) 상기 효소를 불활성화 시킨 콜라겐 추출액에 초산을 첨가하여 pH를 2.0~3.0으로 적정하여, 용액상태의 콜라겐을 만든 후, 원심분리를 통해 침전물을 제거하고 콜라겐을 함유하는 상등액을 회수하는 단계;
(e) 상기 콜라겐을 함유하는 상등액을 포어사이즈(pore size) 0.6~1.0㎛로 1단계, 포어사이즈 0.44~0.46㎛로 2단계, 포어사이즈 0.1~0.3㎛로 3단계의 여과를 순차적으로 수행하여 포어사이즈별 세 번의 여과 과정을 수행하여 여과된 콜라겐 용액을 회수하는 단계;
(f) 상기 여과된 콜라겐 용액에 음압을 가하여 초산에서 구연산으로 버퍼를 교환함과 동시에 1차 농축을 수행하는 단계;
(g) 상기 1차 농축한 농축액을 수산화 나트륨을 이용해 pH 2~7 조건에서 교반하여 pH를 6.5~8.5로 적정하고, 젤라틴(겔)화시켜 2차 농축액을 회수하는 단계; 및
(h) 상기 2차 농축액을 원심분리하여 탈수시키고, 강산에 넣어 균질화시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법.(a) recovering the collagen layer from which the fat has been removed by swelling the pigskin in an acetic acid solution;
(b) stirring the recovered collagen layer in an aqueous acetic acid solution to which a proteolytic enzyme has been added to extract collagen, and pulverizing to recover the homogenized collagen extract;
(c) recovering a collagen extract obtained by inactivating an enzyme by adding sodium hydroxide to the homogenized collagen extract;
(d) adding acetic acid to the collagen extract in which the enzyme is inactivated and titrating the pH to 2.0 to 3.0 to prepare collagen in a solution state, removing the precipitate through centrifugation, and recovering the supernatant containing collagen. ;
(e) filtration of the supernatant containing collagen was sequentially performed in one step with a pore size of 0.6 to 1.0 μm, two steps with a pore size of 0.44 to 0.46 μm, and three steps with a pore size of 0.1 to 0.3 μm. Recovering the filtered collagen solution by performing three filtration processes for each pore size;
(f) exchanging a buffer from acetic acid to citric acid by applying negative pressure to the filtered collagen solution and performing primary concentration at the same time;
(g) the first concentrated concentrate is stirred under pH 2 to 7 conditions with sodium hydroxide to adjust the pH to 6.5 to 8.5, and gelatinized (gel) to recover the second concentrate; And
(h) a method for producing collagen comprising the step of centrifuging the second concentrate to dehydrate, and homogenizing it in a strong acid.
상기 단계 (f)에서 버퍼 교환은 TFF 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.The method of claim 1,
In the step (f), the buffer exchange is characterized in that using the TFF system, a method for producing collagen.
상기 단계 (c)의 효소는 펩신인 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.The method of claim 1,
The enzyme in step (c) is a method for producing collagen, characterized in that pepsin.
상기 단계 (h)의 강산은 염산(HCl)인 것을 특징으로 하는, 콜라겐의 제조방법.The method of claim 1,
The method for producing collagen, characterized in that the strong acid in step (h) is hydrochloric acid (HCl).
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