JP2006320220A - Dna sequence used for production of protein a fusion polypeptide, recombinant expression vector, transformant, and method for producing the fusion polypeptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用して、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインもしくはその部分的配列と、所望するポリペプチドとの融合ポリペプチドを製造する際に利用するＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法に関する。本発明のＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、または形質転換体を用いることにより、ブレビバチルス属細菌を使用して、産業上有用なポリペプチドを効率良く製造する事が可能である。 The present invention relates to a DNA sequence and recombinant expression vector for use in producing a fusion polypeptide of an immunoglobulin-binding domain of protein A or a partial sequence thereof and a desired polypeptide using Brevibacillus bacteria. , A transformant, and a method for producing a fusion polypeptide thereof. By using the DNA sequence, recombinant expression vector, or transformant of the present invention, it is possible to efficiently produce industrially useful polypeptides using Brevibacillus bacteria.
近年の遺伝子組換え技術の進歩により、各種の生物起源から得られたＤＮＡを発現ベクターに連結し、適当な宿主細胞に導入することで、当該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを生産出来るようになった。この遺伝子組換え技術の有効性から、現在までに様々な微生物を宿主とする数多くの宿主ベクター系が開発され、特に大腸菌および酵母を利用した系が確立されている（非特許文献１）。 Due to recent advances in gene recombination technology, it is now possible to produce polypeptides encoded by DNA by ligating DNA obtained from various biological sources to expression vectors and introducing them into appropriate host cells. It was. Due to the effectiveness of this gene recombination technique, a number of host vector systems using various microorganisms as hosts have been developed so far, and in particular, a system using E. coli and yeast has been established (Non-patent Document 1).
近年、鵜高らにより開発されたブレビバチルス・ブレビスを用いた遺伝子組換えポリペプチドの発現系は、ヒト上皮細胞増殖因子を、その生理活性を保持した状態で培養液中に大量に分泌発現できることが知られている（非特許文献１、２）。このブレビバチルス属細菌を用いたポリペプチド発現系は、宿主菌由来の細胞壁蛋白質であるＭＷＰのプロモーター、シャイン・ダルガノ配列および、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターに、成熟型ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結し発現させることで、様々なポリペプチドの直接分泌発現を可能とする（非特許文献２）。 In recent years, the expression system for recombinant polypeptides using Brevibacillus brevis, developed by Takataka et al., Is capable of secreting and expressing human epidermal growth factor in a large amount in the culture medium while maintaining its physiological activity. Is known (Non-Patent Documents 1 and 2). This polypeptide expression system using Brevibacillus genus bacteria comprises a mature polypeptide in an expression vector containing a DNA sequence encoding a promoter, Shine-Dalgarno sequence, and a signal sequence of a host cell-derived cell wall protein. By linking and expressing the encoded DNA sequence, direct secretion expression of various polypeptides is possible (Non-patent Document 2).
しかし、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系は、汎用なポリペプチド生産系として確立されてはいない。なぜならば、ブレビバチルス属細菌によるポリペプチドの分泌発現は、その所望するポリペプチドの性質や特性により発現量が大きく左右されるからである。すなわち原核生物由来で、ジスルフィド結合が存在しない、または少ないポリペプチドは比較的高い生産性が期待できるが、真核生物の分泌ポリペプチドのように複雑な高次構造を有するポリペプチドの分泌発現では、ヒト上皮細胞増殖因子やマグロ成長ホルモンなど一部の例外を除き、生産性が極めて低い（非特許文献２）。複雑な高次構造を有するポリペプチドに対する発現障害は、大腸菌や酵母などの他の微生物を宿主とした場合にも度々認められ、現在、発現障害を改善するために様々な方法が提案されている。 However, the polypeptide secretion expression system of Brevibacillus bacteria has not been established as a general-purpose polypeptide production system. This is because the secretory expression of a polypeptide by a bacterium belonging to the genus Brevibacillus depends greatly on the expression level depending on the properties and characteristics of the desired polypeptide. That is, a prokaryotic-derived polypeptide with no or few disulfide bonds can be expected to have relatively high productivity, but in the secretory expression of a polypeptide having a complex higher-order structure like a eukaryotic secreted polypeptide. Except for some exceptions such as human epidermal growth factor and tuna growth hormone, productivity is extremely low (Non-patent Document 2). Expression disorders for polypeptides with complex higher-order structures are frequently observed when other microorganisms such as E. coli and yeast are used as hosts, and various methods have been proposed to improve the expression disorders. .
効果的な方法として、所望するポリペプチドを融合ポリペプチドの形態で生産する方法（融合発現法）が提案されている。例えば、大腸菌の場合、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、分子シャペロン（ＤＮＡＪ，ＤＮＡＫ）、またはヒスチジンタグ（６から１０残基程度のヒスチジン残基）等を、所望のポリペプチドのＮ末端、またはＣ末端へ結合させることにより、発現量を向上させる方法が開発されている（非特許文献１）。 As an effective method, a method of producing a desired polypeptide in the form of a fusion polypeptide (fusion expression method) has been proposed. For example, in the case of E. coli, calmodulin binding peptide (CBP), glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), cellulose binding domain (CBD), molecular chaperone (DNAJ, DNAK), or histidine tag (6-10) A method for improving the expression level has been developed by binding a histidine residue of about a residue) to the N-terminus or C-terminus of a desired polypeptide (Non-patent Document 1).
また、プロテインＡが有する親和性を精製工程で利用し、所望のポリペプチドの分離、精製を容易にする方法も開発されている(特許文献１)。具体的には、免疫グロブリンに対する親和性を有するプロテインＡとの融合生成物として、所望のポリペプチドを大腸菌またはスタフィロコッカス属細菌等の微生物宿主において発現させ、その融合生成物の精製工程において、プロテインＡが有する親和性を利用して所望のポリペプチドを分離、精製する。 In addition, a method has been developed that utilizes the affinity of protein A in the purification step to facilitate separation and purification of a desired polypeptide (Patent Document 1). Specifically, as a fusion product with protein A having affinity for immunoglobulin, a desired polypeptide is expressed in a microbial host such as Escherichia coli or Staphylococcus bacteria, and in the purification step of the fusion product, A desired polypeptide is separated and purified using the affinity of protein A.
ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、所望のポリペプチドの生産性を向上させる方法として、（１）融合領域として数アミノ酸残基を用い、耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる方法（特許文献２）、（２）ブレビバチルス・ブレビス４７株由来の細胞壁蛋白質のＮ末端から数十アミノ酸残基を融合領域として用い、ヒト成長ホルモンまたはヒトプロインシュリンを融合発現させる方法（特許文献３、４）、（３）カビ由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を融合領域として用い、抗体Ｌ鎖を融合発現させる方法（特許文献５）が知られている。
一般的に、融合ポリペプチドの発現量は、所望のポリペプチドの構造やアミノ酸配列と融合領域との相性に大きく左右され、選択した融合領域が適当でない場合、融合ポリペプチドの大量発現に結びつかないことが知られている。また、上記（１）から（３）で開示された融合領域では、それらが有する親和性を精製工程に利用することができず、所望の融合生成物の分離、精製を簡略化することができない。従って、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系においても、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の開発が望まれていた。 In general, the expression level of the fusion polypeptide depends greatly on the structure of the desired polypeptide and the affinity between the amino acid sequence and the fusion region, and if the selected fusion region is not suitable, it does not lead to mass expression of the fusion polypeptide. It is known. Further, in the fusion regions disclosed in (1) to (3) above, the affinity possessed by them cannot be used in the purification step, and the separation and purification of the desired fusion product cannot be simplified. . Therefore, development of a fusion peptide region that can be applied to the fusion expression of various polypeptides in the Brevibacillus genus polypeptide secretion expression system and that can simplify the separation and purification of the fusion product is desired. It was.
本発明は、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系において、多様なポリペプチドの融合発現に適用でき、かつ、融合生成物の分離、精製の簡略化が可能な、融合ペプチド領域の提供を一つの課題とする。さらに、当該融合ペプチド領域を利用した、ブレビバチルス属細菌による有用ポリペプチドの製造方法の提供を一つの課題とする。 The present invention provides a fusion peptide region that can be applied to the fusion expression of various polypeptides in a Brevibacillus bacterium polypeptide secretion expression system and that can simplify the separation and purification of the fusion product. Let's take one issue. Furthermore, it is an object to provide a method for producing a useful polypeptide using a Brevibacillus bacterium using the fusion peptide region.
本発明者らは、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、所望のポリペプチドを連結した融合生成物を、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させることにより、上記課題が解決されることを見いだした。本発明は、以下の内容を含む１または複数の特徴を有する。 The present inventors have solved the above problem by secreting and expressing a fusion product in which a desired polypeptide is linked to the C-terminal side of an immunoglobulin binding domain of protein A or a partial sequence thereof in Brevibacillus bacteria. I found it solved. The present invention has one or more features including the following contents.
本発明は、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、さらに、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列と作動可能に連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列に関する。 また、本発明は、当該ＤＮＡ配列を含むベクター、および、当該ベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換して得られる形質転換体に関する。さらに、本発明は、当該形質転換体を培養し、培地中に分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。 The present invention comprises a signal peptide capable of functioning in a bacterium belonging to the genus Brevibacillus, a protein A immunoglobulin binding domain or a partial sequence thereof, a linker comprising an arbitrary amino acid sequence, and a desired polypeptide linked in this order. The present invention further relates to a DNA sequence characterized in that the DNA sequence encoding the fusion polypeptide is operably linked to a promoter that can function in Brevibacillus bacteria and a Shine-Dalgarno sequence. The present invention also relates to a vector containing the DNA sequence and a transformant obtained by transforming Brevibacillus bacteria using the vector. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a polypeptide, which comprises culturing the transformant and recovering a polypeptide containing a part or all of a desired polypeptide secreted into the medium.
本発明により、従来、ブレビバチルス属細菌のポリペプチド分泌発現系では著しく発現効率が低かったポリペプチドを、融合ポリペプチドとして大量に培養液中へ分泌発現させることが可能となった。さらに、抗体（免疫グロブリンＧ）などを固定化した担体を用いることにより、所望のポリペプチドを含む当該融合ポリペプチドを、培養液から簡便に分離精製することが可能となった。 According to the present invention, it has become possible to secrete and express a polypeptide that has been remarkably low in expression efficiency in the Brevibacillus genus bacterial secretion system into a culture solution in a large amount as a fusion polypeptide. Furthermore, by using a carrier on which an antibody (immunoglobulin G) or the like is immobilized, the fusion polypeptide containing the desired polypeptide can be easily separated and purified from the culture solution.
以下に本発明の実施形態について詳しく説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
１．ＤＮＡ配列およびポリペプチド
本発明の第一の実施形態は、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列のＣ末端側に、０または１以上のアミノ酸配列を介して所望のポリペプチドを連結した融合ポリペプチドを、ブレビバチルス属細菌で分泌発現させる機能を有するＤＮＡ配列である。詳細には、本発明の実施形態としてのＤＮＡ配列は、（ａ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター、（ｂ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャイン・ダルガノ配列、（ｃ）ブレビバチルス属細菌で機能しうるシグナルペプチド、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、および、所望のポリペプチドを、この順序で連結してなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、の３つの構成要素からなり、かつ、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を互いに作動可能となるよう連結せしめたことを特徴とするＤＮＡ配列である。
1. DNA Sequence and Polypeptide In the first embodiment of the present invention, the desired polypeptide is linked to the C-terminal side of the immunoglobulin A binding domain of protein A or a partial sequence thereof via 0 or one or more amino acid sequences. It is a DNA sequence having a function of secreting and expressing a fusion polypeptide in Brevibacillus bacteria. Specifically, the DNA sequence as an embodiment of the present invention includes (a) a promoter that can function in a bacterium belonging to the genus Brevibacillus, (b) a Shine-Dalgarno sequence that can function in a bacterium belonging to the genus Brevibacillus, and (c) a genus Brevibacillus. It encodes a fusion polypeptide comprising a signal peptide that can function in bacteria, an immunoglobulin-binding domain of protein A or a partial sequence thereof, a linker comprising any amino acid sequence, and a desired polypeptide linked in this order. A DNA sequence comprising the three constituents of a DNA sequence, wherein the constituents (a) to (c) are linked so as to be operable with each other.
ここで、本発明における「作動可能となるよう連結せしめる」との記載は、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素がブレビバチルス属細菌内で機能することにより、所望のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが分泌発現するよう、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素を必要に応じて適当なＤＮＡを介して（またはＤＮＡを介さず）連結せしめることを意味する。本発明における「作動可能となるよう連結」する概念には、前記（ａ）から（ｃ）の構成要素に加えて、エンハンサー等を含む各種の調節エレメントまたは制御因子を連結する場合も含まれる。それら調節エレメントまたは制御因子の種類は、宿主によって変わり得ることは当業者に周知の事項である。 Here, in the present invention, the description “to be operatively linked” means that the components (a) to (c) function in the bacterium belonging to the genus Brevibacillus, and thus include a desired polypeptide. This means that the components (a) to (c) are linked via appropriate DNA (or not via DNA) as necessary so that the polypeptide is secreted and expressed. The concept of “connecting to be operable” in the present invention includes a case of connecting various regulatory elements or control factors including enhancers in addition to the components (a) to (c). It is well known to those skilled in the art that the types of these regulatory elements or control factors can vary depending on the host.
本発明において用いられる「プロモーター」は、ブレビバチルス属細菌において作動可能であるプロモーターであればいかなる生物由来のプロモーターでもよい。好ましくはブレビバチルス属細菌由来のプロモーターが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビス又はブレビバチルス・チョウシネンシス由来の細胞壁蛋白質のプロモーターが良く、更に好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のプロモーターが良い。 The “promoter” used in the present invention may be a promoter derived from any organism as long as it is operable in Brevibacillus bacteria. A promoter derived from a bacterium belonging to the genus Brevibacillus is preferable, more preferably a promoter of a cell wall protein derived from Brevibacillus brevis or Brevibacillus choshinensis, and even more preferably a middle wall protein that is a cell wall protein of Brevibacillus brevis ( MWP), outer wall protein (OWP), or Brevibacillus choshinensis cell wall protein HWP (J. Bacteriol. 172: 1312-1320 (1990)) is preferred.
本発明において用いられる「シャイン・ダルガノ配列」は、ブレビバチルス属細菌において機能する塩基配列であればいかなる原核生物種に由来するものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシャイン・ダルガノ配列が良く、さらに好ましくはブレビバチルス・ブレビスまたはブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質をコードしているＤＮＡの上流に存在するシャイン・ダルガノ配列が良い。更により好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）、ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、又はブレビバチルス・チョウシネンシス細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））をコードする蛋白質のシャイン・ダルガノ配列が良い。ここでいうシャイン・ダルガノ配列とは、原核生物のｍＲＮＡにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列であり、プリン塩基に富んだ約３から９塩基の配列である。 The “Schein-Dalgarno sequence” used in the present invention may be derived from any prokaryotic species as long as it is a base sequence that functions in Brevibacillus bacteria. The Shine-Dalgarno sequence of Brevibacillus spp. Is preferred, and the Shine-Dalgarno sequence existing upstream of the DNA encoding the cell wall protein of Brevibacillus brevis or Brevibacillus choshinensis is more preferred. Even more preferably, the cell wall protein of Brevibacillus brevis, middle wall protein (MWP), outer wall protein (OWP), or Brevibacillus choshinensis cell wall protein HWP (J. Bacteriol. 172: 1312-1220 (1990)) The Shine-Dalgarno sequence of the protein encoding is good. The Shine-Dalgarno sequence here is a common sequence found upstream of the start codon in prokaryotic mRNA, and is a sequence of about 3 to 9 bases rich in purine bases.
本発明において用いられる「シグナルペプチド」は、ブレビバチルス属細菌内で発現させた際、そのＣ末端側に連結されたポリペプチドを細胞外に分泌させる機能を有するペプチドであればいかなる生物種由来のものでも良い。好ましくはブレビバチルス属細菌のシグナルペプチドが良く、より好ましくはブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質であるｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）またはｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＯＷＰ）、さらにブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁蛋白質（ＨＷＰ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１３１２−１３２０（１９９０））のシグナルペプチドが良い。また天然の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良した配列でも良い。具体的には、前記ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＷＰ）のシグナルペプチドＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａに、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ｘ）−Ａｒｇ（ｘ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ｌｅｕ（ｘ）−Ａｌａ（ｘ）−Ｓｅｒ（ｘ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、中の（ｘ）部分で示すアミノ酸配列のように塩基性や疎水性アミノ酸残基を付加したシグナルペプチドを用いても良い。さらに、本発明において使用するプロテインＡが本来有するシグナルペプチド配列を使用しても良い。 The “signal peptide” used in the present invention is a peptide derived from any species as long as it is a peptide having a function of secreting a polypeptide linked to the C-terminal side outside the cell when expressed in bacteria of the genus Brevibacillus. Things can be used. Preferably, the signal peptide of the genus Brevibacillus is better, more preferably the cell wall protein of Brevibacillus brevis (mWP) or outer wall protein (OWP), and the cell wall protein (HWP) of Brevibacillus choshinensis (J. Bacteriol. 172: 1312-1320 (1990)) is preferred. Further, it may be a sequence obtained by improving the amino acid sequence of a natural secretory signal peptide. Specifically, the signal peptide Met-Lys-Lys-Val-Val-Asn-Ser-Val-Leu-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala of the middle wall protein (MWP) -Pro-Met-Ala-Phe-Ala to Met-Lys-Lys-Arg (x) -Arg (x) -Val-Val-Asn-Asn-Ser-Val-Leu-Leu-Leu (x) -Leu (x ) -Leu (x) -Leu (x) -Leu (x) -Ala (x) -Ser (x) -Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Pro-Met-Ala-Phe-Ala Use a signal peptide with basic or hydrophobic amino acid residues added like the amino acid sequence shown in the (x) part And it may be. Furthermore, you may use the signal peptide sequence which protein A used in this invention originally has.
本発明において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、好ましくはスタフィロコッカス属細菌由来のプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインであり、より好ましくは、図１（配列表の配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） ＣＯＷＡＮＩ株
由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインである。しかし、本明細書において用いられる「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」なる用語は上記に限定されず、スタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインと、それらドメインのいずれかと類似の構造および機能を有する分子すべてを包含する。具体的には、図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮ１株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列に、１アミノ酸以上の置換、欠失、または挿入を施して得られ、かつ、本発明のＤＮＡ配列の構成要素の１つである融合領域として用いた場合に、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する変異体は、本明細書において用いられる用語「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」に包含される。このような変異体は、図１（配列番号１、２）にて示されるアミノ酸配列および塩基配列情報を基に、当業者であれば容易に作製、もしくは自然界より探索することができる。
The “protein A immunoglobulin binding domain” used in the present invention is preferably an immunoglobulin binding domain of protein A derived from Staphylococcus bacteria, and more preferably, FIG. ) Is an E, D, A, B, or C domain of protein A from Staphylococcus aureus COWANI strain. However, the term “protein A immunoglobulin-binding domain” as used herein is not limited to the above, and the E, D, A, B, or C domains of protein A from Staphylococcus aureus COWANI strain and , Including all molecules having a structure and function similar to any of those domains. Specifically, the amino acid sequence of the E, D, A, B, or C domain of protein A derived from Staphylococcus aureus COWAN1 strain shown in FIG. Secreted expression level of desired polypeptide in Brevibacillus genus when used as a fusion region obtained by substitution, deletion, or insertion and being one of the components of the DNA sequence of the present invention Variants having the function of improving the function are encompassed by the term “protein A immunoglobulin binding domain” as used herein. Such mutants can be easily prepared or searched from the natural world by those skilled in the art based on the amino acid sequence and base sequence information shown in FIG.
また、本発明において融合領域として使用される「プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメイン」は、ブレビバチルス属細菌内で所望のポリペプチドの分泌発現量を向上させる機能を有する限り、その個数および順列において何ら制限されるものでない。図１（配列番号１、２）にて示されるスタフィロコッカス・アウレウス ＣＯＷＡＮＩ株由来のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインを例として説明すると、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣの任意の１ドメインを使用しても良いし、任意の２ドメインの順列として得られる２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、任意の３ドメインの順列として得られる１２５通りの配列のうちの１つを使用しても良いし、同様に４以上のドメインの順列として得られる配列のうちの１つを使用しても良い。好ましくは、Ｅドメイン（図２、３参照）、Ｅ、Ｄドメインをこの順で連結したもの（図４、５参照）、および、Ｅ、Ｄ、Ａドメインをこの順で連結したもの（図６、７参照）が良い。 The “protein A immunoglobulin binding domain” used as a fusion region in the present invention is not limited in number or permutation as long as it has a function of improving the secreted expression level of a desired polypeptide in Brevibacillus bacteria. It is not limited. The E, D, A, B, or C domain of protein A derived from the Staphylococcus aureus COWANI strain shown in FIG. Alternatively, any one domain of C may be used, one of 25 sequences obtained as a permutation of any two domains, or a permutation of any three domains One of 125 sequences may be used, and one of sequences obtained as a permutation of four or more domains may be used. Preferably, the E domain (see FIGS. 2 and 3), the E and D domains connected in this order (see FIGS. 4 and 5), and the E, D and A domains connected in this order (FIG. 6). 7).
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」とは、０または１以上のアミノ酸配列からなるペプチドを意味し、本発明のＤＮＡ配列がコードする融合ポリペプチド中に、当該リンカーが実質的に含まれないことをも意味する。当該リンカーを構成するアミノ酸配列に特に制限はないが、当該リンカー中に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を配置することにより、融合生成物から所望のポリペプチドを切り離す工程を容易にすることができる。 The term “linker comprising an arbitrary amino acid sequence” used in the present invention means a peptide comprising zero or one or more amino acid sequences, and the linker is substantially contained in the fusion polypeptide encoded by the DNA sequence of the present invention. It also means that it is not included. The amino acid sequence constituting the linker is not particularly limited, but by placing an amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage in the linker, the step of separating the desired polypeptide from the fusion product can be facilitated. Can do.
本発明において用いられる「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」とは、化学的もしくは酵素的にポリペプチドを切断する際、切断箇所として特異的に認識されるアミノ酸配列を指す。化学的なポリペプチド切断法としては、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または蟻酸を使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｍｅｔ］、［Ａｓｎ−Ｇｌｙ、−Ｌｅｕ、またはＡｌａ］、［Ａｓｐ−Ｐｒｏ］を配置するのが好ましい。酵素的なポリペプチド切断方法としては、例えば、コラゲナーゼ、キモシン、カリクレインＢ、エンテロキナーゼ、トロンビン、ファクターＸａ、またはＴＥＶペプチダーゼを使用する方法が挙げられ、これらの方法を用いる場合、特異的に認識されるアミノ酸配列として、それぞれ、［Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸残基）］、［Ｍｅｔ−Ｐｈｅ］、［Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ（Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸残基）］、［（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ（ｎ＝２−４）］、［Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］、［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］、［Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、またはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］を配置するのが好ましい。 The “amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage” used in the present invention refers to an amino acid sequence that is specifically recognized as a cleavage site when a polypeptide is chemically or enzymatically cleaved. Chemical polypeptide cleavage methods include methods using cyanogen bromide, hydroxylamine, or formic acid, and when these methods are used, the specifically recognized amino acid sequences are [Met], [Asn-Gly, -Leu, or Ala], [Asp-Pro] are preferably arranged. Enzymatic polypeptide cleavage methods include, for example, methods using collagenase, chymosin, kallikrein B, enterokinase, thrombin, factor Xa, or TEV peptidase, which are specifically recognized when using these methods. [Pro-X-Gly-Pro (X is an arbitrary amino acid residue)], [Met-Phe], [X-Phe-Arg-Y (X and Y are arbitrary amino acid residues), respectively. )], [(Asp) n-Lys (n = 2-4)], [Leu-Val-Gln-Arg-Gly-Ser], [Ile-Glu-Gly-Arg], [Glu-Asn-Leu- Tyr-Phe-Gln-Gly or Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser] is preferably arranged.
また、所望するポリペプチド自体の切断が問題とならなければ、より特異性の低いペプチダーゼ等を使用しても良い。具体的には、真核生物または原核生物由来のセリンペプチダーゼやシグナルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、カルボキシルペプチダーゼ、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システインペプチダーゼ、グルタミン酸ペプチダーゼ、金属ペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼのファミリーに属するペプチダーゼ群が利用できる。さらに、上記ペプチダーゼのアミノ酸配列を置換、欠失、付加、または変異導入することで基質特異性を改変させたペプチダーゼを利用することも可能である。 Moreover, a peptidase with lower specificity or the like may be used if cleavage of the desired polypeptide itself does not matter. Specifically, peptidases belonging to the family of eukaryotic or prokaryotic serine peptidases, signal peptidases, endopeptidases, carboxyl peptidases, aspartate peptidases, cysteine peptidases, glutamate peptidases, metal peptidases, and threonine peptidases can be used. Furthermore, it is also possible to use a peptidase whose substrate specificity is altered by substitution, deletion, addition, or mutation introduction of the amino acid sequence of the peptidase.
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、分離精製用のタグとして使用され得るアミノ酸配列を配置することもできる。「分離精製用のタグ」とは、ポリペプチドの精製を容易にするために付加される、特定物質に対する親和性を有するペプチドを意味し、その具体例としては、ニッケルメタルに対し親和性を有するヒスチジンが複数連結した構造のもの、またはアミロースに対し親和性を有するマルトース結合ポリペプチド等が挙げられる。本発明では前者が好適に用いられ、より好適には６個のヒスチジンの連続配列が用いられる。 In the “linker consisting of an arbitrary amino acid sequence” used in the present invention, an amino acid sequence that can be used as a tag for separation and purification can also be arranged. “Separation / purification tag” means a peptide having an affinity for a specific substance, which is added to facilitate the purification of the polypeptide. As an example, the tag has an affinity for nickel metal. Examples include a structure in which a plurality of histidines are linked, or a maltose-binding polypeptide having affinity for amylose. In the present invention, the former is preferably used, and more preferably a continuous arrangement of 6 histidines is used.
本発明において用いられる「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」中には、前記「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」、または前記「分離精製用のタグ」のいずれか１つを配置してもよいし、両者を任意の順序で同時に配置してもよい。ただし、所望のポリペプチドから不要な融合領域を極力切除したい場合は、前記「任意のアミノ酸配列からなるリンカー」の最もＣ末端側に「部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列」を配置することが好ましい。 In the “linker consisting of an arbitrary amino acid sequence” used in the present invention, either one of the “amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage” or the “tag for separation and purification” is arranged. Alternatively, both may be simultaneously arranged in an arbitrary order. However, when it is desired to excise unnecessary fusion regions from the desired polypeptide as much as possible, the “amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage” is arranged on the most C-terminal side of the “linker comprising any amino acid sequence”. Is preferred.
本発明における「所望のポリペプチド」としては、例えば、各種の酵素類、ヒト成長ホルモン等のホルモン類、各種の血漿蛋白質類、各種のサイトカイン類、免疫グロブリンＧのＬ鎖、Ｆｄ鎖等の部分抗体、一本鎖抗体等の修飾抗体などが挙げられる。 Examples of the “desired polypeptide” in the present invention include various enzymes, hormones such as human growth hormone, various plasma proteins, various cytokines, immunoglobulin G L chain, Fd chain and the like. Examples thereof include modified antibodies such as antibodies and single chain antibodies.
２．ベクター
本発明の第二の実施形態は、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含むベクターである。本発明の第二の実施形態において用いられるベクターは、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能であればいかなるものでも良いが、好ましくは、ｐＨＹ５００（特開平２‐３１６８２号公報）、ｐＮＵ２００（日本農芸化学会誌６１，６６９‐６７６（１９８７））、ｐＮＨ３２６（図８参照）（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８：５２５−５３１．（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７７：７４５−７４９（１９９５））、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミド（特許第２７２７３９１号）、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２‐２３８５６９号公報）、またはこれらいずれかの誘導体が良い。ただし、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を、ブレビバチルス属細菌の染色体へ組込むことを目的とするベクターの場合、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能である必要はなく、このようなベクターも、本発明の第一の実施形態であるＤＮＡ配列を含む限り、本発明に包含される。
2. Vector A second embodiment of the present invention is a vector comprising the DNA sequence of the first embodiment of the present invention. The vector used in the second embodiment of the present invention may be any vector as long as it is capable of autonomous replication in Brevibacillus bacteria, but preferably, pHY500 (JP-A-2-31682), pNU200 (Nippon Agricultural Chemistry) (Journal 61,669-676 (1987)), pNH326 (see FIG. 8) (Applied and Environmental Microbiology, 58: 525-531. (1992)), pNH400 (J. Bacteriol, 177: 745-749 (1995)), pNY700 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-278091), pHT plasmid (Patent No. 2727391), pNCO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238695), which is a shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus bacteria, or this Any derivative is good. However, in the case of a vector intended to integrate the DNA sequence according to the first embodiment of the present invention into the chromosome of Brevibacillus genus, it is not necessary to be able to autonomously replicate in Brevibacillus bacterium. Vectors are also encompassed by the present invention as long as they contain the DNA sequence that is the first embodiment of the present invention.
３．形質転換体
本発明の第三の実施形態は、本発明の第二の実施形態であるベクターを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体である。本発明の第三の実施形態において用いられるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォーモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・インボカツス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・リムノフィルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、またはブレビバチルス・サーモルベル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）等が挙げられる。ブレビバチルス・ブレビス、またはブレビバチルス・チョウシネンシスが好ましく、ブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株がより好ましい。また生産量の向上などの目的に応じて上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高分泌発現株のような変異株を使用しても良い。
3. Transformant The third embodiment of the present invention is a transformant obtained by transforming Brevibacillus bacteria using the vector according to the second embodiment of the present invention. Examples of bacteria belonging to the genus Brevibacillus used in the third embodiment of the present invention include Brevibacillus agri, Brevibacillus borsterensis, Brevibacillus brevis, Brevibacillus centrosporus spirus roc ), Brevibacillus chorusensis, Brevibacillus formosus, Brevibacillus invocatus, Brevibacillus reversispirus brebrecils, s limnophilus), Brevibacillus Paraburebisu (Brevibacillus parabrevis), Brevibacillus Reusuzeri (Brevibacillus reuszeri), or Brevibacillus Samoruberu (Brevibacillus thermoruber), and the like. Brevibacillus brevis or Brevibacillus choshinensis is preferred, Brevibacillus brevis 47 strain, Brevibacillus brevis 47K strain, Brevibacillus brevis 47-5Q strain, Brevibacillus choshinensis HPD31 strain, or Brevibacillus butterfly The Sinensis HPD31-OK strain is more preferred. In addition, mutant strains such as protease-deficient strains and high-secretory expression strains of the above-mentioned Brevibacillus bacteria may be used depending on the purpose such as improvement of the production amount.
ブレビバチルス属細菌の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５６：１１３０−１１３４（１９８３））、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ５３：３０９９−３１００（１９８９））、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：２０２−２０３（１９９７））により実施することができる。 Brevibacillus bacteria can be transformed, for example, by the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol. 156: 1130-1134 (1983)) or the method of Takagi et al. (Agric. Biol. Chem, 53: 3099-3100 (1989)). Or by the method of Okamoto et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 202-203 (1997)).
４．ポリペプチド製造方法
本発明の第四の実施形態は、本発明の第三の実施形態である形質転換体を培養し、当該形質転換体から分泌される所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドを回収することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法である。
4). Polypeptide Production Method In the fourth embodiment of the present invention, the transformant according to the third embodiment of the present invention is cultured, and a part or all of the desired polypeptide secreted from the transformant is contained. A method for producing a polypeptide, comprising collecting the polypeptide.
当該形質転換体の培養に用いる培地は、当該形質転換体が所望のポリペプチドを効率良く分泌発現できる培地であれば特に制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロールなどの炭素源や、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの窒素源を使用することができ、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン、亜鉛、鉄等の無機塩類が必要に応じて添加される。さらに、栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。培養温度は１５−４２℃、好ましくは約２８−３７℃であり、通気および攪拌により好気的に培養を行うことが望ましいが、もし必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。 The medium used for culturing the transformant is not particularly limited as long as the transformant can efficiently secrete and express the desired polypeptide. Specifically, carbon sources such as glucose, sucrose, and glycerol, and nitrogen sources such as polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used. Potassium salt, sodium salt, phosphate salt, magnesium salt, manganese Inorganic salts such as zinc and iron are added as necessary. Furthermore, when an auxotrophic host cell is used, a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol and neomycin may be added. The culture temperature is 15-42 ° C., preferably about 28-37 ° C., and it is desirable to perform aerobic culture by aeration and agitation. Good.
当該形質転換体から分泌された、所望のポリペプチドの一部または全部を含むポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、当該形質転換体の培養液から回収、精製することができる。例えば、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー等の手法を利用できる。 A polypeptide secreted from the transformant and containing a part or all of the desired polypeptide is recovered and purified from the culture medium of the transformant by appropriately combining commonly known protein purification methods. can do. For example, methods such as salting out, dialysis, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, or affinity chromatography can be used.
特に、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、その分子内にプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインまたはその部分的配列を有しているため、適当な担体に固定化された免疫グロブリンＧ、例えば免疫グロブリンＧセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）等を用いることで、効率良く精製され得る。 In particular, the polypeptide secreted and expressed according to the fourth embodiment of the present invention has an immunoglobulin-binding domain of protein A or a partial sequence thereof in its molecule, and is thus immobilized on a suitable carrier. By using immunoglobulin G, for example, immunoglobulin G Sepharose (Amersham Bioscience), etc., it can be purified efficiently.
また、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に精製用タグを含みうる。この場合、当該箇所に配置した精製用タグを利用して、当該ポリペプチドを精製することも可能である。例えば、精製用タグとしてヒスチジンの連続配列を配置した場合、ニッケルＮＴＡカラム等を用いて精製することが可能である。 In addition, the polypeptide secreted and expressed according to the fourth embodiment of the present invention may include a purification tag in the linker moiety. In this case, it is possible to purify the polypeptide using a purification tag arranged at the location. For example, when a continuous sequence of histidine is arranged as a purification tag, it can be purified using a nickel NTA column or the like.
さらに、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドは、リンカー部分に部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列を含みうる。この場合、当該箇所に配置したアミノ酸配列に応じた方法により、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。例えば、部位特異的切断に利用し得るアミノ酸配列として［Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］を配置した場合、ファクターＸａを用いて、当該箇所よりＮ末端側のポリペプチドを所望のポリペプチドから切除することが可能である。このような切断反応は、本発明の第四の実施形態に従い分泌発現されたポリペプチドの精製工程中のいかなる段階で実施しても良い。切断反応後の所望のポリペプチドは、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、さらに精製することができる。 Furthermore, the polypeptide secreted and expressed according to the fourth embodiment of the present invention may contain an amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage in the linker moiety. In this case, it is possible to excise the polypeptide at the N-terminal side from the desired polypeptide from the desired polypeptide by a method corresponding to the amino acid sequence arranged at the relevant location. For example, when [Ile-Glu-Gly-Arg] is arranged as an amino acid sequence that can be used for site-specific cleavage, a factor Xa is used to excise a polypeptide on the N-terminal side from the desired polypeptide. It is possible. Such a cleavage reaction may be performed at any stage in the purification process of the polypeptide secreted and expressed according to the fourth embodiment of the present invention. The desired polypeptide after the cleavage reaction can be further purified by appropriately combining commonly known protein purification methods.
上記のような本発明の各実施形態を利用することで、これまでブレビバチルス属細菌では効率的に生産できなかったポリペプチドを、極めて効率良く生産することが可能となった。従って、本発明の実施形態は、産業上有用なポリペプチドを製造する上で、非常に有用である。 By using each embodiment of the present invention as described above, it has become possible to produce a polypeptide that could not be efficiently produced by Brevibacillus bacteria so far. Accordingly, embodiments of the present invention are very useful in producing industrially useful polypeptides.
以下に参考例、実施例、図面に基づいて本発明の実施例を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは云うまでもない。本発明に関連する技術分野の当業者は、本発明の説明の範囲内で以下の実施例の変形を認め実行することができる。したがって、そのような変形は、本発明の範囲内に入るものとみなされる。 Examples of the present invention will be specifically described below based on reference examples, examples, and drawings, but it goes without saying that these do not limit the scope of the present invention. Those skilled in the art to which the present invention pertains may recognize and implement variations of the following examples within the scope of the description of the invention. Accordingly, such variations are considered to fall within the scope of the present invention.
本発明の実施例の実行にあたり、発現ＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 （１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 刊（米国）。 （２） 村松正實 編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。
（実施例１）プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ配列の単離
スタフィロコッカス・アウレウス Ｃｏｗａｎ Ｉ株を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．２％、グルコース １％、魚肉エキス ０．５％、ｐＨ７．０）を用いて、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄を行った。菌体を再度トリス−塩酸緩衝液にて懸濁後１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出およびエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。公知のプロテインＡの塩基配列（配列番号１）に基づき、上記で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ −３’（配列番号１６）、５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１７）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号１８））を用い、ＰＣＲ法により、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡをそれぞれ増幅した。配列番号１５は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号１６は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１７は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号１８は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
In carrying out the examples of the present invention, the production and operation of the expressed DNA were carried out according to the following experimental documents unless otherwise specified. (1) "Molecular Cloning / A Laboratory Manual", 2nd edition (1989), published by Cold Spring Harbor Laboratory (USA). (2) Edited by Masaaki Muramatsu “Lab Manual Genetic Engineering”, 3rd edition (1996), published by Maruzen Co., Ltd.
Example 1 Isolation of DNA Sequence Encoding Protein A Immunoglobulin Binding Domain Staphylococcus aureus Cowan I strain was prepared from T2 liquid medium (polypeptone 1%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, Fish meat extract (0.5%, pH 7.0) was cultured with shaking overnight at 37 ° C. The bacterial cells were collected from the obtained culture broth by centrifugation and washed twice with Tris-HCl buffer (pH 8.0). The cells were suspended again in Tris-HCl buffer, lysed with 1% SDS, heated at 60 ° C. for 30 minutes, and then extracted with whole genome DNA by conventional methods such as phenol extraction and ethanol precipitation. Based on the known protein A base sequence (SEQ ID NO: 1), using the genomic DNA prepared above as a template, forward primer (5'-TTGCTCCCCATGGCTTTCGCTGCCGCAACACGATGGAAGCT-3 '(SEQ ID NO: 15)), and the following three reverse primers (5'-TTTTCTGCAGTTTTGGAGCTTTGAGAGTCATTAAGTTTTTGAGC-3 '(SEQ ID NO: 16) 5'-TTTTCTGCAGTTTCGGTGCTTGAGATTCGTTTATTTTTT-3' (SEQ ID NO: 17) , ED domain, or EDA domain code That DNA was amplified respectively. SEQ ID NO: 15 shows the forward primer designed for PCR amplification of the immunoglobulin G binding domain of protein A. SEQ ID NO: 16 shows the reverse primer designed for PCR amplification of immunoglobulin G binding domain E of protein A. SEQ ID NO: 17 shows a reverse primer designed for PCR amplification of protein G immunoglobulin G binding domain ED. SEQ ID NO: 18 shows a reverse primer designed for PCR amplification of protein G immunoglobulin G binding domain EDA.
また、同様に、Ｅドメイン、ＥＤドメイン、またはＥＤＡドメインをコードするＤＮＡの３’側に６残基のヒスチジンを付加して増幅する場合は、上記ゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’ （配列番号１５））と、以下の３種のリバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣ−３’ （配列番号１９）、 ５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２０）、または５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴ−３’ （配列番号２１））を用いた。配列番号１９は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２０は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。配列番号２１は、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインＥＤＡのＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。 Similarly, when 6-residue histidine is added to the 3 ′ side of DNA encoding the E domain, ED domain, or EDA domain for amplification, the genomic DNA is used as a template and a forward primer (5′− TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3 '(SEQ ID NO: 15)), the following three reverse primers (5'-TTTTCTGCAGGTGATGATGATGATGATGTTTTGGAGCTTGAGAGTCATTAAGTTTTTGAGC-3' (SEQ ID NO: 19), 5'-TTTTCTGCAGGTGATGATGATGATGATGTTTCGGTGCTTGAGATTCGTTTAATTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 20), or 5' TTTTCTGCAGGT ATGATGATGATGATGTTTCGGTGCTTGAGATTCATTTAACTTTTT-3 'was used (SEQ ID NO: 21)). SEQ ID NO: 19 shows a reverse primer designed for PCR amplification of immunoglobulin G binding domain E of protein A. SEQ ID NO: 20 shows a reverse primer designed for PCR amplification of protein G immunoglobulin G binding domain ED. SEQ ID NO: 21 shows a reverse primer designed for PCR amplification of protein G immunoglobulin G binding domain EDA.
得られたＤＮＡ断片は制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。一方、発現ベクターｐＮＨ３２６（図８）（配列番号２２、２３）もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
（実施例２）プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの構築
実施例１にて、制限酵素処理したＤＮＡ断片および発現ベクターｐＮＨ３２６をＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、各免疫グロブリン結合ドメインを有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２、配列番号３および４参照）、ｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３、配列番号５および６参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４、配列番号７および８参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤ（図５、配列番号９および１０参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６、配列番号１１および１２参照）、ｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７、配列番号１３および１４参照）を構築した。
（実施例３）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターの作成
プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するために、ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖（軽鎖）遺伝子（配列番号２４、２５）の発現を行った。ヒト・マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、米国特許５６９８１９５号記載の抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の遺伝子配列に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号２７）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号２７は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes NcoI and PstI, and then separated and recovered from an agarose gel. On the other hand, the expression vector pNH326 (FIG. 8) (SEQ ID NOs: 22 and 23) was similarly digested with restriction enzymes NcoI and PstI, purified and recovered, and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment.
(Example 2) Construction of protein A fusion polypeptide expression vector In Example 1, a DNA fragment treated with the restriction enzyme and the expression vector pNH326 were ligated using T4 DNA ligase, and a protein A fusion poly having each immunoglobulin binding domain. Peptide expression vectors pProA3E (see FIG. 2, SEQ ID NOs: 3 and 4), pProA4E (see FIG. 3, SEQ ID NOs: 5 and 6), pProA3ED (see FIG. 4, SEQ ID NOs: 7 and 8), pProA4ED (FIG. 5, SEQ ID NO: 9) And pProA3EDA (see FIG. 6, SEQ ID NOS: 11 and 12), pProA4EDA (see FIG. 7, SEQ ID NOS: 13 and 14) were constructed.
(Example 3) Preparation of protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain expression vector In order to evaluate the expression ability of protein A fusion polypeptide expression vector, the L chain (light chain) gene of human / mouse chimeric anti-human TNFα antibody Expression of (SEQ ID NO: 24, 25) was performed. The L chain gene of a human / mouse chimeric anti-human TNFα antibody is a pBluescript / anti-human TNFα antibody L chain prepared according to the gene sequence of the anti-human TNFα antibody L chain described in US Pat. No. 5,698,195, and two oligonucleotide primers It amplified by PCR method using 5'-AAAACTGCAAGATCGAAGGTCGGTGACATCTTGCTGAACTCAGTTCCCAGCC-3 '(sequence number 26) and 5'-TTTTAAATTCCTAACACTCTCCCCCTGTTTGAAGCTTTT-3' (sequence number 27). SEQ ID NO: 26 shows a forward primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody. SEQ ID NO: 27 shows a reverse primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody.
この増幅されたヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号２６における上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。この抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片とプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ（図９Ａ）（配列番号２８、２９）を構築した。
（実施例４）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターの作成
上記、抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ遺伝子を有するプロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターの発現能を評価するため発現ベクターの構築を行った。抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は上記の抗ＴＮＦα抗体Ｈ鎖の遺伝子配列（配列番号３０、３１）に従い作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡ −３’ （配列番号３２）と５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡ−３’（配列番号３３）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号３２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号３３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
A DNA sequence (SEQ ID NO: 26) encoding a peptide of Ile-Glu-Gly-Arg, which is a recognition cleavage site of factor Xa, at the 5 ′ end of the DNA encoding the L chain of the amplified human TNFα antibody In the underlined portion of ATCGAAGGTCGT). The light chain gene of this anti-human TNFα antibody was cleaved with restriction enzymes PstI and EcoRI. The protein A fusion polypeptide expression vector pProA4E (FIG. 3) was digested with restriction enzymes PstI and EcoRI present at the multicloning site, purified and recovered, and subjected to dephosphorylation treatment with alkaline phosphatase treatment. The above-mentioned DNA fragment subjected to restriction enzyme treatment and the protein A fusion polypeptide expression vector are ligated using T4 DNA ligase, and a protein A fusion anti-human TNFα antibody light chain expression vector pProA4E-L (FIG. 9A) (SEQ ID NO: 28, 29) was constructed.
(Example 4) Preparation of protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression vector An expression vector was constructed in order to evaluate the expression ability of the protein A fusion polypeptide expression vector having the Fd gene of the anti-human TNFα antibody. . The Fd chain gene of the anti-human TNFα antibody is a pBluescript / anti-human TNFα antibody H chain prepared according to the gene sequence of the above-mentioned anti-TNFα antibody H chain (SEQ ID NOs: 30, 31) as a template, and two oligonucleotide primers 5′- AAACTGCAG ATCGAAGGTCGT GAAGTGGAAACTTGAGGAGTCTGAGGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 32) and 5′-CCGGAATTCTCACGGTGGGGCATGTGTGAGTTTGTCACA-3 ′ (SEQ ID NO: 33) were used for amplification. SEQ ID NO: 32 shows a forward primer designed for PCR amplification of Fd chain gene of anti-TNFα antibody. SEQ ID NO: 33 shows a reverse primer designed for PCR amplification of Fd chain gene of anti-TNFα antibody.
この増幅された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖をコードしているＤＮＡの５’末端にはファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのペプチドをコードしているＤＮＡ配列（配列番号３２の上記下線部ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴの配列）を含むように設計されている。このヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩにより切断した。また上記プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ（図２）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ（図４）およびｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ（図６）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩを用い消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と各プロテインＡ融合ポリペプチド発現ベクターをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図９Ｂ、配列番号３４および３５参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図９Ｃ、配列番号３６および３７参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図９Ｄ、配列番号３８および３９参照）を構築した。
（実施例５）抗ヒトＴＮＦα抗体鎖のＬ鎖またはＦｄ鎖単独発現ベクターの作成
プロテインＡ融合型と従来からの目的とするポリペプチド単独で発現させる方法（融合型でない方法）とのポリペプチド発現能を比較検討するため、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖鎖単独発現ベクター、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターを構築した。抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４０）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号４１）とを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４０は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
At the 5 ′ end of the DNA encoding the amplified anti-human TNFα antibody Fd chain, a DNA sequence (SEQ ID NO: 32) encoding a peptide of Ile-Glu-Gly-Arg which is a factor Xa recognition cleavage site. Of the above underlined portion of ATCGAAGGTTCGT). The Fd chain gene of this human TNFα antibody was cleaved with restriction enzymes PstI and EcoRI. In addition, after digestion with restriction enzymes PstI and EcoRI present at the multiple cloning sites of the above protein A fusion polypeptide expression vectors pProA3E (FIG. 2), pProA3ED (FIG. 4) and pProA3EDA (FIG. 6), purification, recovery, and treatment with alkaline phosphatase Was subjected to dephosphorylation treatment. The above DNA fragment subjected to restriction enzyme treatment and each protein A fusion polypeptide expression vector were ligated using T4 DNA ligase, and a protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression vector pProA3E-Fd (FIG. 9B, SEQ ID NO: 34 and 35), pProA3ED-Fd (see FIG. 9C, SEQ ID NO: 36 and 37), pProA3EDA-Fd (see FIG. 9D, SEQ ID NO: 38 and 39).
(Example 5) Preparation of L-chain or Fd-chain single expression vector of anti-human TNFα antibody chain Polypeptide expression between protein A fusion type and conventional method of expressing polypeptide alone (non-fusion type method) In order to compare the performance, an anti-human TNFα antibody L chain single expression vector and an anti-human TNFα antibody Fd chain single expression vector were constructed. The L chain gene of the anti-human TNFα antibody is obtained by using the above-described pBluescript / anti-human TNFα antibody L chain as a template, and two oligonucleotide primers 5′-GCTCCCCATGGCTTTCGCTGACATCTCT-3CTGACTCAGTCTACTCTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT Was amplified by the PCR method. SEQ ID NO: 40 shows a forward primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody. SEQ ID NO: 41 shows a reverse primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody.
また抗ヒトＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子は、先述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ −３’ （配列番号４２）と５’− ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧ −３’（配列番号４３）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号４２は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４３は、抗ＴＮＦα抗体のＦｄ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。 In addition, the Fd chain gene of the anti-human TNFα antibody is obtained by using the above-described pBluescript / anti-human TNFα antibody H chain as a template, two oligonucleotide primers 5′-GCTCCCCATGGCTTTCGCTGAAGTGGAACTTGAGGAGGCTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 42) and 5′-AAACTGGTGTGTCGTCG (SEQ ID NO: 43) was used for amplification by PCR. SEQ ID NO: 42 shows a forward primer designed for PCR amplification of Fd chain gene of anti-TNFα antibody. SEQ ID NO: 43 shows a reverse primer designed for PCR amplification of Fd chain gene of anti-TNFα antibody.
Ｌ鎖およびＦｄ鎖をコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化した。発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩでそれぞれ消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理によりそれぞれ脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター、および、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌ（図１０Ａ、配列番号４４および４５）、ｐＮＨ３２６−Ｆｄ（図１０Ｂ、配列番号４６および４７）を構築した。 DNAs encoding the L chain and the Fd chain were digested with restriction enzymes NcoI and PstI, respectively. Similarly, pNH326 used as an expression vector was digested with restriction enzymes NcoI and PstI, respectively, purified and recovered, and then dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. The above-mentioned DNA fragment subjected to restriction enzyme treatment and the expression vector were ligated using T4 DNA ligase, and the anti-human TNFα antibody L chain expression vector and the anti-human TNFα antibody Fd chain expression vector pNH326-L (FIG. 10A, SEQ ID NO: 44 and 45), pNH326-Fd (FIG. 10B, SEQ ID NOs: 46 and 47) was constructed.
（実施例６）プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの作成
上記抗体以外のポリペプチドに対する本発明の効果を示すために、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを用いプロテインＡ融合発現試験を行った。ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，５９５６−５９６０ （１９８４））を鋳型とし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ−３’ （配列番号４８）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ−３’ （配列番号４９）を用いて、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ増幅した。配列番号４８は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号４９は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
(Example 6) Preparation of protein A fusion human growth hormone expression vector In order to show the effect of the present invention on polypeptides other than the above-mentioned antibodies, a protein A fusion expression test was performed using DNA encoding human growth hormone. Using plasmid pGH-L9 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 5956-5960 (1984)) having a DNA encoding human growth hormone as a template, two oligonucleotide primers 5′-AAAAACTGCAGATCGAAGGTCGTTTCCCAACTATTCCACTGAGT-3 ′ Using (SEQ ID NO: 48) and 5'-TCCCAAGCTTTTAGAAGCCCACACACCACCTCCACAGA-3 '(SEQ ID NO: 49), DNA encoding human growth hormone was amplified by the PCR method. SEQ ID NO: 48 shows a forward primer designed for PCR amplification of the gene encoding human growth hormone. SEQ ID NO: 49 shows a reverse primer designed for PCR amplification of a gene encoding human growth hormone.
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。また発現ベクターとなるｐＰｒｏＡ３Ｅも同様に制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のヒト成長ホルモンＤＮＡ断片とｐＰｒｏＡ３Ｅ発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ （図１１Ａ）（配列番号５０、５１）を構築した。 The amplified DNA encoding human growth hormone was digested with restriction enzymes PstI and HindIII. Similarly, pProA3E as an expression vector was digested with restriction enzymes PstI and HindIII, purified and recovered, and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. The above-mentioned human growth hormone DNA fragment subjected to restriction enzyme treatment and the pProA3E expression vector are ligated using T4DNA ligase to construct a protein A fusion human growth hormone expression vector pProA3E-hGH (FIG. 11A) (SEQ ID NOs: 50 and 51). did.
（実施例７）ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターの構築
本発明の有効性を示すため、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター、および、特許文献５、６で開示されたブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰを融合部分に用いたＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターを構築した。ヒト成長ホルモン単独発現ベクターを構築するため、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’− ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴ −３’ （配列番号５２）と５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡ −３’ （配列番号５３）を用い、先述のプラスミドｐＧＨ−Ｌ９を鋳型として、ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを増幅した。配列番号５２は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５３は、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
Example 7 Construction of Human Growth Hormone Single Expression Vector and MWP Fusion Human Growth Hormone Expression Vector In order to show the effectiveness of the present invention, human growth hormone single expression vector and Brevi disclosed in Patent Documents 5 and 6 An MWP-fused human growth hormone expression vector using the Bacillus brevis cell wall protein MWP as a fusion part was constructed. In order to construct a human growth hormone single expression vector, two oligonucleotide primers 5′-TTGCTCCCCATGGCTTTCGCTTTCCCAACTATTCCACTGAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 52) and 5′-TCCCAAGCTTTTAGAAGCCACACGACCCTTCAACAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 53) were used, and the above-mentioned plasmid p9 As a template, DNA encoding human growth hormone was amplified by PCR. SEQ ID NO: 52 shows a forward primer designed for PCR amplification of a gene encoding human growth hormone. SEQ ID NO: 53 shows a reverse primer designed for PCR amplification of a gene encoding human growth hormone.
増幅されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡは制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に発現ベクターとなるｐＮＨ３２６も同様に制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、精製回収し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。制限酵素処理を行った上記のＤＮＡ断片と発現ベクターはＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨ（図１１Ｂ）（配列番号５４、５５）を構築した。一方、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターとしては、特許文献５の実施例１および実施例４に記載の方法に従い、ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６ （図１１Ｃ）を構築した。 The amplified DNA encoding human growth hormone was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII. Similarly, pNH326 as an expression vector was similarly digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, purified and recovered, and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. The above-mentioned DNA fragment subjected to restriction enzyme treatment and the expression vector were ligated using T4 DNA ligase to construct a human growth hormone single expression vector pNH326-hGH (FIG. 11B) (SEQ ID NOs: 54 and 55). On the other hand, as an MWP fusion human growth hormone expression vector, MWP20-His6-Linker-Clavage1-hGH / pNH326 (FIG. 11C) was constructed according to the method described in Example 1 and Example 4 of Patent Document 5.
（実施例８）各発現ベクターを有する形質転換体の作成
実施例２から７で構築した、プロテインＡ融合発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤＡ、ｐＰｒｏＡ４Ｅ、ｐＮＨ３２６）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌ）、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｌ）、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−Ｆｄ）、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン単独発現ベクター（ｐＮＨ３２６−ｈＧＨ）、およびＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクター（ＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＨ３２６）を、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。
(Example 8) Preparation of transformant having each expression vector Protein A fusion expression vector (pProA3E, pProA3ED, pProA3EDA, pProA4E, pNH326) constructed in Examples 2 to 7, protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain Expression vector (pProA4E-L), protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression vector (pProA3E-Fd, pProA3ED-Fd, pPro3EDA-Fd), anti-human TNFα antibody L chain single expression vector (pNH326-L), anti-human TNFα antibody Fd chain single expression vector (pNH326-Fd), protein A fusion human growth hormone expression vector (pProA3E-hGH), human growth hormone single expression vector (pNH326-hGH), and MWP fusion human synthesis Hormone-expressing vector (MWP20-His6-Linker-Clavage1-hGH / pNH326), according to known methods, it was introduced into Brevibacillus choshinensis HPD31-OK strain respectively to obtain transformants.
（実施例９）抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖の分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体、およびそれらの対照となるベクターｐＮＨ３２６を有する形質転換体の各々を、６０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを添加した３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にて、３０℃で２日間振とう培養した。当該培養液から遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，３分間）により菌体を除去し、得られた培養上清各５μｌを定法に従い処理した後、１０−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。電気泳動後、当該ゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色し、ポリペプチドのバンドを検出した（図１２および、図１３Ａ、Ｂ、Ｃ）。
(Example 9) Secretion expression of L chain and Fd chain of anti-human TNFα antibody Transformant having protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain expression vector pProA4E-L obtained in Example 8, protein A fusion Transformants having anti-human TNFα antibody Fd chain expression vectors pProA3E-Fd, pProA3ED-Fd, and pPro3EDA-Fd, transformants having anti-human TNFα antibody L chain single expression vector pNH326-L, and anti-human TNFα antibody Fd chain Each of the transformant having the single expression vector pNH326-Fd and the transformant having the vector pNH326 serving as a control thereof were treated with 3YC medium (polypeptone S 3%, yeast extract 0.5%) supplemented with 60 mg / L neomycin. %, Glucose 3%, MgSO 4 .7H 2 O 0. (01%, CaCl2 · 7H2O 0.01%, MnSO4 · 4H2O 0.001%, FeSO4 · 7H2O 0.001%, ZnSO4 · 7H2O 0.0001% pH 7.0) and cultured at 30 ° C. for 2 days. . Bacteria were removed from the culture broth by centrifugation (10,000 rpm, 4 ° C., 3 minutes), and 5 μl of the obtained culture supernatant was treated according to a standard method, and then a 10-20% gradient polyacrylamide gel was used. The sample was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the gel was stained with CBB (Coomassie Brilliant Blue) R-250 to detect polypeptide bands (FIGS. 12 and 13A, B, C).
図１２は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したものであり、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。 FIG. 12 shows a comparison of expression levels of each protein A-fused anti-human TNFα antibody L chain expression strain obtained in Example 8 and an anti-human TNFα antibody L chain single expression strain by CBB staining. The thick arrow indicates the expressed protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain. Lane M shows molecular weight markers (214, 120, 92, 52, 35, 28 kDa). Lane 1 is obtained by electrophoresis of 5 μl of a culture solution from an anti-human TNFα antibody L chain single expression strain. Lanes 2 and 3 are culture solutions from a protein A (E domain) fusion anti-human TNFα antibody L chain expression strain. 5 μl was electrophoresed.
図１３は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られた各プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株と抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株との発現量の比較を示す。太い矢印は発現したプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖［（図１３Ａ） プロテインＡ（Ｅドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｂ） プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合Ｆｄ鎖、（図１３Ｃ） プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合Ｆｄ鎖］を示す。細い矢印は抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株から、発現された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の移動度を示す。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン２および３は、プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン４は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン５および６は、プロテインＡ（ＥＤドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン７は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現株からの培養液５μｌを泳動したもの、レーン８および９は、プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。 FIG. 13 shows a comparison of the expression levels of each protein A-fused anti-human TNFα antibody Fd chain expression strain obtained in Example 8 and the anti-human TNFα antibody Fd chain single expression strain by CBB staining. The thick arrow indicates the expressed protein A-fused anti-human TNFα antibody Fd chain [(FIG. 13A) Protein A (E domain) fused Fd chain, (FIG. 13B) Protein A (ED domain) fused Fd chain, (FIG. 13C) Protein A ( EDA domain) fusion Fd chain]. The thin arrow indicates the mobility of the anti-human TNFα antibody Fd chain expressed from the anti-human TNFα antibody Fd chain single expression strain. Lane M shows molecular weight markers (214, 120, 92, 52, 35, 28 kDa). Lane 1 shows the result of electrophoresis of 5 μl of the culture solution from the anti-human TNFα antibody Fd chain expression strain, and lanes 2 and 3 show 5 μl of the culture solution from the protein A (E domain) fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression strain. Lanes 4 and 6 were migrated from 5 μl of the culture solution from the anti-human TNFα antibody Fd chain single expression strain, and lanes 5 and 6 were from the protein A (ED domain) fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression strain. 5 μl of culture solution migrated, lane 7 migrated with 5 μl of culture solution from an anti-human TNFα antibody Fd chain single expression strain, lanes 8 and 9 are protein A (EDA domain) fusion anti-human TNFα antibody Fd chain 5 μl of the culture solution from the expression strain was electrophoresed.
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｌを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖単独発現ベクターｐＮＨ３２６−Ｆｄを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−Ｌを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖の発現量（図１２参照）、およびプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ（図１３Ａ参照）、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ（図１３Ｂ参照）、ｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄ（図１３Ｃ参照）を有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量は飛躍的に上昇した。また、３種類のプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−Ｆｄ、ｐＰｒｏＡ３ＥＤ−Ｆｄ、およびｐＰｒｏ３ＥＤＡ−Ｆｄをそれぞれ有する形質転換体における、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα抗体Ｆｄ鎖の発現量を比較すると、融合領域として使用するプロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインの数を増やす程、融合ポリペプチドの発現量が顕著に増加していた（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ参照）。 As a result of the experiment, the expression level of the anti-human TNFα antibody L chain in the transformant having the anti-human TNFα antibody L chain single expression vector pNH326-L (see FIG. 12), and the anti-human TNFα antibody Fd chain single expression vector pNH326-Fd The expression level of the anti-human TNFα antibody Fd chain in the transformant having γ was so small that it was difficult to confirm the band. On the other hand, the expression level of protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain in a transformant having protein A fusion anti-human TNFα antibody L chain expression vector pProA4E-L (see FIG. 12), and protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain The expression level of the protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain in the transformant having the expression vectors pProA3E-Fd (see FIG. 13A), pProA3ED-Fd (see FIG. 13B), pPro3EDA-Fd (see FIG. 13C) Rose. In addition, the expression level of protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain was compared in transformants having three types of protein A fusion anti-human TNFα antibody Fd chain expression vectors pProA3E-Fd, pProA3ED-Fd, and pPro3EDA-Fd. Then, as the number of immunoglobulin binding domains of protein A used as the fusion region was increased, the expression level of the fusion polypeptide was significantly increased (see FIGS. 13A, B, and C).
（実施例１０）ヒト成長ホルモンの分泌発現
実施例８にて得られた、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、およびヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体の各々を、実施例９と同様に培養した。ただし、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体の培養のみ、培地に添加する薬剤を、ネオマイシン６０ｍｇ／Ｌに替えて、エリスロマイシン１０ｍｇ／Ｌとした。そして、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１４）。
(Example 10) Secretion expression of human growth hormone Transformant having protein A fusion human growth hormone expression vector pProA3E-hGH obtained in Example 8, MWP fusion human growth hormone expression vector MWP20-His6-Linker- Each of the transformant having Clavage1-hGH / pNU211R2L5 and the transformant having human growth hormone single expression vector pNH326-hGH were cultured in the same manner as in Example 9. However, only the culture of the transformant having the MWP fusion human growth hormone expression vector MWP20-His6-Linker-Clavage1-hGH / pNU211R2L5 was used, and the drug added to the medium was changed to neomycin 60 mg / L to make erythromycin 10 mg / L. . And those culture supernatants were analyzed by SDS-PAGE as in Example 9 (FIG. 14).
図１４は、ＣＢＢ染色による、実施例８で得られたプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株、およびヒト成長ホルモン単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８ｋＤａ）を示す。レーン１はヒト成長ホルモン単独発現株からの培養液５μｌ、レーン２はＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌ、レーン３はプロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現株からの培養液５μｌを泳動したものである。 FIG. 14 is a diagram showing a comparison of the expression levels of the protein A fusion human growth hormone expression strain, the MWP fusion human growth hormone expression strain, and the human growth hormone single expression strain obtained in Example 8 by CBB staining. Lane M shows molecular weight markers (214, 120, 92, 52, 35, 28 kDa). Lane 1 was migrated with 5 μl of the culture solution from the human growth hormone expression strain, lane 2 was loaded with 5 μl of the culture solution from the MWP fusion human growth hormone expression strain, and lane 3 was migrated with 5 μl of the culture solution from the protein A fusion human growth hormone expression strain. Is.
実験の結果、ヒト成長ホルモン単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｈＧＨを有する形質転換体におけるヒト成長ホルモンの発現は極めて少量であったが、ＭＷＰ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターＭＷＰ２０−Ｈｉｓ６−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｌａｖａｇｅ１−ｈＧＨ／ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５を有する形質転換体、および、プロテインＡ融合ヒト成長ホルモン発現ベクターｐＰｒｏＡ３Ｅ−ｈＧＨを有する形質転換体の培養液上清には大量のヒト成長ホルモンが分泌生産されていた（図１４参照）。 As a result of the experiment, the expression of human growth hormone in the transformant having human growth hormone single expression vector pNH326-hGH was very small, but MWP fusion human growth hormone expression vector MWP20-His6-Linker-Clavage1-hGH / pNU211R2L5 A large amount of human growth hormone was secreted and produced in the culture supernatant of the transformant having the protein A and the transformant having the protein A fusion human growth hormone expression vector pProA3E-hGH (see FIG. 14).
（実施例１１）プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターの作成
実施例３で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’ （配列番号２６）と５‘−ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５６）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の前半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号２６は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５６は、ｓｃＦｖ（single chain variable fragments）の前半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。ｓｃＦｖは、一般的に、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるVHおよびVLで構成される可変領域（Fv）を、フレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントである。
(Example 11) Preparation of protein A-fused anti-human TNFα single chain antibody expression vector Using the pBluescript anti-human TNFα antibody L chain prepared in Example 3 as a template, two oligonucleotide primers 5'-AAAAACTGCAGATGAGAGAGTCGTGGACATCTTGCTGAACTCAGTCTCCAGCC-3 ' The DNA encoding the first half of the anti-human TNFα single-chain antibody was amplified by the PCR method using SEQ ID NO: 26) and 5′-GGAACCACCGCCGCCCGGAGCCCCCACCACCGGAGCCGCCCACCGCCAGTGCGTTTTACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 56). SEQ ID NO: 26 shows a forward primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody. SEQ ID NO: 56 shows a reverse primer designed for PCR amplification of the gene in the first half of scFv (single chain variable fragments). scFv is generally a single-chain variable region fragment in which a variable region (Fv) composed of VH and VL, which are the minimum units necessary for an antibody to recognize an antigen, is bound by a flexible peptide linker.
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＮ末端に、ファクターＸａの認識開裂サイトであるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇからなる配列が付加されるよう、プライマーを設計した。同様に、実施例４で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖を鋳型にし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号５７）と５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５８）とを用いて、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の後半部分をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法により増幅した。配列番号５７は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたフォワードプライマーを示す。配列番号５８は、ｓｃＦｖの後半部分の遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。 At this time, a primer was designed so that a sequence consisting of Ile-Glu-Gly-Arg, which is a recognition cleavage site of factor Xa, was added to the N-terminus of the anti-human TNFα single chain antibody. Similarly, using the pBluescript • anti-human TNFα antibody H chain prepared in Example 4 as a template, two oligonucleotide primers 5′-GGTGGTCCTGCGTGCCTGGCGTCGGGATGGTGCTGAAGGAATCTGGAGAATCTGGAGGAGGCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: TTG The DNA encoding the latter half of the anti-human TNFα single chain antibody was amplified by the PCR method. SEQ ID NO: 57 shows a forward primer designed for PCR amplification of the gene in the latter half of scFv. SEQ ID NO: 58 shows a reverse primer designed for PCR amplification of the gene of the latter half of scFv.
この時、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体のＣ末端に、ヒスチジン６残基が付加されるよう、プライマーを設計した。そして、これら２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により連結し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。 At this time, primers were designed so that 6 residues of histidine were added to the C-terminus of the anti-human TNFα single chain antibody. Then, these two DNA fragments were ligated by PCR method to prepare DNA encoding anti-human TNFα single-stranded anti-antibody.
作製したＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、実施例２で作製したプロテインＡ融合発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ（図３）およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ（図７）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＰｓｔＩ部位にそれぞれ挿入し、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ（図１５Ａ）（配列番号５９、６０）、およびｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ（図１５Ｂ）（配列番号６１、６２）を構築した。 After digesting the prepared DNA with the restriction enzyme PstI, each was inserted into the restriction enzyme PstI site present in the multiple cloning site of the protein A fusion expression vectors pProA4E (FIG. 3) and pProA4EDA (FIG. 7) prepared in Example 2, Protein A fusion anti-human TNFα single chain antibody expression vectors pProA4E-scFv (FIG. 15A) (SEQ ID NO: 59, 60) and pProA4EDA-scFv (FIG. 15B) (SEQ ID NO: 61, 62) were constructed.
（実施例１２）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターの作成
オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号２６）に替えて、オリゴヌクレオチドプライマー５’− ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ −３’（配列番号４１）を用いる以外は実施例１１と同様の操作を行い、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗をコードするＤＮＡを作製した。配列番号４１は、抗ＴＮＦα抗体のＬ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用にデザインされたリバースプライマーを示す。
(Example 12) Preparation of anti-human TNFα single-chain antibody single expression vector Oligonucleotide primer 5'-GCACTCCTCGCTGCTCTCTCTCGCTGATCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGACTCTCTCTCTCTGACTCTCTCTCTCTGACTCTCTCTCTGACTCTTGCTCTGATCTT ) Was used in the same manner as in Example 11 to prepare DNA encoding anti-human TNFα single-stranded anti-antibody. SEQ ID NO: 41 shows a reverse primer designed for PCR amplification of L chain gene of anti-TNFα antibody.
作製したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化した後、発現ベクターｐＮＨ３２６のマルチクローニングサイトに存在するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖ（図１５Ｃ）（配列番号６３、６４）を構築した。 The prepared DNA was digested with restriction enzymes NcoI and PstI and then inserted into the NcoI-PstI site present at the multiple cloning site of the expression vector pNH326, and the anti-human TNFα single-chain antibody single expression vector pNH326-scFv (FIG. 15C) ( SEQ ID NO: 63, 64) were constructed.
（実施例１３）抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の分泌発現
実施例１１にて得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖ、および、実施例１２にて得られた抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを、公知の方法に従い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ導入し、形質転換体を得た。次に、これらの形質転換体を実施例９と同様に培養し、それらの培養上清を実施例９と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図１６）。
(Example 13) Secretion expression of anti-human TNFα single chain antibody Protein A fusion anti-human TNFα single chain antibody expression vectors pProA4E-scFv and pProA4EDA-scFv obtained in Example 11 and Example 12 The obtained anti-human TNFα single chain antibody single expression vector pNH326-scFv was introduced into Brevibacillus choshinensis HPD31-OK according to a known method to obtain a transformant. Next, these transformants were cultured in the same manner as in Example 9, and their culture supernatants were analyzed by SDS-PAGE as in Example 9 (FIG. 16).
図１６は、ＣＢＢ染色による、実施例１３で得られたプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株、および抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の発現量の比較を示す図である。レーンＭは分子量マーカー（２１４，１２０，９２，５２，３５，２８，２０ｋＤａ）を示す。レーン１および２は各々抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現株の培養液５μｌ、レーン３および４は各々プロテインＡ（Ｅドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌ、レーン５および６は各々プロテインＡ（ＥＤＡドメイン）融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現株の培養液５μｌを泳動したものである。 FIG. 16 is a diagram showing a comparison of the expression levels of the protein A fusion anti-human TNFα single-chain antibody expression strain obtained in Example 13 and the anti-human TNFα single-chain antibody single expression strain obtained by CBB staining. Lane M shows molecular weight markers (214, 120, 92, 52, 35, 28, 20 kDa). Lanes 1 and 2 are each 5 μl of a culture solution of an anti-human TNFα single-chain antibody single expression strain, and lanes 3 and 4 are each 5 μl of a culture solution of a protein A (E domain) -fused anti-human TNFα single-chain antibody expression strain. And 6 are obtained by electrophoresis of 5 μl of a culture solution of a protein A (EDA domain) fusion anti-human TNFα single chain antibody expression strain.
実験の結果、抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体単独発現ベクターｐＮＨ３２６−ｓｃＦｖを有する形質転換体における抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は、そのバンドを確認することが困難なほど少なかった。一方、プロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体発現ベクターｐＰｒｏＡ４Ｅ−ｓｃＦｖ、ならびにｐＰｒｏＡ４ＥＤＡ−ｓｃＦｖを有する形質転換体におけるプロテインＡ融合抗ヒトＴＮＦα一本鎖抗体の発現量は飛躍的に上昇した。 As a result of the experiment, the expression level of the anti-human TNFα single-chain antibody in the transformant having the anti-human TNFα single-chain antibody single expression vector pNH326-scFv was so small that it was difficult to confirm the band. On the other hand, the expression level of the protein A fusion anti-human TNFα single chain antibody in the transformants having the protein A fusion anti-human TNFα single chain antibody expression vector pProA4E-scFv and pProA4EDA-scFv increased dramatically.
ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ：制限酵素。 NcoI, PstI, BamHI, SalI, XbaI, XhoI, EcoRI, KpnI: restriction enzymes.
ＭＷＰ：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質。 MWP: Brevibacillus brevis bacterial cell wall protein.
Ｐ５：ブレビバチルス・ブレビス細菌の細胞壁蛋白質（ＭＷＰ）のプロモーター５。 P5: Brevibacillus brevis bacterial cell wall protein (MWP) promoter 5.
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ：ヘヤピンループ翻訳終結領域。 Terminator: hairpin loop translation termination region.
Ｒｅｐ：ｐＵＢ１１０由来の複製起点。 Rep: Origin of replication from pUB110.
Ｎｍ：ネオマイシン耐性遺伝子。 Nm: Neomycin resistance gene.
ＳＤ１およびＳＤ２：シャイン・ダルガノ配列。 SD1 and SD2: Shine-Dalgarno sequence.
ＶＬ：Ｌ鎖可変領域。 VL: L chain variable region.
ＣＬ：Ｌ鎖定常領域。 CL: L chain constant region.
ＶＨ：Ｈ鎖可変領域。 VH: heavy chain variable region.
ＣＨ１：Ｈ鎖定常領域。 CH1: heavy chain constant region.
ｈ：ヒンジ領域。 h: Hinge region.
Claims (13)
A polypeptide obtained by the production method according to claim 10.
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014175164A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | 株式会社カネカ | Fd chain gene or l chain gene each capable of increasing secretion amount of fab-type antibody |
-
2005
- 2005-05-17 JP JP2005144529A patent/JP2006320220A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014175164A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | 株式会社カネカ | Fd chain gene or l chain gene each capable of increasing secretion amount of fab-type antibody |
| US10570197B2 (en) | 2013-04-25 | 2020-02-25 | Kaneka Corporation | Fd chain gene or L chain gene capable of increasing secretion amount of fab-type antibody |
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