JP2006289222A - 実験用小動物の骨髄採取方法及び骨髄採取用遠心分離チューブ - Google Patents

Abstract

【課題】 実験用小動物から骨髄を効率良く、しかも正確に質量測定可能な状態で採取することができる方法及び遠心分離チューブの提供。
【解決手段】 実験用小動物の骨を遠心して骨髄を分離採取する；骨髄を貯溜する有底外筒体の内部に、骨を収容保持する内筒体を嵌挿した遠心分離チューブ。
【選択図】 図１

Description

本発明は、実験用小動物の骨髄採取方法及び骨髄採取用遠心分離チューブに関する。

マウスやラット等を初めとする実験用小動物は、各種の薬理試験や安全性試験に汎用されている。当該各種試験の一つとして骨髄中の薬物濃度の測定があるが、その場合には、骨の内部に存在する骨髄を採取する必要がある。

而して、従来斯かる骨髄の採取は、図４に示す如く、マウスやラット等の実験用小動物から切断して取り出した大腿骨に、予め注射器に充填した培養液を当該大腿骨の膝関節側から注射器で勢いよく注入することにより押し出して採取する方法（例えば非特許文献１参照）や当該大腿骨を軸方向に切断した後、掻き出して採取する方法によって行なわれていた。

しかしながら、上記の如き従来の採取方法は何れもその操作が非常に煩雑で効率性に欠けると云う問題があった。特に、マウスやラット等の実験用小動物の骨髄は非常に少量であり、かつ骨の内部に存在し、単体での骨髄採取は困難なため、薬物濃度測定に供する量を確保するためには、多数の個体から骨髄を採取する必要があるところ、上記の従来の採取方法では対応し得ず、しかも、濃度測定に重要な骨髄の質量を正確に測定するのも困難なのが実状であった。
日本生化学会編「続生化学実験講座８ 血液」東京化学同人、１９８７年４月１５日、ｐ．８−１０

本発明は、上記の如き従来の問題と実状に鑑みてなされたもので、マウスやラット等の実験用小動物から骨髄を効率良く、しかも正確に質量測定可能な状態で採取することができる方法及び当該採取に好適なチューブを提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を、実験用小動物の骨を遠心して骨髄を分離採取することにより解決したものである。

また、本発明は、上記課題を、骨髄を貯溜する有底外筒体の内部に、骨髄を採取する骨を収容保持する内筒体を嵌挿せしめた遠心分離チューブにより解決したものである。

本発明方法は、遠心法により骨から骨髄のみを取り出すものであるため、従来の如く、注射器に培養液を充填したり、該培養液を骨に注入する必要がなく、極めて効率良く骨髄を採取することができる結果、小動物から単体での骨髄採取が可能となると共に、多数の個体処理も容易となる。
しかも、遠心中に骨が砕けることがないため、骨と骨髄が明確に分離されるので、骨髄質量を正確に測定することができると共に、不要な骨を容易に廃棄することができる。

また、特に本発明遠心分離チューブを用いれば、内外二重筒構造の故に、骨髄を骨から隔離した状態で分離採取することができるので、より正確に骨髄質量を測定することができると共に、そのまま凍結保存や抽出操作を行なうことができる。

さらに骨髄中の薬物濃度を正確に測定することにより、骨髄へ移行する性質を持つ薬物の体内動態を評価する際、実験小動物の同一個体の他組織濃度（例えば血清中濃度、肝臓中濃度など）と骨髄中濃度とを測定することにより、その薬物の体内組織分布の評価等をすることができる。

本発明方法は、実験用小動物の骨を遠心分離チューブに入れ、通常の遠心機にかけることによって実施されるが、当該遠心分離チューブとしては、本発明遠心分離チューブを用いるのが望ましい。本発明による骨髄採取の際は、骨をチューブ内に、骨の軸方向を遠心方向に合わせて収容・保持した後に、遠心操作によって分離することから、骨髄採取に供する骨は、湾曲していないこと及びマウス等非常に小さな動物においても一定量以上の骨髄を含む骨であるといった条件を満たす点で大腿骨が望ましいが、必ずしもこれに限定されない。これらの骨は、骨髄を効率良く採取するために、予め両端を切断して用いることが望ましい。また、ここでいう実験用小動物とは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類およびウサギなどであるが、遠心機に用いるチューブに収容可能な大きさの大腿骨を持つ動物であれば本発明の実施は可能であり、動物の種類は特に限定されない。

本発明遠心分離チューブにおいて、有底外筒体に嵌挿される内筒体は１本であっても良いが、複数本とし、各内筒体毎に１本の骨を収容保持し得るようにするのが、骨同士の接触破損を防止する上で望ましい。特に、内筒体を２本とした場合には、大腿骨から骨髄を採取する場合に、実験用小動物１個体は大腿骨を２本有するため、実験用小動物１個体からの骨髄採取をより正確に行なうことができ、有利である。

また、内筒体内部に、軸方向の隔壁を形設して複数の区分室に区画することによっても、上記と同様な結果を得ることができる。

内筒体が無底の場合、当該無底内筒体の下部開口部内径や区分室の下部開口部内径は、骨を収容保持し得る限り特に限定されないが、これを大腿骨の端部径より小さくするのが、当該開口部から大腿骨が突出するのを防止する上で望ましい。

内筒体の外径は、上部から下部に向って徐々に小径とするのが、有底外筒体への嵌挿をよりスムースに行ない得るので望ましい。

内筒体は有底でも良いが、骨髄が通過することができる程度の大きさで、かつ骨の端部径より小さい内径の穴が底部に開いているか、もしくは同様の径の開き目を持つ網目状の底部とするのが、骨髄を有底外筒体の内底部に貯溜することができるので望ましい。因に、ここでいう開き目とは、網目の内寸（隣り合う線と線の間）のことである。

内筒体の下端と有底外筒体の内底部との間には、当該内筒体の下端が有底外筒体の内底部に貯溜した骨髄と接触することのない間隔を設けるのが、より正確に骨髄を採取し得るので望ましい。

内筒体の有底外筒体への嵌挿は、固定方式であっても良いが、着脱自在とするのが、遠心分離後、骨の入った内筒体を骨髄の入った有底外筒体から抜き出すことにより両者を分離し、内筒体はそのまま廃棄処分し得る一方、有底外筒体はそのまま保存や抽出操作することができ、また、予め有底外筒体の質量を測定しておけば、骨の入った内筒体を抜き出してそのまま質量を測定することにより、骨髄の質量を測定できるので望ましい。

内筒体は、有底外筒体の上部開口部からやや突出するように嵌挿するのが、遠心分離後、当該突出部を摘むことにより、骨が入った内筒体を骨髄の入った有底外筒体から容易に抜き出すことができるので望ましい。

内筒体と有底外筒体の嵌合部は全体的であっても良いが、有底外筒体の上部開口周辺部においてのみ嵌合せしめるのが、内筒体と有底外筒体の着脱操作性に優れ望ましい。

有底外筒体としては、その上部開口部及び内筒体の上部開口部を封止する蓋を備えているものが、密閉した状態で遠心分離できると共に、遠心分離後は骨髄の入った有底外筒体を当該蓋で密閉して保存等をすることができるので望ましい。この場合、有底外筒体の上部開口部内径と内筒体の上部開口部内径は同じとするのが蓋を共用できるので有利である。

尚、有底外筒体及び内筒体の材質は特に限定されないが、そのまま凍結保存可能な合成樹脂製とするのが望ましい。
また、骨髄の薬物濃度を測定する際には、有機溶媒による薬物の抽出操作が必要であるため、有底外筒体及び内筒体並びに蓋は、薬物の抽出に一般的に使用される有機溶媒に対して耐性を有するものが望ましい。ここで言う有機溶媒とは、アセトニトリル、メタノール、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタンなどであるが、薬物の抽出に使用される有機溶媒であれば、特に限定されない。
さらに、有底外筒体および内筒体は透明または半透明であることが望ましい。特に有底外筒体は、得られた骨髄に上記有機溶媒を添加して均一に混合（懸濁）する操作を確実に行えたかどうかを確認するために、透明または半透明であることが望ましい。

以下実施例を挙げて本発明を更に説明するが、かならずしもこれらに限定されない。

実施例１（遠心分離チューブ例１）
図１は、本発明遠心分離チューブの第１の実施例を示す概略断面説明図である。
該図１において、１０は上部のみが開口した有底外筒体で、遠心分離後は骨髄を貯溜するものである。２０は上下が開口した無底内筒体で、大腿骨を収容保持するものである。この無底内筒体２０の外径は、上部において同径部２１を有するが、それより下方は上部から下部に向って徐々に小径のテーパー状となっていると共に、その下部開口部２０ｂの内径は、収容保持される大腿骨Ｐの端部径より小さく形成され、当該大腿骨Ｐが係止して当該下部開口部２０ｂから突出しないようになっている。

上記無底内筒体２０は、上記有底外筒体１０内に、少なくとも同径部２１を有底外筒体１０の上部開口部１０ａから突出せしめて嵌挿され、両筒体１０、２０は当該有底外筒体１０の上部開口周辺部においてのみ着脱自在に嵌合している。また、無底内筒体２０の下端２４と有底外筒体１０の内底部との間には、遠心分離後、無底内筒体２０の下端２２が有底外筒体１０の内底部に貯溜した骨髄Ｑと接触することのない間隔Ｌが設けられている。

有底外筒体１０の上部開口部１０ａの内径と無底内筒体２０の上部開口部２０ａの内径は略同一となっており、有底外筒体１０の上部に、柔軟性を有する連結片３１を介して付設された蓋３０によって、それぞれ当該上部開口部１０ａ、２０ａが着脱自在に密閉し得るようになっている。

実施例２（遠心分離チューブ例２）
図２は、本発明遠心分離チューブの第２の実施例を示す概略断面説明図である。
この実施例は、有底外筒体１０内に２本の無底内筒体２０が嵌挿され、各無底内筒体２０内にそれぞれ１本ずつ大腿骨が収容保持されるようになっている以外は第１の実施例と同様に構成されている。

実施例３（遠心分離チューブ例３）
図３は、本発明遠心分離チューブの第３の実施例を示す概略断面説明図である。
この実施例は、軸方向に形設された隔壁２３により無底内筒体が２つの区分室２４に区画され、各区分室２４内にそれぞれ１本ずつ大腿骨が収容保持されるようになっている以外は第１の実施例と同様に構成されている。

次に、本発明を用いた骨髄採取の具体的な例（実施例４、５）、および従来の方法を用いた骨髄採取の例（比較例１）を挙げて更に説明する。

実施例４（骨髄採取例１）
図１に示した遠心分離チューブの無底内筒体２０に、予め両端を切断したマウスの大腿骨Ｐを２本、骨の軸方向を遠心方向に合わせるよう収容保持せしめた後、これを遠心機にかけ、回転数が約８０００ｒｐｍとなった時点で停止したところ、有底外筒体１０の内底部に骨髄Ｑが分離貯溜した。そこで、無底内筒体２０を有底外筒体１０から取り外し、骨髄が貯溜した状態で有底外筒体１０の質量を測定し、予め測定しておいた当該有底外筒体１０のみの質量を差し引いたところ、得られた骨髄の質量は約１８ｍｇであった。

実施例５（骨髄採取例２）
図１に示した遠心分離チューブの無底内筒体２０にラットの大腿骨Ｐを２本収容保持せしめた後、これを遠心機にかけ、回転数が約８０００ｒｐｍとなった時点で停止したところ、有底外筒体１０の内底部に骨髄Ｑが分離貯溜した。
そこで、無底内筒体２０を有底外筒体１０から取り外し、骨髄が貯溜した状態で有底外筒体１０の質量を測定し、予め測定しておいた当該有底外筒体１０のみの質量を差し引き、得られた骨髄の質量を測定した。８４匹のラットを測定したところ、大腿骨１本における骨髄の平均質量は６２．５ｍｇであった。

比較例１（骨髄採取例３）
ラットの大腿骨を採取し、１本の大腿骨を軸方向に切断し、中の骨髄を全て掻き取った。得られた骨髄の質量を測定したところ、約１０ｍｇであった。

以上の結果から明らかなように、従来の方法（比較例１）に比べて、本発明を用いる方法（実施例４および５）の方が、より効率的に小動物の骨髄を採取することができた。また、従来の方法では、マウス１個体の骨髄の質量を正確に測定することは困難であったが、本発明を用いることにより簡便に測定することができた（実施例４）。

本発明遠心分離チューブの第１の実施例を示す遠心分離後の概略断面説明図。 本発明遠心分離チューブの第２の実施例を示す遠心分離後の概略断面説明図。 本発明遠心分離チューブの第３の実施例を示す遠心分離後の概略断面説明図。 ラットにおける従来の骨髄採取方法を示す模式説明図。

符号の説明

１０：有底外筒体
１０ａ：上部開口部
２０：無底内筒体
２０ａ：上部開口部
２０ｂ：下部開口部
２１：同径部
２２：下端部
２３：隔壁
２４：区分室
Ｐ：大腿骨
Ｑ：骨髄
Ｌ：間隔

Claims (23)

1. 実験用小動物の骨を遠心して骨髄を分離採取することを特徴とする実験用小動物の骨髄採取方法。
2. 実験用小動物の骨を遠心分離チューブに入れ、次いでこれを遠心機にかけて骨髄を骨から分離採取することを特徴とする請求項１に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
3. 両端を切断した実験用小動物の骨を遠心分離チューブに収容し、骨の軸方向を遠心方向に合わせて保持し、さらに遠心機にかけて骨髄を骨から分離採取することを特徴とする請求項１又は２に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
4. 有底外筒体と１ないし複数本の内筒体から構成された遠心分離チューブを用い、該内筒体に実験用小動物の骨を収容して保持することを特徴とする請求項２又は３に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
5. 遠心分離チューブが、有底外筒体の内部に２本の内筒体を嵌挿して構成されていることを特徴とする請求項４に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
6. 遠心分離チューブが、有底外筒体の内部に、軸方向に形設された隔壁により複数の区分室に区画された１本の内筒体を嵌挿して構成されていることを特徴とする請求項４に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
7. 内筒体が、軸方向に形設された隔壁により２つの区分室に区画されていることを特徴とする請求項４又は６に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
8. 内筒体と有底外筒体が着脱自在であることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
9. 骨が大腿骨であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取方法。
10. 骨髄を貯溜する有底外筒体の内部に、骨を収容保持する１ないし複数本の内筒体を嵌挿せしめたことを特徴とする実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
11. 内筒体が無底内筒体であることを特徴とする請求項１０記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
12. 内筒体が２本嵌挿されていることを特徴とする請求項１０又は１１記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
13. 内筒体が、軸方向に形設された隔壁により複数の区分室に区画されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
14. 内筒体が、軸方向に形設された隔壁により２つの区分室に区画されていることを特徴とする請求項１０、１１又は１３に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
15. 内筒体の下部開口部内径が、骨髄を採取する骨の端部径より小さいことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
16. 内筒体の外径が、上部から下部に向って徐々に小径となっていることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか１項記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
17. 内筒体の下端と有底外筒体の内底部との間に、当該内筒体の下端が有底外筒体の内底部に貯溜した骨髄と接触することのない間隔が設けられていることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか１項記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
18. 内筒体と有底外筒体が着脱自在であることを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
19. 内筒体が、有底外筒体の上部開口部からやや突出して嵌挿されていることを特徴とする請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
20. 内筒体が、有底外筒体の上部開口周辺部においてのみ嵌合していることを特徴とする請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
21. 有底外筒体が、該有底外筒体の上部開口部及び内筒体の上部開口部を封止する蓋を備えていることを特徴とする請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
22. 有底外筒体が、有機溶媒耐性を有することを特徴とする請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。
23. 有底外筒体が、透明または半透明であることを特徴とする請求項１０〜２２のいずれか１項に記載の実験用小動物の骨髄採取用遠心分離チューブ。