JP2006282548A5

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Publication number: JP2006282548A5
Application number: JP2005102709A
Authority: JP
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2025-03-31

Description

（２）工程２
得られた化合物を塩基の存在下、ω−メルカプトアルキルカルボン酸と反応させて１−（２−カルボキシアルキルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ｃ）を得る。 (2) Step 2
The presence of the compound obtained bases, omega - reacted with mercaptoalkyl carboxylic acid 1- (2-mosquito Ruboki shear Ruki thio-5- ylmethyl) -2-nitroimino-3,5-dimethyl-hexa hydro -1 3,5-triazine (c) is obtained.

（３）工程３
得られた化合物を酸の存在下、必要により触媒の存在下反応させることにより１−（２−カルボキシアルキルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−メチル−３−ニトログアニジン（ｄ）を得る。 (3) Process 3
The obtained compound is reacted in the presence of an acid and optionally in the presence of a catalyst to give 1- (2-carboxyalkylthiothiazol-5-ylmethyl) -2-methyl-3-nitroguanidine (d).

抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。本発明においては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含される。モノクローナル抗体が有する高感度性および高選択性、さらには、複数のモノクローナル抗体の組み合わせによる複数成分との分離可能な反応性など適用の汎用性の広さから、特にモノクローナル抗体が好ましい。 In general, antibodies are collected from blood from immunized rabbits or goats, and so-called polyclonal antibodies that separate and purify antibodies contained therein, and so-called polyclonal antibodies that secrete cloned hybridomas capable of producing antibodies are separated and purified. There are monoclonal antibodies. In the present invention, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody is included . Monoclonal antibodies are particularly preferred because of the high versatility of application, such as high sensitivity and high selectivity possessed by monoclonal antibodies, and the ability to be separated from a plurality of components by a combination of a plurality of monoclonal antibodies.

前記モノクローナル抗体は、クロチアニジンおよびジノテフランに対する特異性と他の物質に対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ_５０値を有することが好ましい。ここでＩＣ_５０値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。 In order to clarify the specificity for clothianidin and dinotefuran and the cross-reactivity with other substances, the monoclonal antibody preferably has the following IC ₅₀ value. Here, the IC ₅₀ value refers to the concentration of a sample exhibiting 50% inhibition when a standard inhibition curve is obtained by indirect competitive ELISA or direct competitive ELISA.

すなわち、本抗体は、クロチアニジンまたはジノテフランを測定対象とする場合は、直接競合ＥＬＩＳＡによるクロチアニジンまたはジノテフランに対するＩＣ_５０が５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。 That is, when the antibody is clothianidin or dinotefuran, the IC ₅₀ for clothianidin or dinotefuran by direct competitive ELISA is preferably 500 ng / mL or less, more preferably 50 ng / mL or less.

前記抗体は、通常の製造方法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従ってクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物と高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法に従ってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。 The antibody can be produced according to a usual production method (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 to 11.13 (2000)). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, a complex of clothianidin and dinotefuran hapten compound and a polymer compound is formed according to a conventional method, and then the complex is converted into a non-human such as a rabbit. It is possible to immunize an animal and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, the complex is immunized to a non-human animal such as a mouse according to a conventional method, and a hybridoma cell prepared by cell fusion of the obtained spleen cell and myeloma cell is screened. It can be obtained by culturing an antibody-producing hybridoma (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausube liter . (1987) Publish. John Wiley and Sons. Sections 11.4 to 11.11).

また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法についてより詳細に説明する。
前記のように調製した抗原を２ｍｇ／ｍＬ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾細胞を完全に培地中に浮遊させる。遠心、上清除去を数回繰り返し、細胞を洗った後、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と細胞数の比５：１〜１０：１（脾細胞：ミエローマ）で混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）をゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０^５個／ｍＬになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μＬ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗クロチアニジンおよび抗ジノテフラン抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。 The present invention also provides a hybridoma that produces the monoclonal antibody. Hereinafter, a method for producing a hybridoma using a mouse will be described in more detail.
The prepared antigen as described above were dissolved in physiological phosphate buffer to about 2 mg / mL, was mixed adjuvant with an equal volume, administered intraperitoneally into Ba l b / c mice. Thereafter, booster immunization is carried out about every 2 weeks. The spleen of the mouse in which the antibody titer in the serum of blood collected from the tail blood vessel has been increased is removed, removed in a serum-free DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium), and transferred to a new medium. The spleen cells are completely suspended in the medium. Centrifugation and supernatant removal are repeated several times to wash the cells, and then mixed with mouse myeloma cells (P3X63Ag8.653) at a cell number ratio of 5: 1 to 10: 1 (spleen cells: myeloma). After the cells are precipitated and the supernatant is removed, cell fusion is performed by slowly adding 50% polyethylene glycol (molecular weight 1500) while stirring. After cell fusion, the cells collected by centrifugation are suspended by adding HAT medium so that the number of cells is 5 × 10 ⁵ cells / mL, and the cell suspension is added to a 96-well plastic plate in an amount of 250 μL / well. Dispense and incubate in an incubator at 37 ° C., 5% carbon dioxide, humidified conditions. One week later, half of the medium in the well is replaced with HAT medium and cultured for 10 to 14 days. The activity of the antibody in the culture solution is examined by ELISA, and the hybridoma is cloned by limiting dilution for the cells of the well producing the target antibody. Cloning yields a stable hybridoma strain producing anti-clothianidin and anti-dinotefuran antibodies.

実施例１で製造した１−［２−（２−カルボキシエチルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン（クロチアニジンハプテン）１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。 1- [2- (2-Carboxyethylthio) -5-ylmethyl] -2-methyl-3-nitroguanidine (clothianidin hapten) 1.5 mg, N-hydroxysuccinimide 1.2 mg and 1- ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl Pi Le) - carbodiimide hydrochloride 1.9 mg, N, N-dissolved in dimethyl formamide 200 [mu] L, clothianidin hapten solution was left for 1.5 hours in the dark for 25 ° C. It was set as the solution.

クロチアニジンハプテン１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。 Clothianidin haptens 1.5 mg, N- hydroxysuccinimide 1.2mg and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl Pi Le) - carbodiimide hydrochloride 1.9 mg, was dissolved in N, N- dimethylformamide 200 [mu] L, this The solution was left in a dark place at 25 ° C. for 1.5 hours to obtain a clothianidin hapten solution.

＜実施例４＞（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫源を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＦに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／ｍＬの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価を間接競合法で確認した。十分に力価が高くなったことを確認し、１週間後に最終免疫として免疫原１０μｇ／１００μＬ・ＰＢＳを尾静脈から投与した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。 <Example 4> (Production of monoclonal antibody-producing hybridoma)
The immunogen prepared in Example 2 was dissolved in PBF so as to be 2 mg / mL, and an equal amount of complete adjuvant (trade name: Freund's complete adjuvant; FCA) was mixed in an equal amount to make an emulsion. It was administered intraperitoneally to ˜7 weeks old female Balb / C mice. In the same procedure, booster immunization was performed every 2 weeks with 100 μL of 0.5 mg / mL immunogen mixed with an equal amount of incomplete adjuvant (trade name: Freund's incomplete adjuvant; FICA). After four immunizations, blood was collected from the fundus and the antibody titer in the serum was confirmed by the indirect competition method. After confirming that the titer was sufficiently high, an immunogen 10 μg / 100 μL / PBS was administered from the tail vein as a final immunization one week later. Three days later, the spleen was removed from the mouse and subjected to cell fusion.

＜実施例５＞（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０^６個の細胞をＢａｌｂ／ＣメスＲｅｔｉｒｅマウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧカラムによりＩｇＧ精製を行った。 <Example 5> (Preparation of monoclonal antibody)
The hybridoma strain obtained in Example 4 was cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum, about 2 × 10 ⁶ cells were injected into the abdominal cavity of a Balb / C female Retire mouse, and ascites fluid was collected. The obtained ascites was subjected to IgG purification using a protein G column.

（５）ＨＲＰ基質溶液（１００μｇ／ｍＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンおよび０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））１００μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μＬをウェルに加えて酵素反応を止め、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 (5) HRP substrate solution (100 μg / mL of 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine and 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.5) supplemented with 0.006% hydrogen peroxide) 100 μL Was added to the well and incubated at 25 ° C. for 10 minutes. Then, 100 μL of 1N sulfuric acid was added to the well to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader.

モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液についての直接競合阻害法によるクロチアニジンおよびジノテフランの標準阻害曲線を図１および図２に示す。モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によるクロチアニジンの測定可能な範囲は１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ_５０値）は４．５ｎｇ／ｍＬであった。また、ジノテフランの測定可能な範囲は２ｎｇ／ｍＬ〜１２ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ_５０値）は６．０ｎｇ／ｍＬであった。 Standard inhibition curves of clothianidin and dinotefuran by the direct competitive inhibition method for the monoclonal antibody CTN-16A3-13 solution are shown in FIG. 1 and FIG. The measurable range of clothianidin by direct competitive ELISA using monoclonal antibody CTN-16A3-13 solution is 1 ng / mL to 10 ng / mL, and the value indicating 50% inhibition (IC ₅₀ value) is 4.5 ng / mL Met. Moreover, the measurable range of dinotefuran was 2 ng / mL to 12 ng / mL, and the value indicating 50% inhibition (IC ₅₀ value) was 6.0 ng / mL.

＜実施例８＞（抗体のクロチアニジン構造類似化合物に対する交差反応性）
クロチアニジンと化学構造が類似している農薬について抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例６に記載の方法と同様にして試験化合物のＩＣ_５０値を求め、次式により計算し交差反応率を算出した。 <Example 8> (Cross-reactivity of antibody to clothianidin structural analog)
Cross-reactivity of antibody NPR-1H12-15 was examined for pesticides having chemical structures similar to clothianidin. For the cross-reactivity, the IC ₅₀ value of the test compound was determined in the same manner as described in Example 6, and the cross-reactivity was calculated by the following formula.

交差反応率（％）＝（クロチアニジンのＩＣ_５０値／試験化合物のＩＣ_５０値）×１００
その結果、殺虫剤ジノテフランに対しては交差反応率７５％の高い値を示したのに対し、殺虫剤のアセタミプリド、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサム、硫酸ニコチンおよび殺菌剤のピリフェノックスに対しいずれも交差反応性は０．１％以下であり、抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５はクロチアニジンおよびジノテフランに特異的な抗体であった。 Cross-reactivity rate (%) = _{(IC 50} values _{IC 50} values / test compound clothianidin) × 100
As a result, the insecticide dinotefuran showed a high cross-reaction rate of 75%, whereas the insecticides acetamiprid, imidacloprid, nitenpyram, thiacloprid, thiamethoxam, nicotine sulfate and the fungicide pyrifenox. The cross-reactivity was 0.1% or less, and the antibody NPR-1H12-15 was an antibody specific for clothianidin and dinotefuran.