JP2006275648A - ヒト血液型試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】ブナシメジから精製されるＡＧＬを生理活性物質として有効活用することにある。
【解決手段】第1の本発明に係る、ブナシメジから精製される構造式：Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＢ型糖脂質のマイコグリコリピドは、Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１の構造式を有しており、この構造式はＢ型抗原構造で、ヒト血液型判定の試薬として安価に利用することができ、ブナシメジのマイコグリコリピドの有効活用ができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト血液型試薬に関し、詳しくは、キノコ、特にブナシメジから精製されるマイコグリコリピド（ＡＧＬと略す。キノコの酸性糖脂質あるいはイノシトールリン酸性糖脂質とも称される。）を類似ヒト血液型抗原として使用するヒト血液型試薬に関するものである。

近年の急速な高齢化社会の進展と食生活の変化による生活習慣病の増加は、健康への関心を高め、キノコの生理活性が注目されている。
キノコは生活習慣病を始めとして癌や慢性関節リュウマチ、アトピー性皮膚炎などの疾病に効果があるとされ、食用キノコに含まれる新たな有用物質の探索やその生理活性に興味を持たれている。

特にキノコのＡＧＬの生理活性としては、イノシトールリン酸セラミド型の糖脂質がマウスへの免疫実験において、毒性のない良好なアジュバンド活性を有することやヒトや動物の血清中に一部のイノシトールリン酸セラミド型糖脂質を認識する抗体が存在することなどが報告されている。

キノコの中でもブナシメジには、特にＡＧＬが多く含まれ、このブナシメジから精製されるＡＧＬの有効活用が望まれる。

本発明者は、このブナシメジから精製されるＡＧＬにつき、更に鋭意検討研究した結果、このＡＧＬの有効活用方法を明らかにした。
特開２００１−８９４９４号公報 特開２００４−１６６６４６号公報

本発明の目的は、ブナシメジから精製されるＡＧＬを生理活性物質として有効活用することにある。

本発明者は、ブナシメジに含まれるマイコグリコリピドに含有される化合物について、鋭意検討を重ねた結果、ヒト血液型Ｏ型抗原構造、Ｂ型抗原構造、Ａ型抗原構造を有することを見出し、本発明に至った。

第1の本発明に係る、ブナシメジから精製される構造式：Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＢ型糖脂質のマイコグリコリピドは、Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１の構造式を有しており、この構造式はＢ型抗原構造で、ヒト血液型判定の試薬として安価に利用することができ、ブナシメジのマイコグリコリピドの有効活用ができる。

第2の本発明に係る、ブナシメジから精製される構造式：Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＯ型糖脂質のマイコグリコリピドは、Ｆｕｃα１−２Ｇａ１の構造式を有しており、この構造式はＯ型抗原構造で、ヒト血液型判定の試薬として安価に利用することができ、ブナシメジのマイコグリコリピドの有効活用ができる。

第3の本発明に係る、ブナシメジから精製される構造式：Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＯ型糖脂質のマイコグリコリピドに、人胃癌由来の細胞株のＡ型糖転移酵素によりＡ型糖脂質のマイコグリコリピドを合成することができるので、ヒト血液型判定の試薬として安価に利用することができ、ブナシメジのマイコグリコリピドの一層の有効活用ができる。

本発明に係る第1、2の発明であるマイコグリコリピドを見出した分析方法につき説明する。
これまでに報告されているキノコの酸性糖脂質（マイコグリコリピドあるいはイノシトールリン酸性糖脂質とも称される）の化学構造は、マンノース−イノシトールリン酸セラミド（Ｍａｎ−Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ）をコアーとして、更に、ガラクトースやフコース等が結合したものである。

以下に構造解析を行ったブナシメジのマイコグリコリピドについて述べる。
市販のブナシメジを５０℃で乾燥後、クロロホルム−メタノール−水（６０：３５：８）により総脂質を抽出した。

総脂質を弱アルカリ及び弱酸性処理して調整した粗スフィンゴ脂質画分をイオン交換セファデックスカラムクロマトグラフィーによって分画した。
得られた酸性糖脂質画分をイアトロビーズカラムクロマトグラフィーに処し、7種のマイコグリコリピド（ＴＬＣ上での移動度の大きい順にＡＧＬ−０〜ＡＧＬ−６と仮称）をそれぞれ単離、精製した。

カラムからの溶出は、クロロホルム−メタノール−３Ｍアンモニア（７０：３０：３〜５０：５０：１７）の濃度勾配溶出法及びｎ−プロパノール−水−アンモニア（７５：１５：５及び７５：２０：５）の単一溶媒溶出法を用いた。

単離した７種のマイコグリコリピドは、いずれもリン検出試薬のＨａｎｅｓ−Ｉｓｈｅｒｗｏｏｄ試薬に陽性を示し、更に、ＡＧＬ−１〜ＡＧＬ−６はｏｒｃｉｎｏｌ−硫酸試薬にも陽性であった（図１、図２）。

構成糖種はメチルグリコシドＴＭＳ−誘導体として、糖鎖結合位置は部分メチル化アルジトールアセテート誘導体として、それらのＧＣ及びＧＣ−ＭＳ分析によって決定した（図3）。

更に、イノシトールリン酸部分の構造を酸加水分解生成物からのイノシトールリン酸及びイノシトールの同定と、フッ化水素酸による分解成績体からのセラミドの回収及びその解析によって確認した。

また、マンノースが結合するイノシトールの水酸基の位置（Ｍａｎ→Ｉｎｓ）は、主として過ヨウ素酸酸化によるフラグメント成績体の構造解析の結果により決定した。

一方、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析では、セラミド組成を考慮した推定分子量に相当する分子量ピークが得られた。
即ち、7種のマイコグリコリピドは、ＡＧＬ−０に順次マンノース（ｍ／ｚ162）、ガラクトース（ｍ／ｚ162）、フコース（ｍ／ｚ148）、ガラクトース（ｍ／ｚ162）、ガラクトース（ｍ／ｚ162）及びガラクトース（ｍ／ｚ162）分に相当する分子量の増加することがわかった（図4）。

糖のアノマー配置は^１Ｈ−ＮＭＲ分析によったが、１つのガラクトースがβ−アノマーである他は、すべてα−アノマーであった（図5）。
以上のことから、ブナシメジの７種のマイコグリコリピドの構造を次のように決定した。

ＡＧＬ−０：Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−１：Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−２：Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−３：Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−４：Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−５：Ｇａ１１−２Ｇａ１１−３（Ｆｕｃ１−２）Ｇａ１１−６Ｍａｎ１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ； ＡＧＬ−６：Ｇａ１１−２Ｇａ１１−２Ｇａ１１−３（Ｆｕｃ１−２）Ｇａ１１−６Ｍａｎ１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ。

セラミド組成については、これらのマイコグリコリピドのすべてが、長鎖塩基はフィトスフィンゴシンのみを成分とし、一方、脂肪酸はＡＧＬ−０がＣ１６及びＣ１８の飽和酸とＣ１８，Ｃ２２，Ｃ２４の２−ヒドロキシ酸のそれぞれを成分とするのに対し、ＡＧＬ−１〜ＡＧＬ−６は、２−ヒドロキシ酸のみを構成成分としていた（図6）。

これらのマイコグリコリピドの構造を、既に報告されているブナシメジと分類学上で同目のツクリタケのそれら（Ｇａ１α１−６Ｇａ１α１−６Ｇａ１α１−６（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ）と比較したところ、構成糖種は同一であるが、非還元端末からのガラクトースの結合に違いが認められた。

ツクリタケを含めタマゴテングダケ、ホコリタケ、ヤマドリタケ、アンズタケ、シイタケ、ヒラタケ等、今までに報告されているマイコグリコリピドは、全てに共通した骨格構造であるイノシトールリン酸セラミドにマンノースがα１−２結合している。

そして更に、マンノース、ガラクトース及び分岐でフコースが結合して、それらの組み合わせによって糖鎖が延長している。

ブナシメジを含め、前述のエリンギにおいても、それぞれのキノコを特色付けるマイコグリコリピドが存在することは、それらを食用として摂取する動物（特に、ヒト）に及ぼす影響等、生理活性についても関心が寄せられるところである。

また、ブナシメジのマイコグリコリピドの糖鎖の非還元末端構造に注目すると、ＡＧＬ−３のＦｕｃα１−２Ｇａ１はヒト血液型のＯ型抗原構造を有し、ＡＧＬ−４のＧａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１はＢ型抗原構造を有している。

ＴＬＣ上でのそれぞれの抗体との反応性を調べるＴＬＣ−ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇでは、ＡＧＬ−４は血液型判定抗血清及び抗体あるいはＡ型の血液型血清中に含まれる抗Ｂ抗体により認識された。
一方、ＡＧＬ−３は、Ｏ型糖鎖を認識するレクチンにより検出された。

第3の本発明に係る一実施例を説明する。
最初の、材料としては、人胃癌由来の細胞株、Ｈ型糖脂質（ＡＧＬ−３）、Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ、Ｂ型糖脂質（ＡＧＬ−４）、Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（糖転移酵素反応のドナー基質）、薄層プレート、抗Ａ型抗体（モノクローナル抗体、ダコ社製）、セパックＣ１８逆層クロマトカートリッジを用いる。

次に、方法に付き説明する。
細胞培養
上記の２種の細胞株をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで培養し、４Ｘ１０^７細胞を得る。
この細胞をホモジネート処理し、これを酵素源とする。比活性を上げるために１００．０００Ｇ上清のミクロゾームリッチ画分を用いる。

酵素反応
基質：Ｈ型糖脂質（ＡＧＬ−３） １０ｕｇ／５０ｕｌ（チューブ）
緩衝系：カコジル酸バッファー（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
ＭｎＣｌ_２ １０ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．３％
糖供与体：ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ ０．０８５ｍＭ

ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成経路は次のとうりである。
Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ＋ＵＤＰ→
Ｈ型糖脂質（ＡＧＬ−３）
Ｇａ１ＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒ＋ＵＤＰ 合成されるＡ型糖脂質
反応液は５０ｕｌで行う。基質のＡＧＬ−３は先に有機溶媒を除いておく。そのチューブに緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＭｎＣｌ_２、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを加え最後に酵素液を加え３７℃、３時間反応を行う。

Ｃ１８逆層クロマトカートリッジを用いた反応産物の精製
上記の酵素反応でＨ型糖脂質（ＡＧＬ−３）を基質にして糖転移酵素反応により、もう一方の基質であるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）がＡＧＬ−３に移りＡ型糖脂質がｉｎ ｖｉｔｒｏで生合成される。

Ａ型糖転移酵素として、α−Ｎ アセチルガラクトサミン転移酵素を使用している。

反応生成物のＡ型糖脂質は基質（ＡＧＬ−３）に比べて、非常に微量であるため酵素反応終了後、反応液から更に脂質を精製する。

終了後反応チューブへ１ｍｌの水を加え懸濁し、溶液すべてを予め平衡化していたＣ１８逆層クロマトカートリッジにのせる。自然落下で溶出液をチューブに分取する。
更にもう１ｍｌの水を加え、カートリッジを十分洗い込む。

次に、メタノール２ｍｌ、クロロホルム／メタノール、２／１混液２ｍｌを次々に流し、脂質をカートリッジから溶出し、別のガラスチューブで分取する。
Ｃ１８逆層クロマトカートリッジでは水系で過剰の酵素蛋白質、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが洗い出され、最後に有機溶媒（クロロホルム／メタノール混液）で脂質がカートリッジから溶出する。
逆層の高速液体クロマトグラフィーの原理と同じである。

薄層クロマトグラフィーとＴＬＣ免疫染色法
カートリッジからから溶出された有機溶媒に脂質が存在するので、チューブの溶媒をエアーポンプで飛ばし、少量の溶媒（５０ｕｌぐらい）で脂質を溶かし、通常の方法で展開溶媒（Ｃ／Ｍ／Ｗ：６０／３５／８）を用いてＴＬＣで脂質を展開する。

その後、抗Ａ型抗体（モノクローナル抗体）を用いて免疫染色し、生じたＡ型糖脂質を検出する。発色には酵素抗体法（コニカイムノステイン法）あるいはＥＬＣ法を使用する。
通常これらの反応は放射性同位体（^１４Ｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）を用いて、反応後、薄層クロマトグラフィーに展開後、Ｘ線のフィルムの感光によるオートラジオグラフィー法で検出する方法が使われているが、感度が問題にならなければ別の方法を使うことができる。

未反応のＨ型糖脂質もこの系の中に存在するが、同じ脂質なので薄層クロマトグラフィーでは分離できるので問題ない。使う抗体は抗Ａ型抗体（モノクローナル抗体）なので、他のＨ型糖脂質のような糖脂質とは交叉反応しない。検出感度の問題である。酵素活性が高ければ確実に検出できる。

この結果、レーン１はＡ型赤血球膜より調整した中性糖脂質画分を薄層クロマトグラフィーにのせた。右の抗体による反応では抗Ａ型抗体で反応する主要な糖脂質が上からＡ^ａ、Ａ^ｂ、Ａ^ｃバンドが確認できた。

これに対し、ヒト細胞株より調整した酵素画分を用いて反応させたレーン２では酵素を加えないレーン３の反応に比べて免疫染色で検出された。そして、そのバンドはＡ型糖脂質のバンドが基質であるキノコ由来のＨ型糖脂質の下に検出され、構造としては図7の構造であると考えられる。
類似のヒト細胞株でも同様な結果が得られた。

ブナシメジの酸性糖脂質画分には人血液型類似糖脂質、Ｈ型糖脂質、Ｂ型糖脂質がかなり多く存在する。これらの正確な構造が決定された。
抗体との反応性も殆ど差はなく、今までの血液型判定用には赤血球そのものを抗体と直接反応させていたが、ブナシメジ由来の糖脂質を用いれば代替え品として、使用できる。

更に実用化のためには血液型の判定や輸血の際には表試験、裏試験のクロスマッチが必要であるが、キノコ由来の糖脂質を用い、しかも構造既知のＨ型糖脂質の前駆体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ型糖脂質を合成できる方法を確立できたことは、安価な血液型類似糖脂質を供給できる。

リン酸検出試薬と硫酸試薬の場合の説明図。 図1に示す試薬を行う際の説明図。 ＡＧＬのＧＣ及びＧＣ−ＭＳ分析説明図。 ＡＧＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析説明図 ＡＧＬのＨ−ＮＭＲ分析説明図 ＡＧＬのセラミド組成の説明図。 キノコ糖脂質を用いたＡ型糖脂質のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を示す説明図

Claims (3)

1. ブナシメジから精製される構造式：Ｇａ１α１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＢ型糖脂質のマイコグリコリピドを抗原として使用することを特徴とするヒト血液型試薬。
2. ブナシメジから精製される構造式：Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＯ型糖脂質のマイコグリコリピドを抗原として使用することを特徴とするヒト血液型試薬。
3. ブナシメジから精製される構造式：Ｆｕｃα１−２Ｇａ１β１−６Ｍａｎα１−２Ｉｎｓ−Ｐ−Ｃｅｒから成るＯ型糖脂質のマイコグリコリピドに、人胃癌由来の細胞株のＡ型糖転移酵素によりＡ型糖脂質のマイコグリコリピドを合成して抗原として使用することを特徴とするヒト血液型試薬。

Images