JP2006272002A - Medical treatment material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定のペプチドおよび／またはその塩を基材に固定化した医療用手当材に関するものである。本発明の医療用手当材は、生理活性が高く、特に強い細胞増殖促進作用および／または細胞接着作用を有し、生体組織の治癒、接着、補強および／または再生用の材料または剤として有用であり、例えば、創傷被覆材、生体組織接着剤、骨補強剤、軟骨再生剤、神経再生剤などとして用いることができ、特に難治性潰瘍などの難治性創傷の治療に有用である。 The present invention relates to a medical care material in which a specific peptide and / or salt thereof is immobilized on a base material. The medical care material of the present invention has a high physiological activity, has a particularly strong cell growth promoting action and / or cell adhesion action, and is useful as a material or agent for healing, adhesion, reinforcement and / or regeneration of living tissue. For example, it can be used as a wound dressing, a biological tissue adhesive, a bone reinforcing agent, a cartilage regenerative agent, a nerve regenerative agent and the like, and is particularly useful for the treatment of intractable wounds such as intractable ulcers.
生体組織の受けた創傷などを治癒促進する作用を有するペプチドとしては、例えば、配列番号８で表されるペプチド（ＴＲＡＰ−５０８）が知られており、このペプチドは動物に作製した創に対して治癒促進効果があることが報告されている（非特許文献１〜４を参照）。
また、配列番号９で表されるペプチド（ＥＧＦ−１４−３１）は、ヒト線維芽細胞の増殖を促進することが報告されている（非特許文献５を参照）。
さらに、配列番号１０で表されるペプチド（Ｌａｍｉｎｉｎ誘導体ペプチド）は、細胞の接着、遊走および血管新生を促進することが報告されている（非特許文献６および７を参照）。
さらに、配列番号１２で表されるペプチド（ＴＧＦβ６９−８４）は、軟寒天中のＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニー形成を促進することが確認されている（特許文献１を参照）。
そして、配列番号１３で表されるペプチド（Ｅｌａｓｔｉｎ由来ペプチド）は、ヒト皮膚由来の線維芽細胞の遊走と増殖を刺激することが報告されている（非特許文献８および９を参照）。
For example, a peptide represented by SEQ ID NO: 8 (TRAP-508) is known as a peptide having an action of promoting the healing of wounds received by living tissues. It has been reported that there is a healing promoting effect (see Non-Patent Documents 1 to 4).
Further, it has been reported that the peptide represented by SEQ ID NO: 9 (EGF-14-31) promotes the proliferation of human fibroblasts (see Non-Patent Document 5).
Furthermore, it has been reported that the peptide represented by SEQ ID NO: 10 (Laminin derivative peptide) promotes cell adhesion, migration and angiogenesis (see Non-Patent Documents 6 and 7).
Furthermore, it has been confirmed that the peptide represented by SEQ ID NO: 12 (TGFβ69-84) promotes colony formation of NRK-49F cells in soft agar (see Patent Document 1).
And it has been reported that the peptide represented by SEQ ID NO: 13 (Elastin-derived peptide) stimulates migration and proliferation of human skin-derived fibroblasts (see Non-Patent Documents 8 and 9).
上記した配列番号８、９、１０、１２および１３で表されるペプチドは、細胞接着活性または細胞増殖刺激活性を示すが、上記の従来技術ではそれらのペプチドはいずれも基材に固定化せずに遊離の状態で用いて実験が行われており、基材に固定化したときにも細胞接着活性または細胞増殖刺激活性が失われずに維持されるか否かについては何ら知られていない。しかしながら、上記したペプチド類を実際の医療に用いるには、基材に固定化して閉鎖性被覆材などを形成し、それを患部に直接接触させて使用することが、治癒を円滑に効率良く行う上で望ましい。 Although the peptides represented by SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 12, and 13 described above exhibit cell adhesion activity or cell proliferation stimulating activity, none of these peptides are immobilized on a substrate in the above-described conventional technology. Experiments have been conducted in a free state, and it is not known at all whether cell adhesion activity or cell growth stimulating activity is maintained without loss even when immobilized on a substrate. However, in order to use the above-mentioned peptides for actual medical treatment, it is possible to immobilize on a base material to form an occlusive dressing or the like, and use it by directly contacting the affected part, so that healing can be performed smoothly and efficiently. Desirable above.
また、従来、外傷や熱傷、潰瘍、褥瘡などの創傷の治療にはガーゼおよび／または軟膏類が汎用されてきた。これらは滲出液を吸収し、かつ外部からの細菌などの侵入を防ぐ効果がある。近年、創部からの滲出液中に治癒を促進する種々の増殖因子（ｂＦＧＦ、ＴＧＦβなど）が存在することが明らかになり（非特許文献１０を参照）、そのような増殖因子を創部に保持して創部治癒促進効果を示す閉鎖性被覆材が注目されるようになってきた（非特許文献１１を参照）。 Conventionally, gauze and / or ointments have been widely used for the treatment of wounds such as trauma, burns, ulcers and pressure ulcers. These are effective in absorbing exudate and preventing invasion of bacteria from the outside. In recent years, it has become clear that various growth factors (bFGF, TGFβ, etc.) that promote healing exist in exudates from the wound (see Non-Patent Document 10), and such growth factors are retained in the wound. Therefore, a closure covering material that exhibits a wound healing promoting effect has been attracting attention (see Non-Patent Document 11).
閉鎖性の創傷被覆材としては、ポリビニルアルコール含水ゲル、ポリエチレングリコール含水ゲル、ポリアクリルアミド含水ゲルなどの含水ゲル、ポリウレタンフイルム、ハイドロコロイド、アルギン酸塩繊維からなる不織布、ポリビニルアルコールスポンジなどが知られている。特許公報上では、具体的には、例えば、（１）不溶性アルギン酸塩と可溶性アルギン酸塩との混合アルギン酸塩の繊維よりなる不織布製の傷接触パッドに抗微生物剤や局部麻酔剤などの薬剤を含有させたもの（特許文献２を参照）；（２）生体親和性の合成材料よりなる連続気泡フォームの細孔に硼酸塩で変性したグアーガムのヒドロゲルを包含させ、該ヒドロゲルに遊離ヒドロキシル基および／またはアミノ基と二官能カップリング剤とにより創傷治癒を促進するペプチドを表面に結合させるか、および／または殺菌性または抗真菌性の物質を含ませた創傷被覆材（特許文献３を参照）；（３）ケン化度が９５モル％以上で粘度平均重合度が１５００以上のポリビニルアルコールと２〜８個の水酸基を有する水溶性有機化合物を用いて形成したヒドロゲルよりなる創傷被覆材（特許文献４を参照）；（４）ポリビニルアルコールと、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体などからなる複合化材とを物理的に架橋させた半結晶質の半透明で水不溶性の創傷被覆材などとして用いられるヒドロゲル（特許文献５を参照）；（５）ヒアルロン酸および／またはその塩を包括したポリビニルアルコール含水ゲルに塩酸ピロカルピンなどを包含させた創傷被覆材などとして用いられる持続性活性体（特許文献６を参照）などが提案されている。 Known occlusive wound dressings include hydrated gels such as hydrated polyvinyl alcohol gels, hydrated polyethylene glycol gels and hydrated polyacrylamide gels, polyurethane films, hydrocolloids, nonwoven fabrics made of alginate fibers, and polyvinyl alcohol sponges. Specifically, in the patent publication, for example, (1) a non-woven wound contact pad made of a mixed alginate fiber of insoluble alginate and soluble alginate contains a drug such as an antimicrobial agent or a local anesthetic. (2) a guar gum hydrogel modified with borate is included in the pores of an open-cell foam made of a biocompatible synthetic material, the hydrogel containing free hydroxyl groups and / or A wound dressing in which a peptide that promotes wound healing is bound to the surface by an amino group and a bifunctional coupling agent and / or a bactericidal or antifungal substance is contained (see Patent Document 3); 3) Formed by using a water-soluble organic compound having a saponification degree of 95 mol% or more and a viscosity average polymerization degree of 1500 or more and polyvinyl alcohol and 2 to 8 hydroxyl groups. (4) a semi-crystalline semi-crystalline material obtained by physically crosslinking a polyvinyl alcohol and a composite material comprising a methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer or the like. Hydrogel used as a transparent and water-insoluble wound dressing (see Patent Document 5); (5) A wound dressing in which pilocarpine hydrochloride and the like are contained in a polyvinyl alcohol hydrogel containing hyaluronic acid and / or its salt Sustained actives (see Patent Document 6) and the like have been proposed.
しかしながら、上記した従来の創傷被覆材は、創傷の治癒促進作用が十分ではないため、細胞増殖促進活性が高くて、創傷の治癒、生体組織の接着、骨補強、軟骨再生、神経再生などに有効に使用できる医療用手当材の開発が求められている。 However, since the conventional wound dressing described above does not have sufficient wound healing promoting action, it has high cell growth promoting activity and is effective for wound healing, biological tissue adhesion, bone reinforcement, cartilage regeneration, nerve regeneration, etc. There is a need to develop medical care materials that can be used in the future.
したがって、本発明の目的は、生理活性が高く、特に強い細胞増殖促進作用を有していて、生体組織の受けた創傷などの治癒、生体組織の接着、補強（例えば骨の補強）、再生（例えば軟骨や神経などの再生）などに有効に使用することのできる新しい材、特に生理活性が高くて良好な細胞増殖促進作用や細胞接着活性を示す物質を基材に固定化して、創傷の治癒、生体組織の接着、骨の補強、軟骨や神経の再生などに有効に用いることのできる医療用手当材を提供することである。 Therefore, the object of the present invention is to have a high physiological activity and a particularly strong cell growth promoting action, such as healing of wounds received by biological tissues, adhesion of biological tissues, reinforcement (for example, bone reinforcement), regeneration ( Healing wounds by immobilizing a new material that can be used effectively (for example, regeneration of cartilage, nerves, etc.), in particular, a substance with high physiological activity and good cell growth promoting action and cell adhesion activity on a substrate. Another object of the present invention is to provide a medical dressing that can be used effectively for adhesion of living tissue, bone reinforcement, cartilage and nerve regeneration.
上記の目的を達成すべく本発明者らは鋭意研究を重ねてきた。そしてそのような研究の一環として、配列番号８〜配列番号１４で表される従来既知のペプチドおよびその誘導体を含水ゲルなどの基材に固定化したところ、固定化後も前記既知のペプチド類の生理活性が失われず、良好な細胞増殖促進作用、細胞接着作用を示し、その固定化物が医療用手当材として有効に使用できることを見出した。 In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive research. As part of such research, when the conventionally known peptides represented by SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14 and derivatives thereof were immobilized on a substrate such as a hydrous gel, the known peptides were immobilized after immobilization. It was found that the physiological activity is not lost, the cell growth promoting action and the cell adhesion action are exhibited, and the immobilized product can be effectively used as a medical dressing.
さらに、本発明者らは、前記の研究と並行して、細胞増殖促進作用や細胞接着作用などの生理活性を示す新しい物質の開発を目指して研究を行ってきた。その結果、下記の一般式（Ｉ）；
Ｘ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｇ−Ｊ−Ｌ−Ｍ−Pro−Ｑ−Ｙ （Ｉ）
[式中、Ｘは水素、ＣＨ3−Ｃ(Ｏ)−およびＣＨ3−Ｃ(Ｏ)−Ｌys−からなる群から選ばれる基、ＡはＳerまたはＴhrからなるアミノ酸残基、ＤはＩle、ＶalおよびＬeuからなる群から選ばれるアミノ酸残基、ＥはＬysまたはＡrgからなるアミノ酸残基、ＧはＩle、ＶalおよびＬeuからなる群から選ばれるアミノ酸残基、ＪはＧlyまたはＡlaからなるアミノ酸残基、ＬはＩle、ＶalおよびＬeuからなる群から選ばれるアミノ酸残基、ＭはＧlyまたはＡlaからなるアミノ酸残基、ＱはＧly、ＡlaおよびＧly−Ｌys−Ｌys−Ｇlyからなる群から選ばれるアミノ酸残基またはペプチド残基、並びにＹは−ＯＨまたは−ＮＨ２を示す。]
で表される新規なペプチドまたはその塩、そのうちでも配列番号１〜配列番号７で表されるペプチドまたはその塩が、上記した配列番号８〜配列番号１４で表されるペプチドよりも一層強い細胞増殖促進作用、細胞接着促進作用などの生理活性を有し、しかも細胞毒性が低く、そのまま遊離の状態で、または基材に固定化して、創傷の治癒、生体組織の接着、骨の補強、軟骨の再生、神経の再生などに有効に使用できることを見出した。
Furthermore, in parallel with the above-mentioned researches, the present inventors have conducted research aiming at the development of new substances exhibiting physiological activities such as cell proliferation promoting action and cell adhesion action. As a result, the following general formula (I):
X-A-D-E-G-J-LM-Pro-QY (I)
Wherein X is hydrogen, a group selected from the group consisting of CH 3 —C (O) — and CH 3 —C (O) —Lys—, A is an amino acid residue consisting of Ser or Thr, D is Ile, An amino acid residue selected from the group consisting of Val and Leu, E is an amino acid residue consisting of Lys or Arg, G is an amino acid residue selected from the group consisting of Ile, Val and Leu, J is an amino acid residue consisting of Gly or Ala A group, L is an amino acid residue selected from the group consisting of Ile, Val and Leu, M is an amino acid residue consisting of Gly or Ala, Q is an amino acid selected from the group consisting of Gly, Ala and Gly-Lys-Lys-Gly Residue or peptide residue, as well as Y represents —OH or —NH 2. ]
A novel peptide represented by the formula (1) or a salt thereof, of which the peptide represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 or a salt thereof is stronger than the peptide represented by SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14 described above. Physiological activity such as promoting action, cell adhesion promoting action, etc. and low cytotoxicity, as it is, in a free state or immobilized on a base material, wound healing, biological tissue adhesion, bone reinforcement, cartilage It was found that it can be used effectively for regeneration and nerve regeneration.
本発明は、本発明者らによる上記した新しい知見のうち、特に配列番号８で表されるペプチド、配列番号９で表されるペプチド、配列番号１０で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチド、配列番号１２で表されるペプチド、配列番号１３で表されるペプチド、配列番号１４で表されるペプチドおよびそれらの塩から選ばれる少なくとも１種を基材に固定化してあることを特徴とする医療用手当材を要件とするものである。 The present invention includes the peptide represented by SEQ ID NO: 8, the peptide represented by SEQ ID NO: 9, the peptide represented by SEQ ID NO: 10, and the sequence represented by SEQ ID NO: 11 among the above-described new findings by the present inventors. A peptide represented by SEQ ID NO: 12, a peptide represented by SEQ ID NO: 13, a peptide represented by SEQ ID NO: 14, and salts thereof, which are immobilized on a substrate. The medical care allowance material is required.
配列番号８で表されるペプチド、配列番号９で表されるペプチド、配列番号１０で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチド、配列番号１２で表されるペプチド、配列番号１３で表されるペプチド、配列番号１４で表されるペプチドおよびそれらの塩の少なくとも１種を基材に固定化してなる本発明の医療用手当材は、高い生理活性、特に強い細胞増殖促進作用および細胞接着作用を有し、創傷の治癒促進などの生体組織の修復するための創傷被覆材、生体組織の接着促進材料、骨補強材、軟骨再生材、神経再生材などとして有効に使用することができ、難治性潰瘍などの難治性創傷の治療に有用である。 Peptide represented by SEQ ID NO: 8, peptide represented by SEQ ID NO: 9, peptide represented by SEQ ID NO: 10, peptide represented by SEQ ID NO: 11, peptide represented by SEQ ID NO: 12, table represented by SEQ ID NO: 13 The medical care material of the present invention comprising at least one peptide selected from the group consisting of the peptide represented by SEQ ID NO: 14 and salts thereof, has a high physiological activity, particularly a strong cell growth promoting action and cell adhesion. It has an action and can be effectively used as a wound dressing material for repairing biological tissue such as promoting healing of wounds, adhesion promoting material for biological tissue, bone reinforcing material, cartilage regeneration material, nerve regeneration material, etc. It is useful for the treatment of intractable wounds such as intractable ulcers.
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の医療用手当材では、配列番号８で表されるペプチド、配列番号９で表されるペプチド、配列番号１０で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチド、配列番号１２で表されるペプチド、配列番号１３で表されるペプチド、配列番号１４で表されるペプチドおよびそれらの塩の少なくとも１種を基材に固定化してある。
ここで、本発明でいう「医療用手当材」とは、上記した特定のペプチドおよび／またはその塩を基材に固定化した状態で、擦過創、切創、挫創などの一般外傷；採皮創、削皮創などの手術創；熱傷；潰瘍；褥瘡；前記以外の各種創傷などからなる患部に当てて用いることによって患部からの滲出液の吸収、該滲出液の保持、患部への菌類の感染や増殖の防止、患部の治癒促進させるために用いる材、生体組織の接着促進のために用いる材、骨の補強のために用いる材、軟骨の再生促進のために用いる材、神経の再生促進のために用いる材などの総称をいう。
The present invention is described in detail below.
In the medical care material of the present invention, the peptide represented by SEQ ID NO: 8, the peptide represented by SEQ ID NO: 9, the peptide represented by SEQ ID NO: 10, the peptide represented by SEQ ID NO: 11, the table represented by SEQ ID NO: 12 The peptide represented by SEQ ID NO: 13, the peptide represented by SEQ ID NO: 14, and salts thereof are immobilized on a substrate.
Here, the “medical care material” as used in the present invention refers to general trauma such as scratched wounds, cut wounds, and wounds in a state where the above-mentioned specific peptide and / or salt thereof is immobilized on a base material; Surgical wounds such as wounds, skin wounds, etc .; burns; ulcers; pressure ulcers; by applying to wounds such as various wounds other than those mentioned above, absorption of exudate from the affected area, retention of the exudate, and fungi on the affected area Materials used to prevent infection and proliferation, promote healing of affected areas, materials used to promote adhesion of living tissue, materials used to reinforce bone, materials used to promote cartilage regeneration, nerve regeneration promotion This is a general term for materials used for the purpose.
本発明の医療用手当材は、配列番号８で表されるペプチド、配列番号９で表されるペプチド、配列番号１０で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチド、配列番号１２で表されるペプチド、配列番号１３で表されるペプチド、配列番号１４で表されるペプチドおよびそれらの塩の少なくとも１種を基材に固定化してあるものであればいずれでもよい。 The medical care material of the present invention includes a peptide represented by SEQ ID NO: 8, a peptide represented by SEQ ID NO: 9, a peptide represented by SEQ ID NO: 10, a peptide represented by SEQ ID NO: 11, and a peptide represented by SEQ ID NO: 12. Any peptide may be used as long as at least one of the peptide represented by SEQ ID NO: 13, the peptide represented by SEQ ID NO: 14, the peptide represented by SEQ ID NO: 14, and salts thereof is immobilized on a substrate.
本発明の医療用手当材に用いる配列番号８〜１４で表されるペプチドの化学構造を具体的に示すと、下記のとおりである。
（１）配列番号８で表されるペプチド：
Ａla−Ｇly−Ｔyr−Ｌys−Ｐro−Ａsp−Ｇlu−Ｇly−Ｌys−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ａla−Ｃys−Ｇlu−Ｇly−Ａsp−Ｓer−Ｇly−Ｇly−Ｐro−Ｐhe−Ｖal
（２）配列番号９で表されるペプチド：
Ｃys−Ｌeu−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｖal−Ａla−Ｍet−Ｈis−Ｉle−Ｇlu−Ｓer−Ｌeu−Ａsp−Ｓer−Ｔyr−Ｔhr−Ｃys
（３）配列番号１０で表されるペプチド：
Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｖal−Ａla−Ｖal
（４）配列番号１１で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｌys−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｖal−Ａla−Ｖal
（５）配列番号１２で表されるペプチド：
Ａsn−Ｐro−Ｇly−Ａla−Ｓer−Ａla−Ａla−Ｐro−Ｃys−Ｃys−Ｖal−Ｐro−Ｇln−Ａla−Ｌeu−Ｇlu
（６）配列番号１３で表されるペプチド：
Ｖal−Ｇly−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly
（７）配列番号１４で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｌys−Ｖal−Ｇly−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly
Specifically, the chemical structure of the peptide represented by SEQ ID NOs: 8 to 14 used in the medical care material of the present invention is as follows.
(1) Peptide represented by SEQ ID NO: 8:
Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val
(2) Peptide represented by SEQ ID NO: 9:
Cys-Leu-Asn-Gly-Gly-Val-Ala-Met-His-Ile-Glu-Ser-Leu-Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys
(3) Peptide represented by SEQ ID NO: 10:
Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val
(4) Peptide represented by SEQ ID NO: 11
Ac-Lys-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val
(5) Peptide represented by SEQ ID NO: 12:
Asn-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro-Gln-Ala-Leu-Glu
(6) Peptide represented by SEQ ID NO: 13:
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
(7) Peptide represented by SEQ ID NO: 14:
Ac-Lys-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly
また、本発明に関連するものとして、一般式（Ｉ）；Ｘ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｇ−Ｊ−Ｌ−Ｍ−Pro−Ｑ−Ｙで表されるペプチドおよびそれらの塩の少なくとも１種を基材に固定化してある医療用手当材がある。
一般式（Ｉ）で表されるペプチドは、上記したように、本発明者らが初めて見出した新規なペプチドであって、該一般式（Ｉ）において、Ｘは水素、ＣＨ3−ＣＯ−およびＣＨ3−ＣＯ−Ｌys−から選ばれる基であり、ＡはＳerおよびＴhrから選ばれるアミノ酸残基であり、ＤはＩle、ＶalおよびＬeuから選ばれるアミノ酸残基であり、ＥはＬysおよびＡrgから選ばれるアミノ酸残基であり、ＧはＩle、ＶalおよびＬeuから選ばれるアミノ酸残基であり、ＪはＧlyおよびＡlaから選ばれるアミノ酸残基であり、ＬはＩle、ＶalおよびＬeuから選ばれるアミノ酸残基であり、ＭはＧlyおよびＡlaから選ばれるアミノ酸残基であり、ＱはＧly、ＡlaおよびＧly−Ｌys−Ｌys−Ｇlyから選ばれるアミノ酸残基またはペプチド残基であり、そしてＹは−ＯＨおよび−ＮＨ２から選ばれる基である。
Ｘ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｌ、Ｍ、ＱおよびＹが前記した以外の基である場合は、細胞増殖促進作用、細胞接着促進作用などの生理活性が弱い。
In addition, as related to the present invention, at least one of peptides represented by the general formula (I); X-A-D-E-G-J-LM-Pro-Q-Y and salts thereof There is a medical care material that is fixed to a base material.
As described above, the peptide represented by the general formula (I) is a novel peptide first found by the present inventors, and in the general formula (I), X represents hydrogen, CH 3 —CO— and CH 3 —CO—Lys— is a group, A is an amino acid residue selected from Ser and Thr, D is an amino acid residue selected from Ile, Val and Leu, and E is from Lys and Arg. G is an amino acid residue selected from Ile, Val and Leu, J is an amino acid residue selected from Gly and Ala, and L is an amino acid residue selected from Ile, Val and Leu. M is an amino acid residue selected from Gly and Ala, Q is an amino acid residue or peptide residue selected from Gly, Ala and Gly-Lys-Lys-Gly, and Y is —OH and -N Is a group selected from 2.
When X, A, D, E, G, J, L, M, Q, and Y are groups other than those described above, physiological activities such as cell growth promoting action and cell adhesion promoting action are weak.
上記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドとしては、以下の一般式（Ｉ−ａ)、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）および（Ｉ−ｄ）で表されるペプチドが挙げられる。
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa （Ｉ−ａ）
［上記の式（Ｉ−ａ）中、左から１番目のXaaはSer、AcSer、ThrまたはAcThrであり、２番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、３番目のXaaはLysまたはArgであり、４番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、５番目のXaaはGlyまたはAlaであり、６番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、７番目のXaaはGlyまたはAlaであり、９番目のXaaはGly、GlyNH2、AlaまたはAlaNH2である。］
Examples of the peptide represented by the general formula (I) include peptides represented by the following general formulas (Ia), (Ib), (Ic), and (Id). .
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa (Ia)
[In the above formula (Ia), the first Xaa from the left is Ser, AcSer, Thr or AcThr, the second Xaa is Ile, Val or Leu, and the third Xaa is Lys or Arg. Yes, 4th Xaa is Ile, Val or Leu, 5th Xaa is Gly or Ala, 6th Xaa is Ile, Val or Leu, 7th Xaa is Gly or Ala, The ninth Xaa is Gly, GlyNH 2 , Ala or AlaNH 2 . ]
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa （Ｉ−ｂ）
［上記の式（Ｉ−ｂ）中、左から１番目のLysはAcLysであり、２番目のXaaはSerまたはThrであり、３番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、４番目のXaaはLysまたはArgであり、５番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、６番目のXaaはGlyまたはAlaであり、７番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、８番目のXaaはGlyまたはAlaであり、１０番目のXaaはGly、GlyNH2、AlaまたはAlaNH2である。］
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa (Ib)
[In the above formula (Ib), the first Lys from the left is AcLys, the second Xaa is Ser or Thr, the third Xaa is Ile, Val or Leu, and the fourth Xaa Is Lys or Arg, the fifth Xaa is Ile, Val or Leu, the sixth Xaa is Gly or Ala, the seventh Xaa is Ile, Val or Leu, and the eighth Xaa is Gly Or Ala, and the tenth Xaa is Gly, GlyNH 2 , Ala or AlaNH 2 . ]
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Lys Lys Gly （Ｉ−ｃ）
［上記の式（Ｉ−ｃ）中、左から１番目のXaaはSer、AcSer、ThrまたはAcThrであり、２番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、３番目のXaaはLysまたはArgであり、４番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、５番目のXaaはGlyまたはAlaであり、６番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、７番目のXaaはGlyまたはAlaであり、１２番目のGlyはGlyまたはGlyNH2である。］
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Lys Lys Gly (Ic)
[In the above formula (Ic), the first Xaa from the left is Ser, AcSer, Thr or AcThr, the second Xaa is Ile, Val or Leu, and the third Xaa is Lys or Arg. Yes, 4th Xaa is Ile, Val or Leu, 5th Xaa is Gly or Ala, 6th Xaa is Ile, Val or Leu, 7th Xaa is Gly or Ala, 12 th Gly is Gly or GlyNH 2. ]
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Lys Lys Gly （Ｉ−ｄ）
［上記の式（Ｉ−ｄ）中、左から１番目のLysはAcLysであり、２番目のXaaはSerまたはThrであり、３番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、４番目のXaaはLysまたはArgであり、５番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、６番目のXaaはGlyまたはAlaであり、７番目のXaaはIle、ValまたはLeuであり、８番目のXaaはGlyまたはAlaであり、１３番目のGlyはGlyまたはGlyNH2である。］
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Lys Lys Gly (Id)
[In the above formula (Id), the first Lys from the left is AcLys, the second Xaa is Ser or Thr, the third Xaa is Ile, Val or Leu, and the fourth Xaa Is Lys or Arg, the fifth Xaa is Ile, Val or Leu, the sixth Xaa is Gly or Ala, the seventh Xaa is Ile, Val or Leu, and the eighth Xaa is Gly Or it is Ala and the 13th Gly is Gly or GlyNH 2 . ]
一般式（Ｉ）で表されるペプチドの具体例としては、下記の（８）〜（１４）のペプチドを挙げることができる。
（８）配列番号１で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｌys−Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly
（９）配列番号２で表されるペプチド：
Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｉle−Ａla−Ｉle−Ａla−Ｐro−Ｇly
（１０）配列番号３で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｓer−Ｖal−Ａrg−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly
（１１）配列番号４で表されるペプチド：
Ｔhr−Ｉle−Ｌys−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly
（１２）配列番号５で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｌys−Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｉle−Ａla−Ｉle−Ａla−Ｐro−Ｇly
（１３）配列番号６で表されるペプチド：
Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly−Ｌys−Ｌys−Ｇly
（１４）配列番号７で表されるペプチド：
Ａｃ−Ｌys−Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｖal−Ｇly−Ｖal−Ｇly−Ｐro−Ｇly
Specific examples of the peptide represented by the general formula (I) include the following peptides (8) to (14).
(8) Peptide represented by SEQ ID NO: 1
Ac-Lys-Ser-Ile-Arg-Val-Ala-Val-Ala-Pro-Gly
(9) Peptide represented by SEQ ID NO: 2
Ser-Ile-Arg-Ile-Ala-Ile-Ala-Pro-Gly
(10) Peptide represented by SEQ ID NO: 3
Ac-Ser-Val-Arg-Val-Ala-Val-Ala-Pro-Gly
(11) Peptide represented by SEQ ID NO: 4
Thr-Ile-Lys-Val-Ala-Val-Ala-Pro-Gly
(12) Peptide represented by SEQ ID NO: 5:
Ac-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Ala-Ile-Ala-Pro-Gly
(13) Peptide represented by SEQ ID NO: 6:
Ser-Ile-Arg-Val-Ala-Val-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Gly
(14) Peptide represented by SEQ ID NO: 7
Ac-Lys-Ser-Ile-Arg-Val-Gly-Val-Gly-Pro-Gly
上記した（１）〜（１４）のペプチド（配列番号８〜１４のペプチドおよび配列番号１〜７のペプチド）のうちで、本発明者らが初めて見出した新規なペプチドである上記（８）〜（１４）のペプチド（配列番号１〜配列番号７のペプチド）は、高い生理活性、特に強い細胞増殖促進作用および細胞接着促進作用を有し、創傷の治癒、生体組織の接着、骨の補強、軟骨の再生、神経の再生などに極めて有効に作用する。 Among the peptides (1) to (14) described above (peptides of SEQ ID NOs: 8 to 14 and peptides of SEQ ID NOs: 1 to 7), the above-mentioned (8) to The peptide of (14) (the peptide of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7) has a high physiological activity, particularly a strong cell growth promoting action and a cell adhesion promoting action, wound healing, biological tissue adhesion, bone reinforcement, It works extremely effectively on cartilage regeneration and nerve regeneration.
また、本発明の医療用手当材では上記したペプチドの生理学的に許容される塩を用いてもよく、例えば、上記したペプチドと、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩；乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムなどの金属の水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどの有機塩基との塩などを挙げることができる。それらの塩は、上記したペプチドに対して通常の塩形成反応を利用することにより得ることができる。 Further, the medical care material of the present invention may use physiologically acceptable salts of the above-mentioned peptides, for example, salts of the above-mentioned peptides with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid; lactic acid, Salts with organic acids such as tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, oxalic acid, malic acid, citric acid, oleic acid, palmitic acid; alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium, metals such as aluminum And salts with an organic base such as triethylamine, benzylamine, diethanolamine, t-butylamine, dicyclohexylamine, and arginine. Those salts can be obtained by utilizing a normal salt formation reaction for the above-mentioned peptides.
本発明の医療用手当材では、ペプチドを固定化するための基材として、創傷被覆材やその他の医療用手当材において従来から用いられている生理的に許容され得る基材であればいずれも使用可能であり、例えば、各種含水ゲルまたは含水性ゲル、ポリウレタンフイルムなどのプラスチックフイルム、ハイドロコロイド、アルギン酸塩繊維からなる不織布、ポリビニルアルコール系スポンジなどを用いることができる。そのうちでも、本発明の医療用手当材ではペプチドを固定化するための基材として含水ゲルまたは含水性ゲルが好ましく用いられる。 In the medical care material of the present invention, any physiologically acceptable base material conventionally used in wound dressings and other medical care materials as a base material for immobilizing peptides may be used. For example, various water-containing gels or water-containing gels, plastic films such as polyurethane films, hydrocolloids, nonwoven fabrics made of alginate fibers, polyvinyl alcohol sponges, and the like can be used. Among them, in the medical care material of the present invention, a hydrogel or a hydrogel is preferably used as a base material for immobilizing peptides.
その際の含水ゲルまたは含水性ゲルとしては、細胞毒性のない含水ゲルまたは含水性ゲルがより好ましく用いられ、例えば、アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、セルロースおよびこれらの誘導体などの多糖類；ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミンなどの蛋白質；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリペプチド；ポリビニルアルコール系重合体、エチレン／ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸およびこれらの誘導体などの高分子材料からなる含水ゲルまたは含水性ゲルを挙げることができる。
そして、基材に用いる含水ゲルまたは含水性ゲルとしては、特に、本発明者らの発明したアルギン酸共有結合架橋ゲル（特許文献７を参照）、および本発明者らの発明した下記の（イ）および（ロ）のポリビニルアルコール系重合体から主としてなる含水ゲルまたは含水性ゲルが一層好ましく用いられ、これらの含水ゲルおよび含水性ゲルは、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性、強度などの点で優れた特性を備えている。
As the water-containing gel or water-containing gel at that time, a water-containing gel or water-containing gel having no cytotoxicity is more preferably used. For example, polysaccharides such as alginic acid, chitin, chitosan, hyaluronic acid, cellulose and derivatives thereof; gelatin Proteins such as collagen, casein and albumin; polypeptides such as polyaspartic acid, polyglutamic acid and polylysine; polyvinyl alcohol polymers, ethylene / vinyl alcohol copolymers, polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyacrylic acid and derivatives thereof Examples thereof include a hydrogel or a hydrogel made of a polymer material such as.
And as the hydrous gel or hydrous gel used for the substrate, in particular, the alginic acid covalently crosslinked gel (see Patent Document 7) invented by the present inventors, and the following (a) invented by the present inventors And (b) a hydrous gel or hydrous gel mainly composed of a polyvinyl alcohol polymer, these hydrous gels and hydrous gels are stable, flexible, transparent, heat resistant, moist heat resistant, Excellent characteristics in terms of strength.
（イ） 下記の一般式（ｉ）； (A) the following general formula (i);
（式中、Ｒ1は水素原子または１価の炭化水素基であり、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立して１価の炭化水素基であるか又はＲ2とＲ3が一緒になってそれらが結合している炭素原子と共に環を形成するか、或いはＲ1、Ｒ2およびＲ3が一緒になってそれらが結合している炭素原子と共に環を形成している。）
で示される構造単位を５〜５０モル％有し、かつ下記の数式（１）
η＝［ＯＨ、ＶＥＳ］／２［ＯＨ］［ＶＥＳ］ （１）
（式中、［ＯＨ、ＶＥＳ］はポリビニルアルコール系重合体が有するメチレン炭素のうちで水酸基が結合したメチン炭素とアシルオキシ基が結合したメチン炭素に挟まれたもののモル分率を示し、［ＯＨ］はビニルアルコール単位のモル分率を示し、そして［ＶＥＳ］は上記の一般式（ｉ）で表される構造単位のモル分率を示す。）
で表されるブロックキャラクター（η）が０．６以下である粘度平均重合度３００以上のポリビニルアルコール系重合体（特許文献８を参照）。
(In the formula, R 1 is a hydrogen atom or a monovalent hydrocarbon group, and R 2 and R 3 are each independently a monovalent hydrocarbon group, or R 2 and R 3 are taken together. Form a ring with the carbon atom to which R is attached, or R 1 , R 2 and R 3 together form a ring with the carbon atom to which they are attached.)
5 to 50 mol% of the structural unit represented by the formula (1)
η = [OH, VES] / 2 [OH] [VES] (1)
(In the formula, [OH, VES] indicates the molar fraction of the methylene carbon of the polyvinyl alcohol polymer sandwiched between the methine carbon bonded with a hydroxyl group and the methine carbon bonded with an acyloxy group, and [OH] Represents the mole fraction of vinyl alcohol units, and [VES] represents the mole fraction of structural units represented by the above general formula (i).)
A polyvinyl alcohol-based polymer having a viscosity average polymerization degree of 300 or more and having a block character (η) of 0.6 or less (see Patent Document 8).
（ロ） 上記の一般式（ｉ）で表される構造単位を０．０５〜０．５０のモル分率で含有し、且つ下記の一般式（ii）； (B) The structural unit represented by the general formula (i) is contained in a molar fraction of 0.05 to 0.50, and the following general formula (ii);
[式中、Ｘ1は、式−ＣＯ−Ｙ1、式−Ｙ1又は式−ＣＯ−ＣＯＯＨで表される基（前記式中Ｙ1は、カルボキシル基、スルホン酸基、アミノ基及びリン酸基から選ばれる少なくとも１種の極性基で変性された炭化水素基、またはカルボキシル基、スルホン酸基、アミノ基およびリン酸基から選ばれる少なくとも１種の極性基を有する基で変性された炭化水素基を示す）であるか、或いはそれが結合している酸素原子と共にリン酸基を形成している］
で表される構造単位の少なくとも１種を、０．０００１〜０．５０のモル分率、好ましくは下記の数式（２）；
{(１−Ｃest)×Ｃest}×０.０１≦Ｃpol＜{(１−Ｃest)×Ｃest｝×２.０ （２）
［式中、Ｃpolは上記の一般式（ii）で表される構造単位のモル分率、そしてＣestは上記の一般式（ｉ）で表される構造単位のモル分率を示す］
を満足するモル分率で含有するポリビニルアルコール系重合体（特許文献９を参照）。
Wherein, X 1 is the formula -CO-Y 1, wherein -Y 1 or formula -CO-COOH, a group represented by (In the formula Y 1 is a carboxyl group, a sulfonic acid group, amino group and phosphoric acid Hydrocarbon group modified with at least one polar group selected from a group, or hydrocarbon modified with a group having at least one polar group selected from a carboxyl group, a sulfonic acid group, an amino group and a phosphoric acid group Or forming a phosphate group with the oxygen atom to which it is attached]
At least one of the structural units represented by the formula (2): a molar fraction of 0.0001 to 0.50, preferably the following formula (2);
{(1-C est ) × C est } × 0.01 ≦ C pol <{(1-C est ) × C est } × 2.0 (2)
[ Wherein C pol represents the mole fraction of the structural unit represented by the general formula (ii) and C est represents the mole fraction of the structural unit represented by the general formula (i)]
Polyvinyl alcohol polymer containing a molar fraction that satisfies the above (see Patent Document 9).
本発明の医療用手当材における基材として好ましく用いられる含水ゲルまたは含水性ゲルは、水で膨潤した状態（含水ゲル）であっても、水で膨潤する前の乾燥した状態（含水性ゲル）であっても、または完全には水で膨潤していないが水を多少含んだ状態であってもよい。 Even if the water-containing gel or water-containing gel preferably used as the base material in the medical care material of the present invention is in a state swollen with water (water-containing gel), it is in a dried state before being swollen with water (water-containing gel). Or it may not be completely swollen with water but may contain some water.
上記したペプチドおよび／またはその塩を基材に固定化する方法は特に制限されず、ペプチドの生理活性が失われず、しかもペプチドが基材から離れずに固定化され得る方法であればいずれの方法で固定化してもよい。基材の種類やペプチドの種類などに応じて好ましい固定化方法は異なり得るが、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いる活性エステル法、水溶性カルボジイミドを用いる直接縮合法などが好ましく採用される。
また、基材へのペプチドの固定化量は、医療用手当材の用途、基材の種類、基材の形状や構造、医療用手当材が用いられる患部の状態などに応じて種々調節することができる。
さらに、ペプチドを固定化する基材の形状も特に制限されず、例えば、フィルム状、シート状、小塊状、大塊状、粉末状、ペレット状、管状、線状、繊維状、布帛状、網状などの形態にしておくことができる。
The method for immobilizing the peptide and / or salt thereof on the base material is not particularly limited, and any method can be used as long as the physiological activity of the peptide is not lost and the peptide can be immobilized without leaving the base material. It may be fixed with. The preferred immobilization method may vary depending on the type of substrate and the type of peptide, but for example, an active ester method using N-hydroxysuccinimide, a direct condensation method using water-soluble carbodiimide, etc. are preferably employed.
In addition, the amount of peptide immobilized on the base material should be variously adjusted according to the use of the medical dressing material, the type of base material, the shape and structure of the base material, the state of the affected part where the medical dressing material is used Can do.
Furthermore, the shape of the substrate on which the peptide is immobilized is not particularly limited. For example, a film shape, a sheet shape, a small lump shape, a large lump shape, a powder shape, a pellet shape, a tubular shape, a linear shape, a fibrous shape, a fabric shape, a net shape, etc. It can be made into the form.
配列番号８〜配列番号１４で表されるペプチド、上記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドおよびそれらの塩から選ばれる少なくとも１種を固定化してなる医療用手当材は、擦過創、切創、挫創などの一般外傷；採皮創、削皮創などの手術創；熱傷；潰瘍；褥瘡；前記以外の各種創傷などからなる患部に当てて用いて患部からの滲出液の吸収、該滲出液の保持、患部への菌類の感染や増殖の防止、患部の治癒促進させるための創傷被覆材として、さらには骨などの生体組織の接着促進、骨の補強、軟骨の再生促進、神経の再生促進などの用途に有効に使用することができる。 A medical care material obtained by immobilizing at least one selected from the peptides represented by SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14, the peptide represented by the above general formula (I), and salts thereof, General wounds such as wounds and wounds; Surgical wounds such as skin wounds and skin wounds; Burns; Ulcers; Pressure sores; Absorption of exudate from affected areas by applying to wounds such as various wounds Retention of fluid, prevention of fungal infection and growth of affected area, wound dressing to promote healing of affected area, further adhesion of living tissue such as bone, bone reinforcement, promotion of cartilage regeneration, nerve regeneration It can be used effectively for applications such as promotion.
さらに、上記の一般式（Ｉ）で表される新規なペプチドおよび／またはその塩、特に配列番号１〜配列番号７で表される新規なペプチドおよび／またはそれらの塩は、それ自体で高い生理活性、特に強い細胞増殖促進作用や細胞接着活性を有し、上記した各種創傷の治癒作用、生体組織の接着作用、骨の補強作用、軟骨の再生作用、神経の再生作用などを有しているので、基材に固定化せずに、そのまま遊離の状態で、単独で、または他の成分との併用下に、例えば、経口、塗布、注射、埋植などによって患者に投与することができる。そのため、上記の一般式（Ｉ）で表される新規なペプチドおよび／またはその塩、特に配列番号１〜配列番号７で表される新規なペプチドおよび／またはそれらの塩は、細胞増殖促進および／または細胞接着促進用の剤として使用することができる。それらの剤は、特に生体組織の治癒、接着、補強および／または再生用の剤として有効である。 Furthermore, the novel peptide represented by the above general formula (I) and / or a salt thereof, in particular, the novel peptide represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 and / or a salt thereof are themselves highly physiological. Activity, especially strong cell growth promoting action and cell adhesion activity, and various wound healing, biological tissue adhesion, bone reinforcement, cartilage regeneration, nerve regeneration, etc. Therefore, it can be administered to a patient, for example, orally, by application, injection, implantation, etc., without being immobilized on a substrate, in a free state as it is, alone or in combination with other components. Therefore, the novel peptide represented by the above general formula (I) and / or a salt thereof, particularly the novel peptide represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 and / or a salt thereof, Alternatively, it can be used as an agent for promoting cell adhesion. These agents are particularly effective as agents for healing, adhesion, reinforcement and / or regeneration of living tissue.
上記の一般式（Ｉ）で表される新規なペプチドの合成法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば固相合成法、液相合成法などによって合成することができ、そのうちでも固相合成法が操作が簡便であるなどの点から好ましく用いられる。何ら限定されるものではないが、ペプチドの固相合成法に関しては、例えば非特許文献１２などに記載されている。 The method for synthesizing the novel peptide represented by the above general formula (I) is not particularly limited and can be produced in the same manner as a conventionally known method for synthesizing a peptide. For example, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis Among them, the solid phase synthesis method is preferably used because it is easy to operate. Although not limited in any way, the solid phase synthesis method of peptides is described in Non-Patent Document 12, for example.
限定されるものではないが、固相合成法によるペプチドの製造は、例えば、反応溶媒に不溶性なスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの樹脂に目的とするペプチドのカルボキシル末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−カルボキシル基を介して結合させ、次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのアミノ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−カルボキシル基以外のα−アミノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ酸などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作を順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を樹脂から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより、目的とするペプチドを得、それを精製することにより行われる。
その際に、樹脂からのペプチド鎖の脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制できる点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は、例えば、逆相液体クロマトグラフィーによって好ましく行われる。
Although not limited, the production of a peptide by a solid phase synthesis method is performed by, for example, adding an amino acid corresponding to the carboxyl terminus of a target peptide to a resin such as a styrene-divinylbenzene copolymer insoluble in a reaction solvent. An α-carboxyl group other than the α-carboxyl group that the amino acid or peptide fragment has, in the direction of the amino terminus of the peptide of interest, and then the corresponding amino acid or peptide fragment. An operation of condensing and bonding a functional group such as an amino group, and an operation of removing a protecting group of an amino group that forms a peptide bond such as an α-amino acid in the bonded amino acid or peptide fragment are sequentially repeated. The peptide chain corresponding to the target peptide. Chain to form, followed by removal of the protecting group from the functional groups which are desorbed, and protect the peptide chain from the resin is performed by the resulting peptides of interest, purification.
In that case, it is preferable to remove the peptide chain from the resin and to remove the protecting group at the same time using trifluoroacetic acid from the viewpoint of suppressing side reactions. Moreover, purification of the obtained peptide is preferably performed by, for example, reverse phase liquid chromatography.
上記した新規なペプチドおよびその塩は、高い生理活性、特に強い細胞増殖促進作用、細胞接着促進作用を有し且つ低毒性であることが、生理活性試験および毒性試験によって確認されている。 It has been confirmed by physiological activity tests and toxicity tests that the above-mentioned novel peptides and salts thereof have high physiological activity, particularly strong cell growth promoting action, cell adhesion promoting action and low toxicity.
以下に実施例によって本発明について具体的に説明するが、本発明はそれにより何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereby.
《参考例１》
［配列番号１で表されるペプチド（Ａｃ−Ｌys−Ｓer−Ｉle−Ａrg−Ｖal−Ａla−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｇly）の製造］
（１） ４−ヒドロキシメチル−フェノキシ−メチル基を０．８９ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン／ジビニルベンゼン共重合体（９９／１モル比）からなる粒状樹脂（米国アプライド・バイオシステムズ社製「ＨＭＰレジン」）０．２５ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させて、配列番号１で表されるペプチドを合成した。
その際に、上記合成反応（結合反応）では、原料アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（Ｆｍｏｃアラニン）、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシン（Ｆｍｏｃグリシン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎｇ−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル−Ｌ−アルギニン（Ｆｍｏｃアルギニン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃプロリン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−バリン（Ｆｍｏｃバリン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−イソロイシン（Ｆｍｏｃイソロイシン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（Ｆｍｏｃリジン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃセリン）を、それぞれ１ミリモル用いた。
<< Reference Example 1 >>
[Production of peptide represented by SEQ ID NO: 1 (Ac-Lys-Ser-Ile-Arg-Val-Ala-Val-Ala-Pro-Gly)]
(1) Granular resin (US Applied Biosystems) comprising a styrene / divinylbenzene copolymer (99/1 molar ratio) having a 4-hydroxymethyl-phenoxy-methyl group at a ratio of 0.89 mmol / g (resin) The peptide represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized by linking the corresponding amino acids sequentially from the carboxyl terminus to the amino terminus of the target peptide using 0.25 mmol of “HMP resin” manufactured by the company.
At that time, in the above synthesis reaction (binding reaction), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-alanine (Fmocalanine), Nα-9- (fluorene) manufactured by Applied Biosystems, Inc. as a raw material amino acid was used. Nylmethoxycarbonyl) -glycine (Fmoc glycine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -Ng-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl-L-arginine (Fmoc arginine), Nα- (fluorenylmethoxy) Carbonyl) -L-proline (Fmoc proline), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-valine (Fmoc valine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -isoleucine (Fmoc isoleucine), Nα- (fluore) Nylmethoxycarbonyl) -Nε- (t-bu Toxicarbonyl) -L-lysine (Fmoc lysine) and Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -O- (t-butyl) -L-serine (Fmoc serine) were each used in an amount of 1 mmol.
（２） 上記（１）で得られたペプチド−樹脂に、ＤＭＦ中で無水酢酸０．９６Ｍを、トリエチルアミン３２．６ｍＭ 下で３時間反応させ、アセチル化を行った。
（３） 上記（２）で得られたペプチド−樹脂に、５％の水、５％のチオアニソール、７．５％のフェノール、２．５％のエタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌを添加して６時間処理して、ペプチドの保護基の脱離と、固相（樹脂）からのペプチド脱離を行った。それによって生成した溶液をジエチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させ、生成した沈殿をジエチルエーテルで数回洗浄して、粗生成物（粗製ペプチド）を得た。
（４） 上記（３）で得られた粗生成物を、分取用高速液体クロマトグラフィー（カラム：デルタパックＣ１８ ４７×３００ｍｍ プレップパック１０００加圧モジュール付）（ミリポア・ウォーターズ社製）で精製し、それにより得られた精製ペプチドを、分析用高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製「ＬＣ６Ａ」、カラム：東ソー株式会社製「ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ ＣＴＲ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒）に付し、アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に徐々に変化させたところ、１４．４分の位置に単一のピークが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は１０３９であり（分子量の理論値＝１０３９．１８）、配列番号１で表されるペプチドであることが確認された。
(2) The peptide-resin obtained in (1) above was reacted with 0.96 M acetic anhydride in DMF for 3 hours under 32.6 mM triethylamine to perform acetylation.
(3) Add 10 ml of trifluoroacetic acid containing 5% water, 5% thioanisole, 7.5% phenol, 2.5% ethanedithiol to the peptide-resin obtained in (2) above. Then, the peptide was removed from the solid phase (resin). The resulting solution was added to diethyl ether to precipitate the peptide, and the resulting precipitate was washed several times with diethyl ether to obtain a crude product (crude peptide).
(4) The crude product obtained in (3) above is purified by preparative high performance liquid chromatography (column: Deltapack C18 47 x 300 mm with preppack 1000 pressure module) (Millipore Waters). The purified peptide thus obtained was analyzed by high performance liquid chromatography (“LC6A” manufactured by Shimadzu Corporation, column: “TSKgel ODS-80TM CTR manufactured by Tosoh Corporation”, mobile phase: containing 0.05% by volume of trifluoroacetic acid. When the acetonitrile concentration was gradually changed from 5% by volume to 50% by volume over 30 minutes, a single peak was shown at the position of 14.4 minutes. The molecular weight of the purified peptide determined by legal mass spectrum is 1039 (theoretical value of molecular weight = 1039.18). It was confirmed to be the peptide represented by column number 1.
《参考例２〜７》
［配列番号２〜配列番号７で表されるペプチドの製造］
参考例１と同様にして合成反応（結合反応）を行って、配列番号２で表されるペプチド、配列番号３で表されるペプチド、配列番号４で表されるペプチド、配列番号５で表されるペプチド、配列番号６で表されるペプチドおよび配列番号７で表されるペプチドをそれぞれ合成した。
それにより得られた配列番号３、５および７のペプチドについて、参考例１と同様にしてアセチル化および保護基の脱離と固相（樹脂）からの脱離を行って粗生成物（粗製ペプチド）を得て、それを精製した。
また、配列番号２、４および６のペプチドは、アセチル化を行わず、保護基の脱離と固相（樹脂）からの脱離を行って粗生成物（粗製ペプチド）を得て、それを精製した。
それぞれの精製ペプチドについて、参考例１と同様の分析用高速液体クロマトグラフィーを行ったときの溶出時間、およびＦＡＢ法マススペクトル測定により求めた分子量は、下記の表１に示すとおりであった。
なお、その際に、参考例２〜３（配列番号２〜配列番号３で表されるペプチドの合成）および参考例５〜７（配列番号５〜配列番号７で表されるペプチドの合成）では、原料アミノ酸として、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから各々のペプチドの合成に必要なアミノ酸を選んで用いた。
また、参考例４（配列番号４で表されるペプチドの合成）では、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから必要なアミノ酸を選んで用いると共に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−トレオニン（Ｆｍｏｃトレオニン）を更に使用した。
<< Reference Examples 2-7 >>
[Production of peptides represented by SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 7]
A synthesis reaction (binding reaction) was performed in the same manner as in Reference Example 1, and the peptide represented by SEQ ID NO: 2, the peptide represented by SEQ ID NO: 3, the peptide represented by SEQ ID NO: 4, and the peptide represented by SEQ ID NO: 5 The peptide represented by SEQ ID NO: 6 and the peptide represented by SEQ ID NO: 7 were respectively synthesized.
The peptides of SEQ ID NOs: 3, 5, and 7 thus obtained were subjected to acetylation and removal of the protecting group and removal from the solid phase (resin) in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a crude product (crude peptide ) And purified it.
In addition, the peptides of SEQ ID NOs: 2, 4 and 6 were not subjected to acetylation, and were subjected to elimination of the protecting group and elimination from the solid phase (resin) to obtain a crude product (crude peptide). Purified.
For each purified peptide, the elution time when the same analytical high performance liquid chromatography as in Reference Example 1 was performed, and the molecular weight determined by FAB method mass spectrum measurement were as shown in Table 1 below.
At that time, in Reference Examples 2 to 3 (synthesis of peptides represented by SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 3) and Reference Examples 5 to 7 (synthesis of peptides represented by SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7) As raw material amino acids, amino acids necessary for the synthesis of each peptide were selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1 and used.
In Reference Example 4 (synthesis of peptide represented by SEQ ID NO: 4), necessary amino acids are selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1, and Nα- (manufactured by Applied Biosystems, USA) is used. Fluorenylmethoxycarbonyl) -O- (t-butyl) -L-threonine (Fmoc threonine) was further used.
《参考例８〜１４》
［配列番号８〜配列番号１４で表されるペプチドの製造］
参考例１と同様にして合成反応（結合反応）を行って、配列番号８で表されるペプチド、配列番号９で表されるペプチド、配列番号１０で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチド、配列番号１２で表されるペプチド、配列番号１３で表されるペプチドおよび配列番号１４で表されるペプチドをそれぞれ合成した。
それにより得られた配列番号１１および１４のペプチドについて、参考例１と同様にしてアセチル化および保護基の脱離と固相からの脱離を行って粗生成物（粗製ペプチド）を得て、それを精製した。
また、配列番号８、９、１０、１２および１３のペプチドは、セチル化を行わず、保護基の脱離と固相（樹脂）からの脱離を行って粗生成物（粗製ペプチド）を得て、それを精製した。
それぞれの精製ペプチドについて、参考例１と同様の分析用高速液体クロマトグラフィーを行ったときの溶出時間、およびＦＡＢ法マススペクトル測定により求めた分子量は、下記の表１に示すとおりであった。
なお、その際に、参考例１０〜１１（配列番号１０〜配列番号１１で表されるペプチドの合成）および参考例１３〜１４（配列番号１３〜配列番号１４で表されるペプチドの合成）では、原料アミノ酸として、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから各々のペプチドの合成に必要なアミノ酸を選んで用いた。
<< Reference Examples 8-14 >>
[Production of peptides represented by SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14]
A synthesis reaction (binding reaction) was performed in the same manner as in Reference Example 1, and the peptide represented by SEQ ID NO: 8, the peptide represented by SEQ ID NO: 9, the peptide represented by SEQ ID NO: 10, and the peptide represented by SEQ ID NO: 11 The peptide represented by SEQ ID NO: 12, the peptide represented by SEQ ID NO: 13, and the peptide represented by SEQ ID NO: 14 were respectively synthesized.
The peptides of SEQ ID NOs: 11 and 14 thus obtained were subjected to acetylation and removal of the protecting group and removal from the solid phase in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a crude product (crude peptide). It was purified.
In addition, the peptides of SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 12 and 13 were not subjected to cetylation, but were subjected to elimination of the protecting group and elimination from the solid phase (resin) to obtain a crude product (crude peptide). It was purified.
For each purified peptide, the elution time when the same analytical high performance liquid chromatography as in Reference Example 1 was performed, and the molecular weight determined by FAB method mass spectrum measurement were as shown in Table 1 below.
At that time, in Reference Examples 10 to 11 (synthesis of peptides represented by SEQ ID NO: 10 to SEQ ID NO: 11) and Reference Examples 13 to 14 (synthesis of peptides represented by SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 14) As raw material amino acids, amino acids necessary for the synthesis of each peptide were selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1 and used.
また、上記において、参考例８（配列番号８で表されるペプチドの合成）では、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから必要なアミノ酸を選んで用いると共に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−チロシン（Ｆｍｏｃチロシン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−β−（ｔ−ブチルオキシ）−Ｌ−アスパラギン酸（Ｆｍｏｃアスパラギン酸）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−γ−（ｔ−ブチルオキシ）−Ｌ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃグルタミン酸）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃシステイン）、およびＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆｍｏｃフェニルアラニン）を更に使用した。 Further, in the above, in Reference Example 8 (synthesis of peptide represented by SEQ ID NO: 8), a necessary amino acid is selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1 and used, and manufactured by Applied Biosystems, USA. Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -O- (t-butyl) -L-tyrosine (Fmoc tyrosine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -β- (t-butyloxy) -L-aspartic acid (Fmoc) Aspartic acid), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -γ- (t-butyloxy) -L-glutamic acid (Fmoc glutamic acid), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -S-trityl-L-cysteine (Fmoc cysteine) ), And Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-phenylalanine ( Furthermore, using the moc phenylalanine).
また、上記において、参考例９（配列番号９で表されるペプチドの合成）では、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから必要なアミノ酸を選んで用いると共に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃシステイン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｆｍｏｃロイシン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（Ｆｍｏｃアスパラギン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニン（Ｆｍｏｃメチオニン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎ１Ｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（Ｆｍｏｃヒスチジン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−γ−（ｔ−ブチルオキシ）−Ｌ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃグルタミン酸）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−β−（ｔ−ブチルオキシ）−Ｌ−アスパラギン酸（Ｆｍｏｃアスパラギン酸）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−チロシン（Ｆｍｏｃチロシン）、およびＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−トレオニン（Ｆｍｏｃトレオニン）を更に使用した。 Further, in the above, in Reference Example 9 (synthesis of peptide represented by SEQ ID NO: 9), a necessary amino acid is selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1 and is used by Applied Biosystems, USA. Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -S-trityl-L-cysteine (Fmoc cysteine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-leucine (Fmoc leucine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl)- L-asparagine (Fmoc asparagine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-methionine (Fmoc methionine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -N1M-trityl-L-histidine (Fmoc histidine), Nα- (Fluorenylmethoxycarbonyl) -γ- (t- Tyloxy) -L-glutamic acid (Fmoc glutamic acid), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -β- (t-butyloxy) -L-aspartic acid (Fmoc aspartic acid), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -O -(T-Butyl) -L-tyrosine (Fmoc tyrosine) and Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -O- (t-butyl) -L-threonine (Fmoc threonine) were further used.
また、上記において、参考例１２（配列番号１２で表されるペプチドの合成）では、参考例１で使用した原料アミノ酸のうちから必要なアミノ酸を選んで用いると共に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（Ｆｍｏｃアスパラギン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃシステイン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン（Ｆｍｏｃグルタミン）、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｆｍｏｃロイシン）、およびＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−γ−（ｔ−ブチルオキシ）−Ｌ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃグルタミン酸）を更に使用した。 Further, in the above, in Reference Example 12 (synthesis of peptide represented by SEQ ID NO: 12), a necessary amino acid is selected from the raw material amino acids used in Reference Example 1 and used, and manufactured by Applied Biosystems, USA. Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-asparagine (Fmoc asparagine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -S-trityl-L-cysteine (Fmoc cysteine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl)- L-glutamine (Fmoc glutamine), Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -L-leucine (Fmoc leucine), and Nα- (fluorenylmethoxycarbonyl) -γ- (t-butyloxy) -L-glutamic acid (Fmoc) Glutamic acid) was further used.
《試験例１》
（１） 参考例１で得られた配列番号１で表されるペプチド、参考例４で得られた配列番号４で表されるペプチド、参考例５で得られた配列番号５で表されるペプチド、および配列［Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer］で表されるペプチド（株式会社ペプチド研究所製）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液５０μｌを、９６穴（９６ｗｅｌｌｓ）プレートに分注後、乾燥してそれぞれの穴に各々のペプチドを固定化した。
（２） 上記の（１）とは別に、参考例２で得られた配列番号２で表されるペプチドおよび参考例３で得られた配列番号３で表されるペプチドの０．５ｍｇ／ｍｌ ５０％アセトニトリル水溶液１００μｌを、９６穴（９６ｗｅｌｌｓ）プレートに分注後、乾燥してそれぞれの穴に各々のペプチドを固定化した。
（３） 次いで、上記（１）および（２）で各々のペプチドを固定化した各穴（ｗｅｌｌ）に、ＮＲＫ−４９細胞（正常ラット腎由来線維芽細胞）を２．５×１０3個／ｗｅｌｌの割合で投入し、５％ＣＯ2存在下に３７℃で４日間培養し、そのときの細胞の増殖状態を、ＤＮＡ量（ＬＳＱＭ Ａｓｓａｙ）により測定して、そのときの蛍光強度を求めたところ、下記の表２に示すとおりであった。
また、対照として、ペプチドを投入しない穴（ｗｅｌｌ）にも、上記と同様にしてＮＲＫ−４９細胞を２．５×１０3個／ｗｅｌｌの割合で投入し、５％ＣＯ2存在下に３７℃で４日間培養し、そのときの細胞の増殖状態を同様にして調べたところ、下記の表２に示すとおりであった。
<< Test Example 1 >>
(1) The peptide represented by SEQ ID NO: 1 obtained in Reference Example 1, the peptide represented by SEQ ID NO: 4 obtained in Reference Example 4, and the peptide represented by SEQ ID NO: 5 obtained in Reference Example 5 And 50 μl of a 1 mg / ml aqueous solution of a peptide represented by the sequence [Gly-Arg-Gly-Asp-Ser] (manufactured by Peptide Institute, Inc.) into 96-well (96 wells) plates, then dried and dried. Each peptide was immobilized in the hole.
(2) Separately from the above (1), 0.5 mg / ml of the peptide represented by SEQ ID NO: 2 obtained in Reference Example 2 and the peptide represented by SEQ ID NO: 3 obtained in Reference Example 3 100 μl of an aqueous acetonitrile solution was dispensed into a 96-well plate (96 wells) and dried to immobilize each peptide in each well.
(3) Next, 2.5 × 10 3 NRK-49 cells (normal rat kidney-derived fibroblasts) are added to each well in which each peptide is immobilized in (1) and (2) above. Wells were added at a rate of well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 4 days. The proliferation state of the cells at that time was measured by the amount of DNA (LSQM Assay), and the fluorescence intensity at that time was determined. However, it was as shown in Table 2 below.
In addition, as a control, NRK-49 cells were added at a rate of 2.5 × 10 3 cells / well in a well where no peptide was added, and 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. The cells were cultured for 4 days, and the growth state of the cells at that time was examined in the same manner as shown in Table 2 below.
上記の表２の結果から明らかなように、配列番号１〜配列番号５で表されるペプチドのいずれもが、細胞増殖刺激活性を有していた。従来公知の配列［Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer］は有意な細胞増殖刺激活性を示さなかった。 As is clear from the results in Table 2 above, all of the peptides represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5 had cell proliferation stimulating activity. The conventionally known sequence [Gly-Arg-Gly-Asp-Ser] did not show significant cell proliferation stimulating activity.
《実施例１〜２、参考例１５〜１６および比較例１》
（１）アルギン酸共有結合架橋ゲルの製造：
（ｉ） ２．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）（株式会社ペプチド研究所製）を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、撹拌しながら１０ｍｌの酢酸エチルに溶解した０．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のエチレンジアミン（ＥＤＡ）（和光純薬株式会社製）を室温下に滴下した。滴下終了後、さらに１時間撹拌を続けた。析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥してエチレンジアミン２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）２．９ｇ（収率約１００％）を得た。
（ii） アルギン酸ナトリウム（和光純薬株式会社製；粘度５００〜６００ｃｐ）の１重量％水溶液５５０ｍｌ（カルボキシル基：２７５ｍｍｏｌ）に、２．４２ｇ（８．５ｍｍｏｌ）の上記（ｉ）で得られたＥＤＡ・２ＨＯＳｕと、１７．６ｇ（９２ｍｍｏｌ）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（株式会社ペプチド研究所製）を溶解して、１５ｃｍ×２５ｃｍのテフロン(登録商標）被覆アルミ製トレイ４枚に流延し、室温で静置した。約５１時間後に、含水ゲルが得られた。得られた含水ゲルを、細胞間質液と同じ濃度（Ｃａイオン５ｍｅｑ、Ｎａイオン１４３ｍｅｑ）になるように、ＣａＣｌ2とＮａＣｌを溶解した水溶液（ＥＣＦ）で十分に洗浄した後、純水で十分に洗浄し、次いで凍結乾燥してスポンジ状のアルギン酸共有結合架橋ゲル約５ｇを得た。
<< Examples 1-2, Reference Examples 15-16 and Comparative Example 1 >>
(1) Production of alginate covalently crosslinked gel:
(I) 0.6 g (10 mmol) of 2.3 g (20 mmol) of N-hydroxysuccinimide (HOSu) (manufactured by Peptide Institute, Inc.) dissolved in 150 ml of ethyl acetate and dissolved in 10 ml of ethyl acetate with stirring. ) Ethylenediamine (EDA) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added dropwise at room temperature. After completion of the dropwise addition, stirring was continued for another hour. The precipitated crystals were collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 2.9 g (yield: about 100%) of ethylenediamine 2N-hydroxysuccinimide salt (EDA · 2HOSu).
(Ii) 2.42 g (8.5 mmol) of EDA obtained in (i) above in 550 ml (carboxyl group: 275 mmol) of a 1% by weight aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; viscosity 500-600 cp)・ 2HOSu and 17.6 g (92 mmol) of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl) (manufactured by Peptide Laboratories, Inc.) were dissolved in 15 cm × 25 cm Teflon (Registered trademark) Cast onto 4 coated aluminum trays and let stand at room temperature. After about 51 hours, a hydrogel was obtained. The obtained water-containing gel is sufficiently washed with an aqueous solution (ECF) in which CaCl 2 and NaCl are dissolved so as to have the same concentration as the cell interstitial fluid (Ca ions 5 meq, Na ions 143 meq). And then freeze-dried to obtain about 5 g of a sponge-like alginic acid covalently crosslinked gel.
（２）アルギン酸共有結合架橋ゲル（基材）へのペプチドの固定（結合）：
（ｉ） 上記（１）で得られたアルギン酸共有結合架橋ゲルの０．１ｇをジメチルホルムアミドで洗浄してゲル中の水分をジメチルホルムアミドで置換した。次いで、１．２ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと１．９ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）を加えて、一晩振盪した。次いで、メタノールとジメチルホルムアミドで数回洗浄した後、参考例１で得られた配列番号１で表されるペプチド１０μｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン１．７μｌを加えて、さらに一晩振盪し、ゲルにペプチドを結合させた。これを、メタノールとエタノールで数回洗浄した後、真空乾燥して、γ線滅菌（２５ｋＧｙ）を施して創傷被覆材を製造した（参考例１５）。
（ii） ペプチドとして、参考例５で得られた配列番号５で表されるペプチドを用いた以外は、上記（ｉ）と全く同様にして、創傷被覆材を製造した（参考例１６）。
（iii） ペプチドとして、参考例１１で得られた配列番号１１で表されるペプチドを用いるか（実施例１）、または参考例１４で得られた配列番号１４で表されるペプチドを用いた（実施例２）以外は、上記（ｉ）と全く同様にして、創傷被覆材を製造した（実施例１と２）。
（iv） ペプチドの代わりに、グリシンエチルエステル塩酸塩（株式会社ペプチド研究所製）の１０μｍｏｌを用いた以外は、上記（ｉ）と全く同様にして、創傷被覆材を製造した（比較例１）。
(2) Immobilization (binding) of peptide to alginic acid covalently crosslinked gel (base material):
(I) 0.1 g of the alginate covalently crosslinked gel obtained in the above (1) was washed with dimethylformamide to replace the water in the gel with dimethylformamide. Next, 1.2 mg of N-hydroxysuccinimide and 1.9 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl) were added and shaken overnight. Next, after washing several times with methanol and dimethylformamide, 10 μmol of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 obtained in Reference Example 1 and 1.7 μl of diisopropylethylamine were added, and the mixture was further shaken overnight to bind the peptide to the gel. I let you. This was washed several times with methanol and ethanol, then vacuum-dried and subjected to γ-ray sterilization (25 kGy) to produce a wound dressing (Reference Example 15).
(Ii) A wound dressing was produced in the same manner as in (i) above except that the peptide represented by SEQ ID NO: 5 obtained in Reference Example 5 was used as the peptide (Reference Example 16).
(Iii) As the peptide, the peptide represented by SEQ ID NO: 11 obtained in Reference Example 11 was used (Example 1), or the peptide represented by SEQ ID NO: 14 obtained in Reference Example 14 was used ( Except for Example 2), wound dressings were produced in exactly the same manner as (i) above (Examples 1 and 2).
(Iv) A wound dressing was produced in the same manner as (i) above except that 10 μmol of glycine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Peptide Institute, Inc.) was used instead of the peptide (Comparative Example 1). .
《試験例２》
実施例１〜２、参考例１５〜１６および比較例１で得られた創傷被覆材から１ｃｍ×１ｃｍの試験片を採取し、その各々を２４穴（２４ｗｅｌｌｓ）プレートの各ｗｅｌｌに入れ、正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０3個／ｗｅｌｌの割合で投入し、各ｗｅｌｌに１０％ＦＣＳ Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地１ｍｌを加えて、５％ＣＯ2存在下に３７℃で１４日間培養した。次いで、ゲル上の細胞をメタノールで固定化した後、ギムザ染色を行い、ゲルの寸法（１ｃｍ×１ｃｍ＝１ｃｍ２）に対する、ゲル上の染色された面積（％）を求めたところ、下記の表３に示すとおりであった。
<< Test Example 2 >>
A test piece of 1 cm × 1 cm was collected from the wound dressings obtained in Examples 1 and 2, Reference Examples 15 to 16 and Comparative Example 1, and each specimen was placed in each well of a 24-well plate, and normal humans were collected. Skin fibroblasts were added at a rate of 10 3 / well, 1 ml of 10% FCS Eagle's MEM medium was added to each well, and the cells were cultured at 37 ° C. for 14 days in the presence of 5% CO 2 . Next, after fixing cells on the gel with methanol, Giemsa staining was performed, and the stained area (%) on the gel with respect to the size of the gel (1 cm × 1 cm = 1 cm 2) was determined. It was as shown in.
上記の表３の結果から、配列番号１で表されるペプチド、配列番号５で表されるペプチド、配列番号１１で表されるペプチドおよび配列番号１４で表されるペプチドの各々を固定化した参考例１５〜１６および実施例１〜２の創傷被覆材では、グリシンエチルエステル塩酸塩を固定化した比較例１の創傷被覆材に比べて、染色面積が大きく、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖が促進されていること、そのうちでも、新規なペプチドである配列番号１で表されるペプチドおよび配列番号５で表されるペプチドを固定化してなる参考例１５および参考例１６の創傷被覆材は、染色面積が一層大きく、極めて高い、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖促進活性を有していることがわかる。 From the results of Table 3 above, each of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, the peptide represented by SEQ ID NO: 5, the peptide represented by SEQ ID NO: 11 and the peptide represented by SEQ ID NO: 14 was immobilized. In the wound dressings of Examples 15 to 16 and Examples 1 and 2, the stained area was larger and the proliferation of normal human skin fibroblasts was larger than the wound dressing of Comparative Example 1 in which glycine ethyl ester hydrochloride was immobilized. Among them, the wound dressing materials of Reference Example 15 and Reference Example 16 in which the peptide represented by SEQ ID NO: 1 and the peptide represented by SEQ ID NO: 5 which are novel peptides are immobilized are stained It can be seen that it has an activity of promoting the growth of normal human dermal fibroblasts, which has a larger area and is extremely high.
本発明の医療用手当材は、高い生理活性、特に強い細胞増殖促進作用および細胞接着作用を有し、創傷の治癒促進などの生体組織の修復するための創傷被覆材、生体組織の接着促進材料、骨補強材、軟骨再生材、神経再生材などとして有効に使用することができ、難治性潰瘍などの難治性創傷の治療に有用である。 The medical care material of the present invention has high physiological activity, particularly strong cell growth promoting action and cell adhesion action, and is a wound dressing material for repairing biological tissues such as wound healing promotion, and a biological tissue adhesion promoting material It can be effectively used as a bone reinforcing material, cartilage regenerating material, nerve regenerating material and the like, and is useful for treatment of intractable wounds such as intractable ulcers.
Claims (2)
The medical dressing according to claim 1, wherein the base material is a hydrous gel or a hydrous gel.
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