JP2006230817A - Biological tissue compensation material, and method of manufacturing the same - Google Patents

Biological tissue compensation material, and method of manufacturing the same Download PDF

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Shinichi Saotome
Kenichi Shinomiya
Nobutaka Tajima
Tomoaki Tamura
謙一 四宮
進一 早乙女
暢崇 田島
知明 田村
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Olympus Corp
Tokyo Medical & Dental Univ
オリンパス株式会社
国立大学法人 東京医科歯科大学
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To grow cells from inside a biological compensation material while facilitating permeation of cells even into micropores and preventing the cells from easily flow out of the pores. <P>SOLUTION: The biological tissue compensation material introducing a platelet poor plasma into a porous material is provided. In addition, the biological tissue compensation material introducing a liquid including the platelet poor plasma and cells into the porous material in which the platelet poor plasma is gelated is provided. The method of manufacturing a biological tissue compensation body is provided by introducing a liquid including the platelet poor plasma, calcium chloride and cells into the porous biological tissue compensation material (S8) and gelating the liquid after the introduction. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法に関するものである。 The present invention is a biological tissue filling material, those body tissue filler and a method for producing the same.

近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム(β−TCP)やハイドロキシアパタイト(HAP)等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。 Recently, in a so-called regenerative medicine, in order to increase the rate of repair of defects in the postoperative biological tissue, remove the mesenchymal stem cells from bone marrow cells or the like collected from patients, beta-tricalcium phosphate (beta-TCP) Ya by culturing with hydroxyapatite (HAP) body tissue filling material such as it has been proposed to produce a body tissue filler represented by cultured bone. 生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、細胞を含まない生体材料を移植した後に体内で細胞を増殖させ組織を修復する方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる(例えば、非特許文献1参照。)。 Body tissue filler, upon implantation, already because the bone filling material contains many mesenchymal stem cells grown in the scaffold, repairing tissue cells were grown in the body after transplantation of biological material without cells compared to the method, it is possible to greatly reduce the number of days until replaced by autologous tissue (e.g., see non-Patent Document 1.).

生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。 To produce a body tissue filler is generally firstly, increasing the mesenchymal stem cells taken from the patient's bone marrow cells or the like to the required number of cells in primary culture in a culture vessel. この過程において、成長した細胞は、少なくとも1回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。 In this process, the grown cells, at least once, is peeled from the culture vessel is changed further transferred to a large culture vessels. そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。 Then, when increased to ultimately required number of cells, again, allowed to detached from the culture vessel and allowed to adhere to a biological tissue filling material, subcultured is performed. これにより、生体組織補填体が製造される(例えば、非特許文献2参照。)。 Thus, body tissue filler is manufactured (e.g., Non-Patent Document 2 see.).

この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。 In this case, mesenchymal stem cells, by growing attached to the biological tissue filling material, because it is activated as the formation of the biological tissue is actively performed, the mesenchymal stem cells to the body tissue filling material be sufficiently deposited is important. 従来、生体組織補填材に細胞を十分に付着させる方法として、生体組織補填材の材質を改善し、生物活性ガラス材料あるいは生物活性セラミック材料により構成し、 特有のイオンを含む水溶液により処理することが提案されている(例えば、特許文献1参照。)。 As a method to sufficiently adhere the cells to the body tissue filling material, it can improve the material of the biological tissue-reinforcing material, composed of a bioactive glass material or a bioactive ceramic material is treated with an aqueous solution containing a specific ion It has been proposed (e.g., see Patent Document 1.).
特表2000−506738号公報(第10頁20〜23行等) Kohyo 2000-506738 JP (page 10, 20 to 23, line etc.)

しかしながら、例えば、β−TCPのような材質からなる生体組織補填材は、骨のように、再生後の強度を高く保つ必要がある生体組織を補填する場合には、気孔率を小さくしていく必要があるが、気孔率が小さくなればなるほど、播種された細胞は気孔内部に入り込み難くなるという問題がある。 However, for example, biological tissue-reinforcing material made of a material such as beta-TCP, as a bone, in the case of filling a biological tissue that needs to maintain a high strength after regeneration, it will reduce the porosity it is necessary, but the smaller the porosity, seeded cells there is a problem that it becomes difficult to enter the inner pores. すなわち、気孔が小さくなると、細胞自体の粘性や接着性により気孔内に細胞が入って行き難くなる。 That is, when the porosity decreases, and it becomes difficult to go contains cells in the pores by the cells themselves viscosity and adhesiveness. したがって、例えば、所定の大きさの生体組織欠損部を補填するために、該欠損部に合致するような比較的大きなブロック状のβ−TCP多孔体からなる生体組織補填材においては、播種された細胞を生体組織補填材の内部まで浸透させることが困難であった。 Thus, for example, in order to compensate the biological tissue defect of a predetermined size, in the body tissue filling material of relatively large blocky beta-TCP porous body so as to conform to 該欠 loss portion, seeded cells were difficult to penetrate into the body tissue filling material.

一方、細胞を気孔内に進入させ易くするために、細胞を含む液体の粘性を低くすることも考えられるが、粘性が低いと細胞が気孔内に留まり難くなり、細胞が生体組織補填材の気孔内壁に付着する前に生体組織補填材の外部に流れ出てしまうことにもなる。 Meanwhile, in order to easier to enter the cells in the pores, it is conceivable to lower the viscosity of the liquid containing the cells, viscosity and cells hardly remain in the pores low, the cells of the body tissue filling material pores also that flows out to the outside of the body tissue filling material before adhering to the inner wall. 細胞が気孔内に入り込み易く、かつ、流出し難いように細胞を含む液体の粘性を調整することは極めて困難であった。 Easily enter the cells within the pores, and adjusting the liquid containing the cells viscous so hard outflow has been extremely difficult.

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention was made in view of such circumstances, while easily permeate the cell in fine pores, and hardly flows out from the pores, the cells from the inside of the biological tissue-reinforcing material and to provide a method for producing a body tissue filler can be grown.

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。 In order to solve the above problems, the present invention provides the following means.
本発明は、少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材を提供する。 The present invention provides a biological tissue-reinforcing material comprising introducing the platelet-poor plasma into a porous material.
本発明によれば、多孔性材料内に導入された少血小板血漿(PPP:platelet poor plasma)が、クエン酸ナトリウム等のような塩化カルシウム等によってゲル化する材料を含んでいるので、細胞とともに塩化カルシウム等を導入することで、PPPをゲル化させて、細胞を多孔性材料の気孔内に保持することができる。 According to the present invention, platelet-poor plasma that is introduced into the porous material (PPP: platelet poor plasma) is because it contains materials which gel by calcium chloride or the like, such as sodium citrate, chloride with cells by introducing the calcium or the like, the PPP by gelling, cells can be retained within the pores of the porous material.

すなわち、細胞および塩化カルシウム等を含む液体を生体組織補填材の気孔内に浸透させるときに、比較的低い粘性に抑えることができる。 That is, when infiltrating a liquid containing cell and calcium chloride in the pores of the biological tissue-reinforcing material, it can be suppressed to a relatively low viscosity. したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。 Therefore, when introducing, to facilitate penetration into the pores by the relatively high fluidity, after being introduced once, by changing the highly viscous gel, it is possible to stay the cells in the pores. 細胞は、気孔内に滞留させられることによって、PPPのゲル中に保持され、気孔内部に留まり、もしくは、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。 Cells by being allowed to stay in the pores, is retained in the PPP gel, it remains inside the pores, or attached to the pore inner walls near, are activated, to differentiate into fully living tissue can. その結果、本実施形態に係る生体組織補填材が比較的大きなブロック状であっても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。 As a result, even relatively large block shaped biological tissue-reinforcing material according to the present embodiment, it is possible to produce a body tissue filling with cells grown sufficiently to the inside.
また、PPPはTGF−β、PDGF等の骨芽細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子をほとんど含まないので、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。 Further, PPP is TGF-beta, does not include most growth factors inhibiting platelet-derived osteoblast differentiation of PDGF and the like, can activate cells that are fastened to the gel at a very high efficiency Become.

また、本発明は、PPPおよび細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、PPPをゲル化させてなる生体組織補填体を提供する。 Further, the present invention introduces a liquid containing PPP and cells within the porous material, the PPP provides a body tissue filler made by gelling.
本発明によれば、PPP内に含まれるフィブリノーゲンから作られるフィブリンの3次元構造により細胞を活性化させ、かつ、PPPに細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子が含まれていないことによって、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。 According to the present invention, by cells to activate, and does not contain growth factors inhibiting platelet-derived cell differentiation to PPP by the three-dimensional structure of fibrin made from the fibrinogen contained in the PPP, cells fastened into the gel it is possible to activate at a very high efficiency. したがって、生体組織欠損部等に移植することにより、欠損部を早期に修復することができる。 Accordingly, by transplanting the biological tissue defect or the like, it is possible to repair defects at an early stage.

また、本発明は、PPP、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。 Further, the present invention, PPP, a liquid containing calcium chloride and cells were introduced into a porous biological tissue filling material, the liquid to provide a method of manufacturing a body tissue filler to gel after introduction.
本発明によれば、PPPと塩化カルシウムとの作用により、細胞を含む液体が生体組織補填材に導入された後にゲル化させられるので、生体組織補填材への導入時、すなわち、細胞を含む液体が生体組織補填材の気孔内に浸透するときには、比較的低い粘性に抑えることができる。 According to the present invention, by the action of the PPP and calcium chloride, because it is allowed to gel after liquid containing cells is introduced into a biological tissue filling material, upon introduction into a biological tissue filling material, i.e., a liquid containing cells There when penetrating into the pores of the biological tissue-reinforcing material can be suppressed to a relatively low viscosity. したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。 Therefore, when introducing, to facilitate penetration into the pores by the relatively high fluidity, after being introduced once, by changing the highly viscous gel, it is possible to stay the cells in the pores. 細胞は、気孔内に滞留させられることによって、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。 Cells by being allowed to stay in the pores, attached to the pore inner walls of the nearby been activated, it is possible to differentiate into fully living tissue. その結果、比較的大きなブロック状の生体組織補填材においても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。 As a result, even at relatively large blocky biological tissue-reinforcing material, it is possible to produce a body tissue filling with cells grown sufficiently to the inside.

上記発明においては、細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加することが好ましい。 In the above invention, the liquid containing the cells and platelet-poor plasma, prior to introduction of the liquid to the biological tissue-reinforcing material, it is preferable to add calcium chloride. このようにすることで、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始するPPPを含む液体の性質を利用して、細胞が生体組織補填材の内部に浸透するまで流動性を保ち、気孔内に到達した適当な時期に流動性をなくして留まらせることが可能となる。 In this way, when calcium chloride is added, slowly by utilizing the property of the liquid containing the PPP to start gelling, maintaining the fluid to the cells to penetrate the inside of the biological tissue-reinforcing material, it is possible to remain lost fluidity at the appropriate time has been reached in the pores.

また、上記発明においては、塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節することとしてもよい。 In the above invention, thrombin is added with calcium chloride, in accordance with the form of a biological tissue-reinforcing material, it is also possible to adjust the amount of thrombin to be added. これにより、例えば、気孔が細かい生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を少なくして凝固反応を遅くすることにより、ゲル化速度を遅くすることができ、気孔が比較的大きな生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を多くして凝固反応を促進し、PPPと塩化カルシウムとの反応によるゲル化を早めることができる。 Thus, for example, for the pores finer biological tissue filling material, by slowing the coagulation reaction by reducing the amount of thrombin, it is possible to slow down the gelation rate, the pores are relatively large body tissue filling for wood, the amount of thrombin lot to promote coagulation reaction, it is possible to accelerate the gelation by reaction with PPP and calcium chloride.

また、上記発明においては、前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞であることが好ましい。 In the above aspect, the cell is preferably a cell cultured under dexamethasone presence.
本発明によれば、細胞がデキサメタゾンの存在下で初期培養の段階から培養されることにより、骨芽細胞等の前駆細胞への分化能が維持される。 According to the present invention, by the cells are cultured from the initial stage of culture in the presence of dexamethasone, ability to differentiate into progenitor cells of the osteoblast and the like are maintained. そしてデキサメタゾン存在下で培養された細胞が、PPPを含む液体とともに生体組織補填材内に導入され、PPPをゲル化させて生体組織補填材の気孔内に留まらせることにより、気孔内において細胞を活性化させた状態に維持して、生体組織の形成を促進することができる。 The cells dexamethasone cultured in the presence is introduced together with the liquid containing the PPP into the body tissue filling material, by the PPP by gel to stay in the pores of the biological tissue-reinforcing material, cell activity in the pores It maintains the state of being of can promote the formation of a biological tissue.

本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めかつ生体組織補填材内部に細胞を滞留させることを可能として、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を提供することができるという効果を奏する。 According to the present invention, as allows to the interior of the permeable enhanced and body tissue filling material cells into body tissue filling material retained cells, the cells also activated inside the body tissue filling material, sufficient an effect that it is possible to provide a grown biological tissue filling body.

以下に、本発明に係る生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法の一実施形態について説明する。 Below, biological tissue-reinforcing material according to the present invention, body tissue filler and an embodiment of its manufacturing method will be described.
本実施形態に係る生体組織補填材は、多孔性材料にPPPを導入することにより構成されている。 Biological tissue-reinforcing material according to the present embodiment is constructed by introducing the PPP into the porous material. 多孔性材料は、例えば、ブロック状のβ−TCP多孔体である。 The porous material, for example, a block-shaped beta-TCP porous body. PPPは、血液を遠心分離し、可及的に血球成分および血小板を除去したものを使用する。 PPP is the blood is centrifuged and used after removing the blood cells and platelets as possible.

このように構成された本実施形態に係る生体組織補填材によれば、該生体組織補填材に細胞を播種する際に、細胞浮遊液内に塩化カルシウムを添加しておくことにより、生体組織補填材の気孔内において、PPPに含有されているキレート剤であるクエン酸ナトリウムを塩化カルシウムで中和反応することによりゲル化させることができる。 According to the biological tissue-reinforcing material according to the thus constructed present embodiment, when seeding cells into biological tissue filling material, by previously adding calcium chloride to the cell suspension in the biological tissue filling in the pores of the wood, the sodium citrate chelating agent contained in the PPP can be gelled by neutralization with calcium chloride. したがって、ゲル化した細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。 Thus, cells contained in the gelled cell suspension in is allowed to stay in the pores of the body tissue filling material. その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。 As a result, the cells will remain in the pores without flowing out biological tissue filling material, grow attached to the inner wall of the adjacent pores. これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の本実施形態に係る生体組織補填体を製造することが可能となる。 Thus, it is possible to produce a body tissue filling the cell to inside the present embodiment in a state of adhesion of body tissue filling material.

また、PPP内においては、フィブリノーゲンから作られるフィブリンの3次元構造により、細胞が活性化させられる。 Also within the PPP, the 3-dimensional structure of fibrin made from fibrinogen, cells are activated. さらに、PPP内に、細胞の分化を抑制するような血小板由来の成長因子が含まれていないために、気孔内壁に付着し、あるいはゲル中に保持された細胞の分化が促進され、細胞が高い活性を維持したまま成長させられることになる。 Further, in the PPP, in order does not contain growth factor platelet derived that suppresses differentiation of cells, adhere to pores inner wall, or differentiation of cells retained in the gel is promoted, a high cell so that the grown while maintaining the activity. したがって、生体組織の欠損部に移植された後、早期に欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。 Thus, after implantation into the defect of the living tissue, it is possible to produce a recoverable body tissue filler a defect at an early stage.

次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図1および図2を参照して以下に説明する。 Next, a method of manufacturing the body tissue filler according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
この製造方法は、図1に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する(ステップS1)。 This manufacturing method, as shown in FIG. 1, for example, culture by the mesenchymal stem cells taken from bone marrow cells, was charged with a given culture the culture vessel is maintained at a constant culture conditions (step S1).

培養液は、例えば、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Culture, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
Medium)および抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。 Medium) and is a mixture in any mixing ratio antibiotics. また、培養条件は、例えば、温度37℃±0.5℃、湿度100%、CO 濃度5%である。 Also, culture conditions, e.g., temperature 37 ° C. ± 0.5 ° C., 100% humidity, a CO 2 concentration of 5%.

この培養の過程(ステップS1)においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し(ステップS2,S3)、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく(ステップS4,S5)。 In the course of the culture (step S1), the exchange periodically or broth if necessary (step S2, S3), in accordance with the growth of the cells, continue to change them to larger culture vessels ( step S4, S5).

また、少なくとも1回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると(ステップS6)、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される(ステップS7)。 Furthermore, cells cultured while to change the at least one culture container is caused to be grown to a cell number required (step S6), and again, while being detached from the culture vessel, also disconnected cell binding each other It is separated into pieces Te (step S7). その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―TCP多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される(ステップS8)。 Thereafter, cells isolated apart, after being mixed with a predetermined solution, are seeded into body tissue filling material consisting of beta-TCP porous body block (step S8).

図中、符号S9は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。 In the figure, reference numeral S9 is differentiation step, the mesenchymal stem cells to some extent growth, adding differentiation inducer such as dexamethasone. これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。 Thus, mesenchymal stem cells, the desired living tissue, for example, be differentiated into osteoblasts, body tissue filler is produced. 分化ステップS9は、図1のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することが好ましい。 Differentiation step S9, before seeding into cells of the living tissue filling material as shown in FIG. 1, by performing in the culture, to some extent, be seeded were induced to differentiate into biological tissue cells in body tissue filling material preferable. また、符号S10は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。 Further, reference numeral S10 is an evaluation step of evaluating the state of cells contained in body tissue filling produced.

上記播種ステップS8においては、図2に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合される(ステップS81)ことにより、所定濃度の細胞浮遊液が構成される。 In the seeding step S8, as shown in FIG. 2, cells isolated apart is first by being mixed with the medium (step S81), the cell suspension of a predetermined concentration is formed. 培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。 Culture can be the same as the culture solution used in the culture described above. 細胞浮遊液は、その後に添加されるPPP等の他のゲル化可能材料の量を考慮して、細胞を多く含む高い濃度に設定されている。 Cell suspension, taking into account of other amounts of gellable material PPP or the like to be added subsequently, is set to a high concentration containing many cells. 次いで、この細胞浮遊液に、PPPを添加する(ステップS82)。 Then, to this cell suspension, adding PPP (step S82). PPPの添加量は、フィブリノーゲンの濃度がおおよそ2〜45mg/mlとなる程度の量でよい。 The addition amount of the PPP may be an amount that the concentration of fibrinogen becomes approximately 2~45mg / ml.

次に、細胞の播種に先立って、細胞を播種する生体組織補填材を準備しておく。 Then, prior to the seeding of the cells, prepare a body tissue filling material for seeding cells. 生体組織補填材は、例えば、ブロック状のβ−TCP多孔体である。 Biological tissue-reinforcing material, for example, a block-shaped beta-TCP porous body. そして、上記のようにして構成されたPPPを含む細胞浮遊液に、塩化カルシウム溶液を添加する(ステップS83)。 Then, the cell suspension containing the PPP which is constructed as described above, the addition of calcium chloride solution (step S83). 添加する塩化カルシウム溶液は、PPPに対しておおよそ0.01mol/l〜0.1mol/lの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。 Calcium chloride solution added is obtained by dissolving calcium chloride to approximately a concentration of 0.01mol / l~0.1mol / l with respect to PPP.

PPPにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。 Since the PPP contains sodium citrate, it added calcium chloride and sodium citrate gelation is initiated by the reaction. ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウムを添加した後には、即座に、ピペッティングにより生体組織補填材に播種する(ステップS84)。 The reaction of gelation is generally moderate, it takes several minutes to viscosity increases, after addition of calcium chloride immediately seeded into body tissue filling material by pipetting (step S84).

塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液の粘性は低い状態に維持されている。 If you have just calcium chloride addition, gelation is not in progress, the viscosity of the cell suspension is maintained at a low state. したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材の気孔内に浸透していくことが可能となる。 Thus, cells, it is possible to continue to relatively easily penetrate into the pores of the body tissue filling material. そして、細胞が生体組織補填材の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。 Then, the cells by the time to penetrate to the center of the body tissue filling material, gelation reaction of sodium citrate and calcium chloride proceeds, the cell suspension is allowed to gel viscosity increases rapidly.

これにより、ゲル化された細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。 Thus, cells that are included in the gelled cell suspension in is allowed to stay in the pores of the body tissue filling material. その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。 As a result, the cells will remain in the pores without flowing out biological tissue filling material, grow attached to the inner wall of the adjacent pores. これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の生体組織補填体が製造されることになる。 Thus, also in the interior of the body tissue filling material so that the body tissue fillings in a state where the cells are attached is manufactured.

このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の気孔内に細胞を浸透させる浸透段階においては、細胞浮遊液の流動性を高く維持することにより気孔内に円滑に浸透させ、細胞が気孔内部まで到達したときに細胞浮遊液をゲル化させることにより流動性を失わせるので、簡易に、細胞を生体組織補填材の内部にも付着させることができる。 Thus, according to the manufacturing method of the body tissue filler according to the present embodiment, in the osmotic step of infiltrating cells into the pores of the biological tissue-reinforcing material, the pores by maintaining a high fluidity of cell suspension smoothly infiltrated within, since the loss of fluidity by gelling a cell suspension when the cells reached inner pores, easily, the cells can be attached to the inside of the biological tissue-reinforcing material .

この場合において、本実施形態に係る製造方法によれば、ゲル化可能材料としてPPPを採用しているので、PPPに含まれているフィブリノーゲンにより形成されるフィブリンの3次元的な足場の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。 In this case, according to the manufacturing method according to the present embodiment, because it uses the PPP as gellable material, by the action of the three-dimensional scaffold of fibrin which is formed by fibrinogen contained in the PPP, it can promote the activation of cells attached to the body tissue filling material. したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を3次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。 Therefore, simple to adhere to the inside of pores, it is possible to grow the cells from inside the three-dimensionally, to facilitate activation of cells, biological can perform tissue regeneration efficiently tissue filler material it can be produced. また、PPPには、血小板塊その他の細胞の活性化を阻害する物質が含まれていないので、ゲル内に留まる細胞を非常に高い活性に維持することができる。 In addition, the PPP, does not include the substance that inhibits platelet activation masses other cells, it is possible to maintain the cells to remain in the gel to a very high activity.

また、本実施形態に係る製造方法によれば、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。 Further, according to the manufacturing method of this embodiment, the cells were allowed to penetrate into the pores, since it is retained in the pores by the gelled cell suspension, which was conventionally needed, the cells body tissue filling material there is also an effect that it is possible to omit the culturing step for attaching to. すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。 That is, the cells just after introduction since it takes time to adhere to the pore inner wall of the biological tissue-reinforcing material, and placed in the culture vessel, it is necessary to fixed culture time. しかし、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。 However, body tissue filler produced by the method according to the present embodiment, the cell by the gelled cell suspension since it is prohibited to flow from the pores, there is no need to stand. したがって、細胞を生体組織補填材に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。 Therefore, the cells were not required for static culture step for attaching to the biological tissue filling material, or it is possible to shorten, increasing the manufacturing efficiency, it is possible to shorten the manufacturing time.

さらに、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、細胞が気孔内に保持され続けるので、生体組織欠損部への補填前および補填後においても、細胞が生体組織補填材の外部に流出せず、効率よく組織再生を行うことができる。 Furthermore, body tissue filler produced by the method according to this embodiment, since the cell continues to be retained in the pores, even after filling before and filling into the biological tissue defect, the cells of the body tissue filling material not flow out to the outside, it can be efficiently performed tissue regeneration.

なお、本実施形態においては、細胞浮遊液にPPPを添加した溶液に、塩化カルシウム溶液を添加することによりゲル化させる方法を採用した。 In this embodiment, a solution prepared by adding PPP to the cell suspension, was adopted a method of gelling by addition of calcium chloride solution. 添加するトロンビン、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。 Thrombin addition, by adjusting the amount of calcium chloride as appropriate, the extent of gelation, i.e., can be adjusted in viscosity after gelation magnitude, the magnitude of the rate of gelation. また、PPPに適度に含まれるフィブリノーゲンによって形成されるフィブリンにより細胞浮遊液内の血液成分が凝固され、細胞浮遊液の粘性はさらに高められることになる。 Further, the blood components in cell suspension is solidified by a fibrin formed by fibrinogen contained in moderate to PPP, the viscosity of the cell suspension will be further enhanced.

添加する塩化カルシウム量や適度なトロンビンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材の形態に応じて設定することにしてもよい。 The amount of moderate thrombin and calcium chloride amount to be added may be to set depending on the form of the biological tissue-reinforcing material should be seeded cells. すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムを増やすことが考えられる。 That is, for the pores greater cell to flow out easily biological tissue filling material, a relatively premature gelation is started, and it is considered to increase the calcium chloride to be more highly viscous gel. また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液が浸透して行きにくい生体組織補填材に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。 Also, pores for the fine a viscous and cell suspension permeates hardly go biological tissue filling material may be a relatively slow gelation rate may be set lower viscosity of the final gel . したがって、このような場合には、PPP自体に含まれるトロンビン量のままで、塩化カルシウムの添加量は少なくてよい。 Therefore, in such a case, remains thrombin amount included in the PPP itself, the amount of calcium chloride may be less.

また、PPP自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。 Further, since PPP itself is intended to be collected from the patient, there are individual differences in gelation rate. したがって、採取されたPPPの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。 Thus, the component analysis of the collected PPP, may determine the amount of calcium chloride added.

また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ES細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。 Further, as cell seeding, but the mesenchymal stem cells collected from bone marrow cells is described as an example, but the invention is not limited to, ES cells, somatic stem cells, bone cells, cartilage cells, nerve cells, etc. it may be possible to adopt other somatic cells. また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。 Further, mesenchymal stem cells but was be taken from the bone marrow, instead of this, it may be be taken from peripheral blood or umbilical cord blood.

また、細胞を播種する生体組織補填材としては、β―TCP多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。 As the body tissue filling material for seeding cells, instead of the beta-TCP porous body and porous ceramics having biocompatibility, collagen, polylactic acid, polyglycolic acid, hyaluronic acid or combinations thereof, it may be used. また、チタンのような金属であってもよい。 Further, it may be a metal such as titanium. また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。 Moreover, the form also block-like, granular, may be employed a gel like any form.

[実施例1] [Example 1]
次に、上記実施形態に係る生体組織補填体およびその製造方法の実施例について図3を参照して以下に説明する。 It will be described below with reference to FIG. 3 for the embodiment of body tissue filler and its manufacturing method according to the above embodiment.
まず、PPPの採取方法について説明する。 First, a description will be given of a method of collecting PPP.
フィッシャーラットから採血すると同時に血液保存液(CPD液)と混合することにより凝血を防ぐ。 Simultaneously collecting blood from the Fischer rat prevent clotting by mixing blood storage solution and (CPD solution). 全血とCPD液との割合は10:1である。 Ratio of the whole blood and CPD solution is 10: 1. 全血を遠沈管に入れて、312Gで10分間遠心分離し、バフィーコートおよびそれより上層の部分を別の遠沈管に移した。 Put whole blood into the centrifuge tube, and centrifuged for 10 minutes at 312G, they were transferred buffy coat and it than the upper part into another centrifuge tube. これをさらに1248Gで10分間遠心分離し、上清(9/10の量)を採取した。 This was further centrifuged for 10 min at 1248 g, the supernatant was collected (amount of 9/10). これがPPPである。 This is the PPP. 残り1/10が多血小板血漿(PRP:Platelet Rich Plasma)である。 The remaining 1/10 platelet-rich plasma: a (PRP Platelet Rich Plasma).

次に、使用した細胞について説明する。 Next, a description will be given cells used.
フィッシャーラットの大腿骨骨髄より採取した間葉系幹細胞を、DMEMおよび抗生剤を任意の配合比率で混合した培養液内で、温度37℃±0.5℃、湿度100%、CO 濃度5%の培養条件下で10日間培養した後、デキサメタゾン、β−グリセロフォスフェートおよびアスコルビン酸リン酸を添加し4日間分化誘導した。 The mesenchymal stem cells were collected from the femoral marrow of Fisher rats, DMEM and antibiotics mixed in culture in an arbitrary blending ratio, temperature 37 ° C. ± 0.5 ° C., humidity 100%, CO 2 concentration 5% after incubation at culture conditions for 10 days, dexamethasone induced β- glycerophosphate phosphate was added and ascorbic acid phosphate 4 days differentiation.

次に、生体組織補填体について説明する。 Next, a description will be given body tissue filler.
上述したPPPおよびPRPに、培養した細胞を浮遊させ、2%塩化カルシウム溶液(PPPおよびPRPに対し1/7の量)を加え、直ちに、1辺が5mmの立方体からなるβ−TCP多孔体に導入することにより生体組織補填体を製造した。 The PPP and PRP described above, is suspended cultured cells, 2% calcium chloride solution (the amount of 1/7 to PPP and PRP) was added, immediately one side consists of 5mm cubes beta-TCP porous body It was produced body tissue filling by introducing. 細胞濃度は2.6×10 /mlである。 The cell concentration is 2.6 × 10 6 / ml. 製造された生体組織補填体をフィッシャーラットの皮下に移植した。 Were transplanted manufactured body tissue filler subcutaneously Fisher rats.

次に、移植結果について説明する。 Next, a description will be given of transplantation results.
PPP細胞浮遊液およびPRP細胞浮遊液をβ−TCP多孔体に導入した生体組織補填体を、それぞれフィッシャーラットの皮下に移植した後、3週間および6週間経過後に採取し、図3(a)に示すように27分割した。 The PPP cell suspension and body tissue filler introduced with PRP cell suspension into beta-TCP porous body was implanted subcutaneously Fisher rats each were taken after 3 and 6 weeks, in FIGS. 3 (a) was 27 divided as shown. 分割されたA〜Dの部分について新生骨の面積率を分析した結果を図3(b)および図3(c)に示す。 The result of analysis of the area ratio of new bone on divided portions of A~D shown in FIGS. 3 (b) and 3 (c). これらによれば、PRPの場合と比較してPPPの場合の方が、新生骨が多く存在し、細胞の活性が高いことがわかる。 According to these, towards the case of PPP as compared with the case of PRP is, new bone is often present, it can be seen that high activity of the cells.

[実施例2] [Example 2]
次に、PPPとデキサメタゾンとを合わせて用いた場合の効果について説明する。 Next, the effect will be described when used in conjunction with the PPP and dexamethasone.
ニホンザルの大腿骨から穿刺により骨髄液を採取し、DMEMおよびFBS10%の培地で培養した。 The bone marrow fluid was collected by puncture from the femur of Japanese macaques, they were cultured in medium DMEM and FBS10%. このとき、デキサメタゾン10nMを加えたものと加えないものとで培養した。 In this case, it was cultured in shall not apply a plus dexamethasone 10 nM. 継代を行いながら培養し、得られた骨髄細胞をβ−TCP多孔体に播種した。 While passages culturing, the resulting bone marrow cells were plated in beta-TCP porous body.

サンプルとしては、デキサメタゾンを加えずに培養し、移植直前(移植4日前)よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を陰圧でβ−TCP多孔体に導入したもの(DEX−)、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養し、移植直前(移植4日前)よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を、陰圧でβ−TCP多孔体に導入したもの(DEX+PPP−)、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養した骨髄細胞のPPP細胞浮遊液をβ−TCP多孔体に導入してゲル化させたもの(DEX+PPP+)を用意した。 The samples were cultured without adding dexamethasone, dexamethasone than immediately before transplantation (graft 4 days ago), beta-glycerophosphate, beta-TCP porous cell suspension of bone marrow cells obtained by addition of ascorbic acid phosphoric acid at negative pressure that we are introduced to the body (DEX-), and cultured with dexamethasone from the start of culture, dexamethasone than immediately before transplantation (graft 4 days ago), beta-glycerophosphate, cell suspensions of bone marrow cells obtained by addition of ascorbic acid phosphate the liquid, which was introduced into beta-TCP porous body with negative pressure (DEX + PPP-), a PPP cell suspension bone marrow cells cultured with dexamethasone was introduced into beta-TCP porous body is gelled from the start culture ones (DEX + PPP +) was prepared. これらのサンプルをニホンザルの背部皮下に移植し、移植後5週間経過後に回収して顕微鏡で観察した。 The samples were implanted subcutaneously in the back of the Japanese monkey, and observed under a microscope were harvested after 5 weeks after implantation.

その結果を図4〜図6に示す。 The results are shown in FIGS. 4 to 6. これらの図4〜図6において、(a)は1.25倍拡大写真、(b)は10倍拡大写真をそれぞれ示している、 In these FIGS. 4 6, (a) is 1.25 times enlarged photograph shows (b) respectively 10 times enlarged photograph,
これらの図4〜図6によれば、(DEX−)、(DEX+PPP−)、(DEX+PPP+)の順に、β−TCP多孔体の全域に骨組織Xが広がっていることがわかる。 According to these FIGS. 4 6, (DEX -), (DEX + PPP -), it can be seen that order, spread bone tissue X in the entire area of ​​the beta-TCP porous body (DEX + PPP +). このことから、デキサメタゾンを培養開始時より添加し、およびPPPを導入した生体組織補填体が骨形成に有効であることが示された。 Therefore, dexamethasone was added at the initiation of culture, and body tissue filler introduced with PPP has been shown to be effective in bone formation.

この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。 It is a flowchart showing a manufacturing method of the body tissue filler according to an embodiment of the present invention. 図1の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。 Is a flowchart illustrating the step of seeding the cells in the manufacturing method of FIG. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例1を示し、(a)はサンプルの位置を示す模式図、(b)は3週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をPRPを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフ、(c)は6週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をPRPを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフである。 Shows an embodiment 1 of the body tissue filler according to an embodiment of the present invention, the (a) is a schematic view showing the position of the sample, (b) the PRP new bone area ratio of each sample after 3 weeks graph showing in comparison with the body tissue filler containing a graph showing in comparison with the body tissue filler containing (c) is a new bone area ratio of each sample after 6 weeks PRP. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾンを添加せずに培養した細胞を用いた(PPPを用いない)場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。 As a comparative example of a body tissue filler according to an embodiment of the present invention, dexamethasone using cells cultured without the addition of (without using PPP) is a micrograph showing the state of formation of bone tissue in the case. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾン存在下で培養した細胞を用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。 As a comparative example of a body tissue filler according to an embodiment of the present invention is a microscope photograph showing the state of formation of bone tissue in the case of using the cells cultured under dexamethasone presence. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例2を示し、デキサメタゾン存在下で培養した細胞をPPPとともに用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。 Shows an embodiment 2 of the body tissue filler according to an embodiment of the present invention is a microscope photograph showing the state of formation of bone tissue in the case of using the cells cultured under dexamethasone present with the PPP.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

S8 播種ステップ S82 PPP添加ステップ S83 塩化カルシウム添加ステップ S84 細胞播種ステップ S8 seeding step S82 PPP added step S83 calcium chloride added step S84 cell seeding step

Claims (6)

  1. 少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材。 Body tissue filling material obtained by introducing a platelet-poor plasma into a porous material.
  2. 少血小板血漿および細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、少血小板血漿をゲル化させてなる生体組織補填体。 Platelet-poor plasma and a liquid containing cells introduced into the porous material, comprising the platelet-poor plasma is gelled body tissue filler.
  3. 少血小板血漿、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法。 Platelet-poor plasma, a liquid containing calcium chloride and cells were introduced into a porous biological tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler to gel the liquid after introduction.
  4. 細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する請求項3に記載の生体組織補填体の製造方法。 The liquid containing the cells and platelet-poor plasma, prior to introduction of the liquid to the body tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler according to claim 3, addition of calcium chloride.
  5. 塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、 Thrombin was added with calcium chloride,
    生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節する請求項4に記載の生体組織補填体の製造方法。 In accordance with the form of a body tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler according to claim 4 for adjusting the amount of thrombin to be added.
  6. 前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞である請求項3から請求項5のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法。 It said cell, method of manufacturing a body tissue filling body according to claims 3 is a cell cultured under dexamethasone present in any of claims 5.
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