JP2006230817A - Biological tissue compensation material, and method of manufacturing the same - Google Patents

Biological tissue compensation material, and method of manufacturing the same Download PDF

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謙一 四宮
Shinichi Saotome
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暢崇 田島
Tomoaki Tamura
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To grow cells from inside a biological compensation material while facilitating permeation of cells even into micropores and preventing the cells from easily flow out of the pores. <P>SOLUTION: The biological tissue compensation material introducing a platelet poor plasma into a porous material is provided. In addition, the biological tissue compensation material introducing a liquid including the platelet poor plasma and cells into the porous material in which the platelet poor plasma is gelated is provided. The method of manufacturing a biological tissue compensation body is provided by introducing a liquid including the platelet poor plasma, calcium chloride and cells into the porous biological tissue compensation material (S8) and gelating the liquid after the introduction. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法に関するものである。   The present invention relates to a biological tissue filling material, a biological tissue filling material, and a method for producing the same.

近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム(β−TCP)やハイドロキシアパタイト(HAP)等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、細胞を含まない生体材料を移植した後に体内で細胞を増殖させ組織を修復する方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる(例えば、非特許文献1参照。)。   In recent years, in so-called regenerative medicine, mesenchymal stem cells are extracted from bone marrow cells or the like collected from a patient in order to increase the repair speed of a defect in a living tissue after surgery, and β tricalcium phosphate (β-TCP) or It has been proposed to produce a body tissue supplement represented by cultured bone by culturing with a body tissue filling material such as hydroxyapatite (HAP). Biological tissue replacements contain many mesenchymal stem cells that have already proliferated on a bone grafting material as a scaffold at the time of transplantation, so that after transplanting biomaterials that do not contain cells, the cells grow in the body to repair the tissue. Compared with the method to do, the days until it is replaced with a self-organized tissue can be significantly shortened (see, for example, Non-Patent Document 1).

生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。この過程において、成長した細胞は、少なくとも1回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。これにより、生体組織補填体が製造される(例えば、非特許文献2参照。)。   In order to produce a biological tissue complement, generally, first, mesenchymal stem cells taken out from the bone marrow cells of a patient are primarily cultured in a culture vessel to increase the number of cells to the required number. In this process, the grown cells are detached from the culture vessel at least once and transferred to a larger culture vessel. And when it finally increases to the required number of cells, it is peeled again from the culture vessel and attached to the biological tissue filling material, and the secondary culture is performed. Thereby, a biological tissue complement is manufactured (for example, refer nonpatent literature 2).

この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。従来、生体組織補填材に細胞を十分に付着させる方法として、生体組織補填材の材質を改善し、生物活性ガラス材料あるいは生物活性セラミック材料により構成し、 特有のイオンを含む水溶液により処理することが提案されている(例えば、特許文献1参照。)。
植村他2名,「生分解性β−TCP多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」,メディカル朝日,朝日新聞社,2001年10月1日,第30巻,第10号,p.46−49 吉川,「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」,バイオインダストリー,株式会社シーエムシー出版,2001年,第18巻,第7号,p.46−53 特表2000−506738号公報(第10頁20〜23行等)
In this case, the mesenchymal stem cells are activated so that the formation of the living tissue is actively performed by adhering to the living tissue filling material and growing, so that the mesenchymal stem cell is used as the living tissue filling material. It is important that it adheres sufficiently. Conventionally, as a method for sufficiently attaching cells to a biological tissue filling material, it is possible to improve the material of the biological tissue filling material, to make it composed of a bioactive glass material or a bioactive ceramic material, and to treat it with an aqueous solution containing specific ions. It has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
Uemura et al., “Tissue engineering in bone using biodegradable β-TCP porous material -Osferion, a new material that increases strength in vivo”, Medical Asahi, Asahi Shimbun, October 1, 2001, 30th Volume 10, No. 10, p. 46-49 Yoshikawa, “Cultivated dermis and bone marrow with bone marrow mesenchymal cells—Regenerative medicine with bone marrow mesenchymal cells”, Bioindustry, CMC Publishing Co., Ltd., 2001, Vol. 18, No. 7, p. 46-53 JP 2000-506738 A (page 10, lines 20-23)

しかしながら、例えば、β−TCPのような材質からなる生体組織補填材は、骨のように、再生後の強度を高く保つ必要がある生体組織を補填する場合には、気孔率を小さくしていく必要があるが、気孔率が小さくなればなるほど、播種された細胞は気孔内部に入り込み難くなるという問題がある。すなわち、気孔が小さくなると、細胞自体の粘性や接着性により気孔内に細胞が入って行き難くなる。したがって、例えば、所定の大きさの生体組織欠損部を補填するために、該欠損部に合致するような比較的大きなブロック状のβ−TCP多孔体からなる生体組織補填材においては、播種された細胞を生体組織補填材の内部まで浸透させることが困難であった。   However, for example, a tissue filling material made of a material such as β-TCP reduces the porosity when filling a living tissue that needs to maintain high strength after regeneration, such as bone. Although it is necessary, there is a problem that the smaller the porosity, the more difficult the seeded cells enter the pores. That is, when the pores become small, it becomes difficult for the cells to enter the pores due to the viscosity and adhesiveness of the cells themselves. Therefore, for example, in order to make up a biological tissue defect portion of a predetermined size, a biological tissue filling material made of a relatively large block-like β-TCP porous body that matches the defect portion was seeded. It was difficult to infiltrate the cells into the living tissue filling material.

一方、細胞を気孔内に進入させ易くするために、細胞を含む液体の粘性を低くすることも考えられるが、粘性が低いと細胞が気孔内に留まり難くなり、細胞が生体組織補填材の気孔内壁に付着する前に生体組織補填材の外部に流れ出てしまうことにもなる。細胞が気孔内に入り込み易く、かつ、流出し難いように細胞を含む液体の粘性を調整することは極めて困難であった。   On the other hand, in order to facilitate the entry of cells into the pores, it may be possible to reduce the viscosity of the liquid containing the cells. Before adhering to the inner wall, it also flows out of the living tissue filling material. It has been extremely difficult to adjust the viscosity of the liquid containing the cells so that the cells can easily enter the pores and hardly flow out.

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of such circumstances, and while making it easy to permeate cells into fine pores, it is difficult to flow out of the pores, so that cells can be removed from the inside of the living tissue filling material. It aims at providing the manufacturing method of the biological tissue complement which can be made to grow.

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材を提供する。
本発明によれば、多孔性材料内に導入された少血小板血漿(PPP:platelet poor plasma)が、クエン酸ナトリウム等のような塩化カルシウム等によってゲル化する材料を含んでいるので、細胞とともに塩化カルシウム等を導入することで、PPPをゲル化させて、細胞を多孔性材料の気孔内に保持することができる。
In order to solve the above problems, the present invention provides the following means.
The present invention provides a biological tissue filling material obtained by introducing platelet-poor plasma into a porous material.
According to the present invention, platelet poor plasma (PPP) introduced into a porous material contains a material that gels with calcium chloride or the like such as sodium citrate. By introducing calcium or the like, PPP can be gelled and cells can be held in the pores of the porous material.

すなわち、細胞および塩化カルシウム等を含む液体を生体組織補填材の気孔内に浸透させるときに、比較的低い粘性に抑えることができる。したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。細胞は、気孔内に滞留させられることによって、PPPのゲル中に保持され、気孔内部に留まり、もしくは、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。その結果、本実施形態に係る生体組織補填材が比較的大きなブロック状であっても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。
また、PPPはTGF−β、PDGF等の骨芽細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子をほとんど含まないので、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。
That is, when a liquid containing cells, calcium chloride, and the like is permeated into the pores of the biological tissue filling material, it can be suppressed to a relatively low viscosity. Therefore, at the time of introduction, penetration into the pores is promoted by a relatively high fluidity, and once introduced, the cells can be changed into a highly viscous gel to retain the cells in the pores. When cells are retained in the pores, they are retained in the PPP gel and stay inside the pores, or attach to the inner wall of the nearby pores, are activated, and fully differentiate into living tissues. Can do. As a result, even if the biological tissue filling material according to the present embodiment is in a relatively large block shape, a biological tissue filling material having cells that have grown sufficiently to the inside can be produced.
In addition, since PPP contains almost no platelet-derived growth factor that suppresses osteoblast differentiation, such as TGF-β and PDGF, it is possible to activate cells retained in the gel with very high efficiency. Become.

また、本発明は、PPPおよび細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、PPPをゲル化させてなる生体組織補填体を提供する。
本発明によれば、PPP内に含まれるフィブリノーゲンから作られるフィブリンの3次元構造により細胞を活性化させ、かつ、PPPに細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子が含まれていないことによって、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。したがって、生体組織欠損部等に移植することにより、欠損部を早期に修復することができる。
The present invention also provides a biological tissue filling material obtained by introducing a liquid containing PPP and cells into a porous material to gel the PPP.
According to the present invention, by virtue of the fact that the cell is activated by the three-dimensional structure of fibrin made from fibrinogen contained in the PPP, and the PPP does not contain a platelet-derived growth factor that suppresses cell differentiation, It becomes possible to activate cells retained in the gel with very high efficiency. Therefore, a defect part can be repaired at an early stage by transplanting to a biological tissue defect part or the like.

また、本発明は、PPP、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。
本発明によれば、PPPと塩化カルシウムとの作用により、細胞を含む液体が生体組織補填材に導入された後にゲル化させられるので、生体組織補填材への導入時、すなわち、細胞を含む液体が生体組織補填材の気孔内に浸透するときには、比較的低い粘性に抑えることができる。したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。細胞は、気孔内に滞留させられることによって、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。その結果、比較的大きなブロック状の生体組織補填材においても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。
Moreover, this invention provides the manufacturing method of the biological tissue filling body which introduce | transduces the liquid containing PPP, calcium chloride, and a cell into a porous biological tissue filling material, and gelatinizes the said liquid after introduction | transduction.
According to the present invention, the liquid containing the cells is gelled after being introduced into the biological tissue filling material by the action of PPP and calcium chloride. Therefore, at the time of introduction into the biological tissue filling material, that is, the liquid containing cells. When it penetrates into the pores of the biological tissue filling material, it can be suppressed to a relatively low viscosity. Therefore, at the time of introduction, penetration into the pores is promoted by a relatively high fluidity, and once introduced, the cells can be changed into a highly viscous gel to retain the cells in the pores. When the cells are retained in the pores, they adhere to the inner wall of the nearby pores, are activated, and can fully differentiate into living tissues. As a result, even with a relatively large block-shaped biological tissue filling material, a biological tissue filling material having cells that have grown sufficiently to the inside can be produced.

上記発明においては、細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加することが好ましい。このようにすることで、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始するPPPを含む液体の性質を利用して、細胞が生体組織補填材の内部に浸透するまで流動性を保ち、気孔内に到達した適当な時期に流動性をなくして留まらせることが可能となる。   In the above-mentioned invention, it is preferable to add calcium chloride to a liquid containing cells and platelet-poor plasma before introducing the liquid into the body tissue filling material. In this way, when calcium chloride is added, using the property of the liquid containing PPP that gently starts to gel, the fluidity is maintained until the cells penetrate into the living tissue filling material, It becomes possible to retain the fluidity at an appropriate time when it reaches the pores.

また、上記発明においては、塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節することとしてもよい。これにより、例えば、気孔が細かい生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を少なくして凝固反応を遅くすることにより、ゲル化速度を遅くすることができ、気孔が比較的大きな生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を多くして凝固反応を促進し、PPPと塩化カルシウムとの反応によるゲル化を早めることができる。   Moreover, in the said invention, it is good also as adding thrombin with calcium chloride and adjusting the quantity of the thrombin added according to the form of a biological tissue filling material. As a result, for example, for a tissue filling material with fine pores, the gelation rate can be slowed by reducing the amount of thrombin and slowing the coagulation reaction. For the material, the amount of thrombin can be increased to promote the coagulation reaction, and the gelation by the reaction between PPP and calcium chloride can be accelerated.

また、上記発明においては、前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞であることが好ましい。
本発明によれば、細胞がデキサメタゾンの存在下で初期培養の段階から培養されることにより、骨芽細胞等の前駆細胞への分化能が維持される。そしてデキサメタゾン存在下で培養された細胞が、PPPを含む液体とともに生体組織補填材内に導入され、PPPをゲル化させて生体組織補填材の気孔内に留まらせることにより、気孔内において細胞を活性化させた状態に維持して、生体組織の形成を促進することができる。
Moreover, in the said invention, it is preferable that the said cell is a cell cultured in the presence of dexamethasone.
According to the present invention, the ability to differentiate into progenitor cells such as osteoblasts is maintained by culturing cells from the initial culture stage in the presence of dexamethasone. Then, the cells cultured in the presence of dexamethasone are introduced into the biological tissue filling material together with the liquid containing PPP, and the cells are activated in the pores by gelling the PPP and staying in the pores of the biological tissue filling material. It is possible to promote the formation of a living tissue while maintaining the converted state.

本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めかつ生体組織補填材内部に細胞を滞留させることを可能として、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を提供することができるという効果を奏する。   According to the present invention, it is possible to increase the permeability of cells into the biological tissue filling material and to retain the cells inside the biological tissue filling material, and to activate the cells inside the biological tissue filling material. It is possible to provide a biological tissue complement that has been grown to a high level.

以下に、本発明に係る生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法の一実施形態について説明する。
本実施形態に係る生体組織補填材は、多孔性材料にPPPを導入することにより構成されている。多孔性材料は、例えば、ブロック状のβ−TCP多孔体である。PPPは、血液を遠心分離し、可及的に血球成分および血小板を除去したものを使用する。
Hereinafter, an embodiment of a biological tissue filling material, a biological tissue filling body, and a manufacturing method thereof according to the present invention will be described.
The biological tissue filling material according to the present embodiment is configured by introducing PPP into a porous material. The porous material is, for example, a block-shaped β-TCP porous body. PPP is obtained by centrifuging blood and removing blood cell components and platelets as much as possible.

このように構成された本実施形態に係る生体組織補填材によれば、該生体組織補填材に細胞を播種する際に、細胞浮遊液内に塩化カルシウムを添加しておくことにより、生体組織補填材の気孔内において、PPPに含有されているキレート剤であるクエン酸ナトリウムを塩化カルシウムで中和反応することによりゲル化させることができる。したがって、ゲル化した細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の本実施形態に係る生体組織補填体を製造することが可能となる。   According to the biological tissue filling material according to the present embodiment configured as described above, when the cells are seeded on the biological tissue filling material, by adding calcium chloride in the cell suspension, In the pores of the material, gelation can be achieved by neutralizing sodium citrate, which is a chelating agent contained in PPP, with calcium chloride. Therefore, the cells contained in the gelled cell suspension are retained in the pores of the biological tissue filling material. As a result, the cells stay in the pores without flowing out of the living tissue filling material, and grow on the inner walls of the adjacent pores. Thereby, it becomes possible to manufacture the biological tissue filling body according to the present embodiment in a state where cells are also adhered to the inside of the biological tissue filling material.

また、PPP内においては、フィブリノーゲンから作られるフィブリンの3次元構造により、細胞が活性化させられる。さらに、PPP内に、細胞の分化を抑制するような血小板由来の成長因子が含まれていないために、気孔内壁に付着し、あるいはゲル中に保持された細胞の分化が促進され、細胞が高い活性を維持したまま成長させられることになる。したがって、生体組織の欠損部に移植された後、早期に欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。   In PPP, cells are activated by the three-dimensional structure of fibrin made from fibrinogen. Furthermore, since the PPP does not contain a platelet-derived growth factor that suppresses cell differentiation, differentiation of the cells attached to the inner wall of the pores or retained in the gel is promoted, and the cells are high. It will be grown while maintaining activity. Therefore, after transplantation into the defect portion of the biological tissue, a biological tissue complement capable of repairing the defect portion at an early stage can be produced.

次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図1および図2を参照して以下に説明する。
この製造方法は、図1に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する(ステップS1)。
Next, the manufacturing method of the biological tissue filling body which concerns on one Embodiment of this invention is demonstrated below with reference to FIG. 1 and FIG.
In this production method, as shown in FIG. 1, first, for example, mesenchymal stem cells taken out from bone marrow cells are placed in a culture vessel together with a predetermined culture solution and cultured under a constant culture condition. (Step S1).

培養液は、例えば、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's
Medium)および抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。また、培養条件は、例えば、温度37℃±0.5℃、湿度100%、CO濃度5%である。
The culture solution is, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
Medium) and antibiotics mixed at an arbitrary blending ratio. The culture conditions are, for example, a temperature of 37 ° C. ± 0.5 ° C., a humidity of 100%, and a CO 2 concentration of 5%.

この培養の過程(ステップS1)においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し(ステップS2,S3)、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく(ステップS4,S5)。   In this culturing process (step S1), the culture solution is exchanged periodically or as necessary (steps S2 and S3), and the culture vessel is changed to a larger one as the cells grow ( Steps S4 and S5).

また、少なくとも1回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると(ステップS6)、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される(ステップS7)。その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―TCP多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される(ステップS8)。   In addition, when the cells cultured while changing the culture container at least once are grown to the required number of cells (step S6), the cells are detached from the culture container and the connection between the cells is also disconnected. Are separated (step S7). Thereafter, the separated cells are mixed with a predetermined solution and then seeded on a biological tissue filling material composed of a β-TCP porous body block (step S8).

図中、符号S9は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。分化ステップS9は、図1のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することが好ましい。また、符号S10は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。   In the figure, symbol S9 is a differentiation step, and a differentiation-inducing factor such as dexamethasone is added to mesenchymal stem cells proliferated to some extent. As a result, the mesenchymal stem cells are differentiated into a desired biological tissue, for example, osteoblast, and a biological tissue complement is produced. Differentiation step S9 is performed during culture before seeding of the cells on the biological tissue filling material as shown in FIG. 1, so that the cells induced to differentiate to some extent can be seeded on the biological tissue filling material. preferable. Moreover, code | symbol S10 is an evaluation step which evaluates the state of the cell contained in the manufactured biological tissue complement.

上記播種ステップS8においては、図2に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合される(ステップS81)ことにより、所定濃度の細胞浮遊液が構成される。培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。細胞浮遊液は、その後に添加されるPPP等の他のゲル化可能材料の量を考慮して、細胞を多く含む高い濃度に設定されている。次いで、この細胞浮遊液に、PPPを添加する(ステップS82)。PPPの添加量は、フィブリノーゲンの濃度がおおよそ2〜45mg/mlとなる程度の量でよい。   In the seeding step S8, as shown in FIG. 2, the separated cells are first mixed with a culture solution (step S81), thereby forming a cell suspension having a predetermined concentration. The culture solution may be the same as the culture solution used for the culture described above. The cell suspension is set at a high concentration containing many cells in consideration of the amount of other gelable material such as PPP added thereafter. Next, PPP is added to the cell suspension (step S82). The amount of PPP added may be such that the fibrinogen concentration is approximately 2 to 45 mg / ml.

次に、細胞の播種に先立って、細胞を播種する生体組織補填材を準備しておく。生体組織補填材は、例えば、ブロック状のβ−TCP多孔体である。そして、上記のようにして構成されたPPPを含む細胞浮遊液に、塩化カルシウム溶液を添加する(ステップS83)。添加する塩化カルシウム溶液は、PPPに対しておおよそ0.01mol/l〜0.1mol/lの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。   Next, prior to the seeding of cells, a biological tissue filling material for seeding cells is prepared. The biological tissue filling material is, for example, a block-shaped β-TCP porous body. Then, a calcium chloride solution is added to the cell suspension containing PPP configured as described above (step S83). The calcium chloride solution to be added is obtained by dissolving calcium chloride so as to have a concentration of approximately 0.01 mol / l to 0.1 mol / l with respect to PPP.

PPPにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウムを添加した後には、即座に、ピペッティングにより生体組織補填材に播種する(ステップS84)。   Since PPP contains sodium citrate, the added calcium chloride and sodium citrate react to initiate gelation. Since the gelation reaction is generally slow and takes several minutes for the viscosity to increase, immediately after adding calcium chloride, it is seeded on the biological tissue filling material by pipetting (step S84).

塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液の粘性は低い状態に維持されている。したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材の気孔内に浸透していくことが可能となる。そして、細胞が生体組織補填材の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。   If it is immediately after calcium chloride addition, gelation has not progressed and the viscosity of the cell suspension is kept low. Therefore, the cells can permeate into the pores of the tissue filling material relatively easily. When the cells penetrate to the center of the tissue filling material, the gelation reaction between sodium citrate and calcium chloride proceeds, the cell suspension is gelled, and the viscosity rapidly increases.

これにより、ゲル化された細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の生体組織補填体が製造されることになる。   As a result, the cells contained in the gelatinized cell suspension are retained in the pores of the biological tissue filling material. As a result, the cells stay in the pores without flowing out of the living tissue filling material, and grow on the inner walls of the adjacent pores. As a result, a body tissue filling body in which cells are also attached to the inside of the body tissue filling material is manufactured.

このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の気孔内に細胞を浸透させる浸透段階においては、細胞浮遊液の流動性を高く維持することにより気孔内に円滑に浸透させ、細胞が気孔内部まで到達したときに細胞浮遊液をゲル化させることにより流動性を失わせるので、簡易に、細胞を生体組織補填材の内部にも付着させることができる。   As described above, according to the method for manufacturing a biological tissue filling body according to the present embodiment, in the infiltration stage in which cells penetrate into the pores of the biological tissue filling material, the pores are maintained by maintaining high fluidity of the cell suspension. Since the fluidity is lost by allowing the cell suspension to smoothly penetrate into the pores and gelling the cell suspension when the cells reach the inside of the pores, the cells can be easily attached to the inside of the tissue filling material. .

この場合において、本実施形態に係る製造方法によれば、ゲル化可能材料としてPPPを採用しているので、PPPに含まれているフィブリノーゲンにより形成されるフィブリンの3次元的な足場の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を3次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。また、PPPには、血小板塊その他の細胞の活性化を阻害する物質が含まれていないので、ゲル内に留まる細胞を非常に高い活性に維持することができる。   In this case, according to the manufacturing method according to the present embodiment, since PPP is adopted as the gelable material, the action of the three-dimensional scaffold of fibrin formed by fibrinogen contained in PPP, Activation of the cells attached to the biological tissue filling material can be promoted. Therefore, it is possible to easily adhere to the inside of the pores and grow the cells three-dimensionally from the inside, and promote the activation of the cells to efficiently perform the tissue regeneration. Can be manufactured. Moreover, since PPP does not contain platelets or other substances that inhibit the activation of cells, the cells remaining in the gel can be maintained at a very high activity.

また、本実施形態に係る製造方法によれば、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。しかし、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。したがって、細胞を生体組織補填材に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。   Further, according to the manufacturing method according to the present embodiment, since the cells permeated into the pores are held in the pores by the gelled cell suspension, the cells are replaced with a living tissue filling material that has been conventionally required. There is also an effect that the culturing step for adhering to can be omitted. That is, since it takes time for the cells immediately after introduction to adhere to the pore inner wall of the biological tissue filling material, it is necessary to leave the cells in the culture vessel and to culture them for a predetermined time. However, the biological tissue complement produced by the production method according to the present embodiment is not required to stand because cells are prohibited from flowing out of the pores by the gelled cell suspension. Accordingly, the stationary culture step for attaching the cells to the biological tissue filling material can be omitted or shortened, so that the production efficiency can be increased and the production time can be shortened.

さらに、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、細胞が気孔内に保持され続けるので、生体組織欠損部への補填前および補填後においても、細胞が生体組織補填材の外部に流出せず、効率よく組織再生を行うことができる。   Furthermore, since the cells of the biological tissue filling body produced by the production method according to the present embodiment continue to be retained in the pores, the cells are made of the biological tissue filling material before and after filling the biological tissue defect. Tissue regeneration can be performed efficiently without leaking outside.

なお、本実施形態においては、細胞浮遊液にPPPを添加した溶液に、塩化カルシウム溶液を添加することによりゲル化させる方法を採用した。添加するトロンビン、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。また、PPPに適度に含まれるフィブリノーゲンによって形成されるフィブリンにより細胞浮遊液内の血液成分が凝固され、細胞浮遊液の粘性はさらに高められることになる。   In this embodiment, a method of gelation by adding a calcium chloride solution to a solution obtained by adding PPP to a cell suspension is employed. By appropriately adjusting the amounts of thrombin and calcium chloride to be added, the degree of gelation, that is, the magnitude of the viscosity after gelation and the magnitude of the gelation speed can be adjusted. Moreover, blood components in the cell suspension are coagulated by fibrin formed by fibrinogen appropriately contained in the PPP, and the viscosity of the cell suspension is further increased.

添加する塩化カルシウム量や適度なトロンビンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材の形態に応じて設定することにしてもよい。すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムを増やすことが考えられる。また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液が浸透して行きにくい生体組織補填材に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。したがって、このような場合には、PPP自体に含まれるトロンビン量のままで、塩化カルシウムの添加量は少なくてよい。   The amount of calcium chloride to be added and the appropriate amount of thrombin may be set according to the form of the biological tissue filling material to be seeded with cells. That is, it is considered that calcium chloride is increased so that gelation is started relatively early and a higher viscosity gel is formed for a living tissue filling material having large pores and cells easily flowing out. In addition, when the pores are fine and the viscosity is high, the cell suspension can hardly penetrate and the tissue filling material may have a relatively slow gelation rate and the final gel viscosity may be set low. . Therefore, in such a case, the amount of calcium chloride added may be small with the amount of thrombin contained in the PPP itself.

また、PPP自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。したがって、採取されたPPPの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。   Moreover, since PPP itself is collected from a patient, there are individual differences in gelation speed. Therefore, the amount of calcium chloride or the like to be added may be determined by component analysis of the collected PPP.

また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ES細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。   In addition, the mesenchymal stem cells collected from bone marrow cells have been described as examples of cells to be seeded. However, the present invention is not limited to these, and ES cells, somatic stem cells, bone cells, chondrocytes, nerve cells, etc. Other somatic cells may be employed. In addition, although mesenchymal stem cells are collected from bone marrow, they may be collected from peripheral blood or umbilical cord blood instead.

また、細胞を播種する生体組織補填材としては、β―TCP多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。また、チタンのような金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。   In addition, as a tissue replacement material for seeding cells, instead of β-TCP porous material, biocompatible porous ceramics, collagen, polylactic acid, polyglycolic acid, hyaluronic acid, or a combination thereof can be used. It may be used. Further, a metal such as titanium may be used. Moreover, you may employ | adopt arbitrary forms, such as a block form, a granule form, and a gel form.

[実施例1]
次に、上記実施形態に係る生体組織補填体およびその製造方法の実施例について図3を参照して以下に説明する。
まず、PPPの採取方法について説明する。
フィッシャーラットから採血すると同時に血液保存液(CPD液)と混合することにより凝血を防ぐ。全血とCPD液との割合は10:1である。全血を遠沈管に入れて、312Gで10分間遠心分離し、バフィーコートおよびそれより上層の部分を別の遠沈管に移した。これをさらに1248Gで10分間遠心分離し、上清(9/10の量)を採取した。これがPPPである。残り1/10が多血小板血漿(PRP:Platelet Rich Plasma)である。
[Example 1]
Next, an example of the biological tissue filling body and the manufacturing method thereof according to the above embodiment will be described below with reference to FIG.
First, a method for collecting PPP will be described.
Coagulation is prevented by collecting blood from Fisher rats and mixing with blood preservation solution (CPD solution) at the same time. The ratio of whole blood to CPD fluid is 10: 1. Whole blood was placed in a centrifuge tube and centrifuged at 312 G for 10 minutes, and the buffy coat and the upper layer were transferred to another centrifuge tube. This was further centrifuged at 1248G for 10 minutes, and the supernatant (9/10 amount) was collected. This is PPP. The remaining 1/10 is platelet rich plasma (PRP).

次に、使用した細胞について説明する。
フィッシャーラットの大腿骨骨髄より採取した間葉系幹細胞を、DMEMおよび抗生剤を任意の配合比率で混合した培養液内で、温度37℃±0.5℃、湿度100%、CO濃度5%の培養条件下で10日間培養した後、デキサメタゾン、β−グリセロフォスフェートおよびアスコルビン酸リン酸を添加し4日間分化誘導した。
Next, the used cells will be described.
Mesenchymal stem cells collected from the femur bone marrow of Fischer rats are cultured at 37 ° C. ± 0.5 ° C., humidity 100%, CO 2 concentration 5% in a culture solution in which DMEM and antibiotics are mixed at an arbitrary mixing ratio. After culturing for 10 days under the above culture conditions, dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbic acid phosphate were added to induce differentiation for 4 days.

次に、生体組織補填体について説明する。
上述したPPPおよびPRPに、培養した細胞を浮遊させ、2%塩化カルシウム溶液(PPPおよびPRPに対し1/7の量)を加え、直ちに、1辺が5mmの立方体からなるβ−TCP多孔体に導入することにより生体組織補填体を製造した。細胞濃度は2.6×10/mlである。製造された生体組織補填体をフィッシャーラットの皮下に移植した。
Next, the biological tissue complement will be described.
The cultured cells are suspended in the above-described PPP and PRP, and a 2% calcium chloride solution (1/7 of the amount of PPP and PRP) is added, and immediately, a β-TCP porous body consisting of a cube having a side of 5 mm is formed. A biological tissue complement was produced by the introduction. The cell concentration is 2.6 × 10 6 / ml. The produced biological tissue complement was transplanted subcutaneously into Fischer rats.

次に、移植結果について説明する。
PPP細胞浮遊液およびPRP細胞浮遊液をβ−TCP多孔体に導入した生体組織補填体を、それぞれフィッシャーラットの皮下に移植した後、3週間および6週間経過後に採取し、図3(a)に示すように27分割した。分割されたA〜Dの部分について新生骨の面積率を分析した結果を図3(b)および図3(c)に示す。これらによれば、PRPの場合と比較してPPPの場合の方が、新生骨が多く存在し、細胞の活性が高いことがわかる。
Next, the transplantation result will be described.
3 and 6 weeks after transplanting the biological tissue complement in which the PPP cell suspension and the PRP cell suspension were introduced into the β-TCP porous body, respectively, were collected after the passage of 3 weeks and 6 weeks. It was divided into 27 as shown. The results of analyzing the area ratio of new bone for the divided parts A to D are shown in FIG. 3 (b) and FIG. 3 (c). According to these, it can be seen that there are more new bones and the cell activity is higher in the case of PPP than in the case of PRP.

[実施例2]
次に、PPPとデキサメタゾンとを合わせて用いた場合の効果について説明する。
ニホンザルの大腿骨から穿刺により骨髄液を採取し、DMEMおよびFBS10%の培地で培養した。このとき、デキサメタゾン10nMを加えたものと加えないものとで培養した。継代を行いながら培養し、得られた骨髄細胞をβ−TCP多孔体に播種した。
[Example 2]
Next, the effect of using PPP and dexamethasone together will be described.
Bone marrow fluid was collected from a Japanese monkey femur by puncture and cultured in a medium containing DMEM and FBS 10%. At this time, the cells were cultured with and without dexamethasone 10 nM. The bone marrow cells were cultured while being subcultured, and the obtained bone marrow cells were seeded in a β-TCP porous body.

サンプルとしては、デキサメタゾンを加えずに培養し、移植直前(移植4日前)よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を陰圧でβ−TCP多孔体に導入したもの(DEX−)、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養し、移植直前(移植4日前)よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を、陰圧でβ−TCP多孔体に導入したもの(DEX+PPP−)、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養した骨髄細胞のPPP細胞浮遊液をβ−TCP多孔体に導入してゲル化させたもの(DEX+PPP+)を用意した。これらのサンプルをニホンザルの背部皮下に移植し、移植後5週間経過後に回収して顕微鏡で観察した。   The sample was cultured without adding dexamethasone, and the bone marrow cell suspension obtained by adding dexamethasone, β-glycerophosphate, and ascorbic acid phosphate immediately before transplantation (4 days before transplantation) was negative-pressured and β-TCP porous. Cell suspension of bone marrow cells obtained by adding dexamethasone to the body (DEX-), adding dexamethasone from the beginning of culture, and adding dexamethasone, β-glycerophosphate, ascorbic acid phosphate immediately before transplantation (4 days before transplantation) The solution was introduced into the β-TCP porous body under negative pressure (DEX + PPP-), and the bone marrow cells cultured with dexamethasone added from the beginning of the culture were introduced into the β-TCP porous body for gelation. (DEX + PPP +) was prepared. These samples were transplanted subcutaneously in the back of the Japanese macaque, collected 5 weeks after transplantation, and observed with a microscope.

その結果を図4〜図6に示す。これらの図4〜図6において、(a)は1.25倍拡大写真、(b)は10倍拡大写真をそれぞれ示している、
これらの図4〜図6によれば、(DEX−)、(DEX+PPP−)、(DEX+PPP+)の順に、β−TCP多孔体の全域に骨組織Xが広がっていることがわかる。このことから、デキサメタゾンを培養開始時より添加し、およびPPPを導入した生体組織補填体が骨形成に有効であることが示された。
The results are shown in FIGS. 4 to 6, (a) shows a 1.25-fold magnified photograph, and (b) shows a 10-fold magnified photograph.
4 to 6, it can be seen that the bone tissue X spreads over the entire area of the β-TCP porous body in the order of (DEX−), (DEX + PPP−), and (DEX + PPP +). From this, it was shown that the biological tissue complement to which dexamethasone was added from the beginning of the culture and PPP was introduced was effective for bone formation.

この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the manufacturing method of the biological tissue complement body which concerns on one Embodiment of this invention. 図1の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。It is a flowchart explaining the cell seed | inoculation step in the manufacturing method of FIG. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例1を示し、(a)はサンプルの位置を示す模式図、(b)は3週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をPRPを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフ、(c)は6週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をPRPを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフである。1 shows Example 1 of a biological tissue filling body according to an embodiment of the present invention, (a) is a schematic diagram showing the position of a sample, (b) is a new bone area ratio for each sample after three weeks, PRP The graph shown in contrast with the contained biological tissue complement, (c) is a graph showing the ratio of new bone area for each sample after the lapse of 6 weeks in comparison with the biological tissue supplement containing PRP. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾンを添加せずに培養した細胞を用いた(PPPを用いない)場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。It is a microscope picture which shows the formation state of the bone tissue at the time of using the cell cultured without adding dexamethasone as a comparative example of the biological tissue complementation which concerns on one Embodiment of this invention (it does not use PPP). 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾン存在下で培養した細胞を用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。It is a microscope picture which shows the formation state of the bone tissue at the time of using the cell cultured in the presence of dexamethasone as a comparative example of the biological tissue complement according to one embodiment of the present invention. 本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例2を示し、デキサメタゾン存在下で培養した細胞をPPPとともに用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。It is a microscope picture which shows Example 2 of the biological tissue filling body which concerns on one Embodiment of this invention, and shows the formation state of the bone tissue at the time of using the cell cultured in the presence of dexamethasone with PPP.

符号の説明Explanation of symbols

S8 播種ステップ
S82 PPP添加ステップ
S83 塩化カルシウム添加ステップ
S84 細胞播種ステップ
S8 seeding step S82 PPP addition step S83 calcium chloride addition step S84 cell seeding step

Claims (6)

少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材。   A tissue filling material obtained by introducing platelet-poor plasma into a porous material. 少血小板血漿および細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、少血小板血漿をゲル化させてなる生体組織補填体。   A biological tissue filling material obtained by introducing a platelet-containing plasma and a liquid containing cells into a porous material to gel the platelet-free plasma. 少血小板血漿、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法。   A method for producing a biological tissue filling material, wherein a liquid containing platelet-poor plasma, calcium chloride and cells is introduced into a porous biological tissue filling material, and the liquid is gelled after the introduction. 細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する請求項3に記載の生体組織補填体の製造方法。   The method for producing a body tissue complement according to claim 3, wherein calcium chloride is added to a fluid containing cells and platelet-poor plasma before introducing the fluid into the body tissue filling material. 塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、
生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節する請求項4に記載の生体組織補填体の製造方法。
Add thrombin with calcium chloride,
The manufacturing method of the biological tissue filling body of Claim 4 which adjusts the quantity of the thrombin added according to the form of the biological tissue filling material.
前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞である請求項3から請求項5のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法。   The method for producing a biological tissue complement according to any one of claims 3 to 5, wherein the cells are cells cultured in the presence of dexamethasone.
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