JP2005160669A - Manufacturing method of biological tissue prosthesis - Google Patents

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JP2005160669A JP2003402541A JP2003402541A JP2005160669A JP 2005160669 A JP2005160669 A JP 2005160669A JP 2003402541 A JP2003402541 A JP 2003402541A JP 2003402541 A JP2003402541 A JP 2003402541A JP 2005160669 A JP2005160669 A JP 2005160669A
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Koji Hakamazuka
Hisaya Orii
Katsuya Sadamori
Shinichi Saotome
Kenichi Shinomiya
謙一 四宮
久弥 折井
進一 早乙女
康治 袴塚
克也 貞森
Original Assignee
Olympus Corp
Kenichi Shinomiya
オリンパス株式会社
謙一 四宮
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To grow a cell from the inside of a biological tissue prosthetic material by easily making the cell intrude even in a microstoma and preventing easy outflowing thereof from the microstoma. <P>SOLUTION: This manufacturing method of the biological tissue prosthesis introduces liquid including cells into a porous biological tissue prosthetic material (S8), and gelates the liquid after the introduction. More practically, this manufacturing method of the biological tissue prosthesis involves addition of calcium chloride to the liquid including the cells and platelet rich plasma (S83) before introducing the liquid in the biological tissue prosthetic material. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。 The present invention relates to a manufacturing method of repairing biological tissues.

近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム(β−TCP)やハイドロキシアパタイト(HAP)等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。 Recently, in a so-called regenerative medicine, in order to increase the rate of repair of defects in the postoperative biological tissue, remove the mesenchymal stem cells from bone marrow cells or the like collected from patients, beta-tricalcium phosphate (beta-TCP) Ya by culturing with hydroxyapatite (HAP) body tissue filling material such as it has been proposed to produce a body tissue filler represented by cultured bone. 生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる(例えば、非特許文献1参照。)。 Body tissue filler, upon implantation, is already since the bone filling material contains many mesenchymal stem cells grown in the scaffold, as compared to the method of growing cells in the body after surgery, substituted autologous it is possible to significantly reduce the number of days until (e.g., see non-Patent Document 1.).

生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。 To produce a body tissue filler is generally firstly, increasing the mesenchymal stem cells taken from the patient's bone marrow cells or the like to the required number of cells in primary culture in a culture vessel. この過程において、成長した細胞は、少なくとも1回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。 In this process, the grown cells, at least once, is peeled from the culture vessel is changed further transferred to a large culture vessels. そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。 Then, when increased to ultimately required number of cells, again, allowed to detached from the culture vessel and allowed to adhere to a biological tissue filling material, subcultured is performed. これにより、生体組織補填体が製造される(例えば、非特許文献2参照。)。 Thus, body tissue filler is manufactured (e.g., Non-Patent Document 2 see.).

この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。 In this case, mesenchymal stem cells, by growing attached to the biological tissue filling material, because it is activated as the formation of the biological tissue is actively performed, the mesenchymal stem cells to the body tissue filling material be sufficiently deposited is important. 従来、生体組織補填材に細胞を十分に付着させる方法として、生体組織補填材の材質を改善し、生物活性ガラス材料あるいは生物活性セラミック材料により構成し、 特有のイオンを含む水溶液により処理することが提案されている(例えば、特許文献1参照。)。 As a method to sufficiently adhere the cells to the body tissue filling material, it can improve the material of the biological tissue-reinforcing material, composed of a bioactive glass material or a bioactive ceramic material is treated with an aqueous solution containing a specific ion It has been proposed (e.g., see Patent Document 1.).
特表2000−506738号公報(第10頁20〜23行等) Kohyo 2000-506738 JP (page 10, 20 to 23, line etc.)

しかしながら、例えば、β−TCPのような材質からなる生体組織補填材は、骨のように、再生後の強度を高く保つ必要がある生体組織を補填する場合には、気孔率を小さくしていく必要があるが、気孔率が小さくなればなるほど、播種された細胞は気孔内部に入り込み難くなるという問題がある。 However, for example, biological tissue-reinforcing material made of a material such as beta-TCP, as a bone, in the case of filling a biological tissue that needs to maintain a high strength after regeneration, it will reduce the porosity it is necessary, but the smaller the porosity, seeded cells there is a problem that it becomes difficult to enter the inner pores. すなわち、気孔が小さくなると、細胞自体の粘性や接着性により気孔内に細胞が入って行き難くなる。 That is, when the porosity decreases, and it becomes difficult to go contains cells in the pores by the cells themselves viscosity and adhesiveness. したがって、例えば、所定の大きさの生体組織欠損部を補填するために、該欠損部に合致するような比較的大きなブロック状のβ−TCP多孔体からなる生体組織補填材においては、播種された細胞を生体組織補填材の内部まで浸透させることが困難であった。 Thus, for example, in order to compensate the biological tissue defect of a predetermined size, in the body tissue filling material of relatively large blocky beta-TCP porous body so as to conform to 該欠 loss portion, seeded cells were difficult to penetrate into the body tissue filling material.

一方、細胞を気孔内に進入させ易くするために、細胞を含む液体の粘性を低くすることも考えられるが、粘性が低いと細胞が気孔内に留まり難くなり、細胞が生体組織補填材の気孔内壁に付着する前に生体組織補填材の外部に流れ出てしまうことにもなる。 Meanwhile, in order to easier to enter the cells in the pores, it is conceivable to lower the viscosity of the liquid containing the cells, viscosity and cells hardly remain in the pores low, the cells of the body tissue filling material pores also that flows out to the outside of the body tissue filling material before adhering to the inner wall. 細胞が気孔内に入り込み易く、かつ、流出し難いように細胞を含む液体の粘性を調整することは極めて困難であった。 Easily enter the cells within the pores, and adjusting the liquid containing the cells viscous so hard outflow has been extremely difficult.

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention was made in view of such circumstances, while easily permeate the cell in fine pores, and hardly flows out from the pores, the cells from the inside of the biological tissue-reinforcing material and to provide a method for producing a body tissue filler can be grown.

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。 In order to solve the above problems, the present invention provides the following means.
本発明は、細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。 The present invention, a liquid containing cells introduced into a porous biological tissue filling material, the liquid to provide a method of manufacturing a body tissue filler to gel after introduction.
この発明によれば、細胞を含む液体が生体組織補填材に導入された後にゲル化させられるので、生体組織補填材への導入時、すなわち、細胞を含む液体が生体組織補填材の気孔内に浸透するときには、比較的低い粘性に抑えることができる。 According to the present invention, since it is allowed to gel after liquid containing cells is introduced into a biological tissue filling material, upon introduction into a biological tissue filling material, i.e., a liquid containing the cells in the pores of the body tissue filling material when you penetrate, it can be suppressed to a relatively low viscosity. したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。 Therefore, when introducing, to facilitate penetration into the pores by the relatively high fluidity, after being introduced once, by changing the highly viscous gel, it is possible to stay the cells in the pores. 細胞は、気孔内に滞留させられることによって、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。 Cells by being allowed to stay in the pores, attached to the pore inner walls of the nearby been activated, it is possible to differentiate into fully living tissue. その結果、比較的大きなブロック状の生体組織補填材においても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。 As a result, even at relatively large blocky biological tissue-reinforcing material, it is possible to produce a body tissue filling with cells grown sufficiently to the inside.

上記発明においては、前記液体が、フィブリン、多血小板血漿、ゼラチンまたはコラーゲン等のゲル化可能材料を含むことが好ましい。 In the above invention, the liquid, fibrin, platelet rich plasma, preferably includes a gelling material, such as gelatin or collagen.
これらのゲル化可能材料は、生体吸収性の材料であり、生体内に補填された後には消滅するので、体内に異物を残すことがなく、補填材料として適している。 These gelling material is a bioabsorbable material, so vanishing the after being compensated in vivo, without leaving a foreign object in the body, are suitable as filling material. 特に、多血小板血漿(Platelet Rich Plasma:以下、単にPRPとも言う。)は、TGF−β、PDGF、IGFなどの種々の自家成長因子を多く含んでいるため、この多血小板血漿を用いることが、生体組織の再生をさらに促進することになり、好ましい。 In particular, the platelet-rich plasma (Platelet Rich Plasma:. Hereinafter, simply referred to as PRP) is, TGF-beta, PDGF, because it contains a lot of various autologous growth factors such as IGF, is the use of the platelet-rich plasma, It will further promote the regeneration of biological tissue, preferably.

また、上記発明においては、前記液体が、多血小板血漿と塩化カルシウムとを含むことが好ましい。 In the aspect described above, the liquid preferably comprises a calcium chloride platelet-rich plasma.
この発明によれば、クエン酸ナトリウムを含むPRPは、塩化カルシウムが添加される前にはゲル化が起こらないが、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始する。 According to the invention, the PRP containing sodium citrate, but gelation does not occur before the calcium chloride is added, the calcium chloride is added, slowly to start gelation. したがって、この性質を利用すれば、生体組織補填材への導入時には粘性を低く、導入後には粘性を高くすることができ、上記効果を簡易に達成することが可能となる。 Therefore, by utilizing this property, upon introduction into a biological tissue filling material is low viscosity, can increase the viscosity after the introduction, it is possible to achieve the effect easily.

さらに、上記発明においては、細胞と多血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加することが好ましい。 Further, in the above invention, the liquid containing the cells and platelet-rich plasma prior to introducing the liquid into biological tissue filling material, it is preferable to add calcium chloride. このようにすることで、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始する多血小板血漿を含む液体の性質を利用して、細胞が生体組織補填材の内部に浸透するまで流動性を保ち、気孔内に到達した適当な時期に流動性をなくして留まらせることが可能となる。 In this way, when calcium chloride is added, slowly by utilizing the property of liquid containing platelet-rich plasma to start the gelation, the fluid to the cells to penetrate the interior of the body tissue filling material keeping, it is possible to remain lost fluidity at the appropriate time has been reached in the pores.

また、塩化カルシウムとともにPRP内に含まれるフィブリノーゲンを添加し、生体組織補填材の形態に合わせて、添加するフィブリノーゲンの量を調節することにしてもよい。 Further, the addition of fibrinogen contained with calcium chloride in the PRP, in accordance with the form of a biological tissue-reinforcing material, may be adjusting the amount of fibrinogen to be added. これにより、例えば、気孔が細かい生体組織補填材に対しては、フィブリノーゲンの量を少なくして凝固反応を少なくすることにより、ゲル化速度を遅くすることができ、気孔が比較的大きな生体組織補填材に対しては、フィブリノーゲンの量を多くして凝固反応を促進し、PRPと塩化カルシウムとの反応によるゲル化を早めることができる。 Thus, for example, for the pores finer biological tissue filling material, by reducing the coagulation reaction by reducing the amount of fibrinogen, it is possible to slow down the gelation rate, the pores are relatively large body tissue filling for wood, by increasing the amount of fibrinogen to promote coagulation reaction, it is possible to accelerate the gelation by reaction with PRP and calcium chloride.

本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めかつ生体組織補填材内部に細胞を滞留させることを可能として、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を製造することができるという効果を奏する。 According to the present invention, as allows to the interior of the permeable enhanced and body tissue filling material cells into body tissue filling material retained cells, the cells also activated inside the body tissue filling material, sufficient an effect that can be produced body tissue filling grown.

以下に、本発明に係る生体組織補填体の製造方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。 Hereinafter, an embodiment of a method for manufacturing a body tissue filler according to the present invention will be described with reference to the drawings.
この製造方法は、図1に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する(ステップS1)。 This manufacturing method, as shown in FIG. 1, for example, culture by the mesenchymal stem cells taken from bone marrow cells, was charged with a given culture the culture vessel is maintained at a constant culture conditions (step S1).

培養液は、例えば、MEM(Minimal Essential Medium:最小必須培地)、抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。 Culture, for example, MEM (Minimal Essential Medium: Minimum Essential Medium), is a mixture in any mixing ratio antibiotics. また、培養条件は、例えば、温度37℃±0.5℃、湿度100%、CO 濃度5%である。 Also, culture conditions, e.g., temperature 37 ° C. ± 0.5 ° C., 100% humidity, a CO 2 concentration of 5%.

この培養の過程(ステップS1)においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し(ステップS2,S3)、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく(ステップS4,S5)。 In the course of the culture (step S1), the exchange periodically or broth if necessary (step S2, S3), in accordance with the growth of the cells, continue to change them to larger culture vessels ( step S4, S5).

また、少なくとも1回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると(ステップS6)、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される(ステップS7)。 Furthermore, cells cultured while to change the at least one culture container is caused to be grown to a cell number required (step S6), and again, while being detached from the culture vessel, also disconnected cell binding each other It is separated into pieces Te (step S7). その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―TCP多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される(ステップS8)。 Thereafter, cells isolated apart, after being mixed with a predetermined solution, are seeded into body tissue filling material consisting of beta-TCP porous body block (step S8).

図中、符号S9は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。 In the figure, reference numeral S9 is differentiation step, the mesenchymal stem cells to some extent growth, adding differentiation inducer such as dexamethasone. これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。 Thus, mesenchymal stem cells, the desired living tissue, for example, be differentiated into osteoblasts, body tissue filler is produced. 分化ステップS9は、図1のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することにしてもよく、また、生体組織補填材への播種後に行うことにより、生体組織補填材を足場として生体組織細胞を成長させることにしてもよい。 Differentiation step S9, before seeding into cells of the living tissue filling material as shown in FIG. 1, by performing in the culture, to some extent, was induced to differentiate into biological tissue cells to be seeded in a biological tissue filling material at best, also, by proceeding after sowing of the biological tissue-reinforcing material, a biological tissue filling material may be growing the living tissue cells as the scaffold. また、符号S10は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。 Further, reference numeral S10 is an evaluation step of evaluating the state of cells contained in body tissue filling produced.

上記播種ステップS8においては、図2に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合される(ステップS81)ことにより、所定濃度の細胞浮遊液が構成される。 In the seeding step S8, as shown in FIG. 2, cells isolated apart is first by being mixed with the medium (step S81), the cell suspension of a predetermined concentration is formed. 培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。 Culture can be the same as the culture solution used in the culture described above. 細胞浮遊液は、その後に添加されるPRP等の他のゲル化可能材料の量を考慮して、細胞を多く含む高い濃度に設定されている。 Cell suspension, taking into account of other amounts of gellable material PRP or the like which is added subsequently, is set to a high concentration containing many cells. 次いで、この細胞浮遊液に、PRPを添加する(ステップS82)。 Then, this cell suspension is added to PRP (step S82). PRPに含まれるフィブリノーゲンの添加量は、おおよそ2〜45mg/mlの濃度の細胞浮遊液が構成される程度の量でよい。 Amount of fibrinogen contained in the PRP is roughly cell suspension at a concentration of 2~45mg / ml may be an amount of about constructed.

次に、細胞の播種に先立って、細胞を播種する生体組織補填材を準備しておく。 Then, prior to the seeding of the cells, prepare a body tissue filling material for seeding cells. 生体組織補填材は、例えば、ブロック状のβ−TCP多孔体である。 Biological tissue-reinforcing material, for example, a block-shaped beta-TCP porous body. そして、上記のようにして構成されたPRPを含む細胞浮遊液に、塩化カルシウム溶液を添加する(ステップS83)。 Then, the cell suspension containing the PRP, which is constructed as described above, the addition of calcium chloride solution (step S83). 添加する塩化カルシウム溶液は、PRPに対しておおよそ0.01mol/l〜0.1mol/lの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。 Calcium chloride solution added is obtained by dissolving calcium chloride to approximately a concentration of 0.01mol / l~0.1mol / l relative to PRP.

PRPにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。 Because the PRP contains sodium citrate, it added calcium chloride and sodium citrate gelation is initiated by the reaction. ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウムを添加した後には、即座に、ピペッティングにより生体組織補填材に播種する(ステップS84)。 The reaction of gelation is generally moderate, it takes several minutes to viscosity increases, after addition of calcium chloride immediately seeded into body tissue filling material by pipetting (step S84).

塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液の粘性は低い状態に維持されている。 If you have just calcium chloride addition, gelation is not in progress, the viscosity of the cell suspension is maintained at a low state. したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材の気孔内に浸透していくことが可能となる。 Thus, cells, it is possible to continue to relatively easily penetrate into the pores of the body tissue filling material. そして、細胞が生体組織補填材の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。 Then, the cells by the time to penetrate to the center of the body tissue filling material, gelation reaction of sodium citrate and calcium chloride proceeds, the cell suspension is allowed to gel viscosity increases rapidly.

これにより、ゲル化された細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。 Thus, cells that are included in the gelled cell suspension in is allowed to stay in the pores of the body tissue filling material. その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。 As a result, the cells will remain in the pores without flowing out biological tissue filling material, grow attached to the inner wall of the adjacent pores. これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の生体組織補填体が製造されることになる。 Thus, also in the interior of the body tissue filling material so that the body tissue fillings in a state where the cells are attached is manufactured.

このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の気孔内に細胞を浸透させる浸透段階においては、細胞浮遊液の流動性を高く維持することにより気孔内に円滑に浸透させ、細胞が気孔内部まで到達したときに細胞浮遊液をゲル化させることにより流動性を失わせるので、簡易に、細胞を生体組織補填材の内部にも付着させることができる。 Thus, according to the manufacturing method of the body tissue filler according to the present embodiment, in the osmotic step of infiltrating cells into the pores of the biological tissue-reinforcing material, the pores by maintaining a high fluidity of cell suspension smoothly infiltrated within, since the loss of fluidity by gelling a cell suspension when the cells reached inner pores, easily, the cells can be attached to the inside of the biological tissue-reinforcing material .

この場合において、本実施形態に係る製造方法によれば、ゲル化可能材料としてPRPを採用しているので、PRPに含まれているTGF−β、PDGF、IGF等の成長因子の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。 In this case, according to the manufacturing method according to the present embodiment, because it uses the PRP as a gelling material, TGF-beta included in PRP, PDGF, by the action of growth factors IGF, and bio it can promote the activation of cells attached to the tissue filling material. したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を3次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。 Therefore, simple to adhere to the inside of pores, it is possible to grow the cells from inside the three-dimensionally, to facilitate activation of cells, biological can perform tissue regeneration efficiently tissue filler material it can be produced.

また、本実施形態に係る製造方法によれば、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。 Further, according to the manufacturing method of this embodiment, the cells were allowed to penetrate into the pores, since it is retained in the pores by the gelled cell suspension, which was conventionally needed, the cells body tissue filling material there is also an effect that it is possible to omit the culturing step for attaching to. すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。 That is, the cells just after introduction since it takes time to adhere to the pore inner wall of the biological tissue-reinforcing material, and placed in the culture vessel, it is necessary to fixed culture time. しかし、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。 However, body tissue filler produced by the method according to the present embodiment, the cell by the gelled cell suspension since it is prohibited to flow from the pores, there is no need to stand. したがって、細胞を生体組織補填材に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。 Therefore, the cells were not required for static culture step for attaching to the biological tissue filling material, or it is possible to shorten, increasing the manufacturing efficiency, it is possible to shorten the manufacturing time.

さらに、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、細胞が気孔内に保持され続けるので、生体組織欠損部への補填前および補填後においても、細胞が生体組織補填材の外部に流出せず、効率よく組織再生を行うことができる。 Furthermore, body tissue filler produced by the method according to this embodiment, since the cell continues to be retained in the pores, even after filling before and filling into the biological tissue defect, the cells of the body tissue filling material not flow out to the outside, it can be efficiently performed tissue regeneration.

なお、本実施形態においては、細胞浮遊液にPRPを添加した溶液に、塩化カルシウム溶液を添加することによりゲル化させる方法を採用した。 In this embodiment, a solution prepared by adding PRP to the cell suspension, was adopted a method of gelling by addition of calcium chloride solution. 添加するフィブリノーゲン、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。 Fibrinogen addition, by adjusting the amount of calcium chloride as appropriate, the extent of gelation, i.e., can be adjusted in viscosity after gelation magnitude, the magnitude of the rate of gelation. また、PRPに適度に含まれるトロンビンによって細胞浮遊液内の血液成分が凝固され、細胞浮遊液の粘性はさらに高められることになる。 Further, the blood components clotting cell suspension in the thrombin contained in moderate to PRP, the viscosity of the cell suspension will be further enhanced. さらに、トロンビンを添加することにより、ゲル化の速度を調節することも可能である。 Further, by adding thrombin, it is also possible to adjust the speed of gelation.

添加する塩化カルシウム量や適度なフィブリノーゲンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材の形態に応じて設定することにしてもよい。 The amount of moderate fibrinogen and calcium chloride amount to be added may be to set depending on the form of the biological tissue-reinforcing material should be seeded cells. すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムを増やすことが考えられる。 That is, for the pores greater cell to flow out easily biological tissue filling material, a relatively premature gelation is started, and it is considered to increase the calcium chloride to be more highly viscous gel. また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液が浸透して行きにくい生体組織補填材に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。 Also, pores for the fine a viscous and cell suspension permeates hardly go biological tissue filling material may be a relatively slow gelation rate may be set lower viscosity of the final gel . したがって、このような場合には、PRP自体に含まれるトロンビン量のままで、塩化カルシウムの添加量は少なくてよい。 Therefore, in such a case, remains thrombin content in the PRP itself, the amount of calcium chloride may be less.

また、PRP自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。 Further, since the PRP itself is intended to be collected from the patient, there are individual differences in gelation rate. したがって、採取されたPRPの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。 Thus, the component analysis of the collected PRP, may determine the amount of calcium chloride added.

なお、上記実施形態においては、ゲル化可能材料として、PRPを例に挙げて説明した。 In the above embodiment, as the gelling material has been described by way of PRP as an example. PRPはTGF−βのような成長因子を多く含んでいるためにゲル化可能材料として適しているが、これに限定されるものではなく、他の材料、例えば、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンのような生体吸収性のゲル化可能材料を採用することにしてもよい。 The PRP is suitable as a gelling material because it contains a large amount of growth factors such as TGF-beta, is not limited to this, other materials, for example, such as fibrin, gelatin, collagen it may be employing a bioabsorbable gelling material.

また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ES細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。 Further, as cell seeding, but the mesenchymal stem cells collected from bone marrow cells is described as an example, but the invention is not limited to, ES cells, somatic stem cells, bone cells, cartilage cells, nerve cells, etc. it may be possible to adopt other somatic cells. また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。 Further, mesenchymal stem cells but was be taken from the bone marrow, instead of this, it may be be taken from peripheral blood or umbilical cord blood.

また、細胞を播種する生体組織補填材としては、β―TCP多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。 As the body tissue filling material for seeding cells, instead of the beta-TCP porous body and porous ceramics having biocompatibility, collagen, polylactic acid, polyglycolic acid, hyaluronic acid or combinations thereof, it may be used. また、チタンのような金属であってもよい。 Further, it may be a metal such as titanium. また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。 Moreover, the form also block-like, granular, may be employed a gel like any form.

この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。 It is a flowchart showing a manufacturing method of the body tissue filler according to an embodiment of the present invention. 図1の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。 Is a flowchart illustrating the step of seeding the cells in the manufacturing method of FIG.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

S8 播種ステップ S82 PRP添加ステップ S83 塩化カルシウム添加ステップ S84 細胞播種ステップ S8 seeding step S82 PRP added step S83 calcium chloride added step S84 cell seeding step

Claims (5)

  1. 細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法。 A liquid containing cells, was introduced into a porous biological tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler to gel the liquid after introduction.
  2. 前記液体が、フィブリン、多血小板血漿、ゼラチンまたはコラーゲン等のゲル化可能材料を含む請求項1に記載の生体組織補填体の製造方法。 Wherein the liquid, fibrin, platelet rich plasma, method for producing a body tissue filling body according to claim 1 comprising gelatin or a gelling material, such as collagen.
  3. 前記液体が、多血小板血漿溶液と塩化カルシウム溶液とを含む請求項1に記載の生体組織補填体の製造方法。 It said liquid producing method of repairing biological tissues according to claim 1 comprising a platelet-rich plasma solution with a calcium chloride solution.
  4. 細胞と多血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する請求項3に記載の生体組織補填体の製造方法。 The liquid containing the cells and platelet-rich plasma prior to introducing the liquid into biological tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler according to claim 3, addition of calcium chloride.
  5. 塩化カルシウムとともにフィブリノーゲンを添加し、 It added fibrinogen with calcium chloride,
    生体組織補填材の形態に合わせて、添加するフィブリノーゲンの量を調節する請求項4に記載の生体組織補填体の製造方法。 In accordance with the form of a body tissue filling material, manufacturing method of the body tissue filler according to claim 4 for adjusting the amount of fibrinogen to be added.
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