JP2006230260A - Acetobacter having reinforced acetic acid resistance and method for producing edible vinegar by using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酢酸耐性が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法に関し、詳しくは、酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する新規タンパク質、及び該新規タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を用いて培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることによって酢酸耐性の向上した酢酸菌、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの酢酸菌を用いて食酢を効率良く製造する方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an acetic acid bacterium having enhanced acetic acid resistance, and a method for producing vinegar using the acetic acid bacterium, and more specifically, a novel protein having a function of enhancing acetic acid resistance of an acetic acid bacterium, and the novel protein A gene, an acetic acid bacterium improved in acetic acid resistance by increasing the expression level of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount is increased in response to acetic acid in a medium, in particular, Acetobacter and The present invention relates to acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconacetobacter, and a method for efficiently producing vinegar using these acetic acid bacteria.
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しない、酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
Acetic acid bacteria are microorganisms widely used for vinegar production, and particularly acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are used for industrial acetic acid fermentation.
In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted to acetic acid. As a result, acetic acid accumulates in the medium, but acetic acid is also inhibitory to acetic acid bacteria. As the concentration of acetic acid increases and the concentration of acetic acid in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
Therefore, in acetic acid fermentation, it is required to develop acetic acid bacteria that do not decrease the growth ability and fermentation ability even at higher acetic acid concentrations. As one means, a gene involved in acetic acid resistance (acetic acid resistance gene) is required. Attempts have been made to clone and breed and improve acetic acid bacteria using the acetic acid resistance gene.
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献２参照）。
As for the knowledge about the acetic acid resistance gene of acetic acid bacteria so far, a cluster is formed as a complementary gene that can restore acetic acid sensitivity by mutating the acetic acid resistance of Acetobacter acetic acid bacteria. Three genes (aarA, aarB, aarC) have been cloned (see, for example, Non-Patent Document 1).
Among them, the aarA gene is a gene encoding citrate synthase, and the aarC gene was estimated to be an enzyme encoding an enzyme related to acetic acid utilization, but the function of the aarB gene is unknown. (For example, refer nonpatent literature 2).
A transformed strain obtained by cloning a gene fragment containing these three acetate-resistant genes into a multi-copy plasmid and transforming it into a Gluconacetobacter xylinus IFO3288 strain has an improved level of acetate resistance. Whether or not there is an improvement in performance in actual acetic acid fermentation was unclear (see, for example, Patent Document 2).
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
上記以外に酢酸発酵能を向上させる遺伝子として、アコニターゼ遺伝子（例えば、特許文献３参照）、アルコール脱水素酵素（例えば、特許文献４参照）、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと相同性のある遺伝子（例えば、特許文献５参照）、グルコシルセラミド合成酵素（例えば、特許文献６参照）、ＡＢＣトランスポーター遺伝子と相同性のある遺伝子（例えば、特許文献７参照）などが知られており、これらの遺伝子を過剰発現させることにより、酢酸菌の酢酸耐性が向上することを見出されているが、いずれも不十分であった。
このような実情から、より高い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
On the other hand, an example has been disclosed in which the final acetic acid concentration has been improved in acetic acid fermentation by introducing a gene encoding membrane-bound aldehyde dehydrogenase (ALDH) cloned from acetic acid bacteria into acetic acid bacteria. (For example, refer to Patent Document 1). However, since ALDH is an enzyme having a function of oxidizing acetaldehyde and not directly related to acetic acid resistance, it cannot be determined that the gene encoding ALDH is truly an acetic acid resistance gene.
Other than the above, genes that improve acetate fermentation ability include aconitase gene (see, for example, Patent Document 3), alcohol dehydrogenase (see, for example, Patent Document 4), and a gene homologous to serine palmitoyltransferase (for example, Patent Document). 5), glucosylceramide synthase (for example, see Patent Document 6), genes homologous to ABC transporter genes (for example, see Patent Document 7), etc., and overexpressing these genes Has been found to improve the acetic acid resistance of acetic acid bacteria, but both were insufficient.
Under such circumstances, it has been desired to breed acetic acid bacteria having higher acetic acid resistance.
本発明は、酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する新規タンパク質、及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供し、かつ、該新規タンパク質をコードする遺伝子を用いて酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種する方法を提供することを目的とするものである。
また本発明は、該酢酸菌を用いて食酢や高濃度の酢酸を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
The present invention provides a novel protein having a function of enhancing the acetic acid resistance of acetic acid bacteria, and a gene encoding the novel protein, and an acetic acid bacterium having improved acetic acid resistance using the gene encoding the novel protein. The purpose is to provide a breeding method.
Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing vinegar and high-concentration acetic acid using the acetic acid bacterium.
本発明者は、上記目的を達成すべく、従来とは別の観点で、酢酸菌の酢酸耐性を向上させる手段を検討することとした。その過程で、本発明者は、これまで検討されていなかった酢酸菌のセンサーキナーゼタンパク質を利用することに着目した。
一般に遺伝子の発現に係わる転写制御は、その遺伝子の転写開始点における制御とは別に、温度やｐＨなどの各種の培養ストレスに応答するセンサーキナーゼタンパク質とそれによってリン酸化され活性化されるレスポンスレギュレータータンパク質によって構成される２成分系と呼ばれる転写制御系が知られており、この系によって複数の遺伝子の転写が同時に制御されることが大腸菌等で明らかにされている。
しかし、酢酸菌では２成分系と呼ばれる転写制御系の存在は知られていなかった。
In order to achieve the above object, the present inventor decided to examine means for improving acetic acid resistance of acetic acid bacteria from a viewpoint different from the conventional one. In the process, the present inventor has focused on using a sensor kinase protein of acetic acid bacteria that has not been studied so far.
In general, transcriptional control related to gene expression is a sensor kinase protein that responds to various culture stresses such as temperature and pH, and a response regulator protein that is phosphorylated and activated by it, in addition to the control at the transcription start point of the gene. A transcription control system called a two-component system constituted by the above is known, and it has been clarified in E. coli and the like that the transcription of a plurality of genes is simultaneously controlled by this system.
However, in acetic acid bacteria, the existence of a transcription control system called a two-component system has not been known.
そこで、本発明者は、酢酸菌の２成分系、特に、酢酸発酵に特徴的な酢酸ストレスに応答してそれ自体の転写量が変動する２成分系タンパク質の中に、酢酸耐性を向上させる複数の遺伝子の転写を制御する機能を有するものが存在し、その２成分系自体の発現量を制御することにより、酢酸ストレスに応答して酢酸耐性を向上させる複数の遺伝子の転写制御を同時に行うことができ、その結果、従来以上に酢酸菌の酢酸耐性を向上させることができるのではないかと考えた。
さらに、２成分系を構成するセンサーキナーゼタンパク質とレスポンスレギュレータータンパク質のうち、酢酸ストレスを最初に感知する役割を担うセンサーキナーゼタンパク質がより重要と考えた。
Accordingly, the present inventor has proposed that a plurality of acetic acid bacteria to improve acetic acid tolerance among the two-component proteins of acetic acid bacteria, in particular, the two-component proteins whose transcription amount varies in response to acetic acid stress characteristic of acetic acid fermentation. There are those that have the function of controlling the transcription of other genes, and by controlling the expression level of the two-component system itself, the transcriptional control of multiple genes that improve acetic acid tolerance in response to acetic acid stress is performed simultaneously As a result, it was thought that the acetic acid tolerance of acetic acid bacteria could be improved more than before.
Furthermore, among the sensor kinase proteins and response regulator proteins constituting the two-component system, the sensor kinase protein that plays the role of first sensing acetate stress was considered more important.
一般にセンサーキナーゼタンパク質は、そのアミノ酸配列の中に、機能ドメインとしてリン酸化される部位とＡＴＰを結合する部位を有することが知られている。
そこで、本発明者は、上記の特徴的なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を鋭意探索し、培地に酢酸を添加した場合にそれ自体の転写量が増大する遺伝子を見出した。
さらに、見出した培地の酢酸に応答して転写量が増大した遺伝子をプラスミドベクターと連結し、酢酸菌に導入し、形質転換された酢酸菌の酢酸を含む培地での生育の有無を比較することで酢酸耐性を調べたところ、酢酸耐性の向上が認められた。
さらに該微生物を使用してアルコールを含有する培地で培養することにより、酢酸の生成速度や蓄積できる酢酸濃度が高まり、酢酸発酵能が向上することを見出し、本発明を完成した。
In general, it is known that a sensor kinase protein has, in its amino acid sequence, a site that is phosphorylated as a functional domain and a site that binds ATP.
Therefore, the present inventors have eagerly searched for a gene encoding a protein having the above-mentioned characteristic amino acid sequence, and found a gene whose transcription amount increases when acetic acid is added to the medium.
In addition, the gene whose transcription amount increased in response to acetic acid in the found medium is linked to a plasmid vector, introduced into acetic acid bacteria, and the presence or absence of growth of the transformed acetic acid bacteria in a medium containing acetic acid is compared. When the acetic acid resistance was examined by, an improvement in acetic acid resistance was observed.
Furthermore, the inventors have found that by culturing in a medium containing alcohol using the microorganism, the production rate of acetic acid and the acetic acid concentration that can be accumulated are increased, and the acetic acid fermenting ability is improved, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、（１）から（１０）からなる。
（１）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（２）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって発現量を高めることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
That is, the present invention comprises (1) to (10).
(1) A method for breeding acetic acid bacteria having improved acetic acid resistance, characterized by increasing the expression level of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium.
(2) The expression level is increased by introducing and expressing a gene encoding a sensor kinase protein that increases the transcription level in response to acetic acid in the medium. A method for breeding acetic acid bacteria with improved acetic acid resistance.
（３）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(3) The gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium is the DNA shown in the following (a) or (b), Method for breeding acetic acid bacteria with improved acetic acid resistance.
(A) DNA consisting of base numbers 113 to 1507 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of nucleotide numbers 113 to 1507 or DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（４）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(4) The gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium is the DNA shown in the following (a) or (b), Method for breeding acetic acid bacteria with improved acetic acid resistance.
(A) DNA consisting of base numbers 107 to 1486 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(B) Among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（５）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(5) DNA of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) DNA consisting of base numbers 113 to 1507 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of nucleotide numbers 113 to 1507 or DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（６）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(6) A DNA of a gene encoding a sensor kinase protein, the transcription amount of which increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) DNA consisting of base numbers 107 to 1486 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(B) Among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（７）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(7) A sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and is resistant to acetic acid A protein having a function of enhancing the function.
（８）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(8) A sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and resistant to acetic acid A protein having a function of enhancing the function.
（９）酢酸菌がアセトバクター属、または、グルコンアセトバクター属に属することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（１０）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
(9) The method for breeding acetic acid bacteria having improved acetic acid resistance according to any one of (1) to (4) above, wherein the acetic acid bacteria belong to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.
(10) The acetic acid bacterium having improved acetic acid resistance according to any one of (1) to (4) above is cultured in a medium containing alcohol, and acetic acid is produced and accumulated in the medium. To make vinegar.
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸耐性を増強する機能を有する新規なセンサーキナーゼタンパク質、及び、該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
また、該センサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴する酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法が提供される。
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸存在下での生育能を高めることができる。そして、酢酸に対する耐性が顕著に向上する。その結果、培地中での酢酸発酵速度の向上や高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造することができる。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel sensor kinase protein which has a function which enhances acetic acid tolerance with respect to acetic acid bacteria, and the gene which codes this protein are provided.
Also provided is a method for breeding acetic acid bacteria with improved acetic acid resistance, characterized by increasing the expression level of a gene encoding the sensor kinase protein.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the growth ability in the presence of acetic acid can be improved with respect to acetic acid bacteria. And the tolerance with respect to an acetic acid improves notably. As a result, it is possible to improve the rate of acetic acid fermentation in the medium and efficiently produce vinegar containing high concentration of acetic acid.
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする。
ここで、センサーキナーゼタンパク質とは、センサーキナーゼタンパク質、すなわち、一般にヒスチジンキナーゼと呼ばれるタンパク質を指す。このセンサーキナーゼタンパク質は、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列中に、センサーキナーゼタンパク質の機能ドメインであるリン酸化部位とＡＴＰ結合部位とが存在していることが特徴である。
また、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するとは、酢酸菌を、酢酸の存在しない培地を用いた培養中において、該培地中に酢酸を添加して更に培養を継続した場合に、あるタンパク質をコードする遺伝子の転写量が、酢酸添加前と比較して増大することを意味する。このような転写量の増大は、ノザン解析や定量的ＰＣＲ法などの一般的な方法によって検出することができる。
The present invention will be specifically described below.
The method for breeding acetic acid bacteria having improved acetic acid resistance according to the present invention is characterized by increasing the expression level of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium.
Here, the sensor kinase protein refers to a sensor kinase protein, that is, a protein generally called histidine kinase. This sensor kinase protein is characterized in that a phosphorylation site and an ATP binding site, which are functional domains of the sensor kinase protein, are present in the amino acid sequence of the protein encoded by the gene.
In addition, when the amount of transcription increases in response to acetic acid in the medium, acetic acid bacteria are cultured in a medium that does not contain acetic acid and acetic acid is added to the medium, and further cultivation is continued. It means that the transcription amount of a gene encoding a certain protein is increased as compared with that before addition of acetic acid. Such an increase in the transcription amount can be detected by a general method such as Northern analysis or quantitative PCR.
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質の具体例としては、下記の２種類を挙げることができる。
第一の例としては、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２５７番目から３２４番目のアミノ酸の部位には、上述したようにセンサーキナーゼタンパク質に特有のリン酸化部位が存在し、３６４番目から４６５番目のアミノ酸の部位には、ＡＴＰ結合部位が存在する。
第二の例としては、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のうち、２５３番目から３２０番目のアミノ酸の部位には、上述したようなセンサーキナーゼタンパク質に特有のリン酸化部位が存在し、３５９番目から４６０番目のアミノ酸の部位には、ＡＴＰ結合部位が存在する。
Specific examples of the sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium include the following two types.
As a first example, a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing can be mentioned. Among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, the 257th to 324th amino acid site has a phosphorylation site unique to the sensor kinase protein as described above, and the 364th to 465th amino acid sites. The site has an ATP binding site.
As a 2nd example, the protein which has an amino acid sequence of sequence number 4 of a sequence table can be mentioned. Among the proteins having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, there are phosphorylation sites peculiar to the sensor kinase protein as described above at the 253rd to 320th amino acid sites, and the 359th to 460th positions. There is an ATP binding site at the amino acid site.
また、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質としては、該タンパク質を構成するアミノ酸配列そのものを有するものでなくとも、タンパク質の本来の活性が損なわれない限り、該配列のうち１または複数の位置で１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
すなわち、上記第一の例に関して言えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質も、実質的に同一のタンパク質と言うことができる。
また、上記第二の例に関して言えば、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質も、上記のタンパク質と実質的に同一のタンパク質と言うことができる。
Moreover, as a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, even if it does not have the amino acid sequence constituting the protein itself, as long as the original activity of the protein is not impaired, It may encode a protein in which one or several amino acids are substituted, deleted or added at one or more positions.
That is, with regard to the first example, a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. In addition, proteins having a function of enhancing acetic acid resistance can be said to be substantially the same protein.
As for the second example, a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing. In addition, a protein having a function of enhancing acetic acid resistance can be said to be substantially the same protein as the above protein.
本発明の育種方法においては、上記のような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を利用する。
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子としては、該タンパク質を構成するアミノ酸配列に対応する塩基配列そのものをコーディング領域として含むＤＮＡの他、該塩基配列を有するものでなくとも、タンパク質の本来の活性が損なわれない限り、からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。
In the breeding method of the present invention, a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium as described above is used.
The gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium has the base sequence in addition to DNA containing the base sequence itself corresponding to the amino acid sequence constituting the protein as a coding region. Even if it is not, a protein having a base sequence that hybridizes with a DNA consisting of DNA under stringent conditions and has a function of enhancing acetate resistance, as long as the original activity of the protein is not impaired. It may be DNA that encodes.
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子としては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質の具体例として既に示した、２種類のタンパク質それぞれをコードする遺伝子を挙げることができる。
すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質として示される、培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第一のセンサーキナーゼタンパク質と、（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質として示される、培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第二のセンサーキナーゼタンパク質のそれぞれをコードする遺伝子である。
As a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium, the two types of sensor kinase proteins already shown as specific examples of the sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium are shown. The gene which codes each protein can be mentioned.
That is, (a) a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or (b) substitution, deletion, or insertion of one or several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing A first sensor kinase whose transcription amount is increased in response to acetic acid in a medium, which is a protein comprising an amino acid sequence containing an amino acid sequence, an addition, or an inversion, and having a function of enhancing acetic acid resistance (A) a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, or (b) substitution or deletion of one or several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing. A protein consisting of an amino acid sequence containing an insertion, addition, or inversion, and indicated as a protein having a function of enhancing acetate resistance Transcription amount in response to acetate in the medium is a gene encoding the respective second sensor kinase protein increases.
培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第一のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡである。配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７部分は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の領域に対応するものである。
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡのうち、塩基番号１１３〜１５０７部分がコードするタンパク質（すなわち、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）について、アミノ酸レベルでの相同性検索を行った結果、大腸菌の浸透圧センサータンパク質ｅｎｖＺとの間で僅か２８％の相同性を示すに過ぎなかった。また、上記ｅｎｖＺタンパク質について、酢酸の存在により転写量が変化するとの知見はない。このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ｅｎｖＺ遺伝子とは別の遺伝子を構成するものと考えられる。
The gene encoding the first sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium is (a) a DNA comprising nucleotide numbers 113 to 1507 among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing It is. Of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the base numbers 113 to 1507 are coding regions and correspond to the amino acid sequence region described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
Of the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, homology at the amino acid level for the protein encoded by the base numbers 113 to 1507 (ie, the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). As a result of sex search, it showed only 28% homology with the osmotic sensor protein envZ of E. coli. Moreover, there is no knowledge that the transcription amount of the envZ protein changes due to the presence of acetic acid. From this, DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is considered to constitute a gene different from the envZ gene.
また、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、上記のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡと言うことができる。
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
In addition, (b) of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 113 to 1507 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. It can be said that DNA containing a base sequence for soybean and encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance is substantially the same as the above DNA.
The stringent condition referred to here is a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, for example, nucleic acids with high homology, for example, DNAs having homology of 70% or more hybridize and nucleic acids with lower homology than that. Examples include conditions that do not hybridize with each other, or normal hybridization washing conditions, such as conditions in which washing is performed at 60 ° C. with a salt concentration corresponding to 0.1% SDS with 1 × SSC.
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡで構成されるセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）や、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）などの酢酸菌から、一般的な方法で容易に調製することができる。また、人工的に合成することも可能である。 A gene encoding a sensor kinase protein composed of a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter) which is a kind of Gluconacetobacter entanii. It can be easily prepared from acetic acid bacteria such as altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491) and Gluconacetobacter xylinus IFO3288 (Gluconacetobacter xylinus IFO3288) by a general method. It can also be synthesized artificially.
培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第二のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、より具体的には、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６部分は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の領域に対応するものである。
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡのうち、塩基番号１０７〜１４８６部分がコードするタンパク質（すなわち、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）について、アミノ酸レベルでの相同性検索を行った結果、大腸菌の浸透圧センサータンパク質ｅｎｖＺとの間で僅か３７％の相同性を示すに過ぎなかった。また、上記ｅｎｖＺタンパク質について、酢酸の存在により転写量が変化するとの知見はない。このことから、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ｅｎｖＺ遺伝子とは別の遺伝子を構成するものと考えられる。
More specifically, the gene encoding the second sensor kinase protein whose transcription amount is increased in response to acetic acid in the medium is (a) the nucleotide number of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. Of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 of the DNA sequence table consisting of 107 to 1486, the base number 107 to 1486 part is a coding region and corresponds to the amino acid sequence region described in SEQ ID NO: 2 of the sequence table. is there.
Of the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, homology at the amino acid level of the protein encoded by the base number 107 to 1486 portion (that is, the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing). As a result of sex search, it showed only 37% homology with the osmotic sensor protein envZ of E. coli. Moreover, there is no knowledge that the transcription amount of the envZ protein changes due to the presence of acetic acid. From this, it is considered that the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing constitutes a gene different from the envZ gene.
また、（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、上記のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡと言うことができる。
ストリンジェントな条件については、上記第一のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子に関して述べたのと同様である。
In addition, (b) of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. It can be said that DNA containing a base sequence for soybean and encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance is substantially the same as the above DNA.
The stringent conditions are the same as those described for the gene encoding the first sensor kinase protein.
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡで構成されるセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）などの酢酸菌から、一般的な方法で容易に調製することができる。また、人工的に合成することも可能である。 A gene encoding a sensor kinase protein composed of DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing is Acetobacter aceti No. It can be easily prepared from acetic acid bacteria such as 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) strain (FERM BP-2287) by a general method. It can also be synthesized artificially.
本発明の育種方法において、上記のような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高める手段としては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることができる。 In the breeding method of the present invention, the means for increasing the expression level of the gene encoding the sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium as described above is the transcription amount in response to acetic acid in the medium. A gene encoding a sensor kinase protein that increases can be introduced into cells and expressed.
細胞内、すなわち酢酸菌（元株）に導入される対象である培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子については、既に例示した２種類の遺伝子、すなわち、（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、もしくは、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。 Regarding a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium to be introduced into a cell, that is, an acetic acid bacterium (original strain), two types of genes already exemplified, (A) DNA consisting of base numbers 113 to 1507 among the base sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or (b) base sequences 113 to 1507 among base sequences listed in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Or a DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a portion of the DNA or a part of the DNA, and encodes a protein having a function of enhancing acetic acid resistance DNA or (a) DNA consisting of nucleotide numbers 107 to 1486 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or (b Among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, a base sequence that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. And a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance.
本発明の育種方法において、上記のような、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めるためには、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を、細胞内に導入して発現させることができる。例えば、上記遺伝子の変異株の取得、該遺伝子の細胞内コピー数の増幅、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いた酢酸菌の形質転換によることができる。
上記遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、上記遺伝子を保持するマルチコピーベクターを酢酸菌、例えばアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、上記遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をグルコンアセトバクター属やアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
In the breeding method of the present invention, in order to increase the expression level of the gene encoding the sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium as described above, transcription in response to acetic acid in the medium is performed. Genes encoding sensor kinase proteins that increase in quantity can be introduced and expressed intracellularly. For example, a recombinant DNA obtained by obtaining a mutant strain of the above gene, amplifying the intracellular copy number of the gene, and ligating a DNA fragment containing the structural gene of the gene to a promoter sequence that functions efficiently in acetic acid bacteria. It can be by transformation of the acetic acid bacteria used.
Amplification of the intracellular copy number of the gene can be carried out by introducing a multicopy vector carrying the gene into an acetic acid bacterium, for example, an Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid cell. That is, it can be carried out by introducing a plasmid, transposon or the like carrying the above-mentioned gene into a glucone Acetobacter or Acetobacter bacterium cell.
組換えＤＮＡを用いる場合の遺伝子の取得は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子として、前記した２種類のいずれかを用いる場合には、その塩基配列が明らかであるので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、酢酸菌、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（「トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet．）」、５巻、１８５頁、１９８９年）によることができる。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
また、上記塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。
In the case of using a recombinant DNA, the gene is obtained by using any of the above two types as a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium. Therefore, using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence as a primer, acetic acid bacteria such as Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24), Acetobacter aceti No. No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture), deposited on June 27, 1983 (original deposit) (Deposited as FERM BP-2287), polymerase chain reaction (PCR reaction) using genomic DNA of Gluconacetobacter xylinus IFO3288 ("Trends Genet."), Volume 5 185, 1989). The PCR reaction may be performed according to a conventional method using a thermal cycler GeneAmp2400 manufactured by Applied Biosystems, using Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). it can.
It can also be obtained by hybridization using a genomic DNA library using an oligonucleotide synthesized based on the above base sequence as a probe. Oligonucleotides can be synthesized according to a conventional method using, for example, various commercially available DNA synthesizers.
本発明においては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子として、前記したように、実際のタンパク質のアミノ酸配列とは相違するが実質的に同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、配列表の配列番号２または４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いることもできるが、このようなＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位でアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生ずるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。 In the present invention, as described above, as a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, it has substantially the same function as the amino acid sequence that is different from the actual protein amino acid sequence. A gene encoding a protein having, for example, a protein consisting of an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, additions or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing In addition, DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance can be used, but such DNA is substituted, deleted, or inserted at a specific site by, for example, site-directed mutagenesis. It can also be obtained by modifying the base sequence so that addition or inversion occurs. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもグルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌の種、株、変異処理してなるまたは自然変異処理してなる変異体、変種から得ることが可能である。 In addition, it is generally known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so that DNA encoding substantially the same protein For example, DNA consisting of base numbers 113 to 1507 in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, DNA consisting of base numbers 107 to 1486 in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or A DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a part of a complementary base sequence, and a DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance is generally an acetic acid bacterium. Species, strains of acetic acid bacteria belonging to the genus Glucon Acetobacter or Acetobacter, strains, natural mutation treatment Variants comprising Te, it can be obtained from variants.
上述の遺伝子を保持させるために使用するマルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）」、ｐ．１５３−１５８、１９８９年参照）、ｐＭＶ２４（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６、１９８９年参照）、ｐＧＩ１８（例えば、本願明細書製造例１参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９、１９８８年参照）も用いることができる。また、トランスポゾン、例えばＭｕやＩＳ１４５２などを用いることもできる。
細胞内コピー数の増幅対象であるＤＮＡは、上記したような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであれば、特に起源は問わないが、酢酸菌での発現が容易である点で、酢酸菌由来の遺伝子が特に好ましい。
Examples of multi-copy vectors used for retaining the above-described genes include pUF106 (see, for example, “Cellulose”, p. 153-158, 1989), pMV24 (see, for example, “Applied and Environmental Mental”). • Microbiology (Appl. Environ. Microbiol.), 55, p. 171-176, 1989), pGI18 (see, for example, Production Example 1 of the present specification), pTA5001 (A), pTA5001 (B) (For example, refer to JP-A-60-9488). In addition, pMVL1 (see, for example, “Agric. Biol. Chem.”, 52, p. 3125-3129, 1988), which is a chromosomal integration vector, can also be used. . A transposon such as Mu or IS1452 can also be used.
The DNA to be amplified for intracellular copy number is not particularly limited as long as it is a DNA of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium as described above. A gene derived from an acetic acid bacterium is particularly preferable in terms of easy expression in the bacterium.
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、４９巻、ｐ．２０９１、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）等によって行なうことができる。 DNA is introduced into acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter by the calcium chloride method (for example, “Agricultural and Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.)”, Vol. 49, p. 1985) and electroporation (for example, see Biosci. Biotech. Biochem., 58, 974, 1994).
ベクターにＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の酵素遺伝子をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
In order to insert DNA into a vector, first, a method in which the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA, and ligated to the vector is employed. .
The DNA encoding the enzyme gene of the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene encoded by the DNA is exhibited. Therefore, in addition to a promoter and the DNA of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like can be linked to the recombinant vector. . Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
また、染色体ＤＮＡ上の、酵素遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。 In addition, in order to replace the promoter sequence of the enzyme gene on the chromosomal DNA with another promoter sequence that functions efficiently in the acetic acid bacteria of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter, construct a vector for homologous recombination, The vector may be used to cause homologous recombination in the chromosome of the microorganism. Examples of such promoter sequences include ampicillin resistance gene of plasmid pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.) of Escherichia coli, kanamycin resistance gene of plasmid pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.), and chlorampheny of plasmid pHSG396 (manufactured by Takara Bio Inc.). Examples include promoter sequences derived from microorganisms other than acetic acid bacteria such as promoters of genes such as call resistance gene and β-galactosidase gene.
相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性の酵素遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該酵素遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
アセトバクター属（Acetobacter）の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などを用いることができる。
The construction of a vector for homologous recombination is well known to those skilled in the art. Thus, by placing an endogenous enzyme gene in a microorganism under the control of a strong promoter, the copy number from the enzyme gene is amplified and expression is enhanced.
Specific examples of bacteria belonging to the genus Acetobacter include Acetobacter aceti. Specifically, Acetobacter aceti no. No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki), accession number on June 27, 1983 (original deposit) FERM BP-2287), Acetobacter aceti IFO 3283 (Acetobacter aceti IFO3283) strain and the like can be used.
グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）としてはアセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。 Examples of bacteria of the genus Gluconacetobacter include, for example, Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter europaeus, Gluconacetobacter diazotrophicus, Gluconacetobacter diazotrophicus Enthanii (Gluconacetobacter entanii), specifically, Gluconacetobacter xylinus IFO3288 (Gluconacetobacter xylinus IFO3288) strain, Gluconacetobacter europaeus DSM6160 (Gluconacetobacter europaeus DSM6160) strain, Gluconacetobacter 37 diazotrophicus ATCC49037), Acetobacter as Gluconacetobacter entanii・ As of February 23, 1984 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) (Incorporated Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki)) In the original deposit), the deposit number can be used as deposit number FERM BP-491.
本発明者らは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片をグルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）に導入して発現させてなる形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株を得て、該形質転換株の酢酸耐性が飛躍的に向上していることを確認した。このグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０２２７である。
また、本発明者らは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片をアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）に導入して発現させてなる形質転換株アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023/pHIK2）株を得て、該形質転換株の酢酸耐性が飛躍的に向上していることを確認した。このアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023/pHIK2）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０２２８である。
The present inventors have introduced a transformant glucoconacetobacter xylinus (Gluconacetobacter xylinus IFO3288) into which a DNA fragment comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is introduced and expressed. Gluconacetobacter xylinus IFO3288 / pHIK1) strain was obtained, and it was confirmed that the acetic acid resistance of the transformed strain was dramatically improved. The Gluconacetobacter xylinus IFO3288 / pHIK1 strain was founded on February 9, 2005 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki). The deposit number is FERM BP-10227.
In addition, the present inventors obtained a DNA fragment comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as Acetobacter aceti No. No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) strain (FERM BP-2287) transformed into Acetobacter aceti No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023 / pHIK2) strain was obtained, and it was confirmed that the acetic acid resistance of the transformed strain was dramatically improved. This Acetobacter aceti No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023 / pHIK2) strain was deposited on February 9, 2005 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). The accession number is FERM BP-10228.
本発明の育種方法により、酢酸耐性が選択的に増強された酢酸菌を得ることができ、該酢酸菌、特にアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。本発明は、このような食酢の製造方法をも提供するものである。 According to the breeding method of the present invention, an acetic acid bacterium having selectively enhanced acetic acid resistance can be obtained, and the acetic acid bacterium, particularly a bacterium belonging to the genus Acetobacter or Gluconacetobacter, which has an ability to oxidize alcohol. The vinegar can be efficiently produced by culturing in a medium containing alcohol and accumulating acetic acid in the medium. The present invention also provides a method for producing such vinegar.
本発明の製造方法において、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生産蓄積せしめるには、酢酸発酵を行えば良く、その条件は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様とすることができる。
アルコールを含有する培地としては、酢酸発酵に使用する培地を利用することができ、例えば、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
In the production method of the present invention, acetic acid fermentation may be performed in order to culture and accumulate acetic acid in a medium containing alcohol in the production method of the present invention, and the condition is the production of vinegar by the conventional fermentation method of acetic acid bacteria. It can be the same as the law.
As a medium containing alcohol, a medium used for acetic acid fermentation can be used, for example, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, ethanol, and if necessary, a nutrient source required for growth by the strain used. A synthetic medium or a natural medium may be used as long as it contains an appropriate amount. Examples of the carbon source include various carbohydrates including glucose and sucrose, and various organic acids. As the nitrogen source, natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２５〜３７℃の範囲で、通常２７〜３２℃で行う。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。 Cultivation is performed under aerobic conditions such as stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture, and the culture temperature is in the range of 25 to 37 ° C., usually 27 to 32 ° C. The pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be prepared with various acids, various bases, buffers and the like. Usually, acetic acid at a high concentration accumulates in the medium by culturing for 1 to 21 days.
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（製造例１）大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の作製
酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
(Production Example 1) Preparation of E. coli-acetic acid shuttle vector pGI18 The acetic acid-E. Coli shuttle vector pGI18 is about 3 derived from the Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491). .1 kb plasmids pGI1 and pUC18.
That is, from the culture solution of Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491), the cells were collected and lysed using sodium hydroxide or sodium dodecyl sulfate. After treatment with phenol, plasmid DNA was purified with ethanol.
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。
このプラスミドをｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した（図１）。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。即ち、鋳型としてプラスミドｐＧＩ１を用い、プライマーとして制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）及びプライマーＢ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）を用い、下記のＰＣＲ条件にて、ＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
The obtained plasmid was a circular double-stranded DNA plasmid having three recognition sites for HincII and one for SfiI, and the total length of the plasmid was about 3100 base pairs (bp). Moreover, it did not have recognition sites for EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI and HindIII.
This plasmid was named pGI1 and was used to construct the vector pGI18.
The plasmid pGI1 obtained above was amplified by PCR using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and cleaved with AatII. This fragment was inserted into the restriction enzyme AatII cleavage site of pUC18 to prepare plasmid pGI18 (FIG. 1).
Specifically, the PCR method was performed as follows. That is, using plasmid pGI1 as a template, primer A having a restriction enzyme AatII recognition site as a primer (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) and primer B (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) The PCR was carried out under the following PCR conditions.
That is, the PCR method was carried out for 30 cycles, with 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes as one cycle.
図１に示すように、得られたプラスミドｐＧＩ１８はｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有していて、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列を配列表の配列番号７に示した。
As shown in FIG. 1, the obtained plasmid pGI18 contained both pUC18 and pGI1, and the total length was about 5800 base pairs (5.8 kbp).
The base sequence of this plasmid pGI18 is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）からの配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の調製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
(Example 1) Preparation of DNA fragment having base sequence described in SEQ ID NO: 1 from Gluconacetobacter entanii Gluconacetobacter entanii Acetobacter altoaceti which is a kind of Gluconacetobacter entanii Genus MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491) containing 6% acetic acid and 4% ethanol in YPG medium (containing 3% glucose, 0.5% yeast extract, 0.2% polypeptone) ), Shaking culture was performed at 30 ° C. for 240 hours.
After completion of the culture, the culture solution was centrifuged (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells.
得られた菌体から、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ないＤＮＡを含む沈殿物を得た。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）およびプライマー２（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法によって配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
Chromosomal DNA was prepared from the obtained bacterial cells by the method disclosed in JP-A-60-9489.
That is, after washing the cells with TE buffer, the TES buffer solution was added to suspend the cells, lysozyme solution was added and allowed to stand, and EDTA solution was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction, sodium lauryl sulfate was added and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes. Next, centrifugation was performed to obtain a supernatant. Polyethylene glycol 6000 was added to the supernatant and allowed to stand overnight at 4 ° C., followed by centrifugation to obtain a precipitate containing DNA.
Using the chromosomal DNA obtained as described above as a template, PCR was performed using primer 1 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing) and primer 2 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing). A DNA fragment containing the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained by the method. The PCR method was performed 30 cycles, with 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes as one cycle.
（実施例２）アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）からの配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の調製
アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を、ＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
(Example 2) Acetobacter aceti Preparation of DNA fragment having base sequence described in SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing from strain 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) (FERM BP-2287) 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) strain (FERM BP-2287) was shaken and cultured in YPG medium (containing 3% glucose, 0.5% yeast extract and 0.2% polypeptone) at 30 ° C. for 36 hours. I did it.
After completion of the culture, the culture solution was centrifuged (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells.
得られた菌体から、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ないＤＮＡを含む沈殿物を得た。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー３（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）およびプライマー４（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
Chromosomal DNA was prepared from the obtained bacterial cells by the method disclosed in JP-A-60-9489.
That is, after washing the cells with TE buffer, the TES buffer solution was added to suspend the cells, lysozyme solution was added and allowed to stand, and EDTA solution was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction, sodium lauryl sulfate was added and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes. Next, centrifugation was performed to obtain a supernatant. Polyethylene glycol 6000 was added to the supernatant and allowed to stand overnight at 4 ° C., followed by centrifugation to obtain a precipitate containing DNA.
Using the chromosomal DNA obtained as described above as a template, PCR was performed using primer 3 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing) and primer 4 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing). By the method, a DNA fragment containing the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was obtained. The PCR method was performed 30 cycles, with 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes as one cycle.
（実施例３）実施例１で得られたＤＮＡ断片の、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）における酢酸添加時の転写量解析
（１）ＲＮＡの調製
アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、２．５Ｌの原料培地（酢酸７％、エタノール３％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行った。菌体の明らかな増殖が認められ、残留エタノール濃度が２％になった段階で、エタノール含有液（酢酸１％、エタノール５０％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）を流加し、発酵液のエタノール濃度が２％になるように制御した培養を行ない、培養液中の酢酸濃度が６％になった時点で、最終濃度が１２％となるように酢酸を添加し、添加直前、添加後７．５分、添加後１５分の培養液からそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡの調製は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属のマニュアルに従って行った。
(Example 3) Analysis of transcription amount of the DNA fragment obtained in Example 1 upon addition of acetic acid in Gluconacetobacter entanii (1) Preparation of RNA Acetobacter acetogenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP-491) using 5 L Miniger (manufactured by Mitsuwa Riken Co., Ltd .; KMJ-5A), 2.5 L raw material medium (7% acetic acid, 3% ethanol, yeast extract) 0.2%, glucose 0.2%) at 30 ° C., 500 rpm, 0.20 vvm. At the stage where the bacterial cells clearly grew and the residual ethanol concentration reached 2%, an ethanol-containing solution (acetic acid 1%, ethanol 50%, yeast extract 0.2%, glucose 0.2%) was fed. Then, culture is performed so that the ethanol concentration of the fermentation broth becomes 2%, and when the acetic acid concentration in the broth reaches 6%, acetic acid is added so that the final concentration becomes 12%. Total RNA was extracted from the culture solution immediately before, 7.5 minutes after the addition, and 15 minutes after the addition.
Total RNA was prepared using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the attached manual.
（２）プローブの調製
実施例１にてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）から調製した配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、また、プライマー５（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）及びプライマー６（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）をプライマーとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＣＲを、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３分を1サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
得られたＰＣＲ産物とＤＩＧ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い、添付のマニュアルに従ってプローブを調製した。
(2) Preparation of probe Gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing prepared from Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491) in Example 1 And a primer 5 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing) and primer 6 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing) as primers, and TaKaRa Ex Taq (Takara) PCR was performed under the conditions of 30 cycles, with 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes as one cycle.
Using the obtained PCR product and DIG Northern Starter Kit (manufactured by Roche Diagnostics), a probe was prepared according to the attached manual.
（３）転写解析
（１）で調製された全ＲＮＡの電気泳動、及びナイロンメンブレンへのトランスファーは、バイオ実験イラストレイテッド（２）遺伝子解析の基礎（中山広樹・西方敬人著、１９９５年、秀潤社）に従って行った。また、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
遺伝子の転写量の検出には、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士写真フイルム株式会社製）を使用し、得られた画像から該遺伝子の転写量をＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（富士写真フイルム社製）を用いて数値化し、酢酸添加直前の転写量に対する酢酸添加後（７．５分及び１５分）の転写量の比を計算した。
酢酸添加前後における転写量の変動を、表１に示す。
(3) Transcriptional analysis Electrophoresis of total RNA prepared in (1) and transfer to nylon membrane are illustrated in (2) Basics of genetic analysis (by Hiroki Nakayama and Takato Nishikata, 1995, According to Shujunsha). Hybridization was performed using a DIG Northern Starter Kit (manufactured by Roche Diagnostics) according to the attached manual.
LAS-1000plus (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) is used for detection of the gene transcription amount, and the gene transcription amount is digitized from the obtained image using Image Gauge (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) The ratio of the transfer amount after addition of acetic acid (7.5 minutes and 15 minutes) to the transfer amount immediately before the addition of acetic acid was calculated.
Table 1 shows changes in the transfer amount before and after the addition of acetic acid.
表１に示すように、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片の転写量は、培地への酢酸添加後７．５分において添加前の７．０倍に、添加後１５分において添加前の２．４倍に増大することが確認できた。
このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するタンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
As shown in Table 1, the transcription amount of the DNA fragment containing the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is 7.0 times before addition in 7.5 minutes after the addition of acetic acid to the medium. After 15 minutes, it was confirmed to increase 2.4 times before the addition.
This revealed that the DNA fragment containing the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a gene encoding a protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium.
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来の配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡで形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例１にてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）から調製した、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製したＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
(Example 4) Improvement of acetic acid resistance of Gluconacetobacter xylinus IFO3288 strain transformed with DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing derived from Gluconacetobacter entanii (1) Preparation of plasmid A DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 prepared from Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491) in Example 1 was prepared. Then, DNA inserted by ligation into the restriction enzyme SmaI cleavage site of the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector pGI18 was prepared.
The thus prepared DNA is transferred to Escherichia coli JM109 strain by electroporation (for example, “Biosci. Biotech. Biochem.”, Vol. 58, p. 974, see 1994).
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。
得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＨＩＫ１を得た。
Transformants were selected on LB agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin. About the ampicillin resistant transformant grown on the above selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was retained.
Plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method to obtain plasmid pHIK1 containing a DNA fragment consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＨＩＫ１を用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照）によって形質転換した。
(2) Acquisition of transformant strain of acetic acid bacteria Using pHIK1 thus obtained, the glucoconacetobacter xylinus IFO3288 (Gluconacetobacter xylinus IFO3288) strain was electroporated (for example, “Proceeding of National Academy”). -Transformation by the Science of USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 87, p. 8130-8134 (1990)).
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株であるグルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＨＩＫ１（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０２２７である。
Transformants were selected on YPG medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin. About the ampicillin resistant transformant grown on the above selective medium, plasmids were extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that each of them possessed the plasmid.
The transformant thus obtained, Gluconacetobacter xylinus IFO3288 / pHIK1 (Gluconacetobacter xylinus IFO3288 / pHIK1) strain, is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan) It has been deposited on February 9th, 2005 at No. 1 Central 6), and the deposit number is FERM BP-10227.
上記のようにして得られたプラスミドｐＨＩＫ１を保有するアンピシリン耐性の形質転換株（以下、ｐＨＩＫ１形質転換株と称する。）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株（グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株）と比較した。
具体的には、酢酸２％、及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養開始時、培養３６時間目、及び培養６０時間目の結果を、表２に示す。
For the ampicillin resistant transformant carrying the plasmid pHIK1 obtained as described above (hereinafter referred to as pHIK1 transformant), growth in YPG medium supplemented with acetic acid was introduced only with the shuttle vector pGI18. Comparison was made with the former strain (Gluconacetobacter xylinus IFO3288).
Specifically, shaking culture (120 rpm) was performed at 30 ° C. in 100 ml of YPG medium containing 2% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin, and the growth of the transformed strain and the original strain in an acetic acid-added medium was performed at 660 nm. Comparison was made by measuring absorbance. Table 2 shows the results at the start of culture, at 36 hours of culture, and at 60 hours of culture.
その結果、表２に示すように、２％酢酸を添加した培地でｐＨＩＫ１形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入して発現させることによって、酢酸菌の酢酸培地での生育を促進し、酢酸耐性を向上させることができることが確認できた。 As a result, as shown in Table 2, the pHIK1 transformed strain grew vigorously in the medium supplemented with 2% acetic acid, whereas the original strain hardly grew. From this fact, it is possible to promote the growth of acetic acid bacteria in an acetic acid medium and improve the acetic acid resistance by introducing and expressing the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence into the cell. It could be confirmed.
（実施例５）アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）から調製した配列表の配列番号３記載の塩基配列を有する遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例２でアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）から調製した配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製したＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地中で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。
得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＨＩＫ２を得た。
(Example 5) Acetobacter aceti No. Acetobacter aceti No. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) strain (FERM BP-2287) prepared with a gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing Improvement of acetic acid resistance of strain 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) (1) Preparation of plasmid Acetobacter aceti No. 102 in Example 2 A DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing prepared from strain 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) (FERM BP-2287) was ligated to the restriction enzyme SmaI cleavage site of the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector pGI18. Inserted DNA was prepared.
The thus prepared DNA is transferred to Escherichia coli JM109 strain by electroporation (for example, “Biosci. Biotech. Biochem.”, Vol. 58, p. 974, see 1994).
Transformants were selected on LB agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin. About the ampicillin resistant transformant grown in the above selective medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was retained.
Plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method to obtain a plasmid pHIK2 containing a DNA fragment consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＨＩＫ２を用いてアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を、エレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照」）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３／ｐＨＩＫ２（Acetobacter aceti No.1023/pHIK2）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０２２８である。
(2) Acquisition of acetic acid bacteria transformed strain Acetobacter aceti No. 1 was obtained using pHIK2 thus obtained. 1023 (Acetobacter aceti No. 1023) strain (FERM BP-2287) was prepared by electroporation (for example, “Proceeding of National Academy of Science of USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 87, p. 8130-8134 (1990) "). Transformants were selected on YPG medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin.
Ampicillin-resistant transformants that grew on the selection medium were extracted and analyzed by a conventional method to confirm that each had the plasmid.
Of the transformants thus obtained, Acetobacter aceti No. 1023 / pHIK2 (Acetobacter aceti No.1023 / pHIK2) strain was established on February 9, 2005 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Chuo 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba, Japan). The deposit number is FERM BP-10228.
上記のようにして得られたプラスミドｐＨＩＫ２を保有するアンピシリン耐性の形質転換株（以下、ｐＨＩＫ２形質転換株と称する。）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株（アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株）と比較した。
具体的には、酢酸１．５％、及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養開始時、培養４８時間目、及び培養６９時間目の結果を、表３に示す。
The ampicillin resistant transformant carrying the plasmid pHIK2 obtained as described above (hereinafter referred to as pHIK2 transformant) was grown in YPG medium supplemented with acetic acid and only the shuttle vector pGI18 was introduced. Comparison was made with the former strain (Acetobacter aceti No. 1023).
Specifically, in a 100 ml YPG medium containing 1.5% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin, shaking culture (120 rpm) is performed at 30 ° C., and the transformant and the original strain are grown in an acetic acid-added medium. Comparison was made by measuring the absorbance at 660 nm. Table 3 shows the results at the start of culture, 48 hours of culture, and 69 hours of culture.
その結果、表３に示すように、１．５％酢酸を添加した培地でｐＨＩＫ２形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。このことから、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入して発現させることによって、酢酸菌の酢酸培地での生育を促進し、酢酸耐性を向上させることができることが確認できた。 As a result, as shown in Table 3, the pHIK2 transformed strain grew vigorously in the medium supplemented with 1.5% acetic acid, whereas the original strain hardly grew. From this fact, it is possible to promote the growth of acetic acid bacteria in an acetic acid medium and improve the acetic acid resistance by introducing and expressing the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence into the cell. It could be confirmed.
図１中、「Ａａｔ ＩＩ」及び「Ｓｆｉ Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」、「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」はプラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｌｂｐ」及び「５．８ｌｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。 In FIG. 1, “Aat II” and “Sfi I” indicate restriction enzyme recognition sites. MCS is a multicloning site, Ampr is an ampicillin resistance gene site, and the numbers in parentheses are base numbers in bp units. Furthermore, “pUC18”, “pGI1” and “pGI18” in the center indicate plasmid names, and “2.7 kbp”, “3.1 lbp” and “5.8 lbp” indicate the total number of bases of the plasmid.
Claims (10)
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium is the DNA shown in the following (a) or (b): Improved breeding method of acetic acid bacteria.
(A) DNA consisting of base numbers 113 to 1507 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of nucleotide numbers 113 to 1507 or DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium is the DNA shown in the following (a) or (b): Improved breeding method of acetic acid bacteria.
(A) DNA consisting of base numbers 107 to 1486 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(B) Among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The DNA of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) DNA consisting of base numbers 113 to 1507 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) Among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of nucleotide numbers 113 to 1507 or DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The DNA of a gene encoding a sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in a medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) DNA consisting of base numbers 107 to 1486 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(B) Among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of base numbers 107 to 1486 or DNA consisting of a base sequence complementary to a part of the DNA. DNA comprising a base sequence and encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance.
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 The sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and is resistant to acetic acid A protein having a function of enhancing the function.
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。 The sensor kinase protein whose transcription amount increases in response to acetic acid in the medium, as shown in (a) or (b) below.
(A) A protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and resistant to acetic acid A protein having a function of enhancing the function.
A method for producing vinegar comprising culturing the acetic acid bacterium having improved acetic acid resistance according to any one of claims 1 to 4 in a medium containing alcohol to produce and accumulate acetic acid in the medium. Method.
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