すなわち、本発明は、シクロデキストリン誘導体ならびに、アミノ酸および／または解糖系中間体物質を含有する、体外受精用の精子前培養培地に関する。
また、本発明は、シクロデキストリン誘導体が、メチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、グルコシル-β-シクロデキストリン、マルトシル-β-シクロデキストリンおよびスルフォブチル-β-シクロデキストリン、ならびにこれらのα体およびγ体からなる群より選択される１種または２種以上である、前記前培養培地に関する。
さらに本発明は、アミノ酸が、グリシン、アラニン、およびグルタミンからなる群より選択される１種または２種以上である、前記の前培養培地に関する。
That is, the present invention relates to a sperm preculture medium for in vitro fertilization containing a cyclodextrin derivative and an amino acid and / or a glycolytic intermediate substance.
The present invention also provides that the cyclodextrin derivative is methyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl- β -cyclodextrin, glucosyl- β -cyclodextrin, maltosyl- β -cyclodextrin and sulfobutyl- β -cyclodextrin, and these The present invention relates to the preculture medium, which is one or more selected from the group consisting of α-form and γ- form.
Furthermore, the present invention relates to the aforementioned preculture medium, wherein the amino acid is one or more selected from the group consisting of glycine, alanine, and glutamine.
さらにまた、本発明は、解糖系中間体物質が、ホスホエノールピルビン酸、α-D-グルコース6-リン酸、α-D-フルクトース6-リン酸、D-フルクトース1,6-二リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、1,3-ジホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸および2-ホスホグリセリン酸からなる群より選択される１種または２種以上である、前記の前培養培地に関する。
また、本発明は、シクロデキストリン誘導体の含有量が0.1〜20mMである、前記の前培養培地に関する。
本発明はさらに、アミノ酸の含有量が1〜200mMである、前記の前培養培地に関する。
Furthermore, the present invention provides that the glycolytic intermediate substance comprises phosphoenolpyruvate, α- D-glucose 6-phosphate, α- D-fructose 6-phosphate, D-fructose 1,6-diphosphate. , Dihydroxyacetone phosphate, D-glyceraldehyde 3-phosphate, D-glyceraldehyde 3-phosphate, 1,3-diphosphoglycerate, 3-phosphoglycerate and 2-phosphoglycerate It is related with the said preculture medium which is 1 type (s) or 2 or more types selected.
The present invention also relates to the preculture medium, wherein the content of the cyclodextrin derivative is 0.1 to 20 mM.
The present invention further relates to the preculture medium, wherein the amino acid content is 1 to 200 mM.
本発明の前培養培地に含有されるシクロデキストリン誘導体は、凍結精子に対しては、凍結保存剤のコレステロール等によって傷害された精子細胞膜から、その傷害の原因となっているコレステロールを包接して取り除くことにより、細胞膜上のシグナル伝達分子が受精能を獲得する際に活性化できるように作用する。したがって、本発明の前培養培地に用いられるシクロデキストリン誘導体は、水溶性であり、かつコレステロールを包接する性質を有するものであれば、特に限定されないが、６個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したα−シクロデキストリン骨格、７個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したβ−シクロデキストリン骨格、または８個のグルコースがα−1,4結合で環状に結合したγ−シクロデキストリン骨格を有するものが好ましい。このような好ましいシクロデキストリン誘導体としては、メチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、グルコシル-β-シクロデキストリン、マルトシル-β-シクロデキストリン、スルフォブチル-β-シクロデキストリン、ならびにこれらのα体（すなわち、メチル-α-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-α-シクロデキストリン、グルコシル-α-シクロデキストリン、マルトシル-α-シクロデキストリンおよびスルフォブチル-α-シクロデキストリン）およびγ体（すなわち、メチル-γ-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン、グルコシル-γ-シクロデキストリン、マルトシル-γ-シクロデキストリンおよびスルフォブチル-γ-シクロデキストリン）を挙げることができ、これらのうち、メチル-β-シクロデキストリンが特に好ましい。
The cyclodextrin derivative contained in the pre-culture medium of the present invention removes, from frozen sperm, the cholesterol causing the injury from the sperm cell membrane damaged by the cryopreservative cholesterol or the like. Thus, it acts so that a signal transduction molecule on the cell membrane can be activated when acquiring fertility. Therefore, the cyclodextrin derivative used in the preculture medium of the present invention is not particularly limited as long as it is water-soluble and has a property of including cholesterol, but 6 glucoses are α-1,4 bound. Α-cyclodextrin skeleton linked in a cyclic manner, β-cyclodextrin skeleton in which seven glucoses are cyclically linked by α-1,4 bonds, or eight glucoses linked cyclically by α-1,4 bonds Those having a γ-cyclodextrin skeleton are preferred. Such preferred cyclodextrin derivatives include methyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl- β -cyclodextrin, glucosyl- β -cyclodextrin, maltosyl- β -cyclodextrin, sulfobutyl- β -cyclodextrin, and their α Bodies (ie methyl-α-cyclodextrin, hydroxypropyl-α-cyclodextrin, glucosyl-α-cyclodextrin, maltosyl-α-cyclodextrin and sulfobutyl-α-cyclodextrin) and γ- form (ie methyl-γ- Cyclodextrin, hydroxypropyl-γ-cyclodextrin, glucosyl-γ-cyclodextrin, maltosyl-γ-cyclodextrin and sulfobutyl-γ-cyclodextrin), among these, Chill -β- cyclodextrin are particularly preferred.
本発明の前培養培地における解糖系中間体物質は、上記のシクロデキストリン誘導体と共に前培養培地に含有されることにより、精子が充分に受精能を獲得することができるものであればよく、特に限定されない。また、解糖系は、グルコースがピルビン酸または乳酸にまで分解される代謝経路を指すから、解糖系中間体物質にはグルコース、ピルビン酸および乳酸は含まれない。よって、本発明において用いられる解糖系中間体物質は、精子が充分に受精能を獲得する際に惹起されるシグナル伝達経路の活性化に対して補完的に作用するものが好ましく、解糖系において異化的経路（ATPを産生する方向に働く経路）の基質となる中間体物質がより好ましく、このようなものの例としては、ホスホエノールピルビン酸、α-D-グルコース6-リン酸、α-D-フルクトース6-リン酸、D-フルクトース1,6-二リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、D-グリセルアルデヒド3-リン酸、1,3-ジホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸および2-ホスホグリセリン酸が挙げられる。これらのうち、ホスホエノールピルビン酸が特に好ましい。
The glycolytic intermediate substance in the preculture medium of the present invention may be any substance as long as sperm can sufficiently acquire fertility by being contained in the preculture medium together with the above cyclodextrin derivative. It is not limited. In addition, glycolysis refers to a metabolic pathway in which glucose is decomposed to pyruvate or lactic acid, and thus glycolytic intermediate substances do not include glucose, pyruvate and lactic acid. Therefore, the glycolytic intermediate substance used in the present invention is preferably one that acts complementarily on the activation of a signal transduction pathway that is induced when sperm sufficiently acquire fertility. Intermediate substances that serve as substrates for catabolic pathways (pathways that act in the direction of ATP production) are more preferred, and examples of such substances include phosphoenolpyruvate, α- D-glucose 6-phosphate, α − D-fructose 6-phosphate, D-fructose 1,6-diphosphate, dihydroxyacetone phosphate, D-glyceraldehyde 3-phosphate, D-glyceraldehyde 3-phosphate, 1,3-diphospho Examples include glyceric acid, 3-phosphoglyceric acid and 2-phosphoglyceric acid. Of these, phosphoenolpyruvate is particularly preferred.