JP2006204150A - Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease - Google Patents

Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease Download PDF

Info

Publication number
JP2006204150A
JP2006204150A JP2005018801A JP2005018801A JP2006204150A JP 2006204150 A JP2006204150 A JP 2006204150A JP 2005018801 A JP2005018801 A JP 2005018801A JP 2005018801 A JP2005018801 A JP 2005018801A JP 2006204150 A JP2006204150 A JP 2006204150A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amyloid
clac
fiber
complex
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2005018801A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Hiroyoshi Kakuyama
弘嘉 角山
Soderberg Linda
ソドベルグ リンダ
Camilla Dahlqvist
ダールクヴィスト カミーラ
Tjernberg Lars
シャンバリィ ラース
Karin Dannaeus
ディナー カーリン
Graff Caroline
グラフ キャロライン
Winblad Bengt
ヴィンブラット ベンクト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd filed Critical Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority to JP2005018801A priority Critical patent/JP2006204150A/en
Publication of JP2006204150A publication Critical patent/JP2006204150A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a preventive or therapeutic agent for diseases caused by the deposition of amyloid β protein and further provide a splice variant isoform of CLAC (collagen-like Alzheimer amyloid plaque component) that can be used in the screening method according to the invention and the like. <P>SOLUTION: The screening of agents that are effective for prevention and treatment of the diseases caused by the deposition of amyloid β protein, for example, Alzheimer's disease is carried out by selecting the specimens showing the action to reduce the resistance of amyloid β fiber decomposition of the CLAC/amyloid β fiber complex. In this screening, a new splice variant isoform of CLAC is employed. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、アルツハイマー病などのアミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有用な剤のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、本発明スクリーニング方法などに用いることができるCLACのスプライスバリアントに関する。   The present invention relates to a method for screening an agent useful for the treatment or prevention of diseases caused by amyloid β protein deposition such as Alzheimer's disease. The present invention also relates to a splice variant of CLAC that can be used in the screening method of the present invention.

アミロイドβは、アルツハイマー病などのある種の神経疾患患者脳の神経細胞あるいは血管に沈着し痴呆などの症状を引き起こす原因物質とされている。アミロイドβは、正常脳でも恒常的に産生されている生理的なペプチドであるが、凝集・沈着を生じやすく、アルツハイマー病、ダウン症、高齢者の脳にみられる老人斑の主成分でもある。アミロイドβは、膜貫通前駆体蛋白質(βAPP)に由来する39〜43アミノ酸からなり、βAPPの細胞質での正常な代謝過程で生じると言われている。アルツハイマー病患者の脳におけるアミロイドβの蓄積はアミロイドβ分解系の欠陥または産生機序の異常による過剰発現により沈着することに起因すると考えられる。したがってアミロイドβ繊維分解に関与する物質はアルツハイマー病などのアミロイドの沈着によって引き起こされる疾患の治療および予防に有用であると考えられる。
従来、アミロイドβの除去、分解する方法あるいはアミロイドβの蓄積、繊維化を防止する物質のスクリーニング方法はアミロイドβと被検化合物の2者のみで構成されている。しかしながら、従来の技術では現在に至っても本課題を解決する医薬品は得られていない。
老人斑アミロイドの主成分はアミロイドβであるが、その他にもいくつかの蛋白性構成成分が同定されており、アミロイドβ繊維の形成やアルツハイマー病の発症に関与するものと考えられている。Hashimotoらにより老人斑アミロイドを構成する50/100 kDa蛋白質CLAC(collagen-like Alzheimer amyloid plaque component)が報告された(特許文献1,非特許文献1)。CLACは細胞外部分に反復するコラーゲン様配列を持つ新規の一回膜貫通型蛋白質であり、アミロイドβと共にアルツハイマー病患者およびアミロイドβが過剰発現することが知られているダウン症患者脳に蓄積することが公知となっている。さらにCLACは脳特異的に発現し、可溶化したアミロイドよりも繊維化したアミロイドβにより特異的に結合することも公知となっている。
2003年、CLACは従来から検討されてきたAMY(Alzheimer disease amyloid-associated protein)と同一であることが証明された(非特許文献2)。したがってCLACは、現在なお未知の部分が多いアルツハイマ-病の病理メカニズムに深く関与することが推定されているが、その機能や役割については依然不明な部分が多い。
国際公開番号WO 01/58343 Hashimoto, T., et. al. EMBO J 2002 Apr 2;21(7):1524-34 Soderberg, Let., al. J Neuropathol Exp Neurol 2003 Nov;62(11):1108-17
Amyloid β is considered to be a causative substance that is deposited on nerve cells or blood vessels in the brain of patients with certain types of neurological diseases such as Alzheimer's disease and causes symptoms such as dementia. Amyloid β is a physiological peptide that is constantly produced in the normal brain, but is prone to aggregation and deposition, and is also a major component of senile plaques found in Alzheimer's disease, Down's syndrome, and the elderly's brain. Amyloid β is composed of 39 to 43 amino acids derived from a transmembrane precursor protein (βAPP), and is said to occur in the normal metabolic process of βAPP in the cytoplasm. The accumulation of amyloid β in the brains of Alzheimer's disease patients is thought to result from deposition due to overexpression due to defects in the amyloid β degradation system or abnormal production mechanisms. Therefore, substances involved in amyloid β fiber degradation are considered useful for the treatment and prevention of diseases caused by amyloid deposition such as Alzheimer's disease.
Conventionally, a method for removing and decomposing amyloid β or a method for screening a substance that prevents accumulation and fibrosis of amyloid β is composed of only amyloid β and a test compound. However, no pharmaceuticals that can solve this problem have been obtained with conventional techniques.
Although the main component of senile plaque amyloid is amyloid β, several other proteinaceous components have been identified and are considered to be involved in the formation of amyloid β fibers and the onset of Alzheimer's disease. Hashimoto et al. Reported a 50/100 kDa protein CLAC (collagen-like Alzheimer amyloid plaque component) constituting senile plaque amyloid (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). CLAC is a novel single-transmembrane protein with a collagen-like sequence that repeats in the extracellular part, and accumulates in the brain of Alzheimer's disease patients and Down syndrome patients with known amyloid β overexpression along with amyloid β Is known. It is also known that CLAC is specifically expressed in the brain and specifically binds to fibrotic amyloid β rather than solubilized amyloid.
In 2003, it was proved that CLAC is identical to AMY (Alzheimer disease amyloid-associated protein) which has been studied conventionally (Non-patent Document 2). Therefore, although it is estimated that CLAC is deeply involved in the pathological mechanism of Alzheimer's disease, which still has many unknown parts, there are still many unknown parts regarding its functions and roles.
International Publication Number WO 01/58343 Hashimoto, T., et.al.EMBO J 2002 Apr 2; 21 (7): 1524-34 Soderberg, Let., Al. J Neuropathol Exp Neurol 2003 Nov; 62 (11): 1108-17

本発明は、アミロイドβ蛋白の沈着によって引き起こされる疾患の治療および予防に有用な物質のスクリ−ニング法を提供することを目的とする。
また本発明は、本発明スクリーニング方法などに用いることのできるCLACのスプライスバリアントを提供することを目的とする。
An object of the present invention is to provide a screening method for substances useful for the treatment and prevention of diseases caused by amyloid β protein deposition.
Another object of the present invention is to provide a CLAC splice variant that can be used in the screening method of the present invention.

本発明者らは、上記課題を解決するためには新しい方法を開発する必要があると判断し、アミロイドβと共にアルツハイマー病患者脳内に沈着する成分に着目して鋭意研究を進めた結果、アミロイドβと共にアルツハイマー病患者脳内に沈着する蛋白質CLAC(collagenous Alzheimer amyloid plaque componentまたはcollagen-like Alzheimer amyloid plaque component)がアミロイドβ繊維に結合することにより、生体内酵素分解抵抗性を与えている事実を初めて明らかにした。更に、CLACのスプライスバリアントアイソフォームを新たに6種類同定した。
本発明者らは、これら知見により、CLACとアミロイドβ繊維の複合体(以下、本明細書において「CLAC/アミロイドβ繊維複合体」という。)のアミロイドβ分解抵抗性を減少させる物質をスクリーニングすることによって、これまでの公知のスクリーニング方法では見出すことのできなかった、アルツハイマーなどのアミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有用な剤を見出すことができるとの確信を得た。また、新たに見出したCLACのスプライスバリアントは、本発明スクリーニング方法の実施に用いることができるのみならず、CLACの新たな機能の解明や研究に有用であると確信を得て、本発明を完成するに至った。
The present inventors have determined that it is necessary to develop a new method in order to solve the above-mentioned problems, and as a result of intensive research on amyloid β, focusing on components deposited in the brain of Alzheimer's disease patients, amyloid For the first time, the protein CLAC (collagenous Alzheimer amyloid plaque component or collagen-like Alzheimer amyloid plaque component), which is deposited together with β in the brain of Alzheimer's disease, binds to amyloid β fiber, thereby providing in vivo enzymatic degradation resistance. Revealed. Furthermore, six new types of CLAC splice variant isoforms were identified.
Based on these findings, the present inventors screen for a substance that reduces the amyloid β degradation resistance of a complex of CLAC and amyloid β fiber (hereinafter referred to as “CLAC / amyloid β fiber complex”). Thus, it was confirmed that an agent useful for the treatment or prevention of diseases caused by deposition of amyloid β protein such as Alzheimer, which could not be found by conventional screening methods, could be found. In addition, the newly discovered CLAC splice variant can be used not only for the implementation of the screening method of the present invention, but also has been convinced that it is useful for elucidating and researching new functions of CLAC, and completed the present invention. It came to do.

即ち本発明は、下記に掲げるものである:
〔1〕 下記の工程(a)および(b)を含む、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を減少させる物質のスクリーニング方法、
(a)被験物質存在下において、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(b)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程、
〔2〕 下記の工程(a)(b)および(c)を含む、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を減少させる物質のスクリーニング方法、
(a)被験物質存在下において、CLACとアミロイドβ線維とを接触させCLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる工程、
(b)形成されたCLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(c)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程、
〔3〕 タンパク質分解酵素が生体内タンパク質分解酵素である、前記〔1〕または〔2〕記載のスクリーニング方法、
〔4〕 タンパク質分解酵素がネプリライシンまたはインスリン分解酵素である、前記〔1〕〜〔3〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔5〕 アミロイドβ繊維分解抵抗性を測定する手法が、クーマシーブリリアントブルー染色法、ウエスタンブロット法または膜透過法である、前記〔1〕〜〔4〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔6〕 アミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有効な剤をスクリーニングするための、前記〔1〕〜〔5〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔7〕 アルツハイマー病の治療又は予防に有効な剤をスクリーニングするための、前記〔6〕記載のスクリーニング方法、
〔8〕 以下の(a)、(b)または(c)のDNAからなる遺伝子、
(a)配列番号3,5,7,9,11または13のいずれかで示される塩基配列からなるCLAC DNA、
(b)配列番号4,6,8,10,12または14のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるCLACをコードするDNA、
(c)配列番号3,5,7,9,11または13のいずれかで示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミロイドβ繊維と複合体を形成するという特徴を有する蛋白質をコードするDNA、
〔9〕 以下の(a)又は(b)の蛋白質からなるCLAC、
(a)配列番号4,6,8,10または12のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)前記〔8〕に記載の遺伝子によりコードされる蛋白質。
That is, the present invention is as follows:
[1] A screening method for a substance that decreases the resistance to amyloid β fibril degradation of a CLAC / amyloid β fibril complex, comprising the following steps (a) and (b):
(A) contacting the CLAC / amyloid β-fiber complex with a proteolytic enzyme in the presence of a test substance;
(B) measuring the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex, and selecting a test substance that decreases the amyloid β fiber degradation resistance of the complex;
[2] A screening method for a substance that decreases amyloid β fibril degradation resistance of a CLAC / amyloid β fibril complex, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of contacting CLAC with amyloid β-fiber in the presence of a test substance to form a CLAC / amyloid β-fiber complex;
(B) contacting the formed CLAC / amyloid β fibril complex with a proteolytic enzyme;
(C) measuring the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex, and selecting a test substance that decreases the amyloid β fiber degradation resistance of the complex;
[3] The screening method according to [1] or [2] above, wherein the proteolytic enzyme is an in vivo proteolytic enzyme,
[4] The screening method according to any one of [1] to [3], wherein the proteolytic enzyme is neprilysin or an insulin-degrading enzyme,
[5] The screening method according to any one of the above [1] to [4], wherein the method for measuring amyloid β fiber degradation resistance is a Coomassie brilliant blue staining method, a Western blot method or a membrane permeation method,
[6] The screening method according to any one of [1] to [5] above, for screening an agent effective for treating or preventing a disease caused by amyloid β protein deposition,
[7] The screening method according to the above [6], for screening an agent effective for treatment or prevention of Alzheimer's disease,
[8] A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) CLAC DNA consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 or 13;
(B) DNA encoding CLAC comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12 or 14;
(C) a protein having the characteristics of hybridizing with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 or 13 under a stringent condition and forming a complex with amyloid β fiber DNA encoding,
[9] CLAC comprising the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10 or 12,
(B) a protein encoded by the gene of [8] above.

本発明は、アミロイドβ繊維がCLACと複合体を形成することによって生体内タンパク質分解酵素により分解されにくくなる、すなわちアミロイドβ線維分解抵抗性を有する、という全く新しい知見に基づくものである。
本発明によって、これまでに知られている阻害剤とは異なる新たな作用機序に基づく新たなスクリーニング方法が提供され、アルツハイマー病などのアミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患に有効な剤をスクリーニングすることができる。従来のスクリーニングではアミロイドβのみを標的としてスクリーング系が構築されてきたが、これまでに臨床応用されている報告は少ない。なぜならば、実際のアルツハイマー病患者の病態ではアミロイドβ以外にもCLACのようなアミロイド結合蛋白質が病態の進行に重要であると推定されるからである。したがって、本発明のスクリーニング方法では従来のスクリーニング系では得られない化合物を選別することができ、より臨床応用可能な物質を見出すことができる。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、アルツハイマー病などの治療または予防剤などとして有効に利用することができる。
The present invention is based on a completely new finding that amyloid β fibers are not easily degraded by in vivo proteolytic enzymes by forming a complex with CLAC, that is, they have amyloid β fiber degradation resistance.
According to the present invention, a new screening method based on a new mechanism of action different from previously known inhibitors is provided, and an agent effective for a disease caused by amyloid β protein deposition such as Alzheimer's disease is screened. can do. In conventional screening, screening systems have been constructed targeting only amyloid β, but there have been few reports of clinical application so far. This is because it is presumed that amyloid-binding proteins such as CLAC are important for the progression of the disease state in addition to amyloid β in the actual disease state of Alzheimer's disease patients. Therefore, in the screening method of the present invention, compounds that cannot be obtained by conventional screening systems can be selected, and substances that can be more clinically applied can be found. The substance obtained by the screening method of the present invention can be effectively used as a therapeutic or prophylactic agent for Alzheimer's disease and the like.

また本発明によって、新しいCLACのスプライスバリアントが提供される。該スプライスバリアントは、本発明のスクリーニング方法の実施に用いることができるのみならず、公知のCLACを用いたスクリーニング方法やCLACの機能解明の研究などに利用することができる。   The present invention also provides new CLAC splice variants. The splice variant can be used not only for carrying out the screening method of the present invention, but also for screening methods using the known CLAC, research for elucidating the function of CLAC, and the like.

以下、本明細書において、アミノ酸、(ポリ)ペプチド、(ポリ)ヌクレオチドなどの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)および当該分野における慣用記号に従う。   Hereinafter, in the present specification, indications by abbreviations such as amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, etc., are defined by IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 ( 1984)], “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office) and conventional symbols in the field.

本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(正鎖)並びに該正鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(相補鎖)、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列(配列番号:1,3,5,7,9,11,13または15)で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質(例えば変異体)をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる変異体をコードする「遺伝子」または「DNA」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号:1,3,5,7,9,11,13または15で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「DNA」を挙げることができる。   In the present specification, “gene” or “DNA” is used to include not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, a gene (DNA) is a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA containing DNA (positive strand) and a sequence having a complementary sequence to the positive strand. Both double-stranded DNA (complementary strand) and fragments thereof are included. In addition, the “gene” or “DNA” includes not only “gene” or “DNA” represented by a specific base sequence (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15), Included are “genes” or “DNAs” that encode proteins (eg, variants) that are equivalent in biological function to the proteins encoded by these. The “gene” or “DNA” encoding such a mutant is specifically represented by the aforementioned SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 under stringent conditions. And a “gene” or “DNA” having a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the specific base sequence.

本明細書において「CLAC/アミロイドβ線維複合体」とは、アミロイドβ繊維とCLACを接触させることにより、両者が結合することにより形成される蛋白質複合体のことである。CLAC/アミロイドβ線維複合体の調製は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、CLACとアミロイドβ繊維を接触させることにより調製することができる(Methods Enzymol 1999;309:386-402)。   In the present specification, the “CLAC / amyloid β-fiber complex” refers to a protein complex formed by bringing amyloid β fiber and CLAC into contact with each other so as to bind to each other. The CLAC / amyloid β fiber complex can be prepared according to a known method, for example, by contacting CLAC with amyloid β fiber (Methods Enzymol 1999; 309: 386-402).

本明細書において「CLAC」とは、配列番号2で示される公知のアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号2に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In the present specification, “CLAC” means not only a protein containing the known amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but also an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 2 as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber, A protein (polypeptide) containing an amino acid sequence consisting of a part thereof is also included.

なお、本明細書における「CLAC」には、本発明者が新たに見出したCLACのスプライスバリアントアイソフォームも含まれる。CLACのスプライスバリアントアイソフォームとしては、CLAC-P1、CLAC-P3/P8、CLAC-TA7、CLAC-TA9、CLAC-TA10およびAMY(CLAC-P)が挙げられる。   In addition, “CLAC” in the present specification includes a spliced variant isoform of CLAC newly found by the present inventors. Examples of CLAC splice variant isoforms include CLAC-P1, CLAC-P3 / P8, CLAC-TA7, CLAC-TA9, CLAC-TA10 and AMY (CLAC-P).

本明細書においてCLAC-P1とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位および第952位〜第969位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。CLAC-P1は、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号4に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In the present specification, CLAC-P1 is a portion lacking a portion encoded by a base sequence corresponding to exons located at positions 1 to 531 and positions 952 to 969 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a splice variant of CLAC characterized by CLAC-P1 is not only a protein containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, but also has an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 4 or an amino acid comprising a part thereof as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber Also included are proteins (polypeptides) containing the sequence.

本明細書においてCLAC-P3/P8とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。CLAC-P3/P8は、配列番号6で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号6に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In this specification, CLAC-P3 / P8 is a portion encoded by a base sequence corresponding to an exon located at positions 1 to 531 and positions 2296 to 2607 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Is a splice variant of CLAC characterized by the lack of CLAC-P3 / P8 is not only a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, but also an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 6 or a part thereof as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber. A protein (polypeptide) containing the amino acid sequence is also included.

本明細書においてCLAC-TA7とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。CLAC-TA7は、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号8に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In this specification, CLAC-TA7 is a base corresponding to an exon located at positions 1 to 531, 952 to 969, and 2296 to 2607 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a CLAC splice variant characterized by the lack of the portion encoded by the sequence. CLAC-TA7 is not only a protein containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8, but also has an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 8 or an amino acid comprising a part thereof as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber Also included are proteins (polypeptides) containing the sequence.

本明細書においてCLAC-TA9とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。CLAC-TA9は、配列番号10で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号10に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In the present specification, CLAC-TA9 means positions 1 to 531, positions 952 to 969, positions 1507 to 1551 and positions 2296 to 2607 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. This is a CLAC splice variant characterized by lacking a portion encoded by a base sequence corresponding to an exon located at. CLAC-TA9 is not only a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, but also has an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 10 or an amino acid comprising a part thereof as long as it has the feature of binding to amyloid β fiber. Also included are proteins (polypeptides) containing the sequence.

本明細書においてCLAC-TA10とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位、第2161位〜第2187位、第2188位〜第2241位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。CLAC-TA10は、配列番号12で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号12に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In this specification, CLAC-TA10 refers to positions 1 to 531, positions 952 to 969, positions 1507 to 1551, positions 2161 to 2187 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. A CLAC splice variant characterized by lacking a portion encoded by a base sequence corresponding to an exon located at positions 2188 to 2241 and 2296 to 2607. CLAC-TA10 is not only a protein containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12, but also has an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 12 or an amino acid comprising a part thereof as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber Also included are proteins (polypeptides) containing the sequence.

本明細書においてAMY(CLAC-P)とは、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位、第2296位〜第2607位および第2494位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列によってコードされる部分が欠如していることを特徴とするCLACのスプライスバリアントである。AMY(CLAC-P)は、配列番号14で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質のみならず、アミロイドβ繊維と結合するという特徴を有する限り、配列番号14に類似のアミノ酸配列や、それらの一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ポリペプチド)も包含される。   In this specification, AMY (CLAC-P) refers to the 1st to 531st positions, the 952th to 969th positions, the 1507th position to the 1551st position, the 2296th position to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A CLAC splice variant characterized by lacking a portion encoded by a base sequence corresponding to an exon located at positions 2607 and 2494 to 2607. AMY (CLAC-P) is not only a protein containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, but also has an amino acid sequence similar to SEQ ID NO: 14 or a part thereof as long as it has a feature of binding to amyloid β fiber A protein (polypeptide) containing an amino acid sequence consisting of

ここで「類似のアミノ酸配列」とは、例えば、アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜9個程度、より好ましくは1〜5個程度、更に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列が含まれる。
「一部からなるアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号2の配列を有するCLACはアミロイドβ繊維と結合するという活性を示すことが知られているため、該活性を有する配列であればよい。なお、アミロイドβ繊維と結合するという活性は、アミロイドβをアッセイプレートに固相化したCLAC結合試験(Soderberg L, Kakuyama. H., Moller A, Ito A, Winblad B, Tjernberg L, Naslund J. J Biol Chem 2005;280:1007-1015)などの公知の方法により確認することができる。
Here, the term “similar amino acid sequence” refers to, for example, one or more (preferably about 1 to 9, more preferably about 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence. In which the amino acid sequence is substituted.
The “partial amino acid sequence” is, for example, a CLAC having the sequence of SEQ ID NO: 2 that is known to exhibit an activity of binding to amyloid β fiber, and may be any sequence having this activity. In addition, the activity of binding to amyloid β fiber was confirmed by the CLAC binding test in which amyloid β was immobilized on an assay plate (Soderberg L, Kakuyama. H., Moller A, Ito A, Winblad B, Tjernberg L, Naslund J. J Biol Chem 2005; 280: 1007-1015).

そのため、「CLAC遺伝子」といった用語を用いる場合、前記の「CLAC」をコードする遺伝子であるため、特に言及しない限り、配列番号1で示される公知の塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   Therefore, when a term such as “CLAC gene” is used, it is a gene encoding the above “CLAC”. Therefore, unless otherwise specified, not only the gene containing the known base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but also the sequence And a base sequence encoding the above-mentioned “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence”, which is a gene containing a similar base sequence, or a part thereof.

更に「CLAC遺伝子」には、本発明者が新たに見出したCLACのスプライスバリアントアイソフォームをコードする遺伝子も含まれる。そのため、本明細書における「CLAC遺伝子」には、CLAC-P1遺伝子、CLAC-P3/P8遺伝子、CLAC-TA7遺伝子、CLAC-TA9遺伝子、CLAC-TA10遺伝子およびAMY(CLAC-P)遺伝子が含まれる。   Furthermore, the “CLAC gene” includes a gene encoding a splicing variant isoform of CLAC newly found by the present inventors. Therefore, “CLAC gene” in the present specification includes CLAC-P1 gene, CLAC-P3 / P8 gene, CLAC-TA7 gene, CLAC-TA9 gene, CLAC-TA10 gene, and AMY (CLAC-P) gene. .

本明細書においてCLAC-P1遺伝子とは、前記のCLAC-P1をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位および第952位〜第969位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。CLAC-P1遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号3で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the CLAC-P1 gene is a gene encoding the above-mentioned CLAC-P1, and is therefore located at positions 1 to 531 and positions 952 to 969 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. The base sequence corresponding to the exon is lacking. Unless otherwise stated, the CLAC-P1 gene is not only a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, but also a gene containing a nucleotide sequence similar to the nucleotide sequence or a part thereof, A base sequence encoding a “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence” is also included.

本明細書においてCLAC-P3/P8遺伝子とは、前記のCLAC-P3/P8をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。CLAC-P3/P8遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号5で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the CLAC-P3 / P8 gene is a gene encoding the above-mentioned CLAC-P3 / P8. The nucleotide sequence corresponding to the exon located at position 2607 is lacking. Unless otherwise stated, the CLAC-P3 / P8 gene is not only a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, but also a gene containing a nucleotide sequence similar to the nucleotide sequence, or a part thereof. A base sequence encoding the above-mentioned “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence” is also included.

本明細書においてCLAC-TA7遺伝子とは、前記のCLAC-TA7をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。CLAC-TA7遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号7で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the CLAC-TA7 gene is a gene encoding the above-mentioned CLAC-TA7. Therefore, the 1st to 531st positions, the 952th to 969th positions, and the A base sequence corresponding to an exon located at positions 2296 to 2607 is lacking. Unless otherwise stated, the CLAC-TA7 gene is not only a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, but also a gene containing a nucleotide sequence similar to the nucleotide sequence or a part thereof, A base sequence encoding a “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence” is also included.

本明細書においてCLAC-TA9遺伝子とは、前記のCLAC-TA9をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。CLAC-TA9遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号9で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the CLAC-TA9 gene is a gene that encodes the above-mentioned CLAC-TA9, so that the first position to the 531st position, the 952nd position to the 969th position, A base sequence corresponding to exons located at positions 1507 to 1551 and positions 2296 to 2607 is lacking. Unless otherwise stated, the CLAC-TA9 gene is not only a gene containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, but also a gene containing a base sequence similar to the base sequence or a part thereof, A base sequence encoding a “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence” is also included.

本明細書においてCLAC-TA10遺伝子とは、前記のCLAC-TA10をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位、第2161位〜第2187位、第2188位〜第2241位および第2296位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。CLAC-TA10遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号11で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the CLAC-TA10 gene is a gene encoding the above-mentioned CLAC-TA10, and therefore, the first to 531st positions, the 952th to 969th positions, A base sequence corresponding to exons located at positions 1507 to 1551, 2161 to 2187, 2188 to 2241 and 2296 to 2607 is lacking. Unless otherwise stated, the CLAC-TA10 gene is not only a gene containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, but also a gene containing a base sequence similar to the base sequence or a part thereof, A base sequence encoding a “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence” is also included.

本明細書においてAMY(CLAC-P)遺伝子とは、前記のAMY(CLAC-P)をコードする遺伝子であるため、配列番号1に記載の塩基配列の第1位〜第531位、第952位〜第969位、第1507位〜第1551位、第2296位〜第2607位および第2494位〜第2607位に位置するエクソンに該当する塩基配列が欠如していることを特徴とする。AMY(CLAC-P)遺伝子は、特に言及しない限り、配列番号13で示される塩基配列を含有する遺伝子のみならず、該塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子や、それらの一部である、前述の「一部からなるアミノ酸配列を含有するタンパク質(ペプチド)」をコードする塩基配列も含まれる。   In the present specification, the AMY (CLAC-P) gene is a gene encoding the above-mentioned AMY (CLAC-P). Therefore, the first to 531st positions and the 952nd position of the base sequence described in SEQ ID NO: The base sequences corresponding to the exons located at positions 969, 1507 to 1551, 2296 to 2607, and 2494 to 2607 are lacking. Unless otherwise specified, the AMY (CLAC-P) gene is not only a gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13, but also a gene containing a nucleotide sequence similar to the nucleotide sequence or a part thereof. Also included are base sequences encoding the aforementioned “protein (peptide) containing a partial amino acid sequence”.

なお、「類似の塩基配列を含有する遺伝子」とは、配列番号1,3,5,7,9,11または13に示される塩基配列中、1もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含有する遺伝子や、前記配列番号1,3,5,7,9,11または13で示される塩基配列と高い相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。「高い相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子」とは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意味する。例えば、具体的には公知のCLAC遺伝子であれば、配列番号1で示される塩基配列と75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。CLAC-P1遺伝子であれば、配列番号3で示される塩基配列と75%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。CLAC-P3/P8遺伝子であれば、配列番号5で示される塩基配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。CLAC-TA7遺伝子であれば、配列番号7で示される塩基配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。CLAC-TA9遺伝子であれば、配列番号9で示される塩基配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。CLAC-TA10遺伝子であれば、配列番号11で示される塩基配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。AMY(CLAC-P)遺伝子であれば、配列番号13で示される塩基配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。   The “gene containing a similar base sequence” means that one or a plurality of bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 13. And a gene containing a base sequence having high homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 13. The “gene containing a base sequence having high homology” means a gene that hybridizes under stringent conditions. For example, in the case of a known CLAC gene, a gene containing a base sequence having a homology of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Is mentioned. Examples of the CLAC-P1 gene include a gene containing a base sequence having 75% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. In the case of the CLAC-P3 / P8 gene, a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5. The gene to contain is mentioned. The CLAC-TA7 gene contains a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7. Gene. The CLAC-TA9 gene contains a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9. Gene. The CLAC-TA10 gene contains a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11. Gene. In the case of the AMY (CLAC-P) gene, a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 A gene containing

ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができ、所望の相同性に応じて設定されるが、例えば塩濃度:6XSSC、温度:65℃の条件が挙げられる。   The stringent conditions can be adjusted by appropriately changing the temperature, salt concentration, etc. during the hybridization reaction and washing, and are set according to the desired homology. For example, the salt concentration: 6XSSC, Temperature: 65 degreeC conditions are mentioned.

CLACは、本発明により提供される遺伝子の配列情報(配列番号:1,3,5,7,9,11,13)に基づいて、DNAクローニング、各発現ベクターの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。
発現ベクターの宿主へのトランスフェクションする方法としては、具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド(Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社)を用いる方法、マイクロインジェクション法等の公知の方法が挙げられる。発現ベクターは、一般的に使用されているGST、His-tag等のマーカータンパク等との融合タンパク質が発現されるように設計されたものであってもよい。
これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができる。
CLAC is based on the sequence information (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) of the gene provided by the present invention, based on DNA cloning, construction of each expression vector, transfection into a host, It can be obtained by culturing the transformant and recovering the protein from the culture.
Specific methods for transfection of expression vectors into the host include calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electroporation method, a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL), and microinjection. Known methods such as the method can be mentioned. The expression vector may be designed so that a fusion protein with a commonly used marker protein such as GST or His-tag is expressed.
These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.

本明細書において「アミロイドβ線維」とは、アミロイドβ蛋白質が重合した複合体を示す。アミロイドβ繊維は、Myszka, D. G., Wood, S. J., and Biere, A. L. Methods Enzymol 1999;309:386-402.に記載の方法など、公知のアミロイドβ蛋白質を繊維化させる方法に従って調製することができる。
ここでアミロイドβ蛋白質は、一般的に用いられているアミロイドβ蛋白質であればよく、公知の方法で合成(文献名:有機合成〈4〉酸・アミノ酸・ペプチド実験化学講座 日本化学会 (編集) (1999/09 -- ISBN:4621045822 -- 丸善)、ペプチド合成の基礎と実験 泉屋 信夫 著(1985/01 -ISBN:4621029622 -- 丸善))することができる。アミロイドβ1−40などは市販の凍結乾燥品(American peptide社、ペプチド研究所、Bachem社製)を入手することもできる。
As used herein, “amyloid β fibril” refers to a complex in which amyloid β protein is polymerized. The amyloid β fiber can be prepared according to a known method for fibrosis of amyloid β protein, such as the method described in Myszka, DG, Wood, SJ, and Biere, AL Methods Enzymol 1999; 309: 386-402.
Here, the amyloid β protein may be any commonly used amyloid β protein and synthesized by a known method (Reference: Organic Synthesis <4> Acid, Amino Acid, Peptide Laboratory Chemistry Course, Chemical Society of Japan (edit) (1999/09-ISBN: 4621045822-Maruzen), peptide synthesis basics and experiment Nobuo Izumiya (1985/01 -ISBN: 4621029622-Maruzen)). For amyloid β1-40 and the like, commercially available freeze-dried products (American peptide, Peptide Institute, Bachem) can also be obtained.

本明細書において「アミロイドβ線維分解抵抗性」とは、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維が、単に繊維化させたアミロイドβ線維よりもタンパク質分解酵素に対して難分解性を示すことをいう。   In this specification, “amyloid β fibril degradation resistance” means that the amyloid β fiber of the CLAC / amyloid β fiber complex is more resistant to proteolytic enzymes than fibrillated amyloid β fiber. Say.

そのため、「アミロイドβ線維分解抵抗性を減少させる物質」とは、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素に接触させた場合に、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ分解抵抗性を減少させる物質であればよく、何ら限定されない。具体的には、例えば、CLAC/アミロイドβ複合体に直接作用することによって複合体の分解を促進させる物質、あるいはCLAC/アミロイドβ複合体の形成に関与することによって該複合体のタンパク質分解酵素抵抗性を弱める物質などが挙げられる。CLACとアミロイドβ繊維とでCLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる際に被験物質を加えておけば、該複合体の形成に関与することによってタンパク質分解酵素抵抗性を弱める物質を見出すことができる。一方で、CLAC/アミロイドβ複合体形成後に被験物質を加えれば、より強固な複合体を分解させる化合物を選別することができる。   Therefore, “a substance that reduces amyloid β fibril degradation resistance” means that the amyloid β degradation resistance of the CLAC / amyloid β fibril complex is reduced when the CLAC / amyloid β fibril complex is brought into contact with a proteolytic enzyme. Any substance can be used without any limitation. Specifically, for example, a substance that promotes the degradation of the complex by directly acting on the CLAC / amyloid β complex, or the protease resistance of the complex by participating in the formation of the CLAC / amyloid β complex. Examples include substances that weaken sex. If a test substance is added when forming a CLAC / amyloid β fiber complex with CLAC and amyloid β fiber, a substance that weakens the resistance to proteolytic enzymes can be found by participating in the formation of the complex. . On the other hand, if a test substance is added after formation of the CLAC / amyloid β complex, a compound capable of decomposing a stronger complex can be selected.

本明細書において「タンパク質分解酵素」とは、アミロイドβ繊維を分解する活性を有するタンパク質分解酵素であればよく、何ら限定されない。タンパク質分解酵素は生体内タンパク分解酵素が好ましく、更に好ましくはヒト由来の生体内タンパク分解酵素である。生体内タンパク質分解酵素とは、タンパク質分解酵素のうち生体内に存在するタンパク質分解酵素である。生体内タンパク分解酵素としては、具体的には、例えばネプリライシン、インスリン分解酵素、proteinase K、トリプシン等が挙げられ、更に好ましくはネプリライシン、インスリン分解酵素が挙げられる。   In the present specification, the “proteolytic enzyme” may be a proteolytic enzyme having an activity of degrading amyloid β fiber, and is not limited at all. The proteolytic enzyme is preferably an in vivo proteolytic enzyme, more preferably a human-derived in vivo proteolytic enzyme. The in vivo proteolytic enzyme is a proteolytic enzyme existing in vivo among proteolytic enzymes. Specific examples of in vivo proteolytic enzymes include neprilysin, insulin-degrading enzyme, proteinase K, trypsin, and the like, and more preferably neprilysin and insulin-degrading enzyme.

本明細書においてネプリライシンといった用語を用いる場合、特に言及しない限り、国際酵素委員会分類番号EC 3.4.24.11で表される公知の酵素(タンパク質)だけでなく、その同族体や変異体などを包含する趣旨で用いられる。特開2002−34596に記載のネプリライシン様中性エンドペプチダーゼを、本明細書におけるネプリライシンとして用いることもできる。ネプリライシンの取得方法については、Neuroscience Letters, Volume 350, Issue 2, 23 October 2003, Pages 113-116や、特開2002−34596に記載されるように公知である。ネプリライシンは、例えば、ネプリライシン遺伝子の塩基配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法(Molecular Cloning T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができる。なお、市販されているネプリライシン(Alpha Diagnostic International, Inc)を用いることもできる。   When using a term such as neprilysin in the present specification, it includes not only a known enzyme (protein) represented by International Enzyme Commission classification number EC 3.4.24.11, but also its homologues and mutants, unless otherwise specified. Used for purposes. Neprilysin-like neutral endopeptidase described in JP-A-2002-34596 can also be used as neprilysin in the present specification. A method for obtaining neprilysin is known as described in Neuroscience Letters, Volume 350, Issue 2, 23 October 2003, Pages 113-116 and JP-A-2002-34596. Neprilysin can be obtained by, for example, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of a transformant, and recovery of a protein from the culture based on the base sequence information of the neprilysin gene. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). It can be carried out. Commercially available neprilysin (Alpha Diagnostic International, Inc) can also be used.

本明細書においてインスリン分解酵素といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、国際酵素委員会分類番号EC3.4.22.11で表される公知の酵素(タンパク質)だけでなく、その同族体や変異体も包含する趣旨で用いられる。インスリン分解酵素の取得方法についてはJ. Biol. Chem. 278, 4978949794(2003) に記載のように公知である。インスリン分解酵素は、ラット肝臓、ヒト赤血球、ヒト胎盤などから精製するか、あるいは該当cDNA(Science, 242, 1415(1988))を微生物、植物細胞あるいは動物細胞で発現させた後、単離精製することにより得られる。具体的には、例えば、インスリン分解酵素遺伝子の塩基配列情報(例えば、accession No:BX648462, M21188、配列番号:15)に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法(Molecular Cloning T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができる。
タンパク質分解酵素は、市販されているタンパク質分解酵素であるproteinase K(シグマ社)を用いることもできる。
When using a term such as insulin-degrading enzyme in this specification, unless otherwise specified, not only a known enzyme (protein) represented by International Enzyme Commission classification number EC3.4.22.11, but also homologues and variants thereof Used for the purpose of inclusion. A method for obtaining an insulin-degrading enzyme is known as described in J. Biol. Chem. 278, 4978949794 (2003). Insulin-degrading enzyme is purified from rat liver, human erythrocytes, human placenta, etc., or the relevant cDNA (Science, 242, 1415 (1988)) is expressed in microorganisms, plant cells or animal cells and then isolated and purified. Can be obtained. Specifically, for example, based on the nucleotide sequence information of the insulin degrading enzyme gene (for example, accession No: BX648462, M21188, SEQ ID NO: 15), DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, transformation It can be obtained by manipulation of body culture and protein recovery from the culture. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). It can be carried out.
As the proteolytic enzyme, proteinase K (Sigma), which is a commercially available proteolytic enzyme, can also be used.

本発明は、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる物質をスクリーニングする方法を提供する。   The present invention provides a method of screening for a substance that decreases the resistance to amyloid β fiber degradation of a CLAC / amyloid β fiber complex.

本発明は、実施例に示すように、アミロイドβ繊維とCLACとの複合体(CLAC/アミロイドβ繊維複合体)は、アミロイドβ繊維単独よりもタンパク質分解酵素によってアミロイドβ繊維が分解されにくいという性質、すなわちアミロイドβ繊維分解抵抗性を有しているという全く新しい知見に基づいたものである。   In the present invention, as shown in the Examples, a complex of amyloid β fiber and CLAC (CLAC / amyloid β fiber complex) has a property that amyloid β fiber is less likely to be degraded by proteolytic enzyme than amyloid β fiber alone. That is, it is based on a completely new finding that it has amyloid β fiber degradation resistance.

本発明のスクリーニング方法は、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程を、被験物質下において実施することによって行うことができる。
その場合、本発明のスクリーニング方法としては、例えば次の工程(a)および(b)を含むものが例示される:
(a)被験物質存在下において、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(b)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程。
ここで被験物質の選別は、具体的には、被験物質(候補物質)を添加したCLAC/アミロイドβ線維複合体のタンパク質分解酵素によるアミロイドβ繊維分解抵抗性が、被験物質(候補物質)を添加しないCLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性に比して低くなることをもって、行うことができる。
The screening method of the present invention can be carried out by carrying out the step of contacting the CLAC / amyloid β fibril complex with a proteolytic enzyme under a test substance.
In that case, examples of the screening method of the present invention include those comprising the following steps (a) and (b):
(A) contacting the CLAC / amyloid β-fiber complex with a proteolytic enzyme in the presence of a test substance;
(B) A step of measuring the amyloid β-fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β-fiber complex and selecting a test substance that decreases the amyloid β-fiber degradation resistance of the complex.
Specifically, the test substance is selected by adding the test substance (candidate substance) to the amyloid β fiber degradation resistance by the proteolytic enzyme of the CLAC / amyloid β fiber complex to which the test substance (candidate substance) is added. This can be achieved by lowering the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex.

あるいは、本発明のスクリーニング方法は、CLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる工程を、被験物質下において実施することによっても行うことができる。
その場合、本発明のスクリーニング方法としては、例えば次の工程(a)(b)および(c)を含むものが例示される:
(a)被験物質存在下において、CLACとアミロイドβ線維とを接触させCLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる工程、
(b)形成されたCLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(c)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程。
ここで被験物質の選別は、具体的には、被験物質の存在下で形成されたCLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性が、被験物質非存在下で形成されたCLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性に比して低くなることをもって、行うことができる。
なお、「CLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる工程」はCLACとアミロイドβ繊維を接触させてCLAC/アミロイドβ線維複合体が形成されればよく、反応温度や反応時間等の条件は何ら限定されない。例えば、公知の条件(Methods Enzymol 1999;309:386-402)または実施例に記載の条件に従って行うことができる。
Alternatively, the screening method of the present invention can also be performed by carrying out the step of forming a CLAC / amyloid β fibril complex in the presence of a test substance.
In that case, examples of the screening method of the present invention include those comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of contacting CLAC with amyloid β-fiber in the presence of a test substance to form a CLAC / amyloid β-fiber complex;
(B) contacting the formed CLAC / amyloid β fibril complex with a proteolytic enzyme;
(C) A step of measuring the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex and selecting a test substance that decreases the resistance to amyloid β fiber degradation of the complex.
Here, the selection of the test substance is specifically performed by the CLAC / amyloid formed in the absence of the test substance when the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex formed in the presence of the test substance is This can be achieved by lowering the amyloid β-fiber degradation resistance of the β-fiber complex.
The “step of forming a CLAC / amyloid β-fiber complex” is sufficient if CLAC / amyloid β-fiber complex is formed by contacting CLAC and amyloid β-fiber, and the conditions such as reaction temperature and reaction time are not limited. Not. For example, it can be performed according to known conditions (Methods Enzymol 1999; 309: 386-402) or the conditions described in the Examples.

被験物質となりえるものとしては、制限されないが、ヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記CLAC/アミロイドβ線維複合体と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。   Examples of substances that can be used as test substances include, but are not limited to, nucleotides, peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, screening is performed using these test substances or samples (test samples) containing these test substances. / Can be performed in contact with amyloid β-fiber complex. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts containing test substances, gene library expression products, synthetic low-molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.

「アミロイドβ線維分解抵抗性を測定」する工程は、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維の分解が検出できる測定方法であればよく、種々の実施態様を取ることができる。例えば、アミロイドβ分子量特性の可視化などにより測定することができる。
以下、アミロイドβ線維分解抵抗性の測定方法の具体例について例示する。
The step of “measuring amyloid β fibril degradation resistance” may be any measurement method that can detect the degradation of amyloid β fibrils of the CLAC / amyloid β fibril complex, and can take various embodiments. For example, it can be measured by visualization of amyloid β molecular weight characteristics.
Hereinafter, a specific example of a method for measuring amyloid β fibril degradation resistance is illustrated.

(1)染色法によるアミロイドβ線維分解抵抗性の測定
アミロイドβ線維分解抵抗性の測定は、染色試薬、たとえばクーマシーブリリアントブルーR250を用いた方法にて実施することができ、その他にも、グルタルアルデヒドで処理したのちアンモニア性銀/ホルムアルデヒドで処理するなどの方法による銀染色クーマシーブルー染色、銀染色またはスピロルビー染色などの方法を用いて実施することができる。
具体的には、例えば、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素にて分解反応後に、常法に基づいてSDS-PAGEをする。SDS-PAGE終了後、クーマシーブリリアントブルー(Gel Code Blue stain reagent: PIRCE社)染色、銀染色クーマシーブルー染色、銀染色またはスピロルビー染色を、公知の方法に従って実施すれば、分解反応後に残存するCLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維の分子量を可視化することができ、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を測定することができる。
なお、SDS-PAGEをする際には、例えば、残存しているアミロイドβ繊維を蟻酸などを用いて可溶化し、蟻酸を除去後に、さらに尿素などを用いて再度溶解してからSDS-PAGEを行うのが好ましい。
(1) Measurement of amyloid β fibril degradation resistance by staining method The measurement of amyloid β fibril degradation resistance can be carried out by a method using a staining reagent such as Coomassie Brilliant Blue R250. It can be carried out by using a method such as silver staining Coomassie blue staining, silver staining or spirolby staining, such as treatment with aldehyde followed by treatment with ammoniacal silver / formaldehyde.
Specifically, for example, after performing a degradation reaction of the CLAC / amyloid β fiber complex with a proteolytic enzyme, SDS-PAGE is performed based on a conventional method. After SDS-PAGE, CLAC remaining after the degradation reaction can be obtained by performing Coomassie Brilliant Blue (Gel Code Blue stain reagent: PIRCE) staining, silver staining Coomassie blue staining, silver staining, or spirolby staining according to known methods. The molecular weight of the amyloid β fibril of the amyloid β fibril complex can be visualized, and the amyloid β fibril degradation resistance of the CLAC / amyloid β fibril complex can be measured.
When SDS-PAGE is performed, for example, the remaining amyloid β fiber is solubilized using formic acid, etc., formic acid is removed, and then dissolved again using urea or the like and then SDS-PAGE is performed. Preferably it is done.

(2)ウエスタンブロット法によるアミロイドβ線維分解抵抗性の測定
アミロイドβ線維分解抵抗性の測定はウエスタンブロット法を用いて実施することができる。
具体的には、例えば、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素にて分解反応後に、常法に基づいてSDS-PAGEをする。SDS-PAGE終了後、分解されていないアミロイドβ繊維をウエスタンブロット法で検出すれば、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を測定することができる。
なおSDS-PAGEをする際には、例えば、残存しているアミロイドβ繊維を蟻酸などを用いて可溶化し、蟻酸を除去後に、さらに尿素などを用いて再度溶解してからSDS-PAGEを行うのが好ましい。
アミロイドβ繊維の検出に用いる抗体は、アミロイドβを特異的に認識することができる抗体であればよく、例えばアミロイドβ特異抗体である6E10、4G8(Signet Laboratories社)などを挙げることができる。
(2) Measurement of amyloid β fibril degradation resistance by Western blotting The measurement of amyloid β fibril degradation resistance can be carried out using Western blotting.
Specifically, for example, after performing a degradation reaction of the CLAC / amyloid β fiber complex with a proteolytic enzyme, SDS-PAGE is performed based on a conventional method. After completion of SDS-PAGE, amyloid β-fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β-fiber complex can be measured by detecting undegraded amyloid β-fiber by Western blotting.
When performing SDS-PAGE, for example, the remaining amyloid β fiber is solubilized using formic acid, etc., and after removing formic acid, it is dissolved again using urea or the like and then SDS-PAGE is performed. Is preferred.
The antibody used for detection of amyloid β fiber may be any antibody that can specifically recognize amyloid β, and examples thereof include 6E10 and 4G8 (Signet Laboratories), which are amyloid β-specific antibodies.

(3)膜透過法によるアミロイドβ線維分解抵抗性の測定
アミロイドβ線維分解抵抗性の測定は膜透過法を用いて実施することができる。
具体的には、例えば、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素にて分解反応後に、反応溶液中に残存するアミロイドβ繊維を膜に吸着させることにより、酵素分解物と分離する。次に、膜上に吸着した残存アミロイドβ繊維量を、アミロイドβを特異的に認識する抗体を用いて一般的な免疫化学的測定方法で可視化すれば、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を評価することができる。
ここで用いる膜は、CLAC/アミロイドβ繊維複合体が吸着し、該複合体と酵素反応分解物とを分離することができるものであればよく、例えばニトロセルロースやセルロースアセテートなどを挙げることができる。
(3) Measurement of amyloid β fibril degradation resistance by membrane permeation method Measurement of amyloid β fibril degradation resistance can be carried out using a membrane permeation method.
Specifically, for example, after the CLAC / amyloid β-fiber complex is decomposed with a proteolytic enzyme, the amyloid β fiber remaining in the reaction solution is adsorbed on the membrane to be separated from the enzyme degradation product. Next, if the amount of residual amyloid β fibers adsorbed on the membrane is visualized by a general immunochemical measurement method using an antibody that specifically recognizes amyloid β, the amyloid β of the CLAC / amyloid β fiber complex Fibrosis resistance can be evaluated.
The membrane used here only needs to be capable of adsorbing the CLAC / amyloid β fiber complex and separating the complex from the enzymatic reaction degradation product, and examples thereof include nitrocellulose and cellulose acetate. .

また、標識化アミロイドβ(ラジオアイソトープ標識など)を一定割合で混合させたアミロイドβ繊維を用いて評価することもできる。その場合は、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素にて分解反応後に、反応溶液中に残存するアミロイドβ繊維を膜に吸着させ、酵素分解物と分離する。次に、膜上に吸着した残存アミロイドβ繊維量を、標識したアミロイド繊維の放射能を検出することによって測定すれば、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を評価することができる。   It can also be evaluated using amyloid β fibers in which labeled amyloid β (such as radioisotope label) is mixed at a certain ratio. In that case, after the degradation reaction of the CLAC / amyloid β fiber complex with a proteolytic enzyme, the amyloid β fiber remaining in the reaction solution is adsorbed on the membrane and separated from the enzyme degradation product. Next, if the amount of residual amyloid β fiber adsorbed on the membrane is measured by detecting the radioactivity of the labeled amyloid fiber, the resistance to amyloid β fiber degradation of the CLAC / amyloid β fiber complex can be evaluated. it can.

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

アミロイドβ繊維とCLAC複合体に対するproteinase Kによるアミロイドβ繊維分解反応を検討した。
(1)アミロイドβ繊維の調製
アミロイドβを繊維化させ、アミロイドβ繊維を調製する工程は、Myszka, D. G., Wood, S. J., and Biere, A. L. Methods Enzymol 1999;309:386-402の方法に従って実施した。1mgの凍結乾燥品アミロイドβ1−40 トリフルオロ酢酸塩(Bachem社製)をリン酸緩衝液で溶解した後、室温で2日間スターラーを用いて攪拌しながら、繊維化させた。繊維化したアミロイドβは最終濃度100μMに調製し、実験に使用するまで-70℃で保管した。
The amyloid β fiber degradation reaction by proteinase K on amyloid β fiber and CLAC complex was examined.
(1) Preparation of amyloid β fiber The step of fibrillating amyloid β to prepare amyloid β fiber was performed according to the method of Myszka, DG, Wood, SJ, and Biere, AL Methods Enzymol 1999; 309: 386-402. . 1 mg of lyophilized amyloid β1-40 trifluoroacetate (manufactured by Bachem) was dissolved in a phosphate buffer, and then fiberized while stirring with a stirrer at room temperature for 2 days. Fibrotic amyloid β was prepared to a final concentration of 100 μM and stored at −70 ° C. until used for experiments.

(2)組み換えCLACの調製
組み換えヒトCLACを発現する細胞株を含む細胞培養物の調製はSoderberg L.et, al(2004) J Biol Chem in press.の方法に従って実施した。
(2) Preparation of recombinant CLAC A cell culture containing a cell line expressing recombinant human CLAC was prepared according to the method of Soderberg L. et, al (2004) J Biol Chem in press.

(3)アミロイドβ繊維とCLACの反応
細胞培養液から精製したCLACとアミロイドβ繊維とを接触させるため、(1)で調製したアミロイドβ繊維 (最終濃度50μM, 重量20μg)と、(2)で調製した組み換えCLAC(最終濃度200nM 重量5μg)を2時間リン酸緩衝液中に室温で接触させ、アミロイドβ繊維とCLACの複合体を形成させた。
(3) Reaction of amyloid β fiber and CLAC In order to contact CLAC purified from cell culture medium with amyloid β fiber, amyloid β fiber prepared in (1) (final concentration 50 μM, weight 20 μg), and (2) The prepared recombinant CLAC (final concentration 200 nM, weight 5 μg) was contacted in phosphate buffer at room temperature for 2 hours to form a complex of amyloid β fiber and CLAC.

(4)アミロイドβ繊維の生体内蛋白質分解酵素による分解反応
前記(3)に続いて、アミロイドβ繊維CLAC複合体と生体内分解酵素を接触させた。アミロイドβ繊維CLAC複合体を蛋白質分解酵素proteinase K (Sigma社製) を重量比1:10 (酵素 : アミロイドβ繊維) と混合させ37℃で一晩反応させた。反応の停止は70%蟻酸添加によっておこない、蟻酸添加後、一晩放置してアミロイドβ繊維を可溶化させた。つぎにスピードバック(遠心濃縮装置)を用いて蟻酸を除去した後、9M尿素(100 mM Tris, pH 10.5)水溶液に再び溶解し、次の(5)のSDS-PAGEによる解析実験に供した。
(4) Degradation reaction of amyloid β fiber by in vivo proteolytic enzyme Following (3), the amyloid β fiber CLAC complex was contacted with the in vivo degrading enzyme. The amyloid β fiber CLAC complex was mixed with proteinase K (manufactured by Sigma) in a weight ratio of 1:10 (enzyme: amyloid β fiber) and reacted at 37 ° C. overnight. The reaction was stopped by adding 70% formic acid, and after adding formic acid, it was left overnight to solubilize amyloid β fibers. Next, after removing formic acid using a speed bag (centrifugal concentrator), the formic acid was dissolved again in an aqueous solution of 9M urea (100 mM Tris, pH 10.5) and subjected to the analysis analysis by SDS-PAGE of the next (5).

(5)アミロイドβ繊維分解活性の解析
アミロイドβ繊維分解活性の解析はSDS-PAGE法を用いた分子量特性決定法により評価した。SDS-PAGE法には10-20% tricine ゲル(Invitrogen社)、Tricin SDS緩衝液(Invitrogen社)を用いた。SDS-PAGE終了後アミロイドβの可視化にはクーマシーブリリアントブルー(Gel Code Blue stain reagent: PIRCE社)染色ならびにウエスタンブロット法を用いた。ウエスタンブロット法はSDS−PAGEにて分離したアミロイドβをPVDF膜(0.2μm BIO-RAD社)に転写した後、1次抗体にアミロイドβ特異抗体6E10、4G8(Signet Laboratories社)、2次抗体にhorseradish peroxidase結合 抗マウスヒツジIgG(Amersham社)を用い、ECL plus western blotting regents(Amersham社)を用いて可視化した。
(5) Analysis of amyloid β fiber degradation activity Analysis of amyloid β fiber degradation activity was evaluated by a molecular weight characterization method using SDS-PAGE. For SDS-PAGE, 10-20% tricine gel (Invitrogen) and Tricin SDS buffer (Invitrogen) were used. After completion of SDS-PAGE, amyloid β was visualized using Coomassie Brilliant Blue (Gel Code Blue stain reagent: PIRCE) staining and Western blotting. In Western blotting, amyloid β separated by SDS-PAGE is transferred to a PVDF membrane (0.2 μm BIO-RAD), then the primary antibody is amyloid β-specific antibody 6E10, 4G8 (Signet Laboratories), and the secondary antibody Horseradish peroxidase binding Anti-mouse sheep IgG (Amersham) was used for visualization using ECL plus western blotting regents (Amersham).

図1に示すように、クーマシーブリリアントブルー染色法による結果、CLAC添加群では、蛋白質分解酵素proteinase Kと2時間および一晩反応させてもアミロイドβ特異的なバンド(アミロイドβ繊維量)が検出された。一方、CLAC非添加群では2時間反応後すでにアミロイドβ特異的なバンド(アミロイドβ繊維量)は減弱し、一晩反応させた後の検体ではアミロイドβ繊維は完全に分解され検出されなかった。すなわちCLACがアミロイドβ繊維に結合することにより、生体内蛋白質分解酵素であるproteinase Kによるアミロイドβ繊維分解作用に対する抵抗性がCLAC/アミロイドβ繊維複合体に付与されることが判明した。
ウエスタンブロット法による結果も、上記のクーマシーブリリアントブルーによる結果と同じ結果を示した。6E10はアミロイドβN末端付近を認識する抗体であり、4G8はアミロイドβのアミノ酸配列中央付近を認識する抗体である。2種類の異なる領域を認識する抗体を用いても、CLACによるアミロイドβ繊維への蛋白質分解酵素抵抗性の付与が確認できた。(4)の反応によって減少するアミロイドβ繊維残存量をSDS-PAGE法で分子量サイズ特性も決定できた。
これらの結果より、この原理を用いてスクリーニングすれば、CLAC-アミロイドβ繊維複合体のアミロイドβ繊維分解を促進する化合物など、アミロイドβ繊維分解抵抗性を弱める化合物を見出すことが可能であることが判明した。
As shown in Fig. 1, as a result of the Coomassie Brilliant Blue staining method, a band specific to amyloid β (amyloid β fiber content) was detected in the CLAC addition group even when reacted with proteinase K for 2 hours and overnight. It was done. On the other hand, in the CLAC non-added group, the band specific to amyloid β (amyloid β fiber amount) was already attenuated after the reaction for 2 hours, and the amyloid β fiber was completely decomposed and not detected in the specimen after the overnight reaction. In other words, it was found that the CLAC / amyloid β fiber complex is given resistance to the amyloid β fiber degradation action of proteinase K, an in vivo proteolytic enzyme, by binding CLAC to amyloid β fiber.
The result by Western blotting showed the same result as that by Coomassie Brilliant Blue. 6E10 is an antibody that recognizes the vicinity of the amyloid βN terminal, and 4G8 is an antibody that recognizes the vicinity of the center of the amino acid sequence of amyloid β. Even when antibodies that recognize two different regions were used, it was confirmed that CLAC imparted proteolytic enzyme resistance to amyloid β fibers. The molecular weight size characteristic of the remaining amount of amyloid β fiber decreased by the reaction of (4) could also be determined by SDS-PAGE.
From these results, it is possible to find compounds that weaken amyloid β fiber degradation resistance, such as compounds that promote amyloid β fiber degradation of the CLAC-amyloid β fiber complex, by screening using this principle. found.

(1)アミロイドβ繊維、CLACの反応
実施例1の(1)(2)の手順に従ってアミロイドβ繊維とCLACを調製後に、細胞培養液から精製したCLACとアミロイドβ繊維とを接触させた。実施例1(1)で調製したアミロイドβ繊維 (最終濃度0.1μM)、および実施例1(2)で調製した組み換えCLAC(最終濃度100nM )を2時間リン酸緩衝液中に室温で接触させ、アミロイドβ繊維とCLACの複合体を形成させた。
(1) Reaction of amyloid β fiber and CLAC After preparing amyloid β fiber and CLAC according to the procedures of (1) and (2) of Example 1, CLAC purified from the cell culture solution and amyloid β fiber were contacted. The amyloid β fiber prepared in Example 1 (1) (final concentration 0.1 μM) and the recombinant CLAC prepared in Example 1 (2) (final concentration 100 nM) were contacted in phosphate buffer at room temperature for 2 hours. A complex of amyloid β fiber and CLAC was formed.

(2)アミロイドβ繊維の生体内蛋白質分解酵素による分解反応
アミロイドβ繊維CLAC複合体を蛋白質分解酵素proteinase K (Sigma社製)を重量比58:1 (酵素: アミロイドβ繊維) で混合させ、さらに最終濃度SDS(sodium dodeclsulfate)0.4%存在下、37℃で一晩反応させた。反応の停止は、反応溶液の温度を室温に戻し、さらに10%SDS(最終濃度5 SDS%)を添加して反応溶液を希釈して行った。
(2) Degradation reaction of amyloid β fiber by in vivo proteolytic enzyme Amyloid β fiber CLAC complex is mixed with proteolytic enzyme proteinase K (manufactured by Sigma) at a weight ratio of 58: 1 (enzyme: amyloid β fiber), The reaction was allowed to proceed overnight at 37 ° C. in the presence of 0.4% final concentration of SDS (sodium dodeclsulfate). The reaction was stopped by returning the temperature of the reaction solution to room temperature and further diluting the reaction solution by adding 10% SDS (final concentration 5 SDS%).

(3)アミロイドβ繊維分解活性の解析
アミロイドβ繊維分解活性の解析は、膜透過法で行った。残存アミロイドβ繊維と酵素分解物の分離にセルロースアセテート膜(ポアサイズ0.2μm, Schleicher&Schuell社)およびドットブロット装置(Slotblot, Amersham社)を用いた膜透過法を用いた。残存アミロイドβ繊維量の可視化には1次抗体にアミロイドβ特異抗体6E10 (Signet Laboratories社)、2次抗体にhorseradish peroxidase結合 抗マウスヒツジIgG(Amersham社)を用い、ECL plus western blotting regents(Amersham社)を用いた。
膜透過法により評価した結果、図2に示すように、酵素添加群(レーン5-12)では酵素非添加群(レーン1-4)よりもアミロイドβ繊維量の減少が認められた。酵素添加群のうちCLAC添加群(レーン9-12)のアミロイドβ残繊維量はCLAC非添加群(レーン5-8)より多かった。したがってCLAC添加により酵素分解によるアミロイドβ繊維の減少が抑制された。すなわち膜透過法においてもCLACのアミロイドβ繊維への蛋白質分解酵素抵抗性の付与が確認できた。
(3) Analysis of amyloid β fiber degradation activity Analysis of amyloid β fiber degradation activity was performed by a membrane permeation method. A membrane permeation method using a cellulose acetate membrane (pore size 0.2 μm, Schleicher & Schuell) and a dot blot apparatus (Slotblot, Amersham) was used for separation of residual amyloid β fibers and enzyme degradation products. To visualize the amount of residual amyloid β fiber, amyloid β-specific antibody 6E10 (Signet Laboratories) was used as the primary antibody, horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse sheep IgG (Amersham) was used as the secondary antibody, and ECL plus western blotting regents (Amersham) ) Was used.
As a result of evaluation by the membrane permeation method, as shown in FIG. 2, a decrease in the amount of amyloid β fiber was recognized in the enzyme added group (lanes 5-12) than in the enzyme non-added group (lanes 1-4). Among the enzyme added groups, the amount of residual amyloid β in the CLAC added group (lanes 9-12) was higher than that in the CLAC non-added group (lanes 5-8). Therefore, the addition of CLAC suppressed the decrease of amyloid β fiber due to enzymatic degradation. That is, in the membrane permeation method, it was confirmed that the proteolytic enzyme resistance was imparted to the amyloid β fiber of CLAC.

(1)スクリーニング方法1
上記の実施例1(1)(2)の手順に従ってアミロイドβ繊維とCLACを調製し、調製したアミロイドβ繊維と組み換えCLACを、2時間リン酸緩衝液中に室温で接触させ、CLAC/アミロイドβ繊維複合体を形成させる。
次に、被験化合物存在下で、アミロイドβ繊維CLAC複合体と生体内蛋白質分解酵素(ネプリライシン又はインスリン分解酵素)を混合させて37℃で一晩反応させ、実施例2(3)の手順に従って、膜透過法によりアミロイドβ繊維分解活性の解析を行う。被験化合物非存在下でCLAC/アミロイドβ繊維複合体と該酵素を反応させたものを対照として用いることができる。
(1) Screening method 1
Amyloid β fiber and CLAC were prepared according to the procedure of Example 1 (1) (2) above, and the prepared amyloid β fiber and recombinant CLAC were contacted in a phosphate buffer solution at room temperature for 2 hours to obtain CLAC / amyloid β. A fiber composite is formed.
Next, in the presence of the test compound, the amyloid β fiber CLAC complex and the in vivo proteolytic enzyme (neprilysin or insulin degrading enzyme) are mixed and reacted overnight at 37 ° C., according to the procedure of Example 2 (3), Analysis of amyloid β fiber degradation activity is performed by membrane permeation method. A product obtained by reacting the enzyme with the CLAC / amyloid β fiber complex in the absence of the test compound can be used as a control.

(2)スクリーニング方法2
上記の実施例1(1)(2)の手順に従ってアミロイドβ繊維とCLACを調製し、調製したアミロイドβ繊維と組み換えCLACを、被験化合物存在下で、2時間リン酸緩衝液中に室温で接触させ、CLAC/アミロイドβ繊維複合体を形成させる。
次に、アミロイドβ繊維CLAC複合体と生体内蛋白質分解酵素(ネプリライシン又はインスリン分解酵素)を混合させて37℃で一晩反応させ、実施例2(3)の手順に従って、膜透過法によりアミロイドβ繊維分解活性の解析を行う。
(2) Screening method 2
Amyloid β fiber and CLAC were prepared according to the procedure of Example 1 (1) and (2) above, and the prepared amyloid β fiber and recombinant CLAC were contacted in phosphate buffer at room temperature for 2 hours in the presence of the test compound. To form a CLAC / amyloid β fiber complex.
Next, amyloid β-fiber CLAC complex and in vivo proteolytic enzyme (neprilysin or insulin degrading enzyme) are mixed and reacted overnight at 37 ° C., and amyloid β is obtained by membrane permeation according to the procedure of Example 2 (3). Analysis of fiber degradation activity.

CLACの6種類の新規スプライスバリアントアイソフォームをヒト脳cDNAライブラリーよりクローニングし、配列を同定した。
(1)CLACアイソフォームスプライスバリアントのクローニング
CLAC前駆体(CLAC-P)はヒト脳cDNAライブラリー (QUICK-Clone cDNA, BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA)を用いてクローニングした。すなわち1 ng のライブラリーをテンプレートとして用い、forward 1 (F1)およびreverse 1 (R1) プライマーを用いて touch-down PCR法により実施した(2)(表1)。テンプレートとして用いた配列は、Homo sapiens collagen-like Alzheimer amyloid plaque component precursor type I mRNA CLAC-P nucleotide sequence (accession no. AF293340)である。
つぎにPCR法を用いて増幅させたCLAC配列をpCR 2.1-TOPO TA クローニングベクター(Invitrogen, Life Technologies)に挿入しサブクローニングを行った。
Six new splice variant isoforms of CLAC were cloned from a human brain cDNA library and the sequence was identified.
(1) Cloning of CLAC isoform splice variants
The CLAC precursor (CLAC-P) was cloned using a human brain cDNA library (QUICK-Clone cDNA, BD Bioscience Clontech, Palo Alto, Calif.). That is, 1 ng of the library was used as a template, and touch-down PCR was performed using forward 1 (F1) and reverse 1 (R1) primers (2) (Table 1). The sequence used as a template is Homo sapiens collagen-like Alzheimer amyloid plaque component precursor type I mRNA CLAC-P nucleotide sequence (accession no. AF293340).
Next, the CLAC sequence amplified by PCR was inserted into the pCR 2.1-TOPO TA cloning vector (Invitrogen, Life Technologies) for subcloning.

表1にCLAC cDNA中に含まれるプライマーの配列を示す。 Table 1 shows the sequences of the primers contained in the CLAC cDNA.

Figure 2006204150
Figure 2006204150

(2)遺伝子配列解析
挿入された CLAC cDNAの配列解析は ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer sequencer (Applied Biosystems Foster City CA) 、BigDye Terminator Cycle Sequencing キット および表1に記載した F1-F4 , R1-R3 (Thermo-Hybaids, Thermo Electron Corporation, Ulm, Gerrmay) を用いて行った。cDNA クローンの配列は 標識色素ヌクレオチドを用い、公知である (Big-Dye, Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)の説明書に従い実施した。
精製産物を自動配列解析装置ABI PRISM(登録商標) 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Foster City CA社)を用いて解析した。実験に用いたプライマーF1-F4 および R1-R3はそれぞれ CLAC-P cDNA 双方向に全長まで伸展させた。それぞれのプライマーは少なくとも3回、挿入配列の解析に用いられた。
つぎに各cDNA クローンの配列は (コンティングアゼンブリプログラム) Cap3 アゼンブリソフトウウェアーを用いて解析した(http://bio.ifom-firc.it/ASSEMBLY/assemble.html にて入手可能)。
(2) Gene sequence analysis
Sequence analysis of the inserted CLAC cDNA was performed using ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer sequencer (Applied Biosystems Foster City CA), BigDye Terminator Cycle Sequencing kit and F1-F4, R1-R3 (Thermo-Hybaids, Thermo Electron Corporation, (Ulm, Gerrmay). The cDNA clone was sequenced using a labeled dye nucleotide according to a known instruction (Big-Dye, Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT).
The purified product was analyzed using an automatic sequence analyzer ABI PRISM (registered trademark) 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Foster City CA). Primers F1-F4 and R1-R3 used in the experiment were extended to the full length in both directions of the CLAC-P cDNA. Each primer was used at least 3 times for analysis of the inserted sequence.
Next, the sequence of each cDNA clone was analyzed using (Conting Assembly Program) Cap3 assembly software (available at http://bio.ifom-firc.it/ASSEMBLY/assemble.html).

その結果、合計6種類の異なる長さを持った新規CLAC-Pアイソフォームを見出した。新規に見出された配列は、それぞれP1, P3/P8, TA7, TA9, TA10およびAMY/CLAC-P と命名した。なおAMY/CLAC-P は、そのアミノ酸配列を既に発表(Soderberg L, Kakuyama. H., Moller A, Ito A, Winblad B, Tjernberg L, Naslund J. J Biol Chem 2005;280:1007-1015)しているが、コードする塩基配列については未発表である。
表2に、すでに報告されている最長の塩基配列を持つ公知のクローン(Homo sapiens collagen-like Alzheimer amyloid plaque component precursor type I mRNA 配列AF293340:NCBI sequence database)と比較した結果を相同性(%)も合わせて示した。表2において欠損塩基配列位置とは、配列番号1に記載の塩基配列における欠損塩基配列の位置を示している。
As a result, new CLAC-P isoforms with a total of 6 different lengths were found. The newly found sequences were named P1, P3 / P8, TA7, TA9, TA10 and AMY / CLAC-P, respectively. AMY / CLAC-P has already published its amino acid sequence (Soderberg L, Kakuyama.H., Moller A, Ito A, Winblad B, Tjernberg L, Naslund J. J Biol Chem 2005; 280: 1007-1015). However, the encoded nucleotide sequence has not been published.
Table 2 shows the homology (%) of the results of comparison with a known clone having the longest reported base sequence (Homo sapiens collagen-like Alzheimer amyloid plaque component precursor type I mRNA sequence AF293340: NCBI sequence database). Shown together. In Table 2, the deleted base sequence position indicates the position of the defective base sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.

表2に新規CLACアイソフォームをAF293340と比較した結果を示す。 Table 2 shows the results of comparing the new CLAC isoform with AF293340.

Figure 2006204150
Figure 2006204150

本発明によって、これまでに知られている阻害剤と異なる新たな作用機序に基づく、アルツハイマー病などのアミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患に有効な剤のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、アルツハイマー病などのの治療または予防剤などとして有効に利用することができる。
更に、本発明によって本発明スクリーニング方法などに用いることのできる新規なCLACのスプライスバリアントアイソフォームが提供される。
According to the present invention, there is provided a screening method for an agent effective for a disease caused by amyloid β protein deposition such as Alzheimer's disease based on a new mechanism of action different from the known inhibitors. The substance obtained by the screening method of the present invention can be effectively used as a therapeutic or prophylactic agent for Alzheimer's disease and the like.
Furthermore, the present invention provides a novel splice variant isoform of CLAC that can be used in the screening method of the present invention.

CLAC は繊維化したアミロイドβ繊維に蛋白質分解酵素抵抗性を与えている。Aはウエスタンブロット法による結果、Bはクーマシーブリリアントブルー染色法による結果を示す。CLAC+:CLAC添加群、CLAC−:CLAC非添加群。2h: 酵素への接触反応が2時間の反応例、on: 酵素への接触反応が1晩(およそ12時間)の反応例。CLAC imparts proteolytic enzyme resistance to the fibrillar amyloid β fiber. A shows the result by Western blotting, and B shows the result by Coomassie brilliant blue staining. CLAC +: CLAC added group, CLAC-: CLAC non-added group. 2h: Example of contact reaction with enzyme for 2 hours, on: Example of reaction with enzyme contact reaction overnight (approximately 12 hours).

膜透過法法による評価結果を示す。CLAC は繊維化したアミロイドβ繊維に蛋白質分解酵素抵抗性を与えている。アミロイドβ繊維+ CLAC: レーン1-4, アミロイドβ繊維+酵素: レーン5-8, アミロイドβ繊維+CLAC +酵素: レーン9-12The evaluation result by the membrane permeation method is shown. CLAC imparts proteolytic enzyme resistance to the fibrillar amyloid β fiber. Amyloid β fiber + CLAC: Lanes 1-4, Amyloid β fiber + Enzyme: Lane 5-8, Amyloid β fiber + CLAC + Enzyme: Lane 9-12

Claims (9)

下記の工程(a)および(b)を含む、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を減少させる物質のスクリーニング方法、
(a)被験物質存在下において、CLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(b)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程。
A screening method for a substance that decreases the resistance to amyloid β fibril degradation of a CLAC / amyloid β fibril complex, comprising the following steps (a) and (b):
(A) contacting the CLAC / amyloid β-fiber complex with a proteolytic enzyme in the presence of a test substance;
(B) A step of measuring the amyloid β-fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β-fiber complex and selecting a test substance that decreases the amyloid β-fiber degradation resistance of the complex.
下記の工程(a)(b)および(c)を含む、CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ線維分解抵抗性を減少させる物質のスクリーニング方法、
(a)被験物質存在下において、CLACとアミロイドβ線維とを接触させCLAC/アミロイドβ線維複合体を形成させる工程、
(b)形成されたCLAC/アミロイドβ線維複合体をタンパク質分解酵素と接触させる工程、
(c)CLAC/アミロイドβ線維複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を測定し、該複合体のアミロイドβ繊維分解抵抗性を減少させる被験物質を選択する工程。
A screening method for a substance that decreases the resistance to amyloid β fibril degradation of a CLAC / amyloid β fibril complex, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of contacting CLAC with amyloid β-fiber in the presence of a test substance to form a CLAC / amyloid β-fiber complex;
(B) contacting the formed CLAC / amyloid β fibril complex with a proteolytic enzyme;
(C) A step of measuring the amyloid β fiber degradation resistance of the CLAC / amyloid β fiber complex and selecting a test substance that decreases the resistance to amyloid β fiber degradation of the complex.
タンパク質分解酵素が生体内タンパク質分解酵素である、請求項1または2記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 1 or 2, wherein the proteolytic enzyme is an in vivo proteolytic enzyme. タンパク質分解酵素がネプリライシンまたはインスリン分解酵素である、請求項1〜3いずれか記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 1, wherein the proteolytic enzyme is neprilysin or an insulin-degrading enzyme. アミロイドβ繊維分解抵抗性を測定する手法が、クーマシーブリリアントブルー染色法、ウエスタンブロット法または膜透過法である、請求項1〜4いずれか記載のスクリーニング方法。 The screening method according to any one of claims 1 to 4, wherein the method for measuring amyloid β fiber degradation resistance is a Coomassie brilliant blue staining method, a Western blot method, or a membrane permeation method. アミロイドβ蛋白質の沈着によって引き起こされる疾患の治療または予防に有効な剤をスクリーニングするための、請求項1〜5いずれか記載のスクリーニング方法。 The screening method according to any one of claims 1 to 5, for screening an agent effective for treating or preventing a disease caused by deposition of amyloid β protein. アルツハイマー病の治療又は予防に有効な剤をスクリーニングするための、請求項6記載のスクリーニング方法。 The screening method of Claim 6 for screening the agent effective in the treatment or prevention of Alzheimer's disease. 以下の(a)、(b)または(c)のDNAからなる遺伝子、
(a)配列番号3,5,7,9,11または13のいずれかで示される塩基配列からなるCLAC DNA、
(b)配列番号4,6,8,10,12または14のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるCLACをコードするDNA、
(c)配列番号3,5,7,9,11または13のいずれかで示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミロイドβ繊維と複合体を形成するという特徴を有する蛋白質をコードするDNA。
A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) CLAC DNA consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 or 13;
(B) DNA encoding CLAC comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12 or 14;
(C) a protein having the characteristics of hybridizing with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 or 13 under a stringent condition and forming a complex with amyloid β fiber DNA encoding
以下の(a)又は(b)の蛋白質からなるCLAC、
(a)配列番号4,6,8,10または12のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)請求項8に記載の遺伝子によりコードされる蛋白質。
CLAC comprising the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10 or 12,
(B) a protein encoded by the gene according to claim 8;
JP2005018801A 2005-01-26 2005-01-26 Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease Pending JP2006204150A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005018801A JP2006204150A (en) 2005-01-26 2005-01-26 Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005018801A JP2006204150A (en) 2005-01-26 2005-01-26 Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2006204150A true JP2006204150A (en) 2006-08-10

Family

ID=36961635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005018801A Pending JP2006204150A (en) 2005-01-26 2005-01-26 Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer's disease

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2006204150A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1891218A2 (en) Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis
US20030124529A1 (en) Pregnancy-associated plasma protein-A2 (PAPP-A2)
CN1149317A (en) DNA sequences
KR102058624B1 (en) Marker TMEM43 for diagnosing sensorineural hearing loss and uses thereof
CN115707784A (en) Application of USP10 in diagnosis and prognosis evaluation of non-small cell lung cancer patients
JP5695719B2 (en) CC2D2A gene mutation associated with Joubert syndrome and its diagnostic method
US20030103981A1 (en) Methods of use of a prostate-associated protease in the diagnosis and treatment of prostate cancer
JP2002291486A (en) Variant of factor vii-activating protease and detection method using specific antibody
JP4629873B2 (en) Monocyte-derived nucleic acids and related compositions and methods
JP2010526994A (en) Methods for detecting in vivo activity of neurotrypsin, use of the method in the diagnosis and monitoring of neurotrypsin-related disorders and use of the C-terminal 22 kDa fragment of agrin as a biomarker
US20120122113A1 (en) Signature Of Secreted Protein Isoforms Specific To Ovarian Cancer
JPH11508442A (en) Human glandular kallikrein-1 (hK2)
US5731192A (en) Collagen COL4A6: gene, protein and method of detecting collagen deficiency
WO1999060122A1 (en) Method for examining central nervous system diseases and method for screening remedies
JP2003510053A (en) Heparanase-2, a member of the heparanase protein family
JP2006204150A (en) Method for screening preventive or therapeutic agent for alzheimer&#39;s disease
JP2002223782A (en) Human afc1
AU767187B2 (en) Novel serine protease BSSP6
JP2000511408A (en) New treatment
JP4232423B2 (en) Novel ubiquitin-specific protease
US20030152963A1 (en) Human chromosome 15 and 16 bardet-biedl syndrome polynucleotides and polypeptides and methods of use
JPWO2005100566A1 (en) Novel monkey GPR103, monkey QRFP, and method for evaluating compounds using GPR103
WO2001048168A1 (en) A novel peptide--gammal1-pyrroline-5-hydroxy-reductase 14 and the polynucleotide coding this novel peptide
WO2001040480A1 (en) Novel polypeptide - human endopolypeptidase 6 and polynucleotide encoding it
CN111278851A (en) Solute carrier family 14 member 1(SLC14a1) variants and uses thereof