【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には、血漿分画製剤の一種である血清アルブミン製剤の製造方法及び当該方法で得られた製剤に関する。さらに詳細には、アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法、製造工程中に前記アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法を含んでなるアルブミン製剤の製造方法、並びに当該製造方法によって製造されるアルブミン製剤に関する。本願発明により工業的規模での高い収率を維持したアルブミン製剤の製造方法並びにアルブミン凝集体及び/または不純物が低減されたアルブミン製剤が提供される。
【０００２】
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】
アルブミンは分子量６.９万の蛋白質で、５８５個のアミノ酸からなる楕円状の分子である。血清アルブミンは全蛋白質中の約６割を占める血漿中に最も多く含まれる蛋白質であって、生体内では肝臓で合成される。そして、血液中で血漿膠質浸透圧の維持、毒物の中和や酸塩基平衡の維持に関与しており、また多くの薬物や化合物と非特異的に結合し、それらを運搬する役割を担う。
上記アルブミンを製剤化したアルブミン製剤は、火傷、ネフローゼ症候群等によるアルブミン喪失およびアルブミン合成能低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。
アルブミン製剤（加熱人血漿蛋白を含む）は、蛋白質濃度が４.４〜２５％（アルブミン含量が８０％以上もしくは９６％以上）という高濃度の蛋白質製剤である。また、製剤１本あたりの容量も２０〜２５０ｍＬと大量であり、その製造においては大量かつ大容量の蛋白質を処理することが求められる。
【０００３】
アルブミン製剤はその製造工程において、アルコール分画では高い濃度のアルコールに曝され、またウイルス不活化を目的とした６０℃１０時間の液状加熱が施された製剤であり、そのウイルスに対する安全性は５０年来の臨床使用により実証されている。一方、これらアルコール分画及び加熱処理を経ることで、アルブミン製剤中には、アルブミンの凝集体が形成される。アルブミン製剤中に存在するアルブミン凝集体形成の原因としては、▲１▼アルコール分画時のアルコールとの接触、▲２▼加熱処理によるアルブミン自身の凝集、▲３▼加熱処理におけるアルブミンと不純蛋白質との相互作用による凝集等が挙げられる。この凝集体が製剤の安全性に影響を及ぼす直接的な知見はないが、元来生体中に存在していない蛋白質の変性物であることから、製剤中に含有されていないことが望ましい。
【０００４】
従来の技術においては、一般に、ヒト血清アルブミンの精製方法としては、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等が用いられる。さらに製造工程の最終段階ではウイルス不活化を目的とした液状加熱処理が汎用されている。このような方法で製造される市販のアルブミン製剤は、製剤中にゲル濾過分析で全蛋白質中の２〜１０％の凝集体が存在することが知られている。また、アルブミン以外の不純蛋白質も全蛋白質中で１〜４％存在していることが知られている。
ヒト血清アルブミンの凝集体は、上記の液状加熱処理により共在する熱に不安定な不純蛋白質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられている（非特許文献１、非特許文献２を参照）。当該凝集体は、単量体が２分子或いはそれ以上結合して形成されるものであって、等電点や化学的性状が単量体と非常に似通っており、通常生産で行われる精製方法では、分離が困難である。そのため、従来の技術ではゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点分画処理、硫安分画処理、エタノール分画処理など数種類の精製方法を組み合わせて除去されてきた（特許文献１を参照)。不純蛋白質は、原料由来の蛋白質としてハプトグロビン、トランスフェリンやヘモペキシン等の他の蛋白質が夾雑蛋白質として含まれており、これら多くの精製工程を経てもなお、最終製剤中に数％残存し、不純蛋白質を極力低減することが製造上の重要な課題となっている。
精製方法を複数組み合わせると、回収率の低下と共に生産性の低下を招く場合が多い。工業的観点から、なるべく精製工程を少なくして凝集体及び不純蛋白質を効率的に除去し、かつアルブミンの単量体は高収率で回収できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】
特表平１１-５０９５２５（特許第２９２６７２２号）
【非特許文献１】
Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒａｐｉｅ，１６，１６０，１６０−１６４（１９８９）
【非特許文献２】
Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．６７，１２５−１３１（１９９４）
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の構成】
本願発明は、薬液中のウイルス等病原体の除去を目的として使用されているウイルス除去膜による濾過をアルブミン製剤の製造工程において行うことで、製剤中の凝集体含量を低減できることを見出し、完成したものである。即ち、本願発明はアルブミン製剤中の凝集体含量を低減させる方法及び凝集体含量の低いアルブミン製剤を提供することを目的とする。
アルコール分画及び加熱処理を経て得られたアルブミン製剤中の凝集体は、▲１▼アルコール分画において生じたアルブミンの凝集体、▲２▼加熱処理において生じたアルブミンの凝集体、及び▲３▼加熱処理においてアルブミンと不純蛋白とが相互作用して生じた凝集体に大別され、従って、アルブミン製剤の凝集体を低減・除去する方法としては、加熱処理前に▲１▼アルブミンの凝集体を低減・除去すること、▲２▼アルブミンと加熱中に相互作用して凝集体となる不純蛋白質を予め低減・除去すること、及び▲３▼加熱処理後に生じた全ての凝集体を低減・除去することが考察された。本願発明者らは、上記状況を鑑みて鋭意研究を進めた結果、凝集体及び不純蛋白質を含有するアルブミン水溶液をウイルス除去膜、好ましくは１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜を用いて濾過することで、アルブミンの凝集体及び/または分子量約７〜３０万以上の不純蛋白質の除去効果が得られることを見出し、本願発明を完成するに至った。
さらに、本願発明では対象物質の分子サイズの相違による除去という原理に基づいた濾過工程のみで凝集体と不純蛋白質の低減と除去が可能なことから、薬液の組成を変化させることなく、これまでより高収率でアルブミン単量体を得ることができ、これにより、より安全性・安定性に優れた製剤を提供することが可能となった。
【０００７】
上記の課題を解決すべくなされた、本願発明のアルブミン製剤は、製造方法において、ヒト血清アルブミン含有水溶液を、該水溶液中に含まれるアルブミン凝集体及び/または不純蛋白質をウイルス除去膜で除去する工程に付すことを特徴とする。
本願発明で用いられるアルブミン凝集体及不純蛋白質を除去するウイルス除去膜としては、１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜が好ましい。この用件を満たすウイルス除去膜であれば特段の制約はないが、例えば、プラノバ１５Ｎ（旭化成）、ウルチポアＶＦ-ＤＶ２０（ポール）、バイアソルブ（ミリポア）等の製品名で市販されている除去膜は好適な例として挙げられる。
本願発明に係る製剤の主成分であるアルブミンの由来には、特に制限がなく具体的には哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウサギ等に由来するもの、また、遺伝子組換え技術に基づく培養細胞に由来するもの等が挙げられ、特にヒト由来のものは実用的であり、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分等が例示される。
本願発明のアルブミン製剤の製造方法は、上記アルブミンを含有する水溶液をウイルス除去膜に濾過し、アルブミン凝集体及不純蛋白質を除去する工程を含むものであれば、すべてを包含する。すなわち、どの段階で当該工程が含まれようとも本願発明の技術思想から外れるものではない。例えば、ウイルス不活化を目的とする加熱処理以前に本願の濾過工程を実施することにより、すでに形成されたアルブミン凝集体または加熱処理の工程中にアルブミンとの相互作用によりアルブミン凝集体を形成させる夾雑蛋白質を除去することができ、当該濾過工程を加熱処理後に行えば、加熱によって生じる全ての凝集体を低減・除去することが可能となる。
また、必要に応じてウイルス除去膜濾過前にアルブミンを含有する水溶液を陰イオン交換体や除去サイズが３５〜２００ｎｍのプレフィルターに供してアルブミンの凝集体及不純蛋白質の低減・除去を前処理として実施することも、本願発明の効果を助長する好ましい実施態様である。
【０００８】
【発明の効果】
本願発明の製造方法によれば、ウイルス除去膜により混入が危惧されるウイルスを除去すると共に加熱処理での凝集体形成因子である不純蛋白質を低減化することができるため、凝集体及び不純蛋白質含量の少ないアルブミン製剤を得ることができる。従って、本願発明により得られたアルブミン製剤は、加熱処理でウイルスが不活化されていると共にウイルス除去膜でウイルスが除去され、凝集体及不純蛋白質が低減化された、より安全性、安定性に優れた製剤である。
【０００９】
以下に、調製例、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
調製例
（アルブミン製剤の調製）
▲１▼アルブミン含有水溶液の調製
コーン氏のアルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペーストに、注射用水（日局）をペースト重量の２倍以上加え撹拌溶解し、限外濾過法により脱アルコールしたアルブミン画分を、ｐＨ４〜５（好ましくは４.４〜４.６）、ＥＣ５ｍＳ/ｃｍ以下（好ましくは１.５ｍＳ/ｃｍ以下）、蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは８〜１２ｗ/ｖ％）に調整した。
【００１１】
▲２▼イオン交換体による前処理の方法
ｐＨ４〜５（好ましくは４.４〜４.６）、ＥＣ５ｍＳ/ｃｍ以下（好ましくは１.５ｍＳ/ｃｍ以下）の酢酸バッファーで平衡化した陰イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ-セファロース（アマシャム・ファルマシア）、Ｑ-セファロース（アマシャム・ファルマシア）、ＤＥＡＥ-トヨパール（東ソー）、ＱＡＥ-トヨパール（東ソー））に、前記▲１▼で調製されたアルブミン含有水溶液を展開し、素通り画分を回収した。
【００１２】
▲３▼フィルターによる前処理の方法
３５〜２００ｎｍのサイズ排除が可能なフィルターを用いて、蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ/ｖ％）、ｐＨ６〜７.５（好ましくは６.６〜７.２）に調整されたアルブミン含有水溶液を濾過し、回収した。
【００１３】
▲４▼本願発明の処理：ウイルス除去膜への通液
プラノバ１５Ｎ（旭化成）に蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ/ｖ％）、ｐＨ６〜７.５（好ましくは６.６〜７.２）に調整されたアルブミン含有水溶液を通液し、回収した。
【００１４】
▲５▼バルク調製
蛋白濃度を５〜３０ｗ/ｖ％（通常５または２０〜２５ｗ/ｖ％）になるように調整した。この際、蛋白の濃縮が必要な場合には限外濾過法を用いた。蛋白１ｇ当り、アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムをそれぞれ０.０８ｍｍｏｌとなるように加え、溶液ｐＨを６.９±０.５とし、これを孔径０.２２μｍ以下の濾過膜を用いて除菌濾過して最終バルクとした。
【００１５】
▲６▼加熱処理及び小分け分注
最終バルクを６０.０±０.５℃で１０時間以上加熱したものを、所定量ずつバイアルに無菌的に分注して、密栓した。
【００１６】
実施例１
（凝集体の除去、低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認）
本願発明による凝集体の除去、低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認をするために、ｉ）調製例の▲１▼により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白濃度８ｗ/ｖ％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ/ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６.９８に調整したアルブミン溶液と、ii)このアルブミン溶液を本願発明のウイルス除去膜（プラノバ１５Ｎ、旭化成）に０.５ｋｇｆ/ｃｍ2の定圧濾過を実施した後のアルブミン溶液をそれぞれ単量体・重合体含量試験（日本薬局方、一般試験法、液体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析)により測定した。蛋白濃度を乗じて含量を求めた結果を表１に示す。表１から明らかなように、ウイルス除去膜によって凝集体の除去及び低減化効果が判明し、さらにアルブミン単量体の回収率も９９％以上で高効率に凝集体の除去効果が得られることが判明した。
【００１７】
【表１】
ウイルス除去膜濾過前後による凝集体の除去効果とアルブミン単量体の回収率
【００１８】
実施例２
（除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果の確認）
本願発明のウイルス除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果を確認するために、ｉ）調製例の▲１▼により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白濃度８ｗ/ｖ％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ/ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６.９８に調整したアルブミン溶液と、ii)このアルブミン溶液を本願発明のウイルス除去膜（プラノバ１５Ｎ、旭化成）に０.５ｋｇｆ/ｃｍ2の定圧濾過を実施した後のアルブミン溶液を、それぞれゲル内沈降反応試験を実施した結果を表２に示す。表２から明らかなようにウイルス除去膜濾過によりセルロプラスミン、トランスフェリンの除去効果が判明した。さらに、ハプトグロビン、ヘモペキシンの低減化効果が判明した。
【００１９】
【表２】
ウイルス除去膜濾過による主な血漿蛋白質の除去及び低減化(ゲル内沈降反応試験)
―：未検出
【００２０】
実施例３
（加熱処理後の製剤中の凝集体含量を低減する効果の確認）
ウイルス除去膜により凝集体及び不純蛋白質を除去及び低減化し、加熱処理後の製剤中の凝集体含量を低減する効果を確認するために、ｉ）本願発明の調製例▲１▼〜▲４▼により得られたアルブミン溶液を、分画分子量１０００〜３万の限外濾過法により脱塩し、蛋白濃度を２５ｗ/ｖ％に濃縮した。さらに、Ｎ-アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムをそれぞれ蛋白１ｇに対し０.０８ｍｍｏｌ加え、６０℃、１０時間以上加熱処理を行い、分注したアルブミン製剤（ウイルス除去膜処理実施）と、ii）比較例として調製例▲１▼〜▲３▼により得られたアルブミン溶液を分画分子量１０００〜３万の限外濾過法により脱塩し、蛋白濃度を２５ｗ/ｖ％に濃縮し、さらに、Ｎ-アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムをそれぞれ蛋白１ｇに対し０.０８ｍｍｏｌ加え、６０℃、１０時間以上加熱処理を行い、分注したアルブミン製剤（ウイルス除去膜処理未実施）をそれぞれ単量体・重合体含量試験(日本薬局方、一般試験法、液体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析)により測定した。その結果を表３に示す。表３から明らかなようにウイルス除去膜処理未実施の比較製剤に比べ、本願発明のウイルス除去膜濾過を行ったアルブミン製剤は二量体及び多量体の含量が低く、凝集体形成抑制効果があることが判明した。
【００２１】
【表３】
ウイルス除去膜濾過によるアルブミン製剤の凝集体の抑制効果
[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to the field of ethical drugs. In detail, it is related with the manufacturing method of the serum albumin formulation which is 1 type of a plasma fraction formulation, and the formulation obtained by the said method. More specifically, a method for removing albumin aggregates and / or impurities, a method for producing an albumin preparation comprising the method for removing albumin aggregates and / or impurities during the production process, and albumin produced by the production method Relates to the formulation. The present invention provides a method for producing an albumin preparation that maintains a high yield on an industrial scale, and an albumin preparation with reduced albumin aggregates and / or impurities.
[0002]
[Background Art and Problems to be Solved by the Invention]
Albumin is a protein with a molecular weight of 69,000 and is an elliptical molecule consisting of 585 amino acids. Serum albumin is the most abundant protein in plasma, accounting for about 60% of the total protein, and is synthesized in the liver by the liver. It is involved in maintaining plasma colloid osmotic pressure in blood, neutralizing toxins and maintaining acid-base balance, and is responsible for nonspecific binding to many drugs and compounds and transporting them.
Albumin preparations in which the above albumin is formulated are used for treatment of albumin loss due to burns, nephrotic syndrome, etc., hypoalbuminemia due to reduced albumin synthesis ability, hemorrhagic shock, and the like.
The albumin preparation (including heated human plasma protein) is a protein preparation having a high concentration of 4.4 to 25% (albumin content of 80% or more or 96% or more). Moreover, the volume per preparation is as large as 20 to 250 mL, and it is required to process a large amount and a large volume of protein in the production.
[0003]
The albumin preparation is a preparation that is exposed to a high concentration of alcohol in the alcohol fractionation process and subjected to liquid heating at 60 ° C. for 10 hours for the purpose of virus inactivation. It has been demonstrated by clinical use over the years. On the other hand, an albumin aggregate is formed in the albumin preparation through the alcohol fractionation and the heat treatment. The causes of albumin aggregate formation in albumin preparations are as follows: (1) contact with alcohol during alcohol fractionation, (2) aggregation of albumin itself by heat treatment, (3) albumin and impure protein in heat treatment Aggregation due to the interaction of Although there is no direct knowledge that the aggregate affects the safety of the preparation, it is desirable that the aggregate is not contained in the preparation because it is a modified product of a protein that does not originally exist in the living body.
[0004]
In the prior art, generally, as a purification method of human serum albumin, a purification method usually used in protein chemistry, for example, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric precipitation method, ion exchange chromatography method, Gel filtration chromatography, affinity chromatography, and the like are used. Furthermore, liquid heat treatment for the purpose of virus inactivation is widely used at the final stage of the production process. It is known that a commercially available albumin preparation produced by such a method contains 2 to 10% of aggregates in the total protein by gel filtration analysis. It is also known that impure proteins other than albumin are present in 1 to 4% of all proteins.
Aggregates of human serum albumin are considered to be those in which albumin is aggregated by the action of heat-labile impure proteins coexisting with the above-described liquid heat treatment (see Non-patent Documents 1 and 2). ). The agglomerates are formed by combining two or more monomers, and have an isoelectric point and chemical properties that are very similar to those of the monomers. Then, separation is difficult. For this reason, the conventional technology has been removed by combining several purification methods such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, isoelectric focusing, ammonium sulfate fractionation, and ethanol fractionation (patents). Reference 1). Impure protein contains other proteins such as haptoglobin, transferrin, and hemopexin as raw material-derived proteins, and even after these many purification steps, a few percent remain in the final formulation. Reducing as much as possible is an important manufacturing issue.
Combining a plurality of purification methods often leads to a reduction in productivity as well as a reduction in recovery rate. From an industrial point of view, it is desired to develop a method capable of efficiently removing aggregates and impure proteins by reducing the number of purification steps as much as possible, and recovering the albumin monomer in a high yield.
[0005]
[Patent Document 1]
11-509525 (Japanese Patent No. 2926722)
[Non-Patent Document 1]
Infusionstherapie, 16, 160, 160-164 (1989)
[Non-Patent Document 2]
Vox Sang. 67, 125-131 (1994)
[0006]
[Means for Solving the Problems, Structure of the Invention]
The present invention has been completed by finding that the content of aggregates in a preparation can be reduced by performing filtration with a virus removal membrane used for the removal of pathogens such as viruses in a chemical solution in the production process of an albumin preparation. It is. That is, an object of the present invention is to provide a method for reducing the aggregate content in an albumin preparation and an albumin preparation having a low aggregate content.
Aggregates in the albumin preparation obtained through alcohol fractionation and heat treatment are: (1) albumin aggregates produced in the alcohol fraction, (2) albumin aggregates produced in the heat treatment, and (3) Aggregates formed by the interaction between albumin and impure protein in the heat treatment are roughly classified. Therefore, as a method for reducing or removing the albumin aggregates, (1) albumin aggregates before the heat treatment can be used. Reduction / removal, (2) Impure protein that interacts with albumin during heating to reduce / remove in advance, and (3) Reduce / remove all aggregates generated after heat treatment. It was considered. As a result of diligent research in view of the above situation, the inventors of the present application have filtered an albumin aqueous solution containing an aggregate and an impure protein using a virus removal membrane, preferably a virus removal membrane having a pore diameter of 10 to 20 nm. Thus, it has been found that an effect of removing albumin aggregates and / or impure proteins having a molecular weight of about 70 to 300,000 or more can be obtained, and the present invention has been completed.
Furthermore, in the present invention, it is possible to reduce and remove aggregates and impure proteins only by the filtration process based on the principle of removal due to the difference in molecular size of the target substance, so that the composition of the chemical solution is not changed, so far. An albumin monomer can be obtained in a high yield, and it has become possible to provide a preparation with higher safety and stability.
[0007]
The albumin preparation of the present invention, which has been made to solve the above-mentioned problems, is a process for removing human serum albumin-containing aqueous solution from the albumin aggregate and / or impure protein contained in the aqueous solution with a virus removal membrane in the production method. It is attached to.
The virus removal membrane for removing albumin aggregates and impure proteins used in the present invention is preferably a virus removal membrane having a pore size of 10 to 20 nm. There are no particular restrictions as long as it is a virus removal membrane that satisfies this requirement, but for example, removal membranes marketed under the product names such as Planova 15N (Asahi Kasei), Ultipore VF-DV20 (Paul), Viasolve (Millipore) A suitable example is given.
There is no particular limitation on the origin of albumin which is the main component of the preparation according to the present invention. Specifically, it is derived from mammals such as humans, cows, rabbits, etc., and cultured cells based on genetic recombination technology. In particular, those derived from humans are practical, and examples include the V fraction obtained by Mr. Korn's cold alcohol fraction.
The method for producing an albumin preparation of the present invention includes all methods as long as it includes a step of filtering the aqueous solution containing albumin to a virus removal membrane to remove albumin aggregates and impure proteins. That is, it does not deviate from the technical idea of the present invention no matter which stage is included. For example, by carrying out the filtration step of the present application prior to heat treatment for inactivation of viruses, albumin aggregates already formed or impurities that form albumin aggregates due to interaction with albumin during the heat treatment step Proteins can be removed, and if the filtration step is performed after the heat treatment, it is possible to reduce and remove all aggregates produced by heating.
In addition, if necessary, an aqueous solution containing albumin is applied to an anion exchanger or a prefilter with a removal size of 35 to 200 nm before virus removal membrane filtration to reduce and remove albumin aggregates and impure proteins. Implementation is also a preferred embodiment that promotes the effects of the present invention.
[0008]
【The invention's effect】
According to the production method of the present invention, it is possible to remove viruses that may be mixed by the virus removal membrane and reduce the impure protein that is an aggregate forming factor in the heat treatment. Less albumin preparation can be obtained. Therefore, the albumin preparation obtained by the present invention is more safe and stable because the virus is inactivated by heat treatment, the virus is removed by the virus removal membrane, and the aggregates and impure proteins are reduced. It is an excellent formulation.
[0009]
Hereinafter, the present invention will be described in detail according to Preparation Examples and Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0010]
【Example】
Preparation example (preparation of albumin preparation)
(1) Preparation of albumin-containing aqueous solution Water for injection (JP) is added to the V fraction paste obtained by Mr. Korn's alcohol fractionation and dissolved with stirring, and the alcohol is removed by ultrafiltration. The albumin fraction was adjusted to pH 4-5 (preferably 4.4-4.6), EC 5 mS / cm or less (preferably 1.5 mS / cm or less), protein concentration 5-15 w / v% (preferably 8-12 w). / v%).
[0011]
{Circle around (2)} Pretreatment with an ion exchanger Anion exchange equilibrated with an acetate buffer having a pH of 4 to 5 (preferably 4.4 to 4.6) and an EC of 5 mS / cm or less (preferably 1.5 mS / cm or less). Body (for example, DEAE-Sepharose (Amersham Pharmacia), Q-Sepharose (Amersham Pharmacia), DEAE-Toyopearl (Tosoh), QAE-Toyopearl (Tosoh)) with the albumin-containing aqueous solution prepared in (1) above. Expanded and collected the flow-through fraction.
[0012]
{Circle around (3)} Pretreatment method with filter Using a filter capable of eliminating a size of 35 to 200 nm, the protein concentration is 5 to 15 w / v% (preferably 6 to 10 w / v%), pH is 6 to 7.5 (preferably The aqueous solution containing albumin adjusted to 6.6 to 7.2) was collected by filtration.
[0013]
(4) Treatment according to the present invention: The protein concentration was 5-15 w / v% (preferably 6-10 w / v%) and the pH was 6-7.5 (preferably 6. The aqueous solution containing albumin adjusted to 6 to 7.2) was passed through and collected.
[0014]
(5) The bulk protein concentration was adjusted to 5-30 w / v% (usually 5 or 20-25 w / v%). At this time, an ultrafiltration method was used when protein concentration was necessary. Sodium acetyltryptophan and sodium caprylate are added to 0.08 mmol per gram of protein, respectively, and the solution pH is 6.9 ± 0.5, and this is sterilized by filtration using a filtration membrane having a pore size of 0.22 μm or less. The final bulk.
[0015]
{Circle around (6)} Heat treatment and subdivision Dispensing of the final bulk at 60.0 ± 0.5 ° C. for 10 hours or more was aseptically dispensed into vials in predetermined amounts and sealed.
[0016]
Example 1
(Confirmation of aggregate removal, reduction effect and albumin monomer recovery)
In order to confirm the effect of removing and reducing aggregates and the recovery rate of albumin monomer according to the present invention, i) the albumin-containing aqueous solution obtained by (1) of the preparation example should have a protein concentration of 8 w / v%. An albumin solution prepared with water for injection (JP) and adjusted to pH 6.98 with a 1 w / v% sodium hydroxide solution, and ii) this albumin solution with the virus removal membrane of the present invention (Planova 15N, Asahi Kasei) Each of the albumin solutions after constant pressure filtration at 0.5 kgf / cm 2 was measured by a monomer / polymer content test (gel filtration analysis applying the Japanese Pharmacopoeia, general test method, and liquid chromatograph method). The results obtained by multiplying the protein concentration are shown in Table 1. As is apparent from Table 1, the effect of removing and reducing aggregates was found by the virus removal membrane, and the aggregate removal effect could be obtained with high efficiency when the recovery rate of albumin monomer was 99% or more. found.
[0017]
[Table 1]
Removal effect of aggregates before and after filtration of virus removal membrane and recovery rate of albumin monomer
[0018]
Example 2
(Confirmation of removal and reduction effect of impure protein by removal film)
In order to confirm the effect of removing and reducing the impure protein by the virus removal membrane of the present invention, i) water for injection (day) so that the aqueous solution containing albumin obtained by the preparation example (1) has a protein concentration of 8 w / v% And an albumin solution adjusted to pH 6.98 with 1 w / v% sodium hydroxide solution, and ii) this albumin solution is applied to the virus removal membrane of the present invention (Planova 15N, Asahi Kasei) at 0.5 kgf / Table 2 shows the results of carrying out the gel precipitation reaction test on the albumin solution after the constant pressure filtration of cm 2. As is clear from Table 2, the removal effect of ceruloplasmin and transferrin was revealed by filtration with a virus removal membrane. Furthermore, the reduction effect of haptoglobin and hemopexin was found.
[0019]
[Table 2]
Removal and reduction of main plasma proteins by virus removal membrane filtration (in-gel precipitation reaction test)
―: Not detected 【0020】
Example 3
(Confirmation of the effect of reducing the aggregate content in the preparation after heat treatment)
In order to confirm the effect of removing and reducing aggregates and impure proteins by the virus removal membrane and reducing the aggregate content in the preparation after heat treatment, i) according to Preparation Examples (1) to (4) of the present invention The obtained albumin solution was desalted by an ultrafiltration method with a molecular weight cut off of 1000 to 30,000, and the protein concentration was concentrated to 25 w / v%. In addition, 0.08 mmol each of sodium N-acetyltryptophan and sodium caprylate was added to 1 g of protein, heat-treated at 60 ° C. for 10 hours or more, and dispensed with an albumin preparation (virus removal membrane treatment), ii) comparison As an example, the albumin solution obtained in Preparation Examples (1) to (3) was desalted by ultrafiltration with a molecular weight cut off of 1000 to 30,000, the protein concentration was concentrated to 25 w / v%, and N- Add 0.08mmol of acetyltryptophan sodium and sodium caprylate to 1g of protein, respectively, heat-treat at 60 ° C for 10 hours or more, and dispense the albumin preparation (virus removal membrane treatment not performed) as a monomer / polymer. The content was measured by a content test (gel filtration analysis applying Japanese Pharmacopoeia, general test method, liquid chromatograph method). The results are shown in Table 3. As is clear from Table 3, the albumin preparation subjected to the virus removal membrane filtration of the present invention has a low dimer and multimer content and has an aggregate formation inhibitory effect as compared with the comparative preparation not subjected to the virus removal membrane treatment. It has been found.
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[Table 3]
Inhibitory effect of aggregates of albumin preparations by virus removal membrane filtration
