JP2006119138A - 共焦点ラマン分光法を利用した組織からの自己−蛍光信号減少方法及びこれを利用した皮膚癌診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は共焦点ラマン分光法を利用した組織からの自己−蛍光（Ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号減少方法及びこれを利用した皮膚癌診断方法に関する。
【解決手段】本発明では、アミドＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードでの正常及びＢＣＣ組織の間の明確なラマンバンド差はこの技術がスペクトルデータの統計的処理が必要なく皮膚学的診断道具として使用される強い潜在能を有しているということを示した。また、共焦点ラマンデプスプロファイリング技術を使用して周辺の非−癌性組織からＢＣＣ組織を正確に分別することが可能であった。したがって、共焦点ラマン分光学は正常及びＢＣＣ組織の間のスペクトル差の直接観察が可能であるため皮膚学的診断の新たな方法を提供することができる。
【選択図】図２

Description

本発明は共焦点ラマン分光法を利用した組織からの自己−蛍光信号減少方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及びこれを利用した皮膚癌診断方法に関する。

去る数十年にわたった分光学（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）技術の発達は癌研究の領域に相当な影響を及ぼしてきた。ＦＴ−ＩＲ、ラマン（Ｒａｍａｎ）及び共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）蛍光顕微鏡のような技術は癌の根源及び進展を明らかにするために使用されてきた（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓ ２００４，１２６，１−１８ Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００，２８７，２１８−２２５）。これら技術は癌誘発細胞及び組織での癌及び生化的変化の早期診断にも使用されてきた（Ｓｈａｆｅｒ−Ｐｅｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２００２，３３，５５２−５６３ Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２００２，５６，５７０−５７３）。これら分光学技術のうち、ラマン分光学（Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が非破壊的でありサンプル準備工程を必要とせず正常及び疾病組織の分子構造に関する詳細な情報を提供するため医学的診断のために相当な関心を集めてきた。

最近、オゾン層破壊、環境汚染などによって皮膚がＵＶ照射に過度に露出されることによって皮膚癌の発病が顕著に増加した。もし初期に検出さえすれば、皮膚癌は１００％に近い治療率を有する。しかし、不幸にも診断がまだ病理学者による形態学的観察に基づいているため、初期検出が困難である。２種類の一般的な皮膚癌がある：基底細胞癌腫（ＢＣＣ）及び扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）。ＢＣＣ及びＳＣＣは両方とも非−黒色腫皮膚癌であり、ＢＣＣは最も一般的な皮膚新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）である。周辺非−癌性組織からＢＣＣ組織を区別することが難しいため、ＢＣＣの正確な検出は臨床皮膚学者から多くの関心を集めてきた（Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００１，１１６，４３４−４４２ Ｂａｋｋｅｒ Ｓｃｈｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０００，７２，６０１０−６０１８）。

ＢＣＣの検出に使用される日常的な診断技術は生検サンプルの病理学的検査である。これは疑わしい異常（ａｂｎｏｒｍａｌ）領域から組織を除去した後、スライスし染色して病理学者が形態学的異常を同定することができるようにした。この方法は個別病理学者の熟練度による主観的な判断に依存し、組織の過度な生検を誘導することがある。したがって、それ以上の生検のための病変（ｌｅｓｉｏｎｓ）の初期選別及び選択のための迅速かつ正確な診断技術が必要である。

ラマン分光学（Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）はこのような問題点を解決することができる潜在能を有する。それは周辺正常組織からＢＣＣ組織を区別できるさらに正確な医学的診断を提供するために適用できる。最近、多様な研究グループがラマン分光学を利用してＢＣＣ検出を試みた。Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．及びＮｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．はＢＣＣと周辺正常組織とを区別するためにＦＴ−ラマン分光法を使用した（Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００４，１２２，４４３−４４９ Ｎｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２００３，１７，５９７−６０２）。Ｎｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．はＢＣＣの凍結組織切片から得たＦＴ−ラマンスペクトルに基づいてシュード−カラー（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｌｏｒ）ラマン地図（Ｒａｍａｎ ｍａｐｓ）を証明した（Ｎｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００２，１１９，６４−６９）。前記研究で、シュード−カラーラマン地図がヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色されたサンプルの顕微鏡イメージと密接に関連するということを示した。ＦＴ−ラマン分光学を利用した従来の研究で、長波長励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）レーザー（１０６４ｎｍ Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒまたは８５０ｎｍ ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｓａｐｐｈｉｒｅ ｌａｓｅｒ）が皮膚組織からの自己−蛍光を最少化するために適用された。しかし、長波長レーザーは短波長励起レーザーに比べて弱いラマン散乱強度を有する。結果的に、以前に報告されたＢＣＣ組織に対するラマンスペクトルは弱い信号−対−ノイズ率を示すため、癌及び正常組織のラマン信号を分別するために主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣＡ）（Ｎｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２００３，１７，５９７−６０２）、Ｋ−平均群集分析（Ｋ-ｍｅａｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＫＣＡ）（Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２００３，８５，５７２−５８０）及び神経網分析（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）（Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００４，１２２，４４３−４４９）のような分光学データの統計的処理を必要とした。しかし、癌診断の実際適用のためにスペクトルデータのいずれの統計的処理も要しないスペクトル差の直接観察が必然的に要求される。

本発明では、５１４．５ｎｍの短波長アルゴンイオンレーザーを使用した共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）ラマン技術をＢＣＣの皮膚学的診断に適用した。ラマン信号を強く妨害する自己−蛍光を効果的に除去するために、共焦点技術を使用した。共焦点ラマン顕微鏡は蛍光の優れた拒否能を有すると知られた。これはレーザーが小さい点に焦点を合せるためサンプリング体積でレーザーフラックスが一般的なラマン分光法でたびたび要求される時間の分画内に蛍光を除去する程度に十分に高くなるという事実に起因する。第二に、励起電子がそのスリットに沿って一つの分子から他の分子に移動することができるため、焦点体積外の分子は蛍光光子を放出することができる。これら光子は共焦点スリットによって封鎖される。共焦点ラマン顕微鏡を使用して照射された１０個のＢＣＣサンプルに対して正常及び癌組織の間の一貫したスペクトル差が観察された。また、共焦点ラマンデプスプロファイリングを行って周辺非−癌性組織からＢＣＣを分別した。外科手術において除去する領域を決定することは重要である。本発明によって、前癌及び非癌性病変に対する直接診断道具として使用できる共焦点ラマン顕微鏡の可能性が分かる。

したがって、本発明の主な目的は、共焦点技術を利用してラマン信号を強く妨害する自己−蛍光を効果的に除去する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記共焦点ラマン分光学を利用した皮膚癌の非浸透的診断方法を提供することにある。

ラマン分光学（Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）は皮膚癌の非浸透的診断を提供することに強い可能性を有する。本発明では、共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）ラマン顕微鏡を最も一般的な皮膚癌である基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＢＣＣ）の皮膚学的診断に適用した。日常的な生検法を使用して１０名のＢＣＣ患者から組織を得て共焦点ラマン測定に使用した。ラマン信号を妨害する組織からの自己−蛍光（Ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号が共焦点スリット調整（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｌｉｔ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を使用して著しく減少された。アミド（ａｍｉｄｅ）ＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードでの正常及びＢＣＣ組織の間の明確なラマンバンド差はこの技術がスペクトルデータの統計的処理が必要なく皮膚学的診断道具として使用される強い潜在能を有しているということを示した。また、共焦点ラマンデプスプロファイリング（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）技術を使用して周辺の非−癌性組織からＢＣＣ組織を正確に分別することが可能であった。したがって、共焦点ラマン分光学は正常及びＢＣＣ組織の間のスペクトル差の直接観察が可能であるため皮膚学的診断の新たな方法を提供することができる。

本発明の目的を達成するために、本発明は皮膚癌診断のためのラマン分光法において共焦点スリット調整を使用してラマン信号を妨害する組織からの自己−蛍光（Ａｕｔｏ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号を減少させる方法を提供する。
本発明において、共焦点ラマン分光法は当業界で商業的に入手可能なＲｅｎｉｓｈａｗ ２０００ Ｒａｍａｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍのような共焦点が可能なラマン顕微鏡を使用して提供されたプロトコルによって行うことができる。共焦点分光法（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）はサンプルの限定された特定領域（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）からスペクトルが収集されることができるようにする技術である。共焦点作動モードにセッティングされると、関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）からの光（ｌｉｇｈｔ）のみが許容（ａｃｃｅｐｔ）される反面、周辺焦点外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｏｃｕｓ）領域からの光は拒絶（ｒｅｊｅｃｔ）される。共焦点モードで空間的解像度（ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が改善される。空間的解像度は水平解像度（ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び焦点深さ（ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｆｏｃｕｓ）の二つの成分を有する。

本発明において、好ましくは、前記共焦点スリット調整は２スリット共焦点整列（ｔｗｏ−ｓｌｉｔ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を使用して第１共焦点スリットは１０〜２０μｍの幅でセッティングし、第２スリットはスペクトロメータスリットに垂直に整列されたＣＣＤ検出器上の二つのピクセル列（ｐｉｘｅｌ ｒｏｗｓ）から仮想第２スリットを作ることを特徴とする。前記スリット幅の範囲内でラマン信号を妨害する組織からの自己−蛍光信号が効果的に減少した。

本発明において、好ましくは、アミド（ａｍｉｄｅ）Ｉモード、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードで正常及び皮膚癌組織の間の明確なラマンバンド差をスペクトルデータの統計的処理無しに検出することを特徴とする。

本発明において、好ましくは、共焦点ラマンデプスプロファイリング（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）技術を使用して周辺の非−癌性組織から皮膚癌組織を正確に分別することを特徴とする。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は共焦点ラマン分光法を利用した皮膚癌の診断方法において、共焦点スリット調整を使用してラマン信号を妨害する組織からの自己−蛍光（Ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号を減少させることを特徴とする皮膚癌診断方法を提供する。

本発明において、前記皮膚癌は基底細胞癌腫（ＢＣＣ）と扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）のようないずれの皮膚癌であることができるが、好ましくは、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）であることを特徴とする。

本発明において、好ましくは、前記共焦点スリット調整は２スリット共焦点整列（ｔｗｏ−ｓｌｉｔ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を使用して第１共焦点スリットは１０〜２０μｍの幅でセッティングし、第２スリットはスペクトロメータスリットに垂直に整列されたＣＣＤ検出器上の二つのピクセル列（ｐｉｘｅｌ ｒｏｗｓ）から仮想第２スリットを作ることを特徴とする。
本発明において、好ましくは、正常及び皮膚癌組織の間のスペクトル差をスペクトルデータの統計的処理無しに直接的に観察することによって診断することを特徴とする。

本発明において、好ましくは、前記スペクトルでラマンシフト（Ｒａｍａｎ ｓｈｉｆｔ）１０００〜１７００ｃｍ^-1領域の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）変化を観察することを特徴とする。

本発明において、好ましくは、アミド（ａｍｉｄｅ）Ｉモード、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードで正常及び皮膚癌組織の間の明確なラマンバンド差を検出することを特徴とする。前記アミド（ａｍｉｄｅ）Ｉ及びＩＩＩモードでは主に正常／癌組織間の蛋白質アミド構造変化を検出し、ＰＯ_2-対称性ストレッチングモードでは主に正常／癌組織間の燐脂質と核酸構造変化を検出することができる。

本発明において、好ましくは、アミド（ａｍｉｄｅ）Ｉモードはラマンシフト（Ｒａｍａｎ ｓｈｉｆｔ）１５８０〜１６１０ｃｍ^-1領域で、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩモードはラマンシフト１３２０〜１３４０ｃｍ^-1領域で、ＰＯ^2-対称性ストレッチングモードはラマンシフト１０３０〜１０６０ｃｍ^-1領域でラマンバンドが発見されることを特徴とする。

具体的に、アミド（ａｍｉｄｅ）Ｉモードは正常組織の場合には１６３０〜１６６０ｃｍ^-1領域で観測されたが、癌組織の場合にはピークが緩慢になり強さは増加すると共にピークの位置が１５８０〜１６１０ｃｍ^-1領域に移動する現象が発見された。反面、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩモードは正常組織では１２９０〜１３１０ｃｍ^-1領域で観測されたが、癌組織の場合にはピークの位置がむしろ高いエネルギー領域に移動して１３２０〜１３４０ｃｍ^-1領域で発見された。ＰＯ_2-対称性ストレッチングモードの場合には正常組織では１０７０〜１１００ｃｍ^-1領域で観測されたが、癌組織の場合には１０３０〜１０６０ｃｍ^-1領域で発見され、アミドＩモードと同様にピークが３０〜４０ｃｍ^-1程度エネルギーが低い領域に移動しピークの強さは小さくなり緩慢になる傾向性を示した。このような皮膚組織のラマンピーク変化は皮膚癌組織の蛋白質の構造変換によるものであると判断される。

本発明において、好ましくは、共焦点ラマンデプスプロファイリング（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）技術を使用して周辺の非−癌性組織から皮膚癌組織を正確に分別することを特徴とする。
本発明において、好ましくは、前記共焦点ラマンデプスプロファイリング技術は１〜２μｍ程度の焦点大きさを有するレーザー光を３０〜４０μｍ間隔で連続走査して正常組織と癌組織のラマン散乱シグナル差を測定した後、これに基づいて癌の有無を判別する方法であって、レーザー光の走査条件と検出条件を最適化することによって微細組織の正常／癌組織の診断に適用できると判断される。

本発明によれば、ラマン分光学（Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）は皮膚癌の非浸透的診断を提供することに強い可能性を有する。本発明では、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードでの正常及びＢＣＣ組織の間の明確なラマンバンド差はこの技術がスペクトルデータの統計的処理が必要なく皮膚学的診断道具として使用される強い潜在能を有しているということを示した。また、共焦点ラマンデプスプロファイリング（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）技術を使用して周辺の非−癌性組織からＢＣＣ組織を正確に分別することが可能であった。したがって、共焦点ラマン分光学は正常及びＢＣＣ組織の間のスペクトル差の直接観察が可能であるため皮膚学的診断の新たな方法を提供することができる。

以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施の形態を詳細に説明する。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されると解釈されない。

［実施例１］：皮膚組織製造（Ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）
皮膚組織サンプルを大韓民国の高麗大学病院の皮膚科から得た。共焦点ラマン（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ）測定に使用されたＢＣＣ組織は１０名の患者から一般生検法によって得た。クロス−セクション２０μｍ厚さを−２０℃で微細切片器（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）で切断し、凍結切片を使用するまで液体窒素に保管した。二つの薄膜切片を試験のために切断した。一つの切片は共焦点ラマンプロファイリング（ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）実験に使用し、他の一つの切片はＨ＆Ｅで染色して一般癌診断のための専門病理学者に送られた。また、Ｈ＆Ｅ切片は染色されなかった切片においてお互い異なる皮膚−層の間の境界を位置化するラマンリファレンス（Ｒａｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として使用された。本発明において、ＢＣＣ組織の３つの異なる領域に対する特徴的ラマンスペクトルが見られる。

［実施例２］：共焦点ラマン測定（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）
共焦点ラマン測定はＲｅｎｉｓｈａｗ ２０００ Ｒａｍａｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。λ＝５１４．５ｎｍで作動するＳｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓアルゴンイオンレーザーが約２０ｍＷレーザーパワーの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）供給源として使用された。レーリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）線はコレクション通路に位置したホログラフィックノッチフィルター（ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｎｏｔｃｈ ｆｉｌｔｅｒ）によって収集されたラマン散乱から除去された。ラマン散乱は４ｃｍ^-1のスペクトル解像度で電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを使用して検出した。皮膚組織サンプルの光学イメージを得るために光学顕微鏡に追加的にＣＣＤカメラを装着した。非焦点レーザービームからバックグラウンドラマン散乱を減らすために２スリット共焦点整列（ｔｗｏ−ｓｌｉｔ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を使用した。全てのラマンスペクトルは焦点外信号を除去するために共焦点モードで測定した（Ｌｅｅ，Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｐ．；Ｒｈｅｅ，Ｈ．；Ｃｈｏｏ，Ｊ．；Ｇｈａｉ，Ｙ．Ｇ．；Ｌｅｅ，Ｅ．Ｋ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２００３，３４，７３７−７４２）。ラマンシステムにおいて、ピンホール（ｐｉｎｈｏｌｅ）の機能は入射スリット（ｅｎｔｒａｎｃｅ ｓｌｉｔ）とＣＣＤ検出器のピクセル（ｐｉｘｅｌｓ）との協同に代替された。第１共焦点スリットは１５μｍの幅でセッティングされた。その後、スペクトロメータスリットに垂直に整列された仮想第２スリットを作るＣＣＤ検出器上の二つのピクセル列（ｐｉｘｅｌ ｒｏｗｓ）から信号を収集した。この場合、皮膚組織サンプルのある焦点外領域による逸脱（ｓｔｒａｙ）バックグラウンド光が効果的に除去された。

［実験結果］（ＲＥＳＵＬＴＳ ＡＮＤ ＤＩＳＣＵＳＳＩＯＮ）
図１は３名の異なる皮膚癌患者から得たＨ＆Ｅ染色された組織の顕微鏡イメージを示す。暗い領域がＢＣＣ組織であり、明るい領域が正常組織である。生検サンプルのこのような生理学的試験はＢＣＣのラマン分光学的同定の標準を提供する。ラマン測定における共焦点技術の必要性を確認するために、ＢＣＣのラマンスペクトルを２つの異なるモード、非−共焦点モードと共焦点モードを使用して測定した。

図２は前記２つのモード、非−共焦点を使用して測定されたＢＣＣ組織のラマンスペクトルの比較を示す（図２ａは非−共焦点モード、図２ｂは共焦点モード）。蛍光干渉（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は非−共焦点モードラマンスペクトルで非常に高かった。これに反し、ある非焦点散乱信号を除去するために１５μｍ幅共焦点ピンホールを使用した時、共焦点モードスペクトルでＢＣＣ組織からの干渉信号が大きく減少した。したがって、共焦点技術は組織からの自己−蛍光信号（ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｓ）を減らすことに非常に効果的である。

図３は図１ａに示された皮膚サンプルに対する共焦点ラマンスペクトルを示す。共焦点ラマン顕微鏡によって正常及びＢＣＣ組織間に明確な区別が示された。これらスペクトルの多くの差異点は１０００〜１７００ｃｍ^-1領域の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）変化で起こる。以前の研究で（Ｎｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００２，１１９，６４−６９ Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００４，１２２，４４３−４４９；Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏ １９９７，６６，４１８−４２３；Ｇｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ １９９７，２８，１２５−１２９ Ｎｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２００３，１７，５９７−６０２）、アミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩモードの場合には１２５０〜１３５０ｃｍ^-1領域で、ＰＯ_2-ストレッチングモードの場合には１０００〜１１００ｃｍ^-1領域で正常及びＢＣＣ組織の間に弱いスペクトル差が発見された。しかし、本発明の共焦点ラマンスペクトルの場合、この領域で４つの特徴的ラマンバンドで明確なスペクトル差が発見された。図３に示されているように、いずれの統計的処理無しにスペクトルから視覚的診断をすることが可能である。二つのラマンスペクトルの間のさらに詳細な比較のために、ＢＣＣ組織のラマンバンドを正規分布曲線−フィッティング分析（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して分解した。１０００〜１１００ｃｍ^-1領域でのバンドの広い重畳を表１に羅列した３つの特徴的バンドに分解した。ラマンスペクトルで、ＢＣＣ組織の場合には１６５６ｃｍ^-1でのアミド（ａｍｉｄｅ）Ｉバンドがさらに低い周波数に移動（ｓｈｉｆｔ）されそのバンド幅は大きく広くなった反面、１３０２ｃｍ^-1でのアミド（ａｍｉｄｅ）ＩＩＩバンドはさらに高い周波数に移動しその強度は減少した。これら結果はＧｎｉａｄｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．によって報告された従来のラマンデータと類似しているが（Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００４，１２２，４４３−４４９ Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏ １９９７，６６，４１８−４２３；Ｊ．Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ １９９７，２８，１２５−１２９）、本発明の共焦点スペクトルは正常及びＢＣＣ組織の間にさらに明確な差を示す。アミドＩ及びアミドＩＩＩモードでのラマンバンド変化は正常及びＢＣＣ組織の間の蛋白質の２次構造変化と密接に関連している。脂肪（ｌｉｐｉｄｓ）及び蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に対する１４４１ｃｍ^-1でのＣＨ₂変形モード（ＣＨ₂ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は高周波に移動しその強度は減少した。燐脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）及び核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）に対する１０８５ｃｍ^-1でのＰＯ_2-対称性ストレッチングモード（ＰＯ_2-ｓｙｍ．ｓｔｒｅｔｃｈ）は低周波に移動しその強度は著しく減少した。

図４は図１の３名の互いに異なる患者からの正常及びＢＣＣ皮膚組織に対するラマンスペクトルを示す。３名の異なる患者の正常組織に対するラマンスペクトルは互いに従来報告されたものと非常に類似していた。また、３名の患者からのＢＣＣ組織のラマンスペクトルは非常に良好な再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）を示した。正常とＢＣＣ組織の間の直接的差を図４から確認することができる。特に、ＢＣＣ組織でのアミドＩＩＩバンドの増強とＰＯ_2-ストレッチングバンドの消滅は皮膚癌診断に利用することができる。

皮膚学的診断においてまた他の主要な要因は、ラマン分光学を利用してＢＣＣが周辺非腫瘍組織からいかほど正確に区別されることができるかである（Ｋａｍｉｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２００１，３２，１３９−１４１；Ｋａｍｉｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２００２，３３，４９８−５０２）。ラマン分光学は生検領域の選別及び選択のための迅速かつ正確な診断道具として使用される潜在性を有している。これを確認するために、本発明者はＢＣＣ及び周辺組織に対する共焦点ラマン深さ（ｄｅｐｔｈ）プロファイリングを行った。図５は図１ａのＨ＆Ｅ染色された組織の拡大された顕微鏡イメージと３０４０μｍの間隔で１０個の連続的スパット（ｓｐｏｔｓ）でのその共焦点ラマンスペクトルを示す。正常及びＢＣＣ領域の間の差をラマン測定のための凍結組織のイメージでは見ることができないので、Ｈ＆Ｅ染色されたイメージをレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として使用した。１０８５ｃｍ^-1を中心とした強いＰＯ_2-対称性ストレッチングバンドが正常上皮（Ａ及びＢ）及び真皮（Ｉ及びＪ）領域で観察された（図５）。一方、１５８９ｃｍ^-1を中心とした強いアミドＩバンドがＢＣＣ（Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ）領域で観察された。正常及びＢＣＣ組織の間の境界上では（Ｃ及びＨ）、中間強度のＰＯ_2-バンドが観察された。

皮膚学的診断のための共焦点ラマン技術の再現性を確認するために、本発明者は図１の他の皮膚組織に対しても共焦点ラマンプロファイリング実験を行った。図６は図１ｂの第２皮膚組織サンプルに対するラマンプロファイリングデータを示す。この場合、第１の場合と非常に類似したラマンバンドのパターンが観察された。上皮領域で（Ａ、Ｂ及びＣ）、強いＢＣＣアミドＩバンドが観察されず正常組織の特徴的な強いＰＯ_2-バンドが発見された。しかし、ＢＣＣ領域（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ）の場合、強いアミドＩバンドが観察されたが正常組織の強いＰＯ_2-バンドもいくつかのケース（Ｄ、Ｆ、Ｇ及びＨ）で発見された。Ｈ＆Ｅ染色されたイメージを対応するラマンスペクトルと比較した時、ＢＣＣが均質的に転移されないことと示された。真皮領域で最後のスペクトル（Ｊ）は非腫瘍組織の特徴的なラマンバンドを示す。

図７は図１ｃのサンプルに対するスペクトルを示す。真皮領域（Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫ）で、正常組織の典型的なラマンスペクトルが観察され、ＢＣＣ真皮領域（Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ）でＢＣＣ組織の特徴的なラマンバンドが観察された。しかし、このサンプルで正常とＢＣＣ組織の間の境界上（Ｂ及びＣ）で混合されたラマンバンドが観察されることが興味深い。ＡからＤに観察されたスペクトル変化は正常組織に対するアミドＩバンドがＢＣＣ組織に対するバンドに移動したことを示す。組織の正常側から癌側へのＰＯ_2-及びアミドＩＩＩバンドの明白な強度変化も確認することができる。これら結果は人間皮膚組織に共焦点ラマン深さプロファイリング技術を適用することによって周辺非腫瘍組織から癌組織を正確に決定することが可能であるということを示す。

ラマン分光学は正常周辺組織からＢＣＣ組織を分別するために広く使用されてきた。従来の研究では、人間組織からの自己−蛍光（ａｕｔｏ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を最少化するために長波長近赤外線レーザーを使用したＦＴ−ラマン分光学技術が適用された。しかし、この場合、スペクトルを長時間蓄積（縮尺？）させても弱い散乱効率のためラマン強度が比較的に弱かった。結果的に、ＰＣＡ分析または神経網を利用した収集されたラマンデータの統計的処理が正常組織からＢＣＣ組織を分別するために必要であった。本発明では、５１４．５ｎｍアルゴンイオンレーザーを利用した共焦点ラマン分光学がＢＣＣの診断に成功的に適用されることができるということを明らかにした。組織からの面外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）自己−蛍光信号は共焦点技術によって効率的に除去されることができた。特に、アミドＩモードとＰＯ_2-対称性ストレッチングモードの場合、正常及びＢＣＣ組織の間の明確なラマンバンド差はこの共焦点ラマン技術がいずれのデータの統計的処理も必要なく皮膚学的診断道具として強力な潜在性を有するということを示す。

生検の選別と選択のための迅速かつ正確なＢＣＣ診断道具はＭｏｈ´ｓ微細図式手術法（Ｍｏｈ´ｓ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ）に重要である。したがって、共焦点ラマン深さプロファイリングは健康な周辺組織からＢＣＣ領域を正確に決定するために使用でき、これは周辺の非腫瘍組織から癌領域を正確に分別することを可能にする。境界線（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ）付近の正常及びＢＣＣ組織の混合されたアミドＩバンドだけでなく、ＢＣＣ領域内で非均質的転移による正常組織のＰＯ_2-バンドの不規則なパターンも検出されることができた。本発明者は本発明の共焦点ラマンプロファイリング技術が皮膚学的診断道具として強力な性能を有するということを明らかにした。

３名の互いに異なる患者ａ、ｂ、ｃから収集した皮膚組織に対するＨ＆Ｅ染色切片の顕微鏡イメージである。暗い青色領域が悪性組織（ＢＣＣ）であり、明るいエオジン好性（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ）領域が正常組織である。 ＢＣＣ組織のラマンスペクトルである。：（ａ）非−共焦点モードラマンスペクトル、（ｂ）共焦点モードラマンスペクトル。 １０００〜１７００ｃｍ^-1領域での皮膚組織の共焦点ラマンスペクトルである。：（ａ）正常組織のラマンスペクトル、（ｂ）ＢＣＣ組織のカーブ−フィッティング（ｃｕｒｖｅ-ｆｉｔｔｉｎｇ）ラマンスペクトル。 ３名の互いに異なる患者から得た正常及び悪性組織の共焦点ラマンスペクトルである。：（ａ）正常組織、（ｂ）ＢＣＣ組織。 ３０４０μｍの間隔で７個の互いに異なるスパットにおける皮膚組織（図１（ａ））の共焦点ラマンプロファイルである：（ａ）Ｈ＆Ｅ染色された皮膚組織の拡大顕微鏡イメージ、（ｂ）（ａ）に表示された７個領域で該当するラマンスペクトル。 ３０４０μｍの間隔で７個の互いに異なるスパットにおける皮膚組織（図１（ｂ））の共焦点ラマンプロファイルである：（ａ）Ｈ＆Ｅ染色された皮膚組織の拡大顕微鏡イメージ、（ｂ）（ａ）に表示された７個領域で該当するラマンスペクトル。 ３０４０μｍの間隔で７個の互いに異なるスパットにおける皮膚組織（図１（ｃ））の共焦点ラマンプロファイルである：（ａ）Ｈ＆Ｅ染色された皮膚組織の拡大顕微鏡イメージ、（ｂ）（ａ）に表示された７個領域で該当するラマンスペクトル。

Claims (5)

1. 皮膚癌診断のためのラマン分光法において共焦点スリット調整を使用してラマン信号を妨害する組織からの自己−蛍光信号減少方法。
2. 前記共焦点スリット調整は２スリット共焦点整列を使用して、第１共焦点スリットは１０〜２０μｍの幅でセッティングし、第２スリットはスペクトロメータスリットに垂直に整列されたＣＣＤ検出器上の２つのピクセル列から仮想第２スリットを作ることを特徴とする、請求項１に記載の自己−蛍光信号減少方法。
3. アミドＩモード、アミドＩＩＩモードとＰＯ₂−対称性ストレッチングモードで正常及び皮膚癌組織の間の明確なラマンバンド差をスペクトルデータの統計的処理無しに検出することを特徴とする、請求項１に記載の自己−蛍光信号減少方法。
4. 共焦点ラマンデプスプロファイリング技術を使用して周辺の非−癌性組織から皮膚癌組織を正確に分別することを特徴とする、請求項１に記載の自己−蛍光信号減少方法。
5. 前記共焦点ラマンデプスプロファイリングは１〜２μｍ程度の焦点大きさを有するレーザー光を３０〜４０μｍ間隔で連続走査してシグナルを測定することを特徴とする、請求項４に記載の自己−蛍光信号減少方法を用いた皮膚癌診断方法。