JP2006094837A - フローインジェクション分析装置およびフローインジェクション分析方法 - Google Patents
フローインジェクション分析装置およびフローインジェクション分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 本発明は、輸送媒体を送液ポンプから送出し、注入装置により輸送媒体内に試料とカラム内に保持した固定化酵素との反応活性を制御活性制御成分とを交互に注入し、活性制御成分よりも前に注入された試料のピーク高さAと、検出装置により活性制御成分よりも時間的に遅れて注入された試料による固定化酵素との阻害下での反応で与えられるピーク高さBとを検出して阻害率または賦活率を計算し、さらに、その後に注入される試料のピーク高さCを使用して回復率を計算することにより、酵素−活性制御成分の間の生化学的キャラクタリゼーションを行う。
【選択図】 図4
Description
(1)基質
基質としては、市販のL−チロシン(シグマ−アルドリッチジャパン株式会社製)を使用した。
(2)酵素
酵素として、チロシナーゼ(マッシュルーム由来、シグマ−アルドリッチジャパン株式会社製、EC:1.14.18.1)を使用した。最適pHは、6〜7である。
(3)酵素の固定化処理
担体としては、多孔質ガラス(CPG−10、メッシュ200/400、ポア径24.2nm、表面積88.1m2/g、フナコシ薬品株式会社)を使用した。固定化処理は、まず、微細孔性ガラスを3g秤量し、pH3.45に調整した10%のγ-アミノプロピルトリエトキシシラン(γ-APTES)を加えて75℃で3時間反応させ、担体をアルキルアミノ化した。その後、アルキルアミノ化された担体1.0gに対して、10mMリン酸塩緩衝液(pH7.0)を用いて調製した2.5%グルタルアルデヒド溶液を架橋剤として加えてアルデヒド化した後、乾燥させた。その後、10mMリン酸塩緩衝液上10mg/mlに調製したチロシナーゼ溶液を加えて固定化を行った。その後、酵素の固定化された担体を還元剤(NaBH4)で処理した。
(4)カラムの作成
固定化後還元された酵素を、固定化酵素ホルダーに充填し、固定化酵素ホルダーを、恒温容器内にセットして、図2に詳細を説明したカラムを作成した。恒温容器は、恒温水を循環させて、約20℃に保持した。
(5)送液系および検出系
分析装置は、日本分光株式会社製の市販のHPLC装置(送液ポンプPU−1580i)を、本発明の分析方法が適用できるように改造して作成した。具体的には、検出装置として、市販の酸素電極(BO−P、株式会社バイオット製)を使用し、室温に保持した。酸素電極からの出力は、電流計(HOKUTODENKO HA−104、北斗電工株式会社製)により検出し、検出された電流を電圧変換してレコーダ(株式会社理化電機製、MULTI-PEN RECORDER (R-62MB))に出力させた。なお、送液条件は、流速1ml/min、試料注入量0.1ml、キャリヤーとして、50mMリン酸緩衝液+1MNaCl(pH=6.5)を使用した。
上述した分析装置を使用して、検出装置を含めた分析装置の感度特性について検討を加えた。図8には、本発明により得られた装置の感度特性について、横軸に基質(チロシン)濃度とし、縦軸に酸素電極からの出力電流としたプロットを示す。図8に示されるように、チロシン基質については、概ね0〜2mMの範囲でリニアリティが確認された。このため、本発明では、試料注入濃度を、1mMとし、チロシンの濃度によるピーク強度に対する補正が必要ない範囲で検討を行った。
阻害成分は、阻害剤と知られているコウジ酸(和光純薬工業株式会社製)の他、生薬抽出物を使用した。生薬からの薬効成分の抽出は、生薬3gを秤量し、50%エタノール溶液30mlで2日間、成分を抽出させた後、減圧留去してエタノールを除去した。その後、凍結乾燥を行い、生薬抽出物を粉末として得た。得られた生薬抽出物の粉末を、ジメチルスルホキシドに溶解後、所定の終濃度(0.5mg/mlおよび5mg/ml)となるようキャリヤーを用いて調整し、阻害成分溶液を作成した(ジメチルスルホキシドの終濃度は0.5%以下)。図9に使用した阻害成分をリストする。
(実験例1)
セクションAで記載した分析装置の送液ポンプおよび酸素電極を起動させ、チャートレコーダのベースラインが安定した後、マイクロシリンジで、チロシン1mMを、0.1ml注入した。これを第1の基質インジェクションとした。その後、第1の基質インジェクションのピークのテールが安定した時点で0.5mg/mlの阻害成分0.1mlをマイクロシリンジで注入した。この阻害成分注入の6min(Td/Tr=12)後、第2の基質インジェクションを、第1の基質インジェクションと同一の条件で行った。さらにその約6min後、第3の基質インジェクションを、同様にして行った。
また、阻害成分の濃度を、5mg/mlとして実験1と同様の実験を行ない、阻害率および回復率を算出した。
比較実験として、チロシナーゼに対する阻害活性を、リン酸緩衝溶液でコウジ酸とチロシンと混合した溶液に共存させ、酸素電極を使用して溶存酸素をモニタすることにより、バッチ試験により測定した。このときの阻害率は、阻害成分の存在しない条件での酸素消費量をA、阻害成分が存在する条件での酸素消費量をB(A>B)とし、(1−B/A)×100として算出した。チロシナーゼは、チロシナーゼをアミノ化PAN膜(サクラ精機株式会社製)にグルタルアルデヒド架橋法により固定化した。チロシンの濃度は終濃度で1mMとなるようにし、コウジ酸の濃度を、5mg/ml、0.5mg/ml、0.05mg/ml、5×10−3mg/ml、5×10−4mg/mlで変化させた。その結果を、表2に示す。
Claims (11)
- 固定化酵素を保持し、輸送媒体と共に試料が通じられるカラムと、
前記輸送媒体内に前記試料と前記固定化酵素との反応活性を制御する活性制御成分とを交互に注入する注入装置と、
前記活性制御成分よりも時間的に遅れて注入された前記試料と前記固定化酵素との制御下での反応を検出する検出装置と
を含む、フローインジェクション分析装置。 - 前記試料は、美白剤、抗ピロリ菌剤、抗ステロール血症治療薬、抗ウツ剤、抗HIV剤、抗真菌剤、糖尿病治療薬(インスリン非依存)を含む群から選択される、請求項1に記載の分析装置。
- 前記酵素は、酸化還元酵素であり、前記検出装置は、溶存酸素濃度を検出する、請求項1に記載の分析装置。
- 前記酵素は、チロシナーゼであり、前記試料は、チロシンである、請求項3に記載の分析装置。
- 注入装置により輸送媒体内に試料とカラム内に保持した固定化酵素との反応活性を制御する活性制御成分とを交互に注入する段階と、
検出装置により前記活性制御成分よりも時間的に遅れて注入された前記試料と前記固定化酵素との制御下での反応を検出する段階と
を含む、フローインジェクション分析方法。 - 前記試料と前記活性制御成分とを交互に注入する段階は、前記活性制御成分の注入後にさらに同一濃度、同一量の第2の試料を注入する段階を含み、前記活性制御成分の注入後の前記試料の注入までの時間間隔が、前記試料のピーク・リテンションタイムの3〜20倍とされる、請求項5に記載の分析方法。
- さらに、前記活性制御成分の注入前に注入された前記試料によるピークと、前記活性制御成分の注入後に注入された前記第2の試料のピークとの比を使用して活性特性を算出する段階を含む、請求項5に記載の分析方法。
- 前記試料は、美白剤、抗ピロリ菌剤、抗ステロール血症治療薬、抗ウツ剤、抗HIV剤、抗真菌剤、糖尿病治療薬(インスリン非依存)を含む群から選択される、請求項6に記載の分析方法。
- 前記酵素は、酸化還元酵素であり、前記検出装置は、溶存酸素濃度を検出する、請求項6に記載の分析方法。
- 前記固定化酵素としてチロシナーゼを使用し、前記試料としてチロシンを含む薬剤を注入する、請求項9に記載のフローインジェクション分析方法。
- 前記活性特性は、酵素阻害性、酵素賦活性、および酵素阻害からの回復性である、請求項7に記載の分析方法。
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JP2004097126A (ja) * | 2002-09-11 | 2004-04-02 | Tama Tlo Kk | 酵素活性の制御方法、モレキュラースイッチ、金属の計測方法および金属の計測装置 |
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