JP2006069976A - 金属複合体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、金属微粒子と、標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、金属複合体を製造する金属複合体の製造方法である。
【選択図】図1
Description
(a)レーザによる反応の時間、空間、反応量の制御
(b)核酸結合因子の立体障害による核酸−金または核酸−白金塩化物複合体形成反応の阻害効果の利用
等を挙げることができる。これらの特徴を利用した、本実施形態に係る金属複合体の製造方法の応用例として以下の例を挙げることができる。
金属イオンが塩基部分と結合するとDNAの2次構造や3次構造を変化させ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、エステラーゼ、カイネース、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド依存性酵素の活性に影響する。この結果、細胞毒性、抗がん剤、抗リューマチ剤等として利用することができる。従来は、予め金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成し、これを細胞に供与すると、この誘導体がDNAと反応して、その塩基部分と金属塩化物の複合体が生じる。その結果として上記の酵素活性に影響し、細胞毒性の作用を発揮する。本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、誘導体を合成する必要はなく、反応必須因子の存在下でレーザを照射するだけでよい。また、レーザを照射した部位にだけ反応が惹起されるので、反応の時間空間の制御が誘導体投与の場合よりはるかに優れている。
核酸結合因子の立体障害による核酸−金または白金塩化物複合体形成反応の阻害効果、すなわち、核酸と核酸結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金属微粒子から生成した金属化合物が核酸に接近できないため核酸の塩基部分での反応が起こらない。この後、核酸−金塩化物複合体形成反応の起こらなかった部位を同定するため、例えば、DNase Iフットプリント法におけるDNase I部分消化法を用いる。複合体形成反応が起こった箇所ではDNase Iの活性阻害が起こり、起こらなかった箇所では、DNase Iによる部分消化が起こる。電気泳動などの分析手段を用いてDNase Iの活性阻害が起こった部位を特定すると、核酸と核酸結合因子が相互作用したDNA部分を同定することができる。
これも上記と同様に核酸結合因子の立体障害による核酸−金属塩化物複合体形成反応の阻害効果を利用する。具体的には、核酸と核酸結合因子を混合し、これに反応に必要な因子を混合してレーザを10分間程度照射し、可視紫外スペクトルを測定するだけで結合活性が測定可能である。
上記の原理と同様に核酸の高次構造または核酸が1本鎖か2本鎖かによって、レーザ照射された金属微粒子から生成した反応性分子中間体の核酸への接近の容易さによって核酸の塩基部分での反応に差が生じる。この差を可視紫外スペクトルの吸収強度により検出し、核酸の形態に関する知見を得ることができる。
(実施例1)
界面活性剤の入っていない金微粒子をSF−LAS(surfactant-free laser ablation in solution)法(例えば、特開2003−286509号公報、及び、F. Mafune, J. Kohno, Y. Takeda, T. Kondow and H. Sawabe:J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照)により作製した。3mMの濃度のλDNA(TOYOBO製)水溶液100mLと、0.5Mの濃度の塩化カルシウム水溶液100mLと、上記界面活性剤の入っていない金微粒子1.2mgを分散させた溶液100mLとを混合し、反応液を作製した。この反応液のうち0.3mLを、底面が1cm×1cmのガラスセルに入れた。本実施例では、λDNAは10mMのTris−HCl(pH8.0)と1mMのEDTAが添加されているものをそのまま用いた。これにNd:YAGレーザの2倍波532nm、17mJ/パルスのパルスレーザをセルの開口部から10分間照射した。レーザ光はレンズを用いて、(0.1mm)3程度になるように反応液中に集光した。この間、セルの底に長さ10mm、幅1mmの攪拌子を入れて、マグネティックスターラにより溶液を攪拌した。その後、溶液を吸収スペクトル測定用の石英セルに移し、紫外可視分光器(株式会社島津製作所製、UV−1200 SPECTROPHOTOMETER)を用いて紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図2に示す。図2において、点線は金微粒子分散溶液の吸収スペクトルを、太い実線は金微粒子、λDNA、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、CaCl2を添加後、レーザ照射した反応液の吸収スペクトルを示す。金微粒子由来の517nmの吸収ピークとDNA塩基由来の260nmの吸収ピークの強度はレーザ照射前と比較して減少しており、新たに360nmの吸収ピークが観測された。この360nmのピークはDNAの塩基部分と金塩化物との化学結合によって生じた新しい化合物の吸収ピークであることがわかった。なお、360nm付近のピーク強度は、図2において360nmピークの斜線部分の積分を示す。
(比較例1)
実施例1の反応液を使用して、レーザ照射をせずに反応液を10分間混合した。10分間撹拌後、反応液の紫外可視吸収スペクトルを測定したが、360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、360nmの吸収ピーク出現には、532nmのレーザ照射が必要であることを確認した。
実施例1において、反応液にλDNAを添加しない以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、360nmの吸収ピーク出現には、DNAが必要であることを確認した。
実施例1において、反応液に金微粒子を添加しない以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、360nmの吸収ピーク出現には、金微粒子が必要であることを確認した。
実施例1において、反応液に多価陽イオン(Ca2+)を添加しない以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、360nmの吸収ピーク出現には、陽イオンが必要であることを確認した。
実施例1において、金微粒子の代わりに金(Au)プレート(大きさ10mm×10mm×厚さ3mm)を反応液の底部に設置し、Nd:YAGレーザの基本波1064nm、及び2倍波532nmの100mJ/パルスのパルスレーザを金プレートの表面に焦点を合わせてそれぞれ10分間照射した以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、360nmの吸収ピーク出現には、溶液内に金微粒子が分散していることが必要であることを確認した。
実施例1において、λDNAは添加せずに、金微粒子と、陽イオンとを混合して反応液とし、実施例1と同様にしてNd:YAGレーザの2倍波532nm、17mJ/パルスのパルスレーザを10分間照射した。その直後に、λDNA(TOYOBO製)を透析してバッファを除去したものを添加し、可視紫外吸収スペクトルを測定したところ、360nm付近の吸収ピークは観測されなかった。これより、レーザ照射時に金微粒子と陽イオンとアミン化合物とDNAとが同時に共存して反応が進行することを示している。
実施例1においてλDNAとして、10mMのTris−HCl(pH8.0)と1mMのEDTAが添加されているλDNA(TOYOBO製)をそのまま用いたが、本比較例では、反応液に、λDNA(TOYOBO製)の代わりに、λDNA(TOYOBO製)を透析してバッファを除去したものを使用した以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、360nmの吸収ピーク出現には、DNA、金微粒子、多価陽イオンの他に反応必須因子のあることが判明した。
(実施例2)
反応必須因子を明らかにするために、比較例6において、λDNA(TOYOBO製)を透析してバッファを除去したものに、さらに、プロリン(Proline)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、ヒスチジン(Histidine)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid:HEPES)、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン(Aspargine)、アルギニン(Arginine)、トリプトファン(Tryptophan)、スペルミジン(Spermidine)、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、リゾチーム(Lysozyme)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、EDTA、グリシン(Glycine)、リシン(Lysine)、硝酸アンモニウム、dATP、dAMP、アデニン(Adenine)、チミン(Thymine)、グアニン(Guanine)、シトシン(Cytosine)を1Mの濃度でそれぞれ添加して、比較例5と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、ヒスチジン、HEPES、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン、スペルミジン、をそれぞれ添加した溶液では360nm付近の吸収ピークは観測された。一方、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、Lysozyme、DMSO、アセトニトリル、EDTA、グリシン、リシン、硝酸アンモニウム、dATP、dAMP、アデニン、チミン、グアニン、シトシンをそれぞれ添加した溶液では360nm付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これらの結果より、反応にはある種のアミン化合物類が必要であることが判明した。
(実施例3)
実施例1において、Nd:YAGレーザの2倍波532nm、17mJ/パルスのパルスレーザの代わりに、Nd:YAGレーザの基本波1064nmの17mJ/パルスのパルスレーザを10分間照射した以外は実施例1と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。360nm付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これにより、360nmの吸収ピーク出現には、金微粒子の表面プラズモン共鳴の波長を照射することが効果的であることを確認した。
(実施例4)
実施例1において、添加する塩化カルシウム(Ca2+イオン)の濃度を変化させた以外は、実施例1と同様にして、レーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。濃度360nmの吸収ピーク強度のCa2+イオン濃度依存性を図4に示す。横軸にCa2+の濃度を、縦軸に360nm付近の吸収の強度を示す。Ca2+イオン濃度が0.001Mより低いところでは反応がほとんど起こらず、0.1Mより高いところでは反応量は一定の値に飽和している。さらにCa2+イオン濃度が0.005M付近で急激な反応量の増加がみられる。Ca2+イオンをはじめとする陽イオンはDNA分子のリン酸部分と結合して、DNAの負電荷を中和し溶液中のDNAを中和する働きを持っている。中和されたDNAは金微粒子の表面に吸着し、レーザ照射により生成した金イオンとの反応確率が高まると考えられる。図4よりDNA分子とCa2+イオン結合反応において、平衡定数7.6×10−3Mをもった平衡反応であることを示している。ここで求められた平衡定数7.6×10−3Mは、DNA分子とCa2+イオンの解離定数3.3×10−5Mや溶液中のDNAリン酸基濃度4.0×10−4Mのいずれよりも大きい。巨大な負電荷が高密度に存在するλDNAを中性化するためにより高濃度のCa2+イオンが必要であると考えられる。
(実施例5)
以上の実施例及び比較例で用いたλDNAは48502塩基対をもつ2本鎖DNAである。そこで、塩基対数の少ないDNAや一本鎖DNAについて、実施例1と同様に反応を行った。実施したDNAの長さは2mer(一本鎖DNAを以下ssDNAと記す)、4mer(ssDNA)、56mer(ssDNA)、18mer(ssDNA)のいずれも360nm付近のピークを生じ、反応が起こったことが確認された。さらに、モノマdATP、dAMP、アデニン、チミン、グアニン、シトシンについて同様な反応をおこなったが、反応は起こらなかった。以上より2mer以上のポリヌクレオチドで反応が起こることから、金イオンは二つの塩基部分にまたがって反応していると考えられる。
<生成物の加水分解>
金属複合体生成後に、生成物が時間経過とともに分解を起こすかどうかを確認した。レーザ照射後、一定時間をおいて可視紫外吸収スペクトルを測定した。分解の主な原因は溶液中に金イオンと同時に金微粒子から放出された溶媒和電子が配位複合体中の金イオンと再結合し、金原子に還元するためと考えられる。実際、レーザ照射により現れた360nm付近のピークはレーザ照射後に時間とともに減衰した。半減期は25℃で36分であった。図5に結果を示す。測定値を指数関数で当てはめた結果を実線で示した。
<DNAとDNA結合因子の相互作用の検出>
DNA結合因子の立体障害によるDNAへの複合体形成反応の阻害効果について検討した。すなわち、DNAとDNA結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金微粒子から生成した反応性分子中間体がDNAに接近できないためDNAの塩基部分での反応が起こらないと考えられる。具体的には、ssDNA(Seq:ggatcctaatgaccaagg)とT4 phage 32 protein(以下p32タンパク質と記す)との相互作用を検出した。p32タンパク質はT4ファージにコードされているタンパク質でDNAの複製時に配列非特異的にssDNAに結合して、ssDNAの安定化に寄与するタンパク質である。反応は、1.0μMの濃度のssDNA水溶液と、10mMの濃度のTris水溶液と1Mの濃度のCaCl2水溶液と、A:0M,B:0.3×10−6M,C:1.0×10−6Mの3種の濃度のp32タンパク質水溶液を含む反応液に対して、532nmのレーザ光を実施例1と同様に照射した。その後、可視紫外吸収スペクトルを測定し、360nmの吸収ピーク強度を測定した。p32タンパク質の濃度が高いときは360nmの吸収ピーク面積は減少した。p32タンパク質の濃度と360nmの吸収ピークの関係を図6に示す。矢印は360nmのピークの位置を示す。これよりp32タンパク質の解離定数は10−6以下であることが分かる。文献値によると、p32タンパク質のssDNAに対する解離定数は10−8Mである。
(実施例8)
SC−LAS(surfactant-controlled laser ablation in solution)法(SDSを添加した液体中で金微粒子を作製する方法。SDSの濃度を変えることにより生成する金微粒子の大きさを制御することが可能。例えば、特開2003−286509号公報、及び、F.Mafune, J.Kohno, Y.Takeda, T.Kondow and H.Sawabe:J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照)により作製した金微粒子を用いて、実施例1と同様にして反応を行った。これはSC−LAS法で作製した金微粒子の方がSF−LAS(surfactant-free laser ablation in solution)法で作製した金微粒子より溶液中で安定なので、実験の操作が容易となる利点がある。SDSが0.01M以上含まれると沈殿物が生じてしまい、吸収スペクトルの測定が困難であった。しかし0.001以下のSDSでは吸収スペクトルの測定が可能であり、360nmのピークが生成し、反応がSDS存在下でも反応が進行することを確認した。
界面活性剤の入っていない白金微粒子をSF−LAS法で作製した。これに実施例1と同様にして、λDNA(TOYOBO製)と塩化カルシウムと界面活性剤の入っていない白金微粒子とを分散、溶解させた反応液を底面が1cm×1cmのガラスセルに入れた。これにNd:YAGレーザの2倍波532nm、17mJ/パルスのパルスレーザをセルの開口部から10分間照射し、紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図7に示す。DNA塩基由来の260nm吸収ピークの他に、新たに360nmの吸収ピークが観測された。この360nmのピークはDNAの塩基部分と白金化合物との反応によって生じた新しい化合物の吸収ピークである。また塩化カルシウムとトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)が反応に必要であること、またモノマのATPでは反応が起こらないこと、またssDNAでも反応が起こることなどは金微粒子の場合と同じ傾向を示した。なお、図7において、A:白金微粒子分散液にλDNAと塩化カルシウムを添加して反応した時の紫外可視吸収スペクトル,B:Aから塩化カルシウムを除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル,C:AのλDNAをATPに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル,D:AのλDNAを4merのDNAに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル,E:Dのトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)を除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル,を示す。矢印は360nmのピークの位置を示す。
Claims (15)
- 金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子と、前記標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、前記金属複合体を製造することを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応液は、さらに、アミン化合物と、反応促進剤とを含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1または2に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記標的化合物は、生体高分子であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項3に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、核酸であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項3に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、タンパク質であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子は、Au、Ag、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Cu、Hg、Re、Fe、Ni、Co、Cr、Mn、Mo、W、Ta及びNbから選択される少なくとも1つの金属を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、Au、Ag、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Cu、Hg、Re、Fe、Ni、Co、Cr、Mn、Mo、W、Ta及びNbから選択される少なくとも1つの金属と配位結合を形成しやすいアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、ヒスチジン、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン及びスペルミジンから選択される少なくとも1つのアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応促進剤は、陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項9に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記陽イオンは、2価以上の多価陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属複合体は、金属の配位化合物であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザは、パルスレーザであることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
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