JP2006061155A - Kit for identification of bacteria of genus mycobacterium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗酸菌属細菌同定キットに関する。 The present invention relates to an acid-fast bacterium identification kit.
抗酸菌感染症には、結核、非結核性（非定型）抗酸菌感染症やハンセン病があり、現在も、多くの患者が発生している。全世界では総人口の約３分の１（２０億人）が結核に感染しており、毎年８００万人が新たに発病し、２００万人が死亡している。その多くは、アジア地域をはじめとする開発途上国で発生している。日本でも近年、毎年約３．２万人が結核を発病し、２０００人以上が死亡している。抗酸菌感染症、特に、結核感染症は、近年増加傾向にあり、代表的な再興感染症である。また、細胞性免疫能の低下しているＡＩＤ患者の約３分の１が結核を発症しており、ＡＩＤ患者の増加が結核の発症を加速している。さらに、これらの患者では結核のみならず、全身播種型のM.avium complex 感染症や時にはM.kansasii感染症などの抗酸菌症が致命的な合併症となることが知られている。 Mycobacterial infections include tuberculosis, non-tuberculous (atypical) mycobacterial infections and leprosy, and many patients still occur. Around one-third of the world's population (2 billion) is infected with tuberculosis, with 8 million new cases and 2 million dead each year. Most of them occur in developing countries including the Asian region. In recent years, about 32,000 people have developed tuberculosis every year in Japan, and more than 2,000 people have died. Mycobacterial infections, especially tuberculosis infections, have been on the rise in recent years and are typical re-emerging infections. In addition, about one third of AID patients with reduced cellular immunity develop tuberculosis, and an increase in AID patients accelerates the onset of tuberculosis. Furthermore, in these patients, it is known that not only tuberculosis but also mycobacterial diseases such as systemic disseminated M. avium complex infection and sometimes M. kansasii infection are fatal complications.
結核菌は、細菌検査の上で、１）細胞壁に多量の脂質を含有するためグラム染色で染まりにくい、２）増殖が遅く培養同定に時間がかかる、という点が他の細菌とは大きく異なっている。そのため、特殊な染色法および培地が必要となる。この結核の病原診断をできるだけ早く行うために、いろいろな検査法が使われ、その組み合わせも複雑になっている。 Mycobacterium tuberculosis differs greatly from other bacteria in terms of bacterial testing: 1) it contains a large amount of lipid in the cell wall and is difficult to stain with Gram staining; Yes. Therefore, a special staining method and a culture medium are required. In order to conduct the pathogenic diagnosis of tuberculosis as soon as possible, various test methods are used, and the combination is complicated.
迅速細菌検査の第一のものは鏡検であるが、結核菌はグラム染色では染まりにくいため、チーネルゼン染色法あるいは蛍光染色法が使われている。チーネルゼン染色法では、脱色に酸とエタノールを使用するが、脱色しないで赤く染まる抗酸性のある菌を抗酸菌（マイコバクテリウム[Mycobacterium]）と呼ぶ。結核菌は抗酸菌の代表的なものであるが、結核菌以外の抗酸菌は多種類あり、非結核性抗酸菌と呼ばれている。非結核性抗酸菌には現在約１００種類以上の菌種が知られている。その多くは環境に広く分布し、ヒトに対する病原性を持たないが、一部ヒトへの病原性が知られる菌種が存在する。鏡検では、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別することはできない。 The first rapid bacterial test is microscopic examination, but tuberculosis is difficult to stain with Gram staining, so the Chinelsen staining method or fluorescent staining method is used. In the Chinelsen staining method, acid and ethanol are used for decolorization, but an acid-fast bacterium that stains red without decolorization is called an acid-fast bacterium (Mycobacterium). Mycobacterium tuberculosis is representative of mycobacteria, but there are many types of mycobacteria other than tuberculosis, which are called non-tuberculous mycobacteria. About 100 or more types of bacteria are currently known for nontuberculous mycobacteria. Many of them are widely distributed in the environment and have no pathogenicity to humans, but some species are known to be pathogenic to humans. Microscopic examination cannot distinguish between Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria.
結核症の起因となる結核菌群（M. tuberculosis complex）には、M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microtiなどの遺伝学的に近縁な菌種が知られているが、実際にヒトから分離される菌はほとんどM. tuberculosisと考えられている。一方、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）とマイコバクテリウム・イントラセルラー（M. intracellulare）はヒトの日和見感染症の起因菌で非結核性抗酸菌症の７０％を占める。遺伝学的に近縁で従来の生化学的性状試験では分類できなかった為、M. avium complex（ＭＡＣ）と総称された。また、M. kansasiiも非結核性抗酸菌症の起因菌で、ＭＡＣの次に頻度が高く２０％を占める。分離頻度が低くなるが、それ以外の起因菌も多数存在する。なお、complexとは前述のように、分類学的近縁関係の菌を区別せず一括して呼ぶときに用いる用語である。 In the M. tuberculosis complex that causes tuberculosis, genetically related species such as M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, and M. microti are known. In fact, most bacteria isolated from humans are considered M. tuberculosis. On the other hand, Mycobacterium avium and M. intracellulare are the causative bacteria of human opportunistic infections, accounting for 70% of nontuberculous mycobacterial diseases. Since they were genetically related and could not be classified by conventional biochemical property tests, they were collectively called M. avium complex (MAC). M. kansasii is also the cause of nontuberculous mycobacterial disease, the second most frequent after MAC, accounting for 20%. Although the frequency of separation is low, there are many other causative bacteria. As described above, complex is a term used when collectively referring to taxonomic related bacteria without distinction.
近年、分子生物学的手法を利用した迅速検査法が開発されており、結核菌をはじめとする抗酸菌の検出及び同定に、これらの技術が応用されている。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）や転写酵素＋逆転写酵素を用いる方法Transcription-mediated amplification（ＴＭＡ）を利用した、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）や「ＤＮＡプローブ『中外』−ＭＴＤ」（中外製薬）などが知られている。これらの培養操作の不要なキットを使用すれば、喀痰などの臨床検体から１〜２日で結核菌を検出同定することができる。これらのキットは、細菌分類学で最もよく利用されている１６Ｓ リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子をターゲットとし、菌種特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出する。同定可能な菌種は、結核菌群の他、非結核性抗酸菌のM. avium及びM. intracellulareの２菌種に限られている。これらの方法で、多種類の非結核性抗酸菌を同定するためには、高費用かつ低効率であるという欠点がある。 In recent years, rapid testing methods using molecular biological techniques have been developed, and these techniques are applied to the detection and identification of mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis. “Amplicon (registered trademark) Mycobacterium” (Roche Diagnostics) or “DNA probe” using polymerase chain reaction (PCR) or transcription-mediated amplification (TMA) “Chugai” -MTD ”(Chugai Pharmaceutical) is known. By using these kits that do not require culturing, tuberculosis bacteria can be detected and identified from clinical specimens such as sputum in 1 to 2 days. These kits target the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene, which is most commonly used in bacterial taxonomy, and detect it by a hybridization method using a species-specific probe. In addition to the Mycobacterium tuberculosis group, two types of non-tuberculous mycobacteria, M. avium and M. intracellulare, can be identified. In order to identify many types of non-tuberculous mycobacteria by these methods, there is a drawback of high cost and low efficiency.
結核菌をはじめ抗酸菌属細菌の確定診断には、菌の培養が必須である。特に、非結核性抗酸菌に関しては、２００３年に日本結核病学会から出された「肺非結核性抗酸菌症の診断基準」（結核，第７８巻、５６９−５７２ページ、２００３年）に詳しく記述されている。現在、分離培養には固形培地と液体培地が使われている。固形培地は、卵から作製した小川培地が古くから使用されており、抗酸菌の培地上の集落（コロニー）を肉眼で観察することが可能である。液体培地は、小川培地に比べ培養陽性になるまでの時間を短縮できるように近年開発された培地で、主にＭＧＩＴ（Mycobacterium Growth Indicator Tube）法（ベクトン・ディッキンソン社）が使われている。この方法では、菌増殖に伴う液体培地中の溶存酸素の減少を蛍光でモニターしている。いずれの培地でも、抗酸菌の増殖は遅いため、検体中に他の細菌がいると、それが先に増殖してしまう場合がある。それを防ぐために、検体を培養前にアルカリ処理し、抗酸菌以外の菌を殺す操作が必要である。 Culture of bacteria is essential for the definitive diagnosis of mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis. In particular, with regard to nontuberculous mycobacteria, the “Diagnosis Criteria for Nonpulmonary Tuberculosis Mycobacteriosis” published by the Japanese Society for Tuberculosis in 2003 (Tuberculosis, Vol. 78, pages 569-572, 2003) It is described in detail. Currently, solid culture and liquid culture are used for separation culture. As the solid medium, the Ogawa medium prepared from eggs has been used for a long time, and colonies on the acid-fast bacteria medium can be observed with the naked eye. The liquid medium is a medium that has been developed in recent years to shorten the time until the culture becomes positive compared to the Ogawa medium, and the MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube) method (Becton Dickinson) is mainly used. In this method, the decrease in dissolved oxygen in the liquid medium accompanying bacterial growth is monitored by fluorescence. In any medium, the growth of mycobacteria is slow, so if there are other bacteria in the sample, they may grow first. In order to prevent this, it is necessary to perform an alkali treatment on the specimen before culturing to kill bacteria other than acid-fast bacteria.
分離培養で陽性となった場合、その抗酸菌が結核菌なのか非結核性抗酸菌なのか、また、どの菌種なのかを同定する必要がある。従来から、培地上の性状（増殖速度、温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱性カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、蛍光試験などの生化学的性状で菌種の同定が行われており、ナイアシン試験はその中で最も利用されている検査法である。この方法は、結核菌が合成したナイアシンを化学的に検出する試験であるが、小川培地による培養が必須であり、結果がでるまでに２０〜３０日必要である。 If the culture is positive, it is necessary to identify whether the mycobacteria are tuberculosis or non-tuberculous mycobacteria and which species. Conventionally, bacterial species such as growth properties, temperature, colony shape and pigment production, niacin test, nitrate reduction test, heat-resistant catalase test, Tween 80 hydrolysis test, fluorescence test, etc. The niacin test is the most widely used test method. This method is a test for chemically detecting niacin synthesized by Mycobacterium tuberculosis, but culturing with Ogawa medium is essential, and 20 to 30 days are required until results are obtained.
喀痰などの生検体からの迅速検査同様、培養後の確定診断用の同定検査法も、最近、分子生物学的手法を用いた細菌同定法が開発されており、前述の２つの検査キット以外にいくつかキットが開発されている。 Similar to rapid testing from living specimens such as sputum, bacterial identification methods using molecular biological techniques have recently been developed for identification testing for definitive diagnosis after culture. In addition to the two testing kits described above, Several kits have been developed.
例えば、その１つに「アキュプローブ」（極東製薬工業）がある。このキットは、培養菌株中に発現している１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲットとし、ＲＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション法を利用し検出を行う。この方法では、細胞内に多数発現している１６Ｓ ｒＲＮＡを検出していることから、ＭＧＩＴ培養陽性時の菌体を用いて菌種の同定が可能である。このキットで同定できる菌種は、結核菌群（M. tuberculosis complex）とＭＡＣのみであり、M. aviumとM. intracellulareを識別することはできない。 For example, “Accuprobe” (Kyokuto Pharmaceutical) is one of them. This kit targets 16S rRNA expressed in a cultured strain and performs detection using an RNA-DNA hybridization method. In this method, since 16S rRNA expressed in a large number in the cell is detected, it is possible to identify the bacterial species using the bacterial cells when MGIT culture is positive. The only bacterial species that can be identified with this kit are M. tuberculosis complex and MAC, and M. avium and M. intracellulare cannot be distinguished.
さらに、全染色体ＤＮＡをターゲットとしたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法に基づくキット「ＤＤＨマイコバクテリウム極東」（極東製薬工業）が開発されている。この方法は、マイクロプレートに固定された基準株ＤＮＡと被検菌ＤＮＡの全塩基配列の類似度を測定することにより菌種を同定できる。このキットでは、結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. avium、M. intracellulareのほか、M. kansasii、M. gordonae、M. chelonae、M. abscessus、M. fortuitum、M. scrofulaceum、M. marinum、M. simiae、M. szulgai、M. gastri、M. xenopi、M. nonchromogenicum、M. terrae、M. triviale、M. peregrinumの計１８菌種の同定が可能である。しかし、この方法は、比較的多くの被検菌ＤＮＡを必要とするため、分離培養でＭＧＩＴ培地を利用した場合でも、小川培地等の固形培地での増菌培養が必要である。したがって、結果がでるまで４週間かかることもあり、迅速性に欠ける。また、純粋培養された新鮮分離株を必要とし、複数菌種混ざった状態では正確な結果が得られない。 Furthermore, a kit “DDH Mycobacterium Kyokuto” (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) based on a DNA-DNA hybridization method targeting total chromosomal DNA has been developed. In this method, the bacterial species can be identified by measuring the similarity between the entire base sequence of the reference strain DNA immobilized on the microplate and the test bacterial DNA. This kit includes M. tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. scrofulaceum, M. It is possible to identify a total of 18 bacterial species including marinum, M. simiae, M. szulgai, M. gastri, M. xenopi, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale and M. peregrinum. However, since this method requires a relatively large amount of test bacteria DNA, even when an MGIT medium is used in the separation culture, enrichment culture in a solid medium such as Ogawa medium is necessary. Therefore, it may take up to 4 weeks for results to be obtained, which is not quick. In addition, a freshly cultured fresh isolate is required, and an accurate result cannot be obtained in a state where a plurality of bacterial species are mixed.
株式会社ビーエムエルの過去２年半のＤＤＨ法依頼検体（２００１年７月〜２００４年１月、８７０８検体）を用いて、１８菌種の出現頻度を解析した。その結果、出現頻度の高い順に、結核菌群３０００株（３４．５％）、M. avium ２６６１株（３０．６％）、M. intracellulare １３３０株（１５．３％）のほか、M. gordonae ５２１株（６．０％）、M. kansasii ４２０株（４．８％）、M. fortuitum ２４１株（２．８％）、M. abscessus １９０株（２．２％）、M. chelonae １５３株（１．８％）、M. peregrinum ４２株（０．５％）、M. xenopi ４１株（０．５％）、M. terrae ３４株（０．４％）、M. scrofulaceum ２９株（０．３％）、M. szulgai ２４株（０．３％）、M. nonchromogenicum １２株（０．１％）、M. marinum １０株（０．１％）が同定されており、M. simiae、M. gastri及びM. trivialeは一株も検出されていない。 The frequency of appearance of 18 bacterial species was analyzed using DDH method request samples (July 2001 to January 2004, 8708 samples) of the BML Inc. for the past two and a half years. As a result, in addition to M. gordonae, in addition to Mycobacterium tuberculosis group 3000 (34.5%), M. avium 2661 (30.6%), M. intracellulare 1330 (15.3%) in descending order of appearance frequency. 521 (6.0%), M. kansasii 420 (4.8%), M. fortuitum 241 (2.8%), M. abscessus 190 (2.2%), M. chelonae 153 (1.8%), M. peregrinum 42 strain (0.5%), M. xenopi 41 strain (0.5%), M. terrae 34 strain (0.4%), M. scrofulaceum 29 strain (0 .3%), 24 strains of M. szulgai (0.3%), 12 strains of M. nonchromogenicum (0.1%), and 10 strains of M. marinum (0.1%) have been identified, M. simiae, None of M. gastri and M. triviale has been detected.
感染症の原因菌を確定することは治療方針を決める上で重要であることから、迅速かつ正確に多種類の抗酸菌を同時に同定することができる検出系の開発が望まれている。特に、喀痰などの生検体から直接菌種を同定する迅速診断検査法と、確定診断のための培養菌株を用いた菌種同定法の両方に適応可能な検出法の開発が望まれている。 Since determining the causative bacteria of an infectious disease is important in deciding a treatment policy, it is desired to develop a detection system that can quickly and accurately identify many types of acid-fast bacteria at the same time. In particular, it is desired to develop a detection method applicable to both a rapid diagnostic test method for directly identifying a bacterial species from a living specimen such as sputum and a bacterial species identification method using a cultured strain for definitive diagnosis.
本発明は、抗酸菌属細菌の同定のためのキットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a kit for identification of mycobacteria.
本発明者らは、抗酸菌属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １（ＩＴＳ１）領域を解析したところ、従来の方法で検出可能であった結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. aviumおよびM. intracellulareだけでなく、他の臨床的に重要な非結核性抗酸菌を同定することができるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成したものである。したがって、本発明は、下記に関する。 The present inventors analyzed the 16S rRNA gene sequence and 16S-23S rRNA internal transcribed spacer 1 (ITS1) region of mycobacteria belonging to the genus M. tuberculosis. complex), M. avium and M. intracellulare as well as other clinically important nontuberculous mycobacteria have been identified, and the present invention has been completed based on this finding. is there. Accordingly, the present invention relates to the following.
１．下記塩基配列の組：
配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１５、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２９、配列番号２６と３０、配列番号２７と２９、配列番号２８と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３５、配列番号３４と３５、配列番号３６と３７、配列番号３８と３９、配列番号４０と３７、配列番号４１と４２、配列番号４３と４２、配列番号４４と４５、配列番号４６と４７、配列番号４８と５０、配列番号４９と５０、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４、配列番号５５と５６、配列番号５７と５８、配列番号５９と６０、配列番号６１と６２、配列番号６３と６４、配列番号６５と６６、配列番号６７と６８、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８及び配列番号７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
２．下記塩基配列の組：
配列番号５と６、配列番号７と８および１１と１２、配列番号１３〜１７、配列番号２４〜３０、配列番号３１〜３５、配列番号３６と３７および４０、配列番号４１〜４３、配列番号４４と４５および４８〜５０、配列番号５１と５２および５５と５６、配列番号５７と５８および６１と６２、配列番号６５〜６８及び配列番号７１と７２および７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号５、７、１１、１３、１４、１６、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、４０、４１、４３、４４、４８、４９、５１、５５、５７、６１、６５、６７、７１及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
上記１．又は２．に記載のキットを用いる抗酸菌属細菌を同定するための方法。
1. The following base sequence pairs:
SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 15, SEQ ID NO: 14 and 15, SEQ ID NO: 16 and 17, SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 21, SEQ ID NO: 22 and 23, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 26 and 29, SEQ ID NO: 26 and 30, SEQ ID NO: 27 and 29, SEQ ID NO: 28 and 30, SEQ ID NO: 31 and 32, SEQ ID NO: 33 and 35, SEQ ID NO: 34 and 35, SEQ ID NO: 36 and 37, SEQ ID NO: 38 and 39, SEQ ID NO: 40 and 37, SEQ ID NO: 41 and 42, SEQ ID NO: 43 and 42, SEQ ID NO: 44 and 45, SEQ ID NO: 46 and 47, SEQ ID NO: 48 and 50, SEQ ID NO: 49 and 50, SEQ ID NO: 51 and 52, SEQ ID NO: 53 and 54, SEQ ID NO: 55 and 56, SEQ ID NO: 57 and 58, SEQ ID NO: 59 and 60, array No. 61 and 62, SEQ ID NO: 63 and 64, SEQ ID NO: 65 and 66, SEQ ID NO: 67 and 68, SEQ ID NO: 69 and 70, SEQ ID NO: 71 and 72, SEQ ID NO: 73 and 74, SEQ ID NO: 75 and 76, SEQ ID NO: 77 78 and SEQ ID NOs 79 and 80
A mycobacterial bacterium identification kit comprising an oligonucleotide represented by
However, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 31, 33, 34, 36, 38, 40, 41, The oligonucleotides shown by 43, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, and 79 are respectively SEQ ID NO: 81. Or it has the oligonucleotide shown by 82 in the 5 'side.
2. The following base sequence pairs:
SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, and 11 and 12, SEQ ID NOS: 13-17, SEQ ID NOS: 24-30, SEQ ID NOS: 31-35, SEQ ID NOS: 36, 37, and 40, SEQ ID NOS: 41-43, SEQ ID NOS: 44 and 45 and 48 to 50,
A mycobacterial bacterium identification kit comprising an oligonucleotide represented by
However, SEQ ID NOs: 5, 7, 11, 13, 14, 16, 24, 26, 27, 28, 31, 33, 34, 36, 40, 41, 43, 44, 48, 49, 51, 55, 57, The oligonucleotides represented by 61, 65, 67, 71 and 79 have the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 81 or 82 on the 5 ′ side, respectively.
Above 1. Or 2. A method for identifying an acid-fast bacterium using the kit described in 1.
本発明のキットは、インベーダー法を用いる抗酸菌属細菌の同定のために設計されたものである。 The kit of the present invention is designed for the identification of acid-fast bacteria using the invader method.
インベーダー法は、ゲノム上に存在する１塩基多型（Single nucleotide polymorphism: ＳＮＰ）や遺伝子変異などの特定の配列を同定することができる方法である（Ｆｏｒｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１巻、２１９−２２９ページ、２０００年）。この方法は、他のＳＮＰタイピング法に必須なＰＣＲ等のＤＮＡ増幅を必ずしも必要としないことから注目されている。インベーダー法は、インベーダーオリゴがターゲットＤＮＡとシグナルプローブとの間の２本鎖に少なくとも１塩基の浸入（インベージョン）を起こして部分的な３塩基の重複構造を形成すると、構造特異的な５’−エンドヌクレアーゼがシグナルプローブの５’側を切断することを利用している。 The invader method is a method capable of identifying a specific sequence such as a single nucleotide polymorphism (SNP) or gene mutation existing in a genome (Fors et al., Pharmacogenomics, Vol. 1, 219-229). Page, 2000). This method is attracting attention because it does not necessarily require DNA amplification such as PCR, which is essential for other SNP typing methods. In the invader method, when the invader oligo causes at least one base intrusion (invasion) in the double strand between the target DNA and the signal probe to form a partial 3-base overlapping structure, the structure-specific 5 It utilizes the fact that the '-endonuclease cleaves the 5' side of the signal probe.
本発明のキットは、配列番号１〜８０で示した３８対のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とし、上記オリゴヌクレオチドの前者がフラップと呼ぶ配列を５’側に有するシグナルプローブに、後者がインベーダーオリゴに該当し、インベーダー法による抗酸菌同定に用いることができる。 The kit of the present invention comprises 38 pairs of oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 80, wherein the former of the oligonucleotide is a signal probe having a sequence called a flap on the 5 ′ side, and the latter is an invader oligo. And can be used to identify acid-fast bacteria by the invader method.
本キットに採用したプローブ配列（００１６−２）の各オリゴヌクレオチド対（シグナルプローブ及びインベーダーオリゴ）及びその同定可能菌種名を詳細に説明する。なお、シグナルプローブ配列中の小文字で示した塩基配列は、フラップ配列を表す。フラップ配列は、インベーダー法に用いることができる任意の配列を用いることができる。好ましいフラップ配列は、配列番号８１又は８２である。また、下記に示したフラップ配列は、例示であり、これに限定されるものではない。また、インベーダーオリゴ配列中の小文字で示した塩基配列は、３塩基の重複構造を形成させるための塩基を表す。オリゴヌクレオチド名の後のかっこ書きは、フラップに対応するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）プローブの蛍光標識を表す。 Each oligonucleotide pair (signal probe and invader oligo) of the probe sequence (0016-2) employed in this kit and its identifiable bacterial species name will be described in detail. In addition, the base sequence shown by the small letter in a signal probe sequence represents a flap sequence. As the flap sequence, any sequence that can be used in the invader method can be used. A preferred flap sequence is SEQ ID NO: 81 or 82. Moreover, the flap arrangement | sequence shown below is an illustration and is not limited to this. Moreover, the base sequence shown by the small letter in an invader oligo sequence represents the base for forming a 3 base overlapping structure. The parentheses after the oligonucleotide name represent the fluorescent label of the FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) probe corresponding to the flap.
ＭＴＣ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggTAAAGCGCTTTCCACC
インベーダーオリゴ GCGGGCTCATCCCACACCGCc
同定可能菌種名 M. tuberculosis 、M. bovis、M. africanum、M. microti
MTC (FAM)
Signal probe cgcgccgaggTAAAGCGCTTTCCACC
Invader Oligo GCGGGCTCATCCCACACCGCc
Identifiable species name M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti
ＭＡＶ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggAGGTCCTATCCGGTATTAG
インベーダーオリゴ GCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGc
同定可能菌種名 M. avium、M. avium subsp. paratuberculosis、M. avium subsp. silvaticum
MAV (FAM)
Signal probe cgcgccgaggAGGTCCTATCCGGTATTAG
Invader Oligo GCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGc
Identifiable species name M. avium, M. avium subsp. Paratuberculosis, M. avium subsp. Silvaticum
ＭＫＮ／ＭＧＡ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagCCGGGATAAGCCTGG
インベーダーオリゴ ACGTGGGCAATCTGCCCTGCACAa
同定可能菌種名 M. kansasii、M. gastri
MKN / MGA (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagCCGGGATAAGCCTGG
Invader Oligo ACGTGGGCAATCTGCCCTGCACAa
Identifiable species name M. kansasii, M. gastri
ＭＩＮ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ１ cgcgccgaggTAAAGACATGCGCCTAAA
シグナルプローブ２ cgcgccgaggAAAAGACATGCGTCTAAAG
インベーダーオリゴ CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCc
同定可能菌種名 M. intracellulare
MIN (FAM)
Invader Oligo CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCc
Identifiable species name M. intracellulare
ＭＣＨ（ＩＴＳ） （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagGCTGGGAAATGGTGC
インベーダーオリゴ CACTACAGAAACTCGCTTTATGTTCCCAAGCTCATTCGt
同定可能菌種名 M. chelonae
MCH (ITS) (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagGCTGGGAAATGGTGC
Invader Oligo CACTACAGAAACTCGCTTTATGTTCCCAAGCTCATTCGt
Identifiable species name M. chelonae
ＭＣＨ／ＭＡＢ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggACTTCATGGTGAGTGGT
インベーダーオリゴ GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACt
同定可能菌種名 M. chelonae、M. abscessus
MCH / MAB (FAM)
Signal probe cgcgccgaggACTTCATGGTGAGTGGT
Invader Oligo GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACt
Identifiable species name M. chelonae, M. abscessus
Ｇｅｎｕｓ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ１ acggacgcggagACACCGCAAAAGCTTT
シグナルプローブ２ acggacgcggagACACCGCTAAAGCGC
シグナルプローブ３ acggacgcggagACACCGCTACCAAACA
インベーダーオリゴ１ CTGATAGGCCGCGGGCTCATCCCc
インベーダーオリゴ２ GGCCGCGGGCCCATCCCc
同定可能菌種名 ほとんどすべての結核菌群細菌
Genus (Redmond RED)
Identifiable species name Almost all Mycobacterium tuberculosis bacteria
ＭＳＣ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggGCCTTCGTCGATGG
インベーダーオリゴ TCTTCTCCACCTACCGTCAACCCACAAAGTGAt
同定可能菌種名 M. scrofulaceum
MSC (FAM)
Signal probe cgcgccgaggGCCTTCGTCGATGG
Invader Oligo TCTTCTCCACCTACCGTCAACCCACAAAGTGAt
Identifiable species name M. scrofulaceum
ＭＧＯ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ１ acggacgcggagTGTGTCCTGTGGTCC
シグナルプローブ２ acggacgcggagTGTGTTCTGTGGTCCT
インベーダーオリゴ CACCGCAAAAGCTTTCCACCACAGGACAt
同定可能菌種名 M. gordonae
MGO (Redmond RED)
Invader Oligo CACCGCAAAAGCTTTCCACCACAGGACAt
Identifiable species name M. gordonae
ＭＦＯ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggATATTCGGTATTAGACCCAG
インベーダーオリゴ ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
同定可能菌種名 M. fortuitum
MFO (FAM)
Signal probe cgcgccgaggATATTCGGTATTAGACCCAG
Invader Oligo ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
Identifiable strain name M. fortuitum
ＭＦＣ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagCTATCCGGTATTAGACCCA
インベーダーオリゴ ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
同定可能菌種名 M. farcinogenes、M. senegalense、M. houstonense
MFC (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagCTATCCGGTATTAGACCCA
Invader Oligo ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
Identifiable species name M. farcinogenes, M. senegalense, M. houstonense
ＭＰＥ／ＭＳＥ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggGCACTTCCTGGTGTG
インベーダーオリゴ CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
同定可能菌種名 M. peregrinum、M. septicum
MPE / MSE (FAM)
Signal probe cgcgccgaggGCACTTCCTGGTGTG
Invader Oligo CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
Identifiable species name M. peregrinum, M. septicum
ＭＰＣ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagGCTCTTCATGGGGTG
インベーダーオリゴ CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
同定可能菌種名 M. porcinum、M. boenickei、M. neworleansense
MPC (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagGCTCTTCATGGGGTG
Invader Oligo CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
Identifiable species name M. porcinum, M. boenickei, M. neworleansense
ＭＴＥ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggTGGGATGCATGTTCTG
インベーダーオリゴ CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCAa
同定可能菌種名 M. terrae
MTE (FAM)
Signal probe cgcgccgaggTGGGATGCATGTTCTG
Invader Oligo CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCAa
Identifiable species name M. terrae
ＭＮＯ／ＭＴＥ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagTCGGCGAAGCTCC
シグナルプローブ acggacgcggagTCGGCGAAGCTTG
インベーダーオリゴ TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAc
同定可能菌種名 M. nonchromogenicum、M. terrae
MNO / MTE (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagTCGGCGAAGCTCC
Signal probe acggacgcggagTCGGCGAAGCTTG
Invader Oligo TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAc
Identifiable species name M. nonchromogenicum, M. terrae
ＭＸＥ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggAGAATGGTCCTATCCGG
インベーダーオリゴ ACACTTTCCACCACCCCACATGCGCt
同定可能菌種名 M. xenopi
MXE (FAM)
Signal probe cgcgccgaggAGAATGGTCCTATCCGG
Invader Oligo ACACTTTCCACCACCCCACATGCGCt
Identifiable species name M. xenopi
ＭＩＭ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagCTCGGCGCATGCC
インベーダーオリゴ CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTt
同定可能菌種名 M. intermedium
MIM (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagCTCGGCGCATGCC
Invader Oligo CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTt
Identifiable species name M. intermedium
ＭＳＩ（ＩＴＳ） （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggAACCGAAGTCGGCC
インベーダーオリゴ CCACCACCAAGATGGAGGGACACCACTTCt
同定可能菌種名 M. simiae
MSI (ITS) (FAM)
Signal probe cgcgccgaggAACCGAAGTCGGCC
Invader Oligo CCACCACCAAGATGGAGGGACACCACTTCt
Identifiable species name M. simiae
ＭＬＥ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagAAAGGCATGCGCCA
インベーダーオリゴ CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCAc
同定可能菌種名 M. lentiflavum
MLE (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagAAAGGCATGCGCCA
Invader Oligo CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCAc
Identifiable species name M. lentiflavum
ＭＴＲ （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggTATGGCCTACCAAGGC
インベーダーオリゴ CGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTc
同定可能菌種名 M. triviale
MTR (FAM)
Signal probe cgcgccgaggTATGGCCTACCAAGGC
Invader Oligo CGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTc
Identifiable species name M. triviale
ＭＳＺ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagGGGTCCTATCCGGTATT
インベーダーオリゴ CACCCCAAGGCATGCGCCTCGt
同定可能菌種名 M. szulgai
MSZ (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagGGGTCCTATCCGGTATT
Invader Oligo CACCCCAAGGCATGCGCCTCGt
Identifiable species name M. szulgai
ＭＧＡ（ＩＴＳ） （ＦＡＭ）
シグナルプローブ cgcgccgaggTGCTTGCTGTTGCG
インベーダーオリゴ GCCTCAGGACCCAATAGTGTGTCTGGCTa
同定可能菌種名 M. gastri
MGA (ITS) (FAM)
Signal probe cgcgccgaggTGCTTGCTGTTGCG
Invader Oligo GCCTCAGGACCCAATAGTGTGTCTGGCTa
Identifiable species name M. gastri
ＭＭＡ／ＭＵＬ （Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）
シグナルプローブ acggacgcggagTCATGTCCTGTGGTGG
インベーダーオリゴ CTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATc
同定可能菌種名 M. marinum、M. ulcerance
MMA / MUL (Redmond RED)
Signal probe acggacgcggagTCATGTCCTGTGGTGG
Invader Oligo CTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATc
Identifiable species name M. marinum, M. ulcerance
また、本発明の一態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド対を下記：
ＦＡＭ Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ（フラップに対応する蛍光色素）
ＭＴＣ −
ＭＡＶ ＭＫＮ／ＭＧＡ
ＭＩＮ ＭＣＨ（ＩＴＳ）
ＭＣＨ／ＭＡＢ Ｇｅｎｕｓ
ＭＳＣ ＭＧＯ
ＭＦＯ ＭＦＣ
ＭＰＥ／ＭＳＥ ＭＰＣ
ＭＴＥ ＭＮＯ／ＭＴＥ
ＭＸＥ ＭＩＭ
ＭＳＩ（ＩＴＳ） ＭＬＥ
ＭＴＲ ＭＳＺ
ＭＧＡ（ＩＴＳ） ＭＭＡ／ＭＵＬ
の組合わせで用いることができる。
In one embodiment of the present invention, the oligonucleotide pair of the present invention is:
FAM Redmond RED (fluorescent dye corresponding to flap)
MTC-
MAV MKN / MGA
MIN MCH (ITS)
MCH / MAB Genus
MSC MGO
MFO MFC
MPE / MSE MPC
MTE MNO / MTE
MXE MIM
MSI (ITS) MLE
MTR MSZ
MGA (ITS) MMA / MUL
Can be used in combination.
上記の蛍光色素ＦＡＭおよびＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの組み合わせを用いることにより、例えば、マイクロプレートにおいては、使用するウェル数を半分にすることができ、アッセイの効率化及び試薬コストの削減を図ることができる。さらには、本発明をＤＮＡチップ上で行えるようにした基板（特願２００１―３１０１１９）とＳｐｒｅｅｄ法（特願２００３-１８１０６８）によるＮａｎｏ−Ｉｎｖａｄｅｒ法を使用すれば、大幅なアッセイの効率化と試薬コストの削減が可能である。 By using a combination of the above fluorescent dyes FAM and Redmond RED, for example, in a microplate, the number of wells to be used can be halved, and the efficiency of the assay and the reduction of reagent costs can be achieved. Furthermore, if the substrate (Japanese Patent Application No. 2001-310119) on which the present invention can be carried out on a DNA chip and the Nano-Invader method based on the Spread method (Japanese Patent Application No. 2003-181068) are used, the efficiency of the assay and the reagent can be greatly improved. Cost reduction is possible.
試料は、抗酸菌を一種以上含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、培養菌株および喀痰等の生検体を挙げることができる。これらの試料から、公知の調製方法によりＤＮＡを得ることができる。場合により、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ等の公知の方法に従って１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子およびＩＴＳ１領域を増幅することができる。 The sample is not particularly limited as long as it contains or may contain one or more mycobacteria, and examples thereof include a living specimen such as a cultured strain and sputum. From these samples, DNA can be obtained by a known preparation method. In some cases, the 16S rRNA gene and the ITS1 region can be amplified according to a known method such as PCR using DNA obtained from the sample as a template.
プローブの設計
抗酸菌属細菌の基準株と代表的な変異株（ｓｑｖ：sequence variant）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域の塩基配列は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＲＩＤＯＭ（Ｔｕｒｎｎｅら、ＪＣＭ、第３９巻、３６３７−３６４８ページ、２００１年）から入手した。また、臨床分離株での配列の多様性を確認するために、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１１３３配列とＩＴＳ１領域の１８９配列を入手した。ＲＩＤＯＭから得た配列をアライメントすることにより、それぞれの菌種につき１箇所以上の菌種特異的な塩基配列を選定した（図１〜１１）。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による菌種同定法が一般的であるため、可能な限り１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を使用して菌種の同定ができるよう試みた。しかし、進化速度が遅いために、遺伝学的に近縁な菌種で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に明確な違いがない場合は、進化速度が早くより配列に多様性のあるＩＴＳ１領域を利用した。
Probe design The 16S rRNA gene and the base sequence of the ITS1 region of reference strains of mycobacterial bacteria and typical mutants (sqv: sequence variant) are ribosomal differentiation of microorganism: RIDOM (Turne et al., JCM, Vol. 39). 3637-3648, 2001). In addition, in order to confirm the diversity of sequences in clinical isolates, 1133 sequences of 16S rRNA gene and 189 sequences of ITS1 region were obtained from a database such as GenBank. By aligning the sequences obtained from RIDOM, one or more bacterial species-specific base sequences were selected for each bacterial species (FIGS. 1 to 11). In addition, since the bacterial species identification method by 16S rRNA gene analysis is common, an attempt was made to identify bacterial species using the 16S rRNA gene as much as possible. However, due to the slow evolution rate, when there was no clear difference in the 16S rRNA gene in genetically related bacterial species, the ITS1 region with a higher evolution rate and more diverse sequences was used.
選定した菌種特異的な塩基配列を検出するプローブを、Third Wave Technologies社（ＴＷＴ社）のプローブデザインソフト（Invader Creator）を用いて設計した。 A probe for detecting the selected bacterial species-specific base sequence was designed using probe design software (Invader Creator) of Third Wave Technologies (TWT).
ＳＮＰ検出の場合、インベーダー反応における特異性は、Cleavase酵素が認識する３塩基の重複構造が形成されるかどうかが大きなポイントとなる。つまり、ＳＮＰ部位でシグナルプローブとターゲットＤＮＡがマッチする構造のみをCleavase酵素が認識し、フラップが切り出されることになる。しかし、ＳＮＰ部位でシグナルプローブとターゲットＤＮＡがマッチしない（ミスマッチ）場合でも、マッチする場合と比較し反応性は低下するもののフラップが切り出されるケースがある。この特異性の低下の原因は不明であるが、おそらくはＳＮＰ部位およびその前後の配列とそれらの立体構造を認識するCleavase酵素との関係に起因することが予想される。 In the case of SNP detection, the specificity in the invader reaction is largely determined by whether or not a three-base overlapping structure recognized by the Cleavase enzyme is formed. That is, only the structure where the signal probe and the target DNA match at the SNP site is recognized by the Cleavase enzyme, and the flap is cut out. However, even when the signal probe and the target DNA do not match at the SNP site (mismatch), the reactivity may be reduced compared to the case of matching, but the flap may be cut out. The cause of this decrease in specificity is unclear, but is probably due to the relationship between the SNP site and the sequences before and after it and the Cleavase enzyme that recognizes their conformation.
一方、本発明のインベーダー法を用いた抗酸菌同定法では、検出の特異性を高めるためにプローブのデザインに工夫を凝らした。前述したように、インベーダー法に用いるプローブは、シグナルプローブ（ターゲットにハイブリダイズする領域）のＴｍ値は反応温度と同じ６３℃付近に、一方、インベーダーオリゴのＴｍ値は７７℃付近になるようにデザインする。したがって、シグナルプローブのハイブリダイズする領域にターゲットＤＮＡと１塩基でもミスマッチとなる塩基置換が存在すると、プローブのＴｍ値が６３℃より低くなるため、プローブとターゲットＤＮＡのハイブリダイズ効率が低下すると考えられる。一方、インベーダーオリゴとターゲットＤＮＡがミスマッチとなる塩基置換が数塩基ぐらい存在しても、Ｔｍ値が７０℃以下になることはほとんどなく、Cleavase酵素によるフラップの切断反応には影響ないと考えられていた。すなわち、Cleavase酵素によるフラップの切断反応に代表されるインベーダー反応の特異性は、主に３塩基の重複構造を形成する塩基（ＳＮＰと見立てる）を含むシグナルプローブから得られるものと考えられていた。 On the other hand, in the acid-fast bacterium identification method using the invader method of the present invention, the probe design has been devised in order to increase the detection specificity. As described above, the probe used for the invader method is such that the Tm value of the signal probe (region that hybridizes to the target) is around 63 ° C., which is the same as the reaction temperature, while the Tm value of the invader oligo is around 77 ° C. to design. Therefore, it is considered that the hybridization efficiency of the probe and the target DNA decreases because the Tm value of the probe is lower than 63 ° C. if there is a base substitution that causes even a single base mismatch with the target DNA in the region where the signal probe hybridizes. . On the other hand, even if there are several base substitutions that cause mismatches between the invader oligo and the target DNA, the Tm value hardly falls below 70 ° C., and it is considered that there is no effect on the flap cleavage reaction by the Cleavase enzyme. It was. That is, the specificity of the invader reaction represented by the flap cleavage reaction by the Cleavase enzyme was thought to be obtained from a signal probe mainly containing a base (assuming SNP) that forms an overlapping structure of 3 bases.
しかし、後述するように、幾つかの抗酸菌属細菌を同定するために、ＳＮＰと見立てた塩基（３塩基の重複構造を形成する塩基）は同じであるが、そのすぐ近傍の塩基の違いを見分けるプローブが必要であった。この場合、前述のような理由から、異なる塩基をシグナルプローブで認識させるほうがプローブの特異性が得られやすいと考えていた。しかし、以下の例のように、ＳＮＰと見立てた塩基のすぐ近傍の塩基の違いを検出する場合、むしろ、インベーダーオリゴにミスマッチを入れたほうが特異性を得やすいという結果を得た。 However, as will be described later, in order to identify several mycobacterial bacteria, the bases regarded as SNPs (bases forming a three-base overlapping structure) are the same, but the difference between the bases in the immediate vicinity is the same. A probe was needed to distinguish between them. In this case, for the reasons described above, it was thought that the specificity of the probe was more easily obtained when different bases were recognized by the signal probe. However, as in the following example, when detecting the difference between the bases immediately adjacent to the bases regarded as SNPs, it was rather easy to obtain specificity when a mismatch was added to the invader oligo.
１３９〜１４１番塩基（図１参照）の違いを利用して、M. gordonaeを同定した実際の例を挙げる（このプローブはM. heidelbergenseという菌種を検出することが判明したため、キットには採用していない）。１３９〜１４１番塩基の３２菌種のコンセンサス配列（多数決）はＴＴＣであるが、M. fortuitum, M. peregrinumおよびM. nonchromogenicumなどの菌種はＴＴＴを、また、M. abcessus, M. chelonaeおよびM. terraeはＴＣＴを有していた。M. gordonae はＡＴＣを、一方、M. kansasii/M.gastri はＡＣＣを有していることを利用して、両者の同定を試みた。まず、M. gordonaeの検出は、コンセンサス配列と唯一異なる、１３９番塩基のＡをＳＮＰと見立ててプローブのデザインを行った。しかし、M. kansasii/M. gastriも１３９番塩基はＡを有してることから、その１塩基後の１４０番塩基の違いを利用して、M. gordonaeとM. kansasii/M. gastriの識別を行う必要性があった。今までの考えでは、シグナルプローブにミスマッチが入るアンチセンス鎖のプローブにより、M. gordonaeのみ特異的に検出できると考えられた。しかし、実際にアンチセンス鎖をターゲットとしたプローブは、反応効率は若干低下するものの、M. kansasiiおよびM. gastriの基準株ＤＮＡも検出してしまった。逆に、センス鎖をターゲットとしたプローブは、M. kansasii/M. gastriを検出しなかった。つまり、シグナルプローブにミスマッチがある場合に比べ、インベーダープローブの３’末端から２つ目の塩基にミスマッチが導入されたほうが、より特異性の高いプローブとなったのである。これは、インベーダーオリゴのＴｍ値の低下に起因するとは考えられず、インベーダーオリゴの３’末端近くに生じたミスマッチをもった３塩基の重複構造が、Cleavase酵素により認識されにくくなったことが原因だと考えられる。 The actual example which identified M. gordonae using the difference of 139-141 bases (refer FIG. 1) is given. (It became clear that this probe detects the microbial species called M. heidelbergense, and is adopted as a kit. Not) The consensus sequence (majority decision) of 32 strains of bases 139 to 141 is TTC, but strains such as M. fortuitum, M. peregrinum and M. nonchromogenicum represent TTT, and M. abcessus, M. chelonae and M. terrae had a TCT. M. gordonae tried to identify both using ATC, while M. kansasii / M. Gastri had ACC. First, for detection of M. gordonae, a probe was designed assuming that 139th base A, which is only different from the consensus sequence, was regarded as SNP. However, since M. kansasii / M. Gastri also has an A at the 139th base, the difference between the 140th base after the first base is used to distinguish between M. gordonae and M. kansasii / M. Gastri. There was a need to do. Based on the idea so far, it was thought that only M. gordonae could be detected specifically by using an antisense strand probe with a mismatch in the signal probe. However, the probe targeting the antisense strand actually detected the reference strain DNAs of M. kansasii and M. gastri, although the reaction efficiency was slightly reduced. Conversely, the probe targeting the sense strand did not detect M. kansasii / M. Gastri. That is, the probe with higher specificity is obtained when the mismatch is introduced into the second base from the 3 'end of the invader probe as compared with the case where there is a mismatch in the signal probe. This is not thought to be due to a decrease in the Tm value of the invader oligo, but is due to the fact that the 3 base overlapping structure with a mismatch near the 3 'end of the invader oligo is not easily recognized by the Cleavase enzyme. It is thought that.
上記のような現象の発見から、どのようにプローブをデザインしたらより特異性が得られやすいプローブとなるかということが判明した。 From the discovery of the phenomenon as described above, it has been clarified how the probe can be designed to obtain more specificity.
M. aviumあるいはM. intracellulareをはじめ、多くの菌種検出用プローブは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域（Ｖ２）のおよそ１８０〜２００番塩基に設定している。この場合、この領域内のどの塩基をＳＮＰと見立ててプローブをデザイン・合成しても高い特異性が得られると考えられるが、ＳＮＰと見立てる塩基が同じ場合も多く、より特異性が得やすいよう上述の現象等を利用しデザインを慎重に行なった。 Many species detection probes such as M. avium or M. intracellulare are set to about 180 to 200 bases in the hypervariable region (V2) of the 16S rRNA gene. In this case, it is considered that high specificity can be obtained even if the probe is designed / synthesized by considering any base in this region as an SNP, but there are many cases where the same base is regarded as an SNP, so that the specificity can be easily obtained. The design was made carefully using the above phenomenon.
次に、デザインしたプローブの特異性を、ＢＬＡＳＴ検索とＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ−IIの「Probe Match」機能等で確認した。 Next, the specificity of the designed probe was confirmed by BLAST search and “Probe Match” function of Ribosomal Database Project-II.
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を使用した場合、M. avium検出用プローブは３セットとも、M. aviumの亜種で遺伝学的に近縁のM. avium subsp. paratuberculosisとM. avium subsp. silvaticumを同時に同定することが判明した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした同定法で、M. aviumあるいはＭＡＣを同定するキットは、原理的にはすべて、M. avium の亜種であるM. avium subsp. paratuberculosisとM. avium subsp. silvaticumを検出すると考えられるが、これらの菌種は臨床分離株からはほとんど検出されることはないことから、キットの添付書類にはこれらの菌種名は記載されていない。 When using the 16S rRNA gene, all three sets of M. avium detection probes simultaneously identify M. avium subsp. Paratuberculosis and M. avium subsp. Silvaticum genetically related variants of M. avium It has been found. In principle, all kits that identify M. avium or MAC using an identification method targeting the 16S rRNA gene are M. avium subsp. Paratuberculosis and M. avium subsp. Silvaticum. Although it is thought that they are detected, these bacterial species are rarely detected from clinical isolates. Therefore, these bacterial species names are not described in the package insert.
さらに、M. nonchromogenicumも単独での検出は不可能と考えられたため、M. nonchromogenicumと遺伝学的に非常に近縁であるM. terraeを同時に検出するプローブを作製することにした。また、M. marinumとM. ulceransおよびM. peregrinumとM. septicumは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に明らかな違いが認められず、また、それらを分けて同定する意義に乏しいため、それらを同時に検出するプローブを作製することにした。 Furthermore, since it was considered impossible to detect M. nonchromogenicum alone, we decided to create a probe that simultaneously detects M. terrae, which is genetically related to M. nonchromogenicum. In addition, M. marinum and M. ulcerans, M. peregrinum and M. septicum have no obvious difference in 16S rRNA gene sequences, and they have little significance to identify them separately, so they are detected simultaneously. We decided to make a probe.
一方、M. simiaeを１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子で同定しようとすると、M. simiaeと遺伝学的に近縁である、M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. heidelbergense, M. interjectum, M.kubicae, M. intermediumを含む計８菌種を同時に検出してしまうことが判明した。そこで、M. simiaeはＩＴＳ１領域を利用して同定することにした（図９）。さらに、M. kansasiiとM. gastriおよびM. chelonaeとM. abscessusは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に明らかな違いが認められなかったことから、ともに両菌種を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子で同定するプローブと、さらに、ＩＴＳ１領域を利用してM. gastri（図１０）とM. chelonae（図１１）を同定するプローブを作製することにした。 On the other hand, when trying to identify M. simiae with the 16S rRNA gene, M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. heidelbergense, M. interjectum, M. interjectum, M. simiae are genetically related to M. simiae. It was found that a total of 8 bacterial species including kubicae and M. intermedium were detected simultaneously. Therefore, M. simiae was identified using the ITS1 region (FIG. 9). Furthermore, since M. kansasii and M. gastri and M. chelonae and M. abscessus showed no obvious difference in the 16S rRNA gene sequence, both a probe for identifying both bacterial species with the 16S rRNA gene, Therefore, it was decided to create a probe for identifying M. gastri (FIG. 10) and M. chelonae (FIG. 11) using the ITS1 region.
各菌種につき２〜４セットのプローブを作製し、以下の検討に使用した。合成したプローブの特異性は、まず合成オリゴヌクレオチドを用いて確認した後、抗酸菌の基準株５３株（M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra, M. bovis, M. microti, M. africaum, M. asiaticum, M. marinum, M. ulceranse, M. kansasii sqv.I, M. gastri, M. malmoense, M. avium subsp. avium sqv.I, M. avium subsp. silvaticum, M. intracellulare sqv.I, M. intracellulare sqv.II, M. szulgai, M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. simiae, M. heidelbergense, M. interjectum, M. kubicae, M. intermedium, M. gordonae sqv.I, M. gordonae sqv.II, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. shimoidei, M. branderi, M. celatum, M. cookii, M. triviale, M. nonchromogenicum, M. terrae sqv.I, M. abscessus, M. chelonae, M. smegmatis, M. flavescens, M. vaccae, M. peregrinum, M. septicum, M. mucogenicum, M. fortuitum, M. alvei, M. hustonense, M. farcinogenes, M. senegalense, M. neworleansense, M. porcinum, M. chitae, M. aichiense, M. ashagni）と、ＭＧＩＴ培地に混入することが知られているStaphylococcus aureusなどの細菌２９株を用いて検討した。さらに、臨床分離株６６８例を用いて、全染色体ＤＮＡ塩基配列の類似性を利用したＤＤＨ法（極東製薬工業）と比較検討した。 Two to four sets of probes were prepared for each bacterial species and used for the following studies. The specificity of the synthesized probe was first confirmed using a synthetic oligonucleotide, and then the reference strain 53 of acid-fast bacteria (M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra, M. bovis, M. microti, M. africaum, M. asiaticum, M. marinum, M. ulceranse, M. kansasii sqv.I, M. gastri, M. malmoense, M. avium subsp. Avium sqv.I, M. avium subsp. Silvaticum, M. intracellulare sqv.I , M. intracellulare sqv.II, M. szulgai, M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. simiae, M. heidelbergense, M. interjectum, M. kubicae, M. intermedium, M. gordonae sqv.I , M. gordonae sqv. II, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. shimoidei, M. branderi, M. celatum, M. cookii, M. triviale, M. nonchromogenicum, M. terrae sqv.I, M. abscessus , M. chelonae, M. smegmatis, M. flavescens, M. vaccae, M. peregrinum, M. septicum, M. mucogenicum, M. fortuitum, M. alvei, M. hustonense, M. farcinogenes, M. senegalense, M neworleansense, M. porcinum, M. chitae, M. aichiense, M. ashagni) and MGIT medium It was studied using the 29 shares bacteria, such as Staphylococcus aureus that Rukoto is known. Furthermore, 668 clinical isolates were used for comparison with the DDH method (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) using the similarity of the total chromosomal DNA base sequence.
測定は、３８４ウェルプレートを用いて、それぞれのインベーダーオリゴ、シグナルプローブ、ＦＲＥＴプローブおよびCleavase酵素と、熱変性した０．６ngのサンプルＤＮＡ（１．８×１０５コピー相当）を同時に混和し、６６℃で１〜４時間反応させた後、蛍光プレートリーダー（CYTOFLUOR4000／Applied Biosystems）で計測した。判定基準はＦＯＺ法を用いた（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１２巻、２２９−２４０ページ、２００３年）。なお、従来のインベーダー法では、反応温度は６３℃であるが、本発明においては、反応温度を６６℃とすることにより菌種同定の特異性をさらに高めることができた。 The measurement was performed by simultaneously mixing each invader oligo, signal probe, FRET probe and cleavase enzyme with 0.6 ng sample DNA (equivalent to 1.8 × 10 5 copies) using a 384-well plate. After reaction at 1 ° C. for 1 to 4 hours, measurement was performed with a fluorescent plate reader (CYTOFLUOR4000 / Applied Biosystems). The criteria used were the FOZ method (Lyamichev et al., Methods in Molecular Biology, Vol. 212, pages 229-240, 2003). In the conventional invader method, the reaction temperature is 63 ° C., but in the present invention, the specificity of bacterial species identification could be further increased by setting the reaction temperature to 66 ° C.
本発明の方法とＤＤＨ法との結果が整合しない場合には、シークエンス解析により、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列あるいはＩＴＳ１領域の配列を確認した。ＰＣＲプライマーは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用にForward: ５’- GGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGT -３’とReverse: ５’- CTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATC -３’を、また、ＩＴＳ１領域増幅用にForward: ５’- GTCGTAACAAGGTAGCCGT -３’とReverse: ５’- TGCCAAGGCATCCACC -３’使用し、公知の方法によりＰＣＲ増幅した後に、ダイレクトシークエンスあるいはクローニングシークエンス法により、それぞれの配列を解析した。得られた配列を元に、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく菌種名をＲＩＤＯＭを用いて決定した。 When the results of the method of the present invention and the DDH method did not match, the sequence of 16S rRNA gene or ITS1 region was confirmed by sequence analysis. PCR primers are: Forward: 5′-GCGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGT-3 ′ and Reverse: 5′-CTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATC-3 ′ for 16S rRNA gene amplification, and Forward: 5′-GTCGTAACAAGGTAGCCGT-3 ′ for ITS1 region amplification: After 5'-TGCCAAGGCATCCACC-3 'was used and PCR amplification was performed by a known method, each sequence was analyzed by direct sequencing or cloning sequencing. Based on the obtained sequence, the bacterial species name based on the 16S rRNA gene sequence was determined using RIDOM.
シークエンス解析の結果、ＤＤＨ法でM. intracellulareと判定された臨床分離株には、基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する菌株（sqv.II＆III＆IV）が存在することが判明した（図１２）。基準株検出用のプローブに、これら基準株とは異なる配列を有する臨床分離株検出用のシグナルプローブを加えミックスプローブ化することにより、M. intracellulareの同定率を高めることが可能となった。なお、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）では、これら基準株と異なる配列を有するM. intracellulareは検出不可能であった。 As a result of sequence analysis, it was found that clinical isolates determined as M. intracellulare by the DDH method have strains (sqv.II & III & IV) having a sequence different from the 16S rRNA gene sequence of the reference strain (FIG. 12). ). It became possible to increase the identification rate of M. intracellulare by adding a signal probe for detecting clinical isolates having a sequence different from those of the reference strain to the probe for detecting the reference strain, thereby forming a mixed probe. In addition, M. intracellulare having a sequence different from those of the reference strains could not be detected in “Amplicon (registered trademark) Mycobacterium” (Roche Diagnostics).
また、シークエンス解析の結果、M. gordonaeの臨床分離株には、基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する菌株（sqv.II＆III＆IV＆Ｖ）が高頻度に存在することが判明した（図１３）。M. intracellulare同様に、これら基準株とは異なる配列を有する臨床分離株検出用のシグナルプローブを加えミックスプローブ化することにより、M. gordonaeの同定率を高めることが可能となった。 Furthermore, as a result of sequence analysis, it was found that clinical isolates of M. gordonae frequently contain strains (sqv.II & III & IV & V) having a sequence different from the 16S rRNA gene sequence of the reference strain (FIG. 13). . Similar to M. intracellulare, it became possible to increase the identification rate of M. gordonae by adding a signal probe for detection of clinical isolates having sequences different from those of the reference strains to make a mixed probe.
また、M. kansasiiにも、基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する臨床分離株（sqv.II＆III＆VI）が存在することが判明した。３セット作製したM. kansasii/M. gastri検出用のプローブのなかで、これらの配列を有する臨床分離株も検出可能なプローブを選択することにより、M. kansasiiの同定率を高めることが可能となった。 It was also found that M. kansasii also has a clinical isolate (sqv.II & III & VI) having a sequence different from the 16S rRNA gene sequence of the reference strain. It is possible to increase the identification rate of M. kansasii by selecting probes that can detect clinical isolates having these sequences among the three sets of M. kansasii / M. Gastri detection probes. became.
我々の検討結果では、M. terraeのsqv.IIIの配列を有する株はすべてＤＤＨ法でM. nonchromogenicumと同定された。したがって、M. terrae検出用のプローブは、M. terraeのsqv.Ｉ（基準株）とsqv.IIだけを検出するものにした(図１５)。一方、M. nonchromogenicumとM. terraeを同時に検出するプローブの設定領域には、M. terraeの基準株と異なる配列を有する臨床分離株（sqv.II）が存在したことから、シグナルプローブをミックスプローブ化することで対処した。 As a result of our examination, all strains having the sqv.III sequence of M. terrae were identified as M. nonchromogenicum by the DDH method. Therefore, the probe for detecting M. terrae was designed to detect only sqv.I (reference strain) and sqv.II of M. terrae (FIG. 15). On the other hand, in the setting region of the probe that detects M. nonchromogenicum and M. terrae simultaneously, there was a clinical isolate (sqv.II) having a sequence different from the reference strain of M. terrae. It was dealt with by making it.
シークエンス解析の結果、ＤＤＨ法でM. fortuitumと判定される臨床分離株の中に、M. fortuitumと遺伝学的に非常に近縁なM. senegalense, M. farcinogenes, M. porcinumという菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する株が存在した。そこで、これらの菌種を同定するプローブの作製を試みた。M. fortuitum complexと言われている菌種の１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子配列を詳細に検討し慎重にプローブをデザインを行ったところ、M. fortuitumの基準株以外に、M. farcinogenesとM. senegalensとM. houstonenseの３菌種を、また、M. porcinuとM. boenickeiとM. neworleansenseの３菌種をそれぞれ検出するプローブを作製することが可能であった。 Among the clinical isolates that are determined to be M. fortuitum by the DDH method as a result of sequence analysis, M. senegalense, M. farcinogenes, and M. porcinum are closely related to M. fortuitum. There was a strain with the 16S rRNA gene sequence. Therefore, an attempt was made to create probes that identify these species. After careful examination of the 16S RNA gene sequence of a bacterial species called M. fortuitum complex and careful probe design, in addition to the M. fortuitum reference strain, M. farcinogenes, M. senegalens and M. It was possible to prepare probes for detecting three strains of houstonense and three strains of M. porcinu, M. boenickei and M. neworleansense.
一方、M. avium、M. chelonaeおよびM. nonchromogenicumの臨床分離株には、データベースに登録されていない、基準株とは異なる配列を有する株が存在した。そこで、それぞれ３セット作製したプローブのなかで、これらの配列を有する株も検出可能なプローブを選択した。 On the other hand, among clinical isolates of M. avium, M. chelonae, and M. nonchromogenicum, there were strains that were not registered in the database and had a sequence different from that of the reference strain. Therefore, a probe that can detect strains having these sequences was selected from the three probes prepared.
このように、主に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’側配列の超可変領域を利用し、インベーダー法を用いることで、結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. avium、およびM. intracellulareなど臨床的に重要な抗酸菌が同定可能となった。なお、基準株あるいは臨床分離株を使用した特異性試験の結果を図１７と図１８に示す。臨床分離株６６８株を用いた検討では、ＤＤＨ法で同定できた臨床分離株６１２例中５６９例（９３．０％）はインベーダー法の結果と一致した。また、インベーダー法では、混合感染も同定可能であった。 In this way, mainly using the hypervariable region of the 5'-side sequence of the 16S rRNA gene and using the invader method, clinical studies such as M. tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare are performed. An important acid-fast bacterium can be identified. In addition, the result of the specificity test using a reference | standard strain or a clinical isolate is shown in FIG. 17 and FIG. In the study using 668 clinical isolates, 569 cases (93.0%) out of 612 clinical isolates that could be identified by the DDH method agreed with the results of the invader method. Moreover, mixed infection could be identified by the invader method.
一方、ＤＤＨ法で１８菌種以外・判定不能となり、本インベーダー法でM. gordonaeと判定された臨床分離株が１７株確認された。また、ＤＤＨでM. scrofulaceumと判定され、本インベーダー法で３３菌種以外と判定されたものが５株あるなど、ＤＤＨ法と本インベーダー法とで結果が乖離する臨床分離株も確認された。 On the other hand, it was impossible to determine other than 18 bacterial species by DDH method, and 17 clinical isolates determined to be M. gordonae by this invader method were confirmed. In addition, clinical isolates in which the results differed between the DDH method and the invader method were confirmed, such as 5 strains that were determined to be M. scrofulaceum by DDH and were determined to be other than 33 species by the invader method.
「ＤＤＨマイコバクテリウム極東」（極東製薬工業）の添付書類に「相関」に関する以下のような記述がある。「保存抗酸菌236菌株を被検菌として、生化学的性状試験による「極東 抗酸菌同定キット」との間で相関を検討した。全体では、本法の同定率は89％（211/236）、従来法との一致率は84％（199/236）でした。菌種ごとでは従来法でM. scrofulaceumと同定される抗酸菌の27％（7/26）、同様にM. gordonaeの27％（4/15）、M. nonchromogenicum complexの48％（11/23）、M. fortuitumの7％（2/29）、M. chelonaeの10％（1/10）が本法では反応しませんでした。これらの菌種以外では、一致率および同定率は100％を示しました。と記載されている。 The following description regarding “correlation” is included in the attached document of “DDH Mycobacterium Far East” (Far East Pharmaceutical Industries). “The preservation acid-fast bacilli 236 strain was used as a test bacterium, and the correlation was examined with the“ Far East acid-fast bacilli identification kit ”by biochemical property test. Overall, the identification rate of this method was 89% (211/236) and the agreement rate with the conventional method was 84% (199/236). By species, 27% (7/26) of mycobacteria identified as M. scrofulaceum by conventional methods, as well as 27% (4/15) of M. gordonae, 48% of M. nonchromogenicum complex (11 / 23) 7% (2/29) of M. fortuitum and 10% (1/10) of M. chelonae did not react with this method. Other than these species, the concordance rate and identification rate were 100%. It is described.
ＤＤＨ法で同定できなかったM. gordonae １７例は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域のシークエンス解析の結果、すべてM. gordonaeと考えられた。M. gordonaeには、ＤＤＨ法で同定されない臨床分離株が存在することが知られている。ＤＤＨ法の開発者である楠木ら（ＪＣＭ、第２９巻、１５９６−１６０３ページ、１９９１年）は、その論文の中で、ＤＤＨ法でM. gordonaeの同定用にプレートに固相されている基準株（ＡＴＣＣ １４４７０Ｔ）と全染色体ＤＮＡの類似度が７０％以下で、ＤＤＨ法では「１８菌種以外」と判定されてしまう臨床分離株がいることが記述されている。さらに、伊藤ら（ＪＣＭ、第４１巻、１６５６−１６６３ページ、２００３年）は、このようなＤＤＨ法では「１８菌種以外」と判定されてしまうM. gordonaeについて、コロニーの形態・増殖温度・生化学性状・遺伝子解析（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子：ｒｐｏＢなど）など詳細な検討を行っている。この論文によると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析からM. gordonaeと判定された臨床分離株３４株は、ｒｐｏＢにより４つのクラスター（Ａ ９株、Ｂ ４株、Ｃ ３株、Ｄ １５株）に分類された。それぞれ一株ずつしか検討がなされてないが、クラスターＡとＢはＤＤＨ法でM. gordonaeと判定され、一方、クラスターＣとＤは、１８菌種以外と判定されてしまうという結果であった。こららの結果などから、筆者らは、クラスターＣに属するM. gordonaeはM. gordonaeの亜種で、クラスターＤの臨床分離株は「M. gordonae-like」としながらも新菌種の可能性があると述べている。 The 17 cases of M. gordonae that could not be identified by the DDH method were all considered to be M. gordonae as a result of sequence analysis of the 16S rRNA gene and the ITS1 region. M. gordonae is known to have clinical isolates that are not identified by the DDH method. The DDH method developer Kashiwagi et al. (JCM, Vol. 29, pp. 1596-1603, 1991), in that paper, a standard that is solid-phased on a plate for identification of M. gordonae by the DDH method. It is described that there is a clinical isolate whose degree of similarity between the strain (ATCC 14470T) and total chromosomal DNA is 70% or less and is judged as “other than 18 bacterial species” by the DDH method. Furthermore, Ito et al. (JCM, Vol. 41, pages 1656-1663, 2003) have described colony morphology, growth temperature, and M. gordonae that are determined as “other than 18 bacterial species” by such a DDH method. Detailed studies such as biochemical properties and gene analysis (16S rRNA gene, RNA polymerase gene: rpoB, etc.) are being conducted. According to this paper, 34 clinical isolates determined as M. gordonae from 16S rRNA gene analysis were classified into four clusters (A9, B4, C3, D15) by rpoB. It was. Although only one strain has been studied for each, clusters A and B were determined to be M. gordonae by the DDH method, while clusters C and D were determined to be other than 18 bacterial species. From these results, the authors suggested that M. gordonae belonging to cluster C is a subspecies of M. gordonae, and the clinical isolate of cluster D is “M. States that there is.
さらに、ＤＤＨ法とインベーダー法の結果が乖離した臨床分離株について検討した。ＤＤＨ法でM. scrofulaceumと判定されるが、インベーダー法で３３菌種以外と判定された５株について１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンス解析を行ったところ、そのうち４株はM. parascrofulaceumと判定された。M. parascrofulaceumは２００４年にＴｕｒｅｎｎｅら（ＩＪＳＥＭ、第５４巻、１５４３−１５５１ページ、２００４年）によって同定された新菌種で、M. simiaeと相同性の高い１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域を有するが、生化学性状はM. scrofulaceumに似ている菌種である。M. parascrofulaceumは、、M. scrofulaceumには見られないが、発育の早いいわゆる迅速菌とM. simiae complexの遅速菌に見られる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域（Ｖ３）に存在する１２塩基を有していることが特徴的である。一方、ＩＴＳ１領域の配列は、M. simiaeとM. scrofulaceumに非常に相同性の高い配列を有している。我々の検討でも、４株はM. parascrofulaceumに特徴的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子およびＩＴＳ１配列を有していた。以上のことから、ＤＤＨ法ではM. parascrofulaceumをM. scrofulaceumと間違って同定してしまうことが示唆された。 Furthermore, clinical isolates in which the results of the DDH method and the Invader method differed were examined. Although it was determined as M. scrofulaceum by the DDH method, sequence analysis of the 16S rRNA gene was performed on 5 strains determined by the invader method as other than 33 species, and 4 of them were determined as M. parascrofulaceum. M. parascrofulaceum is a new bacterial species identified in 2004 by Turnene et al. (IJSEM, 54, 1543-1551, 2004), and has a 16S rRNA gene and ITS1 region highly homologous to M. simiae. The biochemical properties are similar to M. scrofulaceum. Although M. parascrofulaceum is not found in M. scrofulaceum, it has 12 bases present in the hypervariable region (V3) of the 16S rRNA gene found in the so-called fast-growing bacteria and the slow-acting bacteria of the M. simiae complex. It is characteristic that On the other hand, the sequence of the ITS1 region has a sequence highly homologous to M. simiae and M. scrofulaceum. In our study, four strains had the 16S rRNA gene and ITS1 sequence characteristic of M. parascrofulaceum. From the above, it was suggested that the DDH method mistakenly identifies M. parascrofulaceum as M. scrofulaceum.
また、本インベーダー法やシークエンス解析結果から、M. farcinogenes/M. senegalense/M. houstonenseあるいはM. porcinum/M. boenickei/M. neworleansenseのいずれかの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特徴を有する臨床分離株は、ＤＤＨ法でM. fortuitumと判定された。これらの菌種とM. peregrinumとM. septicumなど加えたグループを「M. fortuitum complex」と称することがあるように、遺伝学的には非常に近縁な菌種である。特に、M. houstonense, M. boenickei, M. neworleansenseは、２００４年に新たな菌種で登録される以前は、すべてM. fortuitumのthird biovariant complexと分類されていた（Ｓｃｈｉｎｓｋｙら、ＩＪＳＥＭ、第５４巻、１６５３−１６６７ページ、２００４年）。 In addition, from the results of this invader method and sequence analysis, clinical isolates having characteristics of 16S rRNA gene of either M. farcinogenes / M. Senegalense / M. Houstonense or M. porcinum / M. Boenickei / M. Neworleansense are: It was determined as M. fortuitum by the DDH method. It is genetically very closely related so that the group which added these bacterial species and M. peregrinum, M. septicum, etc. may be called "M. fortuitum complex". In particular, M. houstonense, M. boenickei, M. neworleansense were all classified as M. fortuitum's third biovariant complex before being registered as a new strain in 2004 (Schinsky et al., IJSEM, 54th). Volume, 1653-1667, 2004).
我々の検討では、M. senegalense（ＡＴＣＣ ３５７５３）, M. houstonense（ＡＴＣＣ ４９４０３）, M. porcinum（ＡＴＣＣ ３３７７６）などの基準株が、ＤＤＨ法ではM. fortuitumと判定されてしまうことがあることを確認している。 In our study, reference strains such as M. senegalense (ATCC 35753), M. houstonense (ATCC 49403), and M. porcinum (ATCC 33776) may be determined as M. fortuitum by the DDH method. I have confirmed.
さらに、M. marinumと遺伝学的に近縁なM. ulceransをM. marinumと間違って判定してしまうことが報告されている（鹿住ら、結核、第７９巻、４３７−４４１ページ、２００４年）。ＤＤＨ法は、「全染色体ＤＮＡの絶対類似度が７０％以上であれば、同じ菌種として良い」という細菌分類学の菌種同定の基準を利用した方法である。しかし、この方法では、臨床分離株がどの菌種の基準株と最も近いかという結果は得られるが、算出された数値は相対類似度であり、分類学で扱う絶対類似度とは隔たりがある場合が多い。ＤＤＨ法の判定基準は、被検体から分離したＤＮＡをビオチン標識した後、１８菌種とブランクである大腸菌のＤＮＡが固相化してあるマイクロプレートに反応させた後、６３０ｎｍの吸光度を測定し、感度（最も吸光度の高かった菌種とブランクの吸光度が）１．９倍以上、相対類似度（２番目に反応性の良かった菌種の特異吸光度が感度の）７０％以下のものを同定結果とする。したがって、被検検体の全染色体ＤＮＡと固相化されている基準株の類似度が７０％未満でも、上記の条件を満たしてしまえば、間違った菌種と誤判定されてしまうことになる。また、この原因の一因は、抽出したＤＮＡ量を最適濃度に合わせていないことも考えられる。 Furthermore, it has been reported that M. ulcerans genetically related to M. marinum is mistakenly determined as M. marinum (Kasumi et al., Tuberculosis, Vol. 79, pages 437-441, 2004). ). The DDH method is a method that uses a bacterial species identification standard of bacterial taxonomy that "if the absolute similarity of all chromosomal DNA is 70% or more, the same bacterial species is acceptable". However, this method gives the result of which bacterial strain is closest to the reference strain of the clinical isolate, but the calculated value is a relative similarity, which is different from the absolute similarity handled in taxonomy. There are many cases. Judgment criteria of the DDH method are that after the DNA separated from the specimen is labeled with biotin, after reacting it with a microplate on which 18 bacterial species and blank E. coli DNA are immobilized, the absorbance at 630 nm is measured, Identification results with sensitivity (absorbance of the highest absorbance species and blank) of 1.9 times or more and relative similarity (specific absorbance of the second most reactive species is less than 70%) And Therefore, even if the degree of similarity between the total chromosomal DNA of the test sample and the reference strain immobilized on the solid phase is less than 70%, if the above condition is satisfied, it is erroneously determined as the wrong bacterial species. One cause of this may be that the amount of extracted DNA is not adjusted to the optimum concentration.
以上のように、ＤＤＨ法では一部の菌種を間違って同定してしまうことが少なからず起こりえることが判明した。 As described above, it has been found that in the DDH method, some bacterial species may be mistakenly identified.
ＤＤＨ法で１８菌種以外の抗酸菌あるいは判定不能とされた臨床検体１５株の１６ ｒＲＮＡ遺伝子シークエンス解析から、M. lentiflavum（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＪＣＭ、第３４巻、１１００−１１０７ページ、１９９６年）, M. intermedium（Ｍｅｉｅｒら、ＩＪＳＢ，第４３巻、２０４−２０９ページ、１９９３年）などの菌株が比較的高頻度に分離検出されることが判明した。これら２菌種をそれぞれ特異的に検出するプローブを本キットに組み込むことにより、従来のキットでは検出できなかったこれらの菌種を、本発明により同定することが可能となった。 Based on 16 rRNA gene sequence analysis of 15 clinical specimens that have been determined to be acid-fast bacteria other than 18 species by the DDH method or indeterminate, M. lentiflavum (Springer et al., JCM, 34, 1100-1107, 1996) , M. intermedium (Meier et al., IJSB, Vol. 43, pages 204-209, 1993) have been found to be isolated and detected relatively frequently. By incorporating probes that specifically detect these two bacterial species into this kit, these bacterial species that could not be detected by conventional kits could be identified by the present invention.
また、これらの臨床検体から、M. mucogenicum, M. triplex, M. shimoidei, M. asiaticum, M. frederiksbergense (M. fluoroanthenivoranse), M. neoaurum, M. tokaiense/M. murale, M. chubuense, M. mageritenseなどの菌種も確認された。しかし、これらの菌種は臨床検体から分離されることは非常に稀であると考えられることから、これらの菌種検出用プローブは本発明キットに加えなかった。 From these clinical specimens, M. mucogenicum, M. triplex, M. shimoidei, M. asiaticum, M. frederiksbergense (M. fluoroanthenivoranse), M. neoaurum, M. tokaiense / M. Murale, M. chubuense, M Bacterial species such as mageritense were also confirmed. However, since these bacterial species are considered to be very rarely separated from clinical specimens, these bacterial species detection probes were not added to the kit of the present invention.
一方、喀痰、気管支洗浄液あるいは胃液や、あるいはそれらの材料から培養した菌株から調製したＤＮＡを使用して抗酸菌を同定する場合、培養の処理として、一般的にアルカリ処理を行う。アルカリ処理は、前述のように抗酸菌以外の細菌を除菌する目的で行われる。しかし、この処理を行ってもStaphylococcus aureusなどの細菌が混入してくるケースが確認されている。そこで、調製したＤＮＡが抗酸菌属の細菌由来のものであるかどうか確認できるように、抗酸菌属特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を検出する「Ｇｅｎｕｓ」プローブを作製した。 On the other hand, when an acid-fast bacterium is identified using DNA prepared from sputum, bronchial lavage fluid or gastric juice, or a strain cultured from these materials, an alkali treatment is generally performed as a culture treatment. The alkali treatment is performed for the purpose of sterilizing bacteria other than acid-fast bacteria as described above. However, it has been confirmed that bacteria such as Staphylococcus aureus are mixed even after this treatment. Therefore, a “Genus” probe for detecting a mycobacterial-specific 16S rRNA sequence was prepared so that it could be confirmed whether the prepared DNA was derived from a mycobacterial bacterium.
現行のインベーダー法の場合、２種類の蛍光色素ＦＡＭおよびＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤを使用することにより、１つのウェルでＳＮＰのタイピングが可能である。本発明においても、これら２種類の蛍光色素を使用することにより、１つのウェルで複数の菌種を同定することが可能となれば、アッセイの効率化および試薬コストの削減が可能となる。 In the case of the current invader method, SNP typing can be performed in one well by using two types of fluorescent dyes FAM and Redmond RED. Also in the present invention, if these two types of fluorescent dyes can be used to identify a plurality of bacterial species in one well, the efficiency of the assay and the reduction of reagent costs can be achieved.
一般的なインベーダー法では、検出する遺伝子配列のセンス鎖かアンチセンス鎖のどちらか一方にハイブリダイズするプローブセット（ＳＮＰに対応する塩基のみが異なる２種類のシグナルプローブと１種類のインベーダーオリゴ）が使われる。 In a general invader method, a probe set that hybridizes to either the sense strand or the antisense strand of a gene sequence to be detected (two types of signal probes differing only in the base corresponding to the SNP and one type of invader oligo) is used. used.
一方、本発明の場合、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’側配列の超可変領域、特にその中の４０塩基に集中した領域に大半のプローブを設定している。さらには、センス鎖とアンチセンス鎖を対象としたプローブが混在している。２セットのプローブを溶液中でミックスした場合、インベーダー反応の特異性や反応性が極端に低下する現象が観察された。これは、互いのプローブがアニールし易くなった結果、プローブのハイブリダイズする効率が低下したり、また、目的とは異なる塩基でCleavase酵素が認識するような３塩基の重複構造が形成されることが原因と考えられる。 On the other hand, in the case of the present invention, most probes are set in the hypervariable region of the 5'-side sequence of the 16S rRNA gene, particularly in the region concentrated in 40 bases therein. Furthermore, probes for the sense strand and the antisense strand are mixed. When two sets of probes were mixed in a solution, a phenomenon in which the specificity or reactivity of the invader reaction was extremely reduced was observed. This is because each probe becomes easier to anneal, resulting in a decrease in the efficiency of probe hybridization and the formation of a three-base overlapping structure that is recognized by the Cleavase enzyme at a base different from the intended purpose. Is considered to be the cause.
センス鎖アンチセンス鎖に関係なく、プローブがハイブリダイズする領域が極力重ならないように、また、仮に重なってもその重なり度が少なくなるように工夫するなど試行錯誤を繰り返しながら、上記のプローブの組み合わせを完成させた。 Regardless of the sense strand and antisense strand, the probe combinations are repeated by repeating trial and error, such as devising that the overlapping regions of the probes do not overlap as much as possible, and that the overlapping degree is reduced even if they overlap. Was completed.
本発明により、１検体につき２４ウェル（１２種類のプローブでの２重測定）の使用で、計３３菌種の抗酸菌属細菌を同定（グループで検出する菌種も含め）することが可能となった。解析例を図１９に示す。 According to the present invention, by using 24 wells per sample (double measurement with 12 types of probes), it is possible to identify a total of 33 species of mycobacteria (including species detected in groups) It became. An analysis example is shown in FIG.
インベーダー反応の検出感度は、ヒトのＳＮＰｓの場合、３８４ウェルプレートの１ウェルあたりおよそ４０ｎｇ（１．２×１０４コピー）である。抗酸菌の全色体ＤＮＡは、１コピーあたり３．３ｆｇであるので、１ウェルあたりおよそ４０ｐｇのＤＮＡがあれば検出可能な計算になる。本キットは、１検体あたり２４ウェル（１２種類のプローブでの２重測定）を使用するので、再検査分を考慮するとおよそ２ｎｇのＤＮＡがあれば本インベーダー法により抗酸菌の同定が可能であると考えられた。 The detection sensitivity of the invader reaction is approximately 40 ng (1.2 × 10 4 copies) per well of a 384 well plate for human SNPs. Since the total color DNA of the acid-fast bacterium is 3.3 fg per copy, the calculation is detectable if there is about 40 pg of DNA per well. Since this kit uses 24 wells per sample (double measurement with 12 types of probes), taking into consideration the retest, it is possible to identify acid-fast bacteria using this invader method if there is approximately 2 ng of DNA. It was thought that there was.
抗酸菌は、脂質に富んだ硬い細胞壁に包まれていることから、そこから効率良くＤＮＡを抽出するためには、細胞を十分に壊すために破砕ビーズが必要である。我々の検討では、破砕を十分に行えば、その後の操作は一般的なフェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を組み合わせた方法であろうが、磁気ビーズを利用した精製法であろうとも効率良くＤＮＡを抽出することが可能であった。以下の検討には、前者の方法を利用しているＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ（極東製薬工業）を用いてＤＮＡの抽出を行った。 Since mycobacteria are encased in a hard cell wall rich in lipids, in order to efficiently extract DNA therefrom, disrupted beads are necessary to sufficiently break the cells. In our study, if sufficient disruption is performed, the subsequent operation will be a method that combines general phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, but DNA purification is efficient even if it is a purification method using magnetic beads. It was possible to extract. In the following examination, DNA was extracted using MORA-EXTRACT (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) using the former method.
小川培地で培養した、M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulareなどを含む３８菌種の抗酸菌基準株を２分の１白金時利用してＤＮＡを抽出したところ、７．２５±３．５１μｇ（平均±標準偏差）のＤＮＡが抽出可能であった。これは本インベーダー法で同定を行うのに十分なＤＮＡ量であった。 When DNA was extracted using a half-platinum of 38 mycobacterial acid-fast bacteria reference strains including M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, etc. cultured in Ogawa medium, 7.25 ± 3 .51 μg (mean ± standard deviation) of DNA could be extracted. This was an amount of DNA sufficient for identification by this invader method.
現在では、その迅速性からＭＧＩＴ培地で分離培養を行うようになっている。しかし、ＤＤＨ法で抗酸菌の同定を実施する場合、多量のＤＮＡが必要なため、ＭＧＩＴ陽性直後の菌体数では十分量のＤＮＡが抽出できない。そのため、ＭＧＩＴ陽性後にＤＤＨ法を実施する場合、小川培地による増菌培養が必須である。なお、ＭＧＩＴ陽性時の抗酸菌の菌数は、菌種により若干の違いはあるがおよそ１×１０６〜１０７ＣＦＵであることが知られている。 At present, separation culture is performed in MGIT medium because of its rapidity. However, when identifying acid-fast bacteria by the DDH method, since a large amount of DNA is required, a sufficient amount of DNA cannot be extracted with the number of cells immediately after MGIT positive. Therefore, when the DDH method is performed after MGIT is positive, enrichment culture using Ogawa's medium is essential. In addition, it is known that the number of acid-fast bacteria at the time of MGIT positive is approximately 1 × 10 6 to 10 7 CFU, although there are some differences depending on the bacterial species.
我々は、ＭＧＩＴ培養陽性後の菌体から抽出したＤＮＡで、本インベーダー法による抗酸菌の同定が可能かどうか検討した。鏡検陽性検体８７検体を用いてＭＧＩＴ培養を行い、培養陽性時の菌体のおよそ半量を用いてＤＮＡ抽出を行ったところ、９５１±９４６ｎｇと菌体によって抽出されたＤＮＡ量に大きな違いがあった。これらのＤＮＡを用いてインベーダー法を実施したところ、８１検体（９３．１％）で菌種を判定することが可能であった。判定可能であった８１例の内訳は、結核菌群４２検体、M. avium２２検体、M. intracellulare１０検体、M. chelonae５検体、M. kansasii２検体、M. gordonae１検体及びM. fortuitum１検体であり、ＤＤＨ法の結果とすべて一致していた。なお、ＭＧＩＴ陽性時に他の細菌の混入が確認された検体が５検体確認されたが、そのうち３検体はインベーダー法で同定可能であった。 We examined whether it is possible to identify acid-fast bacteria by this invader method using DNA extracted from cells after positive MGIT culture. When MGIT culture was performed using 87 microscopically positive specimens and DNA extraction was carried out using about half of the cells at the time of culture positive, there was a large difference between 951 ± 946 ng and the amount of DNA extracted by the bacteria. It was. When the invader method was carried out using these DNAs, it was possible to determine the bacterial species in 81 samples (93.1%). Among the 81 cases that could be determined, 42 samples of M. tuberculosis group, 22 samples of M. avium, 10 samples of M. intracellulare, 5 samples of M. chelonae, 2 samples of M. kansasii, 1 sample of M. gordonae and 1 sample of M. fortuitum, DDH All agreed with the results of the law. In addition, although 5 samples were confirmed in which contamination of other bacteria was confirmed when MGIT was positive, 3 samples were identified by the invader method.
本検出法では、ＤＤＨ法で必要な小川培地での増菌培養は必ずしも必要なく、ＭＧＩＴ培養陽性時の菌株から破砕ビーズを用いた方法でＤＮＡを抽出することにより、必要量のＤＮＡ量を得ることが可能であった。したがって、結果が得られるまでの日数は、ＤＤＨ法より２週間ほど短縮できることになる。 In this detection method, enrichment culture in the Ogawa medium required for the DDH method is not necessarily required, and a necessary amount of DNA is obtained by extracting DNA from a strain with positive MGIT culture by a method using disrupted beads. It was possible. Therefore, the number of days until the result is obtained can be shortened by about two weeks compared with the DDH method.
一方、本発明で検出可能な計３３菌種の抗酸菌属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子あるいはＩＴＳ１領域を同時に増幅できるようなＰＣＲプライマーを使用することにより、喀痰などの生検体からも迅速に菌種の同定が可能となった。例えば、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）キットで得られるアルカリ変性済みのＰＣＲプロダクトを、塩酸等で中和し、ＴＥバッファー等で希釈したものを使用することができる。等量の０．１Ｎ塩酸で中和し、ＴＥバッファーで１０倍希釈したＰＣＲプロダクトを用いた場合、１０分の１量のCleavase酵素を使用しても、反応時間１５分〜２時間で同定可能であった。なお、このキットで使用されているＰＣＲプライマーでは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のみの増幅でかつM. lentiflavumなどの菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は増幅されないため、他の配列を有するＰＣＲプライマーを使用する必要がある。 On the other hand, by using PCR primers capable of simultaneously amplifying the 16S rRNA genes or ITS1 regions of a total of 33 mycobacterial bacteria that can be detected by the present invention, the bacterial species can be rapidly extracted from living specimens such as sputum. Can be identified. For example, use an alkali-denatured PCR product obtained with the Amplicor (registered trademark) Mycobacterium (Roche Diagnostics) kit, neutralized with hydrochloric acid, etc., and diluted with TE buffer, etc. Can do. When using a PCR product neutralized with an equal volume of 0.1N hydrochloric acid and diluted 10-fold with TE buffer, identification is possible in 15 minutes to 2 hours using a 1 / 10th amount of Cleavase enzyme. Met. The PCR primers used in this kit can only amplify the 16S rRNA gene and not the 16S rRNA gene of a bacterial species such as M. lentiflavum, so it is necessary to use PCR primers having other sequences. .
このように、本発明キットを使用することにより、確定診断用として、培養菌株の抗酸菌属細菌の菌種同定だけでなく、喀痰などの生検体からの迅速診断にも適応可能であった。 Thus, by using the kit of the present invention, it was applicable not only to the identification of the species of mycobacteria belonging to the culture strain, but also to the rapid diagnosis from living specimens such as sputum as a definitive diagnosis. .
Claims (3)
配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１５、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２９、配列番号２６と３０、配列番号２７と２９、配列番号２８と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３５、配列番号３４と３５、配列番号３６と３７、配列番号３８と３９、配列番号４０と３７、配列番号４１と４２、配列番号４３と４２、配列番号４４と４５、配列番号４６と４７、配列番号４８と５０、配列番号４９と５０、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４、配列番号５５と５６、配列番号５７と５８、配列番号５９と６０、配列番号６１と６２、配列番号６３と６４、配列番号６５と６６、配列番号６７と６８、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８及び配列番号７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。 The following base sequence pairs:
SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 15, SEQ ID NO: 14 and 15, SEQ ID NO: 16 and 17, SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 21, SEQ ID NO: 22 and 23, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 26 and 29, SEQ ID NO: 26 and 30, SEQ ID NO: 27 and 29, SEQ ID NO: 28 and 30, SEQ ID NO: 31 and 32, SEQ ID NO: 33 and 35, SEQ ID NO: 34 and 35, SEQ ID NO: 36 and 37, SEQ ID NO: 38 and 39, SEQ ID NO: 40 and 37, SEQ ID NO: 41 and 42, SEQ ID NO: 43 and 42, SEQ ID NO: 44 and 45, SEQ ID NO: 46 and 47, SEQ ID NO: 48 and 50, SEQ ID NO: 49 and 50, SEQ ID NO: 51 and 52, SEQ ID NO: 53 and 54, SEQ ID NO: 55 and 56, SEQ ID NO: 57 and 58, SEQ ID NO: 59 and 60, array No. 61 and 62, SEQ ID NO: 63 and 64, SEQ ID NO: 65 and 66, SEQ ID NO: 67 and 68, SEQ ID NO: 69 and 70, SEQ ID NO: 71 and 72, SEQ ID NO: 73 and 74, SEQ ID NO: 75 and 76, SEQ ID NO: 77 78 and SEQ ID NOs 79 and 80
A mycobacterial bacterium identification kit comprising an oligonucleotide represented by
However, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 31, 33, 34, 36, 38, 40, 41, The oligonucleotides shown by 43, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, and 79 are respectively SEQ ID NO: 81. Or it has the oligonucleotide shown by 82 in the 5 'side.
配列番号５と６、配列番号７と８および１１と１２、配列番号１３〜１７、配列番号２４〜３０、配列番号３１〜３５、配列番号３６と３７および４０、配列番号４１〜４３、配列番号４４と４５および４８〜５０、配列番号５１と５２および５５と５６、配列番号５７と５８および６１と６２、配列番号６５〜６８及び配列番号７１と７２および７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号５、７、１１、１３、１４、１６、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、４０、４１、４３、４４、４８、４９、５１、５５、５７、６１、６５、６７、７１及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。 The following base sequence pairs:
SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, and 11 and 12, SEQ ID NOS: 13-17, SEQ ID NOS: 24-30, SEQ ID NOS: 31-35, SEQ ID NOS: 36, 37, and 40, SEQ ID NOS: 41-43, SEQ ID NOS: 44 and 45 and 48 to 50, SEQ ID NOs 51 and 52 and 55 and 56, SEQ ID NOs 57 and 58 and 61 and 62, SEQ ID NOs 65 to 68, and SEQ ID NOs 71, 72, 79 and 80
A mycobacterial bacterium identification kit comprising an oligonucleotide represented by
However, SEQ ID NOs: 5, 7, 11, 13, 14, 16, 24, 26, 27, 28, 31, 33, 34, 36, 40, 41, 43, 44, 48, 49, 51, 55, 57, The oligonucleotides represented by 61, 65, 67, 71 and 79 have the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 81 or 82 on the 5 ′ side, respectively.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007129628A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of mycobacterium intracellulare, and method for detection of mycobacterium intracellulare by using the primer and probe |
| WO2009057330A1 (en) | 2007-11-01 | 2009-05-07 | Yamaguchi University | Method and kit for detection/quantification of target rna |
| TWI470083B (en) * | 2012-10-23 | 2015-01-21 | Oligonucleotide probe and biochip for identifying mycobacteria and the identification method thereof | |
| US10359424B2 (en) | 2008-05-28 | 2019-07-23 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| JPH07155200A (en) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Toyobo Co Ltd | Oligonucleotide for detecting bacterium belonging to genus of mycobacterium and identifying species |
| JPH10323189A (en) * | 1997-05-23 | 1998-12-08 | Toyobo Co Ltd | Oligonucleotide for detection or strain identification of acid-fast bacterium and its application |
| EP0528306B1 (en) * | 1991-08-15 | 1999-11-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mycobacterium primer pair |
| JP2003522527A (en) * | 1999-12-28 | 2003-07-29 | グラクソ グループ リミテッド | Single nucleotide polymorphism detection |
| WO2003106676A1 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | Probes for identifying microorganism and identification method using the same |
-
2005
- 2005-07-28 JP JP2005218754A patent/JP4769041B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| EP0528306B1 (en) * | 1991-08-15 | 1999-11-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mycobacterium primer pair |
| JPH07155200A (en) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Toyobo Co Ltd | Oligonucleotide for detecting bacterium belonging to genus of mycobacterium and identifying species |
| JPH10323189A (en) * | 1997-05-23 | 1998-12-08 | Toyobo Co Ltd | Oligonucleotide for detection or strain identification of acid-fast bacterium and its application |
| JP2003522527A (en) * | 1999-12-28 | 2003-07-29 | グラクソ グループ リミテッド | Single nucleotide polymorphism detection |
| WO2003106676A1 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | Probes for identifying microorganism and identification method using the same |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007129628A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of mycobacterium intracellulare, and method for detection of mycobacterium intracellulare by using the primer and probe |
| JPWO2007129628A1 (en) * | 2006-05-02 | 2009-09-17 | 和光純薬工業株式会社 | Primer and probe for detecting Mycobacterium intracellulare, and method for detecting Mycobacterium intracellulare using the same |
| US8188256B2 (en) | 2006-05-02 | 2012-05-29 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare |
| JP2013046617A (en) * | 2006-05-02 | 2013-03-07 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Primer and probe for detection of mycobacterium intracellulare, and method for detecting mycobacterium intracellulare using the same |
| WO2009057330A1 (en) | 2007-11-01 | 2009-05-07 | Yamaguchi University | Method and kit for detection/quantification of target rna |
| US8435742B2 (en) | 2007-11-01 | 2013-05-07 | Yamaguchi University | Method and kit for detection/quantification of target RNA |
| US10359424B2 (en) | 2008-05-28 | 2019-07-23 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe |
| TWI470083B (en) * | 2012-10-23 | 2015-01-21 | Oligonucleotide probe and biochip for identifying mycobacteria and the identification method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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