JP2006042817A - 自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 - Google Patents
自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006042817A JP2006042817A JP2005222424A JP2005222424A JP2006042817A JP 2006042817 A JP2006042817 A JP 2006042817A JP 2005222424 A JP2005222424 A JP 2005222424A JP 2005222424 A JP2005222424 A JP 2005222424A JP 2006042817 A JP2006042817 A JP 2006042817A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- microorganisms
- specific function
- base sequence
- natural environment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 246
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 146
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 114
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 86
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241001478289 Cycloclasticus Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 43
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 31
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 22
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 8
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 claims description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 7
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 claims 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 claims 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 40
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 35
- 241001478290 Cycloclasticus pugetii Species 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 20
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 239000000295 fuel oil Substances 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003305 oil spill Substances 0.000 description 10
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 8
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 7
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N tetradecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 5
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- -1 petroleum Chemical compound 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 3
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000006384 Jeotgalibacillus marinus Species 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 3
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 2
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- YCOZIPAWZNQLMR-UHFFFAOYSA-N heptane - octane Natural products CCCCCCCCCCCCCCC YCOZIPAWZNQLMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 2
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 150000003071 polychlorinated biphenyls Chemical class 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-trithia-1,3-diarsabicyclo[1.1.1]pentane Chemical compound S1[As]2S[As]1S2 UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEYONPKSDTUPAX-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-2-chloro-6-fluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C=C(Br)C=C1Cl QEYONPKSDTUPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- TYBKADJAOBUHAD-UHFFFAOYSA-J BoBo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=C1C=CN(CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCCN2C=CC(=CC3=[N+](C4=CC=CC=C4S3)C)C=C2)C=C1 TYBKADJAOBUHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203279 Cycloclasticus oligotrophus Species 0.000 description 1
- 241001613019 Cycloclasticus sp. Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOLJGYHEBJNGBV-UHFFFAOYSA-J PoPo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=C1C=CN(CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCCN2C=CC(=CC3=[N+](C4=CC=CC=C4O3)C)C=C2)C=C1 BOLJGYHEBJNGBV-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000588672 Psychrobacter immobilis Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000607253 Vibrio mimicus Species 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N ethidium homodimer Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2C(C)=[N+]1CCCNCCNCCC[N+](C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C11)=C1C1=CC=CC=C1 GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- RPKCZJYDUKVMGF-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow carbohydrazide dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(NC(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N RPKCZJYDUKVMGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000696 methanogenic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- CEOCDNVZRAIOQZ-UHFFFAOYSA-N pentachlorobenzene Chemical compound ClC1=CC(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl CEOCDNVZRAIOQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920005668 polycarbonate resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004431 polycarbonate resin Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 1
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】1)自然環境における特定機能微生物の優占度を推定する工程、2)特定機能微生物の増殖が陽性と判定される最も希釈段階の高い培養液中の微生物の特定の遺伝子領域を増幅し、クローニングする工程、3)クローニングした遺伝子領域の異同を調べ、その塩基配列を決定する工程、および4)決定した塩基配列情報から、自然環境下に生息する特定機能微生物を同定する工程を含む、自然環境から特定機能微生物およびその遺伝子を検出および定量する方法。特定の塩基配列を有する16S rRNA遺伝子。特定の塩基配列の一部を有し、CyCloclasticus属の石油分解細菌と特異的にハイブリダイズしうる、塩基長10〜50bpのRNAまたはDNAプローブおよびその利用法である。
【選択図】なし
Description
(1)自然環境から特定機能微生物およびその遺伝子を検出および定量する方法であって、以下の工程:
1)自然環境から採取した微生物含有試料を段階希釈し、特定機能微生物が増殖しうる条件下で培養を行った後、増殖した特定機能微生物の計数を行う一連の操作と並行して、前記微生物含有試料中の全菌数の計数を行うとともに、全従属栄養微生物の計数を行い、全菌数および/または全従属栄養微生物数に対する特定機能微生物数の比率から、自然環境における特定機能微生物の優占度を推定する工程、
2)特定機能微生物の増殖が陽性と判定される最も希釈段階の高い培養液中の微生物からDNAを抽出し、該DNAを鋳型として特定の遺伝子領域を増幅し、クローニングする工程、
3)クローニングした遺伝子領域の異同を調べ、前記微生物含有試料中の微生物の塩基配列を検索する工程と
4)検索された塩基配列情報から、自然環境下に生息する特定機能微生物を同定する工程
を含む前記方法。
上記において、微生物の増殖の判定には、増殖に伴い生じる菌体の濁りの有無で判定するのがふつうであるが、増殖に伴う培地組成の変化(たとえば、pHや基質濃度の減少、生成物の増大等)で判定することもできる。また、希釈倍率の高い試料で、用いる培地組成や培養条件等により菌体増殖の程度や培地組成の変化が乏しい場合には、試料中の菌体の有無を直接顕微鏡観察して判定することが望ましい。直接顕微鏡観察は、直接顕微鏡計数法(後述)に準拠して行えばよい。ただし、この場合、試料中の菌体の有無の判定を目的としており、試料を添加しない場合のコントロール値より有為な細胞数の検出が確認できればよい。
全菌数(cells/ml)=(1方形中の平均細菌数×フィルター上の濾過面積)/(試料水中の濾過量(ml)×方形の面積
ここで方形とは、接眼レンズ中に挿入したマイクロメータを通して観察される正方形のグリット視野の大きさのことを意味する。
抽出したDNAを鋳型として特定の遺伝子領域を増幅し、クローニングする。
具体的には、上記により獲得したクローン試料、望ましくは30以上の試料を、EcoRIやApaI、XbaI等いくつかの制限酵素を用いて断片化した後、ゲル電気泳動解析によりこれらの制限酵素断片長の多型性(RFLP)パターンの異同を調べる。ここで、異なるRFLPパターンを示した試料は異なる塩基配列情報を有すると考えられることから、この工程により、クローン試料を大まかにグループ化するとともに可能な限り同一クローン試料を除外することで試料を選別し、DNAシークエンサーを用いてその塩基配列を決定する。また、このRFLPパターン解析に基づく試料選別のみならず、DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション解析等によっても、その異同(この場合、プローブが標的とする塩基配列の相同性)を事前に調べることができ、違いの大きい(相同性の低い)試料を塩基配列解析の対象として選別することができる。前述のように、本発明の手法では、これらの選別過程においては、理論上最大でも9種のグループが出現するのみである。ここで、もし9種以上のクローン試料が出現した場合には、クローニング過程で用いた微生物が保有する酵素による不可抗力的な塩基置換の可能性も否定できないが、その違いが多岐にわたる場合には、段階希釈−培養計数時における判定ミスの可能性が高いと判断でき、さらにより希釈度の高い試料を対象に優占的な微生物の検出を行うことができる。
(1)5'-GGAAACCCGCCCAACAGT-3'(Cyclopug829-846*, 18mer)(配列番号5)
3'-CCTTTGGGCGGGTTGTCA-5'
(2)5'-TGCACCACTAAGCGGAAACC-3'(Cyclopug847-866*, 20mer)(配列番号6)
3'-ACGTGGTGATTCGCCTTTGG-5'
(3)5'-GGAAACCCGCCCAACAGTTGCACCACTAAGCGGAAACC-3'
(Cyclopug829-866*, 38mer)(配列番号7)
(なお、*(数字)はEscherichia coliの16S rDNA塩基配列における5'末端からの位置(ナンバーリングシステム)を示す(H.F. Noller and C. R. Woese, Science, 212:403-411, 1981)。
(3)のプローブの塩基配列は、(1)と(2)のプローブの塩基配列が隣接したものであるが、この場合はプローブが自己結合する可能性があるので注意が必要になる。
(1)重油流出事故現場海域における石油分解微生物等の調査
1997年1月2日に起こった日本海重油流出事故により大量の重油が漂着した福井県三国町沿岸域の表層海水を汚染直後の1月15日に採取し、プランクトンネット(目合い:約30μm)でろ過した後、マイクロプレートMPN(M-MPN)計数法により、現場表層海水中の石油分解微生物を計数した。M-MPN計数は、1/10NP培地(NH4NO3, 100mg;Ferric citrate, 2mg; K2HPO4, 2mg; Aged seawater, 800ml; Distilled water,200ml; pH7.8)を1.8mlずつ分注した24穴マイクロプレートのウエル中で供試海水を10倍段階希釈後、唯一の炭素源として、n-テトラデカン、灯油およびC重油を各10μl添加し、20℃で培養した。このMPN計数は3本法で行った。増殖の判定は各ウエルの培地の濁度や浮遊する石油の変化などを菌無接種の対照ウエルと比較して行った。並行して、基本的にはPorterとFeigの方法(K.G. Porter and Y.S. Feig, Limnol. Oceanogr., 25:943-948, 1980)に準じて全菌数の計数、ならびに1/2TZ培地(Polypeptone, 2.5g;Bacto-Yeast extract, 0.5g; HEPES, 4.77g; Kester's artificial seawater, 900ml; Distilled water, 100ml; pH7.5)を用いたM-MPN計数による従属栄養細菌の計数を行った。また、事故直後の1997年1月15日から約1年間にわたり、季節ごとに表層海水を採取し、上記方法により海水中の全菌数を直接顕微鏡計数法、従属栄養細菌数や石油分解細菌数をMPN法により調べた。
上記事故直後の1997年1月15日に採取した現場表層海水試料を用い、1/10NP培地にC重油を添加しM-MPN計数に用いたウエルの中で、増殖が陽性と判定される最も高い希釈段階のウエル(増殖陽性フロント試料)の中から石油分解微生物試料を採取した。この微生物試料は、現場微生物群集を10倍段階希釈法により限界まで絞り込んだものの培養液であることから、この中の微生物は現場油濁海域で最も優占していたものと考えることができる。
増殖陽性フロント試料を遠心分離により集菌し、567μlのTEバッファー(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)に懸濁した。この懸濁液に30μlの0.01% sodium dodecyl sulfate(SDS)と3μlの20mg/ml Proteinase K溶液を加え、37℃で1時間インキュベートした。次いで、5M NaClを100μl加えよく攪拌し、65℃で10分間インキュベートした後、クロロホルム:イソアミルアルコール混合液(24:1)を700μl加え、穏やかに攪拌した。遠心後、上層(水層)を分取し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(20:24:1)を当量加え穏やかに攪拌した。遠心後、その上層(水層)を分取し、0.6容のイソプロパノールを加え、DNAを遠沈した。そのDNAは70%エタノール(-20℃)で洗浄した後、乾燥させ100μlのTEバッファーに溶解した。
(3)により回収・精製したDNAをテンプレートとして16S rRNA遺伝子の保存領域に対応するプライマー27fおよび1525rを用いて、16S rRNA遺伝子をPCR増幅した。
27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(配列番号8)
1525r:5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’(配列番号9)
このPCR産物(16S rDNA)は、電気泳動によりその存在を確認した後、Original TA Cloning(r) kit(Invitrogen Co.)を用いて、クローニングを行った。
まず、無作為に40クローンを選び出し、それらクローンに16S rRNA遺伝子の全長がインサートされているかを確認した。その結果、17クローンが16S rRNA遺伝子の全長がインサートされていることがわかった。次に、それら17クローンを、現場海域で優占していたと考えられる石油分解菌群集の大まかな傾向をつかむため、5種類の制限酵素(EcoRI、HindIII、SalI、XbaIおよびRsaI)を用いて、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)解析によりグルーピングした。その結果、各制限酵素において、1〜3種類の切断パターンが得られた。最終的には、5種類の制限酵素によるそれぞれの断片パターンから4グループに分かれた。
(5)のRFLP解析によりグループに分けられた4グループから各1クローン、合計4クローン(CHO11-1-1、CHO11-1-2、CHO11-1-4、CHO11-1-34)を選抜し、16S rRNA遺伝子の全塩基配列を決定した。
決定した4クローンの16S rDNAの塩基配列情報より、予備検索としてRibosomal Database Project (RDP) II(イリノイ大学)の検索エンジンを用いて、それらと類似の配列情報をもつ微生物の存在を調べた。次いで、この類似の配列ならびに各分類群の代表菌株の配列をデータベース(GenBankやEMBL、DDBJ等)から入手(ダウンロード)し、Clustal W(前出)やSe-Al(前出)プログラム等を用いて、この4クローンの16S rDNAの塩基配列とともに多重アラインメント処理を行った。このアラインメントデータ(約1500 bp)を対象に、PHYLIP(前出)プログラムを用い、NJ法(前出)による分子系統解析および100回反復によるブートストラップ解析を実施した。
(1)Cycloclasticus pugetiiに種特異的な配列の選択(プローブデザイン)
実施例1で行った分子系統解析の結果を用い、16S rRNAの高次構造を考慮して、C. pugetiiに特異的な配列を選択した(プローブデザインを行った)。デザインした2種類のプローブ(Cyclopug829-846とCyclopug847-866)を以下に示す。
◆プローブCyclopug829-846
5'-GGAAACCCGCCCAACAGT-3'(829-846*, 18mer)(配列番号5)
(3'-CCTTTGGGCGGGTTGTCA-5')
◆プローブCyclopug847-866
5'-TGCACCACTAAGCGGAAACC-3'(847-866*, 20mer)(配列番号6)
(3'-ACGTGGTGATTCGCCTTTGG-5')
ここで、*は、Escherichia coliの16S rDNA塩基配列における5’末端からの位置(ナンバーリングシステム)を示す。
(1)でデザインしたプローブの特異性を確認するため、データベース(Ribosomal Database Project II,RDP)を用いて、プローブマッチ検索を行った。検索エンジンは、RDPに付属されているものを使用し、ミスマッチ配列を2塩基の条件で行った。その結果、デザインした2つのプローブともRDP上のCycloclasticus属6株のみとマッチし、ミスマッチ配列が1塩基もなく完全に一致した。また、2つのプローブとも自己結合しないことが確認された。これらのCycloclasticus属6株は、2株がC. pugetiiで、残りの4株はCycloclasticus sp.で未同定株か未承認種の株である。参考までに、RDP上でマッチしたCycloclasticus属6株の由来を表1に示す。
デザインしたプローブとCycloclasticus pugetiiの標準菌株ATCC51542が特異的にハイブリダイズすることをFluorescence in situ hybridization(FISH)法により確認した。
実施例2において、データベースにより特異性が確認されたプローブのCyclopug829-846及びCyclopug847-866をDNA合成機により合成し、常法により精製した。それらのプローブCyclopug829-846及びCyclopug847-866の5'末端をTetramethylrhodamine isothiocyanate(TRITC)でラベルした。
C. pugetiiの標準菌株ATCC51542をAmerica Type Culture Collection(ATCC)から入手し、ポリ塩化ビフェニルを添加した1/2TZ培地(前述)を用いて、20℃で培養した。また、対照菌株として、Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)、Bacillus marinus(B. marinus)、Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus)およびPsychrobacter immobilis (Psy. immobilis)の4種菌の標準菌株を、菌株保存機関が推奨する培地と温度で培養した。それぞれの培養細胞は、3%(w/v)パラホルムアルデヒド/3xPBS(NaCl, 24.0g; KCl, 0.6g; Na2HPO4, 4.32g; KH2PO4, 0.72g)溶液(pH 7.2-7.4)で固定し、遠心分離により集菌した後、3xPBSバッファーで洗浄した。さらに、対照プローブとしては、分子系統樹におけるBacteriaドメインに特異的なプローブEUB338(R.I. Amann et al., J. Bacteriol, 172: 762-770, 1990)を供した。
(2)で前処理を行ったC. pugetiiと4種類の対照菌株の細胞をそれぞれゼラチンコーティング(0.1% gelatine, 0.01% KCr(SO4)2)してあるスライドガラスに滴下し、室温で乾燥させ、スライドガラス上に固定した。その後、50と80、100%エタノールを用いて脱水した。
また、本発明の手法により解析された16S rDNAの塩基配列情報は、油濁環境で優占する能力を有する天然の石油分解微生物に由来すると考えられる。従って、この遺伝子およびこの遺伝子情報に基づいて本微生物の特異的な検出を可能にするように設計されたDNAプローブの塩基配列情報は、この石油分解微生物の自然界や石油処理条件下における挙動を解明し、油濁海域への栄養塩などの添加あるいはこの石油分解微生物の散布により現場石油分解効率を賦活化するといった環境修復技術(バイオレメディエーション技術)の開発を図る上で、きわめて大きな利便性がある。
本発明により、自然環境(例えば、石油や有害化学物質によって汚染された現場環境など)に優占する微生物やバイオレメディエーション過程における分解微生物の挙動を解明する手法が提供された。
さらに、本発明は、微生物を平板培養分離するという手法によらず、特定機能を有する微生物または微生物群を液体培養で選別し、その機能や系統分類学的位置を遺伝子レベルで解析する方法を提供するものである。従って、上記分解機能を有する微生物のみならず、これまで分離が困難であった酵素等有用物質を生産する微生物の検出、定量およびスクリーニングにも有益である。
(配列表の説明)
配列番号1〜4は、16S rDNAの塩基配列を示す。
配列番号5〜7は、プローブの塩基配列を示す。
配列番号8および9は、プライマーの塩基配列を示す。
Claims (7)
- 自然環境から特定機能微生物およびその遺伝子を検出および定量する方法であって、以下の工程:
1)自然環境から採取した微生物含有試料を段階希釈し、特定機能微生物が増殖しうる条件下で培養を行った後、増殖した特定機能微生物の計数を行う一連の操作と並行して、前記微生物含有試料中の全菌数の計数を行うとともに、全従属栄養微生物の計数を行い、全菌数および/または全従属栄養微生物数に対する特定機能微生物数の比率から、自然環境における特定機能微生物の優占度を推定する工程、
2)特定機能微生物の増殖が陽性と判定される最も希釈段階の高い培養液中の微生物からDNAを抽出し、該DNAを鋳型として特定の遺伝子領域を増幅し、クローニングする工程、
3)クローニングした遺伝子領域の異同を調べ、前記微生物含有試料中の微生物の塩基配列を検索する工程と
4)検索された塩基配列情報から、自然環境下に生息する特定機能微生物を同定する工程
を含む前記方法。 - 特定機能微生物および全従属栄養微生物の計数をMPN法により行い、全菌数の計数を直接顕微鏡計数法により行い、特定機能微生物の増殖を顕微鏡観察により判定する請求項1記載の方法。
- 特定機能微生物が特定の化学物質を分解する微生物である請求項1または2記載の方法。
- 自然環境に優占している微生物の遷移を解析することにより、自然環境の微生物群集機能を評価する工程を含む請求項1または2に記載の方法。
- 有害化学物質汚染環境を解析・評価する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号1〜4のいずれかの塩基配列の一部を有し、Cycloclasticus属の石油分解細菌と特異的にハイブリダイズしうる、塩基長10〜50 bpのRNAまたはDNAプローブを使用して塩基配列を検索する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号1〜4のいずれかの塩基配列の一部が配列番号5、6および7の塩基配列からなる群より選択される請求項6記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005222424A JP2006042817A (ja) | 1999-08-25 | 2005-08-01 | 自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23781899 | 1999-08-25 | ||
JP2005222424A JP2006042817A (ja) | 1999-08-25 | 2005-08-01 | 自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001518454 Division | 2000-08-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006042817A true JP2006042817A (ja) | 2006-02-16 |
Family
ID=36022054
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005222424A Pending JP2006042817A (ja) | 1999-08-25 | 2005-08-01 | 自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006042817A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7560236B2 (en) | 2007-06-07 | 2009-07-14 | Kao Corporation | Microbial community analysis |
JPWO2019044126A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2020-08-13 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
-
2005
- 2005-08-01 JP JP2005222424A patent/JP2006042817A/ja active Pending
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN4004008716, Appl. Environ. Microbiol., 1996, Vol.62, No.4, pp.1405−1415 * |
JPN4004008717, Appl. Environ. Microbiol., 1998, Vol.64, No.12, pp.4650−4657 * |
JPN5001025737, DYKSTERHOUSE, SHERYL E, INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 199501, V45N1, P116−123 * |
JPN6010034985, Marine Pollution Bulletin, 197809, Vol.9, No.9, pp.231−234 * |
JPN6010034986, マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集, 1997, Vol.st., p.57 * |
JPN6010034987, Appl. Environ. Microbiol, 199506, Vol.61, No.6, pp.2093−2098 * |
JPN6010034988, International Journal of Food Microbiology, 19970520, Vol.36, No.2−3, pp.135−143 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7560236B2 (en) | 2007-06-07 | 2009-07-14 | Kao Corporation | Microbial community analysis |
JPWO2019044126A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2020-08-13 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
JP7296043B2 (ja) | 2017-08-30 | 2023-06-22 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 微生物密度の推定方法、及び微生物密度推定用マイクロアレイ |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Baums et al. | Luminex detection of fecal indicators in river samples, marine recreational water, and beach sand | |
US20060154292A1 (en) | Novel 16SrRNA gene data and probes useful for detecting and quantitating microorganism from natural environment | |
Park et al. | Development of a real-time PCR probe for quantification of the heterotrophic dinoflagellate Cryptoperidiniopsis brodyi (Dinophyceae) in environmental samples | |
Kinzelman et al. | Identification of human enteric pathogens in gull feces at Southwestern Lake Michigan bathing beaches | |
Marano et al. | Quantitative methods for the analysis of zoosporic fungi | |
Sankaranarayanan et al. | Ancient microbes from halite fluid inclusions: optimized surface sterilization and DNA extraction | |
Shen et al. | Experimental insights into the importance of ecologically dissimilar bacteria to community assembly along a salinity gradient | |
Hussain | Bacteria: the natural indicator of environmental pollution | |
Thies et al. | Amazonian dark earths biological measurements | |
JP4674374B2 (ja) | 16SrRNA遺伝子、RNAまたはDNAプローブ、石油分解細菌を検出、定量および同定する方法。 | |
Maheux et al. | Abilities of the mCP agar method and CRENAME alpha toxin-specific real-time PCR assay to detect Clostridium perfringens spores in drinking water | |
Chen et al. | Development and evaluation of a DNA microarray assay for the simultaneous detection of nine harmful algal species in ship ballast and seaport waters | |
JP2006042817A (ja) | 自然環境からの特定機能微生物およびその遺伝子の検出・定量方法 | |
JP4323740B2 (ja) | 汚染環境および環境試料の分子遺伝学的解析・評価法 | |
Costas et al. | Use of species‐specific primers and PCR to measure the distributions of planktonic ciliates in coastal waters | |
Ren et al. | Antibiotic resistance genes in integrated surface ice, cryoconite, and glacier-fed stream in a mountain glacier in Central Asia | |
Chigbu et al. | Bacteriological analysis of water | |
RU2567011C2 (ru) | ЗОНД ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, НАБОР И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Salmonella spp. И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | |
Ismail et al. | Isolation and screening of biosurfactant-producing marine bacteria from Kuantan Port, Pahang, Malaysia | |
Bilbao et al. | Phytoplankton community composition in relation to environmental variability in the Urdaibai estuary (SE Bay of Biscay): Microscopy and eDNA metabarcoding | |
kadhim Nimr | Detection of 16SRNA Gene variation of bacterial strains isolated from water marsh polluted with oil spills southern of IRAQ | |
Mutlag | Isolation And Identification Of Fungi From Soil And Water In The Bahr Al-Najaf Depression | |
Bilbao Antolín et al. | Phytoplankton community composition in relation to environmental variability in the Urdaibai estuary (SE Bay of Biscay): Microscopy and eDNA metabarcoding | |
Eichler et al. | Extraction of total RNA and DNA from bacterioplankton | |
Coulon et al. | OPEN ACCESS EDITED BY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070801 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071226 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070801 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100622 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101102 |