JP2006022059A - ANTI-METAMORPHIC beta2-MICROGLOBULIN ANTIBODY AND IMMUNOASSAY METHOD FOR METAMORPHIC beta2-MICROGLOBULIN USING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリン、すなわちアミノ酸配列は正常で三次元構造のみが異なるβ２−ミクログロブリンと特異的に反応し、正常なβ２−ミクログロブリンとの交叉反応がない抗体、それを用いた変形β２−ミクログロブリンの免疫測定方法、及び透析アミロイドーシス予知診断用又は治療効果評価用診断薬に関するものである。 The present invention specifically relates to a modified β2-microglobulin in human body fluid, that is, an antibody that reacts specifically with β2-microglobulin having a normal amino acid sequence and different only in three-dimensional structure, and having no cross-reaction with normal β2-microglobulin. Further, the present invention relates to an immunoassay method for modified β2-microglobulin using the same, and a diagnostic agent for predictive diagnosis of dialysis amyloidosis or evaluation of therapeutic effect.
長期血液透析患者には、透析アミロイドーシスと呼ばれる骨や関節構造の破壊を主病変とするアミロイド沈着症を発症することが１９８０年に報告され、その前駆蛋白がβ２−ミクログロブリンであることが１９８５年に確認されている。以来、β２−ミクログロブリンのアミロイドジェネシスーアミロイド蛋白への変形に関する研究がなされ、透析アミロイドーシス発症例の臨床サンプルからこれまで幾つかの化学構造のことなるβ２−ミクログロブリンが報告されてきた。しかしながらアミロイド化したβ２−ミクログロブリン(変形β２−ミクログロブリン)につながる報告はなく、依然として透析現場での診断は臨床所見のみでなされている。本病態は今日２２万人超かつ年間新規発症例約１万５千人を数える透析例に必発の病態であり、この十数年QOL最大の障害要因であったが、近年は脊柱管狭窄、心アミロイドなど生命予後に関わる重大な臨床課題となっている。β２−ミクログロブリンは他のアミロイド蛋白と同様にβシート構造を有しin vitroで不溶性のアミロイド線維を形成するが、その分子メカニズムについて最近の構造解析で線維形成に際してN-末端次いでC−末端がunfoldingすることが確認されている。つまりN-末端,C-末端のunfolding(ミスフォルデイング)はアミロイド化に伴う本質的分子構造変化と理解される。従って、この構造変化を特異的に捉えるツールは透析アミロイドーシスの有用な診断ツールとして期待できる。 It was reported in 1980 that long-term hemodialysis patients develop amyloidosis called dialysis amyloidosis, which is mainly a destruction of bone and joint structure, and the precursor protein is β2-microglobulin in 1985. Has been confirmed. Since then, studies on the transformation of β2-microglobulin into amyloid genesis-amyloid protein have been conducted, and β2-microglobulin having several chemical structures has been reported so far from clinical samples of dialysis amyloidosis cases. However, there is no report that leads to amyloidated β2-microglobulin (modified β2-microglobulin), and diagnosis at the dialysis site is still made only by clinical findings. This condition is an indispensable condition for dialysis cases with over 220,000 new cases and about 15,000 new cases a year, and has been the biggest cause of QOL over the past 10 years. It has become a serious clinical problem related to life prognosis, such as cardiac amyloid. β2-microglobulin, like other amyloid proteins, has a β-sheet structure, and forms insoluble amyloid fibrils in vitro. It has been confirmed to unfolding. In other words, N-terminal and C-terminal unfolding is understood as an essential molecular structural change accompanying amyloidation. Therefore, a tool that specifically captures this structural change can be expected as a useful diagnostic tool for dialysis amyloidosis.
C-末端unfoldingに関しては１９９７年Stoppiniグループによりモノクローナル抗体による解析でβ２−ミクログロブリンC末端９２−９９に対する抗体でin vitroでのアミロイド形成が抑制されることが報告されたが、本抗体はC末端のみならず正常なβ２−ミクログロブリンとも反応を示している（非特許文献１）。 Regarding the C-terminal unfolding, the 1997 Stoppini group reported that the antibody against β2-microglobulin C-terminal 92-99 suppresses in vitro amyloid formation by monoclonal antibody analysis. Not only normal β2-microglobulin but also a reaction (Non-patent Document 1).
従来より、透析アミロイドーシスの患者血清や病変組織からN-末端欠如、AGE(advanced glycation)修飾されたβ２−ミクログロブリンなどが検出され、β２−ミクログロブリンアミロイドジェネシスに関連する物質として透析アミロイドーシスの診断又は治療評価に有用なツールの開発に繋がることが期待されてきたが、臨床病態との関連性も確認されておらず未だ臨床の場で活用されるに至っていない。 Conventionally, N2-terminal lack, AGE (advanced glycation) modified β2-microglobulin, etc. have been detected from sera and diseased tissues of dialysis amyloidosis, and as a substance related to β2-microglobulin amyloidogenesis, diagnosis of dialysis amyloidosis or Although it has been expected to lead to the development of a tool useful for treatment evaluation, its relevance to clinical pathology has not been confirmed, and it has not yet been utilized in clinical settings.
本発明は、これらの点に鑑みてなされたものであり、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化してアミロイド化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応する抗体を提供すること、及び該抗体により変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法を提供することを目的とし、特に透析アミロイドーシス患者の診断及び治療のモニタリングに適したβ２―ミクログロブリン抗体及び免疫測定方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of these points, and provides an antibody that does not react with normal β2-microglobulin but specifically reacts with deformed β2-microglobulin that is amyloidated by changing the three-dimensional structure. And provides an immunoassay method for measuring modified β2-microglobulin using the antibody, and provides a β2-microglobulin antibody and an immunoassay method particularly suitable for diagnosis and treatment monitoring of dialysis amyloidosis patients The purpose is to do.
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、β２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を含むβ２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを免疫原として得られたモノクローナル抗体であって、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応することを特徴とするものである。このような抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９７５９のハイブリドーマの特性を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される。 The anti-deformation β2-microglobulin antibody according to the present invention is a monoclonal antibody obtained using a β2-microglobulin C-terminal homologous peptide containing the 92-th to 99th amino acid sequences of the C-terminal side of β2-microglobulin as an immunogen. Thus, it does not react with normal β2-microglobulin but specifically reacts with modified β2-microglobulin in which the three-dimensional structure is changed and insolubilized. Such anti-variant β2-microglobulin antibodies are preferably produced by a hybridoma cell line having the characteristics of a hybridoma with accession number FERM P-19759.
また、本発明は、前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体と変形β２−ミクログロブリンとの特異的反応を利用して、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法であり、更には、該抗変形β２−ミクログロブリン抗体を試薬として含む未発症透析アミロイドーシスの予知診断用又は透析アミロイドーシス治療評価用免疫測定試薬である。 The present invention also relates to an immunoassay method for measuring modified β2-microglobulin in human body fluid using a specific reaction between the anti-modified β2-microglobulin antibody and the modified β2-microglobulin, An immunoassay reagent for prognostic diagnosis of undeveloped dialysis amyloidosis or for evaluation of dialysis amyloidosis treatment, comprising the anti-deformed β2-microglobulin antibody as a reagent.
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、アミロイド化遷移過程で分子表面に露出してくるβ２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を認識し、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化したあるいは不溶化しつつある変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応する。これにより、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンに特異的な免疫測定が実現され、未発症透析アミロイドーシスの予知診断、透析アミロイドーシス治療効果のマーカーとして有用である。 The anti-deformation β2-microglobulin antibody according to the present invention recognizes the amino acid sequence from the 92nd to 99th amino acids on the C-terminal side of β2-microglobulin exposed on the surface of the molecule during the amyloidization transition process, and normal β2-microglobulin. It does not react with globulin, but specifically reacts with modified β2-microglobulin that has been insolubilized due to a change in the three-dimensional structure or is insolubilized. Thereby, an immunoassay specific for deformed β2-microglobulin in human body fluid is realized, and it is useful as a prognostic diagnosis of undeveloped dialysis amyloidosis and a marker for the therapeutic effect of dialysis amyloidosis.
本発明に係るモノクローナル抗体は、β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチドを作製し、KLHと結合させてBalb/cマウス等の宿主動物に免疫し、その脾細胞を分離しミエローム細胞と融合させハイブリドーマを作製しスクリーニングして得られる。抗原に用いたβ２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチドの検証はマススペクトロメトリーおよびアミノ酸分析器で確認できる。得られたモノクローナル抗体の特異性の確認は直接ELISA および競合ELISA等で行うことができ、さらに血清、血漿炉液、変形β２−ミクログロブリンおよびアミロイド組織(手根管横靭帯)との反応性を確認することが好適である。また、変形β２−ミクログロブリンとして文献的に確立されている酸性処理による酸変性β２−ミクログロブリンを用い、その検証は構造解析の最も一般的手法Circular Dichroism(円二色法)にて行うことができる。 The monoclonal antibody according to the present invention produces β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide, binds to KLH, immunizes host animals such as Balb / c mice, isolates the spleen cells, and fuses them with myeloma cells. Hybridomas are prepared and screened. Verification of β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide used for antigen can be confirmed by mass spectrometry and amino acid analyzer. Specificity of the obtained monoclonal antibody can be confirmed by direct ELISA, competitive ELISA, etc., and the reactivity with serum, plasma furnace fluid, deformed β2-microglobulin and amyloid tissue (carpal canal ligament) can be confirmed. It is preferable to confirm. In addition, acid-modified β2-microglobulin that has been established in the literature as a modified β2-microglobulin is used, and its verification can be performed by the most common method of structural analysis, Circular Dichroism. it can.
〔β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチド〕
β２−ミクログロブリンのＮ末端より９２番目から９９番目のペプチド鎖は、Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Aspのアミノ酸配列であり、これらは正常なβ２−ミクログロブリンの立体構造では完全には分子表面に表出されずに一部分子内に埋没しているが、アミロイド化した或いはアミロイド化しつつある変形β２−ミクログロブリンでは、分子の表面に露呈されると考えられる。このβ２−ミクログロブリンのＮ末端より９２番目から９９番目のアミノ酸配列をエピトープとして、該ペプチド領域に特異的なモノクローナル抗体を作製する為、β２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを合成し抗原として用いた。
[Β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide]
The peptide chain from the 92nd to the 99th peptide from the N-terminus of β2-microglobulin is an amino acid sequence of Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp, which is a normal three-dimensional structure of β2-microglobulin. Then, although it is not completely exposed on the surface of the molecule but is partially embedded in the molecule, it is considered that the modified β2-microglobulin that is amyloidized or amyloidized is exposed on the surface of the molecule. The β2-microglobulin C-terminal homologous peptide is synthesized and used as an antigen in order to produce a monoclonal antibody specific for the peptide region using the amino acid sequence from 92 to 99 from the N-terminus of β2-microglobulin as an epitope. It was.
また、本発明に係るモノクローナル抗体の特異性の検証には、アミロイド化β２−ミクログロブリンのモデルとなる変形β２−ミクログロブリンを作製して用いることが好適である。変形β２−ミクログロブリンは、リコンビナントβ２−ミクログロブリンの６N−HCl処理或いはヒト血漿等から得られたβ２−ミクログロブリンを酢酸緩衝液等の酸性溶液中で酸処理して得られる。ヒト血漿はプール血漿等を用いることができ、また、透析患者の血漿ろ過液から精製してもよい。ヒト血漿等からのβ２−ミクログロブリンの精製は、公知且つ任意の方法が使用できる。得られたミクログロブリンは、酢酸緩衝液等により酸性下で所定時間処理される。酸処理のｐＨ領域は２．０〜５．０が好適であり、処理温度及び時間は、ｐＨにより異なるが３７℃で約１０〜６０分間が好適である。また、酢酸緩衝液等の酸性溶液は、塩化カリウムや塩化ナトリウム等を加えて塩濃度を適宜調整する。 In addition, for the verification of the specificity of the monoclonal antibody according to the present invention, it is preferable to prepare and use a modified β2-microglobulin that becomes a model of amyloidated β2-microglobulin. The modified β2-microglobulin is obtained by treatment of recombinant β2-microglobulin with 6N-HCl or acid treatment of β2-microglobulin obtained from human plasma or the like in an acidic solution such as an acetate buffer. As the human plasma, pooled plasma or the like can be used, and it may be purified from the plasma filtrate of a dialysis patient. For purification of β2-microglobulin from human plasma or the like, any known method can be used. The obtained microglobulin is treated with an acetic acid buffer or the like under an acidic condition for a predetermined time. The pH range of the acid treatment is preferably 2.0 to 5.0, and the treatment temperature and time are preferably about 10 to 60 minutes at 37 ° C., depending on the pH. In addition, in an acidic solution such as an acetate buffer, potassium chloride or sodium chloride is added to adjust the salt concentration as appropriate.
〔抗変形β２−ミクログロブリン抗体〕
前記合成ペプチドをKLHと結合させて動物に免疫することにより、変形β２−ミクログロブリンに特異的なモノクローナル抗体を得ることが可能となる。宿主動物は特に限定されるものではなく、マウスやウサギ、ヤギ等を宿主動物とできるが、Balb/cマウスが好適である。該モノクローナル抗体は既に確立された周知の方法（Galfre and Milstein,）により得ることができる。一般には、免疫動物から回収した抗体産生細胞をマウス由来のミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマとし、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う。即ち、ハイブリドーマのクローニングにより得られた抗体と変形β２−ミクログロブリンとの反応性を確認し、更に、正常なβ２−ミクログロブリンとの交差反応を確認し、免疫測定方法において実質上交差反応のない抗体を産生するクローンを選択する。反応性の確認は、直接ELISAや競合ELISA法で可能である。
[Anti-transformed β2-microglobulin antibody]
It is possible to obtain a monoclonal antibody specific for modified β2-microglobulin by immunizing an animal by binding the synthetic peptide to KLH. The host animal is not particularly limited, and mice, rabbits, goats, and the like can be used as the host animal, but Balb / c mice are preferred. The monoclonal antibody can be obtained by a well-known method (Galfre and Milstein, already established). In general, antibody-producing cells collected from immunized animals are cell-fused with mouse-derived myeloma cells to form a hybridoma, and screening is performed using the activity of the antibody produced as an indicator. That is, the reactivity between the antibody obtained by cloning of the hybridoma and the modified β2-microglobulin was confirmed, and further, the cross-reaction with normal β2-microglobulin was confirmed, and there was substantially no cross-reaction in the immunoassay method. A clone producing the antibody is selected. The reactivity can be confirmed by direct ELISA or competitive ELISA.
〔免疫測定法及び免疫測定試薬〕
前記抗体を用いた免疫測定法は、酵素免疫測定法や放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、ビオチンを用いる方法等、また、直接ＥＬＩＳＡや競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の周知の免疫測定法を用いることができ、これらの測定手順も公知且つ任意の手順を採用できる。例えば２ステップＥＩＡであれば、先ず検体となる患者血清等ビオチン標識された抗β２−ミクログロブリンポリクローナル抗体と反応させ、その反応液を抗ビオチンポリクローナル抗体を吸着させた９６穴マイクロプレートのウェルに添加し、更に酵素標識された前記モノクローナル抗体、即ち抗変形β２−ミクログロブリン抗体を各ウェルに添加して反応させる。洗浄後、抗変形β２−ミクログロブリン抗体を標識した酵素の基質を添加して反応させて発色させることにより、変形β２−ミクログロブリンを比色定量する。この免疫測定法では、抗ビオチンポリクローナル抗体吸着９６穴マイクロプレート、ビオチン標識抗β２−ミクログロブリンポリクローナル抗体含有第１試薬、酵素標識抗変形β２−ミクログロブリン抗体含有第２試薬、及び基質液で免疫測定試薬が構成される。このような免疫測定試薬は、定性試薬又は定量試薬のいずれでもよい。これら免疫測定法又は免疫測定試薬は、透析アミロイドーシスの診断や治療効果の評価に有用である。検体としては、血清、尿等のヒト体液や、血漿ろ過液等のヒト体液と同等のものを用いることができる。
[Immunoassay and immunoassay reagents]
As the immunoassay using the antibody, an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, a fluorescence immunoassay, a method using biotin or the like, or a well-known immunoassay such as direct ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, or the like is used. These measurement procedures can be well-known and arbitrary procedures can be adopted. For example, in the case of two-step EIA, first react with a biotin-labeled anti-β2-microglobulin polyclonal antibody such as patient serum, and add the reaction solution to the well of a 96-well microplate to which the anti-biotin polyclonal antibody is adsorbed. Further, the enzyme-labeled monoclonal antibody, that is, anti-deformation β2-microglobulin antibody is added to each well and reacted. After washing, a modified β2-microglobulin is colorimetrically determined by adding an enzyme substrate labeled with an anti-deformed β2-microglobulin antibody and reacting to cause color development. In this immunoassay, immunoassay is performed using an anti-biotin polyclonal antibody-absorbing 96-well microplate, a biotin-labeled anti-β2-microglobulin polyclonal antibody-containing first reagent, an enzyme-labeled anti-modified β2-microglobulin antibody-containing second reagent, and a substrate solution. Reagents are configured. Such an immunoassay reagent may be either a qualitative reagent or a quantitative reagent. These immunoassays or immunoassay reagents are useful for diagnosis of dialysis amyloidosis and evaluation of therapeutic effects. As the specimen, human body fluids such as serum and urine, and human body fluids such as plasma filtrate can be used.
本モノクローナル抗体の特異性ならびに有用性は患者血清、組織ホモジネートなどの臨床検体との免疫反応およびアミロイド組織での免疫組織化学で検討した。以下、本発明の実施例を示すが、本発明がこれら実施例に限定されるものでないことは当然である。 The specificity and usefulness of this monoclonal antibody were examined by immunoreactivity with clinical specimens such as patient serum and tissue homogenate and immunohistochemistry on amyloid tissue. Examples of the present invention will be described below, but the present invention is naturally not limited to these examples.
〔β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチド〕
β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９相同ペプチドは、バイオシステム／モデル４３０Ａを用いて合成さした。このβ２−ミクログロブリンC-末端９２−９９相同ペプチド（Boc-Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met）を、ＭＢＳ（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）によりＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）と結合して抗原とした。
[Β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide]
The β2-microglobulin C-terminal 92-99 homologous peptide was synthesized using Biosystem / Model 430A. This β2-microglobulin C-terminal 92-99 homologous peptide (Boc-Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met) was converted to KLH (MB-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) with MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester). Keyhole limpet hemocyanin) was used as an antigen.
〔抗変形β２−ミクログロブリン抗体〕
Balb/cマウスに、０．５ｍｇの前記変形β２−ミクログロブリンを皮内注射により投与し、更に２週間毎に０．２５ｍｇでの前記変形β２−ミクログロブリンを皮内注射により投与して免疫した。免疫されたマウスのリンパ球を、ポリエチレングリセロール環境下でＰ３Ｕ１ミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリドーマを１０％牛胎児血清を含有するＨＡＴ培地で培養した。その培養上静を透析した後、ＤＥＡＥ−セルロース・クロマトグラフィーにより精製して、抗変形β２−ミクログロブリン抗体を得た。
[Anti-transformed β2-microglobulin antibody]
Balb / c mice were immunized with 0.5 mg of the modified β2-microglobulin administered by intradermal injection, and further 0.25 mg of the modified β2-microglobulin administered by intradermal injection every 2 weeks. . The lymphocytes of the immunized mice were fused with P3U1 myeloma cells in a polyethylene glycerol environment, and the resulting hybridomas were cultured in HAT medium containing 10% fetal bovine serum. The culture was dialyzed against static and purified by DEAE-cellulose chromatography to obtain anti-deformed β2-microglobulin antibody.
〔特異性試験〕
得られた抗変形β２−ミクログロブリン抗体の特異性は、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨ、酸処理した変形β２−ミクログロブリン及びリコンビナントβ２−ミクログロブリンを用い、直接ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡで確認した。
本実施例では、透析患者の血漿ろ過液から混在するアルブミンを除去してβ２−ミクログロブリンを単離し、６N−HCLを添加してβ２−ミクログロブリンをアミロイド化した。β２−ミクログロブリンのアミロイド化は光学的構造解析法円二色法にて確認したところ、CDスペクトル(far UV)では波長205nmでのpositive peakの消失および波長218nmでのnegative peakの左方移動とアミロイド様変形が確認された。
[Specificity test]
The specificity of the obtained anti-modified β2-microglobulin antibody is determined by direct ELISA and competitive ELISA using β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide bond KLH, acid-treated modified β2-microglobulin and recombinant β2-microglobulin. Confirmed with.
In this example, albumin mixed from the plasma filtrate of a dialysis patient was removed to isolate β2-microglobulin, and 6N-HCL was added to amyloidize β2-microglobulin. The amyloidation of β2-microglobulin was confirmed by optical structure analysis circular dichroism. In the CD spectrum (far UV), the disappearance of the positive peak at a wavelength of 205 nm and the left shift of the negative peak at a wavelength of 218 nm Amyloid-like deformation was confirmed.
〔直接ＥＬＩＳＡ〕
９６穴マイクロプレートにβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを結合させ、これに抗変形β２−ミクログロブリン抗体を反応させた。詳細には、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１μｇ／ｍｌで溶解し、これをマイクロプレートの各ウェルに０．０５ｍｌ添加して、３７℃で１時間反応させた。各ウェルは、洗浄後ブロックエース（大日本製薬）でブロックした。ビオチン標識した前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体を各ウェルに０．０５ｍｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジン−アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン複合体を各ウェルに０．０５ｍｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。その後、ｐ−ニトロフェニルリン酸を反応させて、４０５ｎｍで吸光度測定を行い、前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体がβ２ミクログロブリンのＣ末端９２−９９と反応することを確認した。
[Direct ELISA]
Β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide-bound KLH was bound to a 96-well microplate, and this was reacted with an anti-modified β2-microglobulin antibody. Specifically, β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide-bound KLH was dissolved at 1 μg / ml in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4), and 0.05 ml was added to each well of the microplate. The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour. Each well was blocked with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) after washing. 0.05 ml of the anti-deformation β2-microglobulin antibody labeled with biotin was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, 0.05 ml of an avidin-alkaline phosphatase-labeled anti-biotin complex was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, p-nitrophenyl phosphate was reacted, and absorbance was measured at 405 nm, and it was confirmed that the anti-deformed β2-microglobulin antibody reacted with the C-terminal 92-99 of β2 microglobulin.
〔競合ＥＬＩＳＡ〕
競合物質は、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨ、前記酸処理β２−ミクログロブリン、及びリコンビナントβ２−ミクログロブリンを用いた。５０μｇ／ｍｌビオチン標識抗変形β２−ミクログロブリン抗体含有リン酸緩衝液に、前記各競合物質を各々０，１０，２０，１００，２００μｇ／ｍｌで含有したリン酸緩衝液を等量で添加して３７℃で１時間反応させ、その反応液を、前述と同様にβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを結合させたマイクロプレートに添加して反応させ、吸光度を測定した。その結果を表１に示すが、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨでは濃度２０μｇ／ｍｌで約１００％の反応阻害がみられ、酸処理β２−ミクログロブリンでは濃度１００μｇ／ｍｌで約７０％、濃度２００μｇ／ｍｌで１００％の反応阻害がみられた。一方、リコンビナントβ２−ミクログロブリンでは顕著な反応阻害はみられなかった。
[Competitive ELISA]
As the competitor, β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide bond KLH, the acid-treated β2-microglobulin, and recombinant β2-microglobulin were used. To the phosphate buffer containing 50 μg / ml biotin-labeled anti-deformation β2-microglobulin antibody, an equal amount of phosphate buffer containing 0, 10, 20, 100, and 200 μg / ml of each of the competitors was added. The reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour, and the reaction solution was added to and reacted with a microplate to which β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide-bound KLH was bound in the same manner as described above, and the absorbance was measured. The results are shown in Table 1. In β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide-bound KLH, about 100% of reaction inhibition was observed at a concentration of 20 μg / ml, and in acid-treated β2-microglobulin, about 100% at a concentration of 100 μg / ml. Reaction inhibition of 100% was observed at 70% and a concentration of 200 μg / ml. On the other hand, no significant reaction inhibition was observed with recombinant β2-microglobulin.
〔免疫組織化学〕
透析アミロイドーシス発症症例由来の１７アミロイド組織において、抗変形β２−ミクログロブリン抗体はアミロイド線維形成を示すコンゴーレッド染色陽性部位では一様に陽性であったが、β２−ミクログロブリン蓄積が見られてもコンゴーレッド陰性部位では多くは陽性、一部陰性の二様の染色パターンを示した。このことは抗変形β２−ミクログロブリン抗体がアミロイド化β２−ミクログロブリンのみならずアミロイド化に至る遷移過程上の中間体とも反応しうることを示している。
[Immunohistochemistry]
In 17 amyloid tissue derived from a case of dialysis amyloidosis, the anti-deformation β2-microglobulin antibody was uniformly positive at the congo red staining positive site showing amyloid fibril formation, but even if β2-microglobulin accumulation was seen, congo Many red-positive areas showed positive and partial negative staining patterns. This indicates that the anti-deformation β2-microglobulin antibody can react not only with amyloidated β2-microglobulin but also with an intermediate in the transition process leading to amyloidation.
〔臨床検体〕
抗変形β２−ミクログロブリン抗体はイムノブロッティングで酸処理β２−ミクログロブリン、アミロイド組織ホモジネートと反応を示したが、血清β２−ミクログロブリン、濾液β２−ミクログロブリンとの反応は示さなかった。
[Clinical samples]
The anti-modified β2-microglobulin antibody reacted with acid-treated β2-microglobulin and amyloid tissue homogenate by immunoblotting, but did not react with serum β2-microglobulin or filtrate β2-microglobulin.
〔透析アミロイドーシス患者血清の測定〕
前述の競合ＥＬＩＳＡと同様に、競合物質としてβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチドを用いて０〜１０μｇ／ｍｌの低濃度域での競合ＥＬＩＳＡ測定系を確立して、３２名の透析アミロイドーシス患者から採取した血清を検体として変形β２−ミクログロブリンを測定した。また、表２は０〜１０μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド標準品の測定結果である。この標準品の測定結果から検量線を作成して、透析アミロイドーシス患者血清中の変形β２−ミクログロブリン量を算出したところ、平均値が０．７６μｇ／ｍｌ、標準偏差が０．１５μｇ／ｍｌであり、透析アミロイドーシス患者血清中に変形β２−ミクログロブリンが存在することが確認された。このように、β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９の構造異常を特異的に捉える本変形βミクログロブリン抗体は、本病態の前駆蛋白のアミロイド化遷移過程をとらえている可能性が高く、臨症上極めて有望な診断ツールである。
[Measurement of serum from dialysis amyloidosis patients]
Similar to the aforementioned competitive ELISA, a competitive ELISA measurement system was established in a low concentration range of 0 to 10 μg / ml using β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide as a competitor, and 32 dialysis amyloidosis patients were established. The modified β2-microglobulin was measured using serum collected from the specimen as a specimen. Table 2 shows the measurement results of 0 to 10 μg / ml β2-microglobulin C-terminal 92-99 peptide standard product. A calibration curve was created from the measurement results of this standard product, and the amount of deformed β2-microglobulin in the serum of dialysis amyloidosis patients was calculated. The average value was 0.76 μg / ml and the standard deviation was 0.15 μg / ml. In addition, it was confirmed that deformed β2-microglobulin is present in the serum of dialysis amyloidosis patients. Thus, this modified β-microglobulin antibody that specifically captures the structural abnormality of β2-microglobulin C-terminal 92-99 is likely to capture the amyloidization transition process of the precursor protein of this disease state. It is an extremely promising diagnostic tool.
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体、及びそれを用いた変形β２−ミクログロブリンの免疫測定方法は、ヒト組織中又はヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンの特異的検出に用いることができ、透析アミロイドーシス予知診断用又は治療効果評価用診断薬として利用可能である。 The anti-modified β2-microglobulin antibody and the method for immunoassay of modified β2-microglobulin using the antibody according to the present invention can be used for specific detection of modified β2-microglobulin in human tissues or body fluids. It can be used as a diagnostic agent for dialysis amyloidosis prediction diagnosis or therapeutic effect evaluation.
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