JP2002515981A

JP2002515981A - Immunoassay using monoclonal antibodies reactive to human iNOS

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Publication number: JP2002515981A
Application number: JP54272298A
Authority: JP
Inventors: ロバートウェバー
Original assignee: ロバートウェバー
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2002-05-28
Anticipated expiration: 2017-04-11
Also published as: CA2285408A1; AU2735097A; WO1998045710A1; JP4117911B2

Abstract

(57)【要約】ヒト誘発性窒素酸化物合成酵素（ｉＮＯＳまたはII型ｉＮＯＳ）エンザイムを認識して結合するモノクロナール抗体のパネルが開発された。またモノクロナール抗体は、ヒトｉＮＯＳを検出および／または定量する検定に用いることができる。 (57) Abstract A panel of monoclonal antibodies that recognize and bind to human-induced nitric oxide synthase (iNOS or type II iNOS) enzymes has been developed. Further, the monoclonal antibody can be used in an assay for detecting and / or quantifying human iNOS.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトｉＮＯＳに反応するモノクロナール抗体を用いる免疫学的検定法関連出願の相互参照この出願は、先に1996年４月１２日出願された出願番号第08／634,332号の出願の一部継続出願である。発明の背景この出願は、ヒトｉＮＯＳの検出および／または定量のための免疫学的検定もしくは他の手法に用いることができる新規でかつ有用なモノクロナール抗体に関する。近年、窒素酸化物（ＮＯ）はエフェクターおよび／または調節分子であることが認められてきている。たとえば最近、脈管構造においての内皮依存性弛緩の原因である可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化におけるＮＯの作用に注目した研究分野がある。ランガスミーら（Rangassmy et al.，米国生理学会（1994））による“気管支機能において窒素酸化物がパラ分泌を役割する免疫組織化学的実証”と表題された論文は、気管支血管でのこの効果を認めている。これに関連して研究者は、中枢および末梢神経系においてＮＯが新しい神経伝達物質として作用することを見出している。さらに、活性化されたマクロファージ細胞毒性は、参照番号に基づいた固有宿主（host defense）機構で活性化されることが見出された。ＮＯは、いまや哺乳類系で分泌される生合成的に誘導された最小のエフェクター分子であると考えられている。コッシュランド（kosh land，Science Magazine，258巻（1992年12月））による“最近の分子”と表題された論文の記載された参照文献は、ＮＯの生物学上の重要性を詳述している。ラッフィーら（Laffira et al.,Hepatology，22巻，No.，(1995)）による“腹水および収縮過多性循環を伴う硬変患者からの中性好性白血球および単核細胞による窒素酸化物の生成増加”と表題された論文、およびゲラーら（Geller et al. ，Proc．Natl．Sci．USA，90巻（1993年４月））による“ヒト肝細胞からの誘発性窒素酸化物合成酵素の分子クローニングおよび発現”と表題された論文は、肝臓中の窒素酸化物合成酵素（ＮＯＳ）および窒素酸化物の活性を記述している。後者の文献には、ヒト誘発性ＮＯＳを描写するアミノ酸配列が示されている。一般的に、これらの論文は、ｉＮＯＳ誘発およびそれに続くＮＯの過剰生成に伴って肝臓が炎症および破壊した肝細胞のその随伴活性を伴った硬変について述べている。臓器移植の拒絶反応は、活性化された単核細胞、マクロファージ、および／または中性好性白血球が活性のままで固有宿主機構により媒介され、ｉＮＯＳが不可避的にＮＯの生成を誘導する作用によって引き起こされる。一方、特にｉＮＯＳを阻害し、それによってＮＯの生成を抑止すると同時に神経細胞のＮＯＳ（ｎＮＯＳ）かまたは内皮の（ｅＮＯＳ）、この酵素の他の２つのイソ体（isofroms ）のいずれかを抑制する薬剤の開発も図られている。コンガーら（Conger et al.，The Jouynal of Clinical Investigation，Inc. ，96巻（1995年７月））による“ラットの虚血後急性腎不全における内皮依存性血管拡張剤には無反応にも拘らず増加した窒素酸化物合成酵素の活性”と表題された論文では、ラット腎臓障害における窒素酸化物の活性を認めている。ワイルドハートら（Wildhirt et al.，Cardiovascular Reseach，29巻（1995 ））による“心筋梗塞における窒素酸化物合成酵素イソ酵素の免疫組織化学”と表題された論文は、心臓に損傷を与えたウサギの損傷した心筋層中で、Ｌ−アルギニンからシトルリンおよび窒素酸化物への転化を認めている。ＮＯ生合成経路は近年、広範囲に実験されている。最近、ＮＯを産生するイソ酵素のファミリーが存在することが認められた。セッサ（Sessa，J．Vasc．Res ．（1994））による“窒素酸化物合成酵素のタンパク質ファミリー”は、３つのＮＯＳイソ酵素を認めている。３つのＮＯＳイソ酵素は全て、Ｌ−アルギニンおよび酸素からシトルリンおよびＮＯへの転化を触媒作用する。さらに、この触媒転化が要求する５つの共通要素が見出された。これらはカルモデュリン、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＭＮおよびテトラヒドロビオプテリンである。一般に合成酵素（ＮＯＳ）の３つのイソ体は、好球性イソ体であるタイプ１（ｎＮＯＳ）；誘発性イソ体であるタイプ２（ｉＮＯＳ）；内皮性イソ体であるタイプ３（ｅＮＯＳ）に分類される。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳは、本質的にそれらが存在する細胞中で発現される。ｉＮＯＳは、本質的に発現されないが、いくつかのサイトカインおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）によって多少は誘発される。またｎＮＯＳは、神経伝達物質として働くことも見出されている。さらにｉＮＯＳは、固有宿主および細胞免疫に関係する。またｅＮＯＳは、血圧（vascular tone）および血流コントロールに関与する。３つの（３）ＮＯＳ酵素イソ体は、それらがほぼ６０％の配列相同であることから、真性イソ酵素のカテゴリーに分類される。ｉＮＯＳは、特定の病理学的疾患状態に強く関与している。ワイガートら（We igert et al.,Journal of the American Society of Nephrology、５巻、No.12 （1995））による“内毒血症(endotoxemic)ラット大動脈における誘発性窒素酸化物合成酵素の発現および選択的阻害”では、敗血症ショックに関してｉＮＯＳの果たす重要性を検討している。特に敗血症および敗血症ショックが起きると、多量のグラム陰性菌由来のＬＰＳおよびサイトカインは、単核細胞、マクロファージ、好中球、肝細胞、または他の細胞体中、ｉＮＯＳの発現を生理的に誘発することができ、ＮＯの過剰産生を誘発する。次いでまた全身系の広範な血管拡張による敗血症および敗血症ショックに伴う有害な効果を引き起こす。ＮＯＳに対するモノクロナール抗体の開発およびそのような抗体を生物薬学的検証に用いることがいくつかの研究グループにより報告されている。ハットリら（Hattori et al.，Hybridoma，12巻、No.6（1993））による“モノクロナール抗体による窒素酸化物合成酵素の安定化”と表題された論文では、活性化したラット腹膜マクロファージから誘導したラットｉＮＯＳに対するモノクロナール抗体のパネルについて述べている。そこには、ラットｉＮＯＳの酵素活性を無効にするモノクロナール抗体はないが、酵素を安定化させるモノクロナール抗体がいくつか報告されている。ゲリアら（Gelea et al.，FASAB journal，9巻，（1995年12月））による“脳発達中の血管におけるカルシウム依存性窒素酸化物合成酵素の一過性発現”と表題された論文には、ラットｉＮＯＳに対して培養されたモノクロナール抗体を用いてタンパク質ストリップを検出することが記載されている。さらに先のRe ngasamyの論文には、上記のように、ウシｎＮＯＳに対して開発されたモノクロナール抗体の解析および開発が記載されている。ウェウタン免疫ブロットにより、このモノクロナール抗体はウシｎＮＯＳ、ウシｅＮＯＳおよびマウスｉＮＯＳを認識することが分かった。同一のモノクロナール抗体が、免疫組織化学的方法により、ラットｎＮＯＳ、ラットｅＮＯＳおよびラットｉＮＯＳを認識することがわかった。フジサワら（Fujisawa et al.，Journal of Neurochemistry，64巻（1995））による“ヒトグリア膠芽腫株化細胞における誘発性窒素酸化物合成酵素”と表題された論文には、ヒトグリア膠芽腫株化細胞であるＡ−１７２細胞におけるｉＮＯＳ誘発について記載している。トレーシーら（Tracy et al.，米国生理学会，Rapid Communication（1994））による“ヒト肺における誘発性ＮＯ合成酵素の免疫化学的検出”と表題された論文は、ＲＡＷ264.7マクロファージにおけるｉＮＯＳ誘発について記載している。誘発されたＲＡＷ264.7細胞に由来するマウスｉＮＯＳに対して培養されたポリクロナール抗体が、ヒト肺組織におけるｉＮＯＳの発現の研究に使用された。ポロックら（Pollock et al.，米国生理学会（1993））による“特定のモノクロナール抗体を用いた内皮性窒素酸化物合成酵素の解析および位置決定”は、ウシｅＮＯＳに対して開発され、ｎＮＯＳまたはｉＮＯＳとはクロス反応しないモノクロナール抗体パネルの解析および開発を記載している。米国特許第4,376,110号および第4,879,219号には、モノクロナール抗体を用いて抗体源物質を検出する免疫学的検定が記載されている。ケンタッキー州、レキシントンのトランスダクション・ラボラトリー（Transd ution Laboratories）のパンフレットには、種々のラットＮＯＳイソ体の組換えフラグメントに対して培養されたいくつかのマウスモノクロナール抗体が提示されている。サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biothechnology）社の“ シグナル中間媒体−ＮＯＳ”と名称されたパンフレットには、種々のＮＯＳイソ体を特定するポリクロナール型抗ペプチド抗体が提示されている。ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション（Boehringer Mannheim Corpor ation）による“イソストリップ（Isostrip）”と名称されたパンフレットには、処理済ストリップを用いて簡素化されたマウス免疫グロブリンのサブクラスおよびκまたはλ軽鎖を検出するためのマウスモノクロナール抗体のイソ体を分類するキットが例示されている。ヒトｉＮＯＳを特定するためのイムノアッセイに用いるヒトｉＮＯＳに対するモノクロナール抗体のパネルの開発は、生物医学的分野に特筆すべき進歩をもたらすであろう。発明の開示本発明によれば、新規でかつヒトｉＮＯＳを特定するために有用なモノクロナール抗体の試験体群（パネル）が開発され、ヒトｉＮＯＳを特定するための免疫学的検定（イムノアッセイ）に有用であることが実証された。これらのモノクロナール抗体は、種々の標準的な技術により解析される。さらにヒトｉＮＯＳに反応し、またタンパク質の特定線状合成ペプチド類似体にも結合するこのモノクロナール抗体を用いる種々の試験法が開発された。たとえば競合結合ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）などの試験法が開発された。このような方法としてさらには、ウェウタンブロット、ディップスティック、蛍光ポーラリゼイション、酵素捕獲（キャプチャー）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などが開発された。試験は、ヒト敗血症ショックのマウスモデルおよび敗血症ショックのヒト標本を用いて行われ、制御された環境下で実証された。本発明では、ヒトｉＮＯＳの特定領域がいくつか用いられた。すなわちヒトｉＮＯＳのＡ３、Ａ４、Ａ３＋Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１および／またはＨ１ローカス（ locus）をターゲットとした。これらローカスとの結合における特定の結合対および特定の結合薬分子もまた開発された。たとえば上記したモノクロナール抗体が、特定の結合体構成要素として使用される。勿論、ポリクロナール抗体、オリゴヌクレオチド、人工抗体として刻印されたポリマー、結合部位を呈するファージおよびこれら類似体もまたこの目的で使用することができる。また本発明では、ペプチドを組合わせて試験に用いてもよい。上記に掲示したｉＮＯＳ領域のペプチドおよびペプチド類似体は、直接、間接的に、競合結合、置換もしくは他の形式よる試験および試験キットのための特異的な結合対パートナーまたは特異的結合をする試薬分子とともに用いることができる。このような試験および試験キットのどれであってもｉＮＯＳの定量的または定性的な分析に用いることができる。このような試験は、臨床診断法であってもよい。さらに以下に掲示するようなペプチドおよびペプチド類似体は、満足しうる結果が得られるならば活性領域または活性部分であってもよい。特に21Ｃ10-1Ｄ10 、2Ｄ2-Ｂ2、および5Ｂ3-Ｅ6として同定されたクローンのためのエピトープマッピングが行われた。しかしながら、合成ペプチド、組換えペプチド、組換えタンパク質、融合タンパク質、融合ペプチド、タンパク質発現ファージ、ペプチド発現ファージ、ペプチドライブラリー、ペプチド類似体ライブラリー、およびこれらの相同体を用いることができ、ここでは活性成分がヒトｉＮＯＳのＡ３、Ａ４、Ａ３＋Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１および／またはＨ１ローカスの相同体であることは特筆すべきである。さらに本発明の試験では、ヒトｉＮＯＳの領域は完全または部分的に結合することができる。たとえばＦ６領域は、検定試薬中、ヒトｉＮＯＳのＨ１領域の狭小部分と結合することができる。本発明の試験は、ヒトおよびマウスモデルにおける敗血症、敗血症ショック、心筋梗塞、移植による臓器中組織の拒絶反応、たとえば狼癒、乾癬、多重性硬化症などのある種の自己免疫疾患の“突然の再発（flare ups）”の監視、などのさまざまな病理学的状態のために、細胞および組織中のヒトIＮＯＳを検出または測定することができる。特に、ＩＦＡおよび競合結合ＥＬＩＳＡ試験法により、このような組織をいくつか試験した。しかしながら上記したように、本発明の本質に結びつく他の検定法もまた用いることができる。また競合結合ＥＬＩＳＡなどのある種の試験では、ペプチドを組合わせて用いることによって増感させた。たとえばＡ３＋Ａ４に対するペプチドは、Ａ４単独に対する試験に比べて４倍の増感がみられた。アビジン−ビオチン複合体を用いたときには、検定感度を１２から１５倍増感した。２つを組合わせると、感度は４８から６０倍に高くなる。免疫学的検定および免疫学的検定構成成分のための新規でかつ有用な方法が開示されていることは明白であろう。本発明の目的は、ｈｉＮＯＳの臨床的試験法として用いることができるｈｉＮＯＳに対して特異的なモノクロナール抗体を使用する免疫検定法の開発である。本発明の他の目的は、ｈｉＮＯＳの３つの（３）イソ体に対して特異的な別々のポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体のパネルを開発することである。本発明のさらに他の目的は、ｈｉＮＯＳ領域に相同し、本発明のモノクロナール抗体に結合するペプチド配列を産生することである。本発明のさらなる目的は、ヒトｉＮＯＳタンパク質に反応して特異的に結合し、どの免疫検定方法によっても一様に存在を示す物質を用いる免疫学的検定を実施しうる方法を提供することである。本発明の他の目的は、ヒトｉＮＯＳタンパク質の相同体に特異的に結合して、サンプル中のヒトｉＮＯＳタンパク質の存在を示す物質を用いる免疫学的検定法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｈｉＮＯＳと領域に相同し、本発明のモノクロナール抗体に結合する切断ペプチドの配列を提供することである。本発明の他の目的は、モノクロナール抗体の特異的性質を試験するためのヒトｉＮＯＳ以外のタンパク質由来の相同ペプチドを提供することである。さらに本発明の他の目的は、本発明のモノクロナール抗体のパネルを解析し、それら個々の種々の検定および方法における用途を確認することである。本発明は、特に本明細書に示される本発明の特別な特徴および態様に関係する他の目的および効果も備えている。図面の簡単な説明図１は、本発明のモノクロナール抗体の全パネルのうちのいくつかのモノクロナール抗体が結合するｈｉＮＯＳの領域を示す５つのアミノ酸配列の配列表である。図２−６は、実施例３に示されるように、本発明のモノクロナール抗体を用いて生理的に試験されたマイクロタイタープレートの写像である。図７Ａ−Ｄは、本発明のモノクロナール抗体のエピトープマッピングのために使用しうるペプチド配列の配列表である。図８は、本発明のモノクロナール抗体の特異的性質を決定するために使用しうるペプチド配列の配列表である。図９は、ポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体および４つのマウスモノクロナール抗体を用いてｈｉＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１０は、マウスＩｇＧ2bモノクロナール抗体21Ｃ10-1Ｄ10および２つのマウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体を用いてｈｉＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１１は、マウスＩｇＭモノクロナール抗体7D8-B3および３つのマウスＩｇＧモノクロナール抗体を用いてｈｉＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１２は、４種の初期モノクロナール抗体およびＨＲＰ結合させたヤギの抗マウスＩｇＧ第２抗体を用いたｈｉＮＯＳのウェウタン免疫ブロット倍の拡大写真である。図１３は、マウスＩｇＭモノクロナール捕獲抗体7D8-B3、およびマウスＩｇＧ₁ モノクロナール検出抗体1E8-B8を用いて、非誘導または誘導Ａ-172細胞溶解物中のｈｉＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１４は、マウスＩｇＭモノクロナール捕獲抗体7D8-B3、およびマウスＩｇＧ₁ モノクロナール検出抗体1E8-B8を用いて、非誘導または誘導ＲＡＷ264.7細胞溶解物中のｉＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１５は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図１６は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図１７は、マウスＩｇＭモノクロナール抗体2H11-D11で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図１８は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したＲＡＷ264.7細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図１９は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したＲＡＷ264.7 細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２０は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したヒト単核細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２１は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したヒト単核細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２２は、リポ多糖類の誘導から１６時間後のマウス腹腔洗浄細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。図２３は、リポ多糖類の誘導から１６時間後のマウス腹腔洗浄細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。図２４は、リポ多糖類の誘導から１２時間後のマウス皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。図２５は、リポ多糖類の誘導から１２時間後のマウス皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。図２６は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のヒトＡ-172細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたｈｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２７は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のヒトＡ-172細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたｈｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２８は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のマウスＲＡＷ264.7細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。図２９は、ヒト敗血症患者（No.２）から得られた皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ₁κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたｈｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。図３０は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体21C10-1D10を用い、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のＡ-172およびＲＡＷ264.7細胞から得られる細胞溶解物中のｉＮＯＳを定量する競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図３１は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体21C10-1D10を用い、３人のヒト敗血症性ショック患者の完全血の皮膜形成細胞から得られる細胞溶解物中のｈｉＮＯＳを定量する競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図３２は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体21C10-1D10、およびアミノ酸１８個のＡ４ペプチドPS-5104と比較する長さ３０のアミノ酸Ａ３＋Ａ４ペプチドP S-5251を用いた、４通りに希釈した腹水でのｈｉＮＯＳ競合結合ＥＬＩＳＡにおける増感を示す４つのグラフのパネルである。図３３は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体21C10-1D10、Ａ４ペプチド（PS- 5104）およびＡ４ローカスのアミノ末端領域に対する抗体決定基（エピトープ）の位置を決定する表Ｖ中のカルボキシ末端切断ペプチド（PS-5265からPS-5268）を用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図３４は、マウスＩｇＧ₁モノクロナール抗体21C10-1D10、基準Ａ４ペプチド（PS-5104）および抗体エピトープをPS-5213,ＶＴＱＤＤＬＱと定める表VII中のアミノ末端伸長領域（series）（PS-5211からPS-5216）を用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図３５は、マウスモノクロナール抗体2D2-B2、基準Ｆ６ペプチド（PS-5166）および抗体のエピトープをPS-5294,ＶＱＧＩＬＥＲＶと定める表Ｘ中の中間領域の３つの伸長領域に由来するペプチドを用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図３６は、マウスモノクロナール抗体5B3-E6、基準Ｆ６ペプチド（PS-5166）および抗体のエピトープをPS-5294,ＶＱＧＩＬＥＲＶと定める表Ｘ中の中間領域の３つの伸長領域に由来するペプチドを用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。発明の好ましい実施態様以下に本発明のいくつかの態様例として、好ましい態様例について上記図を参照しながら詳細に説明する。誘導型ヒトＮＯＳ（ｈｉＮＯＳ）を特定するためのマウスモノクロナール抗体の試験体群（パネル）が開発された。モノクロナール抗体類は、酵素結合免疫溶解試験（ＥＬＩＳＡ）、ウェウタン免疫ブロット、¹²⁵Ｉ−ｈｉＮＯＳのイムノプレシピテーション、および細胞の間接的免疫蛍光染色などのさまざまな方法により分析された。モノクロナール類は、全てまずＥＬＩＳＡで検出されたが、ＥＬＩＳＡに基づく試験では、全てうまく検出できた。しかしながら試験された他の全ての方法のうちには、抗ｈｉＮＯＳモノクロナール抗体がうまく適合したものもあり、そうでないものもあった。唯一、モノクロナール抗体1Ｅ8-B8が試験した全ての試験方法に適合することがわかった。2A12-A4、2D2-B2、5B3-E6、2H1 1-D11、7D8-B3、および21C10-1D10などの他の試験体は、試験された方法に全てではないがほぼ適合した。したがってそれぞれのモノクロナール抗体試験体は、それを特定するに好適な試験方法、あるいは目的がなにかに応じて試験する必要があるだろう。このようなモノクロナール抗体は、免疫学的検定におけるｈｉＮＯＳの検出および定量に用いられた。これらモノクロナール抗体は、免疫原として無傷のｈｉＮＯＳを用いて誘導された。しかしながらこれらモノクロナール抗体の全てではないかも知れないが多くは、ｈｉＮＯＳの断片（フラグメント）またはそのペプチド類似体を用いて、マウスでの初期免疫反応を惹起することによって開発することが可能であろう。さらに、ポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体の別のパネルが開発された。このポリクロナール抗体は、３つのＮＯＳイソ体（ｎＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ）に特異的に作用する。このポリクロナール抗体は、ヒトＮＯＳの上記各イソ体のアミノ末端またはカルボキシ末端に擬似するウサギ中の限定されたアミノ酸配列に対して培養された。このポリクロナール抗体の製造に用いられたペプチドは公知の技術にしたがって合成した。またマウスを免疫し、モノクロナール抗体のパネルを開発するために精製ヒトｉＮＯＳが用いられた。モノクロナール抗体は、タンパク質フラグメント、融合タンパク質およびタンパク質またはマウスを免疫するｈｉＮＯＳのペプチド類似体を用いて開発することができるが、ｈｉＮＯＳ領域に対する免疫反応を惹起する。ハイブリドーマ、細胞のクローンの製造、およびモノクロナール抗体の製造には標準的な技術を用いた。ハイブリドーマおよびクローンは、ＥＬＩＳＡおよびウェウタン免疫ブロットによりスクリーンし、培養液上清としてモノクロナール抗体の製造に用い、さらにマウスからの腹水として用いた。またモノクロナール抗体は標準的な技術によりイソ体であることが分析された。モノクロナール抗体は、次いでｈｉＮＯＳの酵素活性を抑制する能力が試験された。タンパク質の領域を決定するための各モノクロナール抗体が確認され、全長１１５３個のアミノ酸の構造のｈｉＮＯＳをカバーするための互いに重複する９６のペプチド、各１８個のアミノ酸が合成された。各ペプチドは、先のペプチドと重複する１１アミノ酸を有するカルボキシ末端ペプチドを除いてその隣接位で重複する６個のアミノ酸を有していた。ペプチドはマイクロタイタープレート上で特定のウエルを感作するために用いられ、各クローンからの培養液上清または腹水は各ウエルに供された。結合したモノクロナール抗体の存在が検出された。ｉＮＯＳタンパク質の特定領域は、モノクロナール抗体により結合されたとき同定される。図１は本発明のモノクロナール抗体のどれかに結合することにより決定されたヒトｉＮＯＳの特定領域を示すペプチド配列である。ひとたびその領域に結合することにより特定のモノクロナール抗体が決定される領域は、公知のタンパク質データベースのコンピューター検索により、他のタンパク質との相似配列が検索される。このサービスは、米国国立衛生研究所のナショナル・バイオテクノロジイ情報センターで提供される。この検索には、ベイシック・ロジスティック・アライメント統計的ツール（ＢＬＡＳＴ）と称されるプログラムが用いられる。このプログラムの使用は、アルツシュールら（Altscu l,et.al.，分子生物学雑誌、215巻（1990）））による“基準位置配列検索ツール”と表題された中に記載されている。下記表は、コンピューターの検索結果を示す。ここで“Ｘxx”はＢＬＡＳＴリスト（caluculation）中には使用されてない不一致アミノ酸を示す。 “Ｐ値”は非一致の確率を示す。換言すればこの値が小さいほど、よりそれに一致する確率である。たとえば表１中、ペプチドＡ３のＢＬＡＳＴ計算結果は、ｈｉＮＯＳ（２５−４２）と完全な配列相同性がみられる。このことは、このペプチドが相同的に作製されたｈｉＮＯＳの領域であるため予想された。コンピューター検索は、他に２つのタンパク質と相同の配列を見出しただけであった。配列相同の１つは、マウスｉＮＯＳ（２５−４２）についてＰ値が０．０２より小さかった。他の配列相同は、ラットｉＮＯＳ（２５−４２）についてＰ値が０．０３より小さかった。上記データベース中の他のタンパク質に、０．１より小さなＰ値での配列相同は見つからなかった。配列相同のためのタンパク質データベースの検索は、ペプチドＡ４ではヒトｉＮＯＳ（３７−５４）のみとの相同がみられた。データベース中にはどのタンパク質の領域も、０．１より小さなＰ値でその配列に一致するものは他にみつからなかった（すなわち９９．９％より大きな確率で一致しない）。ｈｉＮＯＳ（７８１−７９８）であるペプチドＦ６に対する配列相同の検索では、ヒトｉＮＯＳとの配列相同およびマウスとラットのｉＮＯＳとの配列相同がみつかった。この検索では、０．１より小さなＰ値でその配列に一致するものは他にみつからなかった。しかしながらｈｉＮＯＳ（９８５−１００２）であるペプチドＧ１１との配列相同の検索では、表Ｉ中のいくつかのタンパク質との相同がみられた。これらはマウスおよびラットのｉＮＯＳ、ヒトｎＮＯＳ（1256−1273）、ヒトｅＮＯＳ（1017−1031）およびウシｅＮＯＳ（1019−1033）である。ｈｉＮＯＳ（1009−1026）であるペプチドＨ１に対する配列相同のコンピューター検索では、ラットおよびマウスのｉＮＯＳとの相同がみられただけであった。０．５より小さなＰ値での配列相同は他にみつからなかった。ヒトｅＮＯＳおよびヒトｎＮＯＳとの相同が少ないがみられ、Ｐ値が０．５以上であることは注目すべきである。モノクロナール抗体の結合がみられた１８マー（mer）それぞれに由来する配列、すなわち表１中のペプチドＡ３（PS-5103）、Ａ４（PS-5104）、Ｆ６（PS-5 166）、Ｇ１１（PS-5183）およびＨ１（PS-5185）を用いてこれら領域のための一連のエピトープマッピングを設計し実施した。１８-merのアミノ酸末端に由来する４つの切断ペプチド系列、同様に１８-merのカルボキシ末端に由来する４つの切断ペプチド系列を作成した。本発明のモノクロナール抗体に結合しうる最短のアミノ酸はどれであるかを決定するためにさまざまな長さに切断した。図７はこのように切断された本発明のモノクロナール抗体のどれかと結合したペプチドを示すアミノ酸配列である。さらにいくつかのペプチド相同を設計し、ＢＬＡＳＴ検索に基づいて合成した。これらペプチド相同を用いてｈｉＮＯＳ以外のタンパク質に対するモノクロナール抗体の特異性を調べた。このような他のタンパク質は、たとえばｈＮＯＳ、ｈｅＮＯＳ、マウスｉＮＯＳおよびラットｉＮＯＳである。サンプル中のｈｉＮＯＳを検出および定量するためのイムノアッセイを準備した。精製したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いてマイクロタイタープレートを感作した。プレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ウサギポリクロナール型抗ペプチド抗体を添加してサンプル中のｈｉＮＯＳに結合することにより抗体を“捕獲”させた。表III中のパネルから種々のマウスモノクロナール抗体を試験し、そのｈｉＮＯＳ検出および定量能力を調べた。この方法により、表II I中のクローン1E8-B8、21Ｄ10-1Ｄ10、2A12-A4およびその他の作用がみられた。ｉＮＯＳを迅速に検出するためのストリップ法などの他の方法も本発明のアッセイに使用可能であると考えられる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法での使用に加え、表III中のモノクロナール抗体のパネルのサンプル中のｈｉＮＯＳを検出する能力についてウェウタン免疫ブロット法により試験した。この方法では、培地中の細胞をサイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導した。後者の方法は、本発明のモノクロナール抗体によってウェウタン免疫ブロット法で検出可能な細胞によりｉＮＯＳ産生を誘発した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法およびウェウタン免疫ブロット法での使用に加え、表IIIのパネル中の各モノクロナール抗体のｈｉＮＯＳをイムノプレシピテートする能力を調べた。これは、¹²⁵Ｉ標識されたｈｉＮＯＳを用いてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により試験された。この方法により、パネル中の２０種のうち１０のモノクロナール抗体が、ｈｉＮＯＳのイムノプレシピテートさせることがわかった。能力が認められたこの１０のうち、モノクロナール抗体２Ｈ１１ − Ｄ１１、５Ｂ３−Ｅ６および２１Ｄ１０−１Ｄ１０は、放射線標識されたタンパク質を最もイムノプレシピテートさせることがわかった。また、表III中のモノクロナール抗体を細胞中に固定して、ｉＮＯＳを識別し結合する能力を調べた。ｉＮＯＳ産生の誘発を、全くタイプの異なる３つ培養細胞中で、初期抗体として抗hiＮＯＳモノクロナール抗体を用いて、誘発された細胞の間接的免疫蛍光染色して試験した。試験された３種の誘発、培養された細胞は、Ａ−１７２（ヒトグリア膠芽腫株化細胞）、ＲＡＷ264.7（マウスマクロファージ細胞株化細胞）および血液から単離された正常ヒト単核細胞である。この試験方法では、５つのモノクロナール抗体１Ｅ８−Ｂ８、２Ｄ２−Ｂ２、５Ｂ３ −Ｅ６、２Ａ１２−Ａ４および２Ｈ１１−Ｄ１１が特にうまくいこと、パネル中の他モノクロナールはあまりうまくいかないかまたは全く細胞を染色しないことがわかった。上記には、本発明を充分に開示することを目的として、本発明の態様を示したが、本発明の精神および原理を損なわない範囲であれば適宜に変化させ得ることはこの技術に熟練した当業者であれば明らかなことである。次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明またはそのいかなる態様も以下に特定されるこれら実施例およびに限定されるものではない。実施例１ポリクロナール抗体の作製ヒトＮＯＳの各イソ体のアミノ末端かカルボキシ末端に擬似する限定されたアミノ酸配列を有するペプチドを調製した。各ペプチドを、ｆｍｏｃタンパク質法による固相ペプチド合成により合成した。予備処理用ＨＰＬＣを用いた標準的な手法により、固相サポート樹脂から付着した合成ペプチドを単離、精製した。それらの純度を分析用ＨＰＬＣにより分析した。１．各合成ペプチドは、抗体源を抗体をの誘発を構築するためにＥＤＡＣまたはスルホＭＢＳ合成物（chemistries）を用いて、担体タンパク質であるスカシ貝へモシアニン（ＫＨＬ）に接合した。２．各ペプチド／タンパク質接合物は、ウサギでの抗体源として用いた。２− ４のウサギグループ毎に別々の抗体源を用いて免疫した。ウサギでの抗ペプチド抗体の製造のために、以下のような標準的プロトコルで発育させたウサギを、免疫し、高めて、採血した。３．ウサギ採血のそれぞれに由来する抗血清をＥＬＩＳＡによって試験し、合成ペプチド類似体を特定する抗体を作製した。抗体源のペプチド部を特定する抗体の産生能があることがわかったこれら抗血清は、その無傷のタンパク質を認定する能力が評価された。表IIはこのような合成ペプチドの概要を示す。実施例２モノクロナール抗体の作製精製されたヒトｉＮＯＳを用いてマウスを免疫し、モノクロナール抗体のパネルを開発した。ハイブリドーマの作成、細胞クローン、モノクロナール抗体の製造には標準的技術を用いた。このような技術は“モノクロナール抗体の製造”（ Current Protocol in Immunology(1991)）と表題されたプロトコル中に記載されている。簡潔には、免疫マウスから脾臓を無菌的に取出し、脾臓細胞（splenocy tes）を単離し、ポリエチレングリコールとともにＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡでスクリーンし、ｈｉＮＯＳに対するマウスＩｇＧまたはＩｇＭを製造した。完全ハイブリッドは、特定希釈液により培養されクローンされた。クローンはＥＬＩＳＡおよびウェウタンブロット法でスクリーンした。完全ハイブリッドは培養され、冷凍保存のため液体窒素中で凍結し、培地上清としてモノクロナール抗体の製造に用いるとともに、Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス由来の腹水として用いた。さまざまなクローンによって製造されたモノクロナール抗体は、種々の方法により解析られた。ＥＬＩＳＡ、ウェウタンブロット、¹²⁵Ｉ−ｈｉＮＯＳ（Ｉ．Ｐ．）イムノプレシピテーションおよび細胞の間接的免疫蛍光染色（Ｉ．Ｆ．Ａ．）などである。またモノクロナール抗体のイソ体が分類された。表IIIにこれら結果を示す：ここで“ＮＤ”は“検出されず”を意味し、“＋”は“あり”；“−”は“なし”；および“弱”はモノクロナール抗体が高濃度であるときのみ結合したことを示す。実施例３モノクローナル抗体のエピトープマッピング実施例２の各モノクローナル抗体が、タンパク質のどの領域を認識しているのかを決定するために、ｈｉＮＯＳのアミノ酸１１５３個の全長をカバーするよう、９６個の互いに重複するペプチドを合成した。いずれのペプチドも、アミノ酸１８個の長さとし（１８マー）、カルボキシ末端アミドとして合成した。構造中の天然に生じたシステイン残基は、いずれもセリンで置換した。各ペプチドは、カルボキシ末端のペプチド以外は、隣接するペプチドと６個のアミノ酸が重複しており、カルボキシ末端のペプチドは、手前のペプチドと１１個のアミノ酸が重複していた。これらのペプチドは、モノクローナル抗体のパネルをＥＬＩＳＡ法によってエピトープ・マッピングするために使用した。各ペプチドは、一連のマイクロタイタープレートの特定のウェルを感作するのに使用した。次に、各モノクローナル抗体の培養上清あるいは腹水を、感作済みのプレートの全ウェルにそれぞれ加え、各ウェルについて、結合マウスモノクローナル抗体の有無を調べた。この一連の実験で得られた代表的な結果を、図２〜６に示し、また、下記の表ＩＶにまとめて示す。実施例４合成ペプチドを用いたエピトープ・マッピングと特異性解析モノクローナル抗体が結合することがわかった１８マーの各配列（表ＩＶのペプチドＡ３、Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１、Ｈ１）を使用して、これらの領域に関しての一連のエピトープ・マッピング用ペプチドを設計、作製した。ＢＬＡＳＴでのサーチで見つかったｉＮＯＳの相同体も、ｉＮＯＳモノクローナル抗体の特異性の解析に使用した。各１８マーのアミノ末端から所定数のアミノ酸を欠失させた４つの一連の切断ペプチド、ならびに各１８マーのカルボキシ末端から所定数のアミノ酸を欠失させた４つの一連の切断ペプチドを作成した。いずれの一連の切断ペプチドも、１８マーのカルボキシ末端あるいはアミノ末端から、アミノ酸を３つずつ順次欠失させたものである。その結果、それぞれの１８マーについて、各末端からアミノ酸が３つずつ順次短くなっていく２種の一連の切断ペプチドが得られた。表Ｖ、図７Ａ−Ｄ、図８に、作製した切断されたペプチドならびにｈｉＮＯＳのペプチド相同体を示す。このうち、ｈＩＮＯＳのペプチド相同体は、上述のコンピュータによるＢＬＡＳＴサーチでこれらの領域に対して配列相同性が見いだされた場合に、ヒトｎＮＯＳ、マウスならびにラットｉＮＯＳ、ヒトｅＮＯＳから作製したものである。表中の「＋」は正の結合を、「−」は結合しなかったことそ、「弱」は、モノクローナル抗体の濃度が極めて高かった場合にのみ結合が生じたことを示す。モノクローナル抗体が各種の切断類似体、あるいはｎＮＯＳならびにｅＮＯＳ類似体に結合する能力を、もとの９６の１８マーのスクリーニングに使用したのと同様の方法で、ＥＬＩＳＡによって調べた。Ａ−３ローカスについては、モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、ペプチドＡ−３（ＰＳ−５１０３）のみに対して強く結合し、マウス相同ｍｉＮＯＳ（２５−４２）（ＰＳ−５２４１）には弱く結合した。２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、切断ペプチドのいずれとも結合せず、ラット相同ｒｉＮＯＳ（２５−４２）（ＰＳ−５２４２）にも結合しなかった。Ａ−４ローカスについては、最初のスクリーニングで、２種のモノクローナル抗体（６Ｇ１２−Ｈ７ならびに２１Ｃ１０−１Ｄ１０）の結合が確認された。これらの抗体は、切断ペプチドに対しする特異性が互いに異なっていた。モノクローナル抗体６Ｇ１２−Ｈ７は、Ａ−４（ＰＳ−５１０４）ならびに２種の切断類似体（ＰＳ−５２６１ならびにＰＳ−５２６５）に対して強く結合し、ＰＳ−５２６２とも弱く結合した。このことから、もとの１８マーは、配列がThr Gln Asp Asp Leu Gln Tyr His Asn Leu Ser Lysであるような１２マーまでは少なくとも短縮が可能で、全タンパク質のこのペプチド類似体に対しても結合可能性が依然として維持されていることがわかる。一方、モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、もとの１８マーであるＡ−４（ＰＳ−５１０４）と、カルボキシ末端が３残基分切断されたｈｉＮＯＳ（３７−５１）ペプチド配列（ＰＳ−５２６５）のみと結合した。Ｆ６ローカスについては、モノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２は、Ｆ６（ＰＳ− ５１６６）ならびにその切断類似体のうちの３つ、すなわちＰＳ−５２２２、ＰＳ−５２２６、ＰＳ−５２２７と結合し、ＰＳ−５２２８と弱く結合し、ヒトｅＮＯＳ（８０６−８２４）（ＰＳ−５２２１）とは全く結合しないことがわかった。切断ペプチドで得られた結果からすると、エピトープは、Val Gln Gly Ile Leu Glu Arg Val Valの配列に含まれているはずである。Ｇ１１ローカスについては、最初のスクリーニングで、２種のモノクローナル抗体１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４の結合が見いだされた。これらの２種を、切断ペプチドならびに２種の相同体との結合について調べたところ、双方のモノクローナル抗体について似たような認識パターンが認められた。双方とも、予測通り、Ｇ−１１（Ｐ４１８３）と強く結合し、また、双方とも、ヒトｎＮＯＳ（１２５６−１２７３）（ＰＳ−５２０１）を認識したものの、結合は、Ｇ− １１よりはるかに弱かった。また、双方とも、一連のアミノ末端切断ペプチドの最初のものであるＰＳ−５２０３を認識したものの、１Ｅ８−Ｂ８の結合は、２Ａ１２−Ａ４について観察された結合より、はるかに弱かった。最後に、Ｈ１ローカスについては、モノクローナル抗体２４Ｂ１０−２Ｃ７がＨ１（ＰＳ−５１８５）と結合することがわかっていた。このモノクローナル抗体は、ヒトｅＮＯＳ相同体ならびにｎＮＯＳ相同体であるＰＳ−５２８１もＰＳ −５２８２も認識しなかったものの、一連のアミノ末端切断ペプチドの最初の２つであるＰＳ−５２８３とＰＳ−５２８４に強く結合した。モノクローナル抗体２４Ｂ１０−２Ｃ７は、次に短いアミノ末端切断ペプチドであるＰＳ−５３８５にも弱く結合した。こうした結果から、このモノクローナル抗体が、ペプチドＨ −１（ＰＳ−５１８５）のカルボキシ末端側に位置する配列を認識していることがわかる。実施例５試料中のｈｉＮＯＳの量を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡｈｉＮＯＳ用のサンドイッチＥＬＩＳＡを開発する最初の試みでは、「捕獲用」の抗体として、ポリクローナルなウサギ抗ｉＮＯＳ抗血清を使用した。この方法では、アフィニティ精製したヤギ抗ウサギＩｇＧを１μｇ／ウェル／１００μ ｌ使用して、マイクロタイタープレートを感作した。次に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロックした。ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体（ｈｉＮＯＳのカルボキシ末端に対して特異的なもの）を加え、結合させた。この抗体は、試料中のｈｉＮＯＳに結合する「捕獲用」抗体として使用した。表ＩＩＩのパネルの各種マウスモノクローナル抗体が試料中のｈｉＮＯＳを検出および／または定量する能力について調べた（図９）。結果からわかるように、このアッセー方法では、ＩＥ８−Ｂ８、２１Ｃ１０−１Ｄ１０、２Ａ１−Ａ４、７Ｄ８ −Ｂ３がうまく作用することがわかった。しかし、広範な解析を必要とするポリクローナルなウサギ抗ペプチド抗体を繰り返し作製しなくてもすむように、ｈｉＮＯＳ用に作製した表ＩＩＩのパネルの各種マウスモノクローナル抗体を、「捕獲用」抗体と検出用抗体の両方に使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを設計した。このアッセー方法では、アフィニティ精製したヤギ抗マウスＩｇＧ_2A 、またはＩｇＧ_2B、ＩｇＭを使用してマイクロタイタープレートを感作した。次に、「捕獲用」モノクローナル抗体として、２Ａ１−Ｆ８、６Ａ１２−Ａ１２、２１Ｃ−１Ｄ１０、またはＩｇＭクラスのモノクローナル抗体のいずれかを加えた。次に、ＢＳＡでプレートをブロックし、ｈｉＮＯＳを含有することがわかっている試料を、マイクロタイタープレートに加えた。その後、これらを十分洗浄した。検出用のモノクローナル抗体には、「捕獲用」とは異なったイムノグロブリンクラスの抗体を使用した。ＩｇＧ_2Bであるモノクローナル抗体２１Ｃ１０ −１Ｄ１０を「捕獲用」抗体として用いた場合には、図１０に示すように、マウスＩｇＧ₁モノクローナル抗体、たとえばＩＥ８−Ｂ８、２Ｄ２−Ｂ２を検出用抗体として使用した。「捕獲用」モノクローナル抗体をＩｇＭクラスの抗体とした場合には、検出用抗体として、マウスのＩｇＧクローンのいずれもが使用可能であり、こうした抗体としては、図１１に示すＩＥ８−Ｂ８（ＩｇＧ₁）、２Ｄ２−Ｂ２（ＩｇＧ₁）、２１Ｃ１０−１Ｄ１０（ＩｇＧ_2B）がある。このように、表ＩＩＩのモノクローナル抗体のパネルを使用すると、モノクローナル抗体にもとづいた抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを作成することができる。ｈｉＮＯＳに対して作製されたマウスモノクローナル抗体パネルの各種イムノグロブリンクラスのモノクローナル抗体を用いることによって、ポリクローナルな「捕獲用」抗体を使用しなくてもすむようになる。実施例６ウェスタン免疫ブロット表ＩＩＩのモノクローナル抗体のパネルを、サンドイッチＥＬＩＳＡでの使用についてだけでなく、ウェスタン免疫ブロット法で試料中のｈＮＯＳを検出する能力についても調べた。試料を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動して、タンパク質を分子量に応じて分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＰＢＳ／トゥイーン２０バッファーで１：４に希釈したヤギ練乳で膜をブロックした。一次抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体を結合させ、次に、図１２に示すように、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して膜を発現させた。モノクローナル抗体は、サイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導するとｉＮＯＳを含有するようになることが報告されている細胞の細胞ライセートを使用したウェスタンブロットについても調べた。細胞は、米国メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から株化細胞Ａ−１７２ならびにＲＡＷ２６４．７を購入し、細胞の増殖後、サイトカイン／ＬＰＳ混合物による誘導の前ならびに後に回収した（図１３、図１４）。この細胞毒性混合物は、前出のゲラーらの文献に、サイトカイン／ＬＰＳ混合物として記載されている。細胞ペレットは、細胞の回収後にＰＢＳで十分に洗浄して、余分のタンパク質を除去した。細胞は、凍結解凍を２回繰り返し、超音波処理を行うことによって溶解させた。細胞ライセートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーで１：２に希釈し、１０分間煮沸した。試料を、上述のようにして、７．５％のゲルで電気泳動した。非誘導細胞がｉＮＯＳを含有していなかったのに対し、サイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導した細胞では、１３０ｋｄのバンドが認められた。このことから、サイトカイン／ＬＰＳ混合物によってｉＮＯＳが誘導されており、表ＩＩＩのモノクローナル抗体によって、未知試料中のｉＮＯＳをウェスタンブロット法で検出できることが示された。これらの誘導細胞のライセートは、ウェスタン免疫ブロット法によって調べただけでなく、実施例５のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によっても、ｉＮＯＳを検出および／または定量できるかどうかについても調べた。図１３および１４に示すこのＥＬＩＳＡ試験の結果にはっきり示されているように、非誘導細胞にｉＮＯＳが含まれていなかったの対して、サイトカイン／ＬＰＳ混合物による誘導後は、実質的な量のｉＮＯＳが含まれていた。実施例７誘導細胞の免疫蛍光染色各種のモノクローナル抗体が、ｉＮＯＳを産生するよう誘導を行った細胞中でｉＮＯＳと結合する能力を、３種の異なる細胞、すなわち、ヒト膠芽腫株化細胞Ａ−１７２、マウスマクロファージ株化細胞ＲＡＷ２６４．７、正常ヒト単球について調べた。細胞は、正常培養液中で２日間培養し、サイトカイン／ＬＰＳ混合物（ＣＭ）で４０時間処理することによってｉＮＯＳを産生するよう誘導した。この処理の後に、細胞を２種の方法、すなわち細胞溶解に適した方法、ならびに免疫染色法に適した方法で処理した。溶解させる細胞は、培養フラスコから剥がし、５回洗浄し、少量のＰＢＳ中で凍結させて溶解させた。このライセートは、実施例５および６に記載したウェスタン免疫ブロットならびにサンドイッチＥＬＩＳＡでの試験に使用した。免疫染色に用いる細胞は、４回洗浄し、７０％あるいは１００％のアセトンで固定した。これらの細胞を、一次マウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体と６０分間反応させ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭと反応させた。細胞は、落射蛍光顕微鏡によって観察、撮影した。図１５〜１７に、誘導済みのＡ−１７２細胞について、表ＩＶの１Ｅ８−Ｂ８、２Ａ１２−Ａ４、２Ｈ１１−Ｄ１１をそれぞれ用いた場合に観察された間接免疫蛍光染色パターンを示す。図１８と図１９に、固定したＲＡＷ２６４．７について、表ＩＶの１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４をそれぞれ用いた場合に観察された間接免疫蛍光染色パターンを示す。このパターンは、ウェスタン免疫ブロット法で得られた結果と似ている。つまり、これらの２種のモノクローナル抗体は、マウスｉＮＯＳと交叉反応しうるということになる。図２０と２１に、表ＩＶの２種のマウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体、１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４を、それぞれ、誘導済みの正常ヒト単球に使用することによって得られた間接免疫染色の結果を示す。単球は、密度勾配遠心法によって正常なヒト血液から単離したもので、その際には、米国ニューヨーク州ウェストベリー（We stbury）のアキュアト・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Accurate Chemical and Scientific Corp）から入手したオプティプレップ（Optiprep）を、アプリケーション・シート２．３．に詳述された製造業者の指示にしたがって使用した。これらの結果からわかるように、これらのマウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体は、正常ヒト細胞ならびに組織で誘導されたｈｉＮＯＳを認識し、結合することができる。実施例８モノクローナル抗体がｈｉＮＯＳの酵素活性を阻害する能力についての試験基質と補助因子の存在下で生成した窒素化合物（nitrite）の量を測定することによって、ｈｉＮＯＳの酵素活性を測定した。１３種の異なった抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体を、ｈｉＮＯＳの活性を阻害する能力について調べた。調べたいずれのモノクローナル抗体も、ディングら（Ding et al.，"Macrophage Dea crivity Factor and Transforming Growth Factors-beta 1，beta 2，and beta 3Inhiblt Induction of Macrophate Nitogen Oxide Synthesis by IFN-gamma 1" ，Journal of Immunology，Vol．145（1990））ならびにナカネら（"Cloned Hum an Brain Nitric Oxide Syntase in Highly Expressed in Skeletal Muscle"，F EBS Letters，vol．316（1993））に記載されたグライゼ（Greise）比色分析では、酵素の活性を阻害しなかった。実施例９アッセイ用反応物質の調製実施例１の低温保存細胞からの新たな腹水調製物を用いて、実施例２の手順を繰り返した。この手順は、実施例２の最初の調製から約１２ヶ月後に実施したものである。下記に示す表ＶＩの結果は、実施例２のデータを補強するものであった。表ＶＩの競合結合ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートにコーティングした合成ペプチドと、溶液状態の標準あるいは未知物質のｉＮＯＳとに対する抗体の結合の競合に基づくものである。本発明のモノクローナル抗体の多数が、特異的なタンパク質の直鎖状合成ペプチド類似体と結合したことが見いだされたのは当然かもしれない。モノクローナル抗体の大半は、生理学的試料中のｉＮＯＳを測定するうえで十分な感度を有していなかった。しかし、１種のモノクローナル抗体、すなわち２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、生理学的試料のｉＮＯＳの測定に使用しうる感度を有していた。プレートをコーティングするペプチドをもっと長い合成ペプチドとし、ＡＢＣ増幅を行ってＥＬＩＳＡを「微調整」することにより、感度を５０〜６０倍向上させることができた。このアッセイは、臨床検査技師にとって許容できるものであれば、数多くの態様のいずれによって実施してもよい。表ＶＩに記載した競合結合ＥＬＩＳＡの最低感度は、２０フェムトモルで、完了に３時間を要する。さらにプレインキュベーションを行った場合には、感度が２〜３倍向上し、理論上、最低感度が６〜１０フェムトモルの範囲のＥＬＩＳＡが実現される。実施例１０免疫蛍光アッセイ細胞の間接免疫蛍光染色を、ハイマーら（Heimer and Taylor，J．Clin．Path .，27(1974)，p．254）ならびにジョンソンら（Johnson et al.，J．Immunol.， Meth．55(1982)，p．231）を参考として、以下の方法によって行った。細胞は、１分ずつ３回、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）をとりかえて洗浄し、その後すばやく水で洗浄し、十分に水をきった。ガラス上で増殖させた細胞は１００％アセトンで固定し、プラスチック上で増殖させた細胞は、８０％アセトン／２０％水で固定した。固定には室温で１０〜１５分を要した。試料を風乾し、２０℃ で保存した。モノクローナル抗体を、ＰＢＳで１：５００／１：２，５００／１：１２，５００に希釈した培養上清として加えた。上清あるいは腹水は、室温で直接固定細胞に加え、３７℃で時間、あるいは室温で２時間培養した。次に、各サンプルをＰＢＳ中で１分ずつ４回洗浄し、水を切った。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス二次抗体を、ＰＢＳで１：１２０に希釈したハイクロン（hyclone）とともに加えた。試料を、３７℃で０分、あるいは室温で４５分インキュベートした。細胞は、再度、ＰＢＳ中で１分ずつ３回洗浄し、次に水で洗浄して塩を取り除いた。水を切った後、退色を低減させるためにＤＡＢＣＯを含有するグリセリン系のマウンティングメジュームを使用して、カバースリップをマウントした。ＦＩＴＣ用の励起・発光波長を備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、免疫蛍光染色を観察した。この免疫蛍光アッセイでは、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２ −Ｂ２を使用した。染色は、Ｆ６ペプチド（ＰＳ−５１６６）で特異的にブロックした。ｉＮＯＳは多種の細胞で誘導され、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２−Ｂ２によって検出された。誘導プロセスの結果、強い免疫蛍光を発する細胞が得られた。ラットでのｉＮＯＳの誘導を行った場合には、固定組織片が、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２−Ｂ２によって（蛍光でなくＤＡＢを使用して）特異的に免疫染色されることも見いだした。この免疫染色は、適切なペプチド（Ｆ６＝ＰＳ−５１６６）によってのみブロックが可能であった。このアッセイは、現在の手順では、間接免疫蛍光法を使用しているので９０分を要する。直接法を使用すると、所要時間が３０分以下まで短縮されるはずである。図２２〜２９は、実施例９の反応物質を使用して試料を間接免疫蛍光染色したものである。このアッセイについては、特定の培養条件以外ではｈｉＮＯＳ酵素を産生しないＡ−１７２細胞（ヒト膠芽腫の株化細胞）のライセートを使用して実証した。免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング、ポリクローナル抗体を使用したＲＩＡ、モノクローナル抗体とペプチドを使用した競合結合ＥＬＩＳＡによって、これらの対照にｈｉＮＯＳが存在していないことが示された。また、ｈｉＮＯＳが、サイトカインとＬＰＳの混合物によって誘導されることも確認された。実施例１１競合結合ＥＬＩＳＡ試料を競合結合ＥＬＩＳＡで調べた。プレートは一晩にわたって感作させ、４回洗浄し、２％正常ウマ血清（ＮＨＳ）を加えたＰＢＳ（ブロック溶液）で３時間にわたってブロックした。２倍の濃度の試料を、１５μｌのブロック溶液とともに、各プレートに加えた。２倍濃度の２１Ｃ１０−１Ｄ１０腹水を１５μｌの量のＰＢＳに希釈した溶液も、２％ＮＨＳならびに０．１％トウイーン２０とともに加えた。試料を室温で３０分インキュベートした。０．１％トゥイーン２０を加えたＰＢＳでＡＢＣ錯体を１：１２０の濃度に希釈した溶液のプレインキュベーションを、室温で１時間行った。３０分後に、ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、さらに２回洗浄した。２％のＮＨＳおよび０．１％の結晶ＢＳＡを加えたＰＢＳで１：４８０に希釈したｂｉｏｔ-ＨＭＩｇＧ１００μｌを、室温で３０分にわたって加えた。プレートを再度４回洗浄した。ＡＢＣ錯体を、等量のＰＢＳならびに０．１％トゥイーン２０で希釈した。このＡＢＣ混合液に、２％ＮＨＳと０．１％結晶ＢＳＡを加えた。プレインキュベートしておいたＡＢＣ溶液１００μｌ／ウェルを室温で加え、３０分間静置した。試料を８回洗浄した。呈色反応を、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤならびに０．０８％の過酸化水素を加えた１０ｘのリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中で、３７℃にて５５分間実施した。本発明のモノクローナル抗体の多数が、当該タンパク質の特異的な直鎖状合成ペプチド類似体と結合した。そのモノクローナル抗体と合成ペプチドのペアを調べたところ、モノクロナール抗体の１つである２１Ｃ１０−１Ｄ１０が、ヒトｉＮＯＳの測定に使用しうることを見いだした。プレートをコーティングするペプチドをもっと長い合成ペプチドとし、ＡＢＣ増幅を行ってＥＬＩＳＡを「微調整」することにより、感度を５０〜６０倍向上させることができた。このＥＬＩＳＡは、測定では、完了に３時間を要した。さらにプレインキュベーションを行った場合には、感度が２〜３倍向上し、ＥＬＩＳＡの最低感度が６〜１０フェムトモルの範囲となるはずである。図３０および図３１は、本実施例のＥＬＩＳＡアッセイをｉＮＯＳならびにｈｉＮＯＳの定量に用いたものである。図３２では、Ａ４ペプチドのかわりにＡ３＋Ａ４ペプチドを使用することによって本実施例のアッセイの感度を増大させている。このアッセイについては、特定の培養条件以外ではｈｉＮＯＳ酵素を産生しないＡ−１７２細胞（ヒト膠芽腫の株化細胞）のライセートを使用して実証した。免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング、ポリクローナル抗体を使用したＲＩＡ、モノクローナル抗体とペプチドを使用した競合結合ＥＬＩＳＡによって、これらの対照にｈｉＮＯＳが存在していないことが示された。また、ｈｉＮＯＳが、サイトカインとＬＰＳの混合物によって誘導されることも確認された。実施例１２Ａ４ローカスについての２１Ｃ１０−１Ｄ１０によるエピトープ・マッピングモノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０によるエピトープ・マッピングを、ｈｉＮＯＳのＡ４ローカスのアミノ末端についてさらに実施した。表ＶＩＩに、結果を示す。図３３は、マウスＩｇＧ₁モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０、Ａ４ペプチド（ＰＳ−５１０４）、実施例４の表Ｖのカルボキシ末端切断ペプチド（ＰＳ−５２６５〜ＰＳ−５２６８）を使用した「第２工程」の競合結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。表ＶＩＩＩに、ペプチドＰＳ−５２６１〜ＰＳ−５２６９のエピトープ・マッピングを示すが、ここでは、図３３にマッピングしたＰＳ−５２６５〜ＰＳ−５２６８ペプチドが目立っている。標準のＡ４ペプチド（ＰＳ−５１０４）と、表ＶＩＩの一連のアミノ末端延長ペプチド（ＰＳ−５２１１〜ＰＳ−５２５７）をマウスＩｇＧ₁抗体と組み合わせて使用したところ、エピトープがＰＳ−５２１３のVTQDDLQであることがわかった。この「第３工程」のエピトープ・マッピングを図３４のグラフに示す。実施例１３Ｆ６ローカスについての２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６によるエピトープ・マッピングモノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６によるエピトープ・マッピングを、Ｆ６ローカスの中央領域についてさらに実施した（第３工程）。表ＩＸに、このマッピングの結果を、使用したペプチドとともに示す。表には、マウスモノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６を、Ｆ６ローカスの中央領域をマッピングする一連のペプチドとともに使用することによって競合法ＥＬＩＳＡで得られた結果も示す。また、表ＩＸには、これらの双方の抗体のエピトープの配列がＶＱＧＩＬＥＲＶ（ｈｉＮＯＳ７８４−７９１）であることも特定されている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONImmunoassay using monoclonal antibodies reactive to human iNOS Cross-reference of related applications This application is filed under Application No. 08 / 634,332, previously filed on April 12, 1996. It is a continuation-in-part application of the request. Background of the Invention This application also describes an immunoassay for the detection and / or quantification of human iNOS. Or new and useful monoclonal antibodies that can be used in other techniques. I do. In recent years, nitrogen oxides (NO) have been effector and / or regulatory molecules Has been recognized. For example, recently a source of endothelium-dependent relaxation in the vasculature Focusing on the effect of NO on the activation of soluble guanylate cyclase There are research fields. Rangassmy et al., American Physiological Society (1994). Immunohistochemical demonstration that nitric oxide plays a paracrine role in function " Published papers recognize this effect in bronchial vessels. In this regard, researchers have suggested that NO is a new neurotransmitter in the central and peripheral nervous system. It has been found that it acts as a substance. In addition, activated macro fur Dicytotoxicity is activated by a host defense mechanism based on the reference number It was found that NO is now biosynthetically induced in mammalian systems Is believed to be the smallest effector molecule identified. Coshland (kosh land, Science Magazine, Volume 258 (December 1992)) The cited references in the published article detail the biological significance of NO. Laffira et al., Hepatology, Vol. 22, No. (1995). Neutrophil leukocytes and mononuclear cells from patients with cirrhosis and hyperconstrictive circulation Paper entitled "Increasing Nitrogen Oxide Production" and Geller et al. , Proc. Natl. Sci. USA, Vol. 90 (April 1993)) "Induction from human hepatocytes. Entitled “Molecular Cloning and Expression of Functional Nitric Oxide Synthase” It describes the activity of nitric oxide synthase (NOS) and nitric oxide in the gut. The latter document provides an amino acid sequence depicting human-induced NOS. one In general, these articles have been associated with iNOS induction and subsequent NO overproduction. To describe cirrhosis with associated activity of hepatocytes inflamed and destroyed by the liver I have. Organ transplant rejection can be caused by activated mononuclear cells, macrophages, and / or Alternatively, neutral neutrophilic leukocytes remain active and are mediated by endogenous host mechanisms, and iNOS is not It is caused by an action that inevitably induces the production of NO. On the other hand, especially iNO S, thereby inhibiting the production of NO, and at the same time the NOS (n NOS) or endothelial (eNOS), the other two isoforms of this enzyme (isofroms ) Are also being developed. Conger et al., The Jouynal of Clinical Investigation, Inc. Endothelium in Postischemic Acute Renal Failure in Rats, Vol. 96, July 1995). Increased activity of nitric oxide synthase despite no response to dependent vasodilators " The title paper recognizes the activity of nitric oxide in rat kidney damage. Wildhirt et al., Cardiovascular Reseach, Vol. 29 (1995) )) “Immunohistochemistry of nitric oxide synthase isoenzyme in myocardial infarction” The entitled article describes L-Alka in the injured myocardium of a heart-injured rabbit. Conversion of ginine to citrulline and nitrogen oxides has been observed. The NO biosynthetic pathway has been extensively experimented in recent years. Recently, NO producing iso A family of enzymes was found to exist. Sessa, J. Vasc. Res . (1994)), the “protein family of nitric oxide synthases” NOS isoenzyme is recognized. All three NOS isozymes are L-arginine and Catalyzes the conversion of oxygen and oxygen to citrulline and NO. In addition, this catalyst Five common elements required by the conversion were found. These are calmodulin, NAD PH, FAD, FMN and tetrahydrobiopterin. Generally a synthetic enzyme The three isoforms of (NOS) are type 1 (nNOS), which are eosinophilic isoforms; Type 2 (iNOS) which is an isomeric isoform; type 3 (eNOS) which is an endothelial isoform )are categorized. nNOS and eNOS are essentially located in the cells in which they reside. Is expressed in iNOS is essentially not expressed, but some cytokines And lipopolysaccharide (LPS) to some extent. Also, nNOS is It has also been found to act as a transmitter. In addition, iNOS is an indigenous host and Related to cell immunity. ENOS is also used for blood pressure (vascular tone) and blood flow control. Involve in trolls. Three (3) NOS yeasts The isoforms are the true isoenzymes because they are nearly 60% sequence homologous. Classified into categories. iNOS has been implicated in certain pathological disease states. Weigert et al. (We igert et al., Journal of the American Society of Nephrology, Volume 5, No. 12 (1995)), "Induced nitric acid in the aorta of the endotoxemic rat. "Expression and selective inhibition of chloride synthase" describes iNOS with respect to septic shock. We are examining the importance of Especially when sepsis and septic shock occur, Large amounts of LPS and cytokines from Gram-negative bacteria are found in mononuclear cells, macrophages. Physiologically induces iNOS expression in neoplasms, neutrophils, hepatocytes, or other cell bodies And induces overproduction of NO. Then also extensive vasodilation of the systemic system Causes the detrimental effects associated with sepsis and septic shock. Development of monoclonal antibodies against NOS and biopharmaceuticals for such antibodies It has been reported by several research groups to be used for verification. Hattori et al. (Hattori et al., Hybridoma, Vol. 12, No. 6 (1993)) An article entitled "Stabilization of Nitric Oxide Synthase by Antibodies" Monoclonal Antibody Against Rat iNOS Derived from Peritoneal Macrophages Talking about body panels. There is an inactivation of the enzyme activity of rat iNOS There are no monoclonal antibodies that stabilize the enzyme, but no monoclonal antibodies that stabilize the enzyme. Some have been reported. (Brain by Gelea et al., FASAB journal, Vol. 9, (December 1995)) "Transient expression of calcium-dependent nitric oxide synthase in developing blood vessels" The title article includes monoclonal antibodies raised against rat iNOS. To detect protein strips. Further ahead Re As mentioned above, ngasamy's dissertation includes a monochrome version developed for bovine nNOS. The analysis and development of the nal antibody has been described. By urethane immunoblot This monoclonal antibody was used for bovine nNOS, bovine eNOS and mouse iNOS. It was found to recognize. Identical monoclonal antibodies are immunohistochemical Recognizes rat nNOS, rat eNOS and rat iNOS I understood. Fujisawa et al., Journal of Neurochemistry, 64 (1995) Entitled "Inducible nitric oxide synthase in human glioblastoma cell line" The published article includes iN in human glioblastoma cell line A-172 cells. Describes OS triggering. Tracy et al., American Physiological Society, Rapid Communication (1994) ) Entitled "Immunochemical detection of inducible NO synthase in human lung" The article describes iNOS induction in RAW 264.7 macrophages. You. Cultured against mouse iNOS derived from induced RAW 264.7 cells Polyclonal antibodies were used to study iNOS expression in human lung tissue . Pollock et al., American Physiological Society (1993). Analysis and localization of endothelial nitric oxide synthase using lonal antibody ” A model developed for eNOS that does not cross-react with nNOS or iNOS Describes the analysis and development of a nocurnal antibody panel. U.S. Pat.Nos. 4,376,110 and 4,879,219 use monoclonal antibodies. And immunoassays for detecting antibody sources. Transd Laboratory, Lexington, Kentucky (Transd ution Laboratories) contains various rat NOS isoforms Several mouse monoclonal antibodies raised against the fragment were presented. Have been. Santa Cruz Biothechnology “ The brochure labeled "Signal Intermediate-NOS" contains various NOS isoforms. Polyclonal anti-peptide antibodies that identify the body have been presented. Boehringer Mannheim Corpor ation), a brochure named “Isostrip” Mouse immunoglobulin subclass and simplified using treated strips Classifies mouse monoclonal antibodies for detection of κ and λ light chains Kits are illustrated. For human iNOS used in an immunoassay to identify human iNOS The development of monoclonal antibody panels has made significant advances in the biomedical field. I will.Disclosure of the invention According to the present invention, a novel monochromator useful for identifying human iNOS A panel of antibody antibodies has been developed and immunized to identify human iNOS It was proved to be useful for a biological assay (immunoassay). These monochrome The nal antibody is analyzed by various standard techniques. In addition, it reacts to human iNOS and is a specific linear synthetic peptide analog of protein A variety of assays have been developed using this monoclonal antibody that also binds. And For example, test methods such as competitive binding ELISA and immunofluorescence assay (IFA) have been developed. . Such methods further include western blots, dipsticks, Fluorescence Polarization, Enzyme Capture and Radioimmunoassay A (RIA) was developed. The test was performed in a mouse model of human septic shock. Performed in human specimens of septic shock and septic shock and demonstrated in a controlled environment . In the present invention, several specific regions of human iNOS were used. That is, human i NOS A3, A4, A3 + A4, F6, G11 and / or H1 locus ( locus). Specific binding pairs and bindings in these loci And specific binder molecules have also been developed. For example, the monoclonal antibody described above Is used as a specific conjugate component. Of course, polyclonal antibodies, Gonucleotide, polymer imprinted as artificial antibody, fur exhibiting binding site Di and their analogs can also be used for this purpose. In the present invention, , May be used in combination for testing. The peptides and peptide analogs of the iNOS region listed above can be used directly or indirectly. Specific for competitive binding, displacement or other forms of testing and test kits It can be used with a specific binding pair partner or with a specific binding reagent molecule. Wear. In any of these tests and test kits, iNOS quantitative or Can be used for qualitative analysis. Such tests are clinical diagnostics Is also good. Further, peptides and peptide analogs such as those listed below provide satisfactory results. It may be an active region or an active part if the result is obtained. Especially 21C10-1D10 Epitope maps for clones identified as, 2D2-B2, and 5B3-E6. Ping was done. However, synthetic peptides, recombinant peptides, Protein, fusion protein, fusion peptide, protein expression phage, peptide development Current phage, peptide library, peptide analog library, and the like These homologs can be used, wherein the active ingredient is A3, A4 of human iNOS. , A3 + A4, F6, G11 and / or H1 locus homologues It should be noted. Furthermore, in the tests of the present invention, the region of human iNOS was Can be partially combined. For example, the F6 region contains human iNO in the assay reagent. It can bind to a narrow portion of the H1 region of S. The tests of the present invention have been used in human and mouse models for sepsis, septic shock, Myocardial infarction, transplant rejection of tissues in organs such as werewolf, psoriasis, multiple sclerosis Monitoring for "flare ups" of certain autoimmune diseases, such as Detects human INOS in cells and tissues for various pathological conditions Can be measured. In particular, the IFA and competitive binding ELISA test methods Some such tissues were tested. However, as mentioned above, the present invention Other assays that are essential can also be used. Competitive binding ELISA In some tests, such as sensitized by using a combination of peptides . For example, the peptide against A3 + A4 is 4 times higher than the test against A4 alone. Sensitization was seen. When avidin-biotin complex was used, The sensitivity was sensitized 12 to 15 times. When combined, the sensitivity is 48 to 60 times Become higher. New and useful methods for immunoassays and immunoassay components have been developed. What is shown will be clear. An object of the present invention is to provide hiNs that can be used as a clinical test method for hiNOS. The development of an immunoassay using a monoclonal antibody specific for OS. Another object of the present invention is to provide a separate, specific for the three (3) isoforms of hiNOS. To develop a panel of polyclonal rabbit anti-peptide antibodies. Still another object of the present invention is to provide a monoclonal antibody of the present invention that is homologous to the hiNOS region. To produce a peptide sequence that binds to the antibody. A further object of the present invention is to specifically bind in response to human iNOS protein. Perform immunoassays using substances that are uniformly present in all immunoassay methods. It is to provide a method that can be performed. Another object of the invention is to specifically bind to a homolog of the human iNOS protein, Immunoassay using a substance indicating the presence of human iNOS protein in a sample It is to provide. It is a further object of the present invention that the region homologous to hiNOS The sequence of the cleavage peptide that binds to the antibody. Another object of the present invention is to provide a human antibody for testing the specific properties of a monoclonal antibody. The purpose is to provide a homologous peptide derived from a protein other than iNOS. Yet another object of the invention is to analyze a panel of monoclonal antibodies of the invention, The purpose is to identify their use in various assays and methods. The present invention is particularly related to the specific features and aspects of the present invention set forth herein. It has other objectives and effects.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows several monoclonals of the entire panel of monoclonal antibodies of the invention. 5 is a sequence listing of five amino acid sequences showing a region of hiNOS to which a nal antibody binds. You. FIG. 2-6 shows the results obtained using the monoclonal antibody of the present invention as shown in Example 3. 1 is a mapping of a microtiter plate that has been physiologically tested. FIGS. 7A-D are for epitope mapping of the monoclonal antibodies of the present invention. It is a sequence listing of peptide sequences that can be used. FIG. 8 will be used to determine the specific properties of the monoclonal antibodies of the present invention. 2 is a sequence listing of peptide sequences. FIG. 9 shows a polyclonal rabbit anti-peptide antibody and four mouse monoclonals. Graph showing a sandwich ELISA for measuring hiNOS using a nal antibody It is. FIG. 10 shows the mouse IgG2b monoclonal antibody 21C10-1D10 and two mice. IgG₁Sandwich EL for measuring hiNOS using monoclonal antibodies It is a graph which shows ISA. FIG. 11 shows mouse IgM monoclonal antibody 7D8-B3 and three mouse IgGs. Fig. 4 shows a sandwich ELISA for measuring hiNOS using a monoclonal antibody. This is a graph. FIG. 12 shows four primary monoclonal antibodies and HRP-conjugated goat anti-ma Enlarged photo of a urethane immunoblot of hiNOS using a mouse IgG secondary antibody. It is. FIG. 13 shows mouse IgM monoclonal capture antibody 7D8-B3 and mouse IgG.₁ Uninduced or induced A-172 cell lysate using monoclonal detection antibody 1E8-B8 It is a graph which shows the sandwich ELISA which measures hiNOS in. FIG. 14 shows mouse IgM monoclonal capture antibody 7D8-B3 and mouse IgG.₁ Uninduced or induced RAW 264.7 cell lysis using monoclonal detection antibody 1E8-B8 It is a graph which shows the sandwich ELISA which measures iNOS in a disassembly. FIG. 15 shows mouse IgG₁Of A-172 cells induced by monoclonal antibody 1E8-B8 It is a x1600 magnification photograph showing indirect immunofluorescence staining. FIG. 16 shows mouse IgG₁Of A-172 cells induced by monoclonal antibody 2A12-A4 It is a x1600 magnification photograph showing indirect immunofluorescence staining. FIG. 17 shows A-172 cells induced by mouse IgM monoclonal antibody 2H11-D11. It is a x1600 magnification photograph showing indirect immunofluorescence staining. FIG. 18 shows mouse IgG₁RAW264.7 cells induced with monoclonal antibody 1E8-B8 1 is an enlarged photograph at × 1600 magnification showing indirect immunofluorescence staining of a vesicle. FIG. 19 shows mouse IgG₁RAW264.7 induced with monoclonal antibody 2A12-A4 1 is an enlarged photograph at × 1600 magnification showing indirect immunofluorescence staining of cells. FIG. 20 shows mouse IgG₁Human mononuclear cells induced by monoclonal antibody 1E8-B8 1 is an enlarged photograph at × 1600 magnification showing indirect immunofluorescence staining of the present invention. FIG. 21 shows mouse IgG₁Human mononuclear cells induced by monoclonal antibody 2A12-A4 1 is an enlarged photograph at × 1600 magnification showing indirect immunofluorescence staining of the present invention. FIG. 22 shows mouse I peritoneal lavage cells of mouse I 16 hours after induction of lipopolysaccharide. gG₁Indirect immunofluorescence staining of iNOS using κ monoclonal antibody 5B3-E6 It is an enlarged photograph of x800 magnification shown. FIG. 23 shows mouse I peritoneal lavage cells of mouse I 16 hours after induction of lipopolysaccharide. gG₁Indirect immunofluorescence staining of iNOS using κ monoclonal antibody 2D2-B2 It is an enlarged photograph of x800 magnification shown. FIG. 24 shows mouse I-forming cells of mouse membrane-forming cells 12 hours after induction of lipopolysaccharide. gG₁Indirect immunofluorescence staining of iNOS using κ monoclonal antibody 5B3-E6 It is an enlarged photograph of x800 magnification shown. FIG. 25 shows mouse I of mouse skin-forming cells 12 hours after induction of lipopolysaccharide. gG₁Indirect immunofluorescence staining of iNOS using κ monoclonal antibody 2D2-B2 It is an enlarged photograph of x800 magnification shown. FIG. 26 shows mouse Ig of human A-172 cells 40 hours after induction of CM / LPS. G₁Indirect immunofluorescence staining of hiNOS using κ monoclonal antibody 5B3-E6 It is an enlarged photograph of x1600 times shown. FIG. 27 shows mouse Ig of human A-172 cells 40 hours after induction of CM / LPS. G₁Indirect immunofluorescence staining of hiNOS using κ monoclonal antibody 2D2-B2 It is an enlarged photograph of x1600 times shown. FIG. 28 shows a mouse mammary RAW 264.7 cell 40 hours after induction of CM / LPS. Mouse IgG₁Indirect immunofluorescence of iNOS using the kappa monoclonal antibody 2D2-B2 It is a x1600 magnification enlarged photograph which shows dyeing | staining. FIG. 29 shows mouse Ig of the film forming cells obtained from the human sepsis patient (No. 2). G₁Indirect immunofluorescence staining of hiNOS using κ monoclonal antibody 2D2-B2 It is an enlarged photograph of x800 magnification shown. FIG. 30 shows mouse IgG₁CM / LP using monoclonal antibody 21C10-1D10 Cell lysis obtained from A-172 and RAW 264.7 cells 40 hours after induction of S FIG. 4 is a graph showing a competitive binding ELISA for quantifying iNOS in a product. FIG. 31 shows mouse IgG₁3 humans using monoclonal antibody 21C10-1D10 Hi in cell lysates obtained from whole blood film-forming cells of patients with septic shock Figure 4 is a graph showing a competitive binding ELISA for quantifying NOS. FIG. 32 shows mouse IgG₁Monoclonal antibody 21C10-1D10 and amino acid 1 Amino acid A3 + A4 peptide P of length 30 compared to eight A4 peptides PS-5104 HiNOS competitive binding ELISA in ascites diluted in 4 ways using S-5251 4 is a panel of four graphs showing sensitization. FIG. 33 shows mouse IgG₁Monoclonal antibody 21C10-1D10, A4 peptide (PS- 5104) and antibody determinants (epitopes) against the amino-terminal region of A4 locus Carboxy-terminal truncated peptides in Table V to determine the position of the peptide (PS-5265 to PS-5268) 5 is a graph showing competitive binding ELISA using FIG. 34 shows mouse IgG₁Monoclonal antibody 21C10-1D10, reference A4 peptide (PS-5104) and in Table VII where the antibody epitope is PS-5213, VTQDDLQ Competitive binding ELI using amino terminal extension region (series) (PS-5211 to PS-5216) It is a graph which shows SA. FIG. 35 shows mouse monoclonal antibody 2D2-B2, reference F6 peptide (PS-5166) And the intermediate region in Table X which defines the epitope of the antibody as PS-5294, VQGILERV Graph showing competitive binding ELISA using peptides derived from three extended regions It is. FIG. 36 shows mouse monoclonal antibody 5B3-E6, reference F6 peptide (PS-5166) And the intermediate region in Table X which defines the epitope of the antibody as PS-5294, VQGILERV Graph showing competitive binding ELISA using peptides derived from three extended regions It is.Preferred embodiments of the invention Hereinafter, as some embodiments of the present invention, preferred embodiments will be described with reference to the above drawings. This will be described in detail while referring to the drawings. Mouse monoclonal antibody for identifying inducible human NOS (hiNOS) Test panels (panels) have been developed. Monoclonal antibodies are enzyme-linked immunosorbents. Solution test (ELISA), urethane immunoblot,¹²⁵Immuno of I-hiNOS Precipitation and various methods such as indirect immunofluorescence staining of cells More analyzed. Monoclonals were all first detected by ELISA. All tests based on LISA were successfully detected. However other tested Of all methods, anti-hiNOS monoclonal antibodies were well matched. Some were, others were not. Only monoclonal antibody 1E8-B8 tested It was found to be compatible with all the test methods. 2A12-A4, 2D2-B2, 5B3-E6, 2H1 Other specimens such as 1-D11, 7D8-B3, and 21C10-1D10 are all Not nearly but adapted. Therefore, each monoclonal antibody specimen is It is necessary to test according to the test method suitable for identifying it or the purpose. There will be. Such a monoclonal antibody is used in immunoassays for hiN Used for OS detection and quantification. These monoclonal antibodies are induced using intact hiNOS as the immunogen. Was. However, not all of these monoclonal antibodies may be Alternatively, using a fragment of hiNOS or a peptide analog thereof, It could be developed by raising an initial immune response in mice. In addition, another panel of polyclonal rabbit anti-peptide antibodies has been developed. This Polyclonal antibodies have three NOS isoforms (nNOS, iNOS, eNOS ). This polyclonal antibody is the above isoform of human NOS Amino acid sequence in rabbits mimicking the amino or carboxy terminus of Rows were cultured. The peptide used for the production of this polyclonal antibody was Synthesized according to known techniques. Purified humans were also used to immunize mice and develop panels of monoclonal antibodies. iNOS was used. Monoclonal antibodies, protein fragments, fusions Protein and Peptidomimetic of hiNOS Immunizing Mice or Proteins Can be developed using the body, but elicits an immune response to the hiNOS region You. Production of hybridomas, cell clones, and monoclonal antibodies Standard techniques were used for Hybridomas and clones were And western blot immunoscreening, and the culture supernatant And used as ascites from mice. Also a monochromer The antibodies were analyzed to be isoforms by standard techniques. Monoclonal anti The body was then tested for its ability to suppress the enzymatic activity of hiNOS. Protein Each monoclonal antibody for determining the region was identified and 1153 amino acids in total length were identified. 96 overlapping peptides to cover the NONOS structure of hiNOS, each 18 amino acids were synthesized. Each peptide has 11 sites that overlap with the previous peptide. Except for the carboxy-terminal peptide bearing the amino acid, the 6 Had the amino acid. Peptides form specific wells on microtiter plates Used for sensitization, culture supernatant or ascites from each clone is added to each well. Provided. The presence of bound monoclonal antibody was detected. iNOS protein Specific regions of quality are identified when bound by a monoclonal antibody. Figure 1 Human iN determined by binding to any of the monoclonal antibodies of the invention It is a peptide sequence indicating a specific region of OS. Once bound to that region, a specific monoclonal antibody is determined Regions are identified by computer searches of known protein databases. A sequence similar to the protein is searched. This service is available from the National Institutes of Health Provided at the National Biotechnology Information Center. This search includes the bay Called Thick Logistic Alignment Statistical Tool (BLAST) A program is used. Use of this program is supported by Altssur et al. l, et.al., Journal of Molecular Biology, Vol. 215 (1990))). The table below lists computer search results. Show. Here, “Xxx” is not used in the BLAST list (caluculation). Shows the matching amino acids. "P value" indicates the probability of non-match. In other words, the smaller this value, the more The probability of a match. For example, in Table 1, the BLAST calculation result of peptide A3 is Complete sequence homology is seen with hiNOS (25-42). This means that This was expected because the peptide is a region of homologously generated hiNOS. Compu A data search found only sequences homologous to the other two proteins. Distribution One of the column homology is that the P value is less than 0.02 for mouse iNOS (25-42). It was good. Another sequence homology is that the P-value for rat iNOS (25-42) is 0. It was smaller than 03. Less than 0.1 for other proteins in the database No sequence homology at any P value was found. Protein database for sequence homology A search for a source revealed that peptide A4 was homologous to human iNOS (37-54) only. Was done. Every protein region in the database has a P value less than 0.1 No other match for the sequence was found (ie, greater than 99.9%). Do not match with high probability). hiNOS (781-798), against peptide F6 The search for sequence homology that matches the sequence homology with human iNOS Sequence homology between mouse and rat iNOS was found. In this search, from 0.1 No other P value was found that matched the sequence. However, h In a search for sequence homology with peptide G11, which is iNOS (985-1002), Homology was found with some of the proteins in Table I. These are mouse and rat INOS, human nNOS (1256-1273), human eNOS (1017-1031) and And bovine eNOS (1019-1033). Pepti that is hiNOS (1009-1026) Computer search for sequence homology to deH1 showed rat and mouse iN Only homology with the OS was found. Sequence homology at P value less than 0.5 I didn't find it. Less homology with human eNOS and human nNOS It should be noted that the P value is 0.5 or more. Sequences derived from each of the 18 mer where monoclonal antibody binding was observed Columns, ie, peptides A3 (PS-5103), A4 (PS-5104), F6 (PS-5 166), G11 (PS-5183) and H1 (PS-5185) for these regions. A series of epitope mappings were designed and performed. Derived from the 18-mer amino acid end Four truncated peptide series, also four from the carboxy terminus of the 18-mer A series of truncated peptides was created. The shortest possible binding to the monoclonal antibody of the present invention Were cut to various lengths to determine which amino acids were. FIG. 7 Peptide bound to any of the thus-cleaved monoclonal antibodies of the invention FIG. Several additional peptide homologs were designed and synthesized based on a BLAST search. . Using these peptide homology, it is possible to The specificity of the clonal antibody was examined. Such other proteins are, for example, hN OS, heNOS, mouse iNOS and rat iNOS. Providing an immunoassay for detecting and quantifying hiNOS in the sample Was. Microtiter plates were sensitized with purified goat anti-rabbit IgG . Plates were blocked with bovine serum albumin (BSA). Rabbit polyclona By binding to the HINOS in the sample by adding The antibody was "captured". Various mouse monoclonal antibodies from the panel in Table III Was tested to determine its ability to detect and quantify hiNOS. By this method, Table II Clone 1E8-B8, 21D10-1D10, 2A12-A4 in I and other effects were observed. Other methods, such as the strip method for rapid detection of iNOS, are It is thought that it can be used for a. In addition to the use in the sandwich ELISA method, the monoclonal antibodies in Table III Wetane immunoblock for ability to detect hiNOS in panel samples The test was performed by the G method. In this method, cells in the medium are mixed with a cytokine / LPS mixture. Induced by The latter method uses the monoclonal antibody of the present invention INOS production was induced by cells detectable by immunoblotting. In addition to use in sandwich ELISA and western immunoblotting, Immunoprecipitate the hiNOS of each monoclonal antibody in the panel of Table III I checked my ability to do it. this is,¹²⁵Radioimmunoassay using I-labeled hiNOS Tested by the assay (RIA) method. By this method, 20 kinds of panel Of these, 10 monoclonal antibodies can be used for immunoprecipitation of hiNOS. I understood. Of these 10 with the ability, monoclonal antibody 2H11 − D11, 5B3-E6 and 21D10-1D10 are radiolabelled tampers. It has been found that the most immunoprecipitates can be prepared. In addition, the monoclonal antibodies in Table III were immobilized in cells to identify iNOS. The ability to bind was determined. The induction of iNOS production was determined by using three culture cells of completely different types. In the cells, the cells were elicited using an anti-hiNOS monoclonal antibody as the initial antibody. Vesicles were tested by indirect immunofluorescence staining. Three induced, cultured cells tested Indicates A-172 (human glioblastoma cell line), RAW264.7 (mouse macrophage) Large cell line) and normal human mononuclear cells isolated from blood. this In the test method, five monoclonal antibodies 1E8-B8, 2D2-B2, 5B3 -E6, 2A12-A4 and 2H11-D11 are particularly good, in the panel Other monoclonals do not work very well or stain cells at all I understood. Above, embodiments of the present invention have been set forth for the purpose of fully disclosing the present invention. Can be appropriately changed as long as the spirit and principle of the present invention are not impaired. Will be apparent to those skilled in the art. Next, the present invention will be described specifically with reference to examples. The embodiments are not limited to these embodiments and those specified below. Example 1 Preparation of polyclonal antibody A limited amino acid that mimics the amino or carboxy terminus of each isoform of human NOS A peptide having a amino acid sequence was prepared. Each peptide was analyzed by the fmoc protein method. Was synthesized by solid phase peptide synthesis according to Standard preparative HPLC The synthetic peptide attached from the solid support resin was isolated and purified by the technique. So Their purity was analyzed by analytical HPLC. 1. Each synthetic peptide has an EDAC or EDAC to establish the source of the antibody and to elicit the induction of the antibody. Uses a sulfo MBS compound (chemistries), Conjugated to shellfish hemocyanin (KHL). 2. Each peptide / protein conjugate was used as a source of antibodies in rabbits. 2- Each group of four rabbits was immunized with a different source of antibody. Antipeptide in rabbits For antibody production, rabbits developed according to standard protocols such as They were quarantined, raised and bled. 3. Antisera from each of the rabbit bleeds were tested by ELISA and pooled. Antibodies to identify synthetic peptide analogs were generated. Antibody that identifies the peptide portion of the antibody source These antisera found to be capable of producing the body are certified for their intact protein The ability to do was evaluated. Table II gives a summary of such synthetic peptides. Example 2 Preparation of monoclonal antibodies A mouse is immunized with the purified human iNOS, and a panel of monoclonal antibodies is used. Developed. Hybridoma production, cell cloning, monoclonal antibody production Standard techniques were used for fabrication. Such a technique is called "production of monoclonal antibodies" ( Current Protocol in Immunology (1991)). ing. Briefly, spleens are aseptically removed from immunized mice and spleen cells (splenocy tes) is isolated and SP2 / 0-Ag14 myelo with polyethylene glycol. And fused with the human cells. Hybridomas are screened by ELISA and hiNO Mouse IgG or IgM against S was produced. Complete hybrids are It was cultured and cloned by exudation. Clones were ELISA and Wetumb Screened by lot method. Full hybrids are cultured and liquid for cryopreservation Frozen in nitrogen and used for production of monoclonal antibodies as medium supernatant, It was used as ascites from Balb / C female mice. Monoclonal antibodies produced by various clones can be used in various ways. More analyzed. ELISA, western blot,¹²⁵I-hiNOS (I. P. ) Immunoprecipitation and indirect immunofluorescent staining of cells (IFA) . ). Isoforms of the monoclonal antibodies were also classified. This is shown in Table III Here are the results: Here, “ND” means “not detected”, “+” means “present”, and “−” means “na”. And "weak" means that the monoclonal antibody was bound only when the concentration was high. Is shown. Example 3 Epitope mapping of monoclonal antibodies Which regions of the protein each of the monoclonal antibodies of Example 2 recognizes To determine the full length of 1153 amino acids of hiNOS , 96 overlapping peptides were synthesized. Both peptides are amino acids It was 18 lengths (18 mer) and was synthesized as a carboxy terminal amide. In structure All of the naturally occurring cysteine residues were replaced with serine. Each peptide is Except for the peptide at the carboxy terminus, 6 amino acids overlap with the adjacent peptide. The peptide at the carboxy terminus overlaps the previous peptide with 11 amino acids. Was duplicated. These peptides were obtained by ELISA using a panel of monoclonal antibodies. Used for epitope mapping. Each peptide is a series of Used to sensitize specific wells of the microtitre plate. Next, each thing Transfer the clonal antibody culture supernatant or ascites to all wells of the sensitized plate. In addition, each well was examined for the presence of bound mouse monoclonal antibodies. . Representative results obtained in this series of experiments are shown in FIGS. The results are summarized in IV. Example 4 Epitope mapping and specificity analysis using synthetic peptides Each sequence of the 18-mer found to bind to the monoclonal antibody (Table IV Using peptides A3, A4, F6, G11, H1) for these regions A series of epitope mapping peptides were designed and produced. BLAST The homolog of iNOS found in the study also shows the specificity of the iNOS monoclonal antibody. Used for analysis. 4 deletions of a predetermined number of amino acids from the amino terminus of each 18mer A series of truncated peptides, as well as a predetermined number of A series of four truncated peptides with amino acids deleted was generated. Any series of cutting The peptide also contains three amino acids from the 18-mer carboxy or amino terminus. These were sequentially deleted one by one. As a result, for each 18 mer, Two series of truncated peptides are obtained in which the amino acids are shortened by three in order from the end. Was done. Table V, FIGS. 7A-D, and FIG. 8 show the generated truncated peptides and hi 2 shows a peptide homolog of NOS. Among them, the peptide homolog of hINOS is In the BLAST search by the computer described above, sequence homology was found to these regions. When found, human nNOS, mouse and rat iNOS, human eNS It was created from the OS. In the table, "+" indicates a positive bond, "-" indicates no bond, and "weak" indicates a mono. It shows that binding occurred only when the concentration of the clonal antibody was very high. Monoclonal antibodies are various truncated analogs, or nNOS and eNOS The ability to bind the analog was used to screen the original 96 18-mers. In the same manner as described above, it was examined by ELISA. For the A-3 locus, monoclonal antibody 21C10-1D10 Strongly binds only to peptide A-3 (PS-5103); It bound weakly to S (25-42) (PS-5241). 21C10-1D10 Does not bind to any of the truncated peptides and is rat homologous riNOS (25-42) (PS-5242). For the A-4 locus, two monoclonal Binding of the antibodies (6G12-H7 and 21C10-1D10) was confirmed. This These antibodies differed in their specificity for the truncated peptide. Monochrome Antibody 6G12-H7, A-4 (PS-5104) and two cleavage classes Strongly binds to analogs (PS-5261 and PS-5265), and PS-5 262 also weakly bound. From this, the original 18-mer has the sequence A 12-mer such that Thr Gln Asp Asp Leu Gln Tyr His Asn Leu Ser Lys Can at least be shortened, and also bind to this peptide analog of the entire protein. It can be seen that relevance is still maintained. Meanwhile, monoclonal antibodies 21C10-1D10 has the original 18-mer A-4 (PS-5104), HiNOS (37-51) peptide sequence with the carboxy terminus truncated by 3 residues ( PS-5265). For the F6 locus, monoclonal antibody 2D2-B2 was tested for F6 (PS- 5166) and three of its truncated analogs: PS-5222, P S-5226, PS-5227, weakly PS-5228, human e NOS (806-824) (PS-5221) was found not to bind at all. Was. Based on the results obtained with the truncated peptide, the epitope was Val Gln Gly Ile It should be in the Leu Glu Arg Val Val sequence. For the G11 locus, two monoclonals were initially screened. Binding of antibodies 1E8-B8 as well as 2A12-A4 was found. These two types Was tested for binding to the cleaved peptide as well as the two homologs. A similar recognition pattern was observed for the monoclonal antibody. Both As expected, it binds strongly to G-11 (P4183) and both bind to human nNO Although S (1256-1273) (PS-5201) was recognized, the binding was G- It was much weaker than 11. In both cases, a series of amino-terminal truncated peptides Although recognizing the first PS-5203, the binding of 1E8-B8 was 2 It was much weaker than the binding observed for A12-A4. Finally, for H1 locus, monoclonal antibody 24B10-2C7 It was found to bind to H1 (PS-5185). This monoclonal anti The body also recognizes the human eNOS homolog as well as the nNOS homolog, PS-5281. The first two of a series of amino-terminal truncated peptides, although they did not recognize -5282 PS-5283 and PS-5284. Monoclonal antibody 24B10-2C7 is the next shorter amino-terminal truncated peptide, PS-5385. Even weakly bound. Based on these results, this monoclonal antibody was identified as peptide H -1 (PS-5185) is recognized at the carboxy terminal side I understand. Example 5 Sandwich ELISA for measuring the amount of hiNOS in a sample In the first attempt to develop a sandwich ELISA for hiNOS, "capture , A polyclonal rabbit anti-iNOS antiserum was used. This one In the method, affinity-purified goat anti-rabbit IgG was added at 1 μg / well / 100 μg. l to sensitize the microtiter plate. Next, bovine serum albumin Plates were blocked with (BSA). Rabbit polyclonal anti-peptide antibody ( (specific for the carboxy terminus of hiNOS) was added and allowed to bind. this The antibody was used as a "capture" antibody that binds to hiNOS in the sample. Table II Various mouse monoclonal antibodies in panel I detect hiNOS in the sample and And / or ability to quantify (FIG. 9). As you can see from the results, In the Sey method, IE8-B8, 21C10-1D10, 2A1-A4, 7D8 -B3 was found to work well. However, poly- No need to repeatedly produce clonal rabbit anti-peptide antibodies Thus, various mouse monoclonals of the panel of Table III prepared for hiNOS Sandwich ELISA using antibodies as both "capture" and detection antibodies Was designed. In this assay method, affinity-purified goat anti-mouse IgG_2A Or IgG_2BMicrotiter plates were sensitized using IgM. Next, 2A1-F8, 6A12-A12 were used as "capture" monoclonal antibodies. , 21C-1D10, or monoclonal antibodies of the IgM class. I got it. Next, block the plate with BSA and see that it contains hiNOS. The sample was added to the microtiter plate. Then wash them thoroughly Was cleaned. The monoclonal antibody used for detection has a different immunoglobulin from that used for capture. Brin class antibodies were used. IgG_2BMonoclonal antibody 21C10 When -1D10 was used as the “capture” antibody, as shown in FIG. IgG₁For detection of monoclonal antibodies, eg IE8-B8, 2D2-B2 Used as an antibody. The “capture” monoclonal antibody is an IgM class antibody In this case, any mouse IgG clone can be used as the detection antibody As such an antibody, IE8-B8 (IgG₁), 2D 2-B2 (IgG₁), 21C10-1D10 (IgG_2B). in this way Using the panel of monoclonal antibodies in Table III, A based antibody sandwich ELISA can be generated. hiNOS Mouse monoclonal antibody panel Polyclonal "capture" antibodies You don't have to use your body. Example 6 Western immunoblot Use of the panel of monoclonal antibodies in Table III in a sandwich ELISA As well as detecting hNOS in samples by Western immunoblotting The ability was also examined. The sample was electrophoresed on a 7.5% SDS-PAGE gel , Proteins were separated according to molecular weight. Transfer protein to PVDF membrane, PB The membrane was blocked with goat condensed milk diluted 1: 4 with S / Tween 20 buffer . The primary anti-hiNOS monoclonal antibody was allowed to bind and then as shown in FIG. The membrane was expressed using an HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody. Monocrona Antibodies will contain iNOS when induced with a cytokine / LPS mixture Western blot using cell lysate of cells reported to be Was also investigated. Cells were from American Tap, Rockville, MD, USA Cell line A-172 from Ip Culture Collection (ATCC) and RAW 264.7 was purchased and after cell expansion, with cytokine / LPS mixture They were collected before and after induction (FIGS. 13 and 14). This cytotoxic mixture is And described as a cytokine / LPS mixture. Fine The cell pellet is washed thoroughly with PBS after cell harvest to remove excess protein. I left. Cells are lysed by freeze-thawing twice and sonication I let it. Cell lysates were diluted 1: 2 with SDS-PAGE sample buffer. And boiled for 10 minutes. The sample was electrophoresed on a 7.5% gel as described above. Was. Non-induced cells did not contain iNOS, whereas cytokine / LP A 130 kd band was observed in cells induced with the S mixture. this Thus, iNOS was induced by the cytokine / LPS mixture, Western blot of iNOS in unknown samples with monoclonal antibody III It can be detected by the kit method. Lysates of these induced cells were examined by Western immunoblot INOS is detected not only by the sandwich ELISA method of Example 5 but also by And / or whether they could be quantified. Shown in FIGS. 13 and 14 As clearly shown in the results of this ELISA test, non-induced cells S was not included, whereas after induction with the cytokine / LPS mixture , A substantial amount of iNOS. Example 7 Immunofluorescence staining of induced cells Various monoclonal antibodies are induced in cells that produce iNOS The ability to bind to iNOS was determined by three different cells, a human glioblastoma cell line A-172, mouse macrophage cell line RAW264.7, normal human monocytes I checked about it. Cells are cultured for 2 days in normal culture and mixed with cytokine / LPS. Compound (CM) was induced to produce iNOS by treatment for 40 hours. . After this treatment, the cells are separated by two methods, a method suitable for cell lysis, and Were treated by a method suitable for immunostaining. Cells to be lysed are detached from the culture flask. It was washed 5 times and frozen and lysed in a small amount of PBS. This lysate Western blot and sandwich E as described in Examples 5 and 6. Used for LISA testing. Cells used for immunostaining were washed four times, % Or 100% acetone. These cells are used as primary mouse anti-hi Reaction with NOS monoclonal antibody for 60 minutes, FITC-conjugated goat anti-mouse Ig Reacted with G or IgM. Cells were observed and photographed using an epifluorescence microscope . FIGS. 15-17 show 1E8-B8 of Table IV for induced A-172 cells. , 2A12-A4, and 2H11-D11 were observed using indirect immunity, respectively. 3 shows an epifluorescence staining pattern. 18 and 19 show the fixed RAW 264.7. And observed when 1E8-B8 and 2A12-A4 in Table IV were used, respectively. Fig. 2 shows the indirect immunofluorescence staining pattern observed. This pattern is Similar to the result obtained by the lot method. That is, these two types of monoclonal antibodies The body will be able to cross react with mouse iNOS. Figures 20 and 21 show tables IV two mouse anti-hiNOS monoclonal antibodies, 1E8-B8 and 2 A12-A4 were each obtained by using induced normal human monocytes. 4 shows the results of indirect immunostaining performed. Monocytes were isolated from normal humans by density gradient centrifugation. It was isolated from blood, and was extracted in Westbury, New York (We Accurate Chemical and Scientific, Inc. (stbury) Optiprep obtained from Chemical and Scientific Corp) With application sheet 2.3. Follow the manufacturer's instructions detailed in Used. As can be seen from these results, these mouse anti-hiNOS mono The clonal antibody recognizes hiNOS induced in normal human cells and tissues. , Can be combined. Example 8 Testing for the ability of monoclonal antibodies to inhibit the enzyme activity of hiNOS Determine the amount of nitrite produced in the presence of substrate and cofactor. And the enzyme activity of hiNOS was measured. 13 different anti-hiNOS Monoclonal antibodies were tested for their ability to inhibit the activity of hiNOS. Investigation All of the monoclonal antibodies were obtained from Ding et al., "Macrophage Dea. crivity Factor and Transforming Growth Factors-beta 1, beta 2, and beta 3Inhiblt Induction of Macrophate Nitogen Oxide Synthesis by IFN-gamma 1 " , Journal of Immunology, Vol. 145 (1990)) and Nakane et al. ("Cloned Hum an Brain Nitric Oxide Syntase in Highly Expressed in Skeletal Muscle ", F EBS Letters, vol. 316 (1993)). Did not inhibit the activity of the enzyme. Example 9 Preparation of reactants for assays Using the new ascites preparation from the cryopreserved cells of Example 1, the procedure of Example 2 was used. Repeated. This procedure was performed about 12 months after the initial preparation of Example 2. It is. The results in Table VI shown below reinforce the data of Example 2. The competitive binding ELISAs in Table VI were coated on microtiter ELISA plates. The synthesized peptide and iNOS of the standard or unknown substance in solution. This is based on the competition for binding of the antibody to the antibody. Many monoclonal antibodies of the invention Numbers found to be associated with linear synthetic peptide analogs of specific proteins That may have been done. Most monoclonal antibodies are found in physiological samples. It did not have sufficient sensitivity to measure iNOS. However, one kind of thing A clonal antibody, 21C10-1D10, was used to bind iNOS in physiological samples. It had a sensitivity that could be used for measurement. Peptide coating plate Use a longer synthetic peptide and perform ABC amplification to "fine tune" the ELISA. As a result, the sensitivity could be improved by 50 to 60 times. This assay is Performed in any of a number of ways that are acceptable to the technician May be. The lowest sensitivity of the competitive binding ELISA described in Table VI is 20 femto In moles, it takes 3 hours to complete. In case of further pre-incubation Means that the sensitivity is improved by a factor of 2 to 3 and, in theory, the minimum sensitivity is ELISA is realized. Example 10 Immunofluorescence assay Indirect immunofluorescence staining of cells was performed as described by Heimer et al. (Heimer and Taylor, J. Clin. Path. ., 27 (1974), p. 254) and Johnson et al., J. Immunol. Meth. 55 (1982), p. 231) with reference to the following method. The cells are Wash three times for 1 minute with phosphate buffered saline (PBS), then Washed quickly with water and drained well. 100% of cells grown on glass Cells fixed in acetone and grown on plastic were 80% acetone / 20 % Water. Fixation took 10-15 minutes at room temperature. Air dry sample at 20 ° C Saved in. Monoclonal antibodies were purified in PBS at 1: 500/1: 2,500 / 1 : Added as culture supernatant diluted to 2500. Supernatant or ascites at room temperature The cells were added directly to the fixed cells, and cultured at 37 ° C. for 2 hours or at room temperature for 2 hours. Then, each The samples were washed four times for 1 minute each in PBS and drained. FITC-conjugated goat anti-ma Mouse secondary antibody with hyclone diluted 1: 120 in PBS. Added. The samples were incubated at 37 ° C for 0 minutes or at room temperature for 45 minutes. Cells are again washed three times for 1 minute each in PBS, then washed with water to remove salts. Was. Glycerin system containing DABCO to reduce fading after draining water The coverslips were mounted using the mounting media of FI Observe immunofluorescence staining using an epi-fluorescence microscope equipped with excitation and emission wavelengths for TC. I thought. In this immunofluorescence assay, monoclonal antibodies 5B3-E6 and 2D2 -B2 was used. Staining was performed specifically with F6 peptide (PS-5166). Clicked. iNOS is induced in a variety of cells and is not monoclonal antibody 5B3-E6. In addition, it was detected by 2D2-B2. Strong immunofluorescence as a result of the induction process Emitting cells were obtained. When iNOS was induced in rats, fixed tissues The strips were stained (by fluorescence) with monoclonal antibodies 5B3-E6 and 2D2-B2. Specific immunostaining (using DAB). This immunostain Color can only be blocked by the appropriate peptide (F6 = PS-5166) there were. Because this assay uses indirect immunofluorescence in the current procedure, It takes 90 minutes. Using the direct method reduces the time required to 30 minutes or less. It is. Figures 22-29 show indirect immunofluorescent staining of samples using the reactants of Example 9. Things. For this assay, no hiNOS enzyme was produced except under specific culture conditions. A-172 cells (human glioblastoma cell line) were demonstrated using a lysate. Immunofluorescence analysis, Western blotting, RI using polyclonal antibody A. This was determined by competitive binding ELISA using monoclonal antibodies and peptides. These controls indicated that no hiNOS was not present. Also, hiNOS , Were also induced by a mixture of cytokines and LPS. Example 11 Competitive binding ELISA Samples were tested in a competitive binding ELISA. Plates were sensitized overnight, 4 Washed 3 times, 3 hours with PBS (blocking solution) supplemented with 2% normal horse serum (NHS) Blocked across. A double concentration sample was combined with 15 μl of blocking solution. Each was added to each plate. Twice the concentration of 21C10-1D10 ascites in 15 μl The solution diluted in the volume of PBS was also combined with 2% NHS and 0.1% Tween 20. Also added to The samples were incubated at room temperature for 30 minutes. 0.1% Tween 20 Pre-incubation of a solution obtained by diluting the ABC complex to a concentration of 1: 120 with PBS containing Was performed at room temperature for 1 hour. After 30 minutes, wash the plate 4 times with PBS And washed twice more. P with 2% NHS and 0.1% crystalline BSA 100 μl of bio-HMIgG diluted 1: 480 in BS for 30 minutes at room temperature Over. The plate was washed four times again. ABC complex with equal volume of PBS And diluted with 0.1% Tween-20. 2% NHS is added to this ABC mixture. And 0.1% crystalline BSA. Pre-incubated ABC solution 10 0 μl / well was added at room temperature and left for 30 minutes. The sample was washed eight times. Anti-color The reaction was performed with 10 mg / ml OPD and 0.08% hydrogen peroxide. x in phosphate citrate buffer (pH 5.0) at 37 ° C. for 55 minutes. Was. Many of the monoclonal antibodies of the invention have specific linear synthesis of the protein. Bound with peptide analogs. Prepare a pair of the monoclonal antibody and the synthetic peptide. In total, one of the monoclonal antibodies, 21C10-1D10, was It has been found that it can be used to measure NOS. Pep coating plate Using "Tide" as a longer synthetic peptide and performing ABC amplification, "fine-tune" ELISA ", The sensitivity could be improved by 50 to 60 times. This ELIS A took 3 hours to complete in measurement. Further pre-incubation In this case, the sensitivity is improved by 2-3 times, and the minimum sensitivity of ELISA is 6 to 10 femto. It should be in the molar range. FIG. 30 and FIG. The assay was used for the determination of iNOS and hiNOS. In FIG. 32, By using the A3 + A4 peptide instead of the A4 peptide, Increasing the sensitivity of the assay. For this assay, no hiNOS enzyme was produced except under specific culture conditions. A-172 cells (human glioblastoma cell line) were demonstrated using a lysate. Immunofluorescence analysis, Western blotting, RI using polyclonal antibody A. This was determined by competitive binding ELISA using monoclonal antibodies and peptides. These controls indicated that no hiNOS was not present. Also, hiNOS , Were also induced by a mixture of cytokines and LPS. Example 12 Epitope mapping by 21C10-1D10 for A4 locus Epitope mapping by monoclonal antibody 21C10-1D10 Further work was performed on the amino terminus of the A4 locus of hiNOS. In Table VII, The results are shown. FIG. 33 shows mouse IgG₁Monoclonal antibodies 21C10-1D10, A4 Peptide (PS-5104), the carboxy-terminal truncated peptide (P S-5265-PS-5268) using a "second step" competitive binding ELISA The result is shown. Table VIII contains the episode of peptides PS-5261-PS-5269. The topping mapping is shown here, but here, the PS-526 mapped in FIG. The 5-PS-5268 peptide is prominent. Standard A4 peptide (PS-5104) and a series of amino-terminal extensions in Table VII Peptides (PS-5221 to PS-5257) were converted to mouse IgG₁Combined with antibodies When used, it was found that the epitope was VTQDDLQ of PS-5213. Was. The "third step" epitope mapping is shown in the graph of FIG. Example 13 By 2D2-B2 and 5B3-E6 for F6 locus Epitope mapping Epitope masking by monoclonal antibodies 2D2-B2 and 5B3-E6 Papping was further performed on the central region of the F6 locus (third step). table IX shows the results of this mapping along with the peptides used. The table shows Mouse monoclonal antibodies 2D2-B2 as well as 5B3-E6 were Competition method by using with a series of peptides mapping the central region The results obtained in the ELISA are also shown. Table IX also shows the data for both of these antibodies. The sequence of the pitope is VQGILERV (hiNOS 784-791) Has also been identified.

Claims

[Claims] 1. a. The sample was contacted with a specific binding substance reactive with human iNOS protein. Touch, and b. Detecting the presence of the human iNOS protein in the sample. The specific binding substance recognizes a specific region of the human iNOS protein. Immunoassay for samples that are such substances. 2. The specific binding substance is a monoclonal antibody, an oligonucleotide, a polymer. -Claim 1 selected from the group consisting of an artificial antibody and a phage expression binding site. The described method. 3. The region of the human iNOS protein is A-3, A-4, A3 + A4, F 6. The method according to claim 1, wherein the group is selected from the group consisting of 6, G11 and H1 locus. Method. 4. The immunoassay described above can be used for direct, indirect, capture, competitive binding, 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of: 5. 2. The method according to claim 1, wherein the immunoassay is a clinical diagnostic assay. Method. 6. The step of detecting the presence of the human iNOS protein is a qualitative analysis. The method according to claim 1. 7. The step of detecting the presence of the human iNOS protein is quantitative analysis. The method according to claim 1. 8. a. The sample is subjected to specific binding reactive with a homologue of human iNOS protein. Contact with the substance, b. The specific binding substance is a homologue of a specific region of human iNOS protein. The presence of human iNOS protein in the sample Issue An immunoassay for a sample consisting of steps. 9. The specific binding substance is a peptide, a recombinant peptide, a fusion protein, or a fusion protein. Peptide, phage expressed protein, phage expressed peptide, peptide library 9. The method according to claim 8, wherein the peptide is selected from the group consisting of The described method. 10. The region of the human iNOS protein is A-3, A-4, A3 + A4, F 9. The method according to claim 8, which is selected from the group consisting of the locus of 6, G11, and H1. Method. 11. The immunoassay described above can be performed by direct, indirect, capture, competitive binding, 9. The method of claim 8, wherein the method is selected from the group consisting of: 12. 2. The method according to claim 1, wherein the immunoassay is a clinical diagnostic assay. Method. 13. The above step of detecting the presence of the human iNOS protein is a qualitative analysis The method according to claim 8. 14． The above step of detecting the presence of the human iNOS protein is a quantitative analysis The method according to claim 8. 15. Wherein the specific binding substance is any of the peptide analogs of Table VII. 9. The method according to claim 8, wherein the method comprises: 16. Claims wherein said specific binding substance is any of the peptide analogs of Table IX. Item 9. The method according to Item 8. 17． Assay methods include IFA, linear or radial flow, Western blot Method, ELISA, dipstick method, fluorescent polarization method, enzyme key 9. A method selected from the group consisting of the capture method and RIA. Assay. 18. Assay methods include IFA, linear or radial flow, western block Method, ELISA, dipstick method, fluorescent polarization method, enzyme key 2. A method selected from the group consisting of the capture method and the RIA. Assay. 19. The specific binding substance is a peptide analog having the sequence: VTQDDLQ 16. The method according to claim 15, wherein 20. The specific binding substance is a peptide analog having the sequence: VQGILERV 17. The method according to claim 16. 21. a. A specific binding substance reactive with human iNOS protein, and b. The specific binding substance recognizes a specific region of human iNOS protein Vehicle for detecting the presence of human iNOS protein in response to Immunoassay of a sample consisting of