JP2005538718A - グラム陽性菌由来の表面固定化タンパク質を同定するためのバイオインフォマティクス法及びそれによって得られるタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年9月13日付けで出願された米国仮出願第60/410,303号の優先権を主張する。
本発明は、微生物学、分子生物学及び免疫学の分野に関し、さらに詳しくはMSCRAMM(登録商標)として知られている表面固定化タンパク質(surface-anchored protein)に関し、また免疫グロブリン(Ig)様折りたたみ領域を含む潜在的(potential)タンパク質由来の構造的特徴を検出することにより認識可能な細胞壁選別シグナルを有するグラム陽性菌由来の推定上のMSCRAMM(登録商標)タンパク質、すなわち細胞外マトリックス分子に結合できるタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子を同定するバイオインフォマティクス法に関する。さらにまた、本発明は、かかるタンパク質を認識する抗体、例えばポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体、並びにモノクロナール抗体をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞に関し、またヒト及び動物のグラム陽性菌感染症の診断、治療又は予防におけるかかる抗体の使用に関する。
ヒト及び動物において無数の感染症を引き起こす可能性があることから、医薬及び疫学の分野で重要になっている多数のグラム陽性菌が存在する。一つのこのようなグラム陽性菌、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)は、哺乳動物の腸内の共生菌叢に属する。グラム陽性菌はまた、細菌性心内膜炎の病原因物質として長い間知られている(Murray、1990年)。この10年間で、エンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)は、典型的に抗生物質療法を受けている入院患者において感染症を引き起こす日和見性院内病原体としてますます出現している。この細菌の臨床株は、最も一般的に使用されている抗生物質に対して多数の後天的及び内因的に進化させた耐性メカニズムを宿す場合が多く、腸内球菌感染症の治療を困難にしている(Murray、1990年、1999年) (Tailor、1993年)(Huycke、1998年)。多くの抗生物質耐性遺伝子は、可動遺伝要素、例えば小プラスミド及びトランスポゾンにある(Paulsen、2003年)。これは、この生物から他の細菌種への耐性決定因子の遺伝的伝達、例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対するバンコマイシン耐性について最近文書化された伝達について懸念を生じている(CDC、2002年)。抑制することが難しい感染症を一般に引き起こすさらに別のグラム陽性菌、例えばエンテロコッカス属の中の別の細菌、例えばエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、並びにストレプトコッカス属の細菌、例えばストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及び肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ブドウ球菌(Staphylococcus)属の細菌、例えば黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)及び表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)、並びにバシラス属の細菌、例えば炭疽菌(Bacillus anthracis)が知られいてる。
従って、本発明の目的は、グラム陽性菌により生じる感染症を治療又は予防する方法に利用できるグラム陽性菌由来のMSCRAMM(登録商標)タンパク質を同定し且つ単離するバイオインフォマティクス方法を提供することにある。
図1は、本発明に従って同定された種々のMSCRAMM(登録商標)タンパク質を表す図であり、該タンパク質の種々の領域及びこれらの免疫グロブリン様領域を例示する図である。
本発明に従って、グラム陽性菌、例えばエンテロコッカス属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属及びバシラス属のような属からの細菌由来のタンパク質、特にMSCRAMM(登録商標)様の特徴を有するタンパク質を同定し且つ単離し、同定され且つ分離されたタンパク質を利用して抗体を生じさせ且つグラム陽性菌によって引き起こされる感染症を診断、治療又は予防するバイオインフォマティクス法が提供される。一般的に、この方法は、推定上のC末端LPXTG(配列番号:1)細胞壁選別シグナル及び/又はLPXTG含有細胞壁固定化タンパク質を有するMSCRAMM(登録商標)タンパク質(微生物表面成分認識接着性マトリックス分子)に対する別の構造類似物を用いてタンパク質を探索することを伴う。好ましい態様において、本発明は、MSCRAMM(登録商標)タンパク質、すなわち宿主細胞の細胞外マトリックス分子、例えばタンパク質、炭水化物及びその他の成分に結合する表面タンパク質〔但し、これらの配置されたタンパク質は免疫グロブリン様折りたたみを採用する(adopt)領域を含有する〕を同定し且つ単離する方法を提供する。これらのIg折りたたみ含有領域は、同じサイズ及びIg型折りたたみの1〜4個のドメインからなる免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)の解明された結晶構造(〜50−500 aa)に対する幾つかの連続し且つ重複する一致(match)からなる。相同性Ig折りたたみ領域は、フィブロネクチン及びその他のIgSFタンパク質に認められるような“糸に通したビーズ(beads-in-a-string)”配置の連続モジュールを示す(Leahy、1996年)(Sharma、1999年)(Hamburger、1999年)(Luo、2000年)。例えば、Ig折りたたみサブドメイン(N2及びN3)の縦列反復は、ClfAのフィブリノーゲン結合ドメインの結晶構造に認められる。ClfA及び同様の構造のClfBの全長Aドメインは、追加のN末端サブドメイン、N1からなる(Deivanayagam、2002年)(Perkins、2001年)。配列及び二次構造類似性に基づいて、類似のサブドメイン組織はまた、別のMSCRAMM(登録商標)タンパク質、例えばFnbpA、FnbpB、Ace及びSdrタンパク質中に期待される。CNA最小コラーゲン結合性ドメインの解明された 結晶構造は、単一のIg型サブドメイン(N2)からなり(Symersky、1997年)且つC末端反復ドメインB1及びB2それぞれは、Ig折りたたみサブドメインの縦列反復からなる(Deivanayagam、2000年)。同様のモジュール構造は、B3及びB4反復中に期待される。
シグナルペプチドは、任意の適当な同定方法、例えば“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites” Henrik Nielsen、Jacob Engelbrecht、Soren Brunak及びGunnar von Heijne、Protein Engineering 10, 1-6 (1997)、(参考文献として本明細書に組み込まれる)に記載の方法を使用して同定し得る。本方法において、本発明者らにとって好ましいシステムは http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/ のシグナルP予測サーバーであるが、別の類似のシグナルペプチド同定方法も使用し得る。LPXTGモチーフの位置及びC末端の正帯電アミノ酸残基の決定は配列の目視検査を使用して達成されるが、データベースを使用してこれらの特徴の存在を調べてもよい。
http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRHomePage.spl のTIGRウエブサイト(総合微生物資源)に置かれている注釈付きゲノムヌクレオチドデータベースを使用しても位置を確認し得る。これらのデータベースについて、用語“LPXTG”又は“細胞壁”を使用して、関心事のゲノム中の細胞壁固定化タンパク質として注釈付けられているようなタンパク質を検索するのに使用し得る。
本発明の分離抗体、又は前記の分離タンパク質又はエピトープは、以下にさらに記載するように、細菌感染症に対する能動及び受動免疫用ワクチンの開発に利用し得る。能動ワクチンの場合、該ワクチンは、免疫原量の本発明のタンパク質又はその活性領域あるいは前記のエピトープを提供することによって調製され、従って本発明による活性ワクチンは免疫原量のタンパク質又はペプチドを含有し、このようなワクチンを必要とするヒト又は動物に投与されるであろう。該ワクチンはまた、ワクチン技術で知られ且つ常用されている適当な製薬学的に許容し得るビヒクル、賦形剤又は担体を含有し得る。前記のように、本発明に従って使用すべき抗原の“免疫原量”とは、毒性がないが、所望の予防又は治療効果が生じるように免疫原応答が宿主中で引き起こされるような薬剤の十分な量を意味することを意図する。従って、必要とされる抗原の正確な量は、患者の種、年齢、及び全身状態、治療される病気の重症度、使用される具体的な担体又はアジュバント並びにその投与方法などに応じて患者から患者に変化するであろう。同様に、このような抗原ワクチン組成物の“免疫原量”は、具体的な状況に基づいて変化し、適当な免疫原量は、常用の実験だけを使用して当業者によってそれぞれの用途で決定される。その用量は、前記組成物が投与される個人に合わせて調節されるべきであり且つ個人の年齢、体重及び代謝と共に変化するであろう。
当業者によって認められるように、本発明の同定され且つ単離されたタンパク質及びこれに対する抗体であって該タンパク質を認識し、結合できる抗体は、グラム陽性菌感染症、例えばエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ブドウ球菌属などによって引き起こされるグラム陽性菌感染症を治療又は予防することを目的としてヒト又は動物患者に投与するのに適した医薬組成物に形成し得る。前記に定義し且つ記載したような本発明のタンパク質又は抗体を含有する医薬組成物は、この技術で常用される適当な製薬ビヒクル、賦形剤又は担体、例えば食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、その他の医薬化合物及びこれらの組合せと組み合わせて製剤化し得る。当業者が認めるように、使用する具体的なビヒクル、賦形剤又は担体は、患者及び患者の状態に応じて変化するであろうし、また種々の投与方法が当業者によって認められるように本発明の組成物に適するであろう。本明細書に開示される医薬組成物の適当な投与方法は、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内及び皮内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
感染症の発見及び診断
本発明に従って、前記のような本発明のバイオインフォマティクス法によって得られるタンパク質、エピトープ及びペプチド並びにこのようなタンパク質、エピトープ及び/又はペプチドを認識する抗体を使用することによってグラム陽性菌による感染症を同定し且つ診断する方法が提供される。本発明に従って、前記の発明の抗体はこのような感染症を診断するキットに使用し得、またこのようなキットは当該技術で一般的に知られており且つ本発明の抗体に結合する関心事の抗原又は微生物を検出するのに常用される種類のものであり得る。
本発明に従って、本発明の別の使用はグラム陽性菌抗原、又は該抗原を認識する抗体の量を、前記の抗原又は抗体を含有すると疑われるヒト又は動物患者において監視することにあり得ることも意図される。好ましい方法において、これは、ヒト又は動物患者から生物学的試料を最初に得ることによって実施し得、また生物学的試料としては、例えばヒト又は動物患者の血液、血清、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨又は皮膚から得られる、感染症について日常的に監視される適当な試料が挙げられる。次に、試料には、(1)グラム陽性菌に対するヒト又は動物患者の抗体の量を監視する場合には、このような抗体を結合するであろうタンパク質又はそのAドメインの決定可能な量を導入するか;又は(2)細菌感染のレベルを監視することが望まれる場合には、前記試料に、前記のようなタンパク質に対する抗体の測定可能な量を導入する。この方法における次の工程は、試料中の抗原及び抗体が、十分な時間及び条件の後に、結合を達成でき、試料中に見出されるグラム陽性菌の量又は濃度を反映するであろう抗原−抗体結合又はこれに対する抗体の量を調べることができるようなものである。所望の方法においては、量は入院又は治療期間中のようなグラム陽性菌感染症の進行/寛解を追跡するように規則正しい時間(例えば、時間毎、日毎など)で監視し得る。
本発明に従って、体液(例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、生殖器路)又はその他の生物学的物質(例えば、組織、骨、筋肉、軟骨又は皮膚)に存在するグラム陽性菌の検出は、グラム陽性菌によって引き起こされる急性又は慢性の感染症の診断方法を構成することができる。前記の抗体は数種のグラム陽性菌に認められるエピトープを認識することができることから、これらの抗体は、種々様々なグラム陽性菌及び病状の診断を可能にするアッセイに使用できる。モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体は、アッセイで使用でき、且つ前記に挙げたようなモノクロナール抗体の場合に使用できる。このアッセイを使用することにより同定される検出抗原は、多数の慣用の手段、例えばウェスタンブロット試験及びその他の同様の試験により検出することができる。
前記のように、本発明に従って、前記の本発明の抗体は、キットに使用してグラム陽性菌感染症を診断し得る。このような診断キットは当該技術では周知であり、一般的には本発明の抗体に結合するであろうエピトープ又はタンパク質の存在を調べるのに適するように調製されるであろう。これらの診断キットは、一般に本発明の抗体を、当業者に容易に理解されるような抗体による結合を検出するのに適した手段と一緒に含むであろう。例えば、抗体の結合を検出するための手段は、前記の抗体に結合される検出可能な標識からなり得る。この場合に、これらのキットは、診断方法に使用して、細菌感染症の存在を検出することができる。この場合に、このような感染症を有すると疑われる生物学的試料、例えば個体から、例えば血液、唾液、尿、脳脊髄液、生殖器路、組織、骨、筋肉、軟骨又は皮膚から採取される試料を得、該試料に、本明細書に挙げたような1種又はそれ以上の抗体を導入し、次いで 試料中のかかる微生物の存在を示すであろう抗体が試料に結合するか否かを調べる。
本発明に従って、グラム陽性菌によって引き起こされる感染症を予防又は治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒト又は動物患者に有効量の前記の抗体を該感染症を治療又は予防するのに有効な量で投与することからなるグラム陽性菌によって引き起こされる感染症を予防又は治療する方法が提供される。従って、本発明に従って、前記の慣用の方法(例えば、局所、非経口、筋肉内など)での有効量の本発明の抗体の投与は、このようにしてヒト又は動物患者の細菌感染症を治療又は予防する極めて有効な方法を提供する。前記のように、有効量とは、細菌の接着を防止するか又はかかる生物が宿主細胞に結合及び定着するのを阻害するのに十分な量であり、従ってかかる感染症の治療又は予防に有用である使用量、例えば抗体力価を意味する。また、これらの抗体はまた、多数のその他のメカニズム、例えば伝染性微生物の直接殺滅、オプソニン作用の増大、形態学的変遷の阻害などによる保護効果を示し、従って有効量の抗体は保護効果を達成する手段が得られる量を包含するであろう。当業者により認められるように、感染症を治療又は予防するのに有効であるのに必要な抗体力価のレベルは、患者の性質及び状態及び/又は事前に存在する感染症の重症度に応じて変化するであろう。
本発明に従って、ヒト又は動物に前記のバイオインフォマティクス法を使用して分離されたタンパク質、又はこのようなタンパク質の組換え生成体、又は前記の免疫原性断片、領域又はエピトープの免疫有効量を投与して免疫原応答を誘発することからなるヒト又は動物において免疫原反応を誘発する方法が提供される。前記のように、免疫原反応を得るために本発明に従って使用される抗原の“免疫原量”とは、免疫原応答が宿主で誘発され所望の予防又は治療効果が生じるような薬剤の無毒であるが十分な量を意味することを意図する。従って、かかる応答を誘発させるのに必要な単離タンパク質の正確な量は、患者の種、年齢、全身状態、治療される病気の重症度、使用される個々の担体又はアジュバント及びその投与の様式などに応じて変化するであろう。本発明はまた、前記のタンパク質及びエピトープを認識する抗体を産生する方法を意図し、またモノクロナール及びポリクロナール抗体を産生するのに適した方法は上記に詳しく説明される。
本発明に従って、前記の抗体及び組成物はまた、ある種の医療機器及び補綴器具などのその他の移植材料に関する細菌感染症を治療するか又は該感染症の発生から保護するのに利用し得る。本明細書に記載の抗体及び/又は組成物を用いて都合よく被覆し得る医療機器又は高分子生体材料としては、針、縫合糸、代替心臓弁、心臓補助装置、ハード及びソフトコンタクトレンズ、眼内レンズ(前眼房又は後眼房)、その他のインプラント、例えば角膜インレー、人工角膜、血管ステント、エピケラトファリア・デバイス(epikeratophalia device)、緑内障シャント、網膜ステープル、強膜バックル、歯科補綴材、甲状腺形成デバイス(thyroplastic device)、咽頭形成デバイス(laryngoplastic devices)、血管移殖片、軟及び硬組織補綴材、例えば(以下に限定されないが)ポンプ、電気装置、例えば刺激装置及び記録装置、聴覚プロテーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房インプラント、ペニスインプラント、脳顔面頭蓋腱、人工関節、腱、靭帯、半月及び円板、人工骨、人工臓器、例えば人工膵臓、人工心臓、義肢、及び心臓弁;ステント、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内及び中心静脈カテーテル、レーザー及びバルーン血管形成装置、血管及び心臓機器(チューブ、カテーテル、バルーン)、心室補助装置、血液透析要素、血液酸素付加装置、尿道/尿管/尿機器(フォーリーカテーテル、ステント、チューブ及びバルーン)、気道カテーテル(気管内及び気管開口チューブ及びカフ)、経腸栄養チューブ(例えば経鼻胃チューブ、胃内チューブ及び空腸チューブ)、創傷ドレナージチューブ、胸膜腔、腹膜腔、頭蓋腔及び心膜腔などの体腔のドレン排出を行うのに使用されるチューブ、血液バッグ、試験管、血液採取管、バキュテイナー、注射器、針、ピペット、ピペットチップ、及び血液チューブが挙げられるが、これらに限定されない。
実施例1: グラム陽性菌由来のMSCRAMM(登録商標)タンパク質の同定方法並びに該タンパク質のAドメインの発現及び精製
A.グラム陽性菌の注釈付きゲノム中のLPXTGモチーフ含有細胞壁固定化タンパク質の検索
1.配列決定センターのウェブサイトから、関心事の完全ゲノム配列の複数のアミノ酸配列を得る。これらの配列をローカルシリコングラフィックスマシン(SGI)に保存する。
3.LPXTGモチーフ含有タンパク質を、NCBIから得られ且つSGIにローカルインストールされるPHI-blastを使用して同定する。PHI-blast検索は、縮重LPXTGパターンL-P-X-[TSA]-[GANS](Xは任意のアミノ酸である)を使用する。PHI-blastのテンプレートは個々の生物に応じて変化する。それぞれの生物について、配列相同性をもたないブドウ球菌の2つの公知の細胞壁固定化タンパク質を使用し、また入手できない場合には個々の生物から公知の細胞壁固定化タンパク質を使用した。
4.PHI-blastから得られたLPXTG含有タンパク質を分析して、LPXTGモチーフ含有細胞壁固定化タンパク質の典型的な特徴:N末端にシグナルペプチド、後に疎水性貫膜セグメントが続くC末端の近くにあるLPXTGモチーフ、及びC末端の数個の正帯電残基を含有するタンパク質を選択する。これらは以下に記載のようにして行う:
シグナルペプチド: 本発明者らはhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/のシグナルP予測サーバーを使用する。この方法は、“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites”. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht Soren Brunak and Gunnar von Heijne, Protein Engineering, 10, 1-6 (1997) に記載されている。
LPXTGモチーフの位置: 配列の目視検査
LPXTGモチーフの後の疎水性貫膜セグメント: 本発明者らは貫膜セグメントの予測にhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/のTMHMMサーバーを使用する。幾つかの別の予測ウェブサーバーも使用でき、その中にhttp://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.htmlのTMpred、http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/のDAS及びhttp://www.enzim.hu/hmmtop/ のHMMTOPがある。
C末端の正帯電残基: 目視検査
5.前記の特徴を含有する配列は、推定上のLPXTGモチーフ含有細胞壁固定化タンパク質である。
6.用語“LPXTG”又は“細胞壁”を使用して、ウェブサイトTIGR(総合微生物資源、http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRHomePage.spl)で関心事のゲノム配列に細胞壁固定化タンパク質として注釈されているタンパク質を検索した。
1.配列決定センターのウェブサイトから、複数のゲノム配列を得る。これらの配列をローカルシリコングラフィックスマシン(SGI)に保存する。
2.TIGRから得られるプログラム Glimmer 2.0を使用して遺伝子予測する。これは社内で書かれたUNIX Cシェルスクリプトで促進される。
3.予測遺伝子を、社内で書かれた翻訳プログラムを使用してアミノ酸配列に翻訳する。このプログラムは大量の配列を翻訳することができる。
4.翻訳されたアミノ酸配列を、Section A.2におけるように検索可能データベースにローカルフォーマットする。その後の分析はSection A.3-5に記載の通りである。
推定上のLPXTGモチーフ含有細胞壁固定化タンパク質のアミノ酸配列を、折りたたみ認識ウェブサーバー3D-PSSM(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/)に供する。予測の方法は、Kelley LA, MacCallum RM & Sternberg MJE. Enhanced Genome Annotation using Structural Profiles in the Programm 3D-PSSM. J Mol Biol. 2000 Jun 2; 299(2): 499-520に記載されている。
本発明の有用性をさらに特徴付けるために、エンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)由来のEF1091、EF1092及びEF1093タンパク質のAドメイン並びにエンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)由来のEfae 2926、Efae 2925及びEfae 2924タンパク質Aドメインをクローン化し、発現させ且つ精製した。また、EF1824を大きなサイズのタンパク質であるという理由から2つのセグメント、EF1824AI(aa 43-819)及びEF1824AII(aa 820-1829)にクローン化した。EF1824AIは大腸菌細胞質に不溶性であり、アッセイから除外された。結合され且つ下線を付された配列は、クローン化された推定上のAドメインを表す。
PCR(PCR反応に使用したオリゴヌクレオチドを表3に示す)を使用して、EF0089、EF1091、EF1092、EF1093、EF1099、EF1269、EF1824、EF2224及びEF3023由来のAドメインをエンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis) V583又はエンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis) EF1(EF1099)ゲノムDNAから増幅し、大腸菌発現ベクターPQE-30(Qiagen製)にサブクローン化した。
前記の配列のフランキング領域用のプライマーを使用して、エンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)株由来のゲノムDNA 1μgを増幅した。表1の5種類のエンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)株からのPCR生成物を配列決定し、TIGRデータベース配列と比較した。腸球菌MSCRAMM(登録商標)Aドメイン遺伝子生成物を増幅するのに使用したプライマーを以下に示す。
NCBI検索エンジンを用いて上記のAA配列を使用してblastp検索を行った。見い出されたそれぞれの推定上の相同体について、得られたアクセッション番号を示す。%同一性及び類似性の両方は、照会配列に厳密に一致するAAの%を示し、これに対して類似性はマッチング計算における同類AA変化を含む。
予測された免疫グロブリン様折りたたみを含有するLPXTGモチーフ含有細胞壁固定化タンパク質のリスト。それぞれのゲノム配列についての配列決定センターを、括弧内に示す。ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌由来のCNAの配列を除く全ての配列は、TIGRウェブサイト(www.tigr.org)、総合微生物資源セクションから得ることができる。表皮ブドウ球菌RP64Aゲノム配列は注釈が付かない。しかし、前記に挙げた表皮ブドウ球菌タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチドのコーディネート(coordinate)はTIGRウェブサイトにより得ることができる。
SP0462
SP0463
SP0464
エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis) V583 (TIGR)
EF2224
EF1099
EF1092
EF3023
EF1269
EF0089
EF1824
EF1091
EF1093
EF1075
EF1074
EF1651
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans) UA159(オクラホマ大学)
SMU.610
SMU.987
SMU.63c
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) N315(順天堂大学)
SA2447
SA2290
SA2291
SA2423
SA0742
SA0519
SA0520
SA0521
炭疽菌(Bacillus anthracis) Ames(TIGR)
BA0871
BA5258
精製EF1091、EF1092及びEF1093タンパク質を使用して1パネルのネズミ抗体を産生させた。手短に言えば、一群のBalb/Cマウスを、溶液状でるか又は表5に以下に記載のようにアジュバントと混合したタンパク質1〜10mgの一連の皮下免疫処置を施した:
表5.免疫処置スキーム
慣用の注射 日 量(μg) 経路 アジュバント
一次 0 5 皮下 FCA
追加#1 14 1 腹腔内 RIBI
追加#2 28 1 腹腔内 RIBI
追加#3 42 1 腹腔内 RIBI
犠牲時に、血清を採取し、MSCRAMM(登録商標)タンパク質ACE、EF1091、EF1092及びEF1093に対してELISAアッセイで力価測定した(表6)。
Immulon 2-HB高タンパク質結合96ウエルプレートを、EF1091、EF1092又はEF1093の精製Aドメイン100ng/ウエルで被覆し、2〜8℃で一夜インキュベートした。プレートを、Skatron Skanwasherプレートウォシャーを使用してPBS/0.5%Tween 20で4回洗浄し(350μl/ウエル)、次いで及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液200μl/ウエルを用いて室温で1〜2時間ブロックした。インキュベーションの後に、プレートを上記のようにして洗浄し、96ウエルのプレートのB〜H列のそれぞれのウエルに100μlの1×PBS、0.05%Tween 20、0.1%BSA緩衝液を加えた。次いで、陰性対照血清(免疫前Balb/C血清)及び超免疫試料を1×PBS、0.05% Tween 20、0.1%BSA緩衝液に1:100希釈した。200μlの陰性対照血清を、96ウエルのプレートのウエルA1及びA2に二重反復試験として加え、またそれぞれの希釈超免疫試験血清200μlをウエルA3〜A12に二重反復試験として加えた。2倍連続希釈をH列を最後とするプレートで行い、残りの100μlを廃棄した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを前記のようにして再度洗浄し、次いで二次抗体溶液、ヤギ抗マウスIgG(全分子)−AP複合体 (Sigma Cat. A-5153)の1:5000希釈液をそれぞれのウエルに加え(100μl/ウエル)、そして1時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートをPBS/0.5%Tween 20(350μ/ウエル)を用いて4回洗浄した。発色溶液、すなわち1Mジエタノールアミン、pH9.8、0.5mM MgCl2に溶解した1mg/mlの4-ニトロフェニルリン酸(pNPP)を、それぞれのウエルに加え(100μl/ウエルl)、プレートを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、それぞれのウエルの吸光度(A405nm)を、Spectra MAX 190 プレート読み取り装置(Molecular Devices Corp.製、カリフォルニア州サニベール所在)を使用して測定した。データをソフトウエアSOFTmax Pro v.3.1.2.(Molecular Devices Corp.製、カリフォルニア州サニベール所在)を使用して分析した。陰性対照血清の吸光度の2倍であった超免疫血清の希釈液を、超免疫血清試料の力価として使用した。
Balb/cマウスから誘導した(実施例3に記載のようにして)抗血清を使用して、エンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)株の表面で自然に(natively)発現したEF1091、EF1092又はEF1093を同定した。
細菌試料(表7)を採取し、洗浄し、次いでウサギIgG (50mg/ml)でブロックした後にポリクロナール抗血清又は免疫前血清(対照)と共に1:2000に希釈でインキュベートした。血清と共にインキュベートした後に、細菌細胞を、検出抗体として働くヤギ-F(ab´)2-抗-マウス-F(ab´)2-FITC と共にインキュベートした。抗体を標識した後に、細菌細胞 をFACScaliberフローサイトメーターにより吸引して、蛍光発光を分析した(励起:488、発光:570)。それぞれの菌株について、10,000個のイベント(event)を集め、測定した。
モノクロナール抗体(mAb)を産生させ、特定することを目的に、方法を策定して高親和性であり、細胞外マトリックスタンパク質(ECM)の結合を中断し且つ制限することができ且つ生体内で治療効果を実証するmAbをEF1091、EF 1092及びEF 1093に対して産生させた。大腸菌で発現させ且つ精製したEF1091、EF1092及びEF1093 タンパク質を使用して、1パネルのネズミモノクロナール抗体を産生させた。手短に言えば、一群のBalb/C又はSJLマウスを、溶液状の又は表8に以下に記載のようにアジュバントと混合したタンパク質1〜10□gの一連の皮下免疫処置を施した:
表8.免疫処置スキーム
RIMMS注射 日 量(μg) 経路 アジュバント
#1 0 5 皮下 FCA/RIBI
#2 2 1 皮下 FCA/RIBI
#3 4 1 皮下 FCA/RIBI
#4 7 1 皮下 FCA/RIBI
#5 9 1 皮下 FCA/RIBI
慣用の注射 日 量(μg) 経路 アジュバント
一次 0 5 皮下 FCA
追加#1 14 1 腹腔内 RIBI
追加#2 28 1 腹腔内 RIBI
追加#3 42 1 腹腔内 RIBI
犠牲時(RIMMS)に又は追加免疫後7日目に(慣用)、血清を採取し、MSCRAMM又は全細胞〔エンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)及び/又はエンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)〕の免疫処置に対してELISAアッセイで力価測定した。
EF1091融合から生じたクローンを、特異的抗EF1091抗体産生について標準ELISAアッセイを使用して選別した。陽性クローンを拡大し、さらにフローサイトメトリーによる全細菌細胞結合アッセイ及びBiacore分析によるEF1091結合における活性について試験した(表9)。
Immulon 2-HB高タンパク質結合96ウエルプレート(Dynex製)を、1μg/ウエルの1×PBS、pH7.4溶解rEF1091で被覆し、室温で2時間インキュベートした。複数のELISAにおいて洗浄工程は全て、1×PBS、0.05%Tween-20洗浄緩衝液を用いて3回行った。プレートを洗浄し、1%BSA溶液を用いて室温で1時間ブロックし、その後にハイブリドーマ上清試料をウエルに加えた。プレートを試料及び関連がある対照、例えば媒体単独と共に室温で1時間インキュベートし、洗浄し、次いで1×PBS、0.05%Tween-20、0.1%BSAに1:5000希釈したヤギ抗-マウスIgG-AP (Sigma製) を二次試薬として使用した。プレートを、4-ニトロフェニルリン酸(pNPP)(Sigma製)の1mg/ml溶液を加え、次いで37℃で30分間インキュベートすることによって発色させた。吸光度を、405nmでSpectraMax 190 Plate Reader (Molecular Devices Corp.製)を使用して読み取った。OD405≧バックグラウンドよりも3倍(媒体単独、〜0.1 OD)を有していた抗体上清を陽性とみなした。
分析全体を通じて、流量を10ml/minで一定のままであった。EF1091注入の前に、試験抗体をチップにRAM−Fc結合によって吸着させた。時間0で、EF1091を30mg/mlの濃度で、チップ上に3分間注入し、次いで2分間解離させた。分析のこの相は、mAb/EF1091相互作用の相対結合及び解離速度を測定した。
細菌試料を収集し、洗浄し、次いで2mg/ml濃度のmAb又はPBS単独(対照)と共にインキュベートし、その後にウサギIgG (50 mg/ml)を用いてブロックした。抗体と共にインキュベートした後に、細菌細胞を、検出抗体として働くヤギ-F(ab´)2-抗-マウス-F(ab´)2-FlTCと共にインキュベートした。抗体を標識した後に、細菌細胞をFACScaliberフローサイトメーターにより吸引して、蛍光発光を分析した(励起:488、発光:570)。それぞれの細菌株について、10,000個のイベント(event)を集め、測定した。
エンテロコッカス属細菌から発現されるこれらのMSCRAMMが結合する潜在的(potential)細胞外マトリックスタンパク質を理解することは、治療への示唆と共に極めて生物学的に重要である。
組換えタンパク質EF1091、EF1092及びEF1093 (表10) の細胞外マトリックス分子との結合活性を調べるために、96ウエルCostarマイクロタイタープレート(Corning製)の二重のウエルを、100μLの1×PBS、pH7.4(Gibco製)に溶解したヒトコラーゲンI型、II型、III型、IV型、V型又はVI型(Rockland Immunochemicals製)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、ビトロネクチン(Sigma製)あるいはエラスチン(CalBiochem)の2μgを用いて4℃で一夜被覆した。ウエルを、0.05%Tween 20を含有する1×PBS、pH7.4(1×PBST)で4回洗浄した。次いで、ウエルをBSA in 1×PBS、pH7.4に溶解したBSAの1%(w/v)溶液で1時間ブロックし、次いで1×PBSTで4回洗浄した。次に、0.1%BSAを含有する1×PBST(1×PBST-BSA)100μlに溶解した組換えタンパク質5μgを、それぞれのウエルに加えた。前記タンパク質と共に室温で1時間インキュベートした後に、ウエルを1×PBSTで4回洗浄し、次いでそれぞれの組換えタンパク質に対して生じたマウス ポリクロナール 抗血清100□Lをそれぞれのウエルに1×PBST-BSAに1:2000の希釈率で加えた。抗血清と共に室温で1時間インキュベートした後に、ウエルを1×PBSTで4回洗浄した。最後に、ヤギ抗マウスIgG−アルカリ性ホスファターゼ複合体(Sigma製) を1×PBST-BSAで1:2000希釈し、次いで100μLをそれぞれのウエルに加えた。このインキュベーションを室温で1時間行い、次いでウエルを1×PBSTで4回洗浄した。それぞれのウエルに100μLの1mg/mL pNP溶液 (Sigma 104錠剤)を加え、室温で30分間インキュベートすることによって、アルカリ性ホスファターゼを発色させた。発色は、それぞれのウエルに50μLの2M NaOHを加えることによって停止させた。405nm (A405)での吸光度を、SpectraMax 190 (Molecular Devices製) を使用して測定した。得られたシグナルがバックグラウンドよりも2.5倍を越えて大きい場合には、反応性を陽性として記録した。
前記のエンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)に感染したいるか又は感染していない入院患者から採取した腸球菌タンパク質に対する抗体の存在を、若干の変更を加えた(Arduino et al., 1994)(Nallapareddy et al., 2000b)に記載のELISA アッセイで試験した(表11)。手短に言えば、100μlのPBSに溶解したそれぞれの精製腸球菌タンパク質20ngをマイクロプレート(96ウエル、4HBX、Thermo Labsystems製、マサチューセッツマサツ州フランクリン所在)に4℃で一夜塗布した。プレートを、1%BSA、0.01%Tween20を用いて周囲温度で1時間ブロックし、次いでブロッキング緩衝液に溶解した血清1μlを加えた。それぞれの血清を、:100から1:6400までの連続希釈液を用いて三重反復して試験した。プレートを周囲温度で2時間インキュベートし、次いでPBSに溶解した0.01%Tween 20で3回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合抗ヒトIgGの1:3000希釈液100μlを加え、2時間インキュベートした。3回洗浄した後に、0.1Mクエン酸塩−酢酸塩緩衝液、pH6.0中でH2O2の存在下で3,3´,5,5´-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いて周囲温度で15分間シグナルを検出した。2M H2SO4を用いて反応を停止させ、次いで450nmで吸光度を記録した。適当な対照からA450nm値を差し引くことによって力価を測定した。血清力価についてカットオフレベルを調べるために、前のエンテロコッカス・フェカーリス(E. faecalis)に感染していない健常者から得た4種の追加の対照血清をアッセイした。それぞれの対照血清について平均A450nm値の合計及び2回の標準偏差を陽性力価についてカットオフとして挙げた。
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Claims (40)
- 細胞外マトリックス分子に結合するグラム陽性菌由来のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質の同定方法であって、配列情報のデータベースを検索してC末端領域にLPXTGモチーフを有するグラム陽性菌由来の推定上のタンパク質配列を同定し、同定された配列を分析して1個又はそれ以上のIg様折りたたみ領域の存在を調べ、次いで前記の推定上のタンパク質配列を、この配列が細胞外マトリックス分子に結合するLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質の1個又はそれ以上のIg様折りたたみ領域を有する場合に、細胞外マトリックス分子に結合するLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質として明確に同定することからなる、細胞外マトリックス分子に結合するグラム陽性菌由来のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質の同定方法。
- グラム陽性菌がエンテロコッカス属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属及びバシラス属からなる群の中から選択される属由来のものである請求項1に記載の方法。
- グラム陽性菌がエンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)及び炭疽菌(Bacillus anthracis)からなる群の中から選択される種由来のものである請求項1に記載の方法。
- 推定上のLPXTG含有タンパク質配列のIg様折りたたみが、該タンパク質の配列を、細胞外マトリックス分子に結合する公知のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質のIg様折りたたみの配列と比較することによって調べられるものである請求項1に記載の方法。
- 推定上のLPXTG含有タンパク質が、配列の比較に基づいた確率値を使用して公知のLPXTG含有タンパク質と比較されるものであり且つ推定上のLPXTG含有タンパク質が、確率値が<0.25である場合に、細胞外マトリックス分子に結合するLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質として同定されるものである請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により同定される単離タンパク質。
- タンパク質が、SP0368、SP0462、SP0463、SP0464;EF2224、EF1091、EF1092、EF1093、EF3023、EF1269、EF0089、EF1824、EF1075、EF1074、EF1651、SMU.610、SMU.987、SMU.63c、SA2447、SA2290、SA2291、SA2423、SA0742、SA0519、SA0520、SA0521、BA0871、BA5258、SERP_GSE_14_6.AA、SERP_GRE_2_50.AA、SERP_GSE_9_28.AA、SEPN_5_124.AA及びSEPN_8_63.AAとして同定されるグラム陽性菌タンパク質からなる群の中から選択されるものである請求項6に記載の単離タンパク質。
- 請求項6に記載のタンパク質の単離Aドメイン。
- 請求項6に記載のタンパク質に結合することができる単離抗体。
- 請求項6に記載のタンパク質をコードする単離核酸配列。
- 細胞外マトリックス分子に結合するグラム陽性菌由来のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質の同定方法であって、配列情報のデータベースを検索してC末端領域にLPXTGモチーフを有するグラム陽性菌由来の推定上のタンパク質配列を同定し、同定された配列を分析して、該配列がN末端にシグナルペプチドを有し、疎水性貫膜セグメントを伴うC末端の近くにLPXTGモチーフを有し且つC末端に数個の正帯電残基を有するか否かを調べ、次いで前記の推定上のタンパク質配列を、該配列がN末端にシグナルペプチドを有し、疎水性貫膜セグメントを伴うC末端の近くにLPXTGモチーフを有し且つC末端に数個の正帯電残基を有する場合に、細胞外マトリックス分子に結合するLPXTG含有の細胞壁固定化表面タンパク質として明確に同定することからなる、細胞外マトリックス分子に結合するグラム陽性菌由来のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質の同定方法。
- 請求項11の方法により同定された単離タンパク質。
- 請求項12に記載のタンパク質の単離Aドメイン。
- 請求項12に記載のタンパク質に結合することができる単離抗体。
- 請求項11に記載のタンパク質をコードする単離核酸配列。
- 配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:19、配列番号:20〜24からなる群の中から選択されるアミノ酸配列及び前記配列のAドメインを有するグラム陽性菌由来の単離LPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質又は前記タンパク質由来のAドメイン。
- 請求項16に記載のタンパク質をコードする単離核酸配列。
- 配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16及び配列番号:18からなる群の中から選択される核酸配列又はその縮重を有するグラム陽性菌由来のLPXTG含有細胞壁固定化表面タンパク質又は該タンパク質由来のAドメインをコードする単離核酸。
- 請求項16に記載のタンパク質に結合することができる単離抗体。
- 抗体がモノクロナール抗体である請求項19に記載の抗体。
- 一本鎖抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、ヒト化抗体及びヒトモノクロナール抗体からなる群の中から選択される請求項19に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト又は動物においてグラム陽性菌感染症を治療又は予防するものである請求項19に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト又は動物において非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、皮下投与、エアゾール投与又は静脈内投与に適したものである請求項19に記載の抗体。
- 請求項19に記載の抗体を含有する単離抗血清。
- 請求項19に記載の抗体と、該抗体による結合を検出するための手段とからなる診断キット。
- 前記の結合の検出手段が前記抗体に連結される検出可能標識からなるものである請求項25に記載の診断キット。
- ヒト又は動物患者に有効量の請求項19に記載の抗体を投与することからなるグラム陽性菌の感染症の治療又は予防方法。
- 有効量の請求項19に記載の抗体と、製薬学的に許容し得るビヒクル、担体又は賦形剤とを含有してなる医薬組成物。
- 免疫原有効量の請求項8に記載のタンパク質又はペプチドと、製薬学的に許容し得るビヒクル、担体又は賦形剤とを含有してなる医薬組成物。
- 免疫原有効量の請求項16に記載のタンパク質又はペプチドと、製薬学的に許容し得るビヒクル、担体又は賦形剤とを含有してなる医薬組成物。
- ヒト又は動物患者に有効量の請求項19に記載の抗体を投与することからなるグラム陽性菌の感染症の治療又は予防方法。
- グラム陽性菌によって引き起こされる感染症の診断方法であって、かかる感染症を有すると疑われる生物材料の試料に請求項19に記載の抗体を導入し、次いで前記抗体が前記試料中の抗原に結合するか否かを調べることからなるグラム陽性菌によって引き起こされる感染症の診断方法。
- ヒト又は動物に免疫有効量の請求項8に記載のタンパク質を投与することからなるヒト又は動物における免疫原性反応の誘発方法。
- 免疫原有効量の請求項8に記載のタンパク質と、製薬学的に許容し得るビヒクル、担体又は賦形剤とを含有してなるワクチン。
- グラム陽性菌由来の抗原を含有すると疑われる生物試料中のグラム陽性菌由来の抗原の存在のアッセイ方法であって、(a)前記試料を、固相免疫吸着剤に結合された固相固定化抗体か又は可溶性標識抗体の形の請求項19に記載の抗体のいずれかと同時に含有する混合物を形成し;(b)工程(a)で形成された混合物を、試料中の抗原を前記の固定化抗体又は前記の標識抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下でインキュベートし;次いで(c)固相免疫吸着剤に結合された標識抗体を検出するか又は標識可溶性抗体を検出することからなるグラム陽性菌由来の抗原を含有すると疑われる生物試料中のグラム陽性菌由来の抗原の存在のアッセイ方法。
- さらに洗浄、攪拌、振盪又は濾過工程を含む請求項35に記載の方法。
- グラム陽性菌抗原を有すると疑われるヒト又は動物患者におけるグラム陽性菌抗原の量の監視方法であって、(a)前記のヒト又は動物患者から生物試料を採取し;(b)前記の試料に測定可能量の請求項19に記載の抗体を導入し;(c)該試料を、抗体と組み合わせた際に前記の抗原と抗体とを結合させるのに十分な時間及び条件下でインキュベートし;次いで(d)該試料中に存在するグラム陽性菌抗原の量を示す抗原−抗体結合の量を測定することによって試料中の抗原の量を監視することからなるグラム陽性菌抗原を有すると疑われるヒト又は動物患者にグラム陽性菌抗原の量の監視方法。
- 免疫原有効量の請求項16に記載のタンパク質と、製薬学的に許容し得るビヒクル、担体又は賦形剤とを含有してなる医薬組成物。
- グラム陽性菌によって引き起こされる感染症の診断方法であって、請求項16に記載のタンパク質をかかる感染症を有すると疑われる生物材料の試料に導入し且つ前記抗体が前記試料中の抗体に結合するか否かを調べることからなるグラム陽性菌によって引き起こされる感染症の診断方法。
- ヒト又は動物に免疫有効量の請求項16に記載のタンパク質を投与することからなるヒト又は動物における免疫原性反応の誘発方法。
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