JP2005535313A - オステオポンチン、オリゴデンドロサイトおよび髄鞘形成 - Google Patents

Abstract

オステオポンチンはオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーである。オステオポンチンはまた、オリゴデンドロサイトの分化および中枢神経系の髄鞘形成をモジュレートする。オステオポンチンは、オリゴデンドロサイト前駆体の遊走を誘導する。

Description

オステオポンチンはオリゴデンドロサイトの発生に影響する。オリゴデンドロサイトは髄鞘再生に有用であるため、オステオポンチンは髄鞘再生においてある役割を有する。

オステオポンチンは、分子量44〜66kDの範囲のリン蛋白質であり、この分子量は種の起源および修飾の程度たとえばグリコシル化によって変動する。オステオポンチンはまた、分泌されるリン蛋白質１、骨唾液蛋白質、尿結石蛋白質および早期Tリンパ球活性化−１（eta−1）抗原としても知られている。オステオポンチンは酸性で、カルシウムを結合する。オステオポンチンは、一次的に細胞表面におけるα_vβ₃インテグリン、またα_vβ₁、α_vβ₅、α₉β₁およびα₄β₁とも相互作用する接着性アミノ酸配列Arg−Gly−Asp（RGD）を含有する。オステオポンチンは、多くの異なる細胞タイプにおいて発現され、多くの機能を担う。たとえば、オステオポンチンは組織マトリックスのリモデリングまたは骨吸収に、結合因子として、また免疫細胞機能および転移にある役割を有する。ヒトでは、オステオポンチンをコードする単一の遺伝子が第４染色体の長腕上に位置する。

オステオポンチンはまた神経系の様々な細胞にも見出される。神経節および脳の様々な部分における一次感覚ニューロンでオステオポンチンの発現が見出されている。したがって、オステオポンチンは、神経の発達および機能において、ある役割を有する可能性がある。

多発性硬化症は一部、神経プロセスの髄鞘脱落を特徴とする。髄鞘脱落は中枢および末梢神経系における他のいくつかの衰弱性疾患、たとえば脊髄損傷、神経感染およびニューロパシーにおいて観察される。

髄鞘脱落を特徴とする疾患および髄鞘脱落を有する齧歯類モデルでは、髄鞘の再生を生じる証拠がある。たとえば、多発性硬化症では、髄鞘脱落と髄鞘再生のサイクルがあるように思われる。

本発明の目的は、オステオポンチンのレベルにより、オリゴデンドロサイトの分化、オリゴデンドロサイトの数、および髄鞘形成に影響を与える方法を提供することにある。ニューロンの髄鞘脱落が不適当なシグナル伝達を招くので、髄鞘形成の制御は有益である。中枢神経系においては、髄鞘はオリゴデンドロサイトによって形成される。

本発明の他の目的はオステオポンチンのレベルをモジュレートすることによって、髄鞘形成をモジュレートする方法を提供することにある。

本発明の更なる目的は、オステオポンチンのレベルをモジュレートすることによって、オリゴデンドロサイトの分化をモジュレートする方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、オステオポンチンレベルをモジュレートすることにより、オリゴデンドロサイトの遊走をモジュレートすることにある。オステオポンチンのレベルのモジュレートは、オステオポンチン代謝または受容体たとえばα_vβ₃の代謝に影響を与えることにより起こすことができる。オステオポンチンの作用はＴ_H1細胞によって仲介または影響される。

本発明の以上の目的および他の目的は、オステオポンチンがオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を防止するという観察から得られた。すなわち、オステオポンチンレベルの低下は、オリゴデンドロサイトの分化を加速する。分化におけるこの低下は前駆細胞の増殖を伴う。たとえば髄鞘脱落の周辺において、前駆細胞数の増加はさらに多数の前駆細胞、最終的には多数のオリゴデンドロサイトを生じる。オステオポンチンはまた、オリゴデンドロサイトの髄鞘脱落領域への遊走を刺激する。多数のオリゴデンドロサイトは髄鞘再生を増強する。

これらの目的はまた、標的細胞がオステオポンチンを取得し、これに結合し、および／またはこれに応答する能力に影響を与えることにより達成できる。オステオポンチンを取得することができず、そして、それに応答することができない細胞は、分化せず、代わりに増殖する。

オステオポンチンは、ヒトオリゴデンドロサイト細胞系の細胞を生じ、異常な生育特性を提供することが観察されている。オステオポンチンに暴露すると、オリゴデンドロサイト細胞系の細胞は大きな立方体の形状から、前駆細胞に類似する小さな双極性形状に変化する。オステオポンチンは、神経芽腫細胞に対しては同様の効果を有しなかった。オリゴデンドロサイトおよびその前駆体の形態学的特徴は周知であり、分子がオステオポンチンの脱分化または分化阻害活性を模倣する活性を有するか否かの決定に使用することができる。したがって、オステオポンチンはオリゴデンドロサイトの脱分化を惹起し、および／または前駆体もしくは分化程度の低い細胞と思われる細胞の成熟オリゴデンドロサイトへの分化を妨げる。

オステオポンチンのレベルが低いと、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、他の機能の中でもとくにニューロンに髄鞘形成させることができる成熟オリゴデンドロサイトへの分化を開始する。

オステオポンチンはまた、走化性因子としても作用する。オステオポンチンはラットの髄鞘再生病変中に存在する。オリゴデンドロサイト前駆細胞はそれらの病変部に遊走し、そこでそれらの細胞は髄鞘の再生に寄与する。細胞は、オステオポンチンの濃度が低い領域からオステオポンチンの濃度が高い領域へ、オステオポンチンの勾配に沿って移動する。オステオポンチンは、髄鞘再生を起こす髄鞘脱落領域に、前駆細胞を含めた応答細胞の遊走を引き起こす。

したがって、オステオポンチンはオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を抑制し、同時にオステオポンチンの濃度の高い領域への、このようなオリゴデンドロサイト前駆細胞の遊走を誘導する。

オステオポンチンはまたマクロファージ、マイクログリアまたはそれらの両者の髄鞘脱落部位への遊走を誘導する。これらの細胞はミエリンのデブリを「清浄化」する。ミエリンのデブリの除去は髄鞘再生の前提条件である。

本発明の目的のため、オステオポンチンとその受容体間の相互関係から、化学引力（chemoattraction）および／または分化抑制の所望の目的を取得するために、いずれかの操作を実行することができることは、本分野の技術者に認識されるものと思われる。すなわち、オステオポンチンまたはその受容体のいずれかに関するここでの教示は同等であると考えるべきであり、化学引力もしくは分化の制御のような所望の結果が得られる場合に、いずれに対しても適用できる。

オステオポンチンの遺伝子配列は周知であり、技術者によって利用することができる。すなわち、周知の組換え核酸技術（たとえばSambrookら編“Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2^nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989および“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N.Y. 1989）を用いて、選択された細胞におけるオステオポンチンの発現を得るために慣例の方法が使用できる。オステオポンチンの核酸を適当なベクター中にサブクローニングし、適当な細胞に導入して発現させる。ベクターは染色体外に維持してもよく、または宿主ゲノム中に組み込まれるよう構成してもよい。様々な制御エレメントをベクター中に導入してオステオポンチンの高レベルの発現またはその制御された発現を得ることができる。たとえば、エンハンサーとくにプロモーター、スプライス部位等を使用することができる。

ある種の実施態様においては、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおける優先的な核酸の発現を指示することができる（たとえば組織特異的調節エレメントを核酸の発現に使用できる）。組織特異的調節エレメントは、本技術分野において周知である。適当な組織特異的プロモーターの例には、たとえば、ニューロン特異的プロモーター（たとえばニューロフィラメントプロモーター；Byrneら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 5473-5477）ならびに線維芽細胞、内皮細胞、マイクログリア細胞およびオリゴデンドロサイトに特異的なプロモーターがあるが、これらに限定されるものではない。発生的に調整されるプロモーターたとえばマウスhoxプロモーター（Kesselら, Science (1990) 249: 374-379）およびα−フェトプロテインプロモーター（Campesら, Genes Dev. (1989) 3: 537-546）も包含される。

また、発現の制御は本技術分野で周知のように、特定の誘導可能プロモーターを用いることによっても得られる。たとえば、アクティベーター蛋白質に結合し、これによって誘導されるオペレーターエレメントを使用するテトラサイクリン／tetアクティベーターシステムを使用することができる。しかしながら、アクティベーターはテトラサイクリンを結合し、その反応は、アクティベーターのオペレーターエレメントへの結合を防止する。したがって、テトラサイクリンはオペレーターエレメントの下流にクローン化されたトランスジーンの発現を阻害する。

本発明の目的はオステオポンチンの機能を得ることであることから、トランケートまたは修飾型の、発現が増加もしくは低減された、操作が容易なまたは望ましくない作用の最小化されたオステオポンチンを得ることが可能である。すなわちオステオポンチン核酸または蛋白質を周知の技術によって操作して、オステオポンチン受容体に結合し、また本発明で所望の特定の作用をもたらすかまたは求める能力を維持するオステオポンチンのトランケートまたは修飾型を得ることができる。

核酸の突然変異は標準的技術たとえば部位特定突然変異およびＰＣＲ仲介突然変異により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１または２個以上の推定非必須アミノ酸残基に行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置き換えられる置換である。たとえば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびシステイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン）、分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリンおよびイソロイシン）ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）がある。すなわち、オステオポンチンまたはその受容体中の推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができる。別法として、突然変異を、オステオポンチンのコード配列のすべてまたは部分に沿ってランダムに、たとえば飽和突然変異により導入し、得られた突然変異体をオステオポンチン活性についてスクリーニングし、活性を維持する突然変異体を同定することができる。突然変異後、コードされた蛋白質を組換えにより発現させ、その蛋白質の活性を測定することができる。

本発明はまた、オステオポンチンまたはその受容体の発現を本質的に低下させる、アンチセンス核酸分子、すなわち蛋白質をコードするセンス核酸に相補性の分子、たとえば二重鎖cDNA分子のコード鎖に相補性またはmRNA配列に相補性の分子を包含する。したがってアンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、オステオポンチンもしくは受容体の全体をコードする鎖に対して、またはその部分のみ、たとえば蛋白質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）のすべてもしくは部分に対して、相補性とすることができる。アンチセンス核酸分子は、オステオポンチンまたはその受容体をコードするヌクレオチド配列コード鎖の非コード領域に対するアンチセンスとすることができる。非コード領域（“５'および３'非翻訳領域”）はコード領域に隣接する５'および３'配列であり、アミノ酸には翻訳されないが、調節的役割を有し得る。オステオポンチンまたはその受容体の正常な発現がフランキング部位に依存する場合、それに標的化してもよい。

オステオポンチンまたはその受容体をコードする、与えられたコード鎖配列が既知であれば、本発明のアンチセンス核酸はWatson & Crick塩基対の法則に従い設計することができる。アンチセンス核酸分子は適当なmRNAの全コード領域に対して相補性とすることができるが、さらに好ましくは関連mRNAのコードまたは非コード領域の部分のみに対するアンチセンスのオリゴヌクレオチドである。たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オステオポンチンmRNAの翻訳開始部位を囲む領域に相補性とすることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば長さ約５、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドとすることができる。本発明のアンチセンス核酸は、本技術分野で既知の操作を用いる化学合成および酵素リゲーション反応を使用して構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるため、もしくはアンチセンスおよびセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々な修飾ヌクレオチド、たとえばホスホロチオエート誘導体、ホスホネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができる。

このようなアンチセンス技術を用いて、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン受容体遺伝子が非機能性にされたノックアウト動物を産生することができる。アンチセンス分子はコード配列または非コード配列、たとえば調節配列たとえばプロモーターに向けることができる。アンチセンス分子はRNAまたはDNAとすることができる。一般に不活性化作用は、アンチセンス分子が細胞分裂により分解または希釈されるために一過性である。しかしながら、アンチセンス構築体は構成的または誘導性プロモーターで構成し、アンチセンス分子のさらに強力な発現を達成することができる。

さらに永続する不活性化は、アンチセンス構築体を宿主細胞のゲノムに組み込むことにより得ることができる。それは、本技術分野において周知のように、たとえば均一組換えによって達成できる。胚細胞もしくは前駆細胞における均一組換えによって、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン受容体遺伝子が組織、臓器または全生物体において不活性な動物を産生させることが可能で、最後のシナリオではノックアウトトランスジェニック生物を生じる。

アンチセンス核酸の発生に使用できる修飾ヌクレオチドの例には、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルケオシン、イノシン、N⁶−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N⁶−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルケオシン、5−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N⁶−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸、ウイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシルおよび2,6−ジアミノプリンが包含される。また、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生させることができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたRNAは興味ある標的核酸に対してアンチセンス方向である）。

本発明のアンチセンス核酸分子は、通常、対象に投与されるか、またはオステオポンチンもしくはその受容体をコードする細胞性mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズもしくは結合するようにインサイチュで発生させ、たとえば転写および／または翻訳を阻害することによって蛋白質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する、従来のヌクレオチド相補性によってなされるか、または、たとえばDNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用により、またはオステオポンチンまたはその受容体の調節領域に結合することによってなされる。

本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位への直接注射である。またアンチセンス核酸分子は選択された標的細胞を修飾し、ついで全身的に投与されることができる。たとえば、全身投与のためには、たとえば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、たとえば分子が選択された細胞表面に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾できる。アンチセンス核酸分子もまた、ここに記載のベクターを用いて、細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子を強力なプロモーターの制御下に置くことができる。pol IIまたはpol IIIプロモーターが好ましい。

本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子とすることができる。α−アノマー核酸分子は、それらの鎖と互いに平行して走る、相補性RNAとの特異的二重鎖ハイブリッドを形成する（Gaultierら, Nucleic Acids Res. (1987) 15: 6625-6641）。アンチセンス核酸分子はメチルリボヌクレオチド（Inoueら, Nucleic Acids Res. (1987) 15: 6131-6148）、またはキメラRNA−DNA類縁体（Inoueら, FEBS Lett. (1987) 215: 327-330）を含むこともできる。

本発明はまた、リボザイムも包含する。リボザイムはリボザイムがハイブリダイズするmRNAのような単一鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。したがって、リボザイム（たとえばハンマーヘッドリボザイム、Haselhoffら, Nature (1988) 334: 585-591に記載された）は関連mRNA転写体を触媒的に分解して、そのmRNAの翻訳を阻害するために使用することができる。オステオポンチンまたは受容体核酸に特異性を有するリボザイムは、オステオポンチンまたは受容体のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。たとえばテトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、オステオポンチンまたは受容体mRNAにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補性であるように構築される。たとえば米国特許4,987,071および5,116,742参照。また、オステオポンチンmRNAはRNA分子のプールからの特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択するために使用することができる（たとえば、Bartelら, Science (1993) 261: 1411-1418参照）。

本発明はまた、トリプルヘリックス構造を形成する核酸分子を包含する。たとえば、オステオポンチン遺伝子の発現は、標的細胞におけるオステオポンチン遺伝子の転写を防止するトリプルヘリックス構造を形成するために、オステオポンチンの調節領域（たとえばオステオポンチンプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補性のヌクレオチド配列を標的化することにより阻害することができる。一般的には、Helene, Anticancer Drug Dis. (1991) 6 (6): 569；Helene Ann, NY Acad. Sci. (1992) 600: 27およびMaher, Bioassay (1992) 14 (12): 807参照。

好ましい実施態様では、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において、たとえば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善するために修飾することができる。たとえば、核酸のデオキシリボースホスフェート骨格はペプチド核酸を発生するように修飾できる（Hyrupら, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4: 5参照）。ここで用いられる「ペプチド核酸」または「PNA」の語は核酸模倣体、たとえばデオキシリボースホスフェート骨格がシュードペプチド骨格により置換され、４種の天然核酸塩基のみが残されているDNA模倣体を意味する。PNAの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下におけるDNAおよびRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら（1996）前出；Perry-O'Keefeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1996）93: 14670に記載されているような標準的固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施できる。

ここに開示したように塩基対はオステオポンチン発現または受容体発現を妨げるのに必須ではなく、アプタマーは、蛋白質が他の蛋白質または核酸と相互作用するのと全く同じ方法で特定の核酸と相互作用する核酸であり、それは変化、他の吸引力およびコンフォーメーションに依存する。

さらにある種の模倣体は核酸である必要はなく、蛋白質または炭水化物がオステオポンチンまたは受容体核酸に対する特異性を有することが可能であり、それらの転写または翻訳を防止することができる。

オステオポンチンまたはその生物学的に活性な部分が組換えによって産生される場合、培養メジウムを実質的に含まないことも好ましい。すなわち、培養メジウムは蛋白質調製液の容量の約20％、10％もしくは５％未満、またはより少ない量で存在する。

オステオポンチンまたはその部分が化学合成により製造される場合には、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、蛋白質の合成に関与する、化学物質前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、このようなオステオポンチンの調製液は、（乾燥重量に対し）約30％、20％、10％もしくは５％未満またはそれより少ない量の化学物質前駆体または非オステオポンチン化学物質を有する。

オリゴデンドロサイト細胞およびその前駆体は髄鞘再生に重要であるため、適当な宿主細胞はオリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆体である。このようなトランスフォームされた細胞によるオステオポンチンの発現は、トランスフォームされた細胞
の部位における、天然に生じるオリゴデンドロサイト前駆体またはオリゴデンドロサイト遊走の焦点として役立つ。

トランスフォーメーションに適当な宿主細胞は、オステオポンチンを分泌するマイクログリア細胞のようなグリア細胞である。この場合も、トランスフォームされたグリア細胞によって産生されるオステオポンチンが、オリゴデンドロサイト前駆体の特定部位への遊走を刺激する。オステオポンチンはまた、オリゴデンドロサイトの分化の遅延を生じる。オリゴデンドロサイトの成熟の低下およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖の低下は、最終的に、特定部位におけるオリゴデンドロサイト数を上昇させ、それにより髄鞘再生過程を増大または上昇させる。

トランスフォーメーションに適当な他の細胞は、線維芽細胞または特定部位に局所化できる他の内皮細胞である。線維芽細胞は特定の部位でオステオポンチンを発現することが可能で、これによってオリゴデンドロサイト前駆体の数を増加させる。

トランスフォームされたこのような細胞を、髄鞘再生が要求される部位、多くの場合、中枢神経系に置くことができる。すなわち、トランスフォームされた細胞を移植するための様々な既知の外科的方法を用い、所望の部位にオステオポンチンを発現させることができる。

別法として、精製されたオステオポンチンまたはトランケートされた生物学的に有効なその部分は、部位に点滴するか、または放出デバイスたとえばシラスティックインプラント等に配置することができる。すなわち、オステオポンチンは所望の髄鞘再生部位に、予め定められた速度で、局所的に放出される。オステオポンチンはその部位に細胞を吸引する働きを有する。

オリゴデンドロサイト前駆細胞およびマイクログリアにより発現される、たとえば、オステオポンチンはそれらの細胞集団についてのマーカーである。したがって、オステオポンチンの検出は、たとえばオリゴデンドロサイト前駆細胞を同定するための手段である。オリゴデンドロサイト前駆細胞の性質を探索するためには、多くの異なる方法たとえばRIA、ELISA、TaqMan、ノーザンブロットまたは蛍光アッセイを使用することができる。

たとえば、オステオポンチンを能動的に産生、分泌する細胞を同定するためにはオステオポンチンに対する抗体が使用できる。抗体はオステオポンチンまたはオステオポンチンmRNAに対するものでよく、単独でもリボソームに結合していてもよい。本技術分野で周知のように抗体は直接標識してもまた間接的に標識してもよく、後者の場合、オステオポンチン抗体は結合分子または他の抗体のような第二の分子により同定される。

オステオポンチン抗体を直接標識するためには、多くの異なる分子が使用できる。たとえば、放射性標識、酵素標識、蛍光化合物標識、化学発光化合物標識等である。様々な標識を、本技術分野において周知の技術を用いて、たとえば標識アミノ酸前駆体、ある種の他の代謝手段、例えば抗体分子に標識を共有結合させるある種の化学的手段、リンカー分子の使用等により、抗体分子に結合させることができる。ついで標識抗体分子の存在を確認するために、適当な検出手段が使用される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が包含される。適当な酵素の例には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが包含される。適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがある。適当な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがあ
る。発光物質の例にはルミノールがある。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがある。適当な放射性物質の例には¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵Sまたは³Hがある。

結合抗体の検出が間接的である場合は、オステオポンチン抗体に結合する抗体を使用することができる。たとえば、オステオポンチン抗体が非ヒト種で作成される場合には、第二の抗体はアロタイプの決定基をもつ種に対する抗体であることができる。別法として、オステオポンチン抗体のイデオタイプの決定基を標的としてもよい。また、オステオポンチン抗体を同定可能な他の結合分子を使用することができる。たとえば、オステオポンチン抗体がプロテインＡもしくはプロテインＧによって認識可能なIgG分子である場合は、プロテインＡもしくはプロテインＧは標識レポーター分子とすることができる。プロテインＡもしくはプロテインＧを標識するためには、上に論じた様々な標識を使用することができる。他のこのような分子の結合対は、抗体分子を標識するためにビオチンを用い、ついで標識されたアビジン分子を使用してビオチン化抗体分子の局在を決定する。

別法として、オリゴデンドロサイト前駆細胞中に存在するオステオポンチンを検出するためには、核酸を使用することができる。このような核酸はアプタマーとして知られ、本技術分野において周知のようにオリゴデンドロサイトライブラリーから入手できる。

オステオポンチン核酸も検出することができる。この場合はオステオポンチンの発現を検出するのに適当な手段は、オステオポンチンメッセージの存在をモニターすることである。メッセージを検出する既知の方法にはノーザンブロット、Taqman（登録商標）分析、インサイチュ−ハイブリダイゼーション等がある。オステオポンチン特異的核酸プローブは標識し、オステオポンチンmRNAとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、上に論じたような様々な手段のいずれかで標識できるオステオポンチンプローブが、適当な検出手段を用いて明らかにされる。上に論じたような蛋白質ベースのシステムの使用と同様に、オステオポンチンプローブ核酸も、直接標識できるか、または他の標識レポーター分子が結合プローブの同定に使用できる。

オリゴデンドロサイト前駆細胞に対する化学吸引性分子に関しては、オステオポンチンを使用してオリゴデンドロサイト前駆細胞および運動能のあるオリゴデンドロサイトを特性づけて単離することができる。細胞の運動能をモニターするアッセイは、本技術分野において周知であり、たとえばオステオポンチンをアガロースのような半固体マトリックス中に捕捉し、ついで化学吸引性を認識してそれに向けて動くことができる細胞を、該固定したオステオポンチンに暴露して、いずれの細胞がマットリックス中に動き、マトリックス内にあるかを決定することができる。

オステオポンチンに応答するオリゴデンドロサイト前駆体およびオリゴデンドロサイトの移動性を利用し、ならびに上述の抗体分子のような結合分子を用い、オリゴデンドロサイト前駆細胞もしくはオリゴデンドロサイトを精製するための手段を構成することができる。たとえばオステオポンチンに吸引される細胞は細胞の混合集団から識別できる。またオステオポンチンに対する抗体は、細胞の集団からオリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトを解析するために使用することができる。たとえば、オステオポンチン抗体はビーズまたは培養プレート表面のような固体マトリックス上に固定化して、細胞の混合集団に暴露することができる。抗体により結合された細胞は、結合されなかった細胞から分離され、オリゴデンドロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイト前駆細胞に富む集団が得られる。

別法として、たとえばここに教示されたようなスクリーンアッセイを用いて、標的細胞への結合時にそれらの細胞の所望部位への遊走を誘導するアゴニスト分子が同定され、使
用できる。アゴニストは複数の候補化合物から同定できる。

ここに使用される「アゴニスト」の語は、オステオポンチン受容体に結合した場合、所望の細胞内および／または細胞性応答を活性化する成分を意味する。

本明細書で使用される「部分アゴニスト」の語は、アゴニストの場合よりも少ない度合／程度で受容体に結合した場合、細胞内および／または細胞性応答を活性化する成分（たとえばオステオポンチンであるが、これに限定されるものではない）を意味する。
本明細書で使用される「候補化合物」の語はスクリーニング技術に敏感に反応する成分を意味する。このような化合物は、受容体に特異的な内因性リガンドの同定、および／または受容体に対する候補化合物のスクリーニング（このようなスクリーニングは効力を評価するために競合的アッセイを要求する）を包含する旧来の薬物発見過程により、または抗体および組換え核酸の使用を包含するバイオ技術的方法によって同定される。

本発明は、モジュレーター、すなわちオステオポンチン受容体に結合するかまたはオステオポンチン活性を促進するかもしくは阻害する作用を有する、候補もしくは試験化合物または試剤（たとえばペプチド、ペプチド模倣物質、小分子または他の薬物）を同定する方法（以下、「スクリーニングアッセイともいう」）を提供する。

本発明はその実施態様において、オステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分の活性に結合するか、またはそれをモジュレートする候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は本技術分野で周知のコンビナトリアルライブラリー、たとえば生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相または溶液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法「１−ビード１化合物」ライブラリー法、親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法による多くのアプローチを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4種のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用することができる（Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12: 145）。

分子ライブラリーの合成方法の例は、本技術分野において、たとえばDeWittら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6909；Erbら, Proc. Natl Acad. Sci. USA (1994) 91: 11422；Zuckermannら, J. Med. Chem. (1994) 37: 2678；Choら, Science (1993) 261: 1303；Carrelら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994) 33;3209；Carrelら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994) 33: 2061；Gallopら, J. Med. Chem. (1994) 37: 1233に見出すことができる。

化合物のライブラリーは、溶液（たとえばHoughton Bio/Techniques (1992) 13: 412-421）またはビーズ（Lam, Nature (1991) 354: 82-84）、チップ（Fodor, Nature (1993) 364: 555-556）、細菌（米国特許5,223,409）、胞子（米国特許5,571,598；5,403,484および5,223,409）、プラスミド（Cullら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 1865-1869）またはファージ（Scottら, Science (1990) 249: 386-390；Devlin, Science (1990) 249: 404-406；Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6378-6382；およびFelici, J. Mol. Biol. (1991) 222: 301-310）中において提供することができる。

一実施態様においては、アッセイはオステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がオステオポンチン受容体を結合する能力を測定する細胞ベースのアッセイである。細胞は、たとえば酵母細胞または哺乳動物起源の細胞とすることができる。試験化合物がオステオポンチン受容体に結合する能力の測定は、たとえば試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカッ
プリングさせて、試験化合物のオステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分との結合を複合体中の標識化合物を検出することによって決定できるようにすることで達成される。たとえば、試験化合物は¹²⁵I、 ³⁵S、¹⁴Cまたは³Hで直接または間接的に標識し、放射性同位元素は放射発光の直接計数またはシンチレーション計数で検出される。別法として試験化合物は、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼによって酵素的に標識され、適当な基質の生成物への変換を測定することにより、酵素的標識を検出する。

アッセイは標識オステオポンチンを用いる競合アッセイとすることができる。すなわち、アッセイは、オステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分を、細胞表面に発現する細胞をオステオポンチンと接触させてアッセイ混合物を形成させ、アッセイ混合物を試験化合物と接触させて、試験化合物がオステオポンチン受容体と相互作用する能力を測定することからなる。この場合、オステオポンチン受容体と相互作用する試験化合物の能力の測定は、既知の化合物に比較してオステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する試験化合物の能力を測定することからなる。

他の実施態様においては、アッセイは、オステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がオステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレートする能力を測定することからなる。試験化合物がオステオポンチン受容体またはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレートする能力の測定は、たとえばオステオポンチン受容体がオステオポンチンと結合もしくは相互作用する能力またはIL-12を産生する能力を測定することにより達成することができる。オステオポンチンを結合する細胞表面分子はたとえばCD44、およびα_v、α₆、β₁、β₃およびβ₅鎖のように多くのものが知られている。αおよびβ鎖はインテグリンのサブユニットである。

受容体は、必ずしもリガンドの結合を阻害しないが、たとえば活性化を引き起こすことができる受容体の凝集、二量体化またはクラスタリングを可能にする受容体の構造的変化を引き起こす非リガンド分子によって活性化できる。

すなわち、オステオポンチン受容体の様々な部分に対して抗体を産生させることができる。活性化された抗体は標準的なアッセイたとえばIL−12産生のモニタリングで測定し、選択することが可能である。

抗体は既知の技術を用いて作成することができる。分子マッピングとくにエピトープマッピングが関与するので、多分、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、細胞表面に発現される完全な受容体および細胞表面に形成されることが知られているペプチドの両方に対して産生することができる。Geysenらの方法、米国特許5,998,577は複数個の関連ペプチドを得るために実行することができる。

オステオポンチン受容体またはその部分もしくはフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技術を用いて、それらと結合する抗体を産生するための免疫原として使用することができる。完全長のオステオポンチン受容体を用いることができ、別法として本発明は免疫原として使用するためのオステオポンチンの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。オステオポンチン受容体の抗原性ペプチドは少なくとも８個（好ましくは10、15、20、30またはそれ以上）のアミノ酸残基の既知配列からなり、オステオポンチン受容体のエピトープを包含し、これによってそのペプチドに対して産生された抗体がそれらと特異的免疫複合体を形成する。

関連する態様においては、抗原性ペプチドによって包含されるエピトープは、受容体の
特定の部分に結合するかまたは特定の機能を有することが知られているオステオポンチン受容体の領域である。

オステオポンチン受容体免疫原は通常、適当な対象（たとえばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫することによる抗体の調製に使用される。適当な免疫原調製液はたとえば、組換え的に発現されるオステオポンチン受容体または化学的に合成されたオステオポンチン受容体を含有する。その調製液はさらに、アジュバントたとえばフロインド完全もしくは不完全アジュバントまたは類似の免疫刺激物質を含んでよい。免疫原性オステオポンチン受容体調製液による適当な対象の免疫処置はポリクローナル応答を誘導する。

本明細書で使用される「抗体」の語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちオステオポンチン受容体に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。オステオポンチン受容体に特異的に結合する分子はオステオポンチン受容体を結合する分子であるが、サンプルたとえば、天然にオステオポンチン受容体を含有する生物学的サンプル中の他の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には抗体を酵素たとえばペプシンで処理することにより発生させることができるF_(ab)およびF_(ab')2フラグメントが包含される。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」の語は、オステオポンチン受容体の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のただ1種を含有する抗体分子の集団を意味する。したがって、通常、モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合親和性を発揮する。

免疫処置された対象における抗体力価は、固定化されたオステオポンチン受容体を用い、標準技術たとえば酵素免疫測定法（ELISA）により長期にわたりモニターすることができる。所望により、オステオポンチン受容体に対して向けられた抗体分子は、哺乳動物（たとえば血液から）単離することが可能で、周知の技術たとえばプロテインＡクロマトグラフィーによりさらに精製し、IgG分画を得ることができる。免疫処置後適当な時間、たとえば抗体力価が最も高い時点で、抗体産生細胞を対象から取得し、標準技術たとえば最初にKohlerら, Nature (1975) 256: 495-497によって記載されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kohlerら, Immunol. Today (1983) 4: 72）、EBVハイブリドーマ技術（Coleら, Monoclonal Antibody and Cancer Therapy (1985) Alan R. Liss, Inc. pp 77-96）またはトリオーマ技術を用いるモノクローナル抗体の調製に使用することができる。

ハイブリドーマを産生させるための技術はよく知られている（一般にCurrent Protocols in Immunology (1994) Coliganら編, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照）。略述すれば、不死化細胞系（通常ミエローマ）を上述のような興味ある免疫原で免疫処置した哺乳動物からのリンパ球（通常脾臓細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清についてオステオポンチン受容体を結合するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。

リンパ球および不死化細胞系を融合させるために使用された周知の多くのプロトコールは、モノクローナル抗体発生の目的に適用することができる（たとえば、Current Protocols in Immunology, 前出；Galfreら, Nature (1977) 266: 550- 552；Kenneth, in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, NY (1980)；およびLerner, Yale J. Biol. Med. (1981) 54: 387-402参照）。さらに、通常の技術者はこのような方法には多くの変法があり、有用であると評価している。

通常、不死化細胞系（たとえばミエローマ細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から誘導される。たとえばマウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製液で免疫処置したマウスからのリンパ球を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「HATメジウム」を含有する培養メジウムに感受性であるミエローマ細胞系で不死化したマウス細胞系と融合させて作成することができる。任意の数のミエローマ細胞系、たとえばP3−NS1／J−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653またはSp2／O−Ag14ミエローマ系が、標準技術に従って、融合パートナーとして使用することができる。ミエローマ系はATCCから入手できる。

通常、HAT感受性マウスミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール（「PGE」）を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。この融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ついで非融合および非生産性に融合したミエローマ細胞を死滅させるHATメジウムを用いて選択する（非融合脾臓細胞は、トランスフォームされていないので数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、オステオポンチンを結合する抗体のハイブリドーマ培養上清を、たとえば標準ELISAアッセイを用いてスクリーニングして検出される。

好ましくは、モノクローナル抗体は主としてもしくは完全にヒト起源である。したがってヒト抗体フレームワーク中に非ヒト補体決定領域を有するキメラ抗体を使用することが可能であり、実施方法は本技術分野において周知である。PCT公開WO 87/02671；欧州特許出願184,187；欧州特許出願171,496；欧州特許出願173,494；PCT公開WO 86/01533；米国特許4,816,567；欧州特許出願125,023；Betterら, Science (1988) 240: 1041-1043；Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 3439-3443；Liuら, J. Immunol. (1987) 139: 3521-3526；Sunら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 214-218；Nishimuraら, Canc. Res. (1987) 47: 999-1005；Woodら, Nature (1985) 314: 446-449；Shawら, J. Natl. Cancer Inst.(1988) 80: 1553-1559；Morison, Science (1985) 229: 1202-1207；Oiら, Bio/ Techniques (1986) 4: 214；米国特許5,225,539；Jonesら, Nature (1986) 321: 522-525；Verhoeyanら, Science (1988) 239: 1534およびBeidlerら, J. Immunol. (1988) 141: 4053-4060参照。

ヒト抗体はインビトロ技術を用いて作成することができる。完全なヒト抗体はヒト患者の治療的処置にとくに望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないがヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現することができる、トランスジェニックマウスを用いて作成することができる。Abgenix（Fremont, CA）は、部分ヒト免疫グロブリンレパートリーを有するマウスを用い、マウスにおいて、ヒトモノクローナル抗体を作成する。トランスジェニックマウスを選択された抗原で通常の様式により免疫処置する。抗原に向けられたモノクローナル抗体は慣用のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスに繋留されたヒト免疫グロブリントランスジーンはB細胞の分化時に再配列され、ついでクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。

モノクローナル抗体−分泌ハイブリドーマを調製する別法では、モノクローナル抗体は、オステオポンチンまたはその受容体で組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をスクリーニングすることにより、同定単離することが可能で、それによりオステオポンチンまたはその受容体を結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーが単離される。ファージディスプレーライブラリーを発生させ、スクリーニングするためのキットは商業的に入手することができる（たとえば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；およびStratagene SurfZAP(登録商標) Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。

さらに、抗体ディスプレーライブラリーの発生およびスクリーニングにおける使用に特に適当な方法および試薬の例は、たとえば米国特許5,223,409；PCT公開WO 92/18691；PCT公開WO 91/17271；PCT公開WO 92/20791；PCT公開WO 92/15679；PCT公開WO 93/01288；PCT公開WO 92/01047；PCT公開WO 92/09690；PCT公開WO 90/02809；Fuchsら, Bio/Technology
(1991) 9: 1370- 1372；Hayら, Hum. Antibody Hybridomas (1992) 3: 81-85；Huseら, Science (1989) 246: 1275-1281およびGriffithsら, EMBO J. (1993) 25 (12): 725-734に見出すことができる。

すなわち、このようなエピトープを用いて、それを結合する抗体が同定される。抗体の重鎖および軽鎖はクローン化し、ファージディスプレーF_abフラグメントの作製に使用される。たとえば重鎖遺伝子は重鎖が細菌から分泌できるようにプラスミドベクターにクローン化することができる。軽鎖遺伝子は軽鎖がファージの表面上に発現できるようにファージコート蛋白質遺伝子にクローン化することができる。ファージに融合したヒト軽鎖のレパートリー（ランダムコレクション）は、非ヒト重鎖を発現する細菌を感染させるのに使用する。得られた後代のファージはハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選ばれた抗原をパニングスクリーンに使用して選択された抗原を結合するファージを選択する。このようなファージを同定するためには数ラウンドの選択が要求される。

選択された抗原を結合する選択されたファージからヒト軽鎖遺伝子を単離する。ついで、選択されたヒト軽鎖遺伝子を用いて、次のようにヒト重鎖遺伝子の選択を導く。選ばれたヒト軽鎖遺伝子を細菌による発現のためベクターに挿入する。選ばれたヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージに融合させたヒト重鎖のレパートリーで感染させる。得られた後代のファージはヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。

次に、選択された抗原をパニングスクリーンに使用し、選択された抗原を結合するファージを選択する。選ばれたファージは、最初に選択された非ヒトモノクローナル抗体によって認識されるのと同じエピトープを認識する完全なヒト抗体を提示する。重鎖および軽鎖の両者をコードする遺伝子を単離し、ヒト抗体の産生のためにさらに操作することができる。この技術はJespersら（Bio／Technology (1994) 12: 899-903）によって記載されている。

オステオポンチン抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を用いて標準技術、たとえば親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降によってオステオポンチンを単離することができる。このような抗体は、細胞からの天然のオステオポンチンおよび宿主細胞に発現され、組換えにより産生されたオステオポンチンの精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、オステオポンチンの豊富さおよび発現パターンを評価するためのオステオポンチン（たとえば細胞溶解物または細胞上清中）の検出に使用することができる。オステオポンチン抗体は、臨床試験操作の一部として組織における蛋白質のレベルをモニターするために、たとえば、与えられた処置計画の効果を測定するために、診断上使用することができる。

オステオポンチン受容体を活性化することが見出される抗体は、IL−12産生のようなオステオポンチン仲介機能に対して外生の活性を最小限にするように修飾されてもよい。すなわち、抗体分子はオステオポンチン活性化の外部の活性を最小化または除去するためにトランケートするかまたは突然変異を起こさせることができる。たとえば、ある種の抗体には、抗原結合部分のみが必要である。したがって、抗体のF_c部分は除去されてもよい。

オステオポンチン受容体を発現する細胞を活性化のために抗体に暴露する。活性化された細胞はついで、受容体活性を変化させ、活性化レベルを上昇または低下させる分子を同定する観点から、様々な分子に暴露させる。これらの目的を達成する分子はついで、オス
テオポンチン受容体を発現する細胞上で抗体なしで試験し、非活性化細胞上で作用を観察することができる。標的分子はついで、既知の技術を用いて、オステオポンチン代謝の変化を伴う障害の処置のための候補薬物として試験および修飾することができる。

本発明のスクリーニングアッセイは、可溶性および膜結合型の両者のオステオポンチン受容体を使用するのにおいて扱い易い。可溶性オステオポンチン受容体からなる細胞を含まないアッセイの場合、受容体を溶液中に維持するために、本技術分野で周知の膜可溶化剤が使用される。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤、たとえばn−オクチルグルコシド、n−ドデシルグルコシド、n−ドデシルマルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、Triton X−100, Triton X−114, Thesit（登録商標）、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)_n、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミノ]−1−プロパンスルホネート（CHAPS）、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミノ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート（CHAPSO）またはN−ドデシル＝N,N−ジメチル−3−アミノ−1−プロパンスルホネートが包含される。

オステオポンチン、その受容体またはその標的分子は蛋白質の一方または両者を非複合体型から複合体型の分離を容易にするために固定化し、アッセイの自動化を内蔵させることが望ましい。試験化合物のオステオポンチンまたはその受容体への結合または候補化合物の存在下および不存在下におけるいずれかの分子と標的分子との相互作用は、反応物質を含有させるのに適当な任意の容器中で行うことができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠沈管が包含される。一実施態様においては、一方または両者の蛋白質のマトリックスへの結合を可能にするドメインを加える融合蛋白質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／オステオポンチン融合蛋白質またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質を、グルタチオンセファロース（登録商標）ビーズ（Sigma Chemical, St. Louis,
MO）に吸着させることができる。別法としてグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートを用いることができ、これを、ついで試験化合物と組み合わせるかまたは試験化合物と非吸着標的蛋白質またはオステオポンチンのいずれかとを組み合わせ、この混合物を複合体形成が行われる条件（たとえば、塩およびpHについて生理学的条件）下にインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルを洗浄して非結合化合物を除去し、複合体形成を直接または間接にたとえば上述のように測定する。別法として、複合体をマトリックスから解離させ、オステオポンチン結合または活性のレベルを標準技術により測定する。

蛋白質をマトリックス上に固定化する他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。たとえば、オステオポンチン、その受容体またはその標的分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合を利用して固定化することができる。ビオチン化分子は、ビオチン−NHS（N−ヒドロキシコハク酸イミド）から当業界で周知の技術（たとえばビオチン化キット, Pierce Chemicals, Rockford, IL）を用いて調製し、ストレプトアビジンでコートした96−ウエルプレート（Pierce Chemicals）のウエルに固定化する。別法として、オステオポンチン、その受容体またはその標的分子と反応性であるが、標的分子の結合は妨害しない抗体は、プレートのウエルに誘導体化し、非結合標的またはオステオポンチンを、抗体接合によりウエル中に補足することができる。このような複合体を検出する方法には、GST−固定化複合体について上述した方法に加えて、オステオポンチンまたは標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにオステオポンチンに伴う酵素活性の検出に依存する酵素連結アッセイが包含される。

他の実施態様においては、細胞を候補化合物と接触させ、誘導されたmRNAの発現または細胞中の蛋白質を測定する方法において、オステオポンチン機能のモジュレーターを同定する。候補化合物の存在下における特定のmRNAまたは蛋白質レベルを、候補化合物の不存
在下におけるmRNAまたは蛋白質の発現レベルと比較する。候補化合物はついで、その比較に基づいてオステオポンチン機能のモジュレーターとして同定することができる。

本発明のさらに他の態様では、オステオポンチンまたはその受容体は、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイにおける「ベイト蛋白質」として、オステオポンチンまたはその受容体を結合するかまたはそれと相互作用してオステオポンチン活性をモジュレートする他の蛋白質を同定するために使用することができる（たとえば、米国特許5,283,317；Zervosら, Cell (1993) 72: 223-232；Maduraら, J. Biol. Chem. (1993) 268: 12046-12054；Bartelら, Bio/Techniques (1993) 14: 920-924；Iwabuchiら, Oncogene (1993) 8: 1693-1696およびPCT公開WO 94/10300参照）。

他の実施態様においては、たとえばオリゴデンドロサイトの成熟欠如が望ましい場合には、オステオポンチンの産生または反応性を最小化することが望ましい。オステオポンチンのアンタゴニストは、天然に存在するオステオポンチンの１または２以上の活性を、たとえばオステオポンチン受容体に対する競合的結合により、それを活性化することなく阻害することができる。すなわち、特定の生物学的作用は、機能が限定された変異体での処置によって引き出すことができる。天然に存在する蛋白質型の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在するオステオポンチンによる処置に関連して対象への副作用はわずかであり得る。

オステオポンチンのアンタゴニストは上述のアゴニストの場合のように、突然変異体たとえばトランケート突然変異体のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより、またはアンタゴニスト性抗体を取得することにより同定することができる。

大量の純粋なオステオポンチンまたはその受容体を作成することができるので、適当な機能の領域のコンフォ−メーションの物理的特徴を理論的な薬物設計のために確認することができる。ある領域の形状およびイオン配置が識別されると、それらの領域と相互作用すべき候補薬物を、完全な細胞、動物および患者に適合させ、試験することができる。このような３−Ｄ構造の情報を導くことを可能にする方法には、Ｘ−線結晶解析、NMRスペクトル、分子モデリング等が包含される。３−Ｄ構造はまた、その部位で作用する既知薬物が存在する場合に他の既知蛋白質における類似のコンフォーメーション部位の同定を導くことができる。

オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を妨害し、これら前駆細胞の増殖を促進し、その集団を増大させる薬剤として、オステオポンチンは上述のように治療的に用いて、生体内の特定部位におけるオリゴデンドロサイト集団の生育および拡大を促進することができる。オリゴデンドロサイトは中枢神経系においてミエリンを産生するので、たとえば多発性硬化症および髄鞘脱落を特徴とする他の障害の場合において、オステオポンチンの使用は中枢神経系における髄鞘脱落部位での髄鞘再生を賦活する手段である。

オステオポンチンは受容体を発現する応答性細胞に結合する。インテグリン受容体たとえばα_vβ₃はオステオポンチンを結合する。オステオポンチン受容体は高レベルでオリゴデンドロサイト前駆細胞に発現される。

オステオポンチンは、α_v鎖を発現する細胞でIL−12の産生を刺激する。α_v鎖は、骨細胞、オリゴデンドロサイトおよびグリア細胞、ならびにリゾレシチン−処置動物において高度に発現する。α_v鎖は様々なβ−鎖と連結することができる。

α₆鎖は、星状細胞およびマイクログリア細胞によってよく発現される。β₁およびβ₃もこれらの細胞種によってよく発現される。星状細胞およびマイクログリアによって発現
される一方でＢ₅は、オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆体によって高レベルに発現される。

β₃鎖もIL−12の発現に関連する。β₃鎖の発現はオリゴデンドロサイトの分化で弱められる。β₁およびβ₅鎖もオステオポンチンの代謝と関連する。

したがってオステオポンチンの影響を低減させる他の方法は、オステオポンチン受容体の発現を最小限にするかまたはオステオポンチン受容体を占拠し、それらによって該受容体がオステオポンチンと連携できないようにすることである。この目的は、たとえばα_v鎖、β₃鎖またはその両者の発現を低下させることによって達成できる。発現の低下は、たとえば特定部位の突然変異誘発、アンチセンス分子の使用等によって達成できる。α_vおよびβ₃の遺伝子配列は既知であり、技術者によれば利用可能である。本発明の目的では、阻害は不活性化および他のこのような語と同義語と考えられ、その趣旨は、オステオポンチン受容体がその介入なく同じレベルでは作用せず、したがって、オステオポンチンに伴う機能、たとえば、化学吸引性または前駆体の分化を低減させるということである。

別法として、オステオポンチン受容体に結合するが、オステオポンチン活性はない分子を用いて受容体を遮断することができる。このような分子は、たとえば、オステオポンチン受容体を発現する細胞の使用によって同定することができる。これらの細胞は数多くの分子に暴露させ、受容体に結合するが受容体を活性化しない物質を同定することができる。例えばα_vβ₃結合活性について分子をスクリーニングする方法は本技術分野で周知であり、たとえばα_vβ₃を発現もしくは過剰発現する細胞または組換えα_vβ₃を発現するようにトランスフォ−ムされた細胞の使用である。

受容体阻害分子は、ペプチド、炭水化物、有機分子またはそれらの組み合わせのいずれであってもよい。たとえば現在使用されている多くの薬物は特定の受容体リガンドと関係はないが、天然のリガンドたとえばオステオポンチンのコンフォーメーション、電荷またはその両者を模倣したそれらを有する。

オステオポンチン受容体の活性化を測定する方法は既知であり、たとえばIL−12の産生である。IL−12のアッセイ方法は本技術分野において既知である。

オステオポンチンのその受容体への結合を防止するためのさらに他の方法は、オステオポンチンのその受容体への結合を防止する様式でオステオポンチンまたはその受容体へ結合する抗体の使用である。オステオポンチンまたはオステオポンチン受容体に対する抗体を取得する方法は本技術分野で既知である。オステオポンチンまたはその受容体に対する結合を形成させる方法の中で、競合的アレーは、オステオポンチンのその受容体への結合を阻害する抗体を同定するために使用することができる。

他の実施態様では、その受容体に連結するが、受容体を活性化しないオステオポンチンのトランケートまたは修飾型を、本明細書において教示したように作成できる。

オステオポンチンは細胞表面の受容体を介して作用するので、該受容体は、IL−12についてのような特定の遺伝子の活性化および／または不活性化に至る、細胞および核蛋白質および核酸間の分子相互作用のカスケードを誘発する。受容体から下流のこれらの相互作用エレメントはオステオポンチンの機能の増大または抑制のための適当な標的である。オステオポンチンシグナリングカスケードへの介入が見出される候補化合物は、適当な薬物の標的である。

本発明の核酸分子、オステオポンチン、その受容体、抗体、およびそのモジュレーター
たとえばアゴニストおよびアンタゴニストは、投与に適した医薬組成物中に導入することができる。このような組成物は通常、活性物質および医薬的に許容される担体からなる。ここで用いられる「医薬的に許容される担体」の語はすべての任意な溶媒、分散メジウム、賦形剤、担体、希釈剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等、医薬の投与に適合する物質を包含する意図である。医薬的に活性な物質に対するこのようなメジウムおよび剤の使用は本技術分野で周知である。任意の慣用のメジウムまたは剤が活性化合物と不適合性でない限り、組成物中におけるその使用が意図される。追加の活性化合物も組成物中に導入することができる。

本発明の医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口たとえば静脈内、皮膚内および皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および経直腸投与が包含される。非経口、経皮または皮下への適用に使用される溶液または懸濁液は以下の成分：滅菌希釈液たとえば注射用の水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤たとえばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤たとえばEDTA；緩衝剤たとえば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張度の調整のための試剤たとえば食塩またはデキストロースを含むことができる。pHは酸またはアルカリたとえばHClまたはNaOHで調整できる。非経口投与製剤は、保存のために、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。

注射用に適当な医薬組成物には滅菌水性溶液（水混和性）または分散液および滅菌注射用溶液もしくは分散液の即席製剤用の滅菌粉末が包含される。静脈内投与のために適当な担体には、生理的食塩溶液、静菌水、Cremophor EL(登録商標)（BASF, Parsippy, NJ）またはリン酸緩衝食塩溶液（PBS）が包含される。すべての場合、組成物は滅菌され、容易に注入可能な程度の流体でなければならない。組成物は、製造および保存条件下に安定であって、微生物たとえば細菌および真菌の夾雑作用に対して保存性でなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散メジウムとすることができる。適当な流動性はたとえばレシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合に要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖、ポリアルコールたとえばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に添加するのが好ましいであろう。注射用組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収を遅延させる試剤たとえばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを包含させることによりもたらされる。

滅菌された注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上掲の成分の１種または組合わせと共に適当な溶媒中に導入し、ついで必要に応じて滅菌ろ過して調製することができる。一般に分散液は、活性化合物を、基本分散メジウムおよび上掲の成分からの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクルに導入して調製される。滅菌注射溶液の調製用滅菌粉末の場合には、好ましい製造方法は真空乾燥ならびに凍結乾燥であり、これによって予め滅菌ろ過した溶液から活性成分および付加的な所望の成分の粉末が得られる。

経口投与用組成物は一般に不活性希釈剤または食べられる担体を包含する。組成物はゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口的治療投与の目的では、活性化合物は賦形剤とともに導入され、錠剤、トローチまたはカプセルの型で使用される。経口投与用組成物はまた、液体担体を用いて製造して、マウスウォッシュとして使用することもできる。この場合、液体担体中の化合物は口内に適用し、ガラガラいわ
せて、吐き出すか、または嚥下する。

医薬的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質は組成物の部分として包含させることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等には、以下に掲げる類似の性質の成分または化合物：バインダーたとえば微結晶セルロース、トラガントガムまたはゼラチン；賦形剤：たとえばデンプンまたはラクトース、崩壊剤たとえばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；滑沢剤たとえばステアリン酸マグネシウムまたはSterote；グライダント（glidant）たとえばコロイド状二酸化シリコン；甘味剤たとえばスクロースまたはサッカリン；または矯味剤たとえばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーを含有させることができる。吸入による投与の場合には、化合物は適当な噴射剤たとえば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアゾルスプレーの型で送達される。

全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段により実行することができる。経粘膜または経皮投与は、浸透させるべきバリヤーに適当な浸透剤を処方中に使用する。このような浸透剤は一般的に本技術分野において周知であり、たとえば経粘膜投与の場合には、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が包含される。経粘膜投与は鼻用スプレーまたは坐剤の使用によって達成される。経皮的投与では、活性化合物は、本技術分野で一般的に周知のように、オイントメント、軟膏、ゲルまたはクリーム中に処方される。

化合物はまた、坐剤（たとえば、慣用の坐剤基剤と哺乳動物の体温で熔融する滑沢物質、たとえばココア脂および他のグリセライド）または経直腸的送達のための停滞浣腸に調製することができる。

一実施態様においては、活性化合物は、体内からの急速な消失に対して保護するために、たとえば制御放出処方に調製する。これには、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル封入送達システムが包含される。生物分解性、生物適合性ポリマーたとえばエチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。

このような製剤の調製方法は、本技術分野の熟練者には明白である。これらの製剤はAlza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. から市販品を入手することができる。Liposomal懸濁液（モノクローナル抗体とともに感染細胞に標的化したリポソームを含有する）も医薬的に許容される担体として使用することができる。これらは本技術分野の熟練者には周知の方法、たとえば米国特許4,552,811に記載の方法より調製することができる。

経口または非経口投与用組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするため用量単位剤形に処方するのが有利である。ここで用いられる用量単位剤形とは、処置すべき対象に単位量として物理的に区分された単位剤形を意味する。各投与単位は所望の治療効果を生じるように計算され、予め定められた量の活性化合物を、必要な医薬担体とともに含有する。疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μg〜15mg／kg（たとえば0.1〜20 mg／kg）の抗体が、患者に投与される初期の候補投与量として、たとえば、１または２回以上の別個の投与または連続注入により投与される。通常の１日投与量は上述の因子により約１μg／kg〜100mg／kgまたはそれ以上である。数日またはそれ以上にわたる反復投与では、条件に応じて、疾患症状に所望の抑制が起こるまで処置が維持される。しかしながら他の投与基準もまた有用かもしれない、治療の進行は慣用技術およびアッセイにより容易にモニターされる。例示的投与基準はWO 94/04118に開示されている。本発明の投与量単位剤形についての明細は、活性化合物の独特な特性、達成される特定の治療効果、およびこのような各個体の処置のための活性化合物を混合する技術に固有の制限により指示され、それらに直接依存する。

オステオポンチンは髄鞘脱落障害に用途が見出されるので、活性化合物は好ましくは中枢神経系に送達される。したがって、活性化合物は脊髄液または既知の定位法を用いて脳に直接注入される。薬物の血液脳関門の通過を可能にする方法は周知である。

引用された参考文献はすべて、その全体が本明細書に導入される。

本明細書の教示には、様々な修飾および変化が、本発明の範囲から逸脱することなく実施できることは、本技術分野の熟練者に自明であると確信する。

Claims (17)

1. オリゴデンドロサイトおよびその前駆体のオステオポンチンへの暴露を低下させることからなるオリゴデンドロサイトの分化をモジュレートする方法。
2. 低下は、オステオポンチンを特異的に結合する抗体にオリゴデンドロサイトおよびその前駆体を暴露することによって得られる、請求項１記載の方法。
3. 低下は、オステオポンチン受容体を不活性化することによって得られる、請求項１記載の方法。
4. 受容体を、オステオポンチンアンタゴニストに暴露する、請求項３記載の方法。
5. 受容体を、該受容体に結合する抗体に暴露する、請求項３記載の方法。
6. オリゴデンドロサイトまたはその前駆体上のオステオポンチンに対する受容体の活性をモジュレートすることからなるオリゴデンドロサイトの分化をモジュレートする方法。
7. 髄鞘再生が要求される部位におけるオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞のオステオポンチンへの暴露を低下させて該部位におけるオリゴデンドロサイト前駆体の数を増大させ、ついで該前駆細胞のオステオポンチンへの暴露を上昇させてオリゴデンドロサイトへの分化を増大させ、ここで該オリゴデンドロサイトが髄鞘再生を増大させることからなる、髄鞘再生が要求される部位における髄鞘再生を誘導する方法。
8. 低下はオステオポンチンを特異的に結合する抗体の使用によって得られる、請求項７記載の方法。
9. 低下はオステオポンチン受容体を不活性化することによって得られる、請求項７記載の方法。
10. さらに、髄鞘再生が要求される部位から遠位の細胞をオステオポンチンに暴露することからなり、この場合、オステオポンチンは化学吸引性であり、該部位に応答性細胞を遊走させることを含む、請求項７記載の方法。
11. オステオポンチンは星状細胞によって分泌される、請求項１０記載の方法。
12. オステオポンチンはオステオポンチンアゴニストに暴露された細胞によって発現される、請求項１０記載の方法。
13. オステオポンチンはオステオポンチン受容体に結合する抗体に暴露された細胞によって発現される、請求項１０記載の方法。
14. 髄鞘再生を要求する部位への細胞の遊走を誘導する分子を取得する方法であって、
    オステオポンチン受容体を発現する細胞を候補分子に暴露し、
    上記受容体に結合する候補分子を同定し、
    オリゴデンドロサイト前駆細胞を同定された上記候補分子に暴露し、
    上記前駆細胞の遊走を誘導する候補分子を同定すること
    からなる方法。
15. 遊走を誘導する分子は、オステオポンチンアゴニストまたは逆アゴニストである、請求
    項１４記載の方法。
16. オリゴデンドロサイトの脱分化を誘導するかまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を防止する分子を得る方法であって、
    オステオポンチン受容体を発現する細胞を候補分子に暴露し、
    上記受容体に結合する候補分子を同定し、
    オリゴデンドロサイト前駆細胞を同定された上記候補分子に暴露し、
    上記前駆細胞の成熟オリゴデンドロサイトへの分化を防止する候補分子を同定することからなる方法。
17. オリゴデンドロサイトの脱分化を誘導するかまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を防止する分子を得る方法であって、
    オステオポンチン受容体を発現する細胞を候補分子に暴露し、
    上記受容体に結合する候補分子を同定し、オリゴデンドロサイトを同定された上記候補分子に暴露し、そして
    上記オリゴデンドロサイトの脱分化を誘導する候補分子を同定すること
    からなる方法。