JP2005532265A - ヒトgsk3を結晶化するための方法およびその新規な結晶構造 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)の三次元構造;GSK3構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドの三元複合体の結晶;GSK3三元複合体の結晶を形成するための方法;GSK3三元複合体の結晶構造を決定するための方法;およびGSK3三元複合体の三次元構造を使用して、GSK3活性によって媒介される種々の疾患の状態を処置するための可能な治療化合物を同定するための方法に関連する。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)は、2つのアイソフォーム、αおよびβが同定されたセリン/スレオニンキナーゼである(Woodgett,Trends Biochem.Sci.,16:177〜81(1991))。両方のGSK3アイソフォームは、休止細胞において構成的に活性である。GSK3は、本来直接リン酸化によってグリコーゲンシンターゼを阻害するキナーゼとして同定された。インスリン活性化の際に、GSK3は不活化され、これによってグリコーゲンシンターゼおよびおそらく他のインスリン依存性の事象(例えば、グルコース輸送)の活性化を可能にする。引き続いて、GSK3活性はまた、レセプターチロシンキナーゼ(RTK)によるシグナルに伝達されるインスリンのような他の成長因子によって不活化されることが示された。そのようなシグナル伝達分子の例としては、IGF−1およびEGF(Saitoら,Biochem.J.303:27〜31,1994;Welshら,Biochem.J.294:625〜29,1993;およびCrossら,Biochem.J.303:21〜26,1994)が挙げられる。
本発明に従って、ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドの構築物の三元複合体の三次元構造が提供される。
本発明に従って、タンパク質の触媒キナーゼドメイン、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含むヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3−β(GSK3−β)のタンパク質構築物を含む三元複合体の結晶が提供される。三元複合体を結晶化(三元複合体の三次元構造)するための方法およびGSK3−β活性によって媒介される種々の疾患状態の処置における可能な治療化合物の同定のために、三元複合体の三次元構造を使用する方法が提供される。
本発明の三元複合体は、GSK−3β構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含む。この複合体は、GSK3構築物とアデシン三リン酸(ATP)およびGSK−3構築物によってリン酸化し得るペプチドを組み合わせることによって形成され得る。ペプチドのリン酸化は、リン酸化ペプチドおよびアデノシン二リン酸(ADP)を含む複合体を提供する。この複合体はまた、リン酸化ペプチドおよびアデノシン二リン酸とGSK3−β構築物を組み合わせることによって形成され得る。
1つの局面において、本発明は、GSK3−β構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含む三元複合体である組成物を提供する。GSK3−β構築物は、タンパク質の触媒キナーゼドメインを含む。構築物は、ヒトGSK3−βの少なくとも残基37〜384を含み、そしてタンパク質のC末端で36個のアミノ酸を欠く。組成物は、X線による回析研究による構造決定のために十分な結晶性形態である。
構築物配列(配列番号1)が、以下に提供される。星印は、結晶構造において見られる第1の残基を示す。以下の構築物およびさらに有用な構築物ならびにその調製物は、2000年7月27日に出願された同時係属中の米国特許出願第60/221、242号(この開示が全体として本明細書中で参考として、および全ての目的のために援用される)において記載される。
GSK3−βタンパク質構築物は、GSK3−β 580cDNA構築物を有するバキュロウイルスで感染したSF−9細胞から抽出された。GSK3−βタンパク質構築物は、S−Fractogel、Phenyl−650M、およびGlu−tagアフィニティークロマトグラフィーを使用して明らかに均質になるように精製された。次いで、精製されたタンパク質は、結晶化のために濃縮された。構築物の精製は、実施例1において記載される。
タンパク質結晶は、GSK3構築物の溶液から、例えば、ハンギングドロップ技術によって形成され得る。構造決定のために適切なGSK3構築物の適切な結晶を形成するための代表的な方法は、実施例2において記載される。
本発明の別の局面において、GSK3 三元複合体の三次元構造が提供される。アミノ酸配列データおよびX線回析データに由来する原子座標が、構築物の三次元構造を決定するために使用された。構築物の原子座標は、X線回析データと位相データの組み合わせから生成される電子密度マップから計算された。
上で記述されるように、1つの局面において、本発明は、GSK3−β活性によって媒介される種々の疾患状態の処置において、可能な治療化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、GSK三元複合体の三次元構造表示の使用を包含する。三次元構造表示は、(a)完全なGSK構築物、(b)GSK構築物を含むGSK3のフラグメント、または(c)GSK3活性を媒介し得るリガンドと相互作用するアミノ酸を含むGSK構築物のフラグメントを含む表示であり得る。
GSK三元複合体の原子座標は、コンピューターのようなコンピューターデバイス(例えば、スーパーコンピューター、大型コンピューター、小型コンピューター、またはマイクロプロセッサー)を用いる後の使用のために媒体上で記憶され得る。代表的には、座標は、磁気媒体または光学媒体(例えば、フロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク、コンパクトディスク)、磁気光学媒体(「フロッピー(登録商標)の」ディスクもしくは磁気テープ)または電子媒体(例えば、ランダムアクセスメモリー(RAM)もしくは読み取り専用メモリー(ROM)のような多量のデータを保持するために有用な媒体上で記憶される。記憶媒体は、コンピューターに対して局所であり得るか、または遠隔であり得る(例えば、ネットワーク化された記憶媒体(インターネットを含む))。コンピューター、記憶媒体、ネットワーキング、および他のデバイスまたは技術の選択は、構造/コンピューター化学分野の当業者に公知である。
上で記述されるように、結晶学データから得られた構造情報は、GSK3−β活性を媒介するための化合物を合理的に設計するために有用なリガンドプロフィールを発展させるために使用され得る。リガンドプロフィールは、アポタンパク質について上述されたように得られた構造情報を考慮することによって、発展され得る。リガンドプロフィールは、さらに発展され得、そして結合リガンドを有するタンパク質のさらなる構造決定で精密化され得る。最終的に発展されたリガンドプロフィールは、GSK3−β活性を媒介するための可能な治療化合物を同定する。
アポタンパク質の三次元構造、および特にこのタンパク質の活性部位の構造は、活性部位への化合物の適合の決定を可能にする。迅速なドッキングプログラムを利用することで、例えば、化合物データベースに由来する個々の化合物は、活性部位結合について評価され得る。特定の化合物の適合が評価され得、そしてスコアリングされ得る。次いで、スコア閾値の設定は、仮想スクリーニングに対する解として化合物のファミリーを提供し得る。
ドッキングとは、2つ以上の分子がエネルギー考察に基づいて配列されるプロセスをいう。ドッキングは、分子から形成される複合体の立体配座を予測するような2つ以上の分子の三次元構造を配列する(例えば、BlaneyおよびDixon,Perspectives in Drug Discovery and Design 1:301,1993を参照のこと)。本発明の実施において、GSK3との相互作用する能力を評価するために、分子は、GSK3構築物構造とドッキングされる。
上で記述されるように、薬物運搬体は、他の特徴のうちで、表面で接近可能な特徴、水素結合ドナーおよびアクセプター、荷電/イオン化可能な群、ならびに/または疎水性パッチを含むGSK3 三元複合体について定義され得る。これらの特徴は、付与される活性における相対的な重要性に依存して重みづけられ得る(例えば、Computer−Assisted Lead Finding and Optimization,TestraおよびFolkers,1997を参照のこと)。
GSK3 三元複合体の結合表面および薬物運搬体は、官能基(例えば、陽子、ヒドロキシル基、アミン基、酸性基、疎水基および/または二価陽イオン)または低分子フラグメントのための有利な相互作用位置をマップするために使用され得る。次いで、関連官能基がGSK3と相互作用するように正確な空間的な関係で位置付けられる化合物が、デノボで設計され得る。
構造ベースの設計サイクルを開始するほとんどのリード化合物は、ハイスループットスクリーニングによって同定される。上述されるハイスループットスクリーニングとリガンドプロフィールと仮想スクリーニングの結果として、適切な形状を採り、かつタンパク質の活性部位に結合するための必須の立体配座エネルギーを有するリガンドが、同定される。低い立体配座エネルギーを有し、そしてアポタンパク質の活性部位との空間的な適合性を有することに加えて、同定されたリガンドは、好ましくは、合成的に接近可能である。次いで、同定されたリガンドが得られ(例えば、市販で得られるか、または合成される)そして生物活性についてスクリーニングされ得る。同定されたリガンドはまた、タンパク質構築物とともに共結晶化され得、そしてその三次元構造が、結合したリガンドを有するタンパク質について決定され得る。次いで、結合したリガンドを有するタンパク質の構造から得られた情報が、さらに上述されたようなリガンドプロフィールを発展させるために使用され得る。
別の局面において、本発明は、GSK3−βに結合し、そしてその活性を媒介するためのリガンドを設計するために、GSK3結晶構造(特に、GSK3構築物の活性部位の三次元構造)を使用するための方法を提供する。
本発明の方法は、GSK3と相互作用し得るリガンドを同定する。これらの化合物は、デノボで設計され得、公知の化合物であり得るか、または公知の化合物に基づかれ得る。化合物は、有用な薬物自体であり得るか、あるいは結合親和性または他の薬物学的に重要な特徴(例えば、バイオアベイラビリティ、毒物学、代謝、薬物動態学)を改善するための、さらなる薬物精密化のために使用され得る原型(すなわち、リード化合物)であり得る。
(GSK3−β構築物精製)
この実施例において、GSK3−βタンパク質構築物の精製を記載する。GSK3−β580cDNA構築物を有するバキュロウイルスで感染した構築物を、SF9細胞から抽出し、そして以下で記載するように、S−Fractogel、Phenyl−650M、およびGlu−tagアフィニティークロマトグラフィーを使用して明らかに均質になるように精製した。
感染SF−9細胞の20Lの発酵物からの細胞ペーストを、100mLのPBS(10mM NaPi(pH7.5)、150mM NaCl)で洗浄し、次いで300mLの緩衝液H(20mM Tris(pH7.5)、1mMタングステン酸塩、1mMヒ酸塩、50mM DTT、10μg/mL ロイペプチン、1μg/mL ペプスタチンA、10%グリセロール、0.35%オクチルグリコシド、1mM Mg2+)で再懸濁した。細胞を100−mL Douncer(ペステル(pestel)Bを有する20ストローク)中にホモジネートした。細胞破片および核を除去するために、組み合わせたホモジネートを、Ti45ローター中で40,000rpmで35分間遠心分離した。遠心分離からの上清を、注意深くデカントし、そして0.45μフィルターを通して濾過した。
175mLのS−fractogel(EM Science、カタログ番号18882)を5cm×8.9cmカラム中にパックし、そして5倍カラム容量の緩衝液A(20mM Tris(pH7.5)、10%グリセロール)で平衡化した。濾過された上清を充填する前に、50mM DTTを含む1倍カラム容量の緩衝液Aを平衡化したカラムに通した。次いで、前の工程からの濾液を、20mL/分でカラム上に充填した。カラムを50mMを含むDTT3倍カラム容量の緩衝液Aおよび2倍カラム容量の緩衝液Aで洗浄し、次いで20倍カラム容量にわたって緩衝液A中に、0〜1M NaClの直線勾配で溶離した。溶離物を20mL画分に分画した。GSK3を含む画分は、抗GSK抗体(Santa Cruz Biotech、カタログ番号SC−7291)を使用するウェスタンブロッティングによって検出した。ウェスタンブロッティング陽性画分をプールし、そして等量の緩衝液M(20mM Tris(pH7.5)、10%グリセロール、3.1M NaCl)と混合し、そして0.45μのフィルターを通して濾過した。濾液を、Phenyl−650Mクロマトグラフィーに対して使用した。
37.5mL Phenyl−650 M(Tosohass、カタログ番号014943)を、2.2×10cmカラム中に充填し、そして5倍カラム容量の緩衝液C(20mM Tris(pH7.5)、10%グリセロール、1.6M NaCl)で平衡化した。S−fractogel工程からの濾液を、7.5mL/分でカラム上に充填した。充填が完了した後、カラムを5倍カラム容量の緩衝液Cで洗浄し、そして20倍カラム容量にわたって、0%〜100%の緩衝液A(20mM Tris(pH7.5)、10%グリセロール)の直線勾配で溶離した。画分を15mLずつ集め、そしてGSKを含む画分を、抗GSK抗体を使用するウェスタンブロッティングによって検出した。ウェスタン陽性画分をプールし、そしてGlu−タグ抗体アフィニティーカラム上で充填した。
50mgのGlu−タグ抗体を28mLのAffi−Gel10(BioRAD、カタログ番号153−6046)上に固定し、そして2.2×6.5cmカラム中にパックした。カラムを5倍カラム容量の緩衝液D(20mM Tris(pH7.5)、20%グリセロール、0.3M NaCl、0.2%オクチルグルコシド)で平衡化し、そしてPhenyl−650M工程からの画分プールを、2.8mL/分で充填した。充填が完了した後、カラムを5倍カラム容量の緩衝液Dで洗浄し、次いでGlu−タグペプチド(100μg/mL)を含む100mLの緩衝液Dで溶離し、そして4mL画分に分画した。GSKを含む画分を、SDS−PAGEおよびクマシーブルー染色で検出した。これらの画分をプールして、濃縮し、そして10k MWCO YM10膜を使用してAmicon濃縮器に、約4.8mg/mLまで緩衝液Dへとダイアフィルトレートした。次いで、濃縮された物質を、結晶化のために提供した。
(GSK3−β構築物の結晶化)
この実施例において、GSK3−β三元複合体の結晶化を記載した。
(GSK3−β三元複合体結晶構造分解能)
この実施例において、GSK3−β三元複合体の結晶構造を解くための代表的な方法を記載する。
Claims (48)
- 結晶化GSK3−β複合体であって、該複合体は、
(a)GSK3構築物;および
(b)リン酸化ポリペプチド、
を含む、複合体。 - 請求項1に記載の複合体であって、ここで、前記構築物が、配列番号1に示されるアミノ酸配列あるいはその活性突然変異体または改変体を有する、複合体。
- 請求項1に記載の複合体であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、複合体。
- 結晶化GSK3−β複合体であって、該複合体は、
(a)表2において示される原子座標を有するGSK3−β構築物;および
(b)リン酸化ポリペプチド、
を含む、複合体。 - 請求項4に記載の複合体であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、複合体。
- 結晶化形態中のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、GSK3の活性形態およびそのインヒビター結合部位を含み、ここで、該ポリペプチドが表2において示される原子座標を含む、ポリペプチド。
- 請求項6に記載のポリペプチドであって、さらに結合リガンドを含む、ポリペプチド。
- GSK3タンパク質の原子モデルを提供するための方法であって、該方法は、
(a)結晶化形態におけるGSK3タンパク質の原子座標/X線回析データ、すなわちGSK3タンパク質の三次元構造のモデルを作るために十分なデータを保存した、コンピューターで読み取り可能な媒体を提供する工程であって、ここで、該結晶化形態におけるGSK3タンパク質が、GSK3構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む、工程;
(b)(a)からの該原子座標/X線回析データを分析し、該GSK3タンパク質の原子モデルを規定するデータ出力を提供する工程;および
(c)GSK3タンパク質の三次元構造を規定する原子モデル出力データを得る工程、
を包含する、方法。 - 請求項8に記載の方法によって生成されるGSK3タンパク質の原子モデルのデータを保存した、コンピューターで読み取り可能な媒体。
- 請求項8に記載の方法によって生成されるリガンドモデルの原子モデルの物理的モデルに対応するGSK3−βリガンド。
- GSK3タンパク質に結合するリガンドを設計するための方法であって、表2において示されるGSK3複合体の原子座標のいくつかまたは全てを使用する工程を包含する、方法。
- GSK3タンパク質に結合するリガンドを設計するための方法であって、該方法は、
(a)生物活性を有する結晶化GSK3タンパク質を提供するために精製されたGSK3タンパク質を結晶化する工程であり、ここで、該結晶化GSK3タンパク質がGSK3構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む工程;
(b)GSK3タンパク質の三次元構造を決定するための適切なデータを得るために、X線結晶学を使用して結晶化GSK3タンパク質の構造を解く工程;
(c)結晶化GSK3タンパク質の構造を解くことから生じたデータをコンピューターアルゴリズムに適用し、GSK3タンパク質活性部位に結合するリガンドの設計において使用するために適切なGSK3タンパク質のモデルを生成する工程;および
(d)反復プロセスを適用し、それによって、分子構造がコンピューターで生成されるモデルに適用され、GSK3結合リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記結晶化GSK3タンパク質が表2において示される原子座標を含む、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記GSK3タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項11〜14のいずれか1つに記載の方法によって設計されるGSK結合リガンド。
- 潜在的なメディエーターとGSK3結合部位、すなわち表2において示される原子座標の少なくともいくつかによって規定される結合部位との間の結合相互作用を測定することにより、GSK3メディエーターを同定するための方法であって、該方法が、
(a)コンピュータースクリーン上の該結合部位により規定される結合空洞を生成する工程;
(b)その空間構造を有する化合物を生成する工程;および
(c)該化合物が該GSK3結合部位に結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - GSK3活性を媒介する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
(a)表2において示される原子構造座標の少なくともいくつかに基づいてGSK3結合部位におけるアミノ酸と、非共有結合を形成するGSK3に対する潜在的メディエーターを設計する工程;
(b)該潜在的なメディエーターを得る工程;および
(c)該潜在的なメディエーターがGSK3の活性を媒介するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - GSK3活性を媒介する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
(a)表2において示される原子座標によって規定されるようなGSKの三次元構造を使用し、潜在的なメディエーターを設計するかまたは選択する工程;
(b)該潜在的なメディエーターを得る工程;および
(c)該潜在的なメディエーターがGSK3の活性を媒介するか否かを決定するために、該潜在的なメディエーターをGSK3と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 分子もしくは分子複合体の三次元表示または該分子もしくは分子複合体のホモログの三次元表示を生じるためのコンピューターであって、ここで、該分子または分子複合体が表2において提供されるGSK3の原子座標の少なくともいくつかによって規定される結合ポケットを含み、ここで、該コンピューターが、
(a)機械で読み取り可能なデータでコードされるデータの貯蔵物質を備える機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、表2において示される原子座標を含む、貯蔵媒体;
(b)該機械で読み取り可能なデータの処理についての指示書を保存するためのワーキングメモリ;
(c)該機械で読み取り可能なデータを該三次元表示に処理するための中枢処理装置であって、該中枢処理装置は、該ワーキングメモリおよび該機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結される中枢処理装置;および
(d)該三次元表示を表示するための、中枢処理装置に連結されるディスプレイ、
を備える、コンピューター。 - 分子または分子複合体のX線回析パターンに対応する原子座標の少なくとも一部を決定するためのコンピューターであって、ここで、該コンピューターが、
(a)機械で読み取り可能なデータでコードされるデータ貯蔵物質を備える、機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、表2において示される原子座標の少なくとも一部を含む、貯蔵媒体;
(b)機械で読み取り可能なデータでコードされるデータ貯蔵物質を備える、機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、該分子または分子複合体のX線回析パターンを含む、貯蔵媒体;
(c)該(a)および(b)の機械で読み取り可能なデータを処理するための指示書を保存するためのワーキングメモリ;
(d)該(a)の機械で読み取り可能なデータのFourier転換を実行し、そして該(b)の機械で読み取り可能なデータを構造座標に処理するための中枢処理装置であって、該中枢処理装置は、該ワーキングメモリならびに該(a)および(b)の機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結される中枢処理装置;および
(e)該分子または分子複合体の構造座標を表示するための該中枢処理装置に連結されるディスプレイ、
を備える、コンピューター。 - ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質を結晶化するための方法であって、該方法は、
生物活性を有する結晶化GSK3タンパク質を提供するために、精製されたGSK3タンパク質を結晶化する工程であって、ここで、該結晶化GSK3タンパク質がGSK構築物およびリン酸化ポリペプチドを含み、そしてここで、該結晶化GSK3タンパク質の三次元構造の決定のために適切なX線パターンを得るために、該結晶化GSK3タンパク質がX線結晶学を使用することで解くことが可能である、工程、
を包含する、方法。 - 請求項21に記載の方法であって、ここで、GSK3タンパク質の結晶化がハンギングドロップ蒸気拡散法による結晶化工程を包含する、方法。
- 請求項21に記載の方法であって、ここで、前記結晶化GSK3タンパク質が表2において示される原子座標を含む、方法。
- 請求項21に記載の方法であって、ここで、前記GSK3タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはそれの活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項21に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- 請求項21に記載の方法によって提供される結晶化GSK3タンパク質。
- ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質複合体を作るための方法であって、該方法は、
リン酸化され得るポリペプチド、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、およびGSK3タンパク質を組み合わせ、リン酸化ポリペプチド、アデノシン二リン酸、およびGSK3タンパク質を含むGSK3タンパク質複合体を提供する工程、
を包含する、方法。 - 請求項27に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項27に記載の方法であって、ここで、該リン酸化され得るポリペプチドが一リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質複合体を作るための方法であって、該方法は、
リン酸化ポリペプチド、およびGSK3タンパク質を組み合わせ、GSK3タンパク質複合体を提供する工程、
を包含する、方法。 - 請求項30に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項30に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化され得るポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
沈殿剤をリン酸化され得るポリペプチド、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、およびGSK3タンパク質を含む溶液に添加する工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤がポリエチレングリコールを含む、方法。
- 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤が2−メチル−2,4−ペンタンジオールを含む、方法。
- 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質結晶が、表2において示される原子座標を含む、方法。
- 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが一リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- 請求項33に記載の方法によって提供される結晶化GSK3タンパク質。
- ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
沈殿剤をリン酸化ポリペプチドおよびGSK3タンパク質を含む溶液に添加する工程、
を包含する、方法。 - 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤がポリエチレングリコールを含む、方法。
- 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤が2−メチル−2,4−ペンタンジオールを含む、方法。
- 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
結晶化GSK3タンパク質と潜在的GSK3メディエーターを接触させる工程であって、ここで、該結晶化GSK3タンパク質が、GSK3構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む、工程、
を包含する、方法。 - 請求項45に記載の方法であって、ここで、前記GSK3タンパク質が、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
- 請求項45に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
- 請求項45に記載の方法によって提供される結晶化GSK3タンパク質。
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