JP2005531640A - 組換えタンパク質におけるａｄｐ−リボース−アルギニンに対する機能的置換体としてのトリプトファン - Google Patents

Abstract

活性または安定性が修飾されたポリペプチドを、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基をトリプトファンまたはフェニルアラニンと置き換えることによって作製する方法を開示する。1つの態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基について、アルギニン→トリプトファンまたはアルギニン→フェニルアラニンの置換を有するαデフェンシンなどのポリペプチドを含む組成物を提供する。別の態様では、被験対象の免疫応答を修飾する方法を開示する。

Description

優先権の主張
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる、2002年6月28日に出願された米国特許仮出願第60/393,033号によって得られる利益に関する。

分野
本開示は一般的に、タンパク質の活性および安定性を変化させるためのタンパク質の修飾に関し、特に、フェニルアラニンまたはトリプトファンと、ポリペプチド配列中のアデノシン-二リン酸（ADP）-リボシル化されうるアルギニン残基との置換に関する。

背景
タンパク質中のアルギニン残基のモノ-ADP-リボシル化は、以下の段階が関与する可逆的な修飾である：（i）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）のADP-リボース部の、標的タンパク質のアルギニン残基への、または遊離アルギニン残基への、アルギニン特異的ADP-リボシルトランスフェラーゼ（ART）による転移、および（ii）ADP-リボシルアルギニン加水分解酵素による、ADP-リボースとアルギニン間の結合の切断。

ARTは当初、コレラ毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、およびシュードモナス属外毒素Aなどの細菌毒素中で性質が明らかにされた。ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性は、後に、真核細胞で同定された。ARTが原核生物だけでなく真核生物においても広範囲に発現されることは、アミノ酸残基のADP-リボシル化/脱ADP-リボシル化のサイクルが、タンパク質活性の調節に広く関与することを示唆している。またアルギニンなどの特異的なADP-リボースアクセプターは調節スイッチとして作用する場合がある。例えば、窒素固定細菌ロドスピリウム・ラブラム（Rhodospirillium rubrum）のジニトロゲナーゼ酵素の特定のアルギニン残基のADP-リボシル化は、この酵素の活性を調節することがわかっている。

真核生物では、ART活性は、DNA修復やカルシウムまたはリン酸化のレベルの維持などの、細胞の重要な過程に関する調節シグナルと関連する。ヒトでは、細胞内におけるADP-リボシル化レベルの変化は、ループス、糖尿病、および癌を始めとするいくつかの疾患と関連づけられている。この場合、コレラ毒素やジフテリア毒素などの細菌毒素が、そのヒト宿主において、重要な代謝タンパク質または調節タンパク質のADP-リボシル化を触媒する。

さまざまなタンパク質の活性を調節することを目的として修飾可能な特定のアミノ酸を同定する能力は、医学的な治療および療法を開発する上で非常に重要である。したがって、タンパク質の活性に影響を及ぼす、さらに多くの安定なタンパク質修飾を同定することが求められている。

概要
活性または安定性が変化したタンパク質を作製する方法について本明細書で開示する。この方法は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基を、トリプトファン（W）残基またはフェニルアラニン（F）残基のいずれかと置換することによって、活性または安定性が高められたタンパク質を作製する段階を含む。1つの態様では、このようなタンパク質は抗微生物活性を有し、またタンパク質の安定性もしくは活性が高められている。別の態様では、このようなタンパク質はデフェンシンのポリペプチドである。ADP-リボシル化されうるアルギニンが、フェニルアラニンまたはトリプトファンのいずれかで置換されると、デフェンシン分子の抗微生物活性が高まるか、またはデフェンシン分子の安定性が高まる。抗微生物活性の特定の非制限的な例は、T細胞の走化性、好中球動員の促進、またはサイトカインの放出である。

ADP-リボシル化されうるアルギニン残基を含むデフェンシンポリペプチドの活性または安定性を高める方法を提供する。この方法は、アルギニン残基をトリプトファンまたはフェニルアラニンと置換することで、デフェンシンポリペプチドの活性または安定性を高める段階を含む。

別の態様では、タンパク質が安定化可能か否かを判定する方法を開示する。この方法は、タンパク質中のアルギニン残基がADP-リボシル化されうるか否かを判定する段階を含む。アルギニン残基のADP-リボシル化の検出は、抗微生物活性を有するタンパク質などのタンパク質の安定性を、ADP-リボシル化されうるアルギニンをトリプトファンまたはフェニルアラニンのいずれかと置換することで高めることが可能なことを意味する。

本明細書では、ADP-リボシル化されうる少なくとも1残基のアルギニン残基がトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換されるポリペプチドを含む組成物について開示する。1つの態様では、このようなタンパク質は抗微生物活性を有する。別の態様では、このようなタンパク質はデフェンシンのポリペプチドである。さらに別の態様では、このようなアミノ酸の置換は、ポリペプチドの活性または安定性を高める。

本明細書では、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換された、リボシル化されうる少なくとも1残基のアルギニン残基を有する治療有効量のデフェンシンを含む薬学的組成物について開示する。

別の態様では、被験対象の免疫応答を高める方法を提供する。この方法は、アミノ酸の置換を含む、治療有効量のデフェンシンポリペプチドを被験対象に投与する段階を含む（アミノ酸の置換は、ADP-リボシル化されうるアルギニンとトリプトファンまたはフェニルアラニンとの置換である）。

前述の特徴および他の特徴、ならびに利点は、いくつかの態様に関する以下の詳細な説明から明らかになると思われる。まず参照として、添付の図面について説明する。

配列表
添付の配列表に記載した核酸およびアミノ酸の配列を、米国特許法施行規則1.822条で定義されているように、標準的なヌクレオチド塩基の略号、およびアミノ酸の3文字コードを用いて示す。個々の核酸配列は1本鎖のみを示すが、相補鎖は、表示された鎖を参照することで含まれるものと理解される。添付の配列表において、
配列番号：1は、ヒト好中球ペプチド（HNP）-1、HNP-2、HNP-3のプレプロタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：2は、HNP-1のアミノ酸配列である。
配列番号：3は、HNP-2のアミノ酸配列である。
配列番号：4は、HNP-3のアミノ酸配列である。
配列番号：5は、HNP-4のプレプロタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：6は、HNP-4のアミノ酸配列である。
配列番号：7は、ヒトデフェンシン（HD）-5のプレプロタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：8は、HD-5のアミノ酸配列である。
配列番号：9は、HD-6のプレプロタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：10は、HD-6のアミノ酸配列である。
配列番号：11は、ラットART2aのアミノ酸配列である。
配列番号：12は、ラットART2bのアミノ酸配列である。
配列番号：13は、Kozak配列導入用のプライマーである。
配列番号：14は、ART2aのN58A変異導入用のプライマーである。
配列番号：15は、ART2aのK59M、S60N、E61A変異導入用のプライマーである。
配列番号：16は、ART2aのM81R変異導入用のプライマーである。
配列番号：17は、ART2aのY204R変異導入用のプライマーである。
配列番号：18は、ART2bのR81K変異導入用のプライマーである。
配列番号：19は、ART2bのR204K変異導入用のプライマーである。
配列番号：20は、ART2bのR204E変異導入用のプライマーである。
配列番号：21は、ART2bのR204Y変異導入用のプライマーである。
配列番号：22は、ART2bのR204W変異導入用のプライマーである。

詳細な説明
I．省略形
ADP アデノシン-二リン酸
ART ADP-リボシルトランスフェラーゼ
ELISA 酵素結合免疫吸着アッセイ法
F フェニルアラニン
GPI グリコシルホスファチジルイノシトール
HD ヒトデフェンシン
HNP ヒト好中球ペプチド
IL インターロイキン
M81R 81位におけるメチオニン→アルギニン置換
MIP マクロファージ炎症性タンパク質
N58A 58位におけるアスパラギン→アラニン置換
NAD ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
NADase ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド糖加水分解酵素
PI-PLC ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC
R アルギニン
R81K 81位におけるアルギニン→リシン置換
R204E 204位におけるアルギニン→グルタミン酸置換
R204K 204位におけるアルギニン→リシン置換
R204Y 204位におけるアルギニン→チロシン置換
R204W 204位におけるアルギニン→トリプトファン置換
R：W アルギニン→トリプトファン置換
R：F アルギニン→フェニルアラニン置換
W トリプトファン
Y204R 204位におけるチロシン→アルギニン置換
59NMA61 それぞれ59位、60位、および61位におけるアスパラギン、メチオニン、およびアラニン
アミノ酸の標準的な1文字コードを本明細書では使用する。

II．用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法にしたがって用いる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Press、1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science社、1994（ISBN 0-632-02182-9）；およびRobert A. Meyers（編）、Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers社、1995（ISBN 1-56081-569-8）に記載されている。

本開示のさまざまな態様の理解を促す目的で、一部の用語について説明する。

活性：
ポリペプチドや核酸などの分子の生物学的機能。1つの態様では、活性は酵素活性である。別の態様では、生物学的機能は、細胞の動員やサイトカインの分泌などの免疫学的活性である。活性は高くなる場合もあれば低くなる場合もある。高められた活性は例えば、少なくとも約20%、約50%、約80%、約100%、または約200%の活性の上昇である場合がある。活性は、少なくとも約20%、約50%、約80%、または約100%の活性の低下のように低下する場合もある。活性は、野生型タンパク質の活性や標準値などの対照と比較して、高くなる場合もあれば低くなる場合もある。活性プロファイルとは、薬剤（agent）または薬物（drug）などの分子が保持するさまざまな活性の集合である。ポリペプチドは、1つの特定の活性を有する場合もあれば、複数の特定の活性を有する場合もある。

デフェンシン分子の生物学的活性には、T細胞の走化性および好中球の動員の調節が含まれる。1つの態様では、デフェンシン分子の抗微生物活性の上昇は、同様の条件における対照デフェンシン分子と比較して、T細胞の走化性の亢進または好中球動員の増加を含む。

ARTの活性の特定の非制限的な例には、NADase活性があるがこれに限定されない。1つの態様では、ART活性の上昇は、同様の条件における対照ARTと比較してNADase活性の上昇を含む。

ADP-リボシル化：
ADP-リボースが共有結合を介して化合物と結合する反応。真核生物および原核生物のモノ-ARTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）から、アミノ酸（例えばアルギニン残基のグアニジノ基）などのアクセプター求核性分子へのADP-リボースの転移を触媒する。ARTには、細菌毒素（例えばコレラ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素）が含まれる。百日咳毒素およびジフテリア毒素は、ADP-リボースアクセプターとしてアルギニン以外のアミノ酸を用いる。

本明細書に開示するように、宿主防御に関与する一部のタンパク質は塩基性であり、またアルギニンに富むので、ADP-リボースのアクセプターとして作用可能である。このようなタンパク質には、αデフェンシン（HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4、HD-5、HD-6）；βデフェンシン（hBD-1、hBD-2、hBD-3、hBD-4）；主要塩基性タンパク質；好酸球陽イオンタンパク質；およびヒトのカテリシン（Cathelicin）LL-37（hCAP18）などが含まれるがこれらに限定されない。またADP-リボシルトランスフェラーゼには自己ADP-リボシル化能がある。ADP-リボシルトランスフェラーゼには、ART-1、ART2b、ART-3、ART-4、およびART-5などがあるがこれらに限定されない。

ADP-リボシルトランスフェラーゼ（ART）：
NADからアクセプター求核性分子へのADP-リボースの転移を触媒する酵素。ARTは、アルギニン、システイン、アスパラギン、およびジフタミド（diphthamide）（翻訳後修飾されたヒスチジン残基）を含む、対応するアミノ酸標的によって区別することができる。1つの態様では、ARTは、タンパク質中のアルギニンのグアニジノ基へのADP-リボースの転移を触媒する。

原核生物と真核生物の両方からARTが同定されている。原核生物のARTには、細菌毒素（例えばコレラ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素）が含まれる。5種類の哺乳類ART（ART-1、ART-2、ART-3、ART-4、ART-5）が知られている。これら5種類の既知の哺乳類ARTの基質には、細胞内の重要な過程（例えば、リンパ球の活性化や好中球の走化性）に関与するタンパク質が含まれる。

グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを介して細胞表面に局在する哺乳類ARTのファミリーは、上皮細胞および炎症細胞（例えばリンパ球や好中球）上にもっぱら発現される。ART2aおよびART2bは、ラットの成熟T細胞および上皮内リンパ球の表面で発現されるアイソザイムである。これらのタンパク質は自己ART活性とNADase活性の両方を示すが、複数の部位における自己ADP-リボシル化能を有するのはART2bだけである。2つのタンパク質のうちART2aだけがグリコシル化される。また両タンパク質が、T細胞の活性化を調節する膜内外移動性シグナルの伝達に関与する。可溶性のARTも同定されており、血清の高密度リポタンパク質分画中を循環（circulate）している。

細菌毒素ARTの結晶構造の解析により、触媒部位の形成、NAD結合、およびADP-リボースの転移に必要なリボシル-ニコチンアミド結合の活性化に関与する3つの領域が同定されている。これらの領域は哺乳類のトランスフェラーゼ中にも存在するようである。領域Iは、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）の存在によって定義され、領域IIは、疎水性アミノ酸に富む配列、またはセリン（S）XS（Xはスレオニン（T）、セリン（S）、またはアラニン（A）を意味する）の存在によって定義され、また領域IIIは、グルタミン酸（E）の存在によって定義される（Domenighiniら、Mol. Microbial 21（4）：667-74、1996；Bredehorstら、Adv Exp Med. Biol 419：185-9、1997；Mossら、Mol Cell Biochem 193（1-2）：109-13、1999；Takadaら、J Biol Chem（269（13）：9420-3、1994）。

薬剤：
化合物、薬物、小分子、ペプチド模倣体、ペプチド、またはタンパク質を含むがこれらに限定されない任意の物質。

動物：
例えば哺乳類や鳥類を含む分類である、生きている多細胞脊椎動物。「哺乳類」という用語は、ヒトと非ヒト哺乳類の両方を含む。同様に「被験対象（subject）」という表現は、ヒトと獣医学的な対象の両方を含む。

抗微生物剤：
微生物を死滅させたり、微生物の増殖または成長を抑制したりする薬剤や薬物などの化合物。薬剤は、微生物の死滅を招いたり、または微生物の成長を抑制したりするのであれば抗微生物活性を有する。1つの態様では、デフェンシン（例えばαデフェンシン）などのポリペプチドは抗微生物活性を有する。抗微生物活性は、細胞の溶解（例えば細胞毒性によるもの）を含むがこれらに限定されない場合がある。抗微生物活性は、T細胞の走化性および好中球の動員から生じる場合がある。1つの特定の例では、抗微生物活性は細菌細胞の溶解である。抗微生物活性は、修飾型デフェンシンポリペプチドの投与によって修飾可能である。1つの態様では、R：W置換型、R：F置換型のHNP-1ポリペプチド、またはこれ以外の修飾型デフェンシンが被験対象に投与される。

アルギニン（R）：
ヒトの食事に不可欠な植物および動物に存在するアミノ酸（C₆H₁₄N₄O₂）であり、タンパク質の分解によっても生じる。アルギニンの機能的類似体、およびグアニジンを含む化合物（一例としてアルギニン）が構造的に修飾されたアルギニン分子（例えばADP-リボシル化アルギニン残基、アグマチン）も含まれる。ADP-リボシル化されうるアルギニン残基は、NADからアルギニンのグアニジノ基へのADP-リボースの転移によって修飾可能なアルギニンである。

喘息：
炎症、気道狭窄、および吸入薬に対する気道の反応性亢進を特徴とする呼吸器系疾患。喘息は、アトピーやアレルギーの症状との関連性が強いが、常に関連するわけではない。

B細胞またはBリンパ球：
2種類の主要な型のリンパ球のうちの1つ。B細胞受容体と呼ばれることのある、Bリンパ球上の抗原受容体は、細胞表面の免疫グロブリンである。B細胞は抗原によって活性化されると、この受容体と同じ抗原特異性を示す抗体分子を産生する細胞に分化する。

cDNA（相補的DNA）：
内部の非コードセグメント（イントロン）、および転写開始を決定づける調節配列を除いたDNA断片。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジャーRNAの逆転写によって実験室で合成される。

慢性気管支炎：
気管支内面の炎症。気管支が炎症を起こしたり、および/または感染したりすると、肺を出入りする空気の量が少なくなり、濃い粘液や痰が咳とともに出て気管支炎となる。咳や粘液産生を伴う急性気管支炎の短時間の発作は重度の感冒でみられる場合がある。慢性気管支炎は、発生する咳を説明する他の原因疾患のない、1か月のうちの大半、1年のうち3か月を2年連続にわたって占める、粘液産生性の咳の存在と定義される。慢性気管支炎は肺気腫に先行する場合もあれば、肺気腫と同時に発生する場合もある。喫煙は慢性気管支炎の最も一般的な原因である。慢性気管支炎患者の気管支は最初に、細菌やウイルスの感染によって刺激される場合もある。大気汚染および工場から排出される塵埃および煤煙も病因となる可能性がある。気管支が長期間にわたって刺激されると、大量の粘膜が絶え間なく産生され、気管支内面が厚みを増し、しつこい咳が生じ、空気の流れが妨げられる場合があり、肺が損傷を受ける。気管支は、次第に感染に感受性を示すようになる。

クローン病：
クローン病は、炎症性腸疾患（腸に炎症を生じる疾患の一般名）の一種である。クローン病は小腸に炎症を引き起こす。クローン病は通常、小腸の下部（回腸）に生じるが、口から肛門に至る消化管の任意の部分に影響を及ぼす場合がある。炎症は、侵された臓器の内面の深部に拡がり、疼痛および下痢を引き起こす。クローン病は回腸炎または腸炎と呼ばれる場合もある。

慢性閉塞性肺疾患（COPD）：
気道の閉塞を特徴とする疾患である肺気腫および慢性気管支炎を含む。肺気腫と慢性気管支炎は同時に現れる場合が多い。喘息などの他の閉鎖疾患は含まない。

サイトカイン：
リンパ球や好中球などの他の細胞の挙動に影響を及ぼす、細胞によって作られるタンパク質。1つの態様では、サイトカインは細胞内輸送に影響を及ぼす分子であるケモカインである。サイトカインは、MIP-β、インターロイキン（IL）-1、IL-8、IL-10、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、ニューロキニン、および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）を含むがこれに限定されない。

デフェンシン：
デフェンシンファミリーの分子は、3本のジスルフィド結合を形成する6つの保存されたシステイン残基を有する低分子量の陽イオン性ペプチドである。機能性のデフェンシンは、93〜95アミノ酸のプレプロタンパク質の連続的な翻訳後プロセシングによって生じる。デフェンシンファミリーの分子は異なるクラスに分けられる。αデフェンシンは一般的に29〜33残基のポリペプチドである。βデフェンシンはαデフェンシンより塩基性の強いポリペプチドであり、また一般的に長さが34〜37残基のアミノ酸である（Rajら、Biochem J. 347：633-41、2000）。最近同定されたθデフェンシンは、環状の18残基のポリペプチドを生じる、2つのαデフェンシン関連ノナペプチドの頭-尾（head-to-tail）結合によって形成される（Tangら、Science 286：498-502、1999）。

デフェンシンは当初、好中球に同定され、ヒト、ウサギ、モルモット、およびラットの食細胞中に検出されている。αデフェンシンは、HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4、ヒトデフェンシン（HD）-5、およびHD-6を含むがこれらに限定されない。αデフェンシンは、最近同定されたHNP-4相同体であるデフェンシン（Def）-Xも含む（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,329,340号を参照）。HNP-1、HNP-2、およびHNP-3は同じ遺伝子の産物である（参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号P11479）。HNP-4は異なる遺伝子の産物である（参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_001916）。HD-5（GenBankアクセッション番号NP_066290）およびHD-6（参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_001917）は、2種類のヒト腸デフェンシンである。

デフェンシンは、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、真菌、およびエンベロープをもつ一部のウイルスなどの、さまざまな感染性病原体に毒性を示す抗微生物ペプチドである。デフェンシンは、感染性病原体の膜に孔を開けることで、また電位依存性チャネルを作ることで作用する。デフェンシンの抗微生物活性は、細菌、真菌、またはウイルスの溶解；細菌、真菌、またはウイルスに対する毒性；白血球（例えばT細胞）の走化性；ならびに白血球（例えば好中球）の動員を含むがこれらに限定されない。理論に拘束されることなく、デフェンシンは、感染に対する身体の自然免疫に重要な役割を果たす。非修飾型デフェンシンも、複数の正常細胞および悪性細胞に細胞傷害性を示す。

DNA：
デオキシリボ核酸。DNAは、大半の生物の遺伝物質を構成する長鎖のポリマーである（一部のウイルスはリボ核酸（RNA）からなる遺伝子をもつ）。DNAポリマー中の反復性の単位は4種類の異なるヌクレオチドであり、個々のヌクレオチドは、デオキシリボース糖に結合した4種類の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン）のうち1つを含む（デオキシリボース糖にはリン酸基が結合する）。ヌクレオチドのトリプレット（コドンと呼ばれる）は、ポリペプチド中の各アミノ酸をコードする。コドンという用語は、DNAから転写されるmRNA上の3個のヌクレオチドの対応する（相補的な）配列にも使用される。

電気泳動の移動度：
電流の存在下で分子が移動する相対距離。

肺気腫：
肺胞または空気嚢として知られる肺の構造が過剰に拡大した状態。肺胞の過剰な拡大は、肺胞壁の破壊に起因する。この破壊は呼吸機能を低下させ、息切れを引き起こすことが多い。

コードする：
ポリヌクレオチドは、天然の状態で、または当業者に周知の方法で操作された場合に転写および/または翻訳されて、mRNAおよび/またはポリペプチド、またはこの断片を生じることが可能な場合にポリペプチド「をコードする」と言われる。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、アンチセンス配列からコード配列を推定することができる。

機能的に同等である：
配列の変化（例えば、ART2ポリペプチドの機能を変化させないADP-リボシルトランスフェラーゼ2（ART2）ポリペプチドの変化）。1つの態様では、このような機能はT細胞の活性化の調節である。別の態様では、機能は自己免疫を調節することである。このような配列の変化は、置換、欠失、塩基の修飾、変異、標識、および挿入を含む場合があるがこれらに限定されない。

免疫細胞：
宿主防御機構に関与する任意の細胞。免疫細胞は例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マスト細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、好塩基球、好酸球、および好中球を含む。

免疫応答：
好中球、B細胞、またはT細胞などの免疫系の細胞の、刺激に対する応答。1つの態様では、免疫応答は、好中球の動員、好中球による微生物の食作用と、これに続く好中球のアズール顆粒の内容物の放出を含む。別の態様では、免疫応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。さらに別の態様では、免疫応答は炎症反応である。免疫応答は、修飾型デフェンシンポリペプチドを投与することで追加することができる。1つの態様では、R：W置換型、R：F置換型のHNP-1ポリペプチド、またはこれ以外の修飾型デフェンシンが被験対象に投与される。

免疫系不全：
被験対象の免疫系が正常に、量的に、もしくは質的に機能していないか、または被験対象の免疫応答の追加免疫に有用な場合のある疾患もしくは障害。別の非制限的な例では、被験者は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染に起因する免疫不全疾患に罹患している。

感染性病原体（infectious agent）：
ウイルス、細菌、および真菌を含むがこれらに限定されない、被験対象に感染する病原体、および/または感染を引き起こす病原体。

感染性ウイルスの例には、レトロウイルス科（Retroviridae）（例えばHIV-1（HTLV-III、LAVもしくはHTLV-III/LAV、またはHIV-IIIとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウイルス）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えばパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えばインフルエンザウイルス）、ならびにヘルペスウイルス科（Herpesviridae）（単純ヘルペスウイルス（HSV）1およびHSV-2、水痘-帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペスウイルス）などがある。

感染性細菌の例には、ピロリ菌（Helicobacter pyloris）、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophilia）、放線菌類（Mycobacteria sps)（ヒト型結核菌（M. tuberculosis）、鳥型結核菌（M. avium）、バテー桿菌（M. intracellulare）、カンサス・マイコバクテリウム（M. kansaii）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（M. gordonae）など）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（A群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラティエ（Streptococcus agalactiae)（B群連鎖球菌）、連鎖球菌（Streptococcus)（緑色連鎖球菌（viridans)群）、大便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌（嫌気性菌）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター属種（Campylobacter sp.）、腸炎菌類（Enterococcus sp.）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジブテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium sp.）、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、動物パスツレラ症病原菌（Pasteurella multocida）、バクテロイデス属種（Bacteroides sp.）、有核紡錘菌（Fusobacterium nucleatum）、連鎖桿菌（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、フランベジアトレポネス（Treponema pertenue）、レプトスピラ属（Leptospira）、およびイスラエル放線菌（Actinomyces israelli）などがある。

感染性真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプツラータム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストマイセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）などがあるがこれらに限定されない。

他の感染性生物（原生生物など）には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびトキソプラズマ（Toxoplasma gondii）などがある。

炎症：
組織が損傷を受けると、損傷に対する身体の応答は通常、炎症である。このような損傷は、外傷、血液供給不足、出血、自己免疫、外因性組織の移植、または感染に起因する場合がある。このような全身性の応答には、免疫系の複数の成分の放出（例えばデフェンシン、IL-1、および腫瘍壊死因子）、損傷部位への細胞（好中球など）の誘引、体液放出に起因する組織の腫脹、および他の過程などがある。

炎症過程では、さまざまな可溶性因子が、細胞間接着分子の発現増加および化学誘引性による白血球の動員に関与する。このような可溶性メディエーターの一部は、常在型細胞（resident cell）（繊維芽細胞、内皮細胞、組織マクロファージ、およびマスト細胞など）と、新たに動員された炎症細胞（単球、リンパ球、好中球、および好酸球など）の両方の活性化を調節する。1つの態様では、活性化好中球は、デフェンシンを含むアズール顆粒を放出する。高濃度のデフェンシンが、炎症性肺疾患患者の気道分泌物中に見られる場合がある。

炎症性腸疾患：
腸の炎症を生じ、また関節炎を生じる場合のある2種類の別個の疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）。クローン病には結腸および小腸の炎症が伴う。潰瘍性大腸炎は、結腸内壁の潰瘍および炎症を特徴とする。腸疾患の量は通常、関節炎症状の重症度に影響を及ぼす。

先天性免疫：
多くの一般的な微生物に対する防御の第一線となり、一般的な細菌感染の抑制に不可欠である。抗微生物ペプチド（例えばデフェンシン）、上皮関門、食細胞（好中球、マクロファージ）、ナチュラルキラー（NK）細胞、捕体系、ならびに上記の細胞の多くの活性を調節したり協調させさりするサイトカインが含まれる。デフェンシンポリペプチドは、胃や肺を裏打ちする上皮細胞の表面に、また造血系の食細胞（例えば好中球やマクロファージ）の殺菌性細胞小器官（microbicidal organelle）に存在するので、先天性免疫系の重要な成分である。先天性免疫は、修飾型デフェンシンポリペプチドを投与することで追加することもできる。したがって先天性免疫を高めるために、R：W置換型、R：F置換型のHNP-1ポリペプチド、またはこれ以外の修飾型デフェンシンを被験対象に投与する。

単離された：
天然の状態で存在する生物体の細胞中の他の生物学的成分（例えば他の染色体DNAならびに染色体外DNAおよびRNA、ならびにタンパク質）から実質的に分けられる、別個に産生される、または精製される生物学的成分（核酸、ペプチド、またはタンパク質など）。したがって「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、標準的な精製法で精製された核酸およびタンパク質を含む。この表現は、宿主細胞における組換え体の発現によって調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も含む。

白血球：
感染性生物および異物に対する身体防御に関与する、「白色細胞」とも呼ばれる血液中の細胞。白血球は骨髄で作られる。5種類の主な型の白血球が存在する。白血球は、多核白血球（好中球、好酸球、好塩基球）と単核白血球（単球およびリンパ球）の2つの主な群にさらに分類される。感染が生じると、白血球の産生が増加するか、感染部位へ動員される場合がある。

リンパ球：
身体の免疫防御に関与する白血球の一種。B細胞とT細胞と呼ばれる2種類の主な型のリンパ球が存在する。

哺乳類：
この用語は、ヒトと非ヒト哺乳類の両方を含む。同様に「被験対象（subject）」という用語は、ヒトと獣医学的対象の両方を含む。

修飾型アルギニン残基：
アルギニンに施される任意の化学的修飾。1つの態様では、修飾はアルギニン残基のグアニジノ基に施される。グアニジノ基の修飾には、ADP-リボシル化、アシル化、アルキル化、またはポリマーとのコンジュゲーションによるアルギニン残基の修飾が含まれるがこれらに限定されない。ADP-リボシル化されるアルギニン残基は例えば、ピロホスファターゼ/ホスファターゼによる、リボシル-アルギニン残基を生じるピロリン酸の切断によって、さらに修飾される場合がある。1つの態様では、脱炭酸されたアルギニン残基はアグマチン（C₅H₁₄N₄）として知られる修飾型アルギニン残基である。

好中球：
好中球は、顆粒球としても知られる、多核白血球サブグループの白血球である。好中球は、突出部のある核と、中性色素で染色される多量の細胞質顆粒を含む。好中球は、細菌感染に対する一次防御を形成する。免疫系のあらゆる細胞と同様に、好中球は骨髄で作られて血流中を循環する。しかし、好中球は血管から離れて感染組織へ移動し、微生物（例えば細菌、真菌、ウイルス）を飲み込んで死滅させる。好中球は、他の細胞および異物を食作用で取り込むことで、その機能を部分的に果たす。好中球は、化学誘引物質またはサイトカインの濃度勾配にしたがって感染部位に動員される。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド糖加水分解酵素（NADase）：
NAD⁺のニコチンアミドおよびADP-リボースへの加水分解を触媒する酵素。この酵素は、細菌から哺乳類に至る生物に普遍的に存在する。多くの真核生物に存在するNADasは膜に結合した状態であり、またホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCによって放出されることから、GPI結合を介して膜に結合していることが示唆される。

核酸：
1本鎖または2本鎖のいずれかの状態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーであり、特に明記しない限り、天然のヌクレオチドに対する場合と同様に核酸とハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。

オリゴヌクレオチド：
最長約200ヌクレオチド塩基の長さの直線状のポリヌクレオチド配列。例えば、少なくとも6ヌクレオチド、例えば少なくとも15ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、またはさらには200ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド（DNAやRNAなど）。

使用可能に連結された：
第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関連があるように配置される場合に、第2の核酸配列に使用可能に連結される。例えばプロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、コード配列に使用可能に連結される。一般的には、使用可能に連結されたDNA配列は連続的であり、また必要に応じて、2つのタンパク質のコード領域を同じ読み枠で連結する。

薬物：
被験対象または細胞に適切に投与された場合に、所望の治療作用もしくは予防作用を誘導可能な化合物または組成物。「インキュベートする」という表現は、薬物と細胞が十分な長さの時間にわたって相互作用することを含む。「接触させる」という表現は、固体状態または液体状態の薬物を細胞とインキュベートすることを含む。

「治療有効量」は、治療対象の被験対象で所望の作用を十分達成する特定の物質の量である。治療有効量は例えば、免疫応答を変化させるのに、および/またはウイルス、真菌、または細菌の複製を阻害するのに、またはウイルス、真菌、もしくは細菌の感染による症状をある程度変化させるのに必要な量である場合がある。被験対象に投与する場合、一般的には、所望のインビトロ作用を達成することが知られている標的組織濃度（例えばリンパ球における濃度）を達成する投与量が使用される。

薬学的に許容される担体：
本開示に有用な薬学的に許容される担体は従来の担体である。Remington's Pharmaceutical Sciences；E. W. Martin、Mack Publishing社、Easton、PA、第15版、1975には、修飾型αデフェンシンの薬学的輸送に適した組成および剤型について記載されている。

担体の性質は一般に、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口用の剤型は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセリンなどの薬学的および生理的に許容される液体を溶媒として含む注入溶液を含む。固体組成物（例えば粉末、ピル、錠、またはカプセル）の場合、従来の非毒性固体担体には例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含めることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物には、湿潤剤や乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など（例えば酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレート）の、微量の非毒性補助物質を含めることができる。

フェニルアラニン（F）：
タンパク質を構成するアミノ酸（C₉H₁₂NO₂）。

ポリヌクレオチド：
長さが100ヌクレオチド塩基を上回る配列を含む、直線状のヌクレオチド配列。

ポリペプチド：
モノマーのアミノ酸残基がアミド結合で連結されたポリマー。L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかを使用することができるが、自然界ではL-異性体が優先的に使われている。本明細書で用いる「ポリペプチド」または「タンパク質」という表現は、任意のアミノ酸配列を含み、また置換型ポリペプチド、ADP-リボシル化されたポリペプチド、リボシル-ポリペプチド、およびグリコシル化されたポリペプチドを含むがこれらに限定されない場合がある修飾型配列を含むがこれらに限定されない。「ポリペプチド」という表現は特に、天然のタンパク質、ならびに組換え的または合成的に作製された分子が意図される。

本明細書で用いる「実質的に精製されたポリペプチド」という表現は、天然の状態では結合している他のタンパク質、脂質、糖質、または他の物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。1つの態様では、ポリペプチドは例えば、天然の状態では結合している他のタンパク質、脂質、糖質、または他の物質を少なくとも80%含まない。別の態様では、このようなポリペプチドは、天然の状態では結合している他のタンパク質、脂質、糖質、または他の物質を少なくとも90%含まない。さらに別の態様では、このようなポリペプチドは、天然の状態では結合している他のタンパク質、脂質、糖質、または他の物質を少なくとも95%含まない。

疾患を予防または治療する：
「疾患を予防する」という表現は、例えば疾患に罹りやすいことがわかっている人で、疾患の発症または進行を完全に、または部分的に抑えることを意味する。罹りやすいことがわかっている人の例は、家族に糖尿病歴のある者や、被験者をループスや慢性関節リウマチなどの状態になりやすくする因子に暴露した人である。「疾患を治療する」という表現は、疾患もしくは病的状態の少なくとも1つの徴候もしくは症状を回復させる、または疾患もしくは病的状態が現れ始めた後で病態生理学的過程に介入する治療的介入を意味する。

タンパク質：
遺伝子にコードされ、アミノ酸から構成される生物学的分子。

精製された：
「精製された」という表現は、絶対的に純粋である必要はなく、むしろ相対的な表現である。したがって例えば、精製されたペプチド調製物は、含まれるペプチドまたはタンパク質が、細胞内における天然の環境中にあるペプチドまたはタンパク質と比較して大きく濃縮されている。好ましくは調製物は、タンパク質またはペプチドが、調製物の全ペプチドまたはタンパク質内容物の少なくとも50%となるように調製される。

ピロホスファターゼ：
ピロリン酸から2個のリン酸基への加水分解を触媒する酵素。

組換え体：
組換え核酸は、天然には存在しない配列を有する核酸、または人工的に作製された核酸である。人工的な組換えは、化学合成によって、またはさらに一般的には、単離された核酸セグメントの人工操作によって（例えば遺伝子工学的手法で）達成される場合がある。同様に組換えタンパク質は、組換え核酸分子にコードされるタンパク質である。

配列同一性：
2つの核酸配列間または2つのアミノ酸配列間の類似性は、「配列間の類似性」と表現されるか、または「配列同一性」と表現される。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）のパーセンテージとして測定されることが多く、パーセンテージが高いほど2つの配列の類似性は高くなる。デフェンシンなどのポリペプチドの相同体または直系相同体、および対応するcDNA配列は、標準的な方法で並置した場合に、相対的に高い程度の配列同一性をもつ。このような相同性は、直系相同タンパク質またはcDNAが、遠縁の種（例えばヒトとマウスの配列）と比較して、より近縁な種に由来する場合に大きくなる。

配列を比較目的で並置する方法は当技術分野で周知である。さまざまなプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2：482、1981、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：443、1970；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：2444、1988；HigginsおよびSharp、Gene 73：237-244、9、1988）；HigginsおよびSharp、CABIOS、5：151-153、1989；Corpetら、Nuc. Acids Res. 16：10881-90、1988；Huangら、Computer Appls. in the Biosciences 8：155-65、1992；ならびにPearsonら、Meth. Mol. Bio. 24：307-31、1994で説明されている。Altschulら、J. Mol. Biol. 215：403-410、l990では、配列アラインメント法および相同性計算についての詳細な考察が述べられている。

安定性：
ポリペプチドなどの物質がもつ、その形状、構造、または活性を維持する能力。安定性は、高くなる場合もあれば低くなる場合もある。高い安定性は、類似の条件における対照物質と比較時の、ポリペプチドなどの物質のもつ、その形状、構造、または活性を維持する能力の上昇に相当する。1つの態様では、ポリペプチドの安定性は、R：F置換やR：W置換などのアミノ酸置換によって、非置換型ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、少なくとも約20%、50%、80%、100%、または200%高められる。安定性は、当業者に周知の任意の手段によって測定可能であり、また半減期の測定を含むがこれに限定されない。

被験対象（subject）：
ヒトと非ヒト哺乳類の両方を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物。

置換：
ポリペプチドが置換されたアミノ酸をコードする核酸配列の部位特異的変異導入、またはポリペプチドが置換されたアミノ酸の化学合成を含む、当業者に周知の任意の手段による、1個のアミノ酸残基と他のアミノ酸残基との交換。

機能的に類似のアミノ酸を列挙した保存的アミノ酸置換の表は当業者に周知である。以下の6つの群は、相互に保存的置換であるとみなされるアミノ酸の非制限的な例である。
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リシン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。

非保存的アミノ酸の置換は、（a）置換領域内のアミノ酸主鎖の構造、（b）アミノ酸の荷電もしくは疎水性、または（c）アミノ酸の側鎖の大きさの変化によって生じる場合がある。タンパク質の性質に大きな変化を生じると考えられる置換は一般に、（a）親水性残基の疎水性残基との（もしくは、による）置換、（b）プロリンと他の任意の残基との（もしくは、による）置換、（c）大きな側鎖（例えばフェニルアラニン）をもつ残基と、側鎖をもたない残基（例えばグリシン）との（もしくは、による）置換、または（d）正に帯電した側鎖をもつ残基（例えばリシン、アルギニン、またはヒスチジン）と、負に帯電した残基（例えばグルタミンまたはアスパラギン）との（もしくは、による）置換である。

任意のcDNA配列の異型は、好ましくはわずか20個、また好ましくは10個未満のアミノ酸の置換を、コードされるポリペプチドに導入する。異型アミノ酸配列は例えば、80%、90%、またはさらには95%もしくは98%が天然のアミノ酸配列と同一の場合がある。同一性パーセンテージを決定するプログラムおよびアルゴリズムは、NCBIのウェブサイトから入手できる。

T細胞：
免疫応答に重要な役割を果たす白血球。T細胞は、CD4⁺ T細胞およびCD8⁺ T細胞を含むがこれらに限定されない。CD4⁺ Tリンパ球は、その表面に、「4番目の分化クラスター（cluster of differentiation 4)」（CD4）として知られるマーカーを有する免疫細胞である。この細胞はヘルパーT細胞としても知られ、抗体反応ならびにキラーT細胞反応を含む、免疫応答の協調に補助的に作用する。CD8⁺ T細胞は、「8番目の分化クラスター（cluster of differentiation 8)」（CD8）と呼ばれるマーカーを有する。1つの態様では、CD8⁺ T細胞は細胞傷害性Tリンパ球である。別の態様では、CD8⁺細胞はサプレッサーT細胞である。

T細胞の走化性：
T細胞の、サイトカインなどの化学走性活性因子の濃度勾配に沿った定方向移動。正の走化性を示す細胞は、対象薬剤が高濃度で存在する領域に向かって移動し、また負の走化性を示す細胞は、こうした領域から離れるように移動する。

T細胞の走化性の亢進には、走化性刺激を受けない対照試料と比較時の、走化性刺激に反応した、T細胞の遊走の距離もしくは速度の延長もしくは上昇、遊走するT細胞数の増加、試料中の移動性T細胞の種類の増加が含まれるがこれらに限定されない。

治療的有効量：
疾患の進展を妨げたり、疾患の回復を促したりするのに十分な用量、または疾患に起因する症状（疼痛や腫脹など）を緩和可能な用量。

治療：
初期の感染または疾患の予防的阻害と、未治療の感染症、または腫瘍の成長や細菌感染などの疾患過程の自然経過を変化させるための治療的介入の両方を意味する。

トリプトファン（W）：
成長および正常な代謝に不可欠なアミノ酸（C₁₁H₁₂N₂O₂）。トリプトファンはナイアシンの前駆体である。

潰瘍性大腸炎：
結腸内面の潰瘍および炎症を特徴とする炎症性腸疾患。

野生型：
天然に通常認められるポリペプチドまたは核酸の状態。天然状態とも呼ばれる。1つの例では、野生型ポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列中の位置において、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基が置換されていないポリペプチドである。

特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味をもつ。単数形の「1つの（a、an）」、および「その（the）」という表現は、文中で明記しない限りにおいて、複数形を含む。これと同様に、「または（or）」という表現は、文中で明記されない限りにおいて「および（and）」という表現を含むことを意図する。さらに、核酸またはポリペプチドに関する、すべての塩基の大きさ、またはアミノ酸の大きさ、およびすべての分子量もしくは分子量値は概算値であり、説明目的で記載したものと理解される。本明細書に記載された方法および材料と類似していたり同等であったりする方法および材料は、本開示を実施または検討する際に使用することができるが、適切な方法および材料について以下に説明する。本明細書で言及されたすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合は、用語の説明を含む本明細書を優先する。また材料、方法、および実施例は、説明目的のみで提示し、制限する意図はない。

薬学的組成物の組成および投与
ポリペプチドのアミノ酸配列中の位置にアルギニン→トリプトファン（R：W）置換、またはアルギニン→フェニルアラニン（R：F）置換を有するポリペプチドを含む組成物が本明細書で提供される（アルギニンは、ポリペプチドの未置換状態でADP-リボシル化されうる）。アルギニン残基が、トリプトファン（W）残基またはフェニルアラニン（F）残基で置換されることで、活性および/または安定性が修飾されたポリペプチドが得られる。

1つの態様では、ポリペプチドは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基と、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基との置換を含む。ADP-リボシル化されうるアルギニン残基は、この位置でトリプトファンまたはフェニルアラニンのいずれかと置換可能である。1つの特定の非制限的な例では、1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをトリプトファンと置換することができる。別の特定の非制限的な例では、1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをフェニルアラニンと置換することができる。他の特定の非制限的な例では、2つのADP-リボシル化されうるアルギニンを2つのトリプトファンもしくは2つのフェニルアラニンと、または1つのトリプトファンおよび1つのフェニルアラニンと置換することができる。少なくとも1つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基を有するポリペプチドの特定の非制限的な例には、デフェンシンやADP-リボシルトランスフェラーゼなどがある。

本明細書で開示のR：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドは、抗微生物活性のあるポリペプチドを含む。抗微生物活性の特定の非制限的な例には、サイトカインの分泌、T細胞の走化性、および好中球の動員などがある。1つの態様では、抗微生物活性のあるポリペプチドは、αデフェンシンなどのデフェンシンである。

1つの特定の態様では、αデフェンシンは、哺乳類のポリペプチドなどの脊椎動物のポリペプチドである。1つの例では、αデフェンシンのポリペプチドはヒトに由来する。別の例では、αデフェンシンのポリペプチドは、サル、ウサギ、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、またはマウスに由来する。αデフェンシンは、ヒト好中球ペプチド（HNP）-1の場合がある。αデフェンシンのポリペプチドは、HNP-2、HNP-3、HNP-4、HD-5、MD-6、またはDef-Xの場合もある。

αデフェンシンは、HNP-1、HNP-2、HNP-3、およびHNP-4を含む。HNP-1、HNP-2、およびHNP-3は、同じ94アミノ酸のプレプロタンパク質の産物である。このようなプレプロタンパク質の配列を以下に示す：

（配列番号：1を参照。参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号P11479も参照）、またはこの保存的異型。

HNP-1は、プレプロタンパク質の切断によって作られるαデフェンシンのファミリーの1つの分子である。1つの態様では、HNP-1の配列は、以下の通りである：

（配列番号：2）、またはこの保存的異型。

配列番号：2に記載されたHNP-1ポリペプチド配列の（HNP-1ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）5位、14位、15位、または24位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、5位、14位、15位、または24位の少なくとも1つのアルギニン残基は、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基で置換されて、安定性および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドとなりうる。したがって1つの態様では、トリプトファンは、HNP-1ポリペプチドの5位、14位、15位、または24位の少なくとも1か所に含まれる。別の態様では、フェニルアラニンが、5位、14位、15位、または24位の少なくと1か所でアルギニン残基と置換される。別の態様では、HNP-1ポリペプチドは、少なくとも1つのトリプトファンおよび少なくとも1つのフェニルアラニンと、ADP-リボシル化されうるアルギニンとの置換を含む。

少なくとも1つのR：F置換またはR：W置換を有するHNP-1ポリペプチドの特定の非制限的な例を以下の表に示す。

（表１）

HNP-2は、プレプロタンパク質の切断によって作られるαデフェンシンのファミリーの別の分子である。1つの態様では、HNP-2の配列は

で表される配列（配列番号：3）、またはこの保存的異型を有する。

配列番号：3に記載されたHNP-2ポリペプチド配列の（HNP-2ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）4位、13位、14位、または23位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、4位、13位、14位、または23位の少なくとも1つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基は、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基のいずれかと置換されて、安定性および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドとなりうる。当業者であれば、本明細書に記載された記述に含まれるポリペプチドを容易に同定して、表2に示した置換と類似した例示的な置換を作ることができる。

（表２）

HNP-3は、プレプロタンパク質の切断によって作られるαデフェンシンのファミリーの第3の分子である。1つの態様では、HNP-3は

で表される配列（配列番号：4）、またはこの保存的異型を有する。

配列番号：4に記載されたHNP-3ポリペプチド配列の（HNP-3ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）5位、14位、15位、または24位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、5位、14位、15位、または24位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化され、またトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基のいずれかと置換されて、安定性が高められた、および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドが得られる。当業者であれば、本明細書に記載された記述に含まれるポリペプチドを容易に同定して、表3に示した置換のような、例示的な置換を作ることができる。

（表３）

HNP-4は、

（配列番号：5、参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_001916も参照）で表される配列のプレプロタンパク質、またはこの保存的異型の産物であるαデフェンシンである。

1つの態様では、HNP-4の配列は

（配列番号：6）、またはこの保存的異型で表される。

HNP-4ポリペプチド配列の（HNP-4ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）5位、10位、11位、15位、または32位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、5位、10位、11位、15位、または32位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化され、またトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基のいずれかと置換されて、安定性および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドが得られる。当業者であれば、本明細書に記載された記述に含まれるポリペプチドを容易に同定して、表1、表2、または表3に示した置換に類似した例示的な置換を作ることができる。

HD-5は、

（配列番号：7、参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_066290）で表される配列のプレプロタンパク質、またはこの保存的異型の切断によって作られる。

1つの態様では、HD-5の配列は

（配列番号：8）、またはこの保存的異型で表される。

配列番号：8に記載されたHNP-5ポリペプチド配列の（HNP-5ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）5位、8位、12位、24位、27位、または31位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、5位、8位、12位、24位、27位、または31位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化され、またトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換されて、安定性または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドが得られる。当業者であれば、本明細書に記載された記述に含まれるポリペプチドを容易に同定して、表1、表2、または表3に示した置換に類似した例示的な置換を作製することができる。

HD-6は、

（配列番号：9、参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_001917）で表される配列のプレプロタンパク質の切断によって作られる。

1つの態様では、HD-6の配列は

（配列番号：10）、またはこの保存的異型で表される。

配列番号：10に記載されたHNP-6ポリペプチド配列の（HNP-6ポリペプチド配列のアミノ末端から数えて）5位、6位、または26位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化されうる。したがって、5位、6位、または26位の少なくとも1つのアルギニン残基はADP-リボシル化され、またトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換されて、安定性および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドが得られる。当業者であれば、本明細書に記載された記述に含まれるポリペプチドを容易に同定して、表1、表2、または表3に示した置換に類似した例示的な置換を作ることができる。

ADP-リボシル化されうるアルギニン残基を含む任意のADP-リボースアクセプターを、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換することで、安定性および/または抗微生物活性が高められた抗微生物ポリペプチドが得られる。1つの態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドは、NADase活性を有するポリペプチドである。別の態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドは、ARTなどのART活性を有するポリペプチドである。ART活性を有するポリペプチドの2つの特定の非制限的な例がART2aとART2bである。ART活性を有するポリペプチドの他の特定の非制限的な例には、ART1、ART3、ART4、またはART5などがあるがこれらに限定されない。1つの態様では、ARTは脊椎動物のポリペプチドである。別の態様では、ARTは哺乳類のポリペプチドである。さらに別の態様では、ARTはラットのポリペプチド（例えばART2b）である。

本明細書で開示のポリペプチドは、当業者に周知の任意の方法で作製することができる。1つの態様では、このようなポリペプチドは合成ポリペプチドである。約100アミノ酸未満の、または約50アミノ酸未満の合成ポリペプチドは、既知の手法で作製することができる。例えば、Merrifield固相合成法（Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149-2146、1963）などの固相法で合成ポリペプチドを作製することができる。自動合成装置は市販されている（例えばPerkin Elmer、Applied BioSystems）。こうした自動合成装置を用いて、対象ペプチド配列の置換（R：W置換やR：F置換など）を作ることができる。

ADP-リボシル化されうるアルギニンのR：W置換またはR：F置換を含むポリペプチドは、適切な発現ベクターに挿入可能なポリペプチドをコードするDNA配列を用いて組換え的に作製することができる。対象ポリペプチド、ならびに適切な転写および翻訳の制御エレメントをコードする発現ベクターを構築する方法は既知である。また対象核酸配列中における部位特異的変異を、同配列の翻訳がR：W置換またはR：F置換を含むように作製する際に用いられる方法は当業者に周知である。材料は、組換えDNAを必要とせずに化学的に合成することもできる。これは特に、小ペプチドまたは上述の他のアルギニン含有化合物についてあてはまるがこれらに限定されない。

活性および/または安定性が修飾されたポリペプチドの作製法
活性および/または安定性が修飾されたポリペプチドの作製法が提供される。この方法は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基を、ポリペプチドのアミノ酸配列中のトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換する段階を含む。1つの態様では、このようなポリペプチドは抗微生物ポリペプチドである。抗微生物ポリペプチドの特定の非制限的な例は、デフェンシンまたはADP-リボシルトランスフェラーゼである。安定性または活性が修飾されたポリペプチドを作製する方法は、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、または少なくとも4つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基を、ポリペプチドのアミノ酸配列中のトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換する段階を含む場合がある。したがって1つの例では、1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをトリプトファンと置換するポリペプチドを作製することができる。別の例では、1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをフェニルアラニンと置換するようなポリペプチドを作製することができる。他の例では、2つのADP-リボシル化されうるアルギニンを、2つのトリプトファンまたは2つのフェニルアラニンと置換する。別の例では、少なくとも1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをフェニルアラニンと置換し、また少なくとも1つのADP-リボシル化されうるアルギニンをトリプトファンと置換する。

1つの態様では、このような方法で、ADP-リボシル化されうるアルギニンのR：W置換またはR：F置換を作ることで、対照ポリペプチドと比較して活性が高められたポリペプチドが得られる。別の態様では、このような方法で、対照ポリペプチドと比較してポリペプチドの活性が低下したポリペプチドが得られる。1つの例では、高められる活性は、NADase活性などの酵素活性であるがこれに限定されない。他の例では、高められる活性はART活性、免疫細胞の動員、サイトカインの分泌、または抗微生物活性もしくは細胞傷害性活性である。このような活性（例えば抗微生物活性、またはタンパク質の投与に対する応答による病原体の溶解）は、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約80%、または少なくとも約100%高めることができる。別の態様では、活性を少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約80%、または少なくとも約100%低下させることができる。

安定性が高められたポリペプチドを作製する方法についても提供される。この方法は、ADP-リボシル化されうるアルギニンのR：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドを作製する段階を含む。対照ポリペプチドの特定の非制限的な例は、対象位置におけるアルギニンが置換されていないか、またはADP-リボシル化されているアルギニンを含む野生型ポリペプチドである。対照の別の例は標準値である。複数の態様では、安定性の上昇は、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約80%、または少なくとも約100%の安定性の上昇の場合がある。

ADP-リボシル化されうるアルギニン残基と、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基との置換などの、ポリペプチド内のアミノ酸残基の置換は、当業者に周知の任意の手段で達成することができる。上述したように、遺伝子工学的な手法または化学合成法のいずれかを用いることができる。1つの特定の非制限的な例では、標準的なDNA変異導入法には、オリゴヌクレオチド部位特異的変異導入法やPCRによる部位特異的変異導入法などがある。これらの手法の詳細は、Sambrookらの文献（In Molecular Cloning：Laboratory Marital、CSHL、New York、2001）の第13章に記載されている。また上述したように、アミノ酸の置換を、所望のアミノ酸を有する分子の化学合成によって、特定の残基位置に導入することができる。

スクリーニング法
ポリペプチドが安定化可能か否か、またはポリペプチドの活性が変更可能か否かを判定するための、ポリペプチドのスクリーニング法が本明細書に開示される。1つの態様では、アルギニン残基のADP-リボシル化されうる能力が、ポリペプチドの安定化の可能性、またはポリペプチドの活性の上昇可能性の指標となる。1つの例では、このようなポリペプチドは、デフェンシンなどの抗微生物ポリペプチドの場合がある。このようなポリペプチドは、ADP-リボシルトランスフェラーゼなどの酵素の場合もある。

当業者であれば、アルギニンがADP-リボシル化されているか否か容易に判定することができる。1つの特定の非制限的な例では、ポリペプチドを、アルギニン残基をADP-リボシル化しうるARTとインキュベートする。次に、ARTがポリペプチドをADP-リボシル化する能力を評価する。ポリペプチドは、少なくとも1つ、例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基を有する場合がある。対照ポリペプチドの電気泳動移動度と比較する、ポリペプチドの電気泳動移動度の測定などの非限定的な任意のアッセイ法でADP-リボシル化を評価することができる。対照ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの電気泳動移動度が低下している場合、ポリペプチドがADP-リボシル化されていることがわかる。対照ポリペプチドの特定の非制限的な例は、（ARTの代わりに）緩衝液とインキュベートしたポリペプチドなどの、ADP-リボシル化されていないことがわかっているポリペプチドである。対照ポリペプチドの別の特定の非制限的な例は、ADP-リボシル化されないアルギニンのR：F置換および/またはR：W置換を有するポリペプチドである。

スクリーニング法で同定されたポリペプチドの安定性または活性が変化したことを確認するためには、アルギニン残基を、トリプトファンまたはフェニルアラニンと置換する。少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、または少なくとも4つのアルギニン残基を、トリプトファン残基もしくはフェニルアラニン残基と置換することが可能であり、また対象ポリペプチドの安定性または活性に変化があるか否かを判定することが可能である。1つの態様では、ポリペプチドの安定性が、R：F置換またはR：W置換などのアミノ酸の置換によって高められる（例えば、非置換型ポリペプチドまたは対照ポリペプチドと比較して、少なくとも約20%、50%、80%、100%、または200%の上昇）。安定性は、当業者に周知の任意の手段で測定可能であり、またポリペプチドの半減期（t1/2）の測定を含むがこれらに限定されない。R：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドの活性を測定して、対照ポリペプチドの安定性と比較することもできる。対照の特定の非制限的な例は、1か所もしくは複数の対象位置にアルギニンを含むポリペプチド、または標準値である。

少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのR：W置換もしくはR：F置換を有するポリペプチドを検討して、その活性が変化しているか否かを判定することができる。1つの態様では、ポリペプチドの活性は、R：F置換またはR：W置換などのアミノ酸置換によって高まる（例えば、非置換型ポリペプチドなどの対照ポリペプチドと比較して少なくとも約20%、50%、80%、100%、または200%の上昇）。別の態様では、ポリペプチドの活性は、R：F置換またはR：W置換などのアミノ酸置換によって低下する（例えば、非置換型ポリペプチドなどの対照ポリペプチドまたは標準値と比較して少なくとも約20%、50%、80%、または100%の低下）。

活性は、当業者に周知の任意の手段で測定することが可能であり、酵素活性または免疫学的活性を含むがこれらに限定されない。酵素活性を測定するアッセイ法には、キナーゼアッセイ法（セリン/スレオニンアッセイ法やチロシンキナーゼアッセイ法など）、自己リン酸化アッセイ法、ホスファターゼアッセイ法、NADaseアッセイ法、ADP-リボシルトランスフェラーゼアッセイ法、ホスホジエステラーゼアッセイ法、グルタミン酸デカルボキシラーゼアッセイ法、オキシゲナーゼアッセイ法などがある。免疫学的活性を測定するアッセイ法には、走化性アッセイ法、サイトカイン産生・分泌アッセイ法、細胞傷害性活性、Th1活性、およびTh2活性を含むT細胞活性の生物学的アッセイ法、好中球動員のアッセイ法、ならびにB細胞の活性化を測定するアッセイ法などがある。他の酵素学的アッセイ法および免疫学的アッセイ法は当業者に周知である。

薬学的組成物と、置換型ポリペプチドの使用法
本明細書に開示されたように、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のアミノ酸置換は、ポリペプチドの活性を変化させたり、ポリペプチドの安定性を変化させたりすることが可能である。例えば、デフェンシン分子などの抗微生物ペプチドにおける、アルギニン→トリプトファン（R：W）置換、またはアルギニン→フェニルアラニン（R：F）置換は、ペプチドの抗微生物活性を高めたり、および/または治療有効量を被験対象へ投与時に被験対象の免疫応答を修飾したりすることができる。したがって、微生物に対する免疫応答を調節する方法について本明細書で提供する。

デフェンシンポリペプチドは先天的免疫防御に関与する抗微生物ペプチドであり、細菌、真菌、およびある種のウイルスなどの微生物に対して細胞傷害性を示す。またこのポリペプチドは、近傍の細胞からのIL-8の放出を促し、T細胞の走化性の亢進を誘導する。方法のセクションに記載したように、デフェンシン分子の活性を、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基をトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換することでも変化させることができる。またR：W置換型および/またはR：F置換型のデフェンシン分子は、ADP-リボシル化アルギニン残基を有するデフェンシン分子と比較して高い抗微生物活性を示す場合がある。デフェンシン分子の活性プロファイルは変化する場合もある。R：W置換型および/またはR：F置換型のデフェンシン分子は、ADP-リボシル化されたアルギニン残基を含むデフェンシン分子と比較して高い安定性を示す場合がある。

1つの態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基をトリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換することで、非置換型デフェンシン分子と比較して、被験対象に投与時のデフェンシンの抗微生物活性が高められる。複数の特定の非制限的な例では、αデフェンシンは、HNP-1、HNP-2、HNP-3、およびHNP-4を含むがこれらに限定されない。抗微生物活性は、抗菌活性、抗真菌活性、または抗ウイルス活性の場合がある。複数の特定の非制限的な例では、抗微生物活性の上昇は少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約80%、少なくとも約100%、または少なくとも約200%である。別の態様では、抗微生物活性の上昇は、サイトカイン産生の増加である。サイトカイン発現の増加は、サイトカインの分泌、発現、および/または放出の増加の場合がある。1つの特定の非制限的な例では、このようなサイトカインはIL-8である。抗微生物活性は、好中球などの炎症細胞の動員の亢進の場合がある。好中球の動員は、当業者に周知の任意の方法で測定できる。1つの態様では、好中球動員の促進を、細胞からのIL-8の放出によって測定する。1つの特定の非制限的な例では、IL-8の放出を、間接的な酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）で測定する。

さらに別の態様では、抗微生物活性の変化は、炎症細胞の走化性の亢進である。1つの特定の非制限的な例では、炎症細胞はT細胞である。

したがって、微生物に対する免疫応答の修飾法について提供する。この方法は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換および/またはR：F置換を有する治療有効量のデフェンシンを、微生物に感染した被験対象か、または微生物感染リスクのある被験対象に投与することで、微生物に対する免疫応答を調節する段階を含む。被験対象の免疫応答は、非置換型デフェンシン分子を投与した被験対象、または非投与被験対象と比較して高まる。

1つの態様では、免疫応答の修飾は、リンパ球の走化性の亢進を含む。したがって、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するαデフェンシンなどの治療有効量のデフェンシンの被験対象への投与は、被験対象におけるT細胞の走化性を調節する。例えばT細胞の走化性は、修飾型αデフェンシンを置換することで、非置換型αデフェンシン分子と比較して被験対象で高められる。T細胞の走化性は、当業者に周知の任意の手段で測定できるが、一般的には、T細胞の遊走長か遊走T細胞数、またはこの両方を測ることで測定される。1つの特定の非制限的な例では、1つの細胞培養チャンバーから多孔性膜を経て、別の細胞培養チャンバーへのT細胞の遊走を測定するといった方法でT細胞の遊走をインビトロで測定する。

別の態様では、免疫応答の修飾は炎症反応の変化を含む。したがって、αデフェンシンなどの治療有効量のデフェンシンの投与によって炎症反応が高まる。炎症反応は、当業者に周知の任意の手段で測定できる。1つの態様では、炎症反応を、試料中に存在する活性化されたT細胞の数を評価することで測定する。別の態様では、炎症反応を、好中球の動員の変化に注目して測定する。さらに別の態様では、炎症反応を、IL-8の産生および/または放出の変化などの、サイトカインの産生および/または放出に注目して測定する。複数の態様で、サイトカインの産生および/または放出の増加は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するデフェンシンの存在下において、対照と比較時に100%、200%、または300%のサイトカインの産生および/または放出の増加である。

被験対象は哺乳類とすることができる。1つの態様では被験対象はヒトである。別の態様では、被験対象はサル、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはマウスの場合がある。1つの態様では、被験対象は肺疾患などの疾患に罹患した患者である。肺疾患の特定の非制限的な例は、肺気腫、成人呼吸促迫症候群、喘息、気管支肺異形成症、慢性気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、または嚢胞性線維症である。別の態様では、被験対象は、細菌、真菌、またはウイルスなどの病原体に感染している。肺に影響を及ぼす細菌感染の特定の非制限的な例は肺炎または結核である。

別の態様では、被験対象には良性腫瘍または悪性腫瘍などの腫瘍が存在する。特定の非制限的な例は、肺、腸、結腸、乳房、卵巣、子宮、前立腺、睾丸、または肝臓の腫瘍である。

他の態様では、被験対象は腸疾患に罹患している。腸疾患の特定の非制限的な例は、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患である。

さらに別の態様では被験対象は免疫不全である。1つの特定の非制限的な例では、被験対象はヒト免疫不全ウイルス（例えばHIV-1やHIV-2）などの免疫不全ウイルスに感染している。他の態様では、被験対象は自己免疫疾患に罹患している。

薬学的組成物は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有する治療有効量のポリペプチドを含む場合があり、また適切な固体または液体の担体で、選択された特定の投与様式に応じて製剤化することができる。活性または安定性が変化した、R：W置換またはR：F置換を有するポリペプチドの特定の非制限的な例には、αデフェンシンおよびARTなどがある。本開示に有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は従来のものである。例えば、非経口用の剤型は通常、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセリンなどの薬学的および生理的に許容される液体溶媒である注入溶液を含む。含めることが可能な賦形剤は例えば、ヒト血清アルブミンや血漿調製物などの他のタンパク質である。望ましいならば、投与対象の薬学的組成物には、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など（例えば酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレート）の、微量の非毒性補助物質を含めることもできる。

他の医学的薬剤および医薬品、例えば他の免疫賦活剤を含めることもできる。免疫賦活剤は、例えばマクロファージ炎症性タンパク質（MIP）-β、IL-1、IL-8、IL-10、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ニューロキニン、および腫瘍壊死因子αを含むがこれらに限定されない。

薬学的組成物の投与剤型は、被験対象に対して選択された投与様式で決定される。例えば、注入溶液のほかに、局所用、吸入用、経口用の剤型、および座剤を使用することができる。局所用の調製物には、点眼剤、軟膏、スプレー剤などがある。吸入用調製物は液体（例えば溶液または懸濁液）の場合があり、ミスト剤やスプレー剤などを含む。経口用剤型は液体（例えば、シロップ、溶液、もしくは懸濁液）、または固体（例えば粉末、ピル、錠、またはカプセル）の場合がある。座剤も、固体、ゲル、または懸濁状の場合がある。固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含む場合がある。このような投与剤型の実際の調製法は、当業者に既知であるか、または明らかとなる。

ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するαデフェンシンなどの治療有効量のポリペプチドを含む薬学的組成物は、正確な用量の個々の投与に適した単位剤型に製剤化することができる。1つの特定の非制限的な例では、単位用量には、約1 ng〜約1 mgのこのようなポリペプチドを含めることができる。投与される活性化合物（群）の量は、対象となる被験対象、疾患の重症度、および投与様式に依存し、また例えば、処方する医師の判断で決定することができる。これにこれらの範囲には、投与対象となる剤型は、投与被験対象で所望の作用を達成するのに有効な量の活性成分（群）を含む。

本開示の化合物は、局所的、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔、皮下への投与、吸入、または座剤によるなどのさまざまな様式で、組織で有効なヒトまたは他の動物に投与することができる。特定の投与様式および用法は、治療に当たる臨床医によって、症例の詳細（例えば、被験者、疾患、関連疾患状態、および治療が予防的か否か）が考慮されて選択される。投与は、投与期間中に1日1回または1日複数回で数日〜数か月、ときには何年にもわたる化合物（群）の投与とすることができる。しかしながら有効量のデフェンシンは、投与対象の被験対象、疾患の重症度および種類、ならびに治療薬（群）の投与様式に依存する。

ADP-リボシル化されうるアルギニン残基にR：W置換またはR：F置換を有するαデフェンシンなどのポリペプチドの治療有効量は、被験対象の免疫系を調節するのに必要な量のポリペプチドとすることができる。いくつかの例では、治療有効量は、T細胞の走化性を刺激したり、好中球の動員を促進するのに十分な量などの、抗微生物活性を高めるのに十分な置換型デフェンシンの量である。

開示された化合物の部位特異的な投与は例えば、アミノ酸が置換されたデフェンシンポリペプチド（例えばADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換型またはR：F置換型のαデフェンシン）を炎症領域、感染領域、または炎症もしくは感染の起きやすいと考えられる領域に使用することで実施可能である。

本開示は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基におけるR：W置換またはR：F置換を有するαデフェンシンなどのポリペプチドと、免疫に関連した障害、状態、または疾患の治療に有用な1種類もしくは複数の薬剤の組み合わせも含む。例えば本開示の化合物は、有効量の免疫賦活剤、抗癌剤、抗炎症剤、抗感染薬、および/またはワクチンと組み合わせて投与することができる。「併用投与」または「同時投与」という表現は、活性薬剤の同時および連続的な投与の両方を意味する。感染性病原体に感染している被験対象、または免疫抑制を示す被験対象は、以下に挙げる本明細書に開示された治療法による治療の候補となる。

他の方法
被験対象における天然のαデフェンシンポリペプチドの細胞毒性活性を抑制する方法が本明細書に開示される。この方法は、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基の、アルギニン→トリプトファン（R：W）置換またはアルギニン→フェニルアラニン（R：F）置換を有する治療有効量のデフェンシンポリペプチドを被験対象に投与して、同ポリペプチドの細胞毒性活性を低下させる段階を含む。1つの態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換またはR：F置換を有するデフェンシンのポリペプチドは、αデフェンシンのポリペプチドである。例えばαデフェンシンのポリペプチドがHNP-1の場合、配列番号：1（またはこの保存的異型）で表されるHNP-1の配列の14位のアルギニン残基はADP-リボシル化可能であり、またトリプトファン残基で置換可能である。別の例では、14位のアルギニン残基をフェニルアラニン残基と置換する。

細胞毒性活性は、αデフェンシンのポリペプチドの細胞溶解能力を指標に測定する。いくつかの態様では、溶解する細胞は正常細胞、悪性細胞、または宿主防御機構に耐性を示す細胞である。細胞の溶解は、インキュベーション期間後に試料中に残存する生細胞の数を検出する既知の任意の手段で測定できる。試料中の生細胞の数を対照試料と比較する。例えば対照は、野生型αデフェンシンとのインキュベーション後に残った細胞の数の場合がある。

ARTのNADase活性やトランスフェラーゼ活性などの活性を調節する方法についても提供される。1つの態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換および/またはR：F置換は、ARTのNADase活性を高める。別の態様では、ADP-リボシル化されうるアルギニン残基のR：W置換および/またはR：F置換は、ARTのトランスフェラーゼ活性を高める。いくつかの特定の例では、ARTはART-1、ART-2a、ART-2b、ART-3、ART-4、およびART-5である。

いくつかの特定の非制限的な例では、NADase活性またはART活性の上昇は、対照ポリペプチドと比較して少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約80%、少なくとも約100%、または少なくとも約200%の上昇である。NADase活性は、加水分解されたNAD⁺の量の増大の測定などの、当業者に周知の任意の手段で測定できる。ART活性は、ADP-リボシル化アルギニン残基の量の増大の検出などの、当業者に周知の任意の手段で測定できる。

本開示を、以下の非制限的な実施例で説明する。

実施例
特定の残基のADP-リボシル化は、修飾型タンパク質の特性を変化させることが知られているが、ADP-リボース結合はピロホスファターゼで容易に切断される。したがって、タンパク質の活性に作用する安定なタンパク質修飾を他にも同定することが求められている。

モノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼは、NADからアクセプタータンパク質中の複数の特定のアミノ酸の1つへのADP-リボースの転移を触媒する。このような酵素の一部は、アミノ酸に代えて水をアクセプターとして利用することで、NADからADP-リボースおよびニコチンアミドを生じる（NADase活性）。このような酵素の特性は、ADP-リボシル化を利用してタンパク質を修飾して、哺乳類細胞の重要な代謝経路または調節経路の活性を変化させる細菌毒素（例えばアルギニン特異的ADP-リボシルトランスフェラーゼ（ART）であるコレラ毒素（CT））を対象に詳しく調べられている（ADP-ribosylating toxins and G proteins：Insights in Signal Transduction（Moss, J.およびVaughan, M.編）、American Society for Microbiology、Washington、DC、1990）。

哺乳類のARTの1つのファミリーは、小胞体内腔への輸送に関与するシグナル配列をアミノ末端に、また場合によっては、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーの付加に必要なシグナル配列をカルボキシ末端にもつ前駆体を含む（Okazakiら、J Biol Chem 273（37）：23617-20、1998）。これらのARTは細胞外に局在するため、エクト型タンパク質または細胞外タンパク質の修飾を介した細胞間の相互作用および細胞とマトリックス間の相互作用を調節する可能性がある。例えばART1は、C2C12細胞でインテグリンα7を修飾し（Zolkiewskaら、J Biol Chem 268（34）：25273-6、1993）、またマウスのTリンパ球でTCRの補助受容体（例えばLFA-1、CD8、CD27、CD45）を修飾する（Nemotoら、J Immunol 157（8）：3341-9、1996）。これらの修飾は培養細胞で同定されており、ミリモル濃度の細胞外NADを必要とする。先天性免疫応答に関与するデフェンシンなどの細胞外タンパク質はエクト型トランスフェラーゼによってADP-リボシル化され、結果的にその生物学的性質が変化する。ADP-リボシル化されたHNP-1は、そのインビボにおける修飾と一致して、ヒト気管支肺胞洗浄液から回収された。この修飾を触媒するエクト型ARTは、ヒトの気道上皮細胞で同定されており、ヒトの気道がADP-リボシル化経路を利用して免疫応答を調節している可能性があることが示唆されている（Balducciら、Am J Respir Cell Mol Biol 21（3）：337-46、1999）。

ARTのアミノ酸配列は、毒素の配列と大きく異なり、また相互に大きく異なる。ウサギの骨格筋に由来するART1は、ラットのART2 NADase（RT6）と配列が30〜40%が同一である（Balducciら、Am J Respir Cell Mol Biol 21（3）：337-46、1999）。毒素のADP-リボシルトランスフェラーゼの結晶構造の解析により、触媒部位の形成、NAD結合、およびADP-リボースの転移に必要なリボシル-ニコチンアミド結合の活性化に関与する3つの領域が同定されている（Domenighiniら、Mol Microbiol 21（4）：667-74、1996、およびBredehorstら、Adv Exp Med Biol 419：185-9、1997）。これらの領域は、哺乳類のトランスフェラーゼにも存在するようである（Mossら、Mol Cell Biochem 193（1-2）：109-13、1999）。領域Iは、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）の存在によって定義され、領域IIは、疎水性アミノ酸に富む配列の存在によって、またはセリン（S）XS（Xはスレオニン（T）、セリン（S）またはアラニン（A）を意味する）の存在によって定義され、また領域IIIは、グルタミン酸（E）の存在によって定義される。ART1および細菌毒素に関しては、領域IIIを対象とした部位特異的変異導入によって、領域IIIのグルタミン酸が触媒作用に重要なことが検証されており、また領域IIIの第2のグルタミン酸が果たす役割が明らかにされている（Takadaら、J Biol Chem 269（13）：9420-3、1994）。ヒトART1のコンセンサスE-X-E配列中の第2のグルタミン酸を置換すると活性が消失した。マウスのART2a（mRt6.1）の場合、第1のグルタミン酸をグルタミン（Q）に置換したところ、アルギニン特異的トランスフェラーゼ活性が消失してNADaseが生じた（Karstenら、Adv Exp Med Biol 419：175-80、1997）。この結果は、第1のグルタミン酸のカルボキシル基が、アルギニンのグアニジノ基の適切な位置決定に必要であることを示唆している。この逆も成り立ち、ラットのART2 NADaseが、第1のグルタミンをグルタミン酸に置換することでアルギニン特異的トランスフェラーゼに変換されている（Haraら、J Biol Chem 271（47）：29552-5、1996）。

ラットのART2b（RT6.2）およびART2a（RT6.1）は、単一コピー遺伝子の2つの対立遺伝子にコードされているが（Thieleら、Adv Exp Med Biol 419：109-20、1997）、ヒトの相当分子にはコード領域に停止シグナルがあるのでタンパク質は発現されない（Haagら、J Mol Biol 243（3）：537-46、1994）。現時点では、胸腺通過後の末梢および腸上皮内のTリンパ球だけがART2タンパク質を発現することが知られている（Mojcikら、Dev Immunol 1（3）：191-201、1991）。両ART2タンパク質ともインビボで細胞から放出されるとみられ、また血清の高密度リポタンパク質分画中に可溶性分子として存在することが報告されている（Lesmaら、J Immunol 161（3）：1212-9、1998、およびWaiteら、Cell Immunol 152（1）：82-95、1993）。これらの生物学的機能は不明であるが、ART2を発現するTリンパ球の不在、欠損、または減少は自己免疫性糖尿病と関連する（Bortellら、Autoinmunity 33（3）：199-211、2001、およびGreinerら、J Immunol 136（1）：148-51、1986）。両タンパク質とも、GPI-アンカーを介して細胞表面に結合しており、またART2aはグリコシル化されているがART2bはグリコシル化されていない（Thieleら、Immunology 59（2）：195-201、1986、およびKochら、Immunology 65（2）：259-65、1988）。成熟したプロセス後の状態では、ART2bとART2aは10残基のアミノ酸が異なる。ART2は領域IIIにグルタミン（QEE）が存在するために、NADからADP-リボースおよびニコチンアミドへの加水分解を触媒するが、ART1とは対照的に、ADP-リボースをアルギニンや他の低分子量のグアニジノ化合物には転移しない。ART2bでは、タンパク質は、自己修飾の触媒能力が大きく異なっていたが、複数の部位で自己ADP-リボシル化可能なART2aでは差は認められなかった。自己ADP-リボシル化は、NADaseおよびトランスフェラーゼ活性（特に赤血球のNADase活性）を調節することが報告されている。この活性は自己ADP-リボシル化によって低下する（Yamadaら、Arch Biochem Biophys 308（1）：31-6、1994；Hanら、Biochem J 318（Pt 3）：903-8、1996、およびWengら、J Biol Chem 274（45）：31797-803、1999）。

以下の実施例で説明するように、自己ADP-リボシル化と、活性に及ぼす作用に関する構造的特性を調べる目的で、ART2bおよびART2aのアミノ酸配列を、重要な触媒領域IIIに特に注意しながら比較した。204位のアルギニンのリシンへの置換（R204K）では、一次修飾と二次修飾の両方が消失した。しかし、トリプトファンへの置換（R204W）では、非アルギニン部位における自己ADP-リボシル化が認められた。これは、疎水性のトリプトファンがADP-リボシル-アルギニンに代わりうることを示唆しており、204位のアミノ酸が、同タンパク質の他の部位の修飾に調節的役割を果たすことと一致する。

実施例1
材料および方法
野生型ART2a（RT6.1）発現プラスミドおよびART2b（RT6.2）発現プラスミドの構築
ラットのART2aの読み枠を、ART2a-pCRII.1プラスミドをテンプレートとして用いてPCRで増幅し、pMAMneo哺乳類発現ベクター（Clontech、Palo Alto、CA）に、先頭のコドンの上流にKozakコンセンサス領域（GCCACG）を含むNheI/XhoI断片としてクローン化した。ラットのART2b-pMAMneo哺乳類発現ベクターの構築手順については文献に記載されている（Takadaら、J. Biol. Chem 269：9420-9423、1994）。組換えART2bの哺乳類ウイルスにおける発現レベルを上げるために、QuickChange部位特異的変異導入キット（Stratagene、La Jolla、CA）を製造業者の指示書通りに用いて、また配列：

（配列番号：13）に対応する一対の相補的な変異導入用プライマーを用いて、Kozakコンセンサス配列を先頭のATGの上流に挿入した。プラスミドコンストラクトの配列は、読み枠全体のDNA配列を決定して検証した。

ラットのART2bおよびART2aのアミノ酸配列は、細菌毒素および他の哺乳類のADP-リボシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列とはかなり異なるが、個々の配列は、ウサギのART1および細菌毒素に類似した大きな領域（特にNAD結合部位の形成に関与すると考えられている3つの領域）を有する。ART2bの配列とART2aの配列は14残基のアミノ酸が異なり、このうち10残基は、GPI-アンカー付加時に切り出される領域のN末端側に位置する（図1）。ART2bでは、他のARTとは異なり、触媒活性に必要なコンセンサスグルタミン酸（ART2の209位）を含む領域IIIのアミノ末端側の204位にアルギニンが存在する（R204）。また推定コンセンサスグリコシル化部位が、ART2aの58〜60位に存在するが、ART2bには存在しない。

野生型RT6.1およびRT6.2に対する部位特異的変異導入
ART2bとART2aはいずれもNADase活性を有するが、ART2bのみが有意に自己ADP-リボシル化される。触媒機能の差に関する構造的基盤を調べるために、組換え型のART2bタンパク質およびART2aタンパク質をラット腺癌（NMU）細胞でデキサメタゾン感受性プロモーターを利用して合成して部位特異的変異導入を行った。点突然変異をART2aおよびART2bのcDNAにQuickChange部位特異的変異導入キット（Stratagene、La Jolla、CA）を製造業者の指示書通りに用いて導入した。指定の変化をアミノ酸に導入するための、相補的な変異導入用プライマー対を合成するためのセンス鎖の配列を表4および表5に示す。変化対象の塩基に下線を付した。

（表４）ART2a用の変異導入用プライマー

（表５）ART2b用の変異導入用プライマー

すべてのクローンを対象に、制限酵素による切断でスクリーニングを行い、読み枠全体のDNA配列（両鎖）を決定して確認した。

細胞培養およびタンパク質の発現
ラット乳腺腺癌（NMU）細胞を、10%のウシ胎仔血清（GIBCO BRL、Carlsbad、CA）を含むイーグル最小必須培地で37℃で5% CO₂中で成長させた。所定のART2aコンストラクトまたはART2bコンストラクトを含むpMAMneoベクター（Clontech、Palo Alto、CA）を、Lipofectomine Plus Reagent（Invitrogen、Carlsbad、CA）を製造業者の指示書通りに用いて細胞にトランスフェクトした。導入細胞を、0.5 mg/mlのジェネティシン（G-418；Life Technologies社、Grand Island、NY）で選択した。

タンパク質の発現を、1 μMのデキサメタゾン（Sigma、St. Louis、MO）を用いて24時間かけて誘導した。トリプシン処理したコンフルエント細胞を遠心（1000xg）して沈降させ、DPBSで洗浄し、500 μlのDPBSに溶解した0.05単位のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）（ICN Pharmaceuticals、Costa Mesa、CA）とともにインキュベートし（37℃で1時間）、GPIアンカーを切断してタンパク質を細胞表面から解離させた。細胞を遠心（1000xg）して沈降させ、C末端がオリゴ糖と結合したトランスフェラーゼタンパク質を含む上清を回収した。

NAD糖加水分解酵素およびADP-リボシルトランスフェラーゼのアッセイ法
NADase活性を、0.1 mMの［カルボニル-¹⁴C］NAD（8x10⁴ cpm）を添加したDPBS中で30℃で1時間かけて測定した（総容量＝150 μl）。試料（50 μl）を、AG1-X2（BIO-RAD、Hercules、CA）カラム（0.4x4 cm）に添加し、平衡化して水で溶出し、液体シンチレーション測定用の試料を文献（Mossら、Proc Natl Acad Sci USA 73（12）：4424-7、1976）記載の手順で得た。トランスフェラーゼ活性を、ADP-リボースアクセプターとしてのアグマチンの存在化（20 mM）、または非存在下で、［カルボニル-¹⁴C］NAD置換用の［アデニン-¹⁴C］NADの存在下で、同様に測定した。

実施例2
ART2bとART2aの配列比較
ラットのART2bおよびART2aのアミノ酸配列は、細菌毒素および他の哺乳類のADP-リボシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列とは大きく異なるが、各配列は、ウサギART1および細菌毒素に類似した大きな領域（特にNAD結合部位の形成に関与すると考えられる3つの領域）を有する。ART2bとART2aの配列は14アミノ酸が異なり、このうち10残基は、GPI-アンカー付加時に切り出される領域のN末端側に位置する（図1）。ART2bでは、触媒活性に必要なコンセンサスグルタミン酸（ART2では209位）を含む領域IIIのアミノ末端側の204位にアルギニンが存在する（R204）が、他のARTにはこれは認められない。また推定コンセンサスグリコシル化部位が、ART2aの58〜60位に存在する（ART2bには存在しない）。

実施例3
部位特異的変異導入（アミノ酸の置換）
ART2bもART2aもNADase活性を有するが、ART2bだけが有意に自己ADP-リボシル化される。触媒機能における、これらの差違の構造的基盤を調べるために、部位特異的変異導入で、組換え型のART2bタンパク質およびART2aタンパク質をラット腺癌細胞（NMU）でデキサメタゾン感受性プロモーターを利用して合成した。GPI-アンカーを有するタンパク質の誘導および発現後に、細胞をPI-PLCとインキュベートしてGPIアンカーを切断し、次に[³²P]NADを培地に添加し、放出されたタンパク質の自己ADP-リボシル化を促進した（図2）。すべての組換えタンパク質にはNADase活性が認められ、いずれも抗ペプチド抗血清NAD2に反応し、免疫ブロットで推定サイズが29 kDaであることがわかった。グリコシル化されたイソ型であるART2aには、約33 kDaの追加的なバンドが見られ、N-グリコシル化のコンセンサス配列が1つであることと一致した。

自己ADP-リボシル化された野生型ART2bの複数の分子種がSDS-PAGEで認められた。81位のアルギニンをリシンと置換しても自己ADP-リボシル化に影響は認められなかったが、これは204位のアルギニンのリシンによる置換（R204K）（図2）では消失し、204位のアルギニンが一次修飾部位であるということと一致した。予想通り（図5に示すように）、ADP-リボシルアルギニン結合はヒドロキシルアミンに感受性を示した。ART2b（R81K）でR204をY、E、およびKと置換すると（図3）、自己ADP-リボシル化が消失したが、すべてのタンパク質はNADase活性を保持していた。204位がチロシンである野生型ART2aは有意に自己修飾されなかった。しかしながら、ART2a（Y204R）またはART2a（M81R、Y204R）では、グリコシル化された33 kDaの状態、およびグリコシル化されていない29 kDaの状態の両方に自己ADP-リボシル化が認められた（図3）。81位におけるアルギニンの置換（ART2a（M81R））だけでは作用は認められなかった。

すべてのART2a変異体のNADase活性は、野生型ART2aのNADase活性より低く、その自己ADP-リボシル化能に依存していなかった。以上の結果は、204位がNADase活性を調節する役割を果たすことと矛盾しなかった。ART2a（Y204R）では、N58をAで置き換えたり、または59KSE61を59MNA61に変えたりする、推定コンセンサスグリコシル化部位の修飾はグリコシル化を妨げ、SDS-PAGEで1本の免疫反応性のバンドを生じた。非グリコシル化分子種はいずれも自己ADP-リボシル化された。したがって1つのアミノ酸（R204）が、ART2bまたはART2a（Y204R）の自己ADP-リボシル化を担っている。

実施例4
自己ADP-リボシル化
ART2タンパク質であるART2aおよびART2bの、複数の部位における自己ADP-リボシル化能を評価するために、最初にタンパク質を10 μMの[³²P]NADとインキュベートし、次に5 mMの非標識NADを添加し、さらにインキュベートした（図4）。野生型ART2b、ART2b（R81K）、および変異体ART2a（Y204R）、ART2a（Y204R、M81R）、およびART2a（59MNA61、Y204R）は、5 mMのNADとのインキュベーション後に、SDS-PAGEにおける移動度の低下から明らかなように自己ADP-リボシル化を示し、複数の部位が修飾されることと矛盾しなかった。これとは対照的にART2b（R204K）は、NADとのインキュベーションで修飾されず、一次および二次の自己ADP-リボシル化部位が失われたことが示唆された（図5）。反応を1 mMのADP-リボースの存在下で実施したことから、自己修飾が[³²P]ADP-リボースの非酵素的付加に起因する可能性は小さく、また放射標識が、5 mMのNADとのインキュベーションで置換されなかったことから、NAD結合に起因する可能性も小さい。

したがって204位のアルギニンは、ART2bおよびART2a（Y204R）の複数の部位における自己ADP-リボシル化を調節する。保存的置換であるリシンはアルギニンに代わることはできなかったので、アルギニンのADP-リボシル化は、同タンパク質の別の位置における修飾に必要な開始段階であると考えられる。複数の自己ADP-リボシル化部位がSDS-PAGEで認められた際に、野生型ART2bによるNADの加水分解の速度の低下が認められた。野生型ART2bの活性は、ART2b（R204W）の場合と同様に、反応過程中に低下したが、自己ADP-リボシル化されないART2b（R204K）の活性には変化は認められなかった。

以上のデータは、自己修飾される残基が触媒部位に接近し、このために修飾可能となって、ART2a（Y204R）の場合のように自己ADP-リボシル化活性を調節可能となり、またNADase活性を調節可能となることを示唆している。理論に拘束されることなく、ART2aに見られたこの現象の1つの可能な理由は、自己修飾残基が領域IIIのグルタミン酸に近いことである。自己ADP-リボシル化可能なすべてのART2a変異体（例えば204位のアルギニン）は、野生型と比較してNADase活性が低下していた（図3）。

実施例5
ART2b（R204K）のリボシル化とADP-リボース結合の特性解析
ART2b（R204K）が修飾されるか否かを調べるために、野生型ART2bを、変異型ART2b（R204K）およびミリモル量のNADとインキュベートした（図5）。NADと、ART2b（R204K）を適宜添加したインキュベーション後に、ART2bは、SDS-PAGEで移動度の低下を示した。この結果は、同分子が自己ADP-リボシル化されたこと意味する。しかしながら、ART2b（R204K）が、分子間反応で野生型ART2bによって修飾されないという結論と一致して、ART2b（R204K）の移動に変化は認められなかった。

ADP-リボース-アミノ酸結合は、酸、ヒドロキシルアミン、および塩化水銀に対する感受性によって特性を解析することができる（図6）。野生型ART2b、またはART2a（M81R、204R）とミリモル濃度のNADとのインキュベーションの結果生じる、複数のADP-リボース結合の特性を調べるために、その化学感受性を調べた。PI-PLCで放出されたタンパク質を、10 μMの[³²P]NADとインキュベートするか［RT6.1（N58A、Y204R）およびRT6.2（R204W）］、または続けて5 mM のNADとインキュベートした。自己ADP-リボシル化されたART2b、ART2a（M81R、Y204R）、およびRT6.1（N58A、Y204R）に関しては、ヒドロキシルアミンによって[³²P]ADP-リボース放射標識が放出され、ADP-リボース-アルギニン結合が化学的に安定であることと矛盾しなかった。

しかし驚くべきことに、本明細書で開示されるように、アルギニン-204がトリプトファンで置換されたART2b変異体（ART2b（R204W））は、複数の部位で弱い自己ADP-リボシル化活性を示し、NADase活性は野生型ART2bの活性より大きかった（図3、図4）。[³²P]ADP-リボースは、自己ADP-リボシル化されたART2b（R204W）から、ヒドロキシルアミン、塩化水銀、または酸によって放出されなかったことから、アルギニン、システイン、およびリシンはそれぞれ、自己ADP-リボシル化反応で修飾されなかったことが示唆された（図6）。したがって、トリプトファン変異体は自己ADP-リボシルトランスフェラーゼであるが、野生型ART2bとはADP-リボースアクセプター部位（群）が異なる。理論に拘束されることなく、このトリプトファンは、204位のADP-リボシル化されたアルギニンの調節的役割を果たす可能性がある。トリプトファンの大きな側鎖または疎水性が、触媒グルタミン酸（アミノ酸209位）に近接する領域III中に位置することと相まって、自己ADP-リボシルトランスフェラーゼ、ならびにNADaseの活性を高めている可能性がある。しかしながら、この変異体は野生型と同様に、ADP-リボースをアグマチンに移すことができない。

トリプトファンのもつ、ADP-リボシルアルギニンの一部の機能を置き換える能力は、タンパク質の設計に用いられる可能性がある。ADP-リボシル化はタンパク質の機能に影響するが、その修飾そのものは生物系で不安定である。この修飾は、AMPの放出を伴うピロホスファターゼで切断され、結果として生じるホスホ-リボシルタンパク質は、さらにホスファターゼで分解されてリボシル-タンパク質となる。ADP-リボシル化タンパク質の合成には、組換え分子の産生に続く、追加的な段階（群）が必要であることは明らかである。これとは対照的に、トリプトファンを含むタンパク質は標準的な手法で作製することが可能であり、また生物系で異常な不安定性を示さないはずである。本明細書で開示されるように、リボシル化されうるアルギニンと、トリプトファンまたはフェニルアラニンとの置換は、以下に説明するデフェンシンを含むがこれらに限定されない多くの系で有用である。

実施例6
細胞毒性アッセイ法
R：W置換またはR：F置換のいずれかを有する、さまざまな濃度（16 nM、32 nM、64 nM、128 nM、256 nM）のHNP-1、ADP-リボシル-HNP-1、またはHNP-1の大腸菌（Escherichia coli）ATCC43827（American Type Culture Collection、Rockville、Maryland）に対する抗微生物活性を放射拡散（radial diffusion）アッセイ法（Takemuraら、「Evaluation of susceptibility of gram positive and negative bacteria to human defensins by using radial diffusion assay」、Antimicrob. Agents Chemother 40：2280-2284、1996）で評価する。得られた結果から、放射拡散アッセイ法で、R：W置換またはR：F置換を有するHNP-1が、非修飾型HNP-1と比べて大腸菌ATCC43827に対する細胞毒性の小さいADP-リボシル化されたHNP-1と似たようにふるまうことがわかる（参照として本明細書に組み入れられる国際特許出願番号PCT/US03/04649号を参照）。

実施例7
クロム遊離アッセイ法
クロムで標識したA549細胞（American Type Culture Collection）を、HNP-1、ADP-リボシル-HNP-1、またはR：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1（1.5〜24 μM）を含む100 μlの無血清RPMI（Gibco Fluids社、Rockville、Maryland）とインキュベートして（18時間、37℃）、デフェンシンの細胞毒性を定量した。細胞毒性は、細胞から放出されたクロムの量として測定する（Panyutichら、「Human neutrophil defensins and serpins form complexes and inactivate each other」、Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol 12：351-357、1995）。得られた結果から、R：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1、およびADP-リボシル化されたHNP-1の、A549細胞に対する細胞毒性が非修飾型HNP-1より低いことがわかる。

実施例8
放射拡散アッセイ法およびクロム遊離アッセイ法
HNP-1（100 nM）を、ADP-リボシル化されたHNP-1、またはR：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1（0〜800 nM）と37℃で1時間インキュベートした後に、大腸菌に対する細胞毒性アッセイ法を開始する。

HNP-1（12 μM）を、ADP-リボシル-HNP-1、またはR：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1（1.5〜12 μM）と37℃で1時間インキュベートした後に、クロム遊離アッセイ法を開始する。

ADP-リボシル化されたHNP-1は、HNP-1の細胞毒性活性を濃度依存的にブロックする。R：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1は、HNP-1に対してADP-リボシル化されたHNP-1と同じ作用をもつ。

実施例9
A549細胞によるIL-8の産生
A549細胞（3x10⁴細胞/ウェル）を、ADP-リボシル-HNP-1、HNP-1、またはR：W置換もしくはR：F置換のいずれかを有するHNP-1（0.25 μM、0.75 μM、1.5 μM、3 μM）を含む200 μlの無血清RPMI培地（Gibco Fluids社）を添加した96ウェルプレートでインキュベートする。インキュベーションの12時間後または24時間後に培地から試料をサンプリングし、IL-8量を、間接的ELISAで製造業者（R&D System社、Minneapolis、Minnesota）の指示書通りに測定する。0.75 μMおよび1.5 μMの濃度では、IL-8の放出は、ADP-リボシル化されたHNP-1に関して、またはR：W置換もしくはR：F置換のいずれかを有するHNP-1に関して、非修飾型ペプチドと比較して有意に高い。

実施例10
走化性アッセイ法
CD3⁺ T細胞を、白血球搬出法（leukapheresis；NIH、Department of Transfusion Medicine、Bethesda、Maryland）で調製したヒト末梢血から単離し（Chertovら、J. Biol. Chem. 271：2935-2940、1996）、遊走用培地（RPMI 1640、0.5%ウシ血清アルブミン、25 mM HEPES）に懸濁する。コラーゲンIVでコーティングした挿入断片（Becton Dickinson Labware、Bedford、Massachusetts）を24ウェルの培養プレートに据え、各ウェル内に上部および下部のチャンバーを形成した。上部チャンバーを遊走用培地で湿らせ、次にADP-リボシル-HNP-1、HNP-1、またはR：W置換もしくはR：F置換のいずれかを有するHNP-1（0.025〜25 nM）を含むか、または含まない500 μlの遊走用培地を下部チャンバーに添加する。細胞を上部チャンバーに添加し、プレートを5% CO₂中で37℃で4時間インキュベートする。下部チャンバーへ遊走するリンパ球を遠心して回収し、血球計数器で数える。得られた結果から、ADP-リボシルHNP-1、およびR：W置換またはR：F置換のいずれかを有するHNP-1にT細胞動員能力があることがわかる。

本開示は、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基で置換されて、活性および/または安定性が高められたポリペプチドとなる、アルギニン残基を有するポリペプチドを作製する方法を提供する。また本開示は、安定化されたポリペプチドのスクリーニング法、ならびにポリペプチドの活性の修飾法を提供する。記載された方法の詳細は、記載された発明の趣旨から解離することなく変更されたり改変されたりすることは明らかになる。発明者らは、添付の特許請求の範囲および趣旨に含まれる、このようなすべての改変および変更を請求する。

ラットのART2a（RT6.1）およびラットのART2b（RT6.2）の推定アミノ酸配列の略図。同一のアミノ酸に影を付けてある。204位および81位のアルギニンはART2bに特異的である。ART2aでは、N58および58NKSE61が、ART2bには存在しない推定コンセンサスグリコシル化部位中に存在する。細菌毒素および哺乳類のADP-リボシルトランスフェラーゼの触媒部位の形成に関与すると考えられる領域I、領域II、および領域IIIを実線で示し、推定触媒アミノ酸に星印を付してある。点線は、小胞体への輸送時に切り出されるシグナル配列（アミノ末端）を、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーの結合部位（カルボキシ末端）を示す。 ベクターのみ（レーン1）、野生型ART2b（レーン2）、ART2b（R81K）（レーン3）、ART2b（R204K）（レーン4）、野生型ART2a（レーン5）、ART2a（M81R）（レーン6）、およびART2a（Y204R）（レーン7）をトランスフェクトしたNMU細胞に由来する上清の自己[³²P]ADP-リボシル化（図2A）および免疫反応性（図2B）を示す一連のブロットのデジタル画像。データは、8回の独立した実験の代表である。 ART2b、ART2a、およびこれらのタンパク質のさまざまな変異体の自己ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性（図3A）および免疫反応性（図3B）を示す一連のブロットのデジタル画像、ならびにNAD糖加水分解酵素（NADase）活性（nmol/時間）（図3C）を示すデータ。左側は、野生型および変異型のART2bタンパク質のデータを示す（ART2b（レーン1）、ART2b（R204K）（レーン2）、ART2b（R81K）（レーン3）、ART2b（R204Y）（レーン4）、ART2b（R204E）（レーン5）、ART2b（R204W）（レーン6）、ART2b（R81K、R204K）（レーン7））。右側は、野生型および変異型のART2aタンパク質のデータを示す（ART2a（レーン1）、ART2a（M81R）（レーン2）、ART2a（Y204R）（レーン3）、ART2a（M81R、Y204R）（レーン4）、ART2a（N58A、Y204R）（レーン5）、ART2a（59NMA61、Y204R）（レーン6））。データは、2回の実験の代表である。 ART2b（図4A）、ART2a（図4B）、およびこれらのさまざまな変異体の自己ADP-リボシル化を示す一連のブロットのデジタル画像。このゲルは、野生型ART2b（レーン1）、ART2b（R81K）（レーン2）、ART2b（R204W）（レーン3）、ART2a（Y204R）（レーン4）、ART2a（Y204R、M81R）（レーン5）、およびART2a（59NMA61、Y204R）（レーン6）を発現する細胞に由来する試料を含む。データは、2回の実験のうちの1つである。 ホスホイメージャー（図5A）、または免疫応答性（図5B）で解析した、自己ADP-リボシル化されたART2bタンパク質およびART2b（R204K）タンパク質のSDS-PAGEによる分離を示す一連のブロットのデジタル画像。このブロットは、野生型ART2b（レーン1）、ART2b（R204K）（レーン2）を発現する細胞に由来する試料、またはART2bとART2b（R204K）を含む試料混合物（レーン3）を含む。試料は、10 μMの[³²P]NADを添加（または不添加）してインキュベートした後に、TCAによる沈殿か、または5 mMのNADとさらにインキュベートした。放射標識した野生型ART2bタンパク質およびART2b（R204K）タンパク質を混合後に、5 mMのNADを添加（または不添加）してインキュベートした。 酸、ヒドロキシルアミン、および塩化水銀に対する感受性を調べるための、タンパク質のSDS-PAGEによる分離を示す一連のブロットのデジタル画像。野生型ART2b、ART2b（R204W）、ART2a（M81R、Y204R）、およびART2a（N58A、Y204R）を発現する細胞に由来する試料は、10 μMの[³²P]NADと、これに続く10% TCAの添加によって（カラムII）、または5 mMのNADとの30℃で1時間のさらなるインキュベーションと、これに続く10% TCAによる沈殿により（カラムI）、自己ADP-リボシル化された。中和した試料を、0.1 MのTris-HCl、pH 7.5（レーン1）、0.2 MのHCl（レーン2）、10 mMのHgCl₂（レーン3）、2 MのNH₂OH（レーン4）、または0.2 MのNaCl（レーン5）中で37℃で2時間懸濁した。この試料をSDS-PAGE（12%ゲル）で分離し、ニトロセルロースにトランスファーし、ホスホイメージャーで解析し（図6A）、また抗ペプチド抗体1126によるイムノブロットで解析した（図6B）。データは、2回の実験を代表する1回の実験に由来する。

Claims (35)

1. ADP-リボシル化されうるアルギニン残基を、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と、タンパク質のアミノ酸配列の位置において置換することで、活性または安定性が高められたタンパク質を作製する段階を含む、活性または安定性が高められたタンパク質を作製する方法。
2. タンパク質が、高められた抗微生物活性を有する、請求項1記載の方法。
3. 抗微生物活性が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項2記載の方法。
4. サイトカインの放出が、インターロイキン-8の放出を含む、請求項3記載の方法。
5. タンパク質がデフェンシンである、請求項2記載の方法。
6. デフェンシンがαデフェンシンである、請求項5記載の方法。
7. アルギニン残基が、タンパク質のアミノ酸配列中においてトリプトファン残基と置換される、請求項2記載の方法。
8. アルギニン残基が、タンパク質のアミノ酸配列中においてフェニルアラニン残基と置換される、請求項2記載の方法。
9. 活性が、タンパク質のアミノ酸配列の位置にアルギニン残基を有するポリペプチドと比較して高められる、請求項2記載の方法。
10. 安定性が、タンパク質のアミノ酸配列の位置にアルギニン残基を有するポリペプチドと比較して高められる、請求項2記載の方法。
11. 高められた活性または安定性が、対照ポリペプチドと比較して100%の上昇または100%の低下である、請求項2記載の方法。
12. 高められた活性または安定性が、対照ポリペプチドと比較して50%の上昇または50%の低下である、請求項2記載の方法。
13. タンパク質中のアルギニン残基がADP-リボシル化されうるか否かを判定する段階を含む、タンパク質が安定化可能か否かを判定する方法。
14. 被験対象に投与時にタンパク質が抗微生物活性を有する、請求項13記載の方法。
15. 以下の段階を含む、タンパク質中のアルギニン残基がADP-リボシル化されうるか否かを判定する、請求項14記載の方法：
    タンパク質に、アルギニン残基をADP-リボシル化可能なADP-リボシルトランスフェラーゼを接触させる段階；
    ADP-リボシルトランスフェラーゼと接触させたタンパク質の電気泳動移動度を測定する段階；ならびに
    タンパク質の電気泳動移動度を、第1の対照の電気泳動移動度と比較する段階（第1の対照と比較してタンパク質の電気泳動移動度が低下しているのであれば、タンパク質がADP-リボシル化されていることを意味するので、タンパク質中のアルギニン残基がADP-リボシル化されるか否かがわかる）。
16. 抗微生物活性が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項14記載の方法。
17. タンパク質がデフェンシンである、請求項14記載の方法。
18. デフェンシンがαデフェンシンである、請求項17記載の方法。
19. 少なくとも1つのADP-リボシル化されうるアルギニン残基が、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基と置換されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物（置換が、ポリペプチドの活性または安定性を高める）。
20. ポリペプチドが抗微生物活性を有する、請求項21記載の組成物。
21. アルギニン残基がトリプトファン残基と置換される、請求項20記載の組成物。
22. アルギニン残基がフェニルアラニン残基と置換される、請求項20記載の組成物。
23. 抗微生物活性が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項20記載の組成物。
24. タンパク質がデフェンシンである、請求項20記載の組成物。
25. デフェンシンがαデフェンシンである、請求項24記載の組成物。
26. トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基に置換される少なくとも1つのアルギニン残基を含む、治療有効量のデフェンシンを含む薬学的組成物。
27. デフェンシンが抗微生物活性を有する、請求項26記載の薬学的組成物。
28. 抗微生物活性が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項27記載の薬学的組成物。
29. ADP-リボシル化されうるアルギニン残基をトリプトファンまたはフェニルアラニンと置換することで、デフェンシンポリペプチドの活性または安定性を高める段階を含む、デフェンシンポリペプチドの活性または安定性を高める方法。
30. デフェンシンポリペプチドがαデフェンシンである、請求項29記載の方法。
31. 活性が抗微生物活性である、請求項29記載の方法。
32. 抗微生物活性が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項31記載の方法。
33. アミノ酸の置換を含む治療有効量のデフェンシンポリペプチドを被験対象に投与することで、被験対象の免疫応答を修飾する段階を含む、被験対象の免疫応答を高める方法（アミノ酸の置換が、リボシル化されうるアルギニンとトリプトファンまたはフェニルアラニンによる置換である）。
34. 免疫応答が、T細胞の走化性、好中球の動員、またはサイトカインの放出を含む、請求項33記載の方法。
35. 被験対象が免疫疾患に罹患している、請求項33記載の方法。

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