JP2005530516A - トランスポゾンベースのベクターを使用したトランスジェニック動物における遺伝子調節 - Google Patents

トランスポゾンベースのベクターを使用したトランスジェニック動物における遺伝子調節 Download PDF

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Abstract

改変トランスポゾンベースのベクターの投与を使用して、動物への外因性遺伝子の安定した組み込みを達成した。これらのトランスジェニック動物は、トランスジェニック子孫を産生する。さらに、これらのトランスジェニック動物は、導入遺伝子によりコードされる大量の所望の分子を産生する。トランスジェニック卵生動物は、導入遺伝子によりコードされる大量の所望の分子を産生し、卵中にこれらの分子を貯蔵する。

Description

本発明は包括的に、トランスジェニック動物における細胞特異的遺伝子調節に関する。動物は、前核注射、あるいは胎芽内、精巣内、卵管内または静脈内投与を含む任意の投与方法によるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニックとしてもよい。これらのトランスジェニック動物は、生殖細胞を含む細胞すべてにおいて、所定の遺伝子を含有する。動物はまた、トランスポゾンベースのベクターの取り込みおよび遺伝子組み込みのために特異的な細胞を標的とすることによりトランスジェニックとしてもよい。トランスジェニック動物の細胞への所定の遺伝子の安定した組み込みは、細胞中での所定の遺伝子の発現により実証され、ここで発現は、プロモーター配列により調節される。プロモーター配列は、所定の遺伝子と一緒に導入遺伝子(transgene)して用意されてもよく、あるいは細胞にとって内因性であってもよい。プロモーター配列は、構成的であってもよく、あるいは誘導性であってもよく、ここで誘導性プロモーターとしては、組織特異的プロモーター、発生的調節性プロモーター、および化学的誘導性プロモーターが挙げられる。
米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。本発明の開発は、米国農務省からのＨＡＴＣＨ助成金として米国政府により一部資金援助を受けており、米国農務省からのＦｏｒｍｕｌａ１４３３資金により米国政府により一部資金援助を受けており、また陸軍により授与された協定ＤＡＡＤ１９−０２０１６の下で米国政府により一部資金援助を受けている。
［発明の背景］
トランスジェニック動物は、医薬品用途、診断用途および工業用途用の所望の分子を産生するための生物学的工場としての潜在能力を含む各種理由のため望ましい。この潜在能力は、所望の分子の組換え産生に使用される設備の不十分な収容能力およびこれらの設備の使用に関する薬学産業からの高まる需要に起因して産業にとって魅力的である。トランスジェニック動物を産生する無数の試みは、低比率の遺伝子組み込み、および不安定な遺伝子組み込みを含む幾つかの問題に応じてきた。したがって、遺伝子技術の改善が、所望の分子の産生のためのトランスジェニック動物の開発に必要である。
遺伝子送達技術の改善もまた、動物およびヒトにおける疾患の治療に必要である。多くの疾患および状態は、遺伝子送達技術により治療することができ、遺伝子送達技術は、疾患または状態を患う患者に所定の遺伝子を提供する。かかる疾患の例は、１型糖尿病である。１型糖尿病は、最終的には膵臓におけるインスリン産生β−細胞の崩壊をもたらす自己免疫疾患である。１型糖尿病の患者は、インスリン注射またはインスリンポンプにより適切に治療され得るが、これらの療法は、ほんの一部に効果的である。例えばインスリン注射またはポンプ投与によるインスリン補充は、高血糖状態で見出される血管内皮における欠損を完全に逆転させることはできない（Pieper et al., 1996. Diabetes Res. Clin.
Pract. Suppl. S157-S162）。さらに、徹底的な家庭内での血中グルコースのモニタリングにもかかわらず、高血糖症または低血糖症が頻繁に生じる。最終的には、消費される消費カロリーの適切な比率を維持するのに綿密な食事制限が必要である。このことは、多くの糖尿病患者にかなりの心理社会的ストレスを引き起こす場合が多い。糖尿病患者の脾臓へのインスリン遺伝子の送達を提供する遺伝子療法の開発は、これらの問題の多くを克服し、平均寿命およびクオリティ・オブ・ライフの改善をもたらすことができる。
幾つかの従来技術の遺伝子送達技術は、潜在的に望ましくない副作用および安全性の懸念を伴ったウイルスを使用した。遺伝子療法で有用な現在の遺伝子送達技術の大部分が、もはや複製しないように弱毒化したアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ならびに他のウイルスのようなウイルスベースの送達ベクターに依存している(Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7:33-40)。
ウイルスベクターの使用に関連して多数の問題が存在する。まず、ウイルスベクターは、組織特異的ではない。実際に、アデノウイルスを用いた遺伝子療法の治験は、ベクターが患者の精巣に存在したため最近中断された（治療が子供の遺伝子構成を変化させ得る懸念にもかかわらず、遺伝子治験を続行。The New York Times, December 23, 2001）。第二に、ウイルスベクターは、一過的に組み込まれる可能性が高く、これは指定の時間間隔で患者を再治療することを余儀なくさせる(Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7:33-40)。第三に、ウイルスベースのベクターは、その病原性の形態に戻って、疾患を引き起こし得るという懸念が存在する。第四に、ウイルスベースのベクターは、安定した組み込みには分裂中の細胞を要する。第五に、ウイルスベースのベクターは、様々な細胞および組織に無差別に組み込まれ、それは望ましくない生殖系列組み込みをもたらし得る。第６に、所望の効果を達成するのに必要とされる高力価は、患者の死をもたらす場合があり、別の研究では癌の誘発を招くと考えられている(Science, News of the Week, October 4, 2002)。
したがって、安定に組み込まれた遺伝子を有するトランスジェニック動物およびヒトを産生するための新規ベクターが必要とされており、ここで該ベクターは、疾患または他の望ましくない副作用を引き起こさないものである。また、複製中でない静止状態の細胞を含む動物およびヒトの組織ならびに細胞に安定に組み込まれるであろうＤＮＡ構築物に関しても必要性がみられる。動物およびヒトの特異的組織ならびに細胞へ遺伝子を送達することが可能なＤＮＡ構築物に関して当該技術分野においてさらに認識されている必要性がみられる。
所望のタンパク質の産生のために動物に所定の遺伝子を組み込む場合、あるいは疾患の治療のために動物またはヒトに所定の遺伝子を組み込む場合、誘導性プロモーターを用いて、組み込まれた遺伝子を選択的に活性化することが望ましい場合が多い。これらの誘導性プロモーターは、遺伝子が組み込まれた細胞内で産生されるか、または転写制御要素により認識される物質により調節される。多くの場合では、遺伝子発現の制御は、トランスジェニック動物またはヒトにおいて望ましく、その結果組み込まれた遺伝子は、所望の時間で、および／または特異的物質の影響下で選択的に活性化される。したがって、トランスジェニック動物またはヒトの細胞のゲノムに導入された遺伝子を選択的に活性化する手段が必要とされる。これは、組み込みを組織特異的とさせるためのさらなる一歩となることができ、これは患者の身体（動物またはヒト）全体にわたって広範囲に及ぶ遺伝子組み込みを防止する。このことは、治療に必要とされるＤＮＡ量を減少させ、生殖体における組み込みの機会を減少させ、遺伝子が機能することを必要とされる所望の組織への遺伝子送達、組み込みおよび発現を目的とする。
［発明の概要］
本発明は、トランスジェニック動物を産生するための、および動物またはヒトにおいて疾患を治療するための新規、有効かつ効率的な組成物を提供することにより上述の問題に対処する。トランスジェニック動物としては、すべての卵生動物および産乳動物が挙げられる。トランスジェニック動物としてはさらに、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、昆虫類、哺乳類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、動物は、鳥類動物である。別の好ましい実施形態では、動物は産乳動物であり、ウシ、ブタ、
ヒツジおよびウマ動物が挙げられるが、これらに限定されない。動物は、許容可能なキャリアと一緒に、所望のタンパク質の産生のために所定の遺伝子の安定した組み込み用に設計されたトランスポゾンベースのベクターを含む組成物の投与によりトランスジェニックとさせる。トランスフェクション試薬は、投与前に組成物に任意に添加される。
本発明のトランスポゾンベースのベクターは、第１のプロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼ、および第２のプロモーターに操作可能に連結された所定のタンパク質またはペプチドに関するコード配列を含み、ここで所定のタンパク質またはペプチドに関するコード配列およびその操作可能に連結されたプロモーターは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に隣接される。トランスポゾンベースのベクターはまた、以下の特徴を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を高めるための、第１のプロモーターの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号１３）を含む１個またはそれ以上の改変コザック配列、ｂ）トランスポザーゼの最初の幾つかのＮ末端アミノ酸に関するコドンの改変（ここでは、各コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドが、相当するアミノ酸を変更させることなく、ＡまたはＴに変更された）、ｃ）トランスポザーゼ合成の終結を高めるための、１個またはそれ以上の終止コドンの付加、および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに高めるための、トランスポザーゼに操作可能に連結された有効なポリＡ配列の付加。
本発明の組成物の使用は、トランスフェクトした動物のゲノムへの、所定の遺伝子の非常に効率的かつ安定した組み込みをもたらす。例えば、トランスジェニック鳥類を交尾させて、Ｇ１世代でトランスジェニック子孫を産生させた。そのトランスジェニック子孫を交尾させて、Ｇ２世代でトランスジェニック子孫を産生させた。
本発明はまた、所定の遺伝子の組織特異的組み込みおよび／または発現を提供する。所定の遺伝子の組織特異的組み込みは、組織特異的プロモーターの制御下にトランスポザーゼ遺伝子を置くことにより達成され得るのに対し、所定の遺伝子の組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの制御下に所定の遺伝子を置くことにより達成され得る。幾つかの実施形態では、所定の遺伝子は、オボアルブミンまたは他の卵管特異的プロモーターの影響下で転写される。卵生動物において卵管特異的プロモーターに所定の遺伝子を連結させることにより、所望の分子の合成および発達中の卵中での所望の分子の貯蔵をもたらす。本発明はさらに、産乳動物において乳腺の内皮細胞における遺伝子の安定した組み込みおよび発現を提供する。乳腺の内皮細胞における所定の遺伝子の転写は、所望の分子の合成およびミルク中での所望の分子の貯蔵をもたらす。好ましい分子は、タンパク質である。幾つかの実施形態では、ミルク中に貯蔵された所望の分子は、抗ウイルスタンパク質、抗体、または血清タンパク質である。
他の実施形態では、糖尿病動物の肝細胞へのプロインスリン遺伝子の特異的組み込みは、動物の状態の改善をもたらす。かかる改善は、肝臓特異的プロモーターの制御下にトランスポザーゼ遺伝子を置くことにより達成され、これは、糖尿病動物の肝細胞における所定の遺伝子の組み込みを駆動する。
本発明は好適には、安定に組み込まれた所定の遺伝子を有する多数のトランスジェニック動物を産生する。これらのトランスジェニック動物は、それらの子孫へと所望の遺伝子を首尾よく伝える。本発明のトランスジェニック動物はまた、導入遺伝子によりコードされる大量の所望の分子を産生する。トランスジェニック卵生動物、特に鳥類は、迅速な収集および精製のために卵中に貯蔵される大量の所望のタンパク質を産生する。トランスジェニック産乳動物は、迅速な収集および精製に関してミルク中に貯蔵される大量の所望のタンパク質を産生する。
トランスジェニック動物において所望の分子を合成するために、任意の所望の遺伝子が、本発明の新規トランスポゾンベースのベクターに組み込まれてもよい。タンパク質、ペプチドおよび核酸が、本発明のトランスジェニック動物により産生されるのに好ましい所望の分子である。特に好ましいタンパク質は、抗体タンパク質である。
本発明は、実質的に多量の所望のタンパク質またはペプチドを産生することが可能なトランスジェニック雌ニワトリの産生に有用な組成物を提供する。工業的な量の所望の分子を産生するために、トランスジェニック鳥の群れ全体を非常に迅速に発達させてもよい。本発明は、分子の細菌産生に使用される発酵設備の不十分な能力における固有の問題を解決し、かつ所望の分子を産生するより効率的かつ経済的な方法を提供する。したがって、本発明は、大量の治療用分子、診断用分子および試薬分子を生産するための手段を提供する。
トランスジェニックニワトリは、タンパク質およびペプチドのような分子を製造することの利便性および効率性の観点で優れている。単一のトランスジェニック雄ニワトリを出発として、数千ものトランスジェニック子孫を１年以内に産生することができる（原則的に、最大４千万羽の子孫をわずか３世代で産生することができた）。トランスジェニック雌はそれぞれ、少なくとも２５０個の卵／年を産むと予測され、それぞれが潜在的に、数ミリグラムの選択タンパク質を何百個も含有する。数十万にも達するニワトリの群れが、確立された商業システムにより容易に取り扱われる。卵を獲得し、卵を分別するための技術もまた既知であり、広く受け入れられている。したがって、所定の治療用タンパク質、診断用タンパク質または他のタンパク質それぞれに関して、大量の実質的に純粋な物質を、比較的低い増加コストで産生することができる。
広範囲の組換えペプチドおよびタンパク質が、トランスジェニック卵生動物および産乳動物において生産することができる。酵素、ホルモン、抗体、成長因子、血清タンパク質、汎用タンパク質、生物学的応答改質剤、ペプチドおよび設計タンパク質はすべて、本発明の実施により作製され得る。例えば、概算により、１グラム当たり１ドル程度の増加コストで、大量の成長ホルモン、インスリンまたは第ＶＩＩＩ因子を生産し、かつトランスジェニック卵白中にそれらを貯蔵することが可能であると示唆される。かかる費用では、かかる医薬を注射による代わりに、吸入、あるいはさらには経口により投与することを考慮し得る。これらの手段によるバイオアベイラビリティ(bioavailability)の割合が低かった場合、さらに高い有効用量のコストを制止しない。
一実施形態では、卵生トランスジェニック動物は、鳥類である。本発明の方法は、平胸類、オウム目、ワシタカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目、クイナ目、ホトトギス目、ハト目、キジ目、ガン・カモ目、およびヘロディオン(Herodiones）を含む鳥類で使用され得る。好ましくは、卵生トランスジェニック動物は、家禽鳥である。より好ましくは、鳥は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、またはウズラである。別の好ましい鳥は、平胸類、例えばエミュー、ダチョウ、アメリカダチョウ、またはヒクイドリである。他の好ましい鳥は、ヤマウズラ、エリマキライチョウ、キーウィ、オウム、インコ、コンゴウインコ、ハヤブサ、ワシ、タカ、ハト、バタンインコ、鳴き鳥、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ムシクイ、カナリア、オオハシ、マイナまたはスズメである。
別の実施形態では、トランスジェニック動物は、産乳動物であり、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび霊長類動物が挙げられるが、これらに限定されない。産乳動物としては、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、バッファロー、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、本発明の目的は、新規トランスポゾンベースのベクターを提供することである。
本発明の別の目的は、細胞における所望のタンパク質またはペプチドの産生をコードする新規トランスポゾンベースのベクターを提供することである。
本発明の目的は、トランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生することである。
本発明の別の目的は、トランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を生産することであり、ここでトランスジェニック動物は、所望のタンパク質またはペプチドを産生する。
本発明のさらに別の目的は、トランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生することであり、ここでトランスジェニック動物は、所望のタンパク質またはペプチドを産生し、かつ卵またはミルク中にタンパク質またはペプチドを貯蔵する。
本発明のさらなる目的は、トランスポゾンベースのベクターの胎芽内、精巣内または卵管内投与によりトランスジェニック動物を産生することである。
本発明のさらなる目的は、トランスジェニック子孫を産生することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、タンパク質、ペプチドまたは核酸のような所望の分子を産生することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、トランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生する方法を提供することであり、ここでかかる投与は、内因性遺伝子発現の調節をもたらす。
本発明の別の目的は、遺伝子療法の目的で、動物またはヒトにおける所定の遺伝子の細胞あるいは組織特異的発現に有用なトランスポゾンベースのベクターを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によるトランスジェニック鳥類を産生する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、抗体またはその断片をコードするトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック動物を産生することである。
本発明のさらなる別の目的は、タンパク質またはペプチドを産生し、かつ卵中にこれらのタンパク質またはペプチドを貯蔵することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック鳥類を産生する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、安定に組み込まれた導入遺伝子を含有するトランスジェニック鳥類を提供することである。
本発明のさらなる別の目的は、卵を産生するトランスジェニック鳥類に組み込まれた導入遺伝子によりコードされる所望のタンパク質またはペプチドを含有する卵を提供することである。
本発明のさらなる目的は、タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック産乳動物を産生する方法を提供することである。
本発明のさらなる別の目的は、タンパク質またはペプチドを産生し、かつミルク中にこれらのタンパク質またはペプチドを貯蔵することが可能であるトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック産乳動物を産生する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、安定に組み込まれた導入遺伝子を含有するトランスジェニック産乳動物を提供することである。
本発明の別の目的は、タンパク質またはペプチドを産生し、かつミルク中にこれらのタンパク質またはペプチドを貯蔵することが可能であるトランスジェニック産乳動物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ミルクを産生するトランスジェニック産乳動物に組み込まれた導入遺伝子によりコードされる所望の分子を含有するミルクを提供することである。
本発明のさらなる別の目的は、ミルクを産生するトランスジェニック産乳動物に組み込まれた導入遺伝子によりコードされる所望のタンパク質またはペプチドを含有するミルクを提供することである。
本発明のさらなる目的は、動物へのトランスポゾンベースのベクターの投与によりトランスジェニック精子を産生する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、安定に組み込まれた導入遺伝子を含有するトランスジェニック精子を提供することである。
本発明の利点は、従来技術で得られるものよりも高い効率でトランスジェニック動物が産生されることである。
本発明の別の利点は、これらのトランスジェニック動物が、高コピー数の導入遺伝子を保有することである。
本発明の別の利点は、トランスジェニック動物が、導入遺伝子によりコードされる大量の所望の分子を産生することである。
本発明のさらなる別の利点は、所望の分子が、従来技術の方法よりもかなり効率的かつ経済的にトランスジェニック動物により産生され、それにより所望の分子、特にタンパク質およびペプチドの大量スケールの産生のための手段を提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示する実施形態および特許請求の範囲の以下の詳細な説明を参照した後に明らかとなるであろう。
［発明の詳細な説明］
本発明は、所望の分子の産生のための所定の遺伝子の安定した組み込みのために設計されたトランスポゾンベースのベクターを含む組成物の投与による、トランスジェニック動物、特に卵生動物および産乳動物を産生する新規の有効かつ効率的な方法を提供する。
定義
明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、それが使用される状況に応じて、１つまたはそれ以上を意味することができることが理解されよう。したがって、例えば、「細胞」に対する言及は、少なくとも１つの細胞が利用され得ることを意味することができる。
「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と交換可能に使用され、本明細書中では、「抗原」または「免疫原」として一般に称される外来物質の存在に応答して、動物または免疫系の細胞により合成されるタンパク質として定義される。抗体という用語は、抗体の断片を包含する。抗体は、抗原上の部位に対する特異的親和性を特徴とし、ここで部位は、「抗原決定基」または「エピトープ」と称される。抗原は、天然に存在してもよく、あるいは人工的に操作されてもよい。人工的に操作された抗原としては、高分子（例えば、タンパク質、核酸または多糖）のようなハプテンに結合された小ペプチドのような小分子が挙げられるが、これに限定されない。人工的に設計または操作された天然に存在する抗体の変異体、および天然には存在しない人工的に設計または操作された抗体はすべて、本定義に包含される。かかる変異体は、タンパク質およびポリペプチドに関する箇所で記載するように、保存的に置換されたアミノ酸および他の形態の置換を包含する。
本明細書中で使用する場合、「卵生動物」という用語は、鳥、カメ、トカゲのような羊膜類および単孔類動物すべてを包含する。単孔類動物は、卵生哺乳類であり、カモノハシおよびハリモグラが挙げられる。「鳥」または「家禽」という用語は、本明細書で使用する場合、本質的に飛行するように適応された温血卵生脊椎動物を特徴とする鳥網の成員として定義される。鳥類としては、平胸類、オウム目、ワシタカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目、クイナ目、ホトトギス目、ハト目、キジ目、ガン・カモ目、およびヘロディオンが挙げられるが、これらに限定されない。「平胸類」という用語は、本明細書中で使用する場合、幾つかの目を含む飛べない主として大きな走鳥であり、エミュー、ダチョウ、キーウィおよびヒクイドリを包含するものとして定義される。「オウム目」という用語は、本明細書で使用する場合、オウムを包含し、対指足を示し、かつ強力なかぎ状のくちばしを持つ単類性の目の鳥を指す。「オウム」は、短く太い強力なかぎ状のくちばしを特色とするオウム科（オウム目の唯一の科）の鳥類の任意の成員として定義される。本明細書で使用する場合「ニワトリ」は、エッグタイプニワトリのような食用卵産生に使用されるニワトリ、公衆の肉消費用に飼育されたニワトリ、すなわちブロイラー、および卵および肉産生の両方用に飼育されたニワトリ（「二重目的」ニワトリ）のようなニワトリを表す。「ニワトリ」という用語はまた、主要なブリーダー会社により産生されるニワトリ、または公衆の食用卵、肉または食用卵および肉の消費用に飼育されたニワトリの親、その親、さらにその親等であるニワトリも表す。
「卵」という用語は、本明細書中では、鳥および爬虫類により産生される多孔質、石灰質または革様の殻に包まれた巨大雌細胞として定義される。「卵子」という用語は、雌生殖体として定義され、また卵としても知られる。したがって、鳥および爬虫類以外の動物すべてにおける卵産生は、本明細書中で使用する場合、卵巣からの卵子の産生および排出、すなわち「排卵」として定義される。したがって、本明細書中で使用する場合、「卵」という用語は、鳥または爬虫類が卵を産生する場合の多孔質、石灰質または革様の殻に包まれた巨大雌細胞、あるいは他のすべての動物により産生される場合の卵子として定義されることが理解される。
「産乳動物」という用語は、本明細書中では哺乳類を指し、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび霊長類動物が挙げられるが、これらに限定されない。産乳動物としては、ウシ、ラマ、ラクダ、ヤギ、トナカイ、コブウシ、スイギュウ、ヤク、ウマ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
「遺伝子」という用語は、本明細書中では、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドに関するコード領域を含むものと定義される。
「ベクター」という用語は、「構築物」、「ＤＮＡ構築物」、および「遺伝的構築物」という用語と交換可能に使用され、細胞、組織または生物体（例えば、鳥）への外因性遺伝物質のクローニング、サブクローニング、シーケンシングあるいは導入を含むが、これらに限定されない遺伝物質の操作に使用される合成ヌクレオチド配列を表す。ベクターは、合成ＤＮＡ配列、天然に存在するＤＮＡ配列、またはその両方を含有してもよいことが当業者に理解されよう。本発明のベクターは、本明細書中で記載するようなトランスポゾンベースのベクターである。
２つのヌクレオチド配列（一方は調節配列である）について言及する場合、「操作可能に連結された」という用語は、本明細書中では、調節配列が他方のヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことが可能である様式で、２つの配列が結合されていることを意味するものと定義される。操作可能に連結された配列は、介在配列（複数可）なしで互いに直接隣接している必要はない。
「調節配列」という用語は、本明細書中では、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化配列、基質結合部位、単一構築物上の複数遺伝子の発現のためのインスレーター領域、リボソーム侵入／結合部位、発現を高めることが可能であるイントロン、およびサイレンサー）を含むものとして定義される。
トランスポゾンベースのベクター
以下の記述に拘束されることを望まないが、ＤＮＡ構築物の性質は、トランスジェニック動物を首尾よく産生する際に重要な要素であると考えられる。種すべて、特に鳥類においてこれまでほぼ普遍的にトランスジェニック作業に使用されてきた「標準」タイプのプラスミドおよびウイルスベクターは、効率が悪く、これまで観測されている低形質転換率に関する主な理由となり得る。これまで使用されてきたＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物は、宿主ＤＮＡに組み込まれないか、またはほんの低頻度で組み込まれる場合が多い。標的細胞へのベクターの乏しい侵入のような他の要素もまた役割を担ってきた。本発明は、低い導入遺伝子組み込み頻度に関する従来技術の問題を克服する、動物へ投与することができるトランスポゾンベースのベクターを提供する。トランスポザーゼ、所定の遺伝子および他のポリヌクレオチド配列が導入され得る本発明の２つの好ましいトランスポゾンベースのベクターは、ｐＴｎＭＣＳ（配列番号３６）およびｐＴｎＭｏｄ（配列番号１）と称される。
本発明のトランスポゾンベースのベクターは、これまでのベクターで達成された規模よりも数桁高い組み込み頻度をもたらす。より具体的には、従来技術のトランスポゾンベースのベクター（米国特許第５，７１９，０５５号に記載される）を用いて実施した精巣内注射は、４１％の精子陽性雄ニワトリを生じたのに対して、本発明の新規トランスポゾンベースのベクターを用いて実施した精巣内注射は、７７％の精子陽性雄ニワトリを生じた。実際の組み込み頻度は、精子からのＰＣＲシグナルの相対強度、ならびに定量的ＰＣＲによる精巣および精子の組織学的評価のいずれかまたはその両方により推定された。
本発明のトランスポゾンベースのベクターは、第１のプロモーターに操作可能に連結さ
れたトランスポザーゼ遺伝子、および第２のプロモーターに操作可能に連結された所望のタンパク質またはペプチドに関するコード配列を含み、ここで所望のタンパク質またはペプチドに関するコード配列、およびその操作可能に連結されたプロモーターは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に隣接される。トランスポゾンベースのベクターはまた、以下の１つまたはそれ以上の特徴を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を高めるための、第１のプロモーターの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号１３）を含む１個またはそれ以上の改変コザック配列、ｂ）トランスポザーゼの最初の幾つかのＮ末端アミノ酸に関するコドンの改変（ここでは、各コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドが、相当するアミノ酸を変更させることなく、ＡまたはＴに変更された）、ｃ）トランスポザーゼ合成の終結を高めるための、１個またはそれ以上の終止コドンの付加、およびｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに高めるための、トランスポザーゼに操作可能に連結された有効なポリＡ配列の付加。図１は、トランスポゾンベースのベクターの幾つかの成分の略図を示す。本発明はさらに、１個よりも多い所定の遺伝子を含有するベクターを包含し、ここでは第２の所定の遺伝子または続く所定の遺伝子は、第２のプロモーターまたは異なるプロモーターに操作可能に連結される。また、図に示されるトランスポゾンベースのベクターは本発明の描写であり、ベクター要素の順序は、図で示されるのと異なってもよく、要素は、様々な配向で存在してもよく、ベクターは、図に示されないさらなる要素を含有してもよいことが理解されよう。
トランスポザーゼおよび挿入配列
本発明のさらなる実施形態では、トランスポザーゼベースのベクターに見出されるトランスポザーゼは、変更標的部位（ＡＴＳ）トランスポザーゼであり、挿入配列は、ＡＴＳトランスポザーゼにより認識される配列である。しかしながら、トランスポザーゼベースのベクターに位置するトランスポザーゼは、改変ＡＴＳトランスポザーゼに限定されず、任意のトランスポザーゼに由来し得る。従来技術で既知のトランスポザーゼとしては、ＡＣ７、Ｔｎ５ＳＥＱ１、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００（γδ）、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、Ｄｏｔｔｅｄトランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ｄＳｐｍトランスポゾンおよびＩトランスポゾンに見出されるものが挙げられる。本発明によれば、これらのトランスポザーゼおよびそれらの調節配列は、以下の通りに機能の改善のために改変される：ａ）トランスポザーゼに操作可能に連結されたプロモーターの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号１３）を含む１個またはそれ以上の改変コザック配列の付加、ｂ）トランスポザーゼの最初の幾つかのＮ末端アミノ酸に関するコドンの変更（ここでは、各コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドが、相当するアミノ酸を変更させることなく、ＡまたはＴに変更された）、ｃ）トランスポザーゼ合成の終結を高めるための、１個またはそれ以上の終止コドンの付加、および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに高めるための、トランスポザーゼに操作可能に連結された有効なポリＡ配列の付加。
以下の記述に拘束されることを望まないが、トランスポザーゼ遺伝子の最初の幾つかのＮ末端コドンの改変は、幾分鎖の解離を増加させることにより、トランスポザーゼ遺伝子の転写を増加させると考えられる。各コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドが、コードされるアミノ酸を変更させることなく、ＡまたはＴに変更されるように、トランスポザーゼの最初のＮ末端コドンのおよそ１個〜２０個、より好ましくは３個〜１５個、最も好ましくは４個〜１２個が改変されることが好ましい。一実施形態では、トランスポゾン遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンが、この様式で改変される。また、トランスポザーゼは、米国特許第５，７１９，０５５号に記載されるように好ましい挿入部位にあまり特異的とさせない突然変異を含有し、したがって導入遺伝子の挿入率を増加させることが
好ましい。
幾つかの実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、ベクターＤＮＡのメチル化パターンを変更させることにより、特定の宿主における発現に関して最適化される。例えば、原核細胞のメチル化は、トランスポゾンベースのベクターの産生のためにメチル化欠乏生物を使用することにより減少され得る。トランスポゾンベースのベクターはまた、メチル化して、真核細胞宿主における発現のために真核細胞ＤＮＡに似せてもよい。
また改変されて使用することができる他の類似の真核生物トランスポゾンベースのベクター由来のトランスポザーゼおよび挿入配列は、例えば、米国特許第６，２９１，２４３号に開示されるショウジョウバエＰ因子、Sherman等（１９９８年）に記載されるショウジョウバエマリナー因子(Drosophila mariner element)、またはSleeping Beautyトランスポゾンである。同様に、Hackett et al. (1999)、D. Lampe et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11428-11433、S. Fischer et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 6759-6764、L. Zagoraiou et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 11474-11478、およびD. Berg et al. (Eds.), Mobile DNA, Amer. Soc. Microbiol. (Washington, D.C., 1989)も参照されたい。しかしながら、レシピエント種における真核生物トランスポザーゼが導入遺伝子を囲む原核生物挿入配列を認識する可能性が低くなるため、細菌トランスポゾンベースの要素が好ましいことに留意すべきである。
多くのトランスポザーゼは、種々の挿入配列を認識し、したがって、トランスポザーゼベースのベクターは、トランスポザーゼベースのベクターにも見出される特定のトランスポザーゼにより認識される挿入配列を含有することが理解されよう。本発明の好ましい実施形態では、挿入配列は、通常１００個をはるかに上回る塩基対を有する挿入配列を含有する野生型トランスポゾンに見出されるものと比較して、約７０塩基対長に短くされている。
以下に提供する実施例は、挿入事象に続いて破壊される「カットアンドインサート」Ｔｎ１０ベースのベクターを組み込んでいる一方で、本発明はまた、「ローリング複製(rolling replication)」タイプのトランスポゾンベースのベクターの使用も包含する。ローリング複製タイプのトランスポゾンの使用により、トランスポゾン／導入遺伝子の複数のコピーを単一の導入遺伝子構築物から作製して、そのコピーを挿入させることが可能となる。それにより、このタイプのトランスポゾンベースの系は、単一ゲノムへの導入遺伝子の複数のコピーの挿入を提供する。ローリング複製タイプのトランスポゾンベースのベクターは、所定の遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターが、宿主細胞にとって内因性であり、高コピー数で存在するか、または高度に発現される場合に好ましい場合がある。しかしながら、ローリング複製系の使用は、挿入事象を非致死レベルに制限するのに細かい制御を要し得る。Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ２１、Ｔｎ５０１，Ｔｎ５５１、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０およびＴｎ２６０３は、ローリング複製タイプのトランスポゾンの例であるが、Ｔｎ５は、ローリング複製およびカットアンドインサートタイプのトランスポゾンの両方であり得る。
終止コドンおよびポリＡ配列
一実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、トランスポザーゼおよび／または所定の遺伝子に操作可能に連結された２個の終止コドンを含有する。代替的な実施形態では、ＵＡＡまたはＵＧＡの１個の終止コドンが、トランスポザーゼおよび／または所定の遺伝子に操作可能に連結される。本明細書で使用する場合、「有効なポリＡ配列」は、アデニン塩基を含有する複数かつ連続したヌクレオチド（一連のＡポリヌクレオチド）を含有し、かつそれが操作可能に連結された遺伝子の発現を増加させる合成または非合成配列を指す。ポリＡ配列は、トランスポゾン遺伝子および所定の遺伝子を含むが、これらに
限定されないトランスポゾンベースのベクター中の任意の遺伝子に操作可能に連結され得る。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２８に提供されるポリヌクレオチド配列を含む。好ましいポリＡ配列は、宿主動物またはヒトで使用するために最適化される。一実施形態では、ポリＡ配列は、鳥、より具体的にはニワトリで使用するために最適化される。ニワトリ用に最適化されたポリＡ配列は概して、一連のＡポリヌクレオチドに先立ち、それにより終止コドンを一連のＡポリヌクレオチドと分離させる最低６０個の塩基対、より好ましくはおよそ６０個から数百個の塩基対を含有する。ニワトリ用に最適化されたポリＡ配列はまた、合成ポリＡ配列と比較した場合、減少された量のＣＴ反復を有する。本発明の一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号３３で提供されるように、またGenBank受託番号Ｙ００４０７で与えられるコンアルブミンポリＡ配列の塩基対１０６５１〜１１０５８を含む。
プロモーターおよびエンハンサー
トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結された第１のプロモーター、および所定の遺伝子に操作可能に連結された第２のプロモーターは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。構成性プロモーターとしては、即初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）即初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、リゾチーム(lysozyme)プロモーター、初期および後期ＣＭＶプロモーター、初期および後期ＨＳＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、チュブリンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターとしては、組織特異的プロモーター、発生調節性プロモーター、および化学的誘導性プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの例としては、グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）プロモーター、ビテロゲニン（vitellogenin）プロモーター、オボアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボトランスフェリンプロモーター、プロラクチンプロモーター、腎臓ウロモジュリンプロモーター、および胎盤ラクトゲンプロモーターが挙げられる。一実施形態では、ビテロゲニンプロモーターは、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む。Ｇ６Ｐプロモーター配列は、GenBank受託番号Ｕ５７５５２．１で提供されるラットＧ６Ｐ遺伝子の非翻訳上流領域に由来し得る。発生調節性プロモーターの例としては、ホメオボックスプロモーター、および幾つかのホルモン誘導性プロモーターが挙げられる。化学的誘導性プロモーターとしては、生殖ホルモン誘導性プロモーター、および抗生物質誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよび亜鉛誘導メタロチオネインプロモーター）が挙げられる。
他の誘導性プロモーター系としては、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）により誘導されるＬａｃオペレーターリプレッサー系(Cronin, A. et al. 2001. Genes and Development, v. 15)、エクダイソンベースの誘導系(Hoppe, U.C. et al. 2000. Mol. Ther. 1:159-164)、エストロゲンベースの誘導系(Braselmann, S. et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1657-1661)、ＧＡＬ４結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルス転写活性化ドメインであるＶＰ１６およびリガンドを結合する能力を保持し、かつＲＵ４８６により作動され得るヒトプロゲステロン受容体の切断形態から構成されるハイブリッドタンパク質であるキメラ調節物質ＧＬＶＰを用いたプロゲステロンベースの誘導系(Wang, et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8180-8184)、ラパマイシンが細胞タンパク質ＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰの二量化を誘導する系のような、遺伝子発現を調節するのに二量化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を用いたＣＩＤベースの誘導系(Belshaw, P.J.
et al. 1996. J. Chem. Biol. 3:731-738; Fan, L. et al. 1999. Hum. Gene Ther. 10:2273-2285; Shariat, S.F. et al. 2001. Cancer Res. 61: 2562-2571; Spencer, D.M. 1996. Curr. Biol. 6:839-847)が挙げられる。化学的誘導性プロモーターを活性化する化学物質を、当業者に既知の任意の方法により、所定の導入遺伝子を含有する動物に投与することができる。
細胞または組織特異的な構成性プロモーターの他の例としては、キメラＳＭ２２α／テロキンプロモーターを含む平滑筋ＳＭ２２プロモーター(Hoggatt A. M. et al., 2002. Circ Res. 91(12):1151-9)、ユビキチンＣプロモーター(Biochim Biophys Acta, 2003. Jan. 3;1625(1):52-63)、Ｈｓｆ２プロモーター、マウスＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）プロモーター、初期Ｂ細胞特異的ｍｂ−１プロモーター(Sigvardsson
M., et al., 2002. Mol. Cell Biol. 22(24): 8539-51)、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター(Yoshimura I. et al., 2002, J. Urol. 168 (6): 2659-64)、エクソロドプシン（ｅｘｏｒｈ）プロモーターおよび松果体発現促進要素（pineal expression-promoting element）(Asaoka Y., et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99(24):15456-61)、神経および肝臓セラミダーゼ遺伝子プロモーター(Okino N. et al., 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299(1):160-6)、ＰＳＰ９４遺伝子プロモーター／エンハンサー(Gabril M.Y. et al., 2002. Gene Ther. 9(23): 1589-99)、ヒトＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子のプロモーター(Kuriki C., et al., 2002. Biol. Pharm. Bull. 25(11):1476-8)、ＶＬ３０プロモーター(Staplin W.R. et al., 2002. Blood October 24, 2002)、ＩＬ−１０プロモーター(Brenner S., et al., 2002. J. Biol. Chem. December 18, 2002)が挙げられるが、これらに限定されない。
鳥類プロモーターの例としては、オボアルブミン、オボトランスフェリン（コンアルブミン）、オボムコイド、リゾチーム、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボタンパク質、オボスタチン（オボマクログロブリン）、シスタチン、アビジン、チアミン結合タンパク質、グルタミルアミノペプチダーゼ微量糖タンパク質１、微量糖タンパク質２のような卵白タンパク質の発現を制御するプロモーター、およびビテロゲニン、超低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、コバラミン結合タンパク質、リボフラビン結合タンパク質、ビオチン結合タンパク質のような卵黄タンパク質の発現を制御するプロモーター(Awade, 1996. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 202:1-14)が挙げられるが、これらに限定されない。ビテロゲニンプロモーターを使用することの利点は、ビテロゲニンプロモーターが、動物のライフサイクルの卵生段階中に活性であり、所定のタンパク質が適切な標的配列を備えると、所定のタンパク質の産生を、卵黄への所定のタンパク質への移入に一時的に関連させることが可能になることである。
本発明の肝臓特異的プロモーターとしては、以下のプロモーター：ビテロゲニンプロモーター、Ｇ６Ｐプロモーター、コレステロール−７−α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ）プロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）プロモーター、プロテインＣ遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）プロモーター、ビリルビンＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼプロモーター、アルドラーゼＢプロモーター、フューリンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アルブミンプロモーター、およびインスリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
また、βラクトグロブリンプロモーター、乳清酸性タンパク質プロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、およびカゼインプロモーターを含むが、これらに限定されない、産乳動物のミルク中へ所定のタンパク質の発現を目的とするのに使用することができるプロモーターも本発明に包含される。
免疫系の細胞に関連したプロモーターもまた使用され得る。インターロイキン（ＩＬ）−１およびＩＬ−２のような急性期プロモーターを使用してもよい。重鎖および軽鎖Ｉｇのプロモーターもまた使用され得る。Ｔ細胞受容体成分ＣＤ４およびＣＤ８のプロモーター、Ｂ細胞プロモーターおよびＣＲ２（補体受容体２型）プロモーターもまた使用され得る。免疫系プロモーターは、所望のタンパク質が抗体タンパク質である場合に好ましく使用される。
単一プロモーターの要素が重複、改変、あるいはそうでなければ変更されている改変プロモーター／エンハンサーもまた、本発明に包含される。一実施形態では、オボアルブミンプロモーターのステロイドホルモン結合ドメインは、約６．５ｋｂ付近から、おおよそ所定の遺伝子の最初の１０００個の塩基対内に移動される。既存のプロモーターを、プロモーター中に天然には見出されないプロモーター／エンハンサー要素で改変させること、ならびに完全な合成プロモーターを構築すること、あるいは非天然骨格上に一緒に様々な遺伝子からプロモーター／エンハンサー要素を引き出すことはすべて、本発明に包含される。
したがって、本発明のトランスポゾンベースのベクター内に含有されるプロモーターは、完全なプロモーター配列またはプロモーター配列の断片であってもよいことが理解されよう。例えば、一実施形態では、所定の遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターは、ニワトリのオボアルブミンプロモーターのおよそ９００塩基対断片（配列番号４０）である。トランスポゾンベースのベクター内に含有される構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターはまた、ＡＣＣＡＴＧの１つまたはそれ以上の改変コザック配列（配列番号１３）の付加により改変されてもよい。
上述のように、本発明は、１つまたはそれ以上のエンハンサーを含有するトランスポゾンベースのベクターを包含する。これらのエンハンサーは、それらの天然プロモーターに操作可能に連結されてもよく、あるいは連結されなくてもよく、またそれらの操作可能に連結されたプロモーターから任意の距離に位置されてもよい。エンハンサーに操作可能に連結されたプロモーターは、本明細書中では「エンハンスドプロモーター（enhanced promoter）」と称する。トランスポゾンベースのベクター内に含有されるエンハンサーは、好ましくは鳥に見出されるエンハンサー、より好ましくはオボアルビミンエンハンサーであるが、これらのタイプのエンハンサーに限定されない。一実施形態では、オボアルブミンプロモーターのおよそ６７５塩基対のエンハンサー要素は、エンハンサーとプロモーターを分離する３００塩基対のＤＮＡスペーサーとともに、オボアルブミンプロモーターの上流にクローニングされる。一実施形態では、本発明の一部として使用されるエンハンサーは、GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１由来のニワトリのオボアルブミンエンハンサーの塩基対１〜６７５を含む。このエンハンサーのポリヌクレオチド配列は、配列番号３７に提供される。
キャップ部位およびキャップ部位の断片もまた、本発明のトランスポゾンベースのベクターの幾つかに含まれる。一実施形態では、キャップ部位が存在するおよそ５０塩基対の５’非翻訳領域は、エンハンスドプロモーターまたはプロモーターの３’末端上に付加される。例示的な５’非翻訳領域は、配列番号３８に提供される。この５’非翻訳領域中に存在する推定上のキャップ部位は好ましくは、配列番号３９に提供されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態では、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結された第１のプロモーターは、構成性プロモーターであり、所定の遺伝子に操作可能に連結された第２のプロモーターは、組織特異的プロモーターである。この実施形態では、第１の構成性プロモーターの使用により、トランスポザーゼ遺伝子の構成的な活性化、および事実上すべての細胞型（レシピエント動物の生殖系列を含む）への所定の遺伝子の組み込みが可能となる。所定の遺伝子は概して生殖系列に組み込まれるが、所定の遺伝子は組織特異的様式でのみ発現される。本明細書中に記載される細胞または組織特異的発現は、好ましい細胞または組織以外の細胞または組織における発現の完全な欠如を要さないことに留意すべきである。代わりに、「細胞特異的」または「組織特異的」発現は、それぞれ好ましい細胞または組織における特定の所定の遺伝子の大部分の発現を指す。
生殖系列への所定の遺伝子の組み込みが好ましくない場合、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結された第１のプロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。例えば、Ｇ６Ｐプロモーターまたはビテロゲニンプロモーターのような肝臓特異的プロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターのトランスフェクションは概して、肝臓細胞におけるトランスポザーゼ遺伝子の活性化および所定の遺伝子の組み込みを提供するが、生殖系列および他の細胞への組み込みは提供しない。この第２の実施形態では、所定の遺伝子に操作可能に連結された第２のプロモーターは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。好ましい実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターはともに、Ｇ６Ｐプロモーターである。組織特異的発現または組み込みが望ましい実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、所定の組織に直接、あるいは所定の組織へとつながる動脈へ投与されることが好ましい。
したがって、細胞特異的プロモーターを用いて、選択した組織における転写を高めてもよい。鳥では、例えば、オボアルブミン、コンアルブミン、オボムコイドおよび／またはリゾチームのような、ファローピウス管(fallopian tube)の細胞に見出されるプロモーターは、ファローピウス管の上皮細胞および管状腺細胞における所定の遺伝子の転写を確実にして、遺伝子によりコードされる所望のタンパク質の合成および卵白への貯蔵を導くのにベクター中で使用される。哺乳類では、プロラクチン、インスリン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質、ラクトアルブミン、カゼインおよび／または胎盤ラクトゲンのような、乳腺の腺胞の上皮細胞に特異的プロモーターが、ミルク中への貯蔵のために、所望のタンパク質の産生のためのこれらの細胞のトランスフェクションに使用されるベクターの設計で使用される。肝臓細胞では、ＧＰ６プロモーターを用いて、タンパク質産生のために所定の遺伝子の転写を駆動してもよい。鳥の肝臓で作製されるタンパク質は、卵黄へと送達され得る。
トランスポザーゼ遺伝子のより高度なあるいはより効率的な発現を達成するために、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列は、宿主に由来するものであり得る。これらの宿主特異的調節配列は、上述のように組織特異的であってもよく、あるいは構成的性質であってもよい。例えば、鳥類アクチンプロモーターおよびその関連ポリＡ配列は、鳥類へのトランスフェクションのためにトランスポザーゼベースのベクターにおいてトランスポザーゼに操作可能に連結させることができる。トランスポザーゼに操作可能に連結することができる他の宿主特異的プロモーターの例としては、ミオシンプロモーターおよびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。
誘導性配列(directing sequences)
本発明の幾つかの実施形態では、所定の遺伝子は、誘導性配列、すなわち所定の遺伝子によりコードされる所望のタンパク質へ適正なコンホメーションを提供する配列に操作可能に連結される。本明細書中で使用する場合、「誘導性配列(egg directing sequence)」という用語は、シグナル配列、および標的配列の両方を指す。卵誘導性配列としては、オボムコイドシグナル配列、オボアルブミンシグナル配列、およびビテロゲニン標的配列が挙げられるが、これらに限定されない。「シグナル配列」という用語は、連結されているタンパク質を真核生物では小胞体へ、より好ましくは小胞体中の移行孔（translocational pores）へ、または原核生物では原形質膜へ、あるいは例えばミトコンドリア疾患の遺伝子療法の目的ではミトコンドリアへ誘導するアミノ酸配列、または該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。シグナル配列および標的配列は、トランスポゾンベースのベクターが産乳動物に投与される場合に、所望のタンパク質を例えばミルクへと誘導するのに使用することができる。
シグナル配列はまた、トランスポゾンベースのベクターが鳥または卵生動物に投与される場合に、所望のタンパク質を、例えば卵黄または卵白への組み込みに関する分泌経路へと誘導するのに使用することができる。かかるトランスポゾンベースのベクターの一例を図３に示し、ここでは所定の遺伝子は、オボムコイドシグナル配列に操作可能に連結された。本発明はまた、シグナル配列を含有する第２の遺伝子に操作可能に連結された所定の遺伝子を包含する。かかる実施形態の例を図２に示し、ここでは所定の遺伝子は、オボアルブミンシグナル配列を含有するオボアルブミン遺伝子に操作可能に連結される。トランスポゾンベースのベクターに含まれ得る他のシグナル配列としては、オボトランスフェリンおよびリゾチームシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。
また本明細書中で使用する場合、「標的配列」という用語は、細胞の外部上に位置する受容体により認識されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。標的配列への受容体の結合は、標的配列に操作可能に連結されたタンパク質またはペプチドの細胞による取り込みをもたらす。標的配列の一例は、卵母細胞の外部上のビテロゲニン受容体（または低密度リポタンパク質受容体）により認識されるビテロゲニン標的配列である。一実施形態では、ビテロゲニン標的配列は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ビテロゲニン標的配列は、ビテロゲニン遺伝子のすべてまたは一部を含む。他の標的配列としては、ＶＬＤＬおよびＡｐｏＥが挙げられ、これらもまた、ビテロゲニン受容体を結合することが可能である。ＡｐｏＥタンパク質は、鳥では内因的に発現されないため、その存在は、本発明のトランスポゾンベースのベクターを保有する鳥を同定するのに好適に使用され得る。
所望のタンパク質をコードする所定の遺伝子
安定した組み込みに関して選択された所定の遺伝子は、任意の所望のタンパク質またはペプチドをコードするように、あるいは任意の細胞応答を調節するように設計される。幾つかの実施形態では、所望のタンパク質またはペプチドは、卵中またはミルク中に貯蔵される。本発明は、複数の所定の遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを包含することが理解されよう。複数の所定の遺伝子はそれぞれ、別個のプロモーターおよび他の調節配列（複数可）に操作可能に連結されてもよく、あるいはすべて同じプロモーターおよび他の調節配列（複数可）に操作可能に連結されてもよい。一実施形態では、複数の所定の遺伝子は、単一のプロモーターおよび他の調節配列（複数可）に連結され、所定の遺伝子はそれぞれ、切断部位またはシグナル配列のプロ部分により分離される。
タンパク質およびペプチドホルモンは、本発明において好ましい種類のタンパク質である。かかるタンパク質およびペプチドホルモンは、内分泌系全体にわたって合成され、視床下部ホルモンおよび下垂体刺激ホルモン、下垂体前葉ホルモン、下垂体中葉ホルモンおよび下垂体後葉ホルモン、膵島ホルモン、胃腸系で作製されるホルモン、腎臓ホルモン、胸腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモンおよび副腎髄質ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、本発明を使用して産生することができるホルモンとしては、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、エリスロポイエチン、グルカゴン、ＩＧＦ−１、オキシトシン、血小板由来成長因子、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン、黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、ゴナドトロピン放出ホルモンおよびそのアナログ、バソプレシン、オクトレオチド、ソマトスタチン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ドパミン、メラトニン、サイロキシン（Ｔ4）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルココルチコイド（例えば、コルチソル）、ミネラルコルチコイド（例えば、アルドステロン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、アドレナリン（エピネフリン）、ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）、エストロゲン（例えば、エストラジオール）、プロゲステロン、グルカゴン、カルシトリオール、カルシ
フェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ3-36、アンジオテンシノゲン、トロンボポイエチンおよびレプチンが挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリヌクレオチド配列を使用することにより、種特異的ホルモンが、トランスジェニック動物により作製され得る。
本発明の一実施形態では、所定の遺伝子は、プロインスリン遺伝子であり、所望の分子は、インスリンである。プロインスリンは、３つの部分：Ｃ−ペプチドおよび２つのアミノ酸の長鎖（α鎖およびβ鎖と呼ばれる）（これらは後に一緒に連結されるようになり、インスリン分子を形成する）から構成される。図２および図３は、それぞれオボアルブミンプロモーターおよびオボアルブミンタンパク質またはオボムコイドプロモーターおよびオボムコイドシグナル配列に操作可能に連結されたプロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクター構築物の略図である。これらの実施形態では、プロインスリンは、卵管管状腺細胞で発現された後、卵白中に貯蔵される。プロインスリンポリヌクレオチド配列の一例は、配列番号２１に示され、ここではＣ−ペプチド切断部位は、位置３１にあるＡｒｇから位置６５にあるＡｒｇまで及ぶ。
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＨＤＬ−Ｍｉｌａｎｏおよび低密度リポタンパク質のようなリポタンパク質、アルブミン、凝固カスケード因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フィブリノゲンならびにグロブリンを含む血清タンパク質もまた、本発明の所望のタンパク質群に包含される。免疫グロブリンは、所望のグロブリン分子の一種であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、λ鎖、κ鎖およびそれらの断片、Ｆｃ断片、およびＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。所望の抗体としては、天然に存在する抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびハイブリッド抗体が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在する抗体またはそれらの断片の改変型をコードする遺伝子、および人工的に設計された抗体またはそれらの断片をコードする遺伝子は、本発明のトランスポゾンベースのベクターに組み込まれてもよい。所望の抗体にはまた、特定のリガンドを結合する能力を有する抗体、例えば癌関連分子に関連したタンパク質に対する抗体（例えば、抗ｈｅｒ２、または抗ＣＡ１２５）も含まれる。したがって、本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖およびＩｇ軽鎖をコードする１個またはそれ以上の遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを包含する。さらに、１個よりも多い抗体をコードする１個よりも多い遺伝子は、本発明の１個またはそれ以上のトランスポゾンベースのベクターに投与され得る。この様式では、卵は、卵白、卵黄またはその両方中に、１個より多いタイプの抗体を含有し得る。
一実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、ともにプロモーターに操作可能に連結されたＩｇ重鎖およびＩｇ軽鎖を含有する。図５および図６は、この実施形態の例示的構築物を図式的に表す。より具体的には、図５は、セクロピンプレプロ配列およびセクロピンプロ配列を含有する構築物を示し、ここではプレ配列は、生じたタンパク質を小胞体へ誘導するように機能し、プロ配列は、構築物がトランスフェクトされた細胞からのタンパク質の分泌時に切断される。図６は、エンテロキナーゼ切断部位を含有する構築物を示す。この実施形態では、エンテロキナーゼにより切断後に、軽鎖からの幾つかのさらなるアミノ酸をさらに除去することが必要であり得る。別の実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、あるプロモーターに操作可能に連結された重Ｉｇ鎖、および別のプロモーターに操作可能に連結された軽Ｉｇ鎖を含む、図７は、この実施形態の例示的構築物を図式的に表す。本発明はまた、重Ｉｇ鎖の一部および／または軽Ｉｇ鎖の一部をコードする遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを包含する。本発明はさらに、重Ｉｇ鎖および／または軽Ｉｇ鎖、またはそれらの一部を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを包含する。
治療用試薬として使用される抗体としては、特定の抗原に対する癌免疫療法で使用するための抗体、または感染疾患または有毒な作用物質に対して動物またはヒトへ受動免疫性を提供するための抗体が挙げられるが、これらに限定されない。診断用試薬として使用される抗体としては、標識され、かつ検出器で検出され得る抗体、例えば特定の波長に暴露した後に検出され得る蛍光標識に結合されている抗体が挙げられるが、これらに限定されない。かかる標識抗体は、特定の抗原に対して誘導される一次抗体、例えばローダミン標識ウサギ抗成長ホルモンであり得、または標識二次抗体、例えばフルオレセイン標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ等であり得る。かかる標識抗体は、当業者に既知である。抗体に結合するのに有用な標識もまた、当業者に既知である。これらの標識の幾つかは、「Handbook of Fluorescent Probes and Research Products」、第９版、Richard P. Haugland (ed) Molecular Probes, Inc. Eugene, OR（これは、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。
本発明を使用することにより産生される抗体は、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、イムノアフィニティカラムおよび当業者に既知であるような抗体を必要とする他の手法を含む数多くの用途のための実験試薬として使用され得る。かかる抗体としては、一次抗体、二次抗体および三次抗体が挙げられ、これらは標識されても標識されなくてもよい。
本発明の実施により作製され得る抗体としては、一次抗体、二次抗体、デザイナー抗体、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＡ抗体、抗ホルモン抗体、抗下垂体刺激ペプチド、非天然抗原に対する抗体、抗下垂体前葉ホルモン抗体、抗下垂体後葉ホルモン抗体、抗毒物抗体、抗腫瘍マーカー抗体、感染疾患に関連するエピトープに対して誘導される抗体（抗ウイルス、抗細菌、抗原虫、抗真菌薬、抗寄生虫、抗受容体、抗脂質、抗リン脂質、抗成長因子、抗サイトカイン、抗モノカイン、抗イディオタイプおよび抗アクセサリー（提示）タンパク質抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明、ならびに軽鎖または重鎖を用いて作製される抗体はまた、酵素活性を阻害するのに使用され得る。
本発明を用いて産生され得る抗体としては、以下のタンパク質に対して作製される抗体が挙げられるが、これらに限定されない：ウシγ−グロブリン（血清）；ウシＩｇＧ（血漿）；ニワトリγ−グロブリン（血清）；ヒトγ−グロブリン（血清）；ヒトＩｇＡ（血漿）；ヒトＩｇＡ1（骨髄腫）；ヒトＩｇＡ2（骨髄腫）；ヒトＩｇＡ2（血漿）；ヒトＩｇＤ（血漿）；ヒトＩｇＥ（骨髄腫）；ヒトＩｇＧ（血漿）；ヒトＩｇＧ、Ｆａｂ断片（血漿）；ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2断片（血漿）；ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片（血漿）；ヒトＩｇＧ1（骨髄腫）；ヒトＩｇＧ2（骨髄腫）；ヒトＩｇＧ3（骨髄腫）；ヒトＩｇＧ4（骨髄腫）；ヒトＩｇＭ（骨髄腫）；ヒトＩｇＭ（血漿）；ヒト免疫グロブリン、軽鎖κ（尿）；ヒト免疫グロブリン、軽鎖κおよびλ（血漿）；マウスγ−グロブリン（血清）；マウスＩｇＧ（血清）；マウスＩｇＭ（骨髄腫）；ウサギγ−グロブリン（血清）；ウサギＩｇＧ（血漿）およびラットγ−グロブリン（血清）。一実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、ヒトセミノプロテインに関して特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のコード配列（軽鎖および重鎖に関して、それぞれGenBank受託番号ＡＹ１２９００６およびＡＹ１２９３０４）を含む。
他の抗体を認識する抗体のさらなる非限定性のリストは、以下の通りである：抗ニワトリＩｇＧ、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖特異的（ヒツジ）；抗ヤギγ−グロブリン（ロバ）；抗ヤギＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（ウサギ）；抗モルモットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ヒトＩｇ、軽鎖、κ型特異的；抗ヒトＩｇ、軽鎖、λ型特異的；抗ヒトＩｇＡ、α鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＡ、Ｆａｂ断片特異的；抗ヒトＩｇＡ、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＡ、分泌性；抗ヒトＩｇＥ、ε鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＥ、Ｆｃ断片特異的
；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄ断片特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ1、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｄ断片特異的；抗ヒトＩｇＧ3、ヒンジ特異的；抗ヒトＩｇＧ4、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＭ、Ｆｃ断片特異的；抗ヒトＩｇＭ、μ鎖特異的；抗マウスＩｇＥ、ε鎖特異的；抗マウスγ−グロブリン（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）Ｆ（ａｂ’）2断片；抗マウスＩｇＧ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、μ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的（ヤギ）；抗ウサギγ−グロブリン（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的（ヤギ）、抗ラットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ラットＩｇＧ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的；抗アカゲザルγ−グロブリン（ヤギ）および抗ヒツジＩｇＧ、Ｈ＆Ｌ鎖特異的。
本発明を使用して産生され得る抗体の別の非限定性のリストは、Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard, Belmont, CA)、Peninsula
Labs San Carlos CA, SIGMA(St.Louis, MO www. sigma-aldrich.com)、Cappel ICN(Irvine, California, www.icnbiomed.com)、およびCalbiochem(La Jolla, California, www.calbiochem.com)のような会社の製品カタログ（これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）において提供される。これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献から、特許から、およびGenBankのようなデータベースから入手され得る。あるいは、当業者は、所望の抗体において各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、ゲノムに組み込まれるようにポリヌクレオチド配列を設計してもよい。本発明のトランスジェニック動物により作製される抗体は、治療用試薬として（例えば特定の抗原に対する癌免疫療法において）、診断用試薬として、また免疫中和、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降およびイムノアフィニティカラムを含む数多くの用途のための実験試薬として使用され得る抗体を包含する。これらの抗体の幾つかとして、以下のリガンドを結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない：アドレノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃抑制ペプチド、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、神経ペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロフィン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管作用性腸ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、トランスフォーミング成長因子、血管内皮成長因子、小胞性モノアミントランスポーター、小胞性アセチルコリントランスポーター、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体化ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、β−リポトロピン、メラトニン、カリクレイン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポイエチン、ｐ１４６（配列番号１８アミノ酸配列、配列番号１９ヌクレオチド配列）、エストロゲン、テストステロン、コルチコステロイド、ミネラルコルチコイド、甲状腺ホルモン、胸腺ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグリン、アルブミン、ならびにそれらのプロホルモン、プロペプチド、スプライスバリアント、断片およびアナログ。
以下に記載するのは、本発明の方法により産生することができるさらに別の非限定性の抗体である：アブシキシマブ(abciximab)（ＲｅｏＰｒｏ）、アブシキシマブ抗血小板凝集モノクローナル抗体、抗ＣＤ１１ａ（ｈｕ１１２４）、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗体、抗ジゴキシン抗体、抗Ｂ型肝炎抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ−２Ｒ抗体、抗転移性癌抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、抗狂犬病抗体、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗Ｒｈ抗体、抗ＴＣＲ、抗ＴＮＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体およびそのｆａｂ断片、ガラガラヘビ(rattlesnake venom)毒抗体、クロゴケグモ毒抗体、サンゴヘビ毒抗体、最晩期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対する抗体、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化抗体、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒトとマウス)抗体、ヒト血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対して誘導される抗体、ガンマグロブリン、抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン、ヒト抗Ｄ免疫グロブリン、黄色ブドウ球菌に対するヒト抗体、ヒト破傷風免疫グロブリン、上皮成長受容体−２に対するヒト化抗体、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化抗体、ヒト化抗体ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＩＬ−２ Ｒ α鎖に対するヒト化抗体、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、ラウス肉腫ウイルスに対するヒト化ｍＡｂ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するヒト化組換え抗体（ＩｇＧ１ｋ）、リンパ球免疫グロブリン（抗胸腺細胞抗体）、リンパ球免疫グロブリン、第ＶＩＩ因子に対するｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異的抗体、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異的抗体、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異的抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異的ヒト化抗体、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ関連）抗体、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７抗体（ＢＴＩ−３２２のヒト化形態）、モノクローナル抗体ＬＤＰ−０２、ムロモナブ(muromonab)−ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、ＯＫＴ３（「ムロモナブ−ＣＤ３」）抗体、ＰＲＯ５４２抗体、ＲｅｏＰｒｏ「アブシキシマブ」）抗体、およびＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質。
本発明の方法を用いて調製される抗体はまた、当業者に既知の手段により検出され得る特定の標識を保有するように設計してもよい。抗体はまた、当業者に既知の手段による精製に有用な特定の配列を保有するように設計してもよい。特定の抗原に結合するように設計された特殊抗体もまた、本発明のトランスポゾンベースのベクターを用いてトランスジェニック動物において作製され得る。
本発明のトランスポゾンベースのベクターを用いたモノクローナル抗体の産生は、様々な方法で達成することができる。一実施形態では、２つのベクター：モノクローナル抗体の軽鎖をコードするベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターが構築され得る。続いて、これらのベクターは、本明細書中に開示する方法により標的動物のゲノムに組み込まれ得る。代替的実施形態では、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードする配列は、単一のＤＮＡ構築物上に含まれてもよい。例えば、ヒトセミノプロテインに関して特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のコード配列は、本発明のトランスポゾンベースの構築物（軽鎖および重鎖に関して、それぞれGenBank受託番号ＡＹ１２９００６およびＡＹ１２９３０４）を用いて発現させることができる。
さらに、免疫系により合成されるタンパク質およびペプチド（胸腺、リンパ節、脾臓、および胃腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）系により合成されるものを含む）は、本発明に包含される。本発明のトランスポゾンベースのベクターを用いてトランスジェニック動物において作製することができる免疫系タンパク質およびペプチドタンパク質としては、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、α−インターフェロンＡ、α−インターフェロン１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１（Ｉ
Ｌ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に包含される他のサイトカインとしては、カルジオトロフィン、間質細胞由来因子、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、黒色腫成長刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、２、３α、３β、４および５が挙げられる。
ｐ１４６のような溶解性ペプチドもまた、本発明の所望の分子に包含される。一実施形態では、ｐ１４６ペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、配列番号２０のポリヌクレオチド配列を含むｐ１４６核酸を含むトランスポゾンベースのベクターを包含する。
酵素は、本発明のトランスポゾンベースのベクターの使用により作製され得る別の種類のタンパク質である。かかる酵素としては、アデノシンデアミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、ラクターゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、パンクレアチン、パパイン、ストレプトキナーゼＢ、サブチリシン、スーパーオキシドジスムターゼ、トロンビン、トリプシン、ウロキナーゼ、フィブリノリシン、グルコセレブロシダーゼおよびプラスミノゲン活性化因子が挙げられる、これらに限定されない。酵素が有害な影響を有し得る幾つかの実施形態では、機能性酵素の発現を防止するために、所定の酵素のカルボキシ末端に、付加的アミノ酸およびプロテアーゼ切断部位を付加する。続くプロテアーゼによる酵素の消化により、酵素の活性化をもたらす。
細胞外基質タンパク質は、本発明の使用により作製され得る一種の所望のタンパク質である。例としては、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ラミニンおよびフィブロネクチン、ならびにそれらのサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内タンパク質および構造タンパク質は、本発明における別の種類の所望のタンパク質である。
成長因子は、本発明の使用により作製されうる別の所望の種類のタンパク質であり、トランスフォーミング成長因子−α（「ＴＧＦ−α」）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ酸性イソ型１および２、ＦＧＦ塩基性型２、ならびにＦＧＦ４、８、９および１０を含む）、神経成長因子（ＮＧＦ）（ＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ、およびβＮＧＦ、ならびにニューロトロフィンを含む）、脳由来神経栄養性因子、軟骨由来因子、赤血球の産生の刺激用の成長因子、白血球の産生の刺激用の成長因子、骨成長因子（ＢＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、肝細胞成長因子、グリア神経栄養性成長因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦα、β、β１、β２、β３を含む）、骨格成長因子、骨基質由来成長因子、骨由来成長因子、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の使用により作製され得る別の所望の種類のタンパク質としては、レプチン、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、腫瘍壊死因子αおよびβ、ＥＮＢＲＥＬ、アンジオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、骨原性タンパク質−１、骨形成タンパク質２および７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、およびオステオカルシンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の使用により作製され得るペプチドおよびタンパク質の非限定性のリストは、Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard・Belmo
nt, CA)、Peninsula Labs San Carlos CA, SIGMA(St.Louis, MO www. sigma-aldrich.com)、Cappel ICN(Irvine, California, www.icnbiomed.com)、およびCalbiochem(La Jolla,
California, www.calbiochem.com)のような会社の製品カタログにおいて提供される。これらの所定のタンパク質およびペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献から、特許から、およびGenBankのようなデータベースから入手され得る。あるいは、当業者は、所望のタンパク質またはペプチドにおいて各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、ゲノムに組み込まれるようにポリヌクレオチド配列を設計してもよい。
本発明の使用により作製され得るこれらの所望のタンパク質またはペプチドの幾つかとしては、以下の：アドレノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃抑制ペプチド、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、神経ペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロフィン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管作用性腸ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、トランスフォーミング成長因子、血管内皮成長因子、小胞性モノアミントランスポーター、小胞性アセチルコリントランスポーター、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体化ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、β−リポトロピン、メラトニン、カリクレイン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポイエチン、ｐ１４６（配列番号１９、アミノ酸配列、配列番号２０、ヌクレオチド配列）、胸腺ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグリン、アルブミン、ならびにそれらのプロホルモン、プロペプチド、スプライスバリアント、断片およびアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のトランスジェニック動物により作製され得る他の所望のタンパク質としては、バシトラシン、ポリミキシンｂ、バンコマイシン、シクロスポリン、抗ＲＳＶ抗体、α−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、抗サイトメガロウイルス抗体、抗肝炎抗体、抗阻害因子血液凝固剤複合体、抗狂犬病抗体、抗Ｒｈ（Ｄ）抗体、アデノシンデアミナーゼ、抗ジゴキシン抗体、ガラガラヘビ抗蛇毒素（ガラガラヘビ毒抗体）、ゴケグモ抗蛇毒素（クロゴケグモ毒抗体）、サンゴヘビ抗蛇毒素（サンゴヘビ毒抗体）、アプロチニン、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、ジフテリア抗毒素、リンパ球免疫グロブリン（抗胸腺細胞抗体）、プロタミン、サイロトロピン、カプレオマイシン、α−ガラクトシダーゼ、グラミシジン、ストレプトキナーゼ、破傷風トキソイド、チロスリシン、ＩＧＦ−１、水痘ワクチンのタンパク質、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−２ｒ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＯＫＴ３（「ムロモナブ−ＣＤ３」）抗体、ＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲｅｏＰｒｐ（「アブシキシマブ」）抗体、ＡＣＴＨ断片１−２４、デスモプレシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ヒストレリン、ロイプロリド、リプレシン、ナファレリン、血小板上のＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａを結合するペプチド（インテグリリン）、ゴセレリン、カプレオマイシン、コリスチン、抗呼吸器合胞体ウイルス、リンパ球免疫グロブリン（Ｔｈｙｍｏｇｌｏｖｉｎ、Atgam）、パノレックス、α−抗トリプシン、ボツリニン、肺界面活性剤タンパク質、腫瘍壊死受容体−ＩｇＧ融合タンパク質（エンブレル）、ゴナドレリン、インフルエンザワクチン
のタンパク質、ロタウイルスワクチンのタンパク質、ヘモフィルスｂ複合ワクチンのタンパク質、ポリオウイルスワクチンのタンパク質、肺炎球菌複合ワクチンのタンパク質、髄膜炎菌Ｃワクチンのタンパク質、インフルエンザワクチンのタンパク質、巨核球成長および発達因子（ＭＧＤＦ）、ニューロイムノフィリンリガンド−Ａ（ＮＩＬ−Ａ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞系由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、レプシン（天然）、レプシンＢ、レプシンＣ、ＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１ＲＡ）、Ｒ−５６８、新規赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、ラウス肉腫ウイルスに対するヒト化ｍＡｂ（ＭＥＤＩ−４９３）、グルタミル−トリプトファンジペプチドＩＭ８６２、ＬＦＡ−３ＴＩＰ免疫抑制剤、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、ゲルソニン酵素、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、髄膜炎Ｂワクチンのタンパク質、抗転移性癌抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒトとマウス)ｍＡｂ、第ＶＩＩ因子に対するｍＡｂ、リラキシン、カプレオマイシン、グリコペプチド（ＬＹ３３３３２８）、組換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、アルテパーゼ、抗ＣＤ２０抗原、Ｃ２Ｂ８抗体、インスリン様成長因子−１、心房性ナトリウム利尿ペプチド（anaritide）、テネクタプラーゼ、抗ＣＤ１１ａ抗体（ｈｕ １１２４）、抗ＣＤ１８抗体、ｍＡｂ ＬＤＰ−０２、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ Ａｂのｆａｂ断片、ＡＰＯ２リガンド（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド）、ｒＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子−β）、α−抗トリプシン、アナナイン（パイナップル酵素）、ヒト化ｍＡｂ ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＰＲＯ ５４２（ｍＡｂ）、Ｄ２Ｅ７（ｍＡｂ）、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｌ−ガラクトシダーゼ（ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＨＩＶワクチンのタンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチドワクチン、ＴＣＲペプチド、Ｖβ３およびＶβ１３．１.（ＩＲ５０２）、（ＩＲ５０１）、最晩期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対するＢＩ
１０５０／１２７２ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化ｍＡｂ、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、Ｈ．ピロリ(H. pylori)に対する抗菌ペプチド、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異的ヒト化ｍＡｂ、抗サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｍｅｄｉ−４９１ Ｂ１９パルボウイルスワクチン、呼吸器合胞対ウイルス（ＲＳＶ）に対するヒト化組換えｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）、尿路感染ワクチン（大腸菌株上の「線毛」に対する）、ライム病菌(B. burgdorferi)タンパク質（ＤｂｐＡ）に対するライム病ワクチンのタンパク質、Ｍｅｄｉ−５０１ヒトパピローマウイルス−１１ワクチン（ＨＰＶ）のタンパク質、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)ワクチン、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７ｍＡｂ（ＢＴＩ−３３２のヒト化形態）、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３ｍＡｂ、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ関連）ｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異的ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異的ｍＡｂ、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異的ｍＡｂ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（モルグラモスチム）、ＩＬ−２ Ｒ α鎖に対するヒト化ｍＡｂ（バシリキシマブ）、ＩｇＥに対するｍＡｂ（ＩＧＥ ０２５Ａ）、ミエリン塩基性タンパク質改質ペプチド（ＭＳＰ７７１Ａ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化ｍＡｂ、低分子量ヘパリン、抗血友病因子、および殺菌性／透過性増加タンパク質（ｒ−ＢＰＩ）が挙げられる。
本発明を用いて作製されるペプチドおよびタンパク質は、当業者に既知の標識および技法を使用して標識されてもよい。これらの標識の幾つかは、「Handbook of Fluorescent Probes and Research Products」、第９版(Richard P. Haugland (ed) Moleuclar Probes, Inc. Eugene, OR)（これは、その全体が本明細書中に援用される）に記載される。これらの標識の幾つかは、選択したタンパク質またはペプチドの発現用のポリヌクレオチド配列に遺伝子操作してもよい。ペプチドおよびタンパク質はまた、別の状況では標識するのが困難であるか、または不可能であるタンパク質の標識を可能とするように組み込まれる
標識組み込み「ハンドル」を有してもよい。
さまざまな種類の所望のペプチドおよびタンパク質、ならびにこの節に記載される特定のペプチドおよびタンパク質は、所望のアミノ酸置換用の選択コドンを、トランスジェニック動物に組み込まれた遺伝子に挿入することにより、以下に記載するように改変してもよいことが理解されよう。
本発明はまた、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＨＤＬ−Ｍｉｌａｎｏ、および低密度リポタンパク質、脂質、炭水化物、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムを含むが、これらに限定されない、タンパク質およびペプチド以外の所望の分子を産生するのに使用してもよい。これらの実施形態では、所定の遺伝子は、所望の分子の産生を誘導する核酸分子またはタンパク質をコードする。
本発明はさらに、内因性（すなわち、非ベクター）タンパク質産生を阻害するための阻害分子の使用を包含する。これらの阻害分子としては、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよび阻害タンパク質が挙げられる。一実施形態では、転写時に二重鎖ＲＮＡ分子を形成するオボアルブミンＤＮＡ配列を含有するトランスポゾンベースのベクターは、鳥のような動物にトランスフェクトされ、鳥の内因性オボアルブミンタンパク質の産生は、干渉ＲＮＡメカニズム（ＲＮＡｉ）により減少される。さらに、内因性タンパク質の誘導ノックアウトまたはノックダウンを創出して、内因性タンパク質産生の減少または阻害を達成してもよい。
所望のタンパク質およびペプチドの改変
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、あるアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と別のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間での縮合反応により形成されるペプチド結合によりα炭素が結合されるアミノ酸（通常Ｌアミノ酸）鎖である。鎖の一方の末端にある末端アミノ酸（すなわち、アミノ末端）は、遊離のアミノ基を有する一方で、鎖の他方の末端（すなわち、カルボキシ末端）にある末端アミノ酸は、遊離のカルボキシル基を有する。したがって、「アミノ末端」（Ｎ−末端と略記）という用語は、タンパク質のアミノ末端にあるアミノ酸上の遊離α−アミノ基、またはタンパク質内の任意の他の位置にあるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与する場合はイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」（Ｃ−末端と略記）という用語は、タンパク質のカルボキシ末端にあるアミノ酸上の遊離カルボキシル基、あるいはタンパク質内の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指す。
通常、タンパク質を構成するアミノ酸は、アミノ末端から開始して、タンパク質のカルボキシ末端に向かう方向に増加させて、順次数えていく。したがって、あるアミノ酸が、別のアミノ酸に「つづく」といった場合、そのアミノ酸は、先のアミノ酸よりもタンパク質のカルボキシ末端に近いほうに配置する。
「残基」という用語は、本明細書中では、アミド結合によりタンパク質に組み込まれるアミノ酸（ＤまたはＬ）あるいはアミノ酸擬似体を指すのに使用される。したがって、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、あるいは別に限定されない限りは、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する天然アミノ酸の既知のアナログ（すなわち、アミノ酸類似体）を包含し得る。さらに、アミド結合擬似体は、当業者に既知のペプチド骨格改変を包含する。
さらに、当業者は、上述のように、コード配列における単一アミノ酸または低比率のアミノ酸（典型的には約５％未満、より典型的には約１％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、保存的に改変された変化であり、ここでは変更が化学
的に類似のアミノ酸を有するアミノ酸の置換をもたらすことを理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に既知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
保存的置換は、置換性アミノ酸（天然に存在するか、または改変されたもの）が、置換されるアミノ酸に構造的に関連している、すなわち、置換されるアミノ酸とほぼ同じサイズおよび電子特性を有する置換である。したがって、置換するアミノ酸は、もとのアミノ酸と同じか、または類似した官能基を側鎖中に有する。「保存的置換」はまた、側鎖中の官能基が適切な保護基で保護されていること以外は、置換されるアミノ酸に同一である置換性アミノ酸を利用することを指す。
適切な保護基は、Green and Wuts, 「Protecting Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991（この教示は、参照により本明細書に援用される）に記載されている。好ましい保護基は、例えばペプチドの疎水性を減少させ、かつ親油性を増加させることにより、膜を通ってのペプチドの輸送を促進するもの、および加水分解により、あるいは酵素的に切断されるものである(Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57:783; Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57:828; Ditter et al., 1969. J. Pharm. Sci. 58:557; King et al., 1987. Biochemistry 26:2294; Lindberg et al., 1989. Drug Metabolism and Disposition 17:311; Tunek et al., 1988. Biochem. Pharm. 37:3867; Anderson et al., 1985 Arch. Biochem. Biophys. 239:538; およびSinghal et al., 1987. FASEB J. 1:220)。適切なヒドロキシル保護基としては、エステル、カーボネートおよびカルバメート保護基が挙げられる。適切なアミン保護基としては、Ｎ末端保護基に関して上述するように、アシル基およびアルコキシまたはアリールオキシカルボニル基が挙げられる。適切なカルボン酸保護基としては、Ｃ末端保護基に関して以下に記載するように、脂肪族エステル、ベンジルエステルおよびアリールエステルが挙げられる。一実施形態では、本発明のペプチドにおける１個またはそれ以上のグルタミン酸あるいはアスパラギン酸残基の側鎖中のカルボン酸基は、好ましくはメチル、エチル、ベンジルまたは置換ベンジルエステルとして、より好ましくはベンジルエステルとして保護される。
天然に存在するアミノ酸および改変アミノ酸の群を以下に提供し、ここでは群中のアミノ酸それぞれが、類似した電子特性および立体特性を有する。したがって、アミノ酸を、同じ群からの別のアミノ酸で置換することにより、保存的置換がなされ得る。これらの基は、非限定性であり、すなわち各群中に包含され得るさらなる改変アミノ酸が存在することが理解されよう。
群Ｉは、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、および以下の側鎖：エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルを有する改変アミノ酸を包含する。好ましくは、群Ｉは、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンを包含する。
群ＩＩは、グリシン、アラニン、バリン、およびエチル側鎖を有する改変アミノ酸を包含する。好ましくは、群ＩＩは、グリシンおよびアラニンを包含する。
群ＩＩＩは、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シク
ロヘキシルメチルグリシン、および置換ベンジルまたはフェニル側鎖を有する改変アミノ残基を包含する。好ましい置換基として、以下の１個またはそれ以上が挙げられる：ハロゲン、メチル、エチル、ニトロ、−ＮＨ2、メトキシ、エトキシ、おおび−ＣＮ。好ましくは、群ＩＩＩは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを包含する。
群ＩＶは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステル、芳香族エステルあるいはベンジルエステル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロヘキシル、ベンジルまたは置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、−ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミンまたはアスパラギン（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ならびに側鎖−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨ、それらのエステル（置換または無置換の脂肪族エステル、芳香族エステルあるいはベンジルエステル）、それらのアミドおよびそれらの置換または無置換のＮアルキル化アミドを有する改変アミノ酸を包含する。好ましくは、群ＩＶは、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、ならびにグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチルおよびグルタミン酸ベンジル、グルタミンならびにアスパラギンを包含する。
群Ｖは、ヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリンおよび２−アミノ−４−グアニジノブタン酸、リシンのホモログ、アルギニンの同族体ならびにオルニチンの同族体を包含する。好ましくは、群Ｖは、ヒスチジン、リシン、アルギニンおよびオルニチンを包含する。アミノ酸の同族体は、側鎖において１個〜約３個の付加的メチレンユニットまたは差し引かれたメチレンユニットを含む。
群ＶＩは、セリン、スレオニン、システイン、および−ＯＨもしくは−ＳＨで置換されたＣ１〜Ｃ５の直鎖または分岐鎖アルキル側鎖を有する改変アミノ酸、例えば−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨまたは−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨＣＨ3を包含する。好ましくは、群ＶＩは、セリン、システインまたはスレオニンを包含する。
別の態様では、アミノ酸残基に適した置換として、「過酷な(severe)」置換が挙げられる。「過酷な置換」は、置換性アミノ酸（天然に存在するか、または改変されたもの）が、置換されるアミノ酸と比較して、有意に異なるサイズおよび／または電子特性を有する置換である。したがって、置換性アミノ酸の側鎖は、置換されるアミノ酸の側鎖よりも相当大きく（または小さく）あり得て、かつ／あるいは置換されるアミノ酸よりも有意に異なる電子特性を有する官能基を有し得る。このタイプの過酷な置換の例としては、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンによるアラニンの置換、イソロイシンによるグリシンの置換、Ｄアミノ酸による相当するＬアミノ酸の置換、あるいは−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ2）5−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−によるアスパラギン酸の置換が挙げられる。あるいは、官能基を側鎖に付加するか、側鎖から欠失させるか、あるいは別の官能基で交換してもよい。このタイプの過酷な置換の例としては、バリン、ロイシンまたはイソロイシンを付加すること、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖中のカルボン酸をアミンと交換すること、あるいはリシンまたはオルニチンの側鎖中のアミノ基を欠失させることが挙げられる。さらに別の代替物では、置換性アミノ酸の側鎖は、置換されるアミノ酸の官能基と有意に異なる立体特性および電子特性を有することができる。かかる改変の例としては、グリシンに代わるトリプトファン、アスパラギン酸に代わるリシン、およびセリンの側鎖に代わる−（ＣＨ2）4ＣＯＯＨが挙げられる。これらの例は、限定的であると意味されない。
別の実施形態では、例えば、２６アミノ酸長のペプチドの合成では、個々のアミノ酸は、以下の様式に従って置換され得る：
ＡＡ1は、セリン、グリシン、アラニン、システインまたはスレオニンであり、
ＡＡ2は、アラニン、スレオニン、グリシン、システインまたはセリンであり、
ＡＡ3は、バリン、アルギンン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリンまたは２−アミノ−４−グアニジノブタン酸であり、
ＡＡ4は、プロリン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、
ＡＡ5は、トリプトファン、アラニン、フェニルアラニン、チロシンまたはグリシンであり、
ＡＡ6は、セリン、グリシン、アラニン、システインまたはスレオニンであり、
ＡＡ7は、プロリン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、
ＡＡ8は、アラニン、スレオニン、グリシン、システインまたはセリンであり、
ＡＡ9は、アラニン、スレオニン、グリシン、システインまたはセリンであり、
ＡＡ10は、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、
ＡＡ11は、セリン、グリシン、アラニン、システインまたはスレオニンであり、
ＡＡ12は、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、
ＡＡ13は、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリンであり、
ＡＡ14は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステルあるいはアリールエステルであり、
ＡＡ15は、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリンまたは２−アミノ−４−グアニジノブタン酸であり、
ＡＡ16は、プロリン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、
ＡＡ17は、セリン、グリシン、アラニン、システインまたはスレオニンであり、
ＡＡ18は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステルあるいはアリールエステルであり、
ＡＡ19は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステルあるいはアリールエステルであり、
ＡＡ20は、バリン、アルギンン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリンまたは２−アミノ−４−グアニジノブタン酸であり、
ＡＡ21は、アラニン、スレオニン、グリシン、システインまたはセリンであり、
ＡＡ22は、アラニン、スレオニン、グリシン、システインまたはセリンであり、
ＡＡ23は、ヒスチジン、セリン、スレオニン、システイン、リシンまたはオルニチンであり、
ＡＡ24は、スレオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステルあるいはアリールエステルであり、
ＡＡ25は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、あるいはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の置換または無置換の脂肪族エステルあるいはアリールエステルであり、そして
ＡＡ26は、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、リシンまたはオルニチンである。
これらのアミノ酸置換は、上述の例における２６量体よりも長いまたは短いペプチドに対して、およびタンパク質に対して行ってもよいことが理解されよう。
本発明の一実施形態では、トランスポザーゼの最初の幾つかのＮ末端アミノ酸に関する
コドンは、相当するアミノ酸を変更させることなく、各コドンの三番目の塩基がアデニンまたはチミンに変更されるように改変される。所定の遺伝子の最初のＮ末端コドンのおよそ１個〜２０個、より好ましくは３個〜１５個、最も好ましくは４個〜１２個が、相当するアミノ酸を変更させることなく、各コドンの三番目の塩基がアデニンまたはチミンに変更されるように改変されることが好ましい。一実施形態では、所定の遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンがこの様式で改変される。
幾つかの所望のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドが、ゲノムに組み込まれるべき所定の遺伝子においてコードされる場合、タンパク質、タンパク質断片またはペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸から構成される、例えばペプチドのようなスペーサー分子により分離されてもよいことは当業者に理解されよう。概して、スペーサーは、所望のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドを一緒に結合するため、あるいはそれらの間のある最小距離または他の空間的関連性を保持するため以外の特定の生物活性を有さない。しかしながら、スペーサーの構成成分であるアミノ酸は、フォールディング、正味の電荷、または疎水性のような分子の何らかの特性に影響を及ぼすように選択してもよい。スペーサーはまた、精製ハンドル（purification handle）を有するヌクレオチド配列内に含有されてもよく、あるいはタンパク質分解性切断部位に隣接させてもよい。
かかるポリペプチドスペーサーは、約５個〜約４０個のアミノ酸残基を有してもよい。ポリペプチド中のスペーサーは独立して選択されるが、すべて同じであることが好ましい。スペーサーは、空間中での動きの柔軟性を可能にし、したがって、通常小さなアミノ酸、例えば、グリシン、セリン、プロリンまたはアラニンに富んでいる。好ましくは、ペプチドスペーサーは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％のグリシンまたはアラニンを含有する。さらに、ペプチドスペーサーは一般に、生物活性および抗原活性をほとんど有さないか、または全く有さない。好ましいスペーサーは、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）x（配列番号５）および（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）y（ここで、ｘは、約３〜約９の整数であり、ｙは、約１〜約８の整数である）である。適切なスペーサーの具体例としては、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）3
配列番号６ ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙ、
（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3
配列番号７ ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、
または（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）4
配列番号８ ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ
が挙げられる。
発現される組換えタンパク質の精製において有用であり得る残基の産生をコードするヌクレオチド配列もまた、ベクターに構築されてもよい。かかる配列は、当該技術分野で既知であり、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ由来のグルタチオン結合ドメイン、ポリリシン、ヘキサヒスチジンまたは他のカチオンアミノ酸、チオレドキシン、血球凝集素抗原およびマルトース結合タンパク質が挙げられる。
さらに、タンパク質またはペプチドがまた、タンパク質分解性切断に関するシグナルを創出する１個〜約６個のアミノ酸を包含することができるように、ヌクレオチド配列は、組み込まれるべき所定の遺伝子に挿入されてもよい。この様式では、遺伝子が、トランスジェニック動物において１個または以上の所定のペプチドまたはタンパク質を作製するように設計される場合、酵素により認識されるアミノ酸をコードする特定のヌクレオチド配列を遺伝子に組み込ませて、所望のペプチドまたはタンパク質、あるいはその両方への巨
大タンパク質配列またはペプチド配列の切断を促進してもよい。例えば、シグナル配列が、所定の遺伝子によりコードされるタンパク質またはペプチドから切断することができるように、タンパク質分解性切断部位をコードするヌクレオチドを所定の遺伝子の導入することができる。ｐＨ感受性または化学物質感受性を示す他のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もまた、ベクターに付加して、所定のペプチドまたはタンパク質からのシグナル配列の分離を促進してもよい。
本発明の一実施形態では、ＴＡＧ配列を所定の遺伝子に連結させる。ＴＡＧ配列は、３つの目的にかなう：１）単離されるべきペプチドまたはタンパク質の自由回転を可能とし、したがって天然タンパク質またはシグナル配列、すなわちビテロゲニンからの干渉は見られない、２）「精製ハンドル」を提供して、カラム精製を用いてタンパク質を単離する、および３）シグナル配列および精製配列から所望のタンパク質を取り出すための切断部位を含む。したがって、本明細書中で使用する場合、ＴＡＧ配列は、スペーサー配列、精製ハンドルおよび切断部位を含む。ＴＡＧタンパク質中のスペーサー配列は、配列番号２５に示す１個またはそれ以上の繰り返しを含有する。好ましいスペーサー配列は、配列番号２６に提供される配列を含む。精製ハンドルの一例は、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループである。例示的なｇｐ４１ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ配列番号２４および配列番号２３に提供される。しかしながら、ｇｐ４１の任意の抗原性領域を含む任意の抗原性領域が精製ハンドルとして使用され得ることが理解されるべきである。好ましい精製ハンドルは、非常に特異的な抗体を誘発するものである。さらに、切断部位は、当業者に既知の任意のタンパク質切断部位であってもよく、Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（配列番号９）を含むエンテロキナーゼ切断部位およびフューリン切断部位が挙げられる。ＴＡＧ配列を含有する構築物を図２および図３に示す。本発明の一実施形態では、ＴＡＧ配列は、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含む。
トランスポゾンベースのベクターを投与する方法
上述のトランスポゾンベースのベクターの他に、本発明はまた、トランスポゾンベースのベクターを動物に投与する方法、トランスジェニック動物を産生する方法であって、所定の遺伝子が動物の生殖系列に組み込まれる方法、およびトランスジェニック動物を産生する方法であって、所定の遺伝子が動物の生殖系列細胞以外の細胞に組み込まれる方法を包含する。本発明のトランスポゾンベースのベクターは、胎芽内、精巣内、卵管内、腹腔内、動脈内、静脈内、局所、経口、鼻および前核注射の投与方法、またはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない当業者に既知の任意の方法により動物に投与され得る。トランスポゾンベースのベクターはまた、臓器の内腔内に、臓器に、体腔に、脳脊髄液に、泌尿器系を通じて、あるいは任意の経路を通じて投与して、所望の細胞に到達させてもよい。
トランスポゾンベースのベクターは、血管により供給される細胞に分布されるべき血管系を通じて送達されてもよい。例えば、組成物は、卵巣に供給するか、またはファローピウス管に供給する動脈に配置されて、それらの組織中の細胞をトランスフェクトしてもよい。この様式では、卵胞をトランスフェクトして、生殖系列トランスジェニック動物を創出することができる。あるいは、卵管につながる動脈を通じて組成物を供給することは、好ましくは管状腺および上皮細胞をトランスフェクトする。このようなトランスフェクトされた細胞は、卵白中に貯蔵するための所望のタンパク質またはペプチドを製造することができる。門脈を通じての組成物の投与は、肝細胞の取り込みおよび形質導入を目的とする。尿道を通してのかつ膀胱への投与は、膀胱の移行上皮を標的とする。膣および頸を通じての投与は、子宮の管壁を標的とする。内胸動脈を通じての投与は、乳汁分泌性乳腺の分泌細胞をトランスフェクトして、ミルク中に所望のタンパク質またはペプチドを合成および分泌することといった所望の機能を実施する。
好ましい実施形態では、動物は、卵生動物、より好ましくは鳥類である。一実施形態では、およそ１〜５０μｇ、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは５〜１０μｇのトランスポゾンベースのベクターＤＮＡが鳥の卵管に投与される。最適範囲は、鳥の類型および鳥の成熟期の段階に応じる。本発明のトランスポゾンベースのベクターの卵管内投与は、卵管組織においてＰＣＲ陽性シグナルを生じるのに対して、血管内投与は、肝臓においてＰＣＲ陽性シグナルを生じる。他の実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、卵管または肝臓に供給する動脈に投与される。これらの投与方法はまた、エレクトロポレーション、遺伝子銃、裸のＤＮＡの注入、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用を含むがこれらに限定されない、トランスフェクションを促進する任意の方法と併用させてもよい。
本発明は、以下の工程：１）卵を横にして室温で２時間インキュベートする工程であって、それによりその中に含まれる胚を一番上の真ん中（ＴＤＣ）に移動させる、インキュベートする工程、２）下にある卵殻膜を浸透することなく卵殻に孔をあける工程、３）溶液中のトランスポゾンベースのベクターを胚に注入する工程、４）卵の孔を封入する工程、および５）孵化用の孵卵器に卵を入れる工程を含む、鳥類の胚へのトランスポゾンベースのベクターの胚芽内投与方法を包含する。トランスポゾンベースのベクターの投与は、産卵の直後（胚はＸ期である場合）と孵化との間のいつでも行うことができる。好ましくは、トランスポゾンベースのベクターは、産卵の１〜７日後、より好ましくは産卵の１〜２日後に投与される。トランスポゾンベースのベクターは、約５．０μｇ〜１０ｐｇ、好ましくは１．０μｇ〜１００ｐｇの範囲の量で胚に導入され得る。さらに、トランスポゾンベースのベクター溶液容積は、ウズラではおよそ１μｌ〜７５μｌ、またニワトリではおよそ１μｌ〜５００μｌであり得る。
本発明はまた、トランスポゾンベースのベクター、適切なキャリアおよび適切なトランスフェクション試薬を含む組成物を鳥に注射することを含む、トランスポゾンベースのベクターの精巣内投与方法を包含する。一実施形態では、鳥は、成熟期前、好ましくはおよそ４〜１４週齢、より好ましくはおよそ６〜１４週齢、最も好ましくは８〜１２週齢で注射される。別の実施形態では、成熟した鳥は、トランスポゾンベースのベクター、適切なキャリアおよび適切なトランスフェクション試薬を注射される。成熟した鳥は、任意の鳥の類型であってもよいが、一例では、成熟した鳥は、ウズラである。
鳥は、好ましくは血液精巣関門の発達前に注射され、それにより輸精管へのトランスポゾンベースのベクターの侵入および精原細胞または他の生殖系列細胞のトランスフェクションを促進する。４、６、８、１０、１２および１４週齢で、およびその間で、ニワトリの精巣は、トランスフェクションに対してより感受性に富む可能性が高いと考えられている。この週齢範囲では、血液／精巣関門はまだ形成されておらず、他の細胞型（例えば、精子細胞等）の数に対して比較的多数の精原細胞が存在する。J. Kumaran et al., 1949.
Poultry Sci., 29:511-520を参照されたい。同様に、E. Oakberg, 1956. Am. J. Anatomy, 99:507-515、およびP. Kluin et al., 1984 Anat. Embryol., 169:73-78も参照されたい。
トランスポゾンベースのベクターは、約０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは１μｇ〜１０μｇ、より好ましくは３μｇ〜１０μｇの範囲の量で精巣に導入され得る。ウズラでは、約５μｇが好ましい量である。ニワトリでは、精巣１つ当たり約５μｇ〜１０μｇが好ましい。ベクターＤＮＡのこれらの量は、一回用量または複数回用量で、および精巣における１つの部位または複数の部位にて注射されてもよい。好ましい実施形態では、ベクターＤＮＡは、単一の精巣において複数の部位で投与され、両方の精巣がこの様式で注射される。一実施形態では、注射は、３つの注射部位：精巣の両端での部位、および中央での
部位中に広がる：さらに、トランスポゾンベースのベクター溶液容積は、ウズラではおよそ１μｌ〜７５μｌ、およびニワトリではおよそ１μｌ〜５００μｌであり得る。好ましい実施形態では、トランスポゾンベースのベクター溶液容積は、ウズラではおよそ２０μｌ〜６０μｌ、およびニワトリではおよそ５０μｌ〜２５０μｌであり得る。精巣それぞれに注射されるベクターＤＮＡの量および総容積はともに、鳥の年齢および大きさに基づいて決定され得る。
本発明によれば、トランスポゾンベースのベクターは、許容可能なキャリアおよび／またはトランスフェクション試薬と併せて投与される。適切なキャリアとしては、水、生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）およびリオトロピック液晶が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る当業者に一般的に知られるトランスフェクション試薬としては、以下の：カチオン脂質トランスフェクション試薬、カチオン脂質混合物、ポリアミン試薬、リポソームおよびそれらの混合物；ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅ、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（登録商標）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）、およびパーフェクチン（Gene Therapy Systemsから）；リポフェクトアミン、セルフェクチン、ＤＭＲＩＥ−Ｃオリゴフェクトアミン、およびＰＬＵＳ試薬（InVitrogenから）；Ｘｔｒｅｍｅ遺伝子、ｆｕｇｅｎｅ、ＤＯＳＰＥＲおよびＤＯＴＡＰ（Rocheから）；ＬｉｐｏｔａｘｉおよびＧｅｎｅｊａｍｍｅｒ（Staratgeneから）；ならびにＥｓｃｏｒｔ（SIGMAから）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、トランスフェクション試薬は、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）である。ＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比は、投与方法に基づいて変化し得る。一実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、精巣内に投与され、ＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比は、１：１．５〜１：１５、好ましくは１：２〜１：１０（すべてｗｔ／ｖｏｌで表す）であり得る。トランスフェクションはまた、エレクトロポレーション、遺伝子銃、裸のＤＮＡの注入、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の他の手段を用いて達成させてもよい。
トランスフェクションに関して標的とする細胞または組織型に応じて、トランスポゾンベースのベクターの形態が重要であり得る。細菌から収集されるプラスミドは概して、閉環状のスーパーコイル型分子であり、これは、調製の簡易さのため、遺伝子送達にとって好ましい状態のベクターである。場合によっては、トランスポザーゼ発現および挿入は、弛緩状態の閉環状立体配置で、あるいは線状立体配置でより効率的である場合もある。さらに別の場合では、精製トランスポザーゼタンパク質は、より即時の挿入のために所定の遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターと同時注射してもよい。これは、精製トランスポザーゼタンパク質およびトランスポゾンベースのベクターの両方と複合体形成されるトランスフェクション試薬を用いることで達成させることができる。
導入遺伝子を保有する動物の試験および繁殖
トランスポゾンベースのベクターを動物に投与した後、動物からＤＮＡを抽出して、所定の遺伝子の組み込みを確認する。実際の組み込み頻度は、ＰＣＲシグナルの相対強度、および定量的ＰＣＲによる組織の組織学的評価の両方により推定される。導入遺伝子挿入の比率を推定する別の方法は、いわゆるプライムドｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成技法（ＰＲＩＮＳ）である。この方法は、どの細胞が所定の導入遺伝子を保有するかを決定するだけでなく、どの染色体に、さらには染色体のどの部分に遺伝子が挿入されたかも決定する。簡潔に述べると、ＰＣＲの第１ラウンドにより標識したプライマーを染色体スプレッド（スライドガラスに固定）とアニーリングして、続いて通常のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成手順によりスライドを発色させる。この技法は、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲと蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）の最良の形態を組み合わせて、問題となっている遺伝子の明瞭な染色体位置およびコピー数を提供する。２８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
は、精原細胞に関する陽性コントロールとして使用され、この技法が適正に機能しているかを確認する。導入遺伝子および２８ｓ遺伝子に関して異なる蛍光標識を使用することにより、導入遺伝子を含有する細胞を、２つの異なる着色タグで蛍光を発色させる。
繁殖実験もまた、導入遺伝子の生殖系列伝達が行われたかどうかを決定するのに行われる。本発明により実施される一般的な鳥繁殖実験では、雄鳥それぞれを、２〜３羽の異なる成体雌鳥に３〜４日毎に引き合わせた。この手順を、種々の雌を用いて、総計６〜１２週の期間続けた。トランスジェニック雄に最後に引き合わせた１４日後まで、毎日卵を収集して、卵それぞれを標準的な孵卵器中で孵化させた。実験の最初のシリーズでは、得られた胚を、３または４日目に、ＰＣＲを用いて、導入遺伝子の存在に関して検査した。
トランスジェニック胚を産生する任意の雄を、さらなる雌と繁殖させた。これらの雌からの卵をインキュべートして、孵化させて、ヒヨコを外因性ＤＮＡに関して試験した。死亡した任意の胚を検死して、導入遺伝子にまたは導入遺伝子によりコードされるタンパク質を、蛍光またはＰＣＲにより直接検査した。孵化させ、外因性ＤＮＡに関して陽性であることがわかった子孫を成熟させた。これらの鳥を繁殖させて、さらなる世代のトランスジェニック鳥を産生し、トランスジェニック手順および生殖系への導入遺伝子の安定した組み込みの効率を確証した。得られた胚を、３または４日目に、ＰＣＲを用いて、導入遺伝子の存在に関して検査した。
上述の手順は、鳥以外の動物に適するように変更させることができること、および選択した繁殖技法は、遺伝子コピー数およびタンパク質産出量を増幅させるように実施され得ることが理解されよう。
卵白中での所望のタンパク質またはペプチドの産生
一実施形態では、本発明のトランスポゾンベースのベクターは、卵白中での所望のタンパク質またはペプチドの産生のために鳥に投与されてもよい。これらのトランスポゾンベースのベクターは好ましくは、オボアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボアルブミンシグナル配列およびオボムコイドシグナル配列の１個またはそれ以上を含有する。卵管特異的オボアルブミンプロモーターは、B. O'Malley et al., 1987. EMBO
J., vol. 6, pp 2305-12、A. Oiu et al., 1994. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), vol. 91, pp. 4451-4455、D. Monroe et al., 2000. Biochim. Biophys. Acta, 1517 (1):27-32、H. Park et al., 2000. Biochem., 39:8537-8545、およびT. Muramatsu et al., 1996. Poult. Avian Biol. Rev., 6:107-123に記載されている。卵白中での所望のタンパク質の産生用に設計されたトランスポゾンベースのベクターの例を図２および図３に示す。
卵黄中での所望のタンパク質またはペプチドの産生
本発明は、卵黄での低溶解性の組換えペプチドおよびタンパク質の産生にとって特に好適である。かかるタンパク質としては、膜関連または膜結合タンパク質、親油性化合物、付着因子、受容体および第二メッセンジャー伝達機構の成分が挙げられるが、これらに限定されない。低溶解性ペプチドおよびタンパク質は、それらは水系の親水性環境中で凝集するため、従来の組換えタンパク質産生技法（細胞培養および組織培養）を使用して産生するには特に挑戦的である。かかる凝集は、組換え的に産生されるタンパク質の変性およびリフォールディングを必然的に伴い、それらの構造および機能に有害に影響を及ぼし得る。さらに、より一層高い溶解性の組換えペプチドおよびタンパク質は、組換えタンパク質産生系において十分多い量で産生されると、沈殿して、変性および再生を要し得る。本発明は、大量の組換えタンパク質の産生中でのタンパク質およびペプチド溶解性の問題の好適な解決を提供する。
本発明の一実施形態では、卵黄中への所望のタンパク質の貯蔵は、所望のタンパク質を
コードする所定の遺伝子に、卵黄ビテロゲニン受容体へ結合することが可能なタンパク質をコードする配列を結合させることにより達成される。このトランスポゾンベースのベクターは、卵母細胞による所望のタンパク質の受容体媒介性の取り込みに使用することが可能である。好ましい実施形態では、ビテロゲニン受容体への結合を確実にする配列は、ビテロゲニンタンパク質の標的配列である。本発明は、様々なビテロゲニンタンパク質、およびそれらの標的タンパク質を包含する。好ましい実施形態では、ニワトリビテロゲニンタンパク質標的配列が使用されるが、ビテロゲニンタンパク質配列間での高度の保存、およびビテロゲニン標的配列の、それらの卵黄受容体との既知の異種間の反応性に起因して、他のビテロゲニン標的配列で置き換えることができる。本発明のトランスポゾンベースのベクターにおいて使用するための、かつ卵黄中のインスリンタンパク質の貯蔵のための構築物の一例は、配列番号２７に提供される。この実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、ビテロゲニンプロモーター、ビテロゲニン標的配列、ＴＡＧ配列、プロインスリン配列および合成ポリＡ配列を含有する。本発明は、ビテロゲニンのＮ末端ドメインに特にリポビテリンＩ中の存在するビテロゲニン標的配列を含むが、これに限定されない。一実施形態では、ビテロゲニン標的配列は、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含有する。
好ましい実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、肝臓特異的プロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子、ならびに肝臓特異的プロモーターおよびビテロゲニン標的配列に操作可能に連結された所定の遺伝子を含有する。図４は、かかる構築物の例を示す。別の好ましい実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、構成性プロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子、ならびに肝臓特異的プロモーターおよびビテロゲニン標的配列に操作可能に連結された所定の遺伝子を含有する。
所望のタンパク質またはペプチドの単離および精製
タンパク質の大規模の産生のために、導入遺伝子に関してホモ接合性である動物繁殖ストックが好ましい。かかるホモ接合性個体は、例えば標準的な動物繁殖手順またはＰＣＲプロトコルにより得られ、かつ同定される。
いったん発現されれば、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィ、免疫沈降等を含む当業者に既知の標準的な手順に従って精製することができる。治療薬として使用するためには、約５０〜９９％の均一性を有する実質的に純粋な組成物が好ましく、８０〜９５％以上の均一性が最も好ましい。
本発明の一実施形態では、所望のタンパク質が産生される動物は、卵生動物である。本発明の好ましい実施形態では、動物は鳥類であり、所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、卵白から単離される。外因性タンパク質またはペプチドを含有する卵白は、卵産業で既知の各種方法のいずれかにより、工業スケールで、卵黄および他の卵構成成分から分離される。例えば、W. Stadelman et al. (Eds.), Egg Science & Technology, Haworth Press, Binghamton, NY (1995)を参照されたい。他の卵白構成成分からの外因性ペプチドまたはタンパク質の単離は、当業者に既知の多数のポリペプチド単離および精製方法のいずれかにより達成される。これらの技法としては、例えば、ゲル浸透、イオン交換、アフィニティ分離、金属キレート化、ＨＰＬＣ等を単独でまたはそれらを組み合わせたクロマトグラフィ方法が挙げられる。クロマトグラフィ分離方法の代わりに、あるいはそれに加えて、単離または精製に使用され得る別の手段としては、電気泳動が挙げられる。首尾よい単離および精製は、ＨＰＬＣ、質量分析、および吸光度測定法を含む標準的な分析技法により確認される。これらの分離方法は、分離の第１の工程が、卵白の内因性オボアルブミン分画の除去である場合に容易とされる場合が多く、そうすることにより、総
タンパク質含有量を減らして、約５０％分さらに精製される。
所望のタンパク質またはペプチドの精製を促進または可能にするために、トランスポゾンベースのベクターは、１個またはそれ以上のさらなるエピトープあるいはドメインを含んでもよい。かかるエピトープまたはドメインとしては、エンテロキナーゼ切断部位を含むがこれに限定されない酵素的または化学的切断部位、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ由来のグルタチオン結合ドメイン、ポリリシン、ヘキサヒスチジンまたは他のカチオンアミノ酸、チオレドキシン、血液凝集素抗原、マルトース結合タンパク質、ＨＩＶ由来のｇｐ４１の断片、および当業者に一般的に知られる他の精製エピトープまたはドメインをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。
代表的な一実施形態では、卵白からの所望のタンパク質の精製は、オボアルブミン担体タンパク質の抗原性、およびオボアルブミンと所望のタンパク質とにまたがるＴＡＧリンカー配列の特定の特質を利用する。ＴＡＧ配列は、１）非常に抗原性のエピトープであるＨＩＶ由来のｇｐ４１の断片（ストリンジェントなアフィニティ精製を可能にする）、および２）所望のタンパク質にすぐ隣に近接したプロテアーゼエンテロキナーゼに関する認識部位を含有するため、この目的で特に有用である。好ましい実施形態では、ＴＡＧ配列は、およそ５０個のアミノ酸を含む。代表的なＴＡＧ配列を以下に提供する。
Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ（配列番号２２）
下線を付した（最初の方）配列は、ＨＩＶ ｇｐ４１のヘアピンループドメイン（配列番号２３）から取った。下線を付した（後の方）配列は、エンテロキナーゼに関する切断部位（配列番号９）を表す。ループドメインの上流にあるスペーサー配列は、自由回転を提供し、かつオボアルブミン担体タンパク質からのヘアピンループの表面利用可能性を促進するために（Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ）（配列番号２５）の反復から作製した。
所望のタンパク質の単離および精製は、以下の通りに実施される：
１．オボアルブミンおよびトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質を含有する卵白タンパク質分画の濃縮。
２．狭い範囲の分子量内のそれらのタンパク質のみを単離するためのサイズ排除クロマトグラフィ（工程１のさらなる濃縮）。
３．オボアルブミンアフィニティクロマトグラフィ。オボアルブミンに対する高特異的抗体は、オボアルブミンおよびトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質を除く実質的にすべての外来卵白タンパク質を排除する。
４．抗ｇｐ４１抗体を用いたｇｐ４１アフィニティクロマトグラフィ。この工程をストリンジェントに行うことにより、実質的に純粋なトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質が生じる。
５．導入遺伝子産物の切断は、下記の２つの方法の少なくとも１つで達成することができ
る：
ａ．トランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質を工程４からのｇｐ４１アフィニティ樹脂（ビーズ）に結合させて、プロテアーゼエンテロキナーゼを添加する。このことにより、ｇｐ４１アフィニティ樹脂から導入遺伝子標的タンパク質が遊離する一方で、オボアルブミン−ＴＡＧ配列は保持される。遠心分離（バッチプロセスで）または流入（カラム精製で）による分離により、溶液中にエンテロキナーゼと一緒に所望のタンパク質が残される。エンテロキナーゼは、回収して再使用する。
ｂ．あるいは、エンテロキナーゼを、プロテアーゼの非触媒性領域にポリリシン部分を付加することにより樹脂（ビーズ）上に固定化する。続いて、工程４のアフィニティカラムから溶出したトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質をプロテアーゼ樹脂にかける。プロテアーゼの作用により、所望のタンパク質からオボアルブミン−ＴＡＧ配列が切断され、溶液中に両方の物質が残される。固定化したエンテロキナーゼ樹脂は、再度帯電させて再使用する。
ｃ．これらの二者の選択は、導入遺伝子標的タンパク質のサイズおよび化学組成に応じて行われる。
６．これらの２つの（５ａまたは５ｂ）タンパク質混合物のいずれかの最終分離は、サイズ排除またはエンテロキナーゼアフィニティクロマトグラフィを用いて行われる。この工程により、必要に応じて、脱塩、緩衝液交換および／またはポリッシングが可能となる。
続いて、エンテロキナーゼによる導入遺伝子産物（オボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質）の切断により、２つの産物：オボアルブミン−ＴＡＧ、および所望のタンパク質が生じる。ＴＡＧ標識を用いた単離に関してより具体的な方法を実施例で提供する。所望のタンパク質によっては、当業者に既知であるように上述のアプローチの付け足しまたは変更を必要とする場合がある。上記方法は、実験室ベンチから、パイロットおよび生産設備にまで大規模に拡張可能である。というのは、適用される技法が、これらの設定それぞれにおいて十分文書化されているためである。
本発明のトランスジェニック動物により産生される典型的なニワトリの卵は、卵白の標準的な構成成分に加えて（あるいは、ことによっては該構成成分の少数を置き換えて）、少なくとも０．００１ｍｇ、約０．００１〜１．０ｍｇ、または約０．００１〜１００．０ｍｇの外因性タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含有すると考えられる。
生物学的発現または精製後に、所望のタンパク質、それらの断片およびペプチドは、タンパク質、それらの断片およびペプチドの天然のコンホメーションと実質的に異なるコンホメーションを保有し得ることが当業者に理解されよう。この場合、タンパク質を変性および還元した後、タンパク質を好ましいコンホメーションにリフォールディングさせることが必要である場合が多い。タンパク質を還元および変性させて、かつリフォールディングを誘導する方法は、当業者に既知である。
ミルク中でのタンパク質またはペプチドの産生
トランスジェニックタンパク質またはペプチドを含有する卵を産生する方法の他に、本発明は、トランスジェニックタンパク質またはペプチドを含有する産乳方法を包含する。これらの方法は、動物への上述のトランスポゾンベースのベクターの投与を含む。一実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、構成性プロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼ、および乳腺特異的プロモーターに操作可能に連結された所定の遺伝子を含有する。所定の遺伝子としては、抗ウイルスおよび抗菌タンパク質、ならびに免
疫グロブリンを挙げることができるが、これらに限定されない。
疾患の治療および動物の改善
所望の分子の産生および単離に加えて、本発明のトランスポゾンベースのベクターは、様々な遺伝病の治療に使用することができる。例えば、１個またはそれ以上のトランスポゾンベースのベクターは、ハンチントン病、α−１−抗トリプシン欠損アルツハイマー病、各種形態の乳癌、嚢胞性線維症、ガラクトース血症、先天性甲状腺機能低下症、カエデシロップ尿症、神経線維腫症１、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球症、およびスミス−レムリ−オピッツ（ＳＬＯ／ＲＳＨ）症候群を含むが、これらに限定されない単一遺伝病の治療のためにヒトまたは動物に投与することができる。本発明により治療され得る単一遺伝病により引き起こされる他の疾患としては、自己免疫疾患、ウシにおける家畜パスツレラ症、乳腺炎、細菌またはウイルス疾患、動物における皮膚色素の改変が挙げられる。これらの実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、突然変異されていない形態、または疾患を引き起こさない形態のかかる疾患を引き起こすことが知られている遺伝子を含有する。好ましくは、トランスポザーゼベースのベクター内に含有されるトランスポザーゼは、組織特異的プロモーターのような誘導性プロモーターに操作可能に連結され、その結果、突然変異されていない所定の遺伝子は、突然変異遺伝子がｉｎ ｖｉｖｏで発現される特定の組織に挿入される。
本発明の一実施形態では、プロインスリンをコードする遺伝子を含むトランスポゾンベースのベクターは、糖尿病を治療または治癒するために、肝細胞への組み込みのために糖尿病動物またはヒトに投与される。肝臓へのプロインスリン遺伝子の特異的組み込みは、Ｇ６Ｐのような肝臓特異的プロモーターの制御下にトランスポザーゼ遺伝子を置くことにより達成される。このアプローチは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の両方の治療に有用である。Ｇ６Ｐプロモーターは、グルコース応答性であることが示されており(Arguad, D., et al. 1996. Diabetes 45: 1563-1571)、したがって、グルコースを調節するインスリン産生が、本発明のＤＮＡ構築物を用いて達成される。プロインスリン遺伝子を肝細胞に組み込むことにより、Ｉ型糖尿病の経過中に膵島細胞の崩壊の問題が回避される。
別の実施形態では、Ｉ型糖尿病の診断の直後に、膵臓β細胞を破壊する免疫系の細胞は、本発明のトランスポゾンベースのベクターを用いて選択的に除去され、したがって正常なβ細胞を膵臓に備えさせることが可能である。
ＩＩ型糖尿病の治療のために、プロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターは、インスリンプロモーターのような膵臓特異的プロモーターの制御下に、トランスポザーゼ遺伝子を置くことにより、膵臓に特異的に組み込まれる。この実施形態では、ベクターは、膵臓へ供給する動脈への注射により糖尿病動物またはヒトに送達される。送達のために、ベクターは、トランスフェクション剤と複合体形成される。動脈は、膵臓全体にわたって複合体を分布させ、ここで個々の細胞は、ベクターＤＮＡを受け取る。標的細胞への取り込みの後、インスリンプロモーターは、細胞の転写機構により認識され、ベクターによりコードされるトランスポザーゼが発現され、プロインスリン遺伝子の安定した組み込みが行われる。少数のトランスポゾンベースのベクターは他の組織に輸送され、これらの組織はトランスフェクトされると予測される。しかしながら、これらの組織は、安定にトランスフェクトされず、これらの細胞はインスリンプロモーターを活性化することができないことにより、プロインスリン遺伝子は細胞ＤＮＡに組み込まれない。ベクターＤＮＡは、細胞が死亡するか、または時間とともに分解する場合に、損失される可能性が高い。
他の実施形態では、１個またはそれ以上のトランスポゾンベースのベクターは、大腸菌症（大腸菌型感染）、マイコプラズマ病（ＣＲＤ、肺胞嚢、静脈洞炎）、家禽コレラ、壊
死性腸炎、潰瘍性腸炎（ウズラ病）、ひな白痢、家禽チフス、ボツリヌス中毒、感染性コリーザ、丹毒、鶏痘、ニューカッスル病、伝染性気管支炎、ウズラ気管支炎、リンパ性白血病、マレク病（内臓白血症）、伝染性ファブリキウス嚢（ガンボロ病）を含むが、これらに限定されないウイルスまたは細菌感染／疾患の治療のために鳥類に投与される。これらの実施形態では、トランスポゾンベースのベクターは、伝統的なワクチンに類似した様式で使用され得る。
さらに別の実施形態では、１個またはそれ以上のトランスポゾンベースのベクターは、増強された成長特性および栄養利用を有する動物の産生のために、動物に投与される。
本発明のトランスポゾンベースのベクターは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、または任意の他の生物学的に活性な物質を産生する細胞、免疫系の細胞、神経系の細胞、筋（線条体筋、心筋、平滑筋）細胞、血管系の細胞、内皮細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、および肺細胞（気管支細胞および肺胞細胞を含む）を含むが、これらに限定されない任意の動物細胞を形質転換するのに使用することができる。トランスポゾンベースのベクターによる任意の内分泌細胞の形質転換は、本発明の一部として意図される。本発明の一態様では、免疫系の細胞は、抗体の産生をコードする所望の遺伝子（単数または複数）の組み込みに関する標的であり得る。したがって、胸腺、骨髄、βリンパ球（またはＢ細胞）、胃腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、パイエル板、ファブリーキウス嚢、リンパ節、脾臓、および扁桃腺、ならびに任意の他のリンパ組織はすべて、本発明の組成物の投与に関する標的であり得る。
本発明のトランスポゾンベースのベクターは、動物またはヒト細胞によるホルモン、サイトカイン、または成長因子を含むがこれらに限定されない任意の物質の産生を調節（刺激または阻害）するのに使用することができる。第二メッセンジャーの産生のような細胞または組織内の調節シグナルの調節もまた、本発明の一部として意図される。本発明のトランスポゾンベースのベクターの使用は、ホルモンもしくは他の内因性の生物学的活性物質の過少産生（例えば、糖尿病）または過剰産生（例えば、甲状腺機能亢進症）に起因する任意の動物またはヒトの疾患あるいは状態の治療のために意図される。アンチセンスＲＮＡまたは短鎖干渉ＲＮＡのようなＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を組み込むための、本発明のトランスポゾンベースのベクターの使用もまた、本発明の一部として意図される。
さらに、本発明のトランスポゾンベースのベクターは、治療薬に対する組織および細胞特異性を提供するために、治療薬の結合のための受容体分子のような「ビーコン」を細胞または組織に提供するのに使用され得る。幾つかのプロモーターおよび外因性遺伝子を、１つのベクターに組み合わせて、単一ベクター送達から進歩的な制御治療をもたらすことができる。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに役立つが、一方で本発明の任意の限定を構成しない。それどころか、本発明の様々な実施形態、変更および等価物に対する方策がなされてもよく、それは、本明細書中の説明に目を通した後には、本発明の精神を逸脱することなく、当業者に思い浮かび得る。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄの調製
配列番号１として以下に記載するベクターは、真核細胞のゲノムに所望のコード配列を挿入するように設計した。ｐＴｎＭｏｄと称する配列番号１のベクターを構築して、その配列を確証した。
このベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用した。改変コザック配列（ＡＣＣＡＴＧ）（配列番号１３）をプロモーターに付加した。トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットコドン中のゆらぎ(wobble)位置のヌクレオチドを、アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に変更させ、これにより、このコドンによりコードされるアミノ酸は変更しなかった。２個の終止コドンを付加して、合成ポリＡを用いて、強力な終結配列を提供した。このベクターは、安定した組み込みの可能性を増加させるために、細胞に侵入した後すぐに活性である（いかなる誘導なしで）ように設計されたプロモーターを使用する。さらなる終止コドンおよび合成ポリＡは、下流にある潜在的遺伝子まで読取りせずに、適正な終結を保証する。
このベクターを構築する際の最初の工程は、所望の変更を有するようにトランスポザーゼを改変させることであった。トランスポザーゼに対する改変は、プライマー：高効率正方向プライマー（Ｈｅｆ）変更トランスポザーゼ（ＡＴＳ）−Ｈｅｆ５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣ３’（配列番号１０）および変更トランスポザーゼ−高効率逆方向プライマー（Ｈｅｒ）５’ＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＣ３’（配列番号１１、逆方向相補的プライマー）を用いて達成された。５’正方向プライマーＡＴＳ−Ｈｅｆでは、配列ＣＴＣＧＡＧ（配列番号１２）が、制限酵素ＸｈｏＩに関する認識部位であり、これにより増幅遺伝子の定方向クローニングが可能となる。配列ＡＣＣＡＴＧ（配列番号１３）は、コザック配列およびトランスポザーゼに関する開始コドンを含有し、下線を付した塩基は、最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのＡまたはＴへのゆらぎ位置での変更を表す（コドンによりコードされるアミノ酸は変更しない）。プライマーＡＴＳ−Ｈｅｒ（配列番号１１）は、天然終止コドンＴＧＡに加えてさらなる終止コドンＴＡＡを含有し、ＢｃＩ制限部位であるＴＧＡＴＣＡ（配列番号１４）を付加して、定方向クローニングを可能にしている。これらのプライマーは、トランスポザーゼの鋳型としてのｐＴｎＬａｃ（ｐは、プラスミドを定義し、ｔｎは、トランスポゾンを定義し、ｌａｃは、ラクトース遺伝子のβ断片を定義し、このプラスミドはマルチクローニングサイトを含有する）およびＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ系（これは、酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2およびＰＣＲエンハンサーを含む、Epicentre Technologies, Madioson, WI）を用いたＰＣＲ反応で使用した。増幅されたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動させて、臭化エチジウムで染色し、紫外線トランスイルミネータで可視化させた。予測されるサイズに相当するバンドをゲルから切り出して、Ｚｙｍｏ洗浄ゲル回収キット(Zymo Research, Orange, CA)を用いてアガロースゲルから精製した。製造業者のプロトコルに従って、精製したＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（５’）およびＢｃｌ Ｉ（３’）(New England Biolabs, Beverly, MA)で消化した。消化したＤＮＡを、Ｚｙｍｏ
ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット(Zymo Research)を用いて制限酵素から精製した。
プラスミドｇＷｈｉｚ(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)を制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ(New England Biolabs)（これらは、Ｘｈｏ ＩおよびＢｃｌ Ｉと適合性であるが、制限部位を崩壊する）で消化した。消化したｇＷｈｉｚをアガロースゲル上で分離して、所望のバンドを切り出して、上述のように精製した。この様式でベクターを切断することにより、ＣＭＶプロモーターと合成ポリＡとの間の改変トランスポザーゼ（ｍＡＴＳ）の定方向クローニングを容易とした。
ｇＷｈｉｚ中でＣＭＶプロモーターと合成ポリＡとの間にｍＡＴＳを挿入するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｔ４リガーゼキット(Stratagenem Inc. La Jolla, CA)を用いて、製造業者のプロトコルに従って連結反応をセットアップした。連結させた産物を、Invitrogenのプロトコルに従って化学的形質転換を用いて大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテント細胞(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)に形質転換させた。形質転換した細菌を
、ＳＯＣ(GIBCO BRL, CAT# 15544-042)培地１ｍｌ中で３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ（Luria-Bertani培地）（ブロスまたは寒天）プレート（ＬＢ／ａｍｐプレート）に伝播させた。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートして、得られたコロニーをＬＢ／ａｍｐプレートへ採取して、３７℃で一晩成長させた。プラスミドＤＮＡを、変法アルカリ溶解プロトコル(Sambrook et al., 1989)を用いて単離して、１％アガロースゲル上で電気泳動して、臭化エチジウムで染色した後ＵＶトランスイルミネータで可視化させた。予測されるサイズ（およそ６．４ｋｂｐ）のプラスミドを産生するコロニーを、少なくとも２５０ｍｌのＬＢ／ａｍｐブロス中で培養して、製造業者のプロトコル(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐキット（カラム精製）を用いてプラスミドＤＮＡを収集した。カラム精製したＤＮＡを配列決定用の鋳型として使用して、トランスポザーゼ中に作製された変更が所望の変更であり、ＰＣＲ増幅に起因してさらなる変更または突然変異が生じなかったことを確証した。配列決定に関しては、Perkin-ElmerのＢｉｇ Ｄｙｅ配列決定キットを使用した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒモデル３７７自動シーケンサーで配列決定するために、試料はすべて、the Gene Probes and Expression Laboratory (LSU School of Veterinary Medicine)に送付した。
いったん正確な配向で所望のｍＡＴＳを含有するクローンが確認されれば、プライマーＣＭＶｆ−ＮｇｏＭ ＩＶ（５’ＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴ（配列番号１５）、下線を付した塩基は、ＮｇｏＭ ＩＶ認識部位を表す）およびＳｙｎ−ｐｏｌｙＡ−ＢｓｔＥ ＩＩ（５’ＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡ（配列番号１６）、下線を付した塩基は、ＢｓｔＥ ＩＩ認識部位を表す）を使用して、ｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流にクローニングするための完全なＣＭＶプロモーター、ｍＡＴＳおよび合成ポリＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、上述のようにＦａｉｌＳａｆｅ（登録商標）を用いて行い、Ｚｙｍｏ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを用いて精製し、末端をＮｇｏＭ ＩＶおよびＢｓｔＥ ＩＩ(New England Biolabs)で消化して、Ｚｙｍｏキットで再び精製して、以下に記載するようにｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流にクローニングした。
プラスミドｐＴｎＬａｃをＮｇｏＭ ＩＶおよびＢｓｔ ＩＩで消化して、ｐｔａｃプロモーターおよびトランスポザーゼを除去して、断片をアガロースゲル上で分離した。ベクターおよびトランスポゾンに相当するバンドを切り出して、アガロースで精製して、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(New England Biolabs)で脱リン酸化して、自己アニーリングを防止した。Ｚｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５を用いて、酵素をベクターから除去した。精製したベクターとＣＭＶｐ／ｍＡＴＳ／ポリＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｔ４リガーゼキットを用いて一緒に連結させて、上述のように大腸菌に形質転換した。
この形質転換から得られるコロニーを上述のようにスクリーニングして（ミニプレップ）、正確なサイズであるクローンを、上述のようにＤＮＡ配列解析により確証した。このベクターにｐＴｎＭｏｄ（配列番号１）という名称を与え、以下の成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に相当する。
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出し
たＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に相当する。ＣＭＶプロモーターは、ＡＴＧの上流にあるＡＣＣ配列の付加により改変された。
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１７８０〜２９８７は、トランスポザーゼｍＲＮＡ安定性に関して、およびタンパク質の発現に関してコドンを最適化することにより、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼに関するコード配列である。より具体的には、トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのそれぞれにおいて、かかる置換が、コードされるアミノ酸を変更させない場合に、ＧまたはＣをＡまたはＴに変更させた。
塩基対２９８８〜２９９３は、２個の改変終止コドンである。
塩基対２９９４は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター(Gene Therapy Systems)から取り出した合成ポリＡ配列であり、１０ｐＧｗｉｚのｂｐ１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対３８３８〜４５２７は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（２０）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ９２４〜２３５に相当する。このマルチクローニングサイトは、ベクターに任意の所定のコード配列を挿入するのに使用され得る。
塩基対４５２８〜４５３２は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４５３３〜４６０２は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対４６０３〜４６４４は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対４６４５〜５４８８は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対５４８９〜７６８９は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ７６１〜２９６１に相当する。
ｐＴｎＭｏｄの完成は、ｃｏｌＥ Ｉ複製起点および抗生物質耐性マーカー（アンピシリン）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖である。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。上述の構築物中でのヌクレオチド配列の欠如は、制限部位の残遺物(remnant)を表す。
プラスミドＤＮＡはすべて、標準的な手順により単離した。簡潔に述べると、プラスミドを含有する大腸菌(Escherichia coli)を、５００ｍＬ分取量のＬＢブロス（適切な抗生物質を補充）中で、３７℃にて一晩、振とうしながら成長させた。プラスミドＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐキット(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)を用いて細菌から回収した。プラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ等級の水５００μＬ中に再懸濁させて、使用するまで−２０℃で保管した。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／Ｒｅｄ）の調製
配列番号２として以下に記載するベクターは、脊椎動物細胞のゲノムに、ＣＭＶプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（ＤｓＲｅｄ）を挿入するように設計した。選択したレポーター遺伝子は、即初期サイトメガロウイルスプロモーター(the immediate early cytomegalovirus promoter)により駆動されるＤｓＲｅｄ遺伝子であり、ｐＴｎＣＭＶ／ＤｓＲｅｄと呼ばれるプラスミドを産生した。ＤｓＲｅｄ遺伝子産物は、インド洋のイソギンチャク（イソギンチャクモドキ科の一種）に由来する赤色蛍光タンパク質であり、これは５５８ｎｍで鮮赤色の蛍光を発する。レポーター遺伝子、すなわちＤｓＲｅｄ遺伝子は、本発明の単なる一実施形態であり、任意の所定の遺伝子を、本明細書中に記載する任意の実験においてＤｓＲｅｄレポーター遺伝子の代わりにプラスミドに挿入してもよいことが理解されよう。
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／Ｒｅｄ）と称される配列番号２のベクターが構築され、その配列は、再配列決定により確証された。配列番号２であるｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／Ｒｅｄ）は、以下の成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ１〜１３０に相当する。
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１７８０〜２９８７は、上述のコドンを最適化することにより、Ｔｎ１０(GenBa
nk受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼに関するコード配列である。
塩基対２９８８〜２９９３は、２個の改変終止コドンである。
塩基対２９９４は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター(Gene Therapy Systems)から取り出した合成ポリＡ配列であり、ｐＧｗｉｚのｂｐ１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部（residual）である非コードλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０４５〜４０４８は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４０４９〜５６９３は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に相当する。
。
塩基対５６９４〜５７０１は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対５７０２〜６６１７は、ｐＤｓＲｅｄ１．１(Clontech)由来のポリＡ配列を含むＤｓＲｅｄレポーターコード配列であり、ｐＤｓＲｅｄ１．１のｂｐ７７〜９９２に相当する。
塩基対６６１８〜７１０１は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ７１８〜２３５に相当する。
塩基対７１０２〜７１０６は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対７１０７〜７１７６は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対７１７７〜７２１８は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対７２１９〜８０６２は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対８０６３〜１０２６３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ニワトリの調製
ベクターを、鳥のゲノムに、オボアルブミンプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（ＤｓＲｅｄ）を挿入するように、かつオボアルブミンシグナル配列を含むように設計した。このベクターの１つの型を配列番号３として以下に記載する。ｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ニワトリと称される配列番号３のベクターは、ニワトリのオボアルブミンプロモーターおよびシグナル配列を含む。
配列番号３であるｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ニワトリは、以下の成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ１〜１３０に相当する。
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１７８０〜２９８７は、上述のコドンを最適化することにより、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼに関するコード配列である。
塩基対２９８８〜２９９３は、２個の改変終止コドンである。
塩基対２９９４は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター(Gene Therapy Systems)から取り出した合成ポリＡ配列であり、ｐＧｗｉｚのｂｐ１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、１０ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０４５〜４０４９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４０５０〜４９５１は、の上流要素（ＳＤＲＥ、すなわちステロイド依存性応答要素を含む）を含有する。GenBank受託番号Ｊ００８９５ Ｍ２４９９９、ｂｐ４３１〜１３３２を参照されたい。塩基対４９５２〜４９５９は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４９６０〜５１１２は、ニワトリのオボアルブミンシグナル配列（Gen Bank受託番号Ｊ００８９５ Ｍ２４９９９、ｂｐ２９９６〜３１４８）である。
塩基対５１１３〜５１１８は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対５１１９〜６０１１は、ｐＤｓＲｅｄ１．１(Clontech)由来のポリＡ配列を含むＤｓＲｅｄレポーターコード配列であり、ｐＤｓＲｅｄ１．１のｂｐ１００〜９９２に相当する。
塩基対６０１２〜６０１７は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対６０１８〜６０５６は、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ Ｔｏｐｏクローニングベクター(Invitrogen)のマルチクローニングサイトの一部であり、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔのｂｐ３３７〜３７７に相当する。
塩基対６０５７〜６０６２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対６０６３〜６４９５は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ６６７〜２３５に相当する。
塩基対６４９６〜６５００は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対６５０１〜６５７０は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対６５７１〜６６１２は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対６６１３〜７４７７は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対７４７８〜９６７８は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラの調製
配列番号４として以下に記載するベクターは、鳥のゲノムに、オボアルブミンプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（ＤｓＲｅｄ）を挿入するように、かつオボアルブミンシグナル配列を含むように設計した。ｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラと称される配列番号４のベクターが構築され、配列の選択部分を再配列決定により確証した。
配列番号４であるｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラは、以下の成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ１〜１３０に相当する。
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対１７８０〜２９８７は、上述のコドンを最適化することにより、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼに関するコード配列である。
塩基対２９８８〜２９９３は、２個の改変終止コドンである。塩基対２９９４は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター(Gene Therapy Systems)から取り出した合成ポリＡ配列であり、ｐＧｗｉｚのｂｐ１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮ
Ａである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０４５〜４０４９は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４０５０〜４９３４は、ニホンウズラのオボアルブミンプロモーター（ＳＤＲＥ、すなわちステロイド依存性応答要素を含む）である。ニホンウズラのオボアルブミンプロモーターは、ニワトリのオボアルブミンプロモーター（GenBank受託番号Ｊ００８９５
Ｍ２４９９９、ｂｐ４３１〜１３３２）に対するその高度の相同性により単離された。ニワトリの配列と比較した場合、幾つかの欠失がウズラ配列では観察された。
塩基対４９３５〜４９４２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対４９４３〜５０５２は、ニホンウズラのオボアルブミンシグナル配列である。ウズラのシグナル配列は、ニワトリのシグナル配列（GenBank受託番号Ｊ００８９５ Ｍ２４９９９、塩基対２９９６〜３１４８）に対するその高度な相同性により単離された。ニワトリの配列と比較した場合、幾つかの欠失がウズラ配列では観察された。
塩基対５０９３〜５０９８は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対５０９９〜５９９１は、ｐＤｓＲｅｄ１．１(Clontech)由来のポリＡ配列を含むＤｓＲｅｄレポーターコード配列であり、ｐＤｓＲｅｄ１．１のｂｐ１００〜９９２に相当する。
塩基対５９９２〜５９９７は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対５９９８〜６０３６は、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ Ｔｏｐｏクローニングベクター(Invitrogen)のマルチクローニングサイトの一部であり、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔの塩基対３３７〜３７７に相当する。
塩基対６０３７〜６０４２は、ベクターを構築する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対６０４３〜６４７５は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチ
クローニングサイトの一部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）のｂｐ６６７〜２３５に相当する。
塩基対６４７６〜６４８０は、ベクターを構成する際に使用する制限酵素部位のライゲーションによる残基である。
塩基対６４８１〜６５５０は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列の７０ｂｐである。
塩基対６５５１〜６５９２は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードλＤＮＡである。
塩基対６５９３〜７４５７は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対７４５８〜９６５８は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。
胚注入によるｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラを用いたＸ期のニホンウズラの卵のトランスフェクション
トランスジェニックニホンウズラを、Ｘ期の胚をトランスフェクトすることにより産生し、胚トランスフェクションにより送達される導入遺伝子の遺伝力を確立した。より具体的には、雌の卵を、午前中に収集し、注入用に十分数が収集されるまで、１５℃で置いておいたが、７日より長くは保持しなかった。Ｘ期の胚（卵）を、２つの処理群のどちらかに割り当てた。処理前に、卵それぞれを、横にして室温で約１２時間インキュベートして、胚を「一番上の真ん中」（ＴＤＣ）に移動させた。卵それぞれを、下にある卵殻膜を浸透することなく卵殻に１ｍｍの孔をあける（直接胚の上に）ことによりトランスフェクトした。２８ゲージの針をはめた０．５ｍｌシリンジを用いて、５０μｌ容積中のトランスフェクト用試薬、すなわちＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）に複合体形成させたＤＮＡを送達した。吸着吸盤を用いて、孔を封入し、処理の識別用のラベルを付した。卵すべてをトランスフェクトした後、吸着盤を上向きにしてそれらを孵化用の孵卵器にセットした。
孵化させた鳥はすべて、一週齢で採血して、血液細胞からＤＮＡを抽出し、陽性対照としての２８ｓプライマー、およびＤｓＲｅｄに特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。陰性であった任意の鳥は終結させた一方で、陽性の鳥は、導入遺伝子の維持を確定するためにモニタリングした。首尾一貫して陽性である鳥を、成熟期まで維持して、繁殖させた。陽性の雄および雌鳥を交配させた。交配させた雌ニワトリの卵を孵化させて、得られたニワトリ（Ｇ１世代）を、それらがトランスジェニックであるかどうかを決定するために評価した。この交配から得られたＧ１すべてを採血して、上述のようにＰＣＲを行った。
卵注入：２つの処理群および１つの対照群を、この実験に使用した。スーパーコイル状形態（処理１）および線状形態（処理２）のベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）を使用して、１つの処理について１５個の卵をトランスフェクトした。この実験用に線状ＤＮＡを得るために、ｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）をＮｇｏＭ ＩＶで消化して、
カラム精製して、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
卵それぞれに、総注射容積５０μｌ中の１：３の比でＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）と複合体形成させたＤＮＡ０．７５μｇを注射した。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を用いて、容積を５０μｌにした。ＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物は、注射前に１０分間室温でインキュベートさせなくてはならず（複合体形成のため）、また初期の混合後の４０分以内に使用しなくてはならない。卵は、注入後に上述のように孵化させた。
結果：スーパーコイル型注射群では、２羽の雌および１羽の雄が、ＤｓＲｅｄコード配列に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲ陽性と同定された。これらの鳥を上述のように交配させた。Ｇ１ニワトリから血液を採取して、ＰＣＲを行った。結果により、導入遺伝子がこれらの鳥の生殖体に組み込まれていることが示された。遺伝子が存在しないか、または完全なトランスジェニック鳥の繁殖群を創始するのに十分なトランスジェニックＧ１が得られたかを確証されるまで、これらの鳥からのＧ１ニワトリを週に一回の頻度で検査した。これらのＧ１ニワトリからの卵は、それらの卵のアルブミン部分においてＤｓＲｅｄタンパク質を発現した。
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／Ｒｅｄ）（配列番号２）によるニワトリの精巣内注射
種々の週齢（４週、６週、８週、１０週、１２週および１４週）の未熟鳥を、麻酔下に置いて、構築物ｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／Ｒｅｄ）を用いて精巣内に注射した。精製ＤＮＡベクター１〜５μｇを含有する生理食塩水を、１：６（ｗｔ：ｖｏｌ）の比でＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）トランスフェクト用試薬(Qiagen, Valencia, CA)と混合した。生理食塩水の量は、鳥の週齢および大きさに応じて、精巣それぞれに注射する総容積が１５０〜２００μｌとなるように調節した。４週齢および６週齢のニワトリに関しては、各５０μｌの３つの用量に分けて、１５０μｌ中のＤＮＡ１μｇを精巣それぞれに注射した。より高週齢の鳥に関しては、精巣に対してＤＮＡ３μｇ（８週齢の鳥に関して）またはＤＮＡ５μｇ（それより高週齢の鳥に関して）のいずれかを含有する総容積２００μｌを注射した。まず、一方の精巣を、注射前に外科的に露出させた。注射後に、切開を縫合して、この順序をもう一方の精巣に繰り返した。
手術後６〜９ヶ月目に、週に一度の精子試料を、注射した鳥それぞれ、および対照鳥から採取した。精子試料それぞれを、注射した遺伝子の取り込みおよび発現に関して評価した。試料は、収集後１週間以内に精子全体に関してＰＣＲで評価した。
４週齢、６週齢、８週齢、１０週齢、１２週齢および１４週齢の５〜２６羽の群のおよそ１００羽の雄白色レグホーンニワトリを使用した。というのも、精巣が最も「受容性が高い」である可能性が高いと予測される週齢範囲であるためである。この週齢範囲では、血液／精巣関門がまだ形成されておらず、他の細胞型、例えば精子細胞等の数と比較して、比較的多数の精原細胞が存在する。J. Kumaran et al., 1949. Poultry Sci., vol. 29, pp. 511-520を参照されたい。同様に、E. Oakberg, 1956. Am. J. Anatomy, vol. 99, pp. 507-515、およびP. Kluin et al., 1984. Anat. EmbryoL, vol. 169, pp. 73-78も参照されたい。
実験雄および対照雄は、一日齢で商業的供給源から入手し、使用するまで育雛器中で維持した。雄鳥は、それらが成熟期に近づくまで、個々の標準的なケージ中の温度管理スペース中に収容した。雄鳥には、随意、水および標準的な商業的飼料を与えた。雄鳥は、初期には２３：１時間の明暗サイクルで保持し、およそ週に一度の間隔で１５：８時間の明暗サイクルにまで程度を落とした。というのも、このレジメンは、成熟期および繁殖力を最適化すると報告されている。
外科的およびＤＮＡ注射手順
適切な週齢で、個々の雄の群を一晩空腹にさせた後、熟達した動物外科医によりＤＮＡの直接的精巣内注射による導入遺伝子送達を施した。雄それぞれを、簡素化したガスマシーンによりイソフルランで麻酔した。
各種装置および麻酔マシーンは、イソフルラン（および他のガス性麻酔薬）を鳥に投与することに関してこれまでに記載されている。Alsage et al., Poultry Sci., 50: 1876-1878 (1971)、Greenlees et al., Am. J. Vet. Res., vol. 51, pp. 757-758(1990)を参照されたい。しかしながら、これらの従来の技法は、幾分扱いにくく、実行するには複雑である。従来技術の不足点のために、イソフルラン（または他のガス性）麻酔を投与するための新規かつかなり簡潔なシステム、すなわち本発明者等がすべての週齢のニワトリで十分に作動することを見出したシステムを開発した。エーテルをマウスに投与するためここ数十年間使用されているシステムに類似して、標準的なノーズコーンを、ニワトリの頭部上にのせた。直径およそ３．５ｃｍおよび長さ１２ｃｍのプラスチックチューブに綿を充填して、そこに、イソフルラン(Abbott Laboratories, Chicago)およそ２ｍＬを注いだ。ニワトリの頭部を、シリンダーに部分的にのせて、服用過多なしで、適正な水準の麻酔を維持することが必要とされるのに応じて、手術全体にわたって断続的に適所に保持した。
麻酔した鳥それぞれを、精巣領域への接近が可能となるようにコードで羽と足を引っ張りつつ、動物ボード上に横にして配置させた。その領域を０．５％クロルヘキシジンでふきとり、精巣上の皮膚において２ｃｍの側背切開を行った（去勢に一般的に使用される方法に類似）。小さな動物レトラクタを用いて、最後の２つの肋骨を広げて、精巣を露出させた。続いて、ＤＮＡ溶液を、製造業者のプロトコルに従って、およそ１：６ｗｔ／ｖｏｌ比で、最終濃度０．０１〜０．０５μｇ／μｌとなるようにＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）(Qiagen)と混合した。これにより、精巣それぞれに注射される総ＤＮＡ１〜５μｇ（１５０〜２００μｌの容量中）が得られ、３つの注射部位：精巣のそれぞれの末端に１つずつおよび中央に１つに展開した。
注射装置は、５０、１００または２００μｌのシリンジに取り付けた標準的な２５ゲージの１／２インチ（１．２７ｃｍ）の皮下針であった。針先のおよそ５ｍｍを９０度の角度で曲げて、精巣への挿入を容易とした。ＤＮＡ−ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）溶液のおよそ５０〜７０μｌを、精巣１つ当たり３つの部位それぞれに注射した。複数回の注射は、精巣全体にわたってＤＮＡを満たすように算出し、その概念は、実現可能な限り多くＤＮＡと精原細胞との間の接触を促進することである。本発明者等は、本発明者等の手順により、精原細胞１個当たり約１００，０００個のＤＮＡ分子の注射がもたらされると推定した。これらの試験で使用される構築物は、配列番号２に示されるようなｄｓＲｅｄ遺伝子に操作可能に連結された非常に強力な構成改変ＣＭＶプロモーターであった。
注射後に、４〜０の吸収性縫合糸を用いて２層で切開を閉じ、続いて、対側性の精巣を同様に露出および注射した。手術後に、鳥それぞれをそのケージに戻して、回復させた。トランスフェクション試薬のみを含有する注射による偽手術を施した４羽の鳥（１６〜２０週齢）とともに、実験レジメンで、成功の全体的な可能性を高めるために１１３羽の雄を最終的に使用した。
鳥の評価
したがって、総計１１３羽の白色レグホーンニワトリに、様々な週齢の５〜２６羽の群でＤＮＡベクターを注射した。１４羽の鳥は４週で、２３羽の鳥は６週で、２６羽の鳥は８週で、２３羽の鳥は１０週で、５羽の鳥は１２週で、および２２羽の鳥は１４週で形質
転換した。１６羽の鳥が、サンプリングする前に死亡し、そこで現在までに９７羽の雄ニワトリと４羽の対照をサンプリングした。鳥は、（ａ）精子中での潜在的な形質転換、および（ｂ）首尾よい精巣トランスフェクションに関して、１８〜２４週齢で評価した。精子試料は、標準的な技法を用いて、手による操作で各雄ニワトリから得られた。精子を洗浄し、それらのＤＮＡを、G. Mann et al., 1993. J. Reprod. Fert., 99:505-12の技法に従って抽出した。続いて、分析するまで試料を凍結させた。評価は、ＰＣＲ分析により行われ、精子への、あるいは精巣細胞のいずれかへのＤＮＡ組み込みを検出した。さらに、選択した精巣を、精子サンプリング期間の最後に収集した。
試験した９７羽の鳥のうち、少なくとも２２羽が陽性である見込みがある結果を示した。陽性の結果は、試験しなかった４週を除くすべての形質転換週齢で観測された。少なくとも２羽の鳥が、初期の注射の４ヶ月後に実施した精子のＰＣＲにより陽性であると確認された。しかしながら、概念実験のこれらの初期の実証で使用されるＤｓＲｅｄ遺伝子産物が毒性であると考えられるため、これらの結果は多くの場合で一過性であった。それにもかかわらず、陽性ＰＣＲの結果は推測によると、導入遺伝子が精原細胞（思春期前）に組み込まれ、それがトランスジェニック精子中で保有されることを示した。続いて、かかる精子は、遺伝子を次の世代へと伝達することができ、真の生殖系列トランスジェニック「創始者」鳥の産生をもたらす。
ＤＮＡが精子に組み込まれ、かつ混入しているベクターが他の供給源から検出されないことをさらに確認するために、実験鳥の精子、ならびに陽性および陰性対照におけるＰＣＲにより、実験鳥の精子がトランスポザーゼをコードするＤＮＡを欠如していることを確認した。好ましいトランスポゾンベースのベクターの設計は、トランスポザーゼをコードする配列がベクター中に含有されるが、形質転換された染色体に組み込まれないようにすることである。したがって、トランスポザーゼ遺伝子の欠如と連動させた外因性コード配列の存在は、外因性コード配列、すなわち導入遺伝子の組み込みに関する強力な証拠である。
陽性ＰＣＲの結果が処理鳥の精子から得られたため、これらの結果により、概念の実証が示された。これらの予備結果の解釈は、実験で使用される改変ＣＭＶプロモーターがおそらくあまりに「激しい(hot)」という事実により、より困難となっていた。ＤｓＲｅｄ産物は、細胞から分泌されないため、産物は、毒性であるレベルにまで細胞内で構築され、頻繁に細胞を死滅させた。当然のことながら、この結果もさらに、形質転換が成功したことを意味する。導入遺伝子は、他の場合では細胞を死滅させることはできなかった。
ＤｓＲｅｄ遺伝子の産物の毒性に関する問題を解決するために、導入遺伝子が卵白で発現するように、オボアルブミンプロモーターに操作可能に連結された種々のレポーター遺伝子を用いて実験を行った。これらの実験を以下の実施例１２〜１５に提供する。
精巣注射によるベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラ（配列番号４）を用いた雄白色レグホーンニワトリのトランスフェクション
レグホーンニワトリで行ったさらなる実験では、８、１０、１２または１４週齢で精巣内注射したニワトリは、注射の６〜８ヶ月後に、平均しておよそ４０％の陽性精子を有することが実証された。他の実験では、首尾よいトランスフェクションが、１３週齢で注射したニワトリで達成された。
およそ８、１０、１２または１４週齢の４９羽の白色レグホーン雄ニワトリを入手して収容した。鳥を識別し、羽にバンドをつけ、処理群に割り当てた。適切な場合（精巣の大きさおよび血管新生に基づいて）、一方の精巣を去勢して、全ＤＮＡ注射容積を、残りの
精巣に送達した。３２羽の雄が、１：３の比のＤＮＡ対ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）で、ＤＮＡ５μｇ／精巣のＤＮＡ注射を受けた。残りの鳥は対照として使用した。注射後、鳥すべてを少なくとも５羽の雌と交配させて、成熟期および卵生が始まるまで観測した。ピークの卵産生前（雌ニワトリに関してはおよそ２４週齢）に収集した卵すべてをインキュベートして、明かりに透かして胚の存在を確定した。同定した任意の胚を孵卵器で孵化させて、ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲを行い、導入遺伝子の存在を確定した。
ｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラ構築物に関して陽性である雄ニワトリを保持して、Ｆ１子孫を産生させた（ピークの産生時に卵を収集）。この孵卵器からの子孫を採血して、血液からＤＮＡを抽出して、ＤｓＲｅｄ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。子孫の７７％がトランスジェニックであることが確定された。
精巣注射によるベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラ（配列番号４）を用いた成熟雄ニホンウズラのトランスフェクション
１２羽の性的に成熟した雄（およそ１３週齢にて）に、ニワトリに関して上述したように、精巣注射のために手術を施した。２１〜２８日齢にて、鳥を識別して、足にバンドをつけ、上くちばしの尖端を取り除き、性別に基づいて分離した。注射には、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）に関して濃度１：３または１：１０で、あるいはＭｉｒｒｕｓの場合では１：１の比で、ベクター５μｇ／精巣が含まれていた。研究は、１：３のＤＮＡ：ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）群に５羽の雄、１：１０のＤＮＡ：ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）群に３羽の雄、および１：１のＭｉｒｒｕｓ群に４羽の雄の３処理群から構成された。手術はすべて、一日で行われた。
１９日間、鳥を保持することにより、任意の組み込まれていないＤＮＡを精巣から清浄化した後、雌と交配させた。１５週齢で、２羽の週齢を合わせた雌を、処理雄それぞれとともに収容した。トランスフェクトされたＤＮＡの存在は、産卵の第二週目中に受精卵中で確定された。陽性と同定されるトランスジェニック卵を産生する親から収集される続く卵を収集して、孵卵器へ取るまで保管した。
３ヶ月齢で注射したウズラの精子で実施したＰＣＲにより、ウズラの精子へのＤｓＲｅｄ導入遺伝子の首尾よい組み込みが示された。
精巣注射によるベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／Ｒｅｄ）−ウズラ（配列番号４）を用いた未熟雄ニホンウズラのトランスフェクション
およそ４５０羽のウズラの卵をセットして、孵化させた。２１〜２８日齢にて、鳥を識別して、羽にバンドをつけ、上くちばしの尖端を取り除き、性別に基づいて分離した。４週齢で、６５羽の雄鳥に、上述のように手術および精巣注射を施した。注射には、様々な濃度（０、１／３、１／５、および１／１０）の３つの異なるトランスフェクション試薬：１）ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、２）Ｍｉｒｕｓ／Ｐａｎｖｅｒａ、および３）Ｄｏｓｐｅｒで、対照およびベクター２μｇ／精巣が含まれていた。研究は、１群当たり５羽の雄を有する１３処理群から構成された。１日当たり１つのトランスフェクション試薬を投与した。
７週齢で、２羽の週齢を合わせた雌を、処理雄それぞれとともに収容した。トランスフェクトされたＤＮＡの存在は、産卵の第二週目中に受精卵中で確定された。陽性と同定されるトランスジェニック卵を産生する親から収集される続く卵を収集して、孵卵器へ取るまで保管した。４週齢および５週齢で注射したウズラの精子で実施したＰＣＲにより、ウズラの精子へのＤｓＲｅｄ導入遺伝子の首尾よい組み込みが示された。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ ＴＡＧ／ｐ１４６／ＰＡ）−ニワトリの調製
配列番号２９として以下に記載するベクターは、鳥のゲノムに、ニワトリのオボアルブミンプロモーターの制御下にｐ１４６遺伝子を、およびオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するように設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に相当する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、１個の改変終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡであり、ｐＧｗｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０５０〜４９５１は、GenBank受託番号Ｊ００８９５ Ｍ２４９９９におけるニワトリのオボアルブミンプロモーターの塩基対４３１〜１３３２に相当するニワトリのオボアルブミンプロモーター（ＳＤＲＥを含む）である。
塩基対４９５８〜６１１５は、GenBank受託番号Ｖ００３８３．１の塩基対６６〜１２２３に相当するニワトリのオボアルブミンシグナル配列およびオボアルブミン遺伝子（終止コドンは省かれている）である。
塩基対６１２２〜６２７１は、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位およびスペーサー（合成）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２７２〜６３１６は、２個の付加終止コドンを有するｐ１４６配列（合成）である。
塩基対６３２４〜６６７６は、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に相当するｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリアデニル化配列である。
塩基対６６８２〜７１１４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に相当する。
塩基対７１２０〜７１８９は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対７１９０〜７２３１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対７２３２〜８０９６は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対８０９７〜１０２９７は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。上述の構築物中でのヌクレオチド配列の欠如は、制限部位の残物を表す。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ ＴＡＧ／ｐ１４６／ＰＡ）−ウズラの調製
配列番号３０として以下に記載するベクターは、鳥のゲノムに、ウズラのオボアルブミンプロモーターの制御下にｐ１４６遺伝子を、およびオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するように設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に相当する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、１個の改変終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡであり、ｐＧｗｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０５０〜４９３８は、ニホンウズラのオボアルブミンプロモーター（ＳＤＲＥ、すなわちステロイド依存性応答要素を含む）である。ニホンウズラのオボアルブミンプロモーターは、ニワトリのオボアルブミンプロモーター（GenBank受託番号Ｊ００８９５
Ｍ２４９９９、塩基対４３１〜１３３２）に対するその高度の相同性により単離された。
ｂｐ４９４５〜６０９２は、GenBank受託番号Ｘ５３９６４．１の塩基対５４〜１２０１に相当するウズラのオボアルブミンシグナル配列およびオボアルブミン遺伝子（終止コドンは省かれている）である。
塩基対６０９７〜６２４６は、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位およびスペーサー（合成）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２４７〜６２９１は、２個の付加終止コドンを有するｐ１４６配列（合成）である。
塩基対６２９９〜６６５１は、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に相当するｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリアデニル化配列である。
塩基対６６５７〜７０８９は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に相当する。
塩基対７０９５〜７１６４は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対７１６５〜７２０６は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対７２０７〜８０７１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対８０７２〜１０２７２は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。上述の構築物中でのヌクレオチド配列の欠如は、制限部位の残物を表す。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ ＴＡＧ／ＰｒｏＩｎｓ／ＰＡ）−ニワトリの調製
配列番号３１として以下に記載するベクターは、鳥のゲノムに、ニワトリのオボアルブミンプロモーターの制御下にプロインスリン遺伝子を、およびオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するように設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に相当する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、１個の改変終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡであり、ｐＧｗｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０５０〜４９５１は、GenBank受託番号Ｊ００８９５ Ｍ２４９９９におけるニワトリのオボアルブミンプロモーターの塩基対４３１〜１３３２に相当するニワトリのオボアルブミンプロモーター（ＳＤＲＥを含む）である。
塩基対４９５８〜６１１５は、GenBank受託番号Ｖ００３８３．１の塩基対６６〜１２２３に相当するニワトリのオボアルブミンシグナル配列およびオボアルブミン遺伝子（終止コドンは省かれている）である。
塩基対６１２２〜６２７１は、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位およびスペーサー（合成）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２７２〜６５３１は、プロインスリン遺伝子である。
塩基対６３５９〜６８９１は、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に相当するｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリアデニル化配列である。
塩基対６８９７〜７３２９は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対６６７〜
２３５に相当する。
塩基対７３３５〜７４０４は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対７４０５〜７４４６は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対７４４７〜８３１１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対８３１２〜１０５１２は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。上述の構築物中でのヌクレオチド配列の欠如は、制限部位の残物を表す。
トランスポゾンベースのベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ ＴＡＧ／ＰｒｏＩｎｓ／ＰＡ）−ウズラの調製
配列番号３２として以下に記載するベクターは、鳥のゲノムに、ニワトリのオボアルブミンプロモーターの制御下にプロインスリン遺伝子を、およびオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するように設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に相当する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に相当する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０(GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、１個の改変終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡであり、ｐＧｗｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に相当する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される左挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチ
クローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に相当する。
塩基対４０５０〜４９３８は、ニホンウズラのオボアルブミンプロモーター（ＳＤＲＥ、すなわちステロイド依存性応答要素を含む）である。ニホンウズラのオボアルブミンプロモーターは、ニワトリのオボアルブミンプロモーター（GenBank受託番号Ｊ００８９５
Ｍ２４９９９、塩基対４３１〜１３３２）に対するその高度の相同性により単離された。ニワトリの配列と比較して、ウズラの配列では幾つかの欠矢が観察された。
塩基対４９４５〜６０９２は、GenBank受託番号Ｘ５３９６４．１の塩基対５４〜１２０１に相当するウズラのオボアルブミンシグナル配列およびオボアルブミン遺伝子（終止コドンは省かれている）である。
塩基対６０９３〜６２４６は、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位およびスペーサー（合成）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２４７〜６５０７は、プロインスリン遺伝子である。
塩基対６５１４〜６８６６は、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に相当するｐＧＷｉｚ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリアデニル化配列である。
塩基対６８６７〜７３０３は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に相当する。
塩基対７３０４〜７３７９は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される右挿入配列（ＩＳ１０）の７０塩基対である。
塩基対７３８０〜７４２１は、ｐＮＫ２８５９由来の残部であるλＤＮＡである。
塩基対７４２２〜８２８６は、ｐＮＫ２８５９由来の残部である非コードＤＮＡである。
塩基対８２８７〜１０４８７は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター(Stratagene, Inc.)であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に相当する。
上述の非コードＤＮＡ配列はすべて、任意の他の非コードＤＮＡ配列（複数可）と置き換えることができることに留意すべきである。上述の構築物中でのヌクレオチド配列の欠如は、制限部位の残物を表す。
精巣注射によるプロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを用いた未熟レグホーン雄ニワトリのトランスフェクション
要素Ｏｖａｌプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡを含有するベクター（配列番号３１）およびＣＭＶプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡを含有するベクター（配列番号４２）を、１１週齢の白色レグホーン雄ニワトリの精巣にそれぞれ注射した。成熟期に達するまで、これらの鳥を標準的な条件下で保持した。
成熟期の時点で、鳥それぞれを取り扱って、操作して、精子を獲得した。精子試料をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に収集して、必要になるまで−２０℃または４℃のいずれかで保管した。ＭｏＢｉｏ Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄｓｐｉｎキット(MoBio laboratories, Solana Beach CA)を用いて、精子からＤＮＡを抽出した。精子５０マイクロリットルをＤＮＡ抽出プロトコルで使用し、精製したゲノムＤＮＡを水１００μｌ中に溶出させた。各ＰＣＲ反応では、ｅｎｔａｇ−１（５’）および合成ポリＡ−２（３’）に固着させたプライマーとともにゲノムＤＮＡおよそ０．５〜０．７５μｇを使用して、６８５ｂｐ断片を増幅させた。９羽のうち５羽の鳥が、適切なベクター構築物の存在に関して陽性反応を与えた。続いて、これらの鳥を正常な雌と交配させた。
精子におけるＰＣＲで陽性の結果をもたらさない鳥は屠殺して、それらの精巣を取り出して、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキットで組織片およそ２５ｍｇを用いて、ＤＮＡを抽出して、精製したＤＮＡを水２００μｌ中に溶出させて、上述のようにＰＣＲを行った。これらの鳥のうち２羽が非常に強力な陽性ＰＣＲ反応を与えた。
卵管注射によるプロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを用いたニホンウズラのトランスフェクション
Ｏｖａｌプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ（配列番号３１）またはＣＭＶプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ（配列番号４２）のいずれかを含有するトランスポゾンベースのベクターを用いて、ニホンウズラにおいて２つの実験を行った。
第１の実験では、Ｏｖａｌプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ含有構築物を、性的に成熟したウズラの卵管に注射した：３羽の雌ニワトリに、１：３のＳｕｐｅｒｆｅｃｔ比で５μｇを与え、３羽の雌ニワトリに、１：３のＳｕｐｅｒｆｅｃｔ比で１０μｇを与えた。本願を記載した時点で、ＤＮＡ１０μｇを与えた少なくとも１羽の鳥が、卵白中にヒトプロインスリンを産生していた（他の鳥は、依然試験している状態である）。この実験により、１）ＤＮＡは、少なくとも３ヶ月間安定であること、２）タンパク質レベルは、ＣＭＶプロモーターのような構成性プロモーターで観測される場合に匹敵する、および３）性的に成熟した鳥に注射をして、細胞培養を必要とせずに結果を得ることができることが示される。
第２の実験では、ＣＭＶプロモーター／Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡを含有するトランスポゾンベースのベクターを、性的に未熟なニホンウズラの卵管に注射した。総計９羽に注射した。８羽の生き残りのうち。３羽が、６週間以上にわたって、卵の卵白中にヒトプロインスリンを産生した。ＧＰ４１ペプチド配列は特有であり、正常な卵白タンパク質の一部として見出されないため、以下に詳述するＥＬＩＳＡアッセイを展開して、融合ペプチド（Ｏｖａｌ遺伝子／ＧＰ４１エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン）中のＧＰ４１を検出した。すべてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、同じ鳥が陽性の結果をもたらし、対照はすべて、予想通りに作動した。
ＥＬＩＳＡ手順：個々の卵白試料を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に希釈して、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに、総容積０．１ｍｌで添加した。続いて、これらのプレートを４℃で一晩コーティングさせた。ＥＬＩＳＡ展開の前に、プレートを室温にまで加温させた。コーティング溶液をデカントして、任意の過剰分をふき取ると、抗体の非特異的結合は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を添加して、それを最低４５分間振とうさせながらインキュベートすることによりブロックされた。続いて、こ
のブロッキング溶液をデカントして、新鮮なＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈した一次抗体（ヤギ抗ＧＰ４１ＴＡＧ）の溶液で置き換えた。一次抗体とともに２時間インキュベーションした後、自動プレート洗浄機で、各プレートをＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液で洗浄して、未結合の抗体を除去した。次に、二次抗体であるウサギ抗ヤギアルカリホスファターゼ結合抗体をＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈して、１時間インキュベートさせた。続いて、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０による第２の洗浄に付した。アルカリホスファターゼ用のジエタノールアミン基質緩衝液中のｐ−ニトロフェニルリン酸の溶液を用いて抗原を検出し、３０分および１時間で吸光度を測定した。
卵管内および卵巣内動脈注射の最適化
ニワトリまたはウズラの雌鳥の群における卵管細胞の全体的なトランスフェクション比率は、群内の卵管および卵巣の発達を同調させることにより高められる。卵管および卵巣の発達が、雌鳥群にわたって均一である場合、かつ卵管および卵巣の発達段階を決定または予測することができる場合、注射のタイミングは、最大数の細胞をトランスフェクトするように最適化される。したがって、卵管の発達を以下に記載するように同調させて、確実に大きくかつ均一な割合の卵管分泌細胞を所定の遺伝子でトランスフェクトする。
Oka and Schimke(T. Oka and RT Schimke, J. Cell Biol., 41, 816 (1969))、Palmiter, Christensen and Schimke(J Biol. Chem. 245(4):833-845, 1970)に記載されるように、雌鳥をエストラジオールで処理して、卵管の成熟を刺激した。具体的には、成熟期の始まる前の１〜１４週齢の範囲の期間、安息香酸エストラジオール１ｍｇの繰り返しの毎日の注射を実施する。卵管の発達を最大限にするのに十分な刺激期間の後、ホルモン処理を撤収して、それにより卵管分泌細胞の大きさにおいて後退を引き起こすが、細胞数の後退は引き起こさない。ホルモン撤収後の最適な時間で、処理雌鳥の卵管にトランスポゾンベースのベクターを注射した。トランスポゾンベースのベクターが卵管分泌細胞へ取り込まれる最適化した時間後に、雌鳥をさらなるエストロゲン刺激に付す。エストロゲンによる再刺激により、トランスポゾンベースのベクターのトランスポゾンメカニズムが活性化され、宿主ゲノムへの所定の遺伝子の組み込みを引き起こす。続いて、エストロゲン刺激を撤収して、雌鳥に正常な性的な発達を続けさせる。オボアルブミンプロモーターのような発生調節性プロモーターを使用する場合、トランスポゾンベースのベクターの発現は、成熟期の時点で卵管にて開始する。この時間枠中での卵巣内動脈注射は、生殖系列トランスフェクションおよび考え得る卵管発現をもたらすための卵胞の高くかつ均一なトランスフェクション効率を可能にする。
同様に、他の手段を用いて、卵管および卵巣の発達または後退を同調させて、高くかつ均一なトランスフェクション効率を可能にする。照明および／または飼育レジメンの代替法は、例えば、雌鳥の「羽毛を抜け変わらせて」、その間に卵管および卵巣が後退する。羽毛の抜け変わりを用いて、雌鳥をトランスフェクションに関して同調させて、他のホルモン方法と併用して、卵管および卵巣の後退および／または発達を制御してもよい。
抗ＴＡＧカラムクロマトグラフィを用いたヒトプロインスリンの単離
ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化１ｍＬカラム(Amersham）に、ｇｐ−４１ヘアピンループの形成を安定化するｇｐ−４１の天然ジスルフィド結合を含有するｇｐ−４１エピトープを含有した３０アミノ酸ペプチドを負荷した。３０アミノ酸ｇｐ４１ペプチドは、配列番号２３として提供される。ペプチドおよそ１０ｍｇを、カップリング緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）中に溶解して、０．５ｍＬ／分で室温にて２時間カラム上にリガンドを循環させた。続いて、過剰の活性基を、６倍カラム容積
の０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３を用いて不活性化して、カラムを６倍カラム容積の酢酸緩衝液（０．１Ｍ 酢酸塩、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）およびエタノールアミン（上述）で交互に洗浄した。１×ＰＢＳを用いて、カラムを中和した。続いて、アフィニティ精製で使用されるべき緩衝液：７５ｍＭ トリス、ｐＨ８．０および溶出緩衝液、１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７でカラムを洗浄した。最終的に、７５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０中でカラムを平衡化させた。
ｇｐ−４１に対する抗体を、上述のｇｐ−４１ペプチドによる接種によりヤギにおいて産生させた。より具体的には、ヤギに、ｇｐ−４１ペプチドのブースター投与を前提として接種した後、採血した。遠心分離により血清を収集した。ヤギ血清およそ３０ｍＬを０．４５μＭへ濾過して、０．５ｍＬ／分の速度でＴＡＧカラム上を通した。２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに達するまで、カラムを７５ｍＭトリス、ｐＨ８．０で洗浄した。３倍カラム容積（３ｍＬ）の溶出緩衝液（１００ｍＭ グリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．７）を、続いて７５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０を、すべて０．５ｍＬ／分の速度で適用した。１ミリリットル分画を収集した。分画を１Ｍトリス２００μＬ（ＰＨ９．０）に収集して、できる限り迅速に酸性分画を中和した。溶出緩衝液の適用と同時に、大きなピークがカラムから溶出した。分画をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、ＩｇＧの重鎖および軽鎖構造を維持して、還元条件下で２つの断片に分離する高分子量種が示された。
プールした抗体分画を用いて、順次、連結させた２つの１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化カラムを負荷した。ＴＡＧカラムを負荷するのに使用したのと同じ様式で、カップリングを行った。
卵白からのオボアルブミン−ＴＡＧ−プロインスリンの単離
ＣＭＶ−オボアルブミン−ＴＡＧ−プロインスリン構築物の卵管内注射により処理したウズラおよびニワトリからの卵白をプールした。陰圧濾過を用いて連続的により細かい孔径へ（最終的には０．２２μＭ孔径を用いて）尿嚢液を付すことにより、粘度を下げた。プロセスにより、卵白は、およそ１：１６に希釈された。清浄化した試料を、抗ＴＡＧカラムにのせて、抗ＴＡＧ抗体の精製に関して上述するのと同じ様式で溶出させた。溶出緩衝液の適用と同時に伴う２８０ｎｍでの吸光度のピークは、タンパク質が抗ＴＡＧカラムから特異的に溶出されたことを示した。溶出ピークを含有する分画を分析にプールした。
抗ＴＡＧアフィニティカラムからプールした分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析で特性化した。プールした分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、トランスジェニックタンパク質の予測分子量と一致する、対照卵白液には存在しない６０ｋＤａｌ分子量バンドが明らかとなった。幾つかの混入バンドが観測されたが、６０ｋＤａｌの種は、他のタンパク質と比較して非常に濃縮されていた。分取量のプールした分画を室温で一晩、プロテアーゼであるエンテロキナーゼで切断した。切断生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、市販のヒトプロインスリン陽性対照と同時に移動する、未切断物質中には存在しないバンドが明らかとなった。ウェスタンブロット分析により、非還元条件（これは、ジスルフィド結合を保持することにより、ｇｐ−４１のヘアピンエピトープを保存する）下で６０ｋＤａｌ種への特異的結合が示された。抗ヒトプロインスリン抗体を用いた切断時に出現する低分子量種のウェスタン分析により、最終的に切断断片をヒトプロインスリンと同定した。
モノクローナル抗体の発現用のトランスポゾンベースの導入遺伝子の構築
トランスポゾンベースのトランスジェニック方法論を用いたモノクローナル抗体の産生
は、各種方法で達成される。
１）２つのベクター：モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを構築する。続いて、これらのベクターを、２つの方法の少なくとも一方により標的動物のゲノムに組み込む：ａ）両方のベクターによる単一動物の直接的トランスフェクション（同時に、あるいは別個の事象として）、またはｂ）種の雄および雌がベクターの一方を生殖系列に保有し、続いてそれらを交配させて、それぞれのコピーを受け継ぐ子孫を産生すること。
２）軽鎖および重鎖は、インスレーターによりそれぞれ分離して、単一ＤＮＡ構築物上に含まれ、同じ（または異なる）プロモーターにより、あるいは内部リボソーム侵入部位のような両方の導入遺伝子の別個の転写を可能にする要素の含入により両方の導入遺伝子の単一プロモーター支配の発現を用いることにより、発現が支配される。
以下の実施例は、単一構築物上にモノクローナル軽鎖および重鎖に関するコード領域の両方を含有するトランスポゾンベースのＤＮＡ構築物の産生について記載する。ベクターｐＴｎＭｏｄを始めとして、重鎖および軽鎖に関するコード配列を、それぞれ適切なプロモーターおよびシグナル配列に先立って付加する。当業者に既知の方法を使用して、オボアルブミンプロモーターのおよそ１Ｋｂの近位要素を、オボアルブミンまたは標的組織から分泌される幾つかの他のタンパク質のシグナル配列に連結させる。プロモーターおよびシグナル配列の２つのコピーをｐＴｎＭｏｄのマルチクローニングサイトに付加して、それら間にスペースおよび重要な制限部位を残して、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のコード配列の続く付加を可能にする。当業者に既知の方法により、軽鎖および重鎖のコード配列を、適切な発現に関してインフレームで挿入させることが可能である。例えば、ヒトセミノプロテインに関して特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のコード配列が近年開示されている（軽鎖および重鎖に関して、それぞれGenBank受託番号ＡＹ１２９００６およびＡＹ１２９３０４）。軽鎖ｃＤＮＡ配列は、配列番号３４に提供されるのに対して、重鎖のｃＤＮＡは、配列番号３５に提供されるように報告されている。
当業者は、標的組織および種内の単一細胞中に、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の両方を産生することができる。改変細胞が正常な翻訳後改変能力を含有する場合、２つの鎖は、それらの天然な立体配置およびジスルフィド結合を形成し、かつグリコシル化の基質となるであろう。続いて、分泌時に、モノクローナル抗体は、例えば、導入遺伝子が卵管の筒部で発現される場合、ニワトリの卵の卵白中に蓄積される。
この実施例は、完全長マウスモノクローナル抗体の産生について詳述しているが、上記方法は、ハイブリッド抗体（例えば、ヒトとマウスの配列の組合せ；「ヒト化」モノクローナル抗体）、ならびにＦａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）およびＦｖ断片のような当業者に既知の有用な抗体断片を産生することがまったく可能であることにも留意すべきである。この方法は、望ましい場合に他のタンパク質に連結、改変または組み込まれる抗体の抗原認識配列（相補性決定領域）であると考えられる特異的領域を含有する分子を産生するのに使用することができる。
組織特異的インスリン遺伝子組み込みのためのトランスポゾンベースのベクターによるラットの処理
薬物ストレプトゾトシン(Zanosar; Upjohn, Kalamazoo, MI)をおよそ２００ｍｇ／ｋｇで投与することにより、ラットを糖尿病にする。ラットを採血して、標準的な手順に従って維持する。プロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクター、適切な
キャリア、および任意のトランスフェクション剤を、安定的な形質転換の目的でラットの肝下(singhepatic)（Ｇ６Ｐを使用する場合）動脈に注射する。ラットゲノムへのインスリン遺伝子の組み込みおよびインスリン発現レベルは、当該技術分野で既知の各種方法により確認される。生存動物または屠殺動物からの血液ならびに組織試料を試験する。ＰＣＲ、サザンブロットおよびノーザンブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成ならびに関連核酸分析方法の組合せを用いて、ラットの様々な器官および組織におけるベクターに由来するプロインスリンＤＮＡの組み込み、ならびに相当するｍＲＮＡの転写レベルを決定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、およびＥＬＩＳＡ、ならびに当業者に既知の他の方法の組合せを用いて、インスリンの存在および産生される量を決定する。発現されるインスリンの初期量が満足でない場合に、あるいは発現レベルが次第に衰える場合に、ベクターのさらなるトランスフェクションを用いて、タンパク質発現を増加させる。ラットの生理学的状態をトランスフェクション後に綿密に検査して、遺伝子療法の陽性または任意の陰性の影響を登録する。遺伝子組み込みの安定性およびタンパク質発現をモニタリングするために、トランスフェクション後の長期間にわたって動物を検査する。
例示的なトランスポゾンベースのベクター
以下の実施例は、本発明の様々なトランスポゾンベースのベクター、ならびに本発明のトランスポゾンベースのベクターへの挿入用の幾つかの構築物の説明を提供する。これらの実施例は、いかなる場合でも限定するものと意味されない。トランスポゾンベースのベクターへの挿入用の構築物は、ｐＴｎＭＣＳとラベルされたクローニングベクターに提供される。
ｐＴｎＭＣＳ（ベースベクター）
ｂｐ１〜１３０ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部（ｂｐ１〜１３０）
ｂｐ１３３〜１７７７ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２２９〜１８７３）
ｂｐ１７８３〜２９９１ Ｔｎ１０（GenBank受託番号Ｊ０１８２９）由来のトランスポザーゼ（ｂｐ１０８〜１３１６）
ｂｐ２９９２〜３３４４ ベクターｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ３３４５〜３３８７ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ３３８８〜３４５７ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ３４６４〜３６７０ ＸｍａＩ部位までのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ９２４〜７１８）
ｂｐ３６７１〜３７１５ ＸｍａＩ部位からＸｈｏＩ部位までのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト。これらの塩基対は、ｐＴｎＭＣＳにクローニングする場合は通常損失される。（ｂｐ７１７〜６７３）
ｂｐ３７１６〜４１５３ ＸｈｏＩ部位からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ６７２〜２３５）
ｂｐ４１５９〜４２２８ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ４２２９〜４２７０ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ４２７１〜５１１４ ｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ５１１５〜７３１５ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｋ（−）ベースベクター（Stratagene, Inc.)（ｂｐ７６１〜２９６１）
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−プレプロ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
ｂｐ１〜３６７０ ベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜５３２０ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出した
ＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５３２６〜５４９６ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５５０４〜５６５２ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ５６５３〜６３０６ GenBank受託番号Ｖ００５１９から取り出したヒト成長ホルモン（ｂｐ１〜６５４）
ｂｐ６３１３〜６７２０ GenBank受託番号Ｙ００４０７から取り出したコンアルブミンポリＡ（ｂｐ１０６５１〜１１０５８）
ｂｐ６７２２〜１０３２１ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ＣＨＯＶｇ−ｅｎｔ−プロインスリン−ｓｙｎＰＡ）（配列番号４１）
ｂｐ１〜３６７０ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜５３２０ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５３２７〜６４８０ GenBank受託番号Ｘ００３８３から取り出したニワトリのオボアルブミン遺伝子（ｂｐ６６〜１２１９）
ｂｐ６４８７〜６６３６ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６６３７〜６８９７ GenBank受託番号ＮＭ０００２０７から取り出したヒトプロインスリン（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６８９８〜６９４２ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６９４３〜７２９５ クローニングベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７２９６〜１０８９５ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−プレプロ−ｅｎｔ−プロインスリン−ｓｙｎＰＡ）
ｂｐ１〜３６７０ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜５３２０ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５３２６〜５４９６ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５５０４〜５６５２ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ５６５３〜５９１３ GenBank受託番号ＮＭ０００２０７から取り出したヒトプロインスリン（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ５９１４〜５９５８ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ５９５９〜６３１０ クローニングベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ６３１３〜９９１２ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ニワトリＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜３６７０ ベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜４３５０ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４３５７〜５６９２ GenBank受託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ５６９９〜６９１７ GenBank受託番号Ｖ００３８３．１由来のニワトリのオボアルブミン遺伝子（ｂｐ２〜１２２０）（この配列は、推定キャップ部位を含有する５’ＵＴＲを含む（ｂｐ５６９９〜５７６２）。）
ｂｐ６９２４〜７０７３ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ７０７４〜７３３４ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ７３３５〜７３７９ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ７３８０〜７７３１ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７７３３〜１１３３２ ベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ニワトリＯＶｅｐ＋プレプロ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜３６７０ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜４３５０ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４３５７〜５６９２ GenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ５６９９〜５８６９ セクロピンキャップ部位およびプレプロであるGenBank受託番号Ｘ０７４０４（ｂｐ５６３〜７３３。）
ｂｐ５８７６〜６０２５ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６０２６〜６２８６ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６２８７〜６３３１ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６３３２〜６６８３ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ６６８５〜１０２８４ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ウズラＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜３６７０ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜４３３３ ウズラのオボアルブミンエンハンサー：最上流のニワトリのオボアルブミンエンハンサーであるGenBank受託番号Ｓ８２５２７．１（ｂｐ１〜６７５）におおよそ等しいウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた６５８ｂｐ配列。（ニワトリに対して、ウズラ配列では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ４３４０〜５７０５ ウズラのオボアルブミンプロモーター：ニワトリのオボアルブミンプロモーターであるGenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９（ｂｐ１〜１３３６）におおよそ相当するウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた１３６６ｂｐ配列。（ウズラ配列とニワトリ配列との間では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩
基数は正確に対応しない。）
ｂｐ５７１２〜６９１０ ウズラのオボアルブミン遺伝子、EMBL受託番号Ｘ５３９６４（ｂｐ１〜１１９９）（この配列は、推定キャップ部位を含有する５’ＵＴＲを含む（ｂｐ５７１２〜５７６４）。）
ｂｐ６９１７〜７０６６ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ７０６７〜７３２７ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ７３２８〜７３７２ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ７３７３〜７７２４ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７７２６〜１１３２５ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＨＯＶｅｐ−プレプロ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
ｂｐ１〜３６７０ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜４３５０ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４３５７〜５６９２ GenBank受託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ５６９９〜５８６９ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５８７７〜６０２５ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６０２６〜６６７９ GenBank受託番号Ｖ００５１９から取り出したヒト成長ホルモン（ｂｐ１〜６５４）
ｂｐ６６８６〜７０９３ GenBank受託番号Ｙ００４０７から取り出したコンアルブミンポリＡ（ｂｐ１０６５１〜１１０５８）
ｂｐ７０９５〜１０６９４ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＣＳ（ウズラＯＶｅｐ＋プレプロ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜３６７０ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜３６７０）
ｂｐ３６７６〜４３３３ ウズラのオボアルブミンエンハンサー：最上流のニワトリのオボアルブミンエンハンサーであるGenBank受託番号Ｓ８２５２７．１（ｂｐ１〜６７５）におおよそ等しいウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた６５８ｂｐ配列。（ニワトリに対して、ウズラ配列では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ４３４０〜５７０５ ウズラのオボアルブミンプロモーター：ニワトリのオボアルブミンプロモーターであるGenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９（ｂｐ１〜１３３６）におおよそ相当するウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた１３６６ｂｐ配列。（ウズラ配列とニワトリ配列との間では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ５７１２〜５８８２ セクロピンキャップ部位およびプレプロ、GenBank受託番号Ｘ０７４０４（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５８８９〜６０３８ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６０３９〜６２９９ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂ
ｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６３００〜６３４４ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６３４５〜６６９６ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ６６９８〜１０２９７ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ
ｂｐ１〜１３０ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部（ｂｐ１〜１３０）
ｂｐ１３３〜１７７７ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２２９〜１８７３）
ｂｐ１７８３〜２９９１ Ｔｎ１０（GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼ（ｂｐ１０８〜１３１６）
ｂｐ２９９２〜２９９４ 改変終止コドン
ｂｐ２９９６〜３４１１ ｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２２〜２３３７）
ｂｐ３４１２〜３７１９ ベクターｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ３７２０〜３７６２ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ３７６３〜３８３２ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ３８３９〜４０４５ ＸｍａＩ部位までのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ９２４〜７１８）
ｂｐ４０４６〜４０９０ ＸｍａＩ部位からＸｈｏＩ部位までのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト。これらの塩基対は、ｐＴｎＭＣＳにクローニングする場合は通常損失される。（ｂｐ７１７〜６７３）
ｂｐ４０９１〜４５２８ ＸｈｏＩ部位からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ６７２〜２３５）
ｂｐ４５３４〜４６０３ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ４６０４〜４６４５ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ４６４６〜５４８９ ｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ５４９０〜７６９０ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター（Stratagene, INC)（ｂｐ７６１〜２９６１）
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＨＯＶｅｐ−プレプロ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
ｂｐ１〜４０４５ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜４７２５ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４７３２〜６０６７ GenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ６０７４〜６２４５ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ６２５２〜６４００ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６４０１〜７０５４ GenBank受託番号Ｖ００５１９から取り出したヒト成長ホルモン（ｂｐ１〜６５４）
ｂｐ７０６１〜７４６８ GenBank受託番号Ｙ００４０７から取り出したコンアルブミンポリＡ（ｂｐ１０６５１〜１１０５８）
ｂｐ７４７０〜１１０６９ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜
７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−ＣＨＯＶｇ−ｅｎｔ−プロインスリン−ｓｙｎＰＡ）（配列番号４２）
ｂｐ１〜４０４５ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜５６９５ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５７０２〜６８５５ GenBank受託番号Ｖ００３８３から取り出したニワトリのオボアルブミン遺伝子（ｂｐ６６〜１２１９）
ｂｐ６８６２〜７０１１ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ７０１２〜７２７２ GenBank受託番号ＮＭ０００２０７から取り出したヒトプロインスリン（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ７２７３〜７３１７ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ７３１８〜７６７０ クローニングベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７６７２〜１１２７１ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−プレプロ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
ｂｐ１〜４０４５ ベクターＰＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜５６９５ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５７０１〜５８７１ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５８７９〜６０２７ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６０２８〜６６８１ GenBank受託番号Ｖ００５１９から取り出したヒト成長ホルモン（ｂｐ１〜６５４）
ｂｐ６６８８〜７０９５ GenBank受託番号Ｙ００４０７から取り出したコンアルブミンポリＡ（ｂｐ１０６５１〜１１０５８）
ｂｐ７０９７〜１０６９６ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−プレプロ−ｅｎｔ−プロインスリン−ｓｙｎＰＡ）
ｂｐ１〜４０４５ ベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜５６９５ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２３０〜１８６４）
ｂｐ５７０１〜５８７１ GenBank受託番号Ｘ０７４０４から取り出したキャップ部位／プレプロ（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ５８７９〜６０２７ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６０２８〜６２８８ GenBank受託番号ＮＭ０００２０７から取り出したヒトプロインスリン（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６２８９〜６３３３ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６３３４〜６６８５ クローニングベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由
来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ６６８７〜１０２８６ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ニワトリＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）（配列番号４３）
ｂｐ１〜４０４５ クローニングベクターｐＴｎＭＯＤ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜４７２５ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４７３２〜６０６７ GenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ６０７４〜７２９２ GenBank受託番号Ｖ００３８３．１由来のニワトリのオボアルブミン遺伝子（ｂｐ２〜１２２０）（この配列は、推定キャップ部位を含有する５’ＵＴＲを含む）（ｂｐ６０７４〜６１３７）
ｂｐ７２９９〜７４４８ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ７４４９〜７７０９ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ７７１０〜７７５４ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ７７５５〜８１０６ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ８１０８〜１１７０７ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ニワトリＯＶｅｐ＋プレプロ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜４０４５ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜４７２５ GenBank受託番号Ｓ８２５２７．１から取り出したニワトリのオボアルブミンエンハンサー（ｂｐ１〜６７５）
ｂｐ４７３２〜６０６７ GenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９から取り出したニワトリのオボアルブミンプロモーター（ｂｐ１〜１３３６）
ｂｐ６０７４〜６２４４ セクロピンキャップ部位およびプレプロ、GenBank受託番号Ｘ０７４０４（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ６２５１〜６４００ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６４０１〜６６６１ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６６６２〜６７０６ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６７０７〜７０５８ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７０６０〜１０６５９ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ウズラＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜４０４５ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜４７０８ ウズラのオボアルブミンエンハンサー：最上流のニワトリのオボアルブミンエンハンサーであるGenBank受託番号Ｓ８２５２７．１（ｂｐ１〜６７５
）におおよそ等しいウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた６５８ｂｐ配列。（ニワトリに対して、ウズラ配列では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ４７１５〜６０８０ ウズラのオボアルブミンプロモーター：ニワトリのオボアルブミンプロモーターであるGenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９（ｂｐ１〜１３３６）におおよそ相当するウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた１３６６ｂｐ配列。（ウズラ配列とニワトリ配列との間では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ６０８７〜７２８５ ウズラのオボアルブミン遺伝子、EMBL受託番号Ｘ５３９６４（ｂｐ１〜１１９９）。（この配列は、推定キャップ部位を含有する５’ＵＴＲを含む（ｂｐ６０８７〜６１３９）。）
ｂｐ７２９２〜７４４１ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ７４４２〜７７０２ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ７７０３〜７７４７ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ７７４８〜８０９９ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ８１０１〜１１７００ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ｐＴｎＭＯＤ（ウズラＯＶｅｐ＋プレプロ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
ｂｐ１〜４０４５ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ１〜４０４５）
ｂｐ４０５１〜４７０８ ウズラのオボアルブミンエンハンサー：最上流のニワトリのオボアルブミンエンハンサーであるGenBank受託番号Ｓ８２５２７．１（ｂｐ１〜６７５）におおよそ等しいウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた６５８ｂｐ配列。（ニワトリに対して、ウズラ配列では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ４７１５〜６０８０ ウズラのオボアルブミンプロモーター：ニワトリのオボアルブミンプロモーターであるGenBank受託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９（ｂｐ１〜１３３６）におおよそ相当するウズラゲノムＤＮＡから院内で増幅させた１３６６ｂｐ配列。（ウズラ配列とニワトリ配列との間では複数の塩基対置換および欠失が存在するため、塩基数は正確に対応しない。）
ｂｐ６０８７〜６２５７ セクロピンキャップ部位およびプレプロ、GenBank受託番号Ｘ０７４０４（ｂｐ５６３〜７３３）
ｂｐ６２６４〜６４１３ 付加したエンテロキナーゼ切断部位を伴う合成スペーサー配列およびＨＩＶ ｇｐ４１ヘアピンループ
ｂｐ６４１４〜６６７４ ヒトプロインスリンGenBank受託番号ＮＭ０００２０７（ｂｐ１１７〜３７７）
ｂｐ６６７５〜６７１９ クローニングベクターｐＴＯＰＯ ＢｌｕｎｔＩＩ(Invitrogen)およびｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から人工産物として得られるスペーサーＤＮＡ
ｂｐ６７２０〜７０７１ クローニングベクターｇＷＩＺ(Gene Therapy Systems)由来の合成ポリＡ（ｂｐ１９２０〜２２７１）
ｂｐ７０７３〜１０６７２ クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ由来（ｂｐ３７１６〜７３１５）
ＰＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／トランスポザーゼ／ニワトリＯｖｅｐ／プレプロ／プロテインＡ
／コンポリＡ）
ｂｐ１〜１３０ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）(Stratagene)由来のＦ１（−）の残部（ｂｐ１〜１３０）
ｂｐ１３３〜１７７７ ベクターｐＧＷＩＺ(Gene Therapy Systems)から取り出したＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ｂｐ２２９〜１８７３）
ｂｐ１７８０〜２９８７ Ｔｎ１０（GenBank受託番号Ｊ０１８２９）から改変させたトランスポザーゼ
ｂｐ２９８８〜２９９０ 改変終止コドン
ｂｐ２９９１〜３３４３ ベクターｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ３３４４〜３３８６ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ３３８７〜３４５６ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ３４５７〜３６７４ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ９２４〜７０７）
ｂｐ３６７５〜５６９１ Ｔｏｐｏ Ｃｌｏｎｅ １０ｍａｘｉ０４０３０３由来のニワトリのオボアルブミンエンハンサー＋プロモーター（５’ＸｍａＩ、３’ＢａｍＨＩ）
ｂｐ５６９８〜５８６５ ｐＭＯＮ２００（GenBank受託番号Ｘ０７４０４）のセクロピンから増幅したキャップ部位を伴うプレプロ（５’ＢａｍＨＩ、３’ＫｐｎＩ）
ｂｐ５８７２〜７３３８ GenBank受託番号Ｊ０１７８６由来のプロテインＡ遺伝子（成熟ペプチドｂｐ２９２〜１７５５）（５’ＫｐｎＩ、３’ＳａｃＩＩ）
ｂｐ７３４５〜７７５２ GenBank受託番号Ｙ００４０７由来のニワトリのコンアルブミンポリＡ由来のコンポリＡ（ｂｐ１０６５１〜１１０５８）（５’ＳａｃＩＩ、３’ＸｈｏＩ）
ｂｐ７７５３〜８１９５ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）由来のマルチクローニングサイト（ｂｐ６７７〜２３５）
ｂｐ８１９６〜８２６５ Ｔｎ１０から残されたＩＳ１０の７０ｂｐ
ｂｐ８２６６〜８３０７ ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ
ｂｐ８３０８〜９１５１ ｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ
ｂｐ９１５２〜１１３５２ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｓｋ（−）ベースベクター（Stratagene, INC.)（ｂｐ７６１〜２９６１）
上記に引用した特許、刊行物および要約はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。上記事項は、本発明の好ましい実施形態だけに関するものであり、そこでは、添付の特許請求の範囲に規定するような本発明の精神および範囲を逸脱することなく、無数の変更または変化がなされてもよいことが理解されるべきである。
第１のプロモーターに操作可能に連結されたトランスポザーゼおよび第２のプロモーターに操作可能に連結された所定の遺伝子を含有するトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図であり、ここでは所定の遺伝子およびその操作可能に連結されたプロモーターは、トランスポザーゼにより認識される挿入配列（ＩＳ）に隣接する。「Ｐｒｏ」は、プロモーターを指す。この図および続く図では、実際のヌクレオチド配列のサイズは、その配列を表す囲いに必ずしも比例してはいない。 卵白中のポリペプチドの貯蔵を標的とするためのトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図であり、ここではＯｖ Ｐｒｏは、オボアルブミンプロモーターであり、Ｏｖタンパク質は、オボアルブミンタンパク質であり、ポリＡは、ポリアデニル化配列である。ＴＡＧ配列は、スペーサー、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループおよびタンパク質切断部位を含む。 卵白中のポリペプチドの貯蔵を標的とするためのトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図であり、ここではＯｖ ｐｒｏは、オボムコイドプロモーターであり、Ｏｖｏ ＳＳは、オボムコイドシグナル配列である。ＴＡＧ配列は、スペーサー、ＨＩＶ Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループおよびタンパク質切断部位を含む。 卵黄中のポリペプチドの貯蔵を標的とするためのトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図であり、ここではＶｉｔ ｐｒｏは、ビテロゲニンプロモーターであり、Ｖｉｔ ｔａｒｇは、ビテロゲニン標的配列である。 抗体重鎖および軽鎖の発現のためのトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図である。Ｐｒｅｐｒｏは、セクロピン(cecropin)由来のプレプロ配列を示し、ｐｒｏは、セクロピン由来のプロ配列を示す。 抗体重鎖および軽鎖の発現のためのトランスポゾンベースのベクターを図式的に表す図である。Ｅｎｔは、エンテロキナーゼ切断配列を示す。 尾−尾（図７Ａ）または尾−頭（図７Ｂ）配置いずれかの１つのベクター由来の抗体重鎖および軽鎖の卵白を標的とした発現を図式的に示す図である。尾−尾配置では、軽鎖の遺伝子に隣接したオボアルブミンシグナル配列は、その３’末端上にエンテロキナーゼ切断部位を含有して（図示せず）、軽鎖からのシグナル配列の切断を可能にし、重鎖の遺伝子に隣接したオボアルブミンシグナル配列は、その５’末端上にエンテロキナーゼ切断部位を含有して（図示せず）、重鎖からのシグナル配列の切断を可能にする。尾−頭配置では、重鎖および軽鎖の遺伝子に隣接したオボアルブミンシグナル配列は、その３’末端上にエンテロキナーゼ切断部位を含有して（図示せず）、重鎖または軽鎖からのシグナル配列の切断を可能にする。
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【配列表】
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Claims (51)

  1. ａ）第１のプロモーターに操作可能に連結された改変トランスポザーゼ遺伝子、および
    ｂ）１個またはそれ以上のさらなるプロモーターに操作可能に連結された１個またはそれ以上の所定の遺伝子
    を含むベクターであって、
    ｃ）前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子およびそれらの操作可能に連結されたプロモーターが、前記トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に隣接され、かつ
    ｄ）前記第１のプロモーターが、ＡＣＣＡＴＧを含む改変コザック配列を含む、ベクター。
  2. 前記トランスポザーゼ遺伝子の最初にある１個〜２０個のコドンが、該コドンによりコードされるアミノ酸を改変することなく、該コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドを、アデニンまたはチミンに変更することにより改変される、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記トランスポザーゼ遺伝子が、その最初の１０個のコドンで改変される、請求項２に記載のベクター。
  4. 前記トランスポザーゼが、Ｔｎ１０トランスポザーゼである、請求項１に記載のベクター。
  5. 前記第１のプロモーターが、構成性プロモーターである、請求項１に記載のベクター。
  6. 前記第１のプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１に記載のベクター。
  7. 前記誘導性プロモーターが、オボアルブミンプロモーターまたはビテロゲニンプロモーターである、請求項６に記載のベクター。
  8. １個の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結された、請求項１に記載のベクター。
  9. 前記第２のプロモーターが、構成性プロモーターである、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記第２のプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項８に記載のベクター。
  11. 前記誘導性プロモーターが、オボアルブミンプロモーターまたはビテロゲニンプロモーターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 前記トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結されたポリＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
  13. 前記ポリＡ配列が、コンアルブミンポリＡ配列である、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結された２個の終止コドンをさらに含む、請求項１または請求項１２に記載のベクター。
  15. 第１の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結され、第２の所定の遺伝子が、第３のプロモーターに操作可能に連結された、請求項１に記載のベクター。
  16. 第１および第２の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結された、請求項１に記載のベクター。
  17. 前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子に操作可能に連結されたエンハンサーをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
  18. 前記エンハンサーが、オボアルブミンエンハンサーの少なくとも一部を含む、請求項１７に記載のベクター。
  19. 前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子に操作可能に連結された卵誘導性配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
  20. 前記卵誘導性配列が、オボアルブミンシグナル配列またはオボムコイドシグナル配列である、請求項１９に記載のベクター。
  21. 前記卵誘導性配列が、ビテロゲニン標的配列である、請求項１９に記載のベクター。
  22. トランスジェニック動物を産生する方法であって、
    ａ）第１のプロモーターに操作可能に連結された改変トランスポザーゼ遺伝子、および
    ｂ）１個またはそれ以上のさらなるプロモーターに操作可能に連結された１個またはそれ以上の所定の遺伝子
    を含むベクターを前記動物に投与することを含み、
    ｃ）前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子およびそれらの操作可能に連結されたプロモーターが、前記トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に隣接され、かつ
    ｄ）前記第１のプロモーターが、ＡＣＣＡＴＧを含む改変コザック配列を含む、方法。
  23. 前記トランスポザーゼ遺伝子の最初にある１個〜２０個のコドンが、該コドンによりコードされるアミノ酸を改変することなく、該コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドを、アデニンまたはチミンに変更することにより改変される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記トランスポザーゼ遺伝子が、その最初の１０個のコドンで改変される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ベクターが、精巣内、動脈内、卵管内または胎芽内経路により投与される、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記トランスポザーゼが、Ｔｎ１０トランスポザーゼである、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記第１のプロモーターが、構成性プロモーターである、請求項２２に記載の方法。
  28. 前記第１のプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２２に記載の方法。
  29. 前記誘導性プロモーターが、オボアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーターおよびビテロゲニンプロモーターからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. １個の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結された、請求項２２に記
    載の方法。
  31. 前記第２のプロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記誘導性プロモーターが、オボアルブミンプロモーターまたはビテロゲニンプロモーターである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ベクターが、前記トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結されたポリＡ配列をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  34. 前記ポリＡ配列が、コンアルブミンポリＡ配列である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ベクターが、前記トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に連結された２個の終止コドンをさらに含む、請求項２２または請求項３３に記載の方法。
  36. 第１の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結され、第２の所定の遺伝子が、第３のプロモーターに操作可能に連結された、請求項２２に記載の方法。
  37. 第１および第２の所定の遺伝子が、第２のプロモーターに操作可能に連結された、請求項２２に記載の方法。
  38. 前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子に操作可能に連結されたエンハンサーをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  39. 前記エンハンサーが、オボアルブミンエンハンサーの少なくとも一部を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記動物が、鳥類動物である、請求項２２に記載の方法。
  41. 前記鳥類動物が、ニワトリまたはウズラである、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項４０に記載の鳥類動物により産生される卵であって、前記１個またはそれ以上の所定の遺伝子によりコードされる１個またはそれ以上の所望のタンパク質を含有する卵。
  43. 請求項２２に記載の動物により産生されるトランスジェニック精子。
  44. 所望のタンパク質を産生する方法であって、
    ａ）第１のプロモーターに操作可能に連結された改変トランスポザーゼ遺伝子、および第２のプロモーターに操作可能に連結された前記所望のタンパク質をコードする所定の遺伝子を含むベクターを動物に投与すること、および
    ｂ）前記動物で産生される前記所望のタンパク質を単離すること
    を含み、
    ｃ）前記所定の遺伝子および該遺伝子が操作可能に連結されたプロモーターが、前記トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に隣接され、かつ
    ｄ）前記第１のプロモーターが、ＡＣＣＡＴＧを含む改変コザック配列を含む、方法。
  45. 前記トランスポザーゼ遺伝子の最初にある１個〜２０個のコドンが、該コドンによりコードされるアミノ酸を改変することなく、該コドンの三番目の塩基位置にあるヌクレオチドを、アデニンまたはチミンに変更することにより改変される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記動物が、卵生動物であり、前記所望のタンパク質が、卵白から単離される、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記ベクターが、ＴＡＧ配列をさらに含み、前記所望のタンパク質が、前記ＴＡＧ配列を用いて精製される、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記ＴＡＧ配列が、ｇｐ４１タンパク質の抗原性部分をコードするポリヌクレオチド配列、エンテロキナーゼ切断部位、およびスペーサーポリヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＴＡＧ配列が、配列番号２２で示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記所望のタンパク質が、溶解性タンパク質である、請求項４４に記載の方法。
  51. 前記ベクターが、第３のプロモーターに操作可能に連結された第２の所定の遺伝子をさらに含み、前記所定の遺伝子が、抗体ポリペプチドをコードする、請求項４４に記載の方法。
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