JP2005526485A - ｂｂｃ３遺伝子プロモーターならびにｂｂｃ３遺伝子プロモーターを用いてアポトーシスおよびｂｂｃ３遺伝子発現のモジュレーターを同定する方法 - Google Patents

ｂｂｃ３遺伝子プロモーターならびにｂｂｃ３遺伝子プロモーターを用いてアポトーシスおよびｂｂｃ３遺伝子発現のモジュレーターを同定する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、bbc3遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現の変化により、または細胞のアポトーシス特性の変化により測定して、アポトーシスを直接または間接的にモジュレートする化合物を同定する方法に関する。本発明はまた、bbc3遺伝子の発現をモジュレートする化合物を同定する方法およびbbc3遺伝子のプロモーターと相互作用する化合物を同定する方法に関する。本発明はさらに、細胞のアポトーシスをモジュレートする方法、細胞のbbc3遺伝子発現をモジュレートする方法、アポトーシスのモジュレーターを作る方法、およびbbc3遺伝子発現のモジュレーターを作るプロセスに関する。最後に、本発明は本発明の方法のそれぞれにより同定した化合物ならびにbbc3遺伝子のプロモーターおよびそれに相同的な配列に関する。

Description

発明の分野
本発明は、bbc3遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現の変化によりまたは細胞のアポトーシス特性の変化により測定して、アポトーシスを直接または間接的にモジュレートする化合物を同定する方法に関する。
本発明はまた、bbc3遺伝子の発現をモジュレートする化合物を同定する方法およびbbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法に関する。
本発明はさらに、細胞のアポトーシスをモジュレートする方法、細胞のbbc3遺伝子発現をモジュレートする方法、アポトーシスのモジュレーターを作る方法、およびbbc3遺伝子発現のモジュレーターを作るプロセスに関する。
最後に、本発明は本発明の方法のそれぞれにより同定した化合物ならびにbbc3遺伝子のプロモーターおよびそれに相同的な配列に関する。
関係技術の説明
Bcl-2ファミリータンパク質はアポトーシス刺激に対する細胞応答を調節する（Adams, J. M.ら, Science 281:1322-6 (1998)；Korsmeyer, S. J., Cancer Res. 59:1693s-1700s (1999)）。このファミリーのメンバーは細胞死を抑制するかまたは促進する機能を有し、Bcl-2相同性（BH）ドメインと名付けられた４つまでの異なる保存アミノ酸モチーフにより特徴付けられる（Adams, J.ら, Science 281:1322-6 (1998)；Korsmeyer, S. J., Cancer Res. 59:1693s-1700s (1999)）。BH3ドメインはBcl-2関係タンパク質のプロアポトーシス（pro-apoptotic）クラスのなかでもユニークで重要な機能性エレメントであり、これらのタンパク質が他のBcl-2関係タンパク質と二量化する能力に介在してアポトーシスを促進する（Chittenden, T.ら, Nature 374:733-6 (1995)；Huang, D.C.ら, Cell 103:839-42 (2000)）。さらに細胞死ドメインとしてのBH3の機能は、他のBcl-2ファミリーメンバーとBH3だけを共有する新しく登場した「BH3オンリー（BH3-only）」タンパク質のグループにより明らかにされている。Bik、Bad、Bid、Bim、Egl-1およびHrkを含むこのクラスのタンパク質は、BH3ドメインを介してBcl-2ファミリーの抗アポトーシス（anti-apoptotic）メンバーと結合することによりアポトーシスを誘導する（Huang, D.C.ら, Cell 103:839-42 (2000)）。
生化学的および遺伝的確証は、BH3オンリータンパク質が脊椎動物および無脊椎動物の両方に保存される細胞死経路中のBcl-2上流の点において機能することを示す（Huang, D. C.ら, Cell 103:839-42 (2000)；Horvitz, H.R., Cancer Res. 59:1701s-1706s (1999)）。BH3オンリータンパク質は、アポトーシス刺激の後、ミトコンドリアに局在化し、ここでBcl-2ファミリーと結合して、シトクロムcのサイトゾル中への放出を含むアポトーシスに関連するミトコンドリア事象を誘導することが示されている（Huang, D. C.ら, Cell 103:839-42 (2000)）。BH3タンパク質BadおよびBidの機能は、外因性細胞生存／細胞死刺激に応答して、それぞれリン酸化およびタンパク分解活性化により調節される（Zha, J.ら, Cell 87:619-28 (1996)；Luo, X.ら, Cell 94:481-90 (1998)；Li, H.ら, Cell 94:491-501 (1998)）。翻訳後の改変を経て、BadおよびBidは細胞表面受容体に起こるシグナルをBcl-2調節性ミトコンドリアのアポトーシス制御点に伝達する。
線虫Ｃ．エレガンス（C. elegans）においては、BH3オンリータンパク質Egl-1は、全ての細胞死に必要とされる遺伝的に規定された経路中の最も近位において機能する（Conradt, B.ら, Cell 93:519-29 (1998)）。Egl-1は線虫（nematode）Bcl-2対応物、Ced-9と結合して、哺乳類動物BH3タンパク質に基づく機能と同様に、その機能と拮抗する。BadおよびBidと対照的に、Egl-1の活性は主に転写制御機構全体で調節されるように思われる。egl-1遺伝子は、発生中に死滅することの定まっている細胞において特異的に活性であり、遺伝研究はある特定の細胞系譜において、egl-1上流にその発現を制御する転写因子を同定している（Conradt, B.ら, Cell 98:317-27 (1999)；Metzstein, M. M.ら, Nature 382:545-7 (1996)；Metzstein, M. M.ら, Mol. Cell. 4:309-19 (1999)）。
線虫および哺乳類動物において細胞死経路を制御する遺伝子の間には顕著な構造および機能の保存が認められる（Horvitz, H. R., Cancer Res. 59:1701s-1706s (1999)）。Ｃ．エレガンスのプログラム細胞死に対するEgl-1の本質的な寄与とその転写調節は、哺乳類動物細胞のアポトーシスがBH3オンリータンパク質をコードする遺伝子の転写制御に依存しうることを強く示唆する。このクラスにおけるBH3オンリー遺伝子の転写を制御する機構の調節障害は、癌などの疾患におけるアポトーシスの欠失に寄与しうる。
本発明者らは最近、プロアポトーシス性の強いBH3オンリータンパク質を同定し、これをBbc3（Bcl-2 binding component 3（Bcl-2結合成分3））と名付けたが、このタンパク質は遺伝子bbc3（ヒトbbc3のcDNA、プロモーターおよびタンパク質配列はそれぞれ、GenBank受託番号U82987、AF411827およびAAB51243に見出しうる）によりコードされ、複数の細胞死シグナル伝達経路による転写調節に関わる。実験結果は、bbc3遺伝子の転写制御が哺乳類動物細胞における細胞死調節に寄与することを示している。bbc3遺伝子発現は、DNA損傷、グルココルチコイド処理、および増殖因子欠乏を含む少なくとも３つのアポトーシス刺激により活性化され、広範な転写応答を構成し、従って哺乳類動物細胞死調節遺伝子のなかでも非常にユニークである。egl-1との類似性から、bbc3遺伝子は他の環境においても、例えば、発生中の細胞死においても誘導されることを証明しうる。従って、bbc3遺伝子の発現は、Bcl-2ファミリーにより調節される共通のミトコンドリアのアポトーシス事象に対する様々な刺激に由来する細胞死シグナルを伝達するのに役立ちうる。
アポトーシスへ導く経路におけるBbc3の明白な広い役割によって、Bbc3の効果をモジュレートする化合物の同定は治療薬の開発につながりうる。実際、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物およびBbc3タンパク質の活性をモジュレートする化合物の同定は、正常なアポトーシス経路がブロックされている癌（例えば、白血病）などの医学的症状、およびアポトーシスが加速されるパーキンソン病などの神経変性疾患の治療に利用しうる可能性がある。
さらに、bbc3遺伝子を利用してbbc3シグナル伝達経路の構成要素、ならびにアポトーシスに関わる他の経路の構成要素を同定することができる。これらの経路をモジュレートする化合物はまた一連の医学的症状を治療するための重要な治療薬でもありうる。
従って、アポトーシスおよびbbc3遺伝子の活性の両方をモジュレートする化合物を同定する方法は、潜在的治療化合物を同定するのに、ならびにアポトーシスが関わる医学的症状の治療に対するその他の標的を同定するのに役立ちうる。本発明はこれらおよびその他の重要な目的に関する。
発明の概要
従って、本発明の目的は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法、bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法、アポトーシスをモジュレートする方法、bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法、アポトーシスをモジュレートする化合物を作る方法、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を作る方法を提供すること、これらの方法により同定した化合物、ならびにbbc3遺伝子プロモーターおよびそれと相同的な配列を提供することを含む。
これらおよびその他の目的は、少なくともヒトbbc3遺伝子プロモーターの一部分（配列番号１）を提供し、単離しかつ特性決定することにより達成した。
本発明は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。
一実施形態においては、本発明は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、上記確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質もしくはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施するか、または、上記確認は細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
好ましい実施形態においては、本発明は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(e)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、bbc3遺伝子の発現またはレポーター遺伝子の発現は候補化合物によりダウンレギュレートされる。
好ましくは、上記確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより、または細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態においては、本発明は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性を阻害することが公知の化合物に曝すステップ、(e)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(f)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、bbc3遺伝子の発現またはレポーター遺伝子の発現は候補化合物によりアップレギュレートされる。
好ましくは、上記確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより、または細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
本発明はまた、細胞におけるbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法も提供する。
一実施形態においては、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、上記確認は、bbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質もしくはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施するか、または細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
好ましい実施形態においては、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(e)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、bbc3遺伝子の発現またはレポーター遺伝子の発現は候補化合物によりダウンレギュレートされる。
好ましくは、上記確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより、または細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態においては、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞をbbc3遺伝子プロモーターを阻害することが公知の化合物に曝すステップ、(e)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(f)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、bbc3遺伝子の発現またはレポーター遺伝子の発現は候補化合物によりアップレギュレートされる。
好ましくは、上記確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより、または細胞死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、細胞を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、細胞を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
本発明はまた、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定するための、細胞を使わないまたはin vitroの方法も提供する。
従って、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を提供するステップ、(b)上記組成物を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法を提供する。
好ましくは、上記確認は、bbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質もしくはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施する。
好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、本方法はさらに、組成物を候補化合物に曝す前のいずれかの時点で、組成物を候補化合物に曝した後のいずれかの時点で、または組成物を候補化合物に曝すと同時に、組成物を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すことを含むものである。
好ましくは、１以上の誘導物質および／またはインヒビターは、増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される。
本発明はまた、bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法も提供する。
従って、本発明は、bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法であって、(a)bbc3遺伝子プロモーターを提供するステップ、(b)プロモーターを候補化合物と接触させるステップ、および(c)プロモーターと候補化合物との間の相互作用を検出するステップを含んでなり、それによりbbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する上記方法を提供する。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むものである。
好ましくは、検出は候補化合物を認識して結合する抗体を用いて実施するか、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施するかまたはゲル遅延分析により実施する。
好ましくは、bbc3遺伝子プロモーターは細胞内にあり、そしてその細胞を候補化合物と接触させる。
本発明はまた、アポトーシスをモジュレートする方法も提供する。
従って、本発明は、細胞のアポトーシスをモジュレートする方法であって、(a)bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および(b)上記細胞をアポトーシスをモジュレートする上記方法の１つで同定した化合物と接触させ、それにより細胞のアポトーシスをモジュレートするステップを含んでなる上記方法を含む。
好ましくは、上記モジュレーションは細胞のアポトーシスの阻害または誘導である。
本発明はまた、bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法も提供する。
従って、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法であって、(a)bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および(b)上記細胞をbbc3遺伝子発現をモジュレートする上記方法の１つで同定した化合物と接触させ、それによりbbc3遺伝子発現をモジュレートするステップを含んでなる上記方法を提供する。
好ましくは、上記モジュレーションはbbc3遺伝子発現の阻害または誘導である。
本発明はまたは、アポトーシスをモジュレートする化合物を作る方法も提供する。
従って、本発明は、アポトーシスのモジュレーターを作る方法であって、(a)アポトーシスのモジュレーターを同定する本明細書に記載の方法のいずれかを実施して、それによりアポトーシスのモジュレーターである化合物を同定するステップ、および(b)上記化合物を製造するステップを含んでなる上記方法を提供する。
本発明はまた、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を作る方法も提供する。
従って、本発明は、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を作る方法であって、(a)bbc3遺伝子発現のモジュレーターを同定する本明細書に記載の方法のいずれかを実施し、それによりbbc3遺伝子発現のモジュレーターである化合物を同定するステップ、および(b)上記化合物を製造するステップを含んでなる上記方法を提供する。
さらなる実施形態においては、本発明は本明細書の方法のいずれかにより同定した化合物を提供する。
追加の実施形態においては、本発明は、配列番号１の塩基1-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、配列番号１の塩基1168-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、配列番号１の塩基1934-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
最後の実施形態においては、本発明は、配列番号１の塩基1-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、配列番号１の塩基1168-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、配列番号１の塩基1934-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
発明の詳細な説明
本明細書で使用される技術用語および科学用語は、別に定義しない限り、本発明が関係する技術分野の当業者が通常理解する意味を有する。
本明細書においては、当業者に公知の様々な方法論を参照している。参照されるそのような公知の方法論を記述する刊行物およびその他の資料は、本明細書に参照によりその全体がそのまま組み入れられる。組換えDNA技術の一般原理を記述する標準的参考文献としては、Sambrook, J.ら, 「Molecular Cloning,: A Laboratory Manual（分子クローニング：研究室マニュアル）」, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)；「Directed Mutagenesis: A Practical Approach（指向性突然変異誘発：実際的手法）」, IRL Press, Oxford；Jones, J. (1992); 「Amino Acid and Peptide Synthesis（アミノ酸およびペプチド合成）」, Oxford Science Publications, Oxford；Austen, B. M.およびWestwood, O. M. R. (1991); 「Protein Targeting and Secretion（タンパク質ターゲティングおよび分泌）」, IRL Press, Oxfordが挙げられる。当業者に公知のいずれの適当な材料および／または方法を、本発明を実施するのに利用することができる。しかし、好ましい材料および／または方法を記載する。以下の明細書および実施例において参照される材料、試薬などは、別に記述しない限り、市販元から入手可能である。
実施形態の説明
アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法
本発明は、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法を含む。
これらの方法の第１は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現レベルの変化は、候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す兆候である。
当業者であれば、用語「アポトーシス」の意味を理解しうるが、一般的に、アポトーシスは遺伝的に制御された細胞死を意味する。アポトーシスの特徴は、細胞質の凝縮、核の断片化および核クロマチンの分断塊への移行、ミトコンドリアおよびリボソーム緊密化、ならびに小胞体の拡張とそれに続く細胞膜との融合である。最後に、細胞はバラバラに壊れていくつかの膜に結合した小胞またはアポトーシス体となる。アポトーシスが起こる前に、特定の遺伝子の活性化が必要であると考えられる。多くの生物において、アポトーシスは形態学的発生の正常な一部分である。
本発明によると、アポトーシスを「モジュレートする（modulate）」とは、アポトーシスを誘導することまたはアポトーシスを阻害することを意味する。アポトーシスの誘導は、アポトーシスの完全ではない誘導であってもよい。例えば、誘導は細胞におけるアポトーシス能力の誘発を意味してもよい。同様にアポトーシスの阻害は部分的であってもまたは完全であってもよい。
本発明によると、アポトーシスをモジュレートする「化合物」はアポトーシスをモジュレートするあらゆる物質を意味する。そのような化合物としては、限定されるものでないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、アミノ酸、およびヌクレオチド化合物を含む化学的または生物学的化合物を含み、これらは、限定されるものでないが、そのような化合物の合成形態、ならびに／またはそのような化合物の化学的および／もしくは遺伝的に改変された形態を含む。適当なポリペプチドはキナーゼ、ホスファターゼ、およびその他の酵素を含みうる。「化合物」は１つの化合物であってもまたは２以上の化合物の組合わせであってもよい。
当業者は、本発明の方法のそれぞれで試験する候補化合物はいずれの供給源から入手してもよいが、公知のアポトーシス誘導物質およびアポトーシスインヒビターの相同体は試験すべき有望な候補化合物であることを理解するであろう。さらに、化合物の供給源としては、天然供給源から単離された天然化合物のライブラリー、そのような天然化合物の誘導体のライブラリー、合成化合物のライブラリー、ペプチドライブラリー（合成物、天然物、または遺伝子操作して大腸菌（E. coli）、酵母、哺乳動物細胞および昆虫細胞などの様々な宿主において産生されたもの）、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのライブラリー（合成物、天然物または遺伝子操作して大腸菌（E. coli）などの様々な宿主において産生されたもの）が挙げられる。
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、単離されたもしくは合成の全長タンパク質、または単離されたもしくは合成の全長オリゴペプチドであって、最小サイズではアミノ酸２個を有するそのようなタンパク質またはオリゴペプチド、を意味する総称用語として使用される。
用語「アミノ酸」は、本明細書において、単独のアミノ酸および／または類似体、および／またはそれらの改変型を意味するために使用される。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、単離された全長DNAもしくはRNA；または合成全長DNAおよび／もしくはRNA；または単離されたDNAもしくはRNAオリゴヌクレオチド；または合成DNAおよび／もしくはRNAオリゴヌクレオチドであって、最小サイズではヌクレオチド２個を有するそのようなDNAおよび／もしくはRNA、を意味する総称用語として使用される。
用語「ヌクレオチド」は、本明細書において、5’-dNMP、-dNDP、-dNTP、-rNMP、-rNDP、-rNTP；ならびに／またはそれらの類似体および／もしくは改変型を意味するために使用される。
本発明の方法を利用して、アポトーシス活性および／もしくは抗アポトーシス活性をモジュレートまたは調節する化合物を、例えば、そのような活性を阻害、減少、回復、または誘導することによって同定することができる。そのようなモジュレーションは、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターを利用することによりアッセイする。
生理学的条件のもとでは、bbc3遺伝子はbbc3遺伝子プロモーターの制御下にある。当業者であれば、bbc3遺伝子プロモーターは、主にbbc3遺伝子の上流に位置するDNA配列を含むが、またbbc3遺伝子を含んでなるエキソン同士の間に存在するイントロン内、ならびにbbc3遺伝子翻訳停止部位の下流の配列内に見出される領域も含みうることを理解するであろう。本発明の方法のそれぞれにおいて利用するヒトbbc3遺伝子プロモーターの好適な一部分が同定された。それらは、配列番号１に記載した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記載した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記載した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドを含む。
しかし、ヒトbbc3遺伝子のプロモーターと相同的なポリヌクレオチドを有する任意の種のbbc3遺伝子プロモーターを本発明の方法において利用してもよいし、それと相同的なポリヌクレオチドを利用してもよい。あるいは、bbc3遺伝子プロモーターは、上述の配列と同一または相同的であって、天然プロモーターと比較して改変された活性を有するように設計した合成プロモーターであってもよい。
ポリヌクレオチドがBH3ドメインを含有するポリペプチドをコードしかつbbc3遺伝子に対して実質的な配列同一性を示す場合には、そのポリヌクレオチドはbbc3遺伝子と「相同的」である。ポリヌクレオチドは、それらがbbc3遺伝子またはその相同体の発現を指令することができるポリヌクレオチドをコードする場合には、そのポリヌクレオチドはbbc3遺伝子プロモーターと「相同的」である。遺伝子および該プロモーターの両方の相同体については、それらの活性は、それらが基づく野生型配列と定量的に類似したり同じであったりする必要はない。相同的ポリペプチドのBH3ドメインはBbc3タンパク質のBH3ドメインと同一である必要はないが、Bbc3タンパク質BH3ドメインに対して実質的な配列同一性を有しうる。
２つのポリヌクレオチドは、それら核酸またはその相補鎖を適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適にアラインしたときに、それらを比較して、ヌクレオチドの少なくとも約60％、ヌクレオチドの通常は少なくとも約70％、さらに通常は少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、そしてさらに好ましくは少なくとも約95〜98％において同一であれば、「実質的な配列同一性」を共有する。あるいは、第１のポリヌクレオチドが選択的ハイブリダイゼーション条件のもとで第２のポリヌクレオチドとハイブリダイズするであろうとき、第１と第２のポリヌクレオチドの間には実質的な配列同一性が存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、ハイブリダイゼーションが無作為ではなくある程度の特異性をもって起こるときに存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、ひとつながりの少なくとも約14ヌクレオチドにわたって少なくとも約55％、好ましくは少なくとも約65％、さらに好ましくは少なくとも約75％、そして最も好ましくは少なくとも90％の同一性があるときに起こりうる。例えば、Kanehisa, Nuc. Acids Res., 12:203-213 (1984)を参照すること。
当業者は、本発明の方法において使用するためのbbc3遺伝子プロモーターを単離しかつ調製する方法を理解するであろう。例えば、bbc3遺伝子プロモーターは、bbc3遺伝子を発現することが知られている細胞から単離したゲノムDNAを１以上の制限酵素で処理することにより、単離することができる。次いでそのゲノムDNA断片を、bbc3遺伝子プロモーターとして機能することが知られている配列、またはbbc3遺伝子のプロモーターとして作用する能力を試験すべき配列に接するように予め特定されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）で処理し、そしてPCR産物を単離することができる。
本発明の方法で使用するために選択されるbbc3遺伝子プロモーターは、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子と機能しうる形で連結されている。用語「機能しうる形で（operably）」とは、遺伝子の発現が、少なくとも、本方法で使用するプロモーターの制御下にあることを意味する。
本発明の方法は、bbc3遺伝子それ自身またはレポーター遺伝子を用いて実施することができる。bbc3遺伝子を使用する場合には、bbc3 mRNAの発現の変化、Bbc3タンパク質の発現の変化、または細胞死を誘導するBbc3の能力の変化によって示される、アポトーシスをモジュレートする候補化合物の能力について、該候補化合物をスクリーニングする。
当業者は、本発明の方法において、多数のレポーター遺伝子のうちの任意のものを、bbc3遺伝子の代わりに、またはそれと一緒に利用できることを理解するであろう。好ましくは、選択されたレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現レベルに変化があるかどうかの簡単な定性分析を可能にするものである。好ましいレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ酵素をコードする遺伝子、アルカリホスファターゼ酵素をコードする遺伝子、β-ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
bbc3遺伝子と機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドは、両方のエレメントをプラスミド発現ベクター中に挿入することによって作ることができる。例えば、bbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列を、制限酵素とリガーゼを利用してプラスミド発現ベクターのマルチクローニングサイト中に挿入すればよい。次いでbbc3遺伝子をコードするcDNAを、bbc3遺伝子プロモーターの下流に挿入することができる。
同様に、レポーター遺伝子構築物と機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを、bbc3遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を用いて作ることができる。
２以上の遺伝子が、２つの別々の遺伝子または２つの遺伝子が一緒になって融合したもののいずれかとして、発現ベクター中に含まれていてもよい。
本発明の方法で利用しうる細胞は、DNAの外来断片をトランスフェクトしてmRNAを発現させることができる任意の型の原核細胞または真核細胞であってよい。好ましくは、哺乳動物細胞を利用する。構築後、発現ベクターを、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、およびリポソームトランスフェクションなどの当業者には公知の任意の手段を用いて、選んだ細胞系中にトランスフェクトする。
あるいは、bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含有する細胞系は、bbc3ゲノム遺伝子座（19番染色体上に位置する）中に、相同組換えによってレポーター遺伝子を「ノックイン」することにより、作製してもよい。レポーター遺伝子などの選択した遺伝子をノックインする方法は周知である（例えば、Hu-Liら, Immunity 14:1-11 (2001)を参照）。そのようなノックイン手法により作製した細胞系は、bbc3調節配列の全てを保持しうる。
bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現は、遺伝子の発現を解析するための任意の方法で確認することができる。確認には、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子が発現しているかどうか、および／またはbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現レベルが変化したかどうかの、定性的確認を含む。確認はまた、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の相対的または正確な発現レベルを確認する定量アッセイも含む。発現のいかなる指標を用いてもよいが、好ましくは、確認はbbc3 mRNA、レポーター遺伝子mRNA、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することによって実施する。
bbc3遺伝子mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAについてアッセイすることによって実施される確認は、細胞の培養物を調製し、そして、bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子をコードする発現ベクターを用いて、細胞の第１の一部分をトランスフェクトすることにより実施することができる。対照として、並行して、同じ培養物から得た細胞の第２の一部分を、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子を欠いた「空」の発現プラスミドベクターを用いてトランスフェクトする。次いで、両方の細胞培養物を候補化合物によって処理する。続いて、mRNAを２つの細胞培養物から単離し、相対レベルを比較し、それによりbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認する。
Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質についてアッセイすることにより実施される確認は、mRNAについて上述したようにして実施することができるが、タンパク質は２つの細胞培養物から単離し、ウェスタンブロット解析によるなどして相対レベルを比較する。ウェスタンブロット解析はBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質を認識する抗体を用いて実施することができる。さらに、インフルエンザヘマグルチニンHAタグまたはFLAGタグなどのエピトープタグを、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子に連結してもよく、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を、抗HAまたは抗FLAG抗体を用いて確認することができる。
当業者はまた、Bbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質を認識する抗体を製造する方法も理解するであろう。そのような抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体はいずれのクラスまたはサブクラスのものであってもよく、全抗体、抗体のフラグメント、異なる２種由来のキメラ抗体、ヒト化抗体、または候補化合物と結合することができるその他の任意の型の抗体であってもよい。抗HAおよび抗FLAG抗体は市販されている。
相対タンパク質レベルはまた、選択される特定のレポーター遺伝子によっては、培養細胞を溶解させることなく決定することもできる。例えば、大腸菌（E. coli）β-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミド発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞中のβ-ガラクトシダーゼの発現の程度は、β-ガラクトシダーゼELISA（Boehringer Mannheim）により、製造業者の推奨に従って決定することができる。また、レポーター遺伝子の活性の程度は、X-galを用いて染色した後のβ-ガラクトシダーゼを発現する青色細胞を、顕微鏡下で可視スコアリングにより決定することができる。
そのようなアッセイにおいて、細胞の培養物から得た細胞の第１の一部分を、bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトする。対照として，並行して、同じ培養物から得た細胞の第２の一部分を、β-ガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝子インサートを欠いた「空」の発現プラスミドベクターを用いてトランスフェクトする。次いで両方の細胞培養物を候補化合物を用いて処理し、レポーター遺伝子の発現を測定して比較する。
分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）アッセイシステムを製造業者（Clontech、Palo Alto、CA）の推奨に従って使用することができる。ルシフェラーゼ酵素、CAT酵素、および他の適当なレポーター遺伝子の利用は、Sambrook, J.ら, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Vol.3, pp.17.30-17.47 (2001)に十分説明されている。
以上考察したように、bbc3遺伝子のアップレギュレーションはその遺伝子を含有する細胞におけるアポトーシスの誘導を生じる。結果として、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法はまた、bbc3遺伝子発現の効果に基づいて確認することもできる。例えば、bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞の数を、候補化合物に曝した後で測定すると、正常細胞集団と比較して、その細胞数は安定なままであるか、増加しているか、または減少している。対照細胞と比べた試験細胞のアポトーシス特性における変化は、恐らくbbc3遺伝子の発現における変化によるものと思われる。従って、２つの細胞培養物中の細胞数の測定は、本発明の方法の確認ステップとなる。
細胞死またはアポトーシスの程度は、Sellers, J. R.ら, J. Immunol. Meth. 172:255-264 (1994)および同書に引用された参考文献；Telford, W. G.ら, J. Immunol. Meth. 172:1-16 (1994)および同書に引用された参考文献；Poirier, J., 編, 「Apoptosis Techniques and Protocols（アポトーシス技術およびプロトコル）」, Humana Press, Totowa, N. J. (1997)に記載の方法などの様々な方法により確認することができる。これらの方法としては、アネキシンV結合アッセイ、DNA断片化アッセイ、カスパーゼの活性化を検出するアッセイ、および位相差顕微鏡下で生存細胞の直接可視スコアリングが挙げられる。間接的アッセイとしては、チミジン取り込みアッセイによる細胞生存度の測定、またはテトラゾリウム塩MMT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー）の切断に基づくアッセイが挙げられる。
そのようなアッセイにおいては、細胞培養物から得た細胞の第１の一部分を、bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトする。対照として、並行して、同じ培養物から得た細胞の第２の一部分を、bbc3遺伝子を欠いた「空」の発現プラスミドベクターを用いて、トランスフェクトする。次いで両方の細胞培養物を候補化合物を用いて処理し、細胞死を誘導するBbc3の能力を測定する。アポトーシス活性の変化、すなわち、アポトーシスの阻害または誘導は、bbc3遺伝子を用いてトランスフェクトした前記の一部分の細胞におけるアポトーシス活性の程度を、対照細胞において検出されるアポトーシス活性の程度と比較することにより検出することができる。
従って、候補化合物のモジュレート活性、すなわち、アポトーシス活性の阻害または誘導は、bbc3遺伝子をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞培養物の一部分において示されるアポトーシス活性の相対レベルを、空のベクターを用いてトランスフェクトした同じ細胞培養物の第２の一部分（対照細胞）と比較して測定することにより、検出することができる。
本方法は上記の３ステップであってもよいし、またはさらなるステップを含んでもよい。例えば、本発明の方法は、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を、１以上のアポトーシス誘導物質またはアポトーシスインヒビターに曝すステップを含んでもよい。本発明の方法に用いる成分およびこの方法の目的に基づいて、この方法のいずれかの時点で、例えば、細胞を候補化合物に曝す前に、細胞を候補化合物に曝した後に、または細胞を候補化合物に曝すと同時に、該細胞を１以上の誘導物質またはインヒビターに曝してもよい。
誘導物質またはインヒビターは、上記の化合物、ならびに記載してないその他の化合物および将来同定されるはずのその他の化合物のうちの任意のものであってよいし、または上記の任意の化合物が不在であってもよい。例えば、１以上の誘導物質またはインヒビターは増殖因子であってもまたは増殖因子の不在であってもよい。また、好ましくは、１以上の誘導物質またはインヒビターはDNA損傷薬剤、グルココルチコイド、p53またはキナーゼインヒビターである。
当業者は誘導物質またはインヒビターの量を容易に決定することができるが、一般的に、無処理の対照培養物と比較して、誘導物質もしくはインヒビターを適用した細胞培養物において生じる、bbc3遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現レベルにおける明確な差異、またはアポトーシスにおける明確な差異のいずれかをもたらす量でなければならない。
アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する好ましい方法
上記のアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法の好ましいバージョンは、候補化合物に曝す前に培地からの血清の付加および／または撤収を介して、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の活性がダウンレギュレートまたはアップレギュレートされる細胞を利用する。
第１の好ましい方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(e)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。発現の変化は候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示すものである。
この方法は、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を血清に曝すことにより、最初にbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現がダウンレギュレートすることを可能にする。血清を除去すると、実施するアッセイで選択されたbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子のアップレギュレーションが起こる。従って、候補化合物がbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子をダウンレギュレートするのが理想的であり、そしてこの方法はアポトーシスの阻害を介してアポトーシスをモジュレートする化合物を同定するために利用される。
第２の好ましい方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性を阻害することが公知の化合物に曝すステップ、(e)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(f)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。発現の変化は候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示すものである。
この方法は、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を血清に曝すことにより、最初にbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現がダウンレギュレートすることを可能にする。血清を除去すると、実施するアッセイで選択されたbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子のアップレギュレーションが起こる。その細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性の公知のインヒビターに曝すと、遺伝子のダウンレギュレーションが起こる。従って、候補化合物はbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子をアップレギュレートするのが理想的であり、そしてこの方法はアポトーシスの誘導を介してアポトーシスをモジュレートする化合物を同定するために利用される。
当業者であれば、これらの両方の方法で使用する培地は、本方法を利用するために選択される細胞型に依存することを理解しうる。本方法で使用する血清は、選択した細胞型を培養するために一般的に使用されるいずれの型の血清であってもよい。同様に、培地で使用する血清濃度は、一般的に選択した細胞型を培養するのに使用する濃度である。胎児ウシ血清、新生児子ウシ血清、子ウシ血清およびヒト血清を利用することができる。
別に示さない限り、好ましい方法に対するそれぞれの用語、成分およびステップは、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する一般的方法に対して上に記載したものと同じである。
上記のそれぞれの方法を利用して、アポトーシスをモジュレートする化合物を、アッセイに使用されるbbc3遺伝子プロモーターに直接接触することにより同定することができる。しかしまた、Bbc3タンパク質の機能の上流および下流の両方において、bbc3遺伝子が関わるアポトーシス経路の成分と相互作用する化合物を同定することもできる。本方法を利用して、細胞のアポトーシスをダウンレギュレートする化合物、ならびに細胞のアポトーシスをアップレギュレートする化合物を同定することができる。
bbc3は、複数の細胞死シグナル伝達経路による転写調節を受けると思われるので、本発明の方法を利用して複数の様々な細胞死シグナル伝達経路に影響を与える化合物を同定することができる。
bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法
本発明の他の３つの方法は、これらがbbc3遺伝子の発現をモジュレートする化合物を同定する方法であることを除くと、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する上記の方法に類似している。
bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する第１の方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。遺伝子の発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す。
上記に記載したアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する第１の方法のように、bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定するこの方法にも、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を最初にダウンレギュレートするかまたはアップレギュレートすることを特徴とする好ましい実施形態がある。
第１の好ましいbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(e)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す。
この方法は、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を血清に曝すことにより、最初にbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを可能にする。血清を除去すると、実施するアッセイで選択されたbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子のアップレギュレーションが起こる。従って、候補化合物がbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子をダウンレギュレートするのが理想的であり、そしてこの方法は、そのような発現の阻害を介してbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定するために利用される。
第２の好ましいbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、(b)上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、(c)上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、(d)上記細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性を阻害することが公知の化合物に曝すステップ、(e)上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および(f)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す。
この方法は、bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を血清に曝すことにより、最初にbbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを可能にする。血清を除去すると、実施するアッセイで選択されたbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子のアップレギュレーションが起こる。その細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性の公知のインヒビターに曝すと、遺伝子のダウンレギュレーションが起こる。従って、候補化合物がbbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結された遺伝子をアップレギュレートするのが理想的であり、そしてこの方法は、そのような発現の誘導を介してbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定するために利用される。
第４のbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法においては、上記方法は、(a)bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を提供するステップ、(b)上記組成物を候補化合物に曝すステップ、および(c)上記bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなる。発現の変化は候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す。
この方法を利用してbbc3遺伝子発現を阻害する化合物とbbc3遺伝子発現を誘導する化合物の両方を同定することができる。好ましくは、この方法は、in vitro転写アッセイによるような、無細胞またはin vitro環境において実施する。
in vitro転写アッセイは、哺乳動物細胞または組織から得た核抽出物を用いて、定量PCR、プライマー伸長分析、または放射性ATP、UTP、CTPまたはGTPの組み込みにより、bbc3遺伝子プロモーターが指令する転写を測定することによって実施することができる。in vitro転写アッセイについてのそのような方法は、M. Careyら, 「Transcriptional Regulation in Eukaryotes: Concepts Strategies and Techniques（真核生物における転写調節：概念計画と技術）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY, Chapter 14, 「Crude and Fractionated Systems for In Vitro Transcription（in vitro転写のための粗および分画系）」, pp.505-579 (2000)に記載されている。
別に示さない限り、それぞれの用語、成分およびステップは、アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法について上記に記載したそれらと同じである。
bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法
本発明はまた、bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法を含む。本方法は、(a)bbc3遺伝子プロモーターを提供するステップ、(b)プロモーターを候補化合物と接触させるステップ、および(c)プロモーターと候補化合物との間の相互作用を検出するステップを含んでなり、それによりbbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する。
bbc3遺伝子プロモーターと候補化合物の間の相互作用の「検出」は、当業者に周知の様々な方法により実施することができる。好ましくは、上記検出は、候補化合物を認識して結合する抗体を用いて実施するか、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施するかまたはゲル遅延分析により実施する。
抗体を用いて実施する検出は、限定されるものでないが、ウェスタンブロット分析および免疫沈降を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して実施する検出は、アッセイされるbbc3遺伝子プロモーターが候補化合物と結合してPCR反応系に含まれるポリメラーゼを妨害したことを、PCR産物の欠如により示すことができる簡単なアッセイであってもよい。この方法において、PCRを利用しうる他の手段は当業者には容易に明らかであろう。
ゲル遅延分析により実施する検出は、候補化合物がアッセイされるbbc3遺伝子プロモーターと結合することを示す。その理由は、ゲルに適用された候補化合物とプロモーターを含むサンプルは、プロモーターを単独で含有する対照サンプルよりゲル系を遅く移動することによる（Sambrook, J.ら, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Vol.3, pp.17.13-17.16 (2001)）。
本発明の方法は無細胞系でも実施しうるが、好ましくはbbc3遺伝子プロモーターを細胞においてアッセイし、細胞を候補化合物と接触させる。
別に示さない限り、それぞれの用語、成分およびステップはアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法について上記に記載したそれらと同じである。
アポトーシスをモジュレートする方法
本発明はまた、アポトーシスをモジュレートする方法も含む。その方法は、(a)bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および(b)上記細胞を、上記に考察したアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法のいずれかで同定した化合物と接触させるステップを含んでなる。
この方法によるいずれの程度のアポトーシスのモジュレーションも意図しており、好ましくは、そのモジュレーションは細胞のアポトーシスを阻害または誘導する。
bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法
同様に、本発明はまた、bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法も含む。本方法は、(a)bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および(b)上記細胞を、上記に考察したbbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法のいずれかで同定した化合物と接触させるステップを含んでなる。
この方法によるいずれの程度のbbc3遺伝子発現のモジュレーションも意図されていて、好ましくは、そのモジュレーションはbbc3遺伝子発現を阻害または誘導する。
別に示さない限り、それぞれの用語、成分およびステップはアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法について上記に記載したそれらと同じである。
化合物を作製する方法
本発明はまた、アポトーシスのモジュレーターを作製する方法を含む。本方法は、(a)本明細書に記載のアポトーシスのモジュレーターを同定する方法のいずれかを実施して、それによりアポトーシスのモジュレーターである化合物を同定するステップ、および(b)上記化合物を製造するステップを含んでなる。
同様に、本発明は、bbc3遺伝子発現のモジュレーターを作製する方法を含む。本方法は、(a)本明細書に記載のbbc3遺伝子発現のモジュレーターを同定する方法のいずれかを実施して、それによりbbc3遺伝子発現のモジュレーターである化合物を同定するステップ、および(b)上記化合物を製造するステップを含んでなる。
別に示さない限り、それぞれの用語、成分およびステップはアポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法について上記に記載したそれらと同じである。
化合物
本発明はまた、本明細書に記載のいずれかの方法により同定した化合物にも関する。
プロモーター
最後に、本発明は単離された核酸分子を含む。好ましくは、核酸分子は配列番号１の塩基1-2099のポリヌクレオチド配列、配列番号１の塩基1168-2099のポリヌクレオチド配列、および配列番号１の塩基1934-2099のポリヌクレオチド配列である。
単離された核酸分子はまた、配列番号１の塩基1-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチド、配列番号１の塩基1168-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチド、および配列番号１の塩基1934-2099のポリヌクレオチド配列と相同的なポリヌクレオチドであってもよい。用語「相同的な」の意味は上記に記載の通りである。
実施例１：新規BH3オンリー、プロアポトーシスタンパク質の発見
酵母ツーハイブリッド相互作用スクリーニングを、Bcl-2をベイト（bait）として用いて実施し、Bcl-2と結合する細胞タンパク質を同定した。３つの強い相互作用を有するクローンのクラスを、ヒトリンパ球cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより単離した：２つはBikおよびBad、すなわち先に同定されたBcl-2と結合するBH3オンリータンパク質をコードするcDNAクローンであったが、第３は新規遺伝子であり、Bcl-2結合成分３（Bcl-2 binding component 3）に因んでbbc3と名付けた。このbbc3 cDNA配列は元来、1997年にGenBankに寄託（受託番号U82987）されたが、その際、正しいBbc3オープンリーディングフレームと比較して＋１レジスターで推定したアミノ酸配列の注釈が付けられた。
Bbc3は、ツーハイブリッドアッセイにおいて、Bcl-2が関係する細胞死サプレッサー、Bcl-xLと相互作用するが、プロアポトーシスタンパク質BikおよびBakと相互作用しないことを見出した。bbc3 cDNAは、候補BH3ドメインを有し、Egl-1およびBadと最も高い類似性を共有する193アミノ酸のタンパク質（図1A）をコードする。より高度に保存されるコアBH3残基に直ぐ隣接する複数の残基がBbc3とEgl-1において同一である（図1B）。マウスBbc3は、BH3領域内の完全な保存を含めて、ヒトBbc3と90％を超える全体アミノ酸同一性を共有する。
Bbc3はBH3オンリータンパク質を規定する機能的特性を示すことを見出した。免疫蛍光および細胞分画研究は、Bbc3が、他のBH3オンリータンパク質に記載されているように（Huang, D. C.ら, Cell 103:839-42 (2000)）、ミトコンドリア膜に局在化することを実証した。一過的にトランスフェクトした細胞において、Bbc3のHAエピトープタグ付き型（図2A）をFlagエピトープタグ付きBcl-xLとともに免疫共沈降し、Bbc3が哺乳動物細胞においてBcl-xLと結合しうることを確証した。
トランスフェクトした細胞（図2A）およびin vitroの両方において、Bbc3のBH3ドメイン内の３個の保存残基のアラニン置換（HA-Bbc3ala）またはBH3内の10個のアミノ酸欠失（HA-Bbc3ΔBH3）は、Bbc3のBcl-xLと結合する能力を破壊した。競合結合アッセイは、Bbc3 BH3ドメインを包含する20アミノ酸合成ペプチド（残基133〜152）が、組換えGST-Bcl-xLとin vitroにおいて、先に特性決定したBak BH3ペプチド（Zhou, X. M.ら, J. Biol. Chem. 275:25046-51 (2000)）と比較しうるアフィニティで結合することを実証した（図2B）。従って、Bbc3のBH3ドメインはBcl-xLとの結合にとって必要であると共に十分である。
先に特性決定したBH3オンリータンパク質は、少なくとも部分的にそれぞれのBH3ドメインに依存するプロアポトーシス活性を示す（Huang, D. C.ら, Cell 103:839-42 (2000)）。Bbc3のアポトーシスを誘導する能力を試験するために、タグ無しおよびFlagエピトープタグ付きBbc3（FT-Bbc3）発現プラスミドを、β-ガラクトシダーゼマーカープラスミドと共にRat-1細胞中に、一過的に同時トランスフェクトした（図2C）。Bbc3は、このアッセイにおいて著しく強力な細胞死促進活性を示し、対照プラスミド（pcDNA3/CAT）について観察された400〜500のβ-galマーク付き細胞と比較して、トランスフェクション後24時間にβ-galマークした細胞のほとんど完全な消失を検出した（図2C）。BH3ドメイン残基の欠失は、Bbc3の細胞死滅活性を低減したが、完全に消失しなかった（FT-Bbc3-ΔBH3）（図2C）。また、BH3領域（残基136-185）の50 アミノ酸を含んでなるBbc3の末端切断型も有意なプロアポトーシス機能を保持した（FT-BH3/50）（図2C）。本アッセイにおけるBbc3のプロアポトーシス活性は、カスパーゼ-9またはBcl-xLのドミナントネガティブ型を高モル比にて用いる同時トランスフェクションにより抑制することができた（示してない）。Bbc3のBH3依存性二量体化とプロアポトーシス活性は、一緒に、Bbc3が先に特性決定したBH3オンリータンパク質と機構的に類似の様式で機能することを示す。
実施例２：bbc3 mRNAレベルはDNA損傷およびp53により誘導される
bbc3の活性が転写制御のもとにあるかどうかを評価するために、新しいmRNA／タンパク質合成に関わる見込みのあるアポトーシス刺激に応答するbbc3の発現を試験した。マウスNIH3T3細胞をDNA損傷薬エトポシドに曝すと、アポトーシス発生前に、bbc3 mRNAレベルを急速に誘導した（図3A）。
マウス繊維芽細胞においてエトポシドおよび他のDNA損傷薬により誘導される細胞死は、少なくとも部分的に、p53腫瘍サプレッサーが介在する（Levine, A. J., Cell 88:323-31 (1997)；Vousden, K. H., Cell 103:691-4 (2000)）。従って、p53がbbc3 mRNAレベルを誘導するのに十分であるかどうかを、条件付きp53機能をもつ細胞系を用いて確認した。野生型p53活性は、p53-エストロゲン受容体融合タンパク質を発現するE1a/Ras形質転換p53-/-マウス胚繊維芽細胞への4-ヒドロキシ-タモキシフェン（4-OHT）の添加により特異的に誘導することができる（Vater, C. A.ら, Oncogene 13:739-48 (1996)）。これらの細胞の4-OHTへの曝露によるp53の活性化は、細胞死発生前にbbc3 mRNAレベルを誘導するのに十分であった（図3B）。
第２の細胞系、マウスM1p53ts細胞は、温度感受性突然変異体p53を発現し、37℃で不活性であるが、32℃で野生型コンフォメーションおよび活性を有すると想定される（Yonish-Rouach, E.ら, Nature 352:345-7 (1991)）。bbc3 mRNAレベルは、32℃への温度シフトによる野生型p53活性化後に有意に誘導された（図3C）。M1細胞においてp53により誘導されるアポトーシスを抑制するIL-6（Yonish-Rouach, E.ら, Nature 352:345-7 (1991)）は、32℃にてbbc3 mRNAの誘導を阻止しなかった（図3C）。従って、野生型p53は、bbc3を誘導するのに十分であることを示したので、bbc3レベルの上昇は細胞死、それ自身の発生に対する応答でない。
実施例３：bbc3はp53の直接転写標的である
p53によるbbc3 mRNAの急速な活性化を考慮して、p53がbbc3遺伝子プロモーターに直接作用するかどうかを確認した。bbc3 cDNAを草案のヒトゲノム（draft human genome）配列と比較すると、bbc3遺伝子が染色体19上の４つのエキソンからなることがわかった（受託番号AC008532）。bbc3遺伝子を包含するP1ゲノムDNAクローンを単離し、エキソン１をコードするDNAセグメントおよびエキソン１の直ぐ5'の配列を、サブクローニングおよびDNA配列分析により特性決定した。注目すべきこととして、p53に対して規定されたコンセンサスDNA結合部位（el-Deiry, W. S.ら, Nat. Genet. 1:45-9 (1992)）と優れた一致をするDNA配列モチーフを、bbc3 cDNAの5'末端の150bp上流に同定し（図4A）、そしてこれはマウスbbc3ゲノム遺伝子座に保存されている（受託番号AC073741）。
この候補bbc3遺伝子プロモーター領域がp53によりトランス活性化されるかどうかを試験するために、bbc3エキソン１の直ぐ5'のDNA配列の2.0、0.9または0.17kbのいずれかを包含するゲノムDNAセグメント（図4A）をプロモーターを持たないルシフェラーゼレポーターベクター、pGL3中にサブクローニングした。予想p53結合部位エレメントを含有するこれらの構築物のそれぞれは、p53欠失Saos-2細胞において、野生型p53をコードするプラスミド（図4B）との同時トランスフェクションにより強くトランス活性化された。トランス活性化機能を欠く突然変異体p53を発現するプラスミドとの同時トランスフェクションでは、トランス活性化が検出されなかった（図4B）。
推定p53結合部位がp53によるbbc3遺伝子プロモーターのトランス活性化に介在するかどうかを確認するため、４つの単一ヌクレオチド置換突然変異を導入して、その潜在的なp53による認識を消失させた（図4Aに示す）。未改変p53結合部位をもつ0.9kb bbc3遺伝子プロモーター領域は強くトランス活性化されたが、突然変異部位を有する同じ0.9kb領域は野生型p53（pGL3/0.9mut）によりトランス活性化されなかった（図4C）。
これらの結果は、bbc3が、bbc3遺伝子プロモーター領域内のp53結合部位を介するp53トランス活性化の直接標的であることを実証した。
実施例４：グルココルチコイド処理および血清欠乏もBbc3を誘導する
p53が介在しない細胞死経路を含む広範囲のアポトーシス刺激がbbc3発現を調節しうることを示した。一次マウス胸腺細胞において、電離放射線への曝露はp53依存性経路を介してアポトーシスを引き起こしたが、グルココルチコイドデキサメタゾンによる処理はp53非依存性経路を介して急速な細胞死を誘導した（Lowe, S.W.ら, Nature 362:847-9 (1993); Clarke, A. R.ら, Nature 362:849-52 (1993)）。bbc3は直接p53標的であるという本発明者らの知見と一致して、胸腺細胞のγ線照射は、先に特性決定されたp53標的ei24（Gu, Z.ら, Mol. Cell. Biol. 20:233-41 (2000)）、bax（Miyashita, T.ら, Cell 80:293-9 (1995)）、およびp21（el-Deiry, W. S.ら, Cell 75:817-25 (1993)）に対するmRNAと平行して、bbc3 mRNAを誘導した（図5A）。意味深いことに、胸腺細胞のデキサメタゾンによる処理もbbc3 mRNA発現を誘導し、他のp53標的遺伝子とは極めて対照的であった(図5A)。このように、bbc3 mRNAレベルは同じ細胞型において、p53依存性およびp53非依存性細胞死経路の両方により誘導することができる。
血清の欠乏は、多くの培養腫瘍細胞系にとって強いプロアポトーシス刺激となり、細胞死を引き起こすかまたは他のアポトーシス刺激に対して細胞を感作する。従って、bbc3 mRNA発現およびBbc3タンパク質レベルに与える血清欠乏の効果も、組換えヒトBbc3に対して産生したモノクローナル抗体を用いて試験した。機能性p53を欠く細胞系を含む複数のヒト腫瘍細胞系において、血清欠乏が起こると、Bbc3タンパク質レベルの著しい増加が観察された（図5B）。広いスペクトルのカスパーゼインヒビター、z-VADを血清飢餓Jurkat細胞に加えると、カスパーゼ基質、PARPの切断を阻止するがBbc3タンパク質レベルの誘導に影響を与えなかった（図5C）。従って、Bbc3の誘導は、カスパーゼ活性化に優先し、細胞死プログラムの約束に対する単なる応答でない。
ヒト大腸癌細胞系HT29においては、血清撤収後24時間に、Bbc3タンパク質レベルの劇的な増加が観察された（図5D、上側パネル）。これらの細胞において、血清撤収後４時間内にBbc3タンパク質レベルの上昇は観察されたが、試験したBax、Bcl-xL、Bak、BidおよびBadを含む他のBcl-2およびBH3オンリー ファミリーメンバーのレベルは血清撤収によって誘導されなかった（示してない）。bbc3 mRNAレベルの協調的な変化が観察され（図5D、下側）、血清欠乏によるBbc3発現の上昇は主に転写レベルで起こることを示唆した。
さらに、増殖因子がbbc3発現を制御する機構を規定するために、bbc3遺伝子プロモーター領域が直接、血清欠乏に応答するかどうかを確認する試験を行った。bbc3遺伝子プロモーター／ルシフェラーゼレポーター構築物を、血清の存在または不在のいずれかのもとで培養した、トランスフェクトしたHeLa/Bcl-xL細胞におけるそれらの活性について試験した。これらの実験でHeLa/Bcl-xL細胞を用いたが、その理由は、それらが相対的に高いトランスフェクション効率を有し、かつBcl-xL発現がさもなくば血清撤収後に起こる高レベルの細胞死を防止するからであった。2.0kbおよび0.9kbのbbc3遺伝子プロモーター領域を含有するルシフェラーゼレポーター構築物は両方とも、トランスフェクトした細胞を無血清条件で培養すると、有意に活性化された（図5E）。対照的に、pGL3/SV40プロモーター対照ルシフェラーゼ構築物の活性は、血清の不在のもとで有意に低下し、血清欠乏に対するプロモーターのより典型的な応答を表した。bbc3遺伝子プロモーター領域のp53結合部位の突然変異は血清撤収による活性化を防止せず（pGL3/0.9mut；図5E）、この効果はp53を必要としないことを立証した。
これらの知見は、bbc3遺伝子プロモーター領域が血清欠乏に応答して活性化されることを示し、かつ増殖因子がbbc3遺伝子発現を転写レベルで制御する確証を与える。
実施例５：抗アポトーシス活性をもつ増殖因子はBbc3発現を抑制する
血清撤収により起こるHT29細胞中のBbc3の増加は「可逆的」であって、Bbc3タンパク質レベルは血清の再添加後24時間に顕著に低下し（図6A、上側パネル）、これはbbc3 mRNAレベルの変化と相関があった（図6A、下側パネル）。
Bbc3 発現に対して血清の影響があることから、特定の増殖因子の添加がBbc3レベルを抑制するのに十分であるかどうかを確認するさらなる試験を行った。広い抗アポトーシス活性をもつ増殖因子、IGF-1またはEGFのいずれかの添加も、血清飢餓HT29細胞におけるBbc3タンパク質発現を強く阻害したが（図6B）、BaxまたはBcl-xLに対しては影響を与えなかった。第３の増殖因子、PDGFは、本アッセイにおいてBbc3レベルを抑制しなかったが、しかし、PDGF受容体がHT29細胞において発現されたかおよびPDGFにより活性化されたかは確認されなかった。
多くの状況において、IGF-1受容体による抗アポトーシスシグナル伝達はホスファチジルイノシトール-3キナーゼ（PI-3キナーゼ）の活性化を必要とする（Dudek, H.ら, Science 275:661-5 (1997)；O'Connor, R.ら, Biochem. Soc. Trans. 28:47-51 (2000)）。PI-3キナーゼ特異的インヒビター、LY294002の添加は、血清飢餓HT29細胞におけるBbc3レベルを抑制するIGF-1の能力を損なった（図6C）。LY294002処理はまた、同じ環境におけるBbc3タンパク質レベルを抑制する血清の能力も有意に損なって（図6D）、PI-3キナーゼが血清およびIGF-1がBbc3の発現を抑制するために必要であることを示唆した。一緒に考えると、これらの結果は、強力なプロアポトーシスBH3オンリー遺伝子であるbbc3の抑制は、増殖因子受容体による抗アポトーシスシグナル伝達の重要な構成成分である可能性を生じる。
HT29細胞において、EGF受容体キナーゼインヒビターAG1478の添加は、Bbc3タンパク質発現を抑制するEGFおよび血清の能力をブロックした（図7Aおよび7B）。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MAPKK）インヒビター、PD98059、およびチロシンキナーゼインヒビター、チロホスチン（tyrphostin）AG1024も、Bbc3タンパク質発現を抑制する血清の能力を損なった（図7B）。このように、Bbc3タンパク質レベルは、細胞生存にとって重要であるシグナル伝達経路の多様な化学インヒビターに応答する。
実施例６：細胞生存シグナル伝達経路はbbc3遺伝子プロモーターの活性を制御する
さらなる実験を実施して、bbc3遺伝子プロモーターが、細胞生存に役割を果たす公知のシグナル伝達経路により調節されるかどうかを確認した。0.9kbのbbc3遺伝子プロモーター領域を含有するbbc3遺伝子プロモーター-ルシフェラーゼレポーター構築物をHeLa/Bcl-xL細胞中にトランスフェクトし、そのプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイによりトランスフェクション後48時間に測定した。上記に報じたデータ（図4E）と一致して、トランスフェクトした細胞を血清の不在のもとで培養すると、ルシフェラーゼ活性のレベルが有意に誘導された（図8A）。血清の不在のもとでのbbc3遺伝子プロモーター活性の誘導は、IGF-1の添加により実質的に低下し、IGF-1のBbc3タンパク質レベルに対する効果（例えば、図6B、6C）は転写機構を介して起こることを示唆した。血清の存在のもとで培養したトランスフェクトした細胞へのPI-3キナーゼインヒビター、Ly294002の添加は、bbc3遺伝子プロモーターの活性を誘導するのに十分であった（図8A）。従って、PI-3キナーゼ依存経路は、少なくとも部分的に、bbc3遺伝子プロモーターの活性を制御する。
PI-3キナーゼが介在する細胞生存経路の重要な下流エフェクターは、セリン／トレオニンキナーゼ、Aktである（Dudek, H.ら, Science 275:661-5 (1997)；O'Connor, R.ら, Biochem. Soc. Trans. 28:47-51 (2000)）。0.9kb bbc3遺伝子プロモーターレポーター構築物とPI-3キナーゼのドミナントネガティブ型（PI3k-DN）を発現するプラスミドとの同時トランスフェクションは、血清の存在のもとでも、bbc3遺伝子プロモーター活性を誘導するのに十分であった（図8B）。逆に、レポーターとAkt（pM-AKT）構成的活性型との同時トランスフェクションは、細胞を血清の不在のもとで培養したときに、bbc3遺伝子プロモーター活性を抑制するのに十分であった。これらの結果は、bbc3遺伝子プロモーター活性が細胞生存シグナル伝達経路に影響を与える分子に応答することを実証する。
材料および方法
bbc3 cDNAの単離
全長Bbc3オープンリーディングフレーム（受託番号U82987）をコードする1.6kb bbc3 cDNAは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングで、GAL4 DNA結合ドメイン/Bcl-2融合タンパク質およびヒトリンパ球cDNAライブラリー（Matchmaker system、Clontech）を用いて単離した。相同的ヒトEST（受託番号AI784404）の分析によりさらなる5'非翻訳配列を同定し、ノーザン分析により検出したbbc3メッセージサイズと一致する組み立てられた1.9kb cDNAを得た。マウスBbc3オープンリーディングフレームをコードするcDNAは、M1p53ts細胞由来のcDNAを用いてPCRにより単離した。
細胞系
使用した全ての細胞系は、別に記載しない限り、ATCCから得た。HeLa/Bcl-xL細胞は、Flagエピトープタグ付きBcl-xLをコードするベクターを用いて、HeLa細胞の安定トランスフェクションにより作製した。温度感受性p53-val135突然変異体（M1p53ts）を含有するマウス骨髄性白血病M1細胞、およびp53-エストロゲン受容体融合物を含有するE1A/ras形質転換p53-/-マウス胚繊維芽細胞は、先に記載されている（Vater, C. A.ら, Oncogene 13:739-48 (1996)；Yonish-Rouach, E.ら, Nature 352:345-7 (1991)）。
プラスミド構築物および細胞死アッセイ
Bbc3の非タグ付き型を発現するために、1.6kb bbc3 cDNAを、pcDNA3ベクター（Invitrogen）中にサブクローニングした。Bbc3 オープンリーディングフレームをPCRにより増幅し、アミノ末端インフルエンザヘマグルチニンタグ（HA）またはFlagエピトープタグ（FT）のいずれかを組込んで、pcDNA3中にクローニングした。オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発を用いて、アミノ酸141、144、および147におけるアラニン置換を導入し、pcDNA3/HA-Bbc3-alaプラスミドを作製した。アミノ酸141-150を欠失してpcDNA3中にBbc3-ΔBH3のHAおよびFT型の両方を作製し、そしてアミノ酸136-185をコードするbbc3セグメントをPCRにより増幅し、pcDNA3中にクローニングしてFT-BH3/50構築物を作製した。全てのBbc3構築物は、DNA配列決定により検証した。細胞生存度に対するBbc3発現の効果は、Rat-1細胞において、一過的トランスフェクションアッセイを用いて、先に記載の通り試験した（Chittenden, T.ら, EMBO J. 14:5589-96 (1995)）。
結合アッセイ
Cos7細胞をリポフェクタミン処理（Gibco/BRL）の後、HA-Bbc3およびFT-Bcl-xL発現プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトした。細胞溶解物を調製し、免疫共沈降アッセイは先に記載のように実施した（Chittenden, T.ら, EMBO J. 14:5589-96 (1995)）。Bcl-xL競合結合アッセイは先に記載（Zhou, X. M.ら, J. Biol. Chem. 275:25046-51 (2000)）のように、Bbc3の残基133-152、およびBakの残基70-89を含有する合成BH3ペプチドを用いて実施した。
Bbc3モノクローナル抗体の作製とウェスタンブロット分析
マウスモノクローナル抗体KM140を、組換えGST-Bbc3融合タンパク質に対して作製した。アレイしたオーバーラッピングBbc3ペプチド（Research Genetics）を用いてブロットをプロービングして、KM140エピトープを残基73-76へマッピングした。細胞を、血清を含有する（10％ FBS）または無血清（0％ FBS、0.1％ BSA）のいずれかの培地中に、100mmディッシュ１枚当たり3〜10 x 106個の細胞でプレーティングした。細胞溶解物を調製し、4〜20％ポリアクリルアミド還元ゲル上で電気泳動し（１レーン当たり100〜200μg）、先に記載のようにウェスタンブロットにより分析した（Chittenden, T.ら, EMBO J. 14:5589-96 (1995)）。
ノーザンブロット分析
全RNAはマウス胸腺細胞から単離した（RNeasyシステム、Qiagen）。全ての他の実験のポリ(A)+RNA（FastTractシステム、Invitrogen）を調製した。１レーン当たり10μgの全RNAまたは3μgのポリ(A)+RNAを変性し、1％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動により分離した。ノーザンブロットを標準の方法に従って実施した。
Bbc3レポーター構築物とルシフェラーゼレポーターアッセイ
ヒトP1ゲノムDNAライブラリー（Genome Systems）を5’末端bbc3 cDNA PCR産物を用いてスクリーニングし、２つのP1 bbc3ゲノムDNAクローンを得た。bbc3 cDNAの5’末端のすぐ上流の2.0kb BamHIゲノムDNA断片をサザンブロット分析により同定し、サブクローニングし、配列決定した。2.0kb断片中に存在する3'BamHI部位は、1.9kb bbc3 cDNAの5'末端の上流35bpに位置する。候補bbc3遺伝子プロモーター領域を表す2.0kb BamHI断片を、pGL3Luc-Basicルシフェラーゼレポーターベクター（Promega）中にクローニングしてpGL3/2.0を作製した。2.0kb断片内のユニークなEcoRIおよびPstI部位から0.9kb EcoRI/BamHI断片および0.17kb PstI/BamHI断片を得て、それらをpGL3Luc-Basic中にクローニングしてpGL3/0.9およびpGL3/0.17をそれぞれ作製した。オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により、ヌクレオチド置換をpGL3/0.9の推定p53結合部位中に導入してpGL3/0.9mutを作製した。
ルシフェラーゼアッセイを、Dual-Lightシステム（Tropix）を用いて実施し、ルシフェラーゼとβ-ガラクトシダーゼを組合わせて検出した。Saos-2細胞を、Superfect（Qiagen）を用いて６ウエルプレート中で、1.8μgのルシフェラーゼレポータープラスミド、および0.025μgの野生型p53または突然変異体p53-SN22/23のいずれかをコードするpRC/CMVを用いてトランスフェクトした（Lin, J.ら, Genes Dev. 8:1235-46 (1994)）。β-ガラクトシダーゼレポーターpCMVβ-gal（Promega）をトランスフェクション効率の内部対照として含んだ（0.1μg）。トランスフェクション後24時間に、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。HeLa/Bcl-xL細胞のトランスフェクションは、６ウエルプレート中で、1.8μgのルシフェラーゼレポータープラスミドおよび0.1μgのpCMVβ-galを用いて実施した。トランスフェクション後24時間に、細胞培地を20％血清を含有するDMEM、または血清を含まないDMEMのいずれかに変えて、さらに24時間のインキュベーションの後にルシフェラーゼ/β-ガラクトシダーゼレベルを測定した。全てのレポーターアッセイは、少なくとも３つの独立した実験で類似の結果を生じた。
本発明を詳細にかつ本発明の具体的な実施形態を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な改変と修飾を行いうることが当業者には明白であろう。
ヒト（hBbc3）とマウス（mBbc3）Bbc3アミノ酸配列のアラインメントならびにBH3ドメイン（影付き）、KM140抗体結合部位（線）、および非同一残基（星印）を示す。 Bbc3とその他のBH3オンリーファミリーメンバーのBH3ドメインのアラインメントを示す。Bbc3とEgl-1が共有するさらなる配列に下線を引き；BH3-ala突然変異体においてアラニンに突然変異されたBbc3残基を星印で示す。 Bbc3のBcl-xLとのBH3依存性免疫共沈降からのデータを示す。HA-Bbc3またはBbc3-BH3突然変異構築物をFT-Bcl-xLと共にCos7細胞中に同時トランスフェクトし、溶解物を抗HA抗体により免疫沈降し、そして結合したBcl-xLを抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した（左）。細胞溶解物中のタンパク質発現を抗HA＋抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットにより確認した（右）。 Bbc3 BH3ドメインがBcl-xLと結合する場合の競合結合アッセイの結果を示す。固定されたBak BH3ペプチドとGST-Bcl-xLとの結合を、示した濃度の競合する合成Bbc3 BH3またはBak BH3ペプチドの存在のもとで、ELISAにより測定した（３重サンプル＋S.D.）。 Bbc3がそのBH3ドメインを介して細胞死をトリガーすることを立証する。対照（pcDNA3/CAT）またはBbc3発現構築物をβ-ガラクトシダーゼマーカープラスミドを用いてRat-1細胞中に同時トランスフェクトした。細胞死は、トランスフェクション後24時間における、青色（β-ガラクトシダーゼ発現）細胞の数の減少により測定した（３重サンプル＋S.D.）。 bbc3 mRNAのp53による誘導を示す。ノーザンブロットをマウスbbc3 cDNAプローブを用いてハイブリダイズし、次いでアクチンプローブを用いて再ハイブリダイゼーションした。図3Aは、エトポシド（50μM）を用いた６時間処理時のNIH3T3細胞におけるbbc3 mRNAの誘導を示す。図3Bは、4-ヒドロキシ-タモキシフェン（4-OHT、100nM）を用いた５時間処理時のE1a/Ras/p53MERマウス繊維芽細胞系におけるbbc3 mRNAの誘導を示す。図3Cは、６時間、32℃への温度シフトを介しておよびまたIL-6の存在のもとでM1p53ts細胞の野生型p53機能を誘導した時の、bbc3 mRNAの誘導を示す。 bbc3遺伝子構造の模式図、およびクローニングしたbbc3遺伝子プロモーター領域のセグメントを示す。BamHI、PstIおよびEcoRIの制限酵素切断部位をそれぞれB、P、およびRにより示す。ヒト（hbbc3）およびマウス（mbbc3）bbc3遺伝子プロモーター領域中の推定p53結合部位を、コンセンサスp53結合部位、およびヒト部位中に導入した置換突然変異と一緒に示す。 野生型p53によるbbc3遺伝子プロモーターのトランス活性化の結果を示す。図4Aに示したbbc3遺伝子プロモーター領域断片をルシフェラーゼレポータープラスミド中にクローニングし、野生型p53（wt）または突然変異p53（mut）を発現するプラスミドと共にSaos-2細胞中に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性（３重で測定した）を内部トランスフェクション効率対照（β-ガラクトシダーゼ）に対して正規化した。 p53結合部位の突然変異がp53によるbbc3遺伝子プロモーターのトランス活性化を無効化することの実験的確証を示す。トランスフェクションは図4Bのように、無処置（pGL3/0.9）または突然変異（pGL3/0.9mut）p53結合部位を含有するbbc3遺伝子プロモーターレポータープラスミドを用いて、野生型p53の存在または不在のもとで実施した。 1μMデキサメタゾン（Dex）または5Gy電離放射線（γ-IR）を用いて処理した一次マウス胸腺細胞のノーザンブロット分析の結果を示す。処理後３または６時間に、RNAサンプルを調製し、bbc3およびアクチンのmRNAをノーザンブロットの逐次プロービングにより検出した（上側２パネル）。同じRNAサンプルから調製した別々のブロットをei24、bax、p21、およびアクチンに対して逐次的にプロービングした（下側４パネル）。 血清の存在または不在のもとで24時間培養した、ヒト腫瘍細胞系のBbc3タンパク質発現の免疫ブロット分析を示す。 カスパーゼ（caspase）インヒビターz-VAD（100μM）の不在または存在のもとで、24時間、血清を含まない培地中で培養したJurkat細胞からのデータを示す。Bbc3およびPARPはウェスタンブロット分析により検出した。 血清の存在のもとで（時点０）増殖し、そして血清の存在（+）または不在（-）のもとで24時間インキュベートしたHT29細胞からのデータを示す。Bbc3タンパク質はウェスタン分析（上側）により、そしてmRNA発現はノーザン分析（下側パネル）により検出した。 血清撤収によるbbc3遺伝子プロモーターの活性化から得た結果を示す。示したbbc3遺伝子プロモータールシフェラーゼレポータープラスミドをHeLa-Bcl-xL細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間に、細胞をさらに24時間、20％血清の存在（+）または血清の不在（-）の存在のもとでインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を測定し、トランスフェクション効率を正規化した。 血清がBbc3の発現を抑制することを示す。HT29細胞を１日間、血清の不在のもとで（時点０）インキュベートし、次いで血清の存在（+）または不在（-）のもとで24時間培養した。Bbc3タンパク質はウェスタンブロット、およびブロットのさらなるBax発現に対するプロービングを用いて検出し（上側２パネル）；bbc3 mRNAレベルはノーザン分析により検出した（下側２パネル）。 抗アポトーシス増殖因子がBbc3の発現を抑制することを示す。HT29細胞を血清の不在のもとで（-）１日間インキュベートし、次いで、血清、100ng/ml IGF-1、50ng/ml EGF、または25ng/ml PDGFのいずれかを含有する培地中で24時間インキュベートした。Bbc3をウェスタンブロット分析、および次いでブロットの抗Baxおよび抗Bcl-xL抗体によるプロービングにより検出した。 PI-3キナーゼ特異的インヒビターであるLY294002が、Bbc3発現を抑制するIFG-1の能力を損なうことを示す。HT29細胞を図6Bのように培養し、次いで血清、100ng/ml IGF-1、または50μM LY294002（IGF-1の１時間前に添加した）の存在下で100ng/ml IGF-1のいずれかを含有する培地中で24時間インキュベートした。Bbc3をウェスタンブロット分析により検出した。 PI-3キナーゼ特異的インヒビターであるLY294002が、Bbc3発現を抑制する血清の能力を損なうことを示す。HT29細胞を血清の存在のもとで培養し（レーン１）、次いで血清の不在のもとで、または50μM LY294002を補充した血清の存在のもとで24時間インキュベートした。 EGF受容体キナーゼインヒビターであるAG1478の添加がBbc3タンパク質発現を抑制するEGFの能力をブロックすることを示す。HT29細胞を血清の不在のもとで（-）１日間インキュベートし、次いで、血清、50ng/ml EGF、または50ng/ml EGF＋30nM AG1478のいずれかを含有する培地中で24時間インキュベートした。Bbc3をウェスタンブロット分析により検出した。 EGF受容体キナーゼインヒビターであるAG1478の添加がBbc3タンパク質発現を抑制する血清の能力をブロックすることを示す。HT29細胞を血清の存在のもとで（+）１日間インキュベートし、次いで、血清または血清なしで、または10μM PD98059、30nM AG1478、または50μM AG1024のいずれかを補充した血清の存在のもとでインキュベートした。Bbc3をウェスタンブロット分析と、続いてブロットを抗Baxを用いて再プロービングすることにより検出した。 PI-3キナーゼインヒビターによるbbc3遺伝子プロモーターの活性化の結果およびIGF-1によるbbc3遺伝子プロモーター活性の抑制を示す。pGL3/0.9 bbc3遺伝子プロモータールシフェラーゼレポータープラスミドをHeLa-Bcl-xL細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間に、細胞を、50μM LY294002を用いてまたは用いずに20％血清の存在（+）のもとで、または100ng/ml IGF-1を用いてまたは用いずに血清の不在（-）のもとでさらに24時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を測定してトランスフェクション効率について正規化した（β-ガラクトシダーゼ）。 PI-3キナーゼ/Akt経路による、bbc3遺伝子プロモーター活性の調節を示す。pGL3/0.9 bbc3遺伝子プロモータールシフェラーゼレポータープラスミドを、HeLa/Bcl-xL細胞中に、PI-3キナーゼ優性ネガティブ突然変異体（PI3k-DN）をコードするプラスミドまたはミリストイル化AKT（pM-AKT）をコードするpcDNA3プラスミドのいずれかとともに、同時トランスフェクトした。トランスフェクション後24時間に、細胞を20％血清の存在（+）または血清の不在（-）のもとでさらに24時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を測定し、トランスフェクション効率について正規化した。 ヒトbbc3遺伝子プロモーターの2.0kbのゲノムDNA配列を示す。BamHI、EcoRIおよびPstIの切断部位を示した。p53結合部位を太字で示した。
【配列表】
Figure 2005526485
Figure 2005526485

Claims (94)

  1. アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞に候補化合物を曝すステップ、および
    c. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法。
  2. 上記確認をbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施する、請求項１に記載の方法。
  3. 上記確認をBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施する、請求項１に記載の方法。
  4. 上記確認を上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する、請求項１に記載の方法。
  5. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  7. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  8. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  9. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  10. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項７、８または９に記載の方法。
  11. アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、
    c. 上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、
    d. 上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および
    e. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法。
  12. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現が上記候補化合物によりダウンレギュレートされる、請求項１１に記載の方法。
  13. 確認がbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施される、請求項１１に記載の方法。
  14. 確認がBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施される、請求項１１に記載の方法。
  15. 確認が上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施される、請求項１１に記載の方法。
  16. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  17. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
  18. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  19. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  20. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  21. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
  22. アポトーシスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、
    c. 上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、
    d. 上記細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性を阻害することが公知の化合物に曝すステップ、
    e. 上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および
    f. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がアポトーシスをモジュレートすることを示す上記方法
  23. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現が上記候補化合物によりアップレギュレートされる、請求項２２に記載の方法。
  24. 確認がbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施される、請求項２２に記載の方法。
  25. 確認がBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施される、請求項２２に記載の方法。
  26. 確認が上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施される、請求項２２に記載の方法。
  27. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  28. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項２２に記載の方法。
  29. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
  30. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
  31. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のアポトーシスの誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
  32. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項２９、３０または３１に記載の方法。
  33. bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および
    c. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法
  34. 確認をbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施する、請求項３３に記載の方法。
  35. 確認をBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施する、請求項３３に記載の方法。
  36. 確認を上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施する、請求項３３に記載の方法。
  37. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  38. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法。
  39. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項３３に記載の方法。
  40. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項３３に記載の方法。
  41. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項３３に記載の方法。
  42. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項３９、４０または４１に記載の方法。
  43. bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、
    c. 上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、
    d. 上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および
    e. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法
  44. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現が上記候補化合物によりダウンレギュレートされる、請求項４３に記載の方法。
  45. 確認がbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施される、請求項４３に記載の方法。
  46. 確認がBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施される、請求項４３に記載の方法。
  47. 確認が上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施される、請求項４３に記載の方法。
  48. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  49. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項４３に記載の方法。
  50. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
  51. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
  52. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
  53. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項５０、５１または５２に記載の方法。
  54. bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供するステップ、
    b. 上記細胞を血清の存在のもとで培養するステップ、
    c. 上記細胞を血清の不在のもとで培養するステップ、
    d. 上記細胞をbbc3遺伝子プロモーター活性を阻害することが公知の化合物に曝すステップ、
    e. 上記細胞を候補化合物に曝すステップ、および
    f. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法
  55. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現が上記候補化合物によりアップレギュレートされる、請求項５４に記載の方法。
  56. 確認がbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施される、請求項５４に記載の方法。
  57. 確認がBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施される、請求項５４に記載の方法。
  58. 確認が上記細胞の死を誘導するBbc3の能力をアッセイすることにより実施される、請求項５４に記載の方法。
  59. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  60. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
  61. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項５４に記載の方法。
  62. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項５４に記載の方法。
  63. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項５４に記載の方法。
  64. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項６１、６２または６３に記載の方法。
  65. bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を提供するステップ、
    b. 上記組成物を候補化合物に曝すステップ、および
    c. 上記bbc3遺伝子または上記レポーター遺伝子の発現を確認するステップを含んでなり、ここで発現の変化は上記候補化合物がbbc3遺伝子発現をモジュレートすることを示す上記方法
  66. 確認をbbc3 mRNAまたはレポーター遺伝子mRNAの発現を検出することにより実施する、請求項６５に記載の方法。
  67. 確認をBbc3タンパク質またはレポーター遺伝子タンパク質の発現を検出することにより実施する、請求項６５に記載の方法。
  68. 上記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ酵素、アルカリホスファターゼ酵素、β-ガラクトシダーゼ酵素およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  69. 上記bbc3遺伝子プロモーターが配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述された配列のヌクレオチド1-2099からなる群から選択されるポリヌクレオチド、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドである、請求項６５に記載の方法。
  70. 上記細胞を上記候補化合物に曝す前のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  71. 上記細胞を上記候補化合物に曝した後のいずれかの時点で上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  72. 上記細胞を上記候補化合物に曝すと同時に上記細胞を１以上のbbc3遺伝子発現の誘導物質および／またはインヒビターに曝すステップをさらに含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  73. 上記１以上の誘導物質またはインヒビターが増殖因子、増殖因子の不在、DNA損傷薬、グルココルチコイド、p53およびキナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項７０、７１または７２に記載の方法。
  74. bbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する方法であって、
    a. bbc3遺伝子プロモーターを提供するステップ、
    b. 上記プロモーターを候補化合物と接触させるステップ、および
    c. 上記プロモーターと上記候補化合物との間の相互作用を検出するステップを含んでなり、それによりbbc3遺伝子プロモーターと相互作用する化合物を同定する上記方法
  75. 上記bbc3遺伝子プロモーターが、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1934-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1168-2099、配列番号１に記述した配列のヌクレオチド1-2099、およびそれらと相同的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項７４に記載の方法。
  76. 上記検出が候補化合物を認識して結合する抗体を用いて実施される、請求項７４に記載の方法。
  77. 上記検出がポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項７４に記載の方法。
  78. 上記検出がゲル遅延分析により実施される、請求項７４に記載の方法。
  79. 上記bbc3遺伝子プロモーターが細胞内にあり、そして上記細胞を上記候補化合物と接触させる、請求項７４に記載の方法。
  80. アポトーシスをモジュレートする方法であって、
    a. bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および
    b. 上記細胞を、請求項１、１１または２２で同定した化合物と接触させ、それによりアポトーシスをモジュレートするステップを含んでなる上記方法。
  81. 上記モジュレーションがアポトーシスを阻害する、請求項８０に記載の方法。
  82. 上記モジュレーションがアポトーシスを誘導する、請求項８０に記載の方法。
  83. bbc3遺伝子発現をモジュレートする方法であって、
    a. bbc3遺伝子プロモーターと機能しうる形で連結されたbbc3遺伝子を含有する細胞を提供するステップ、および
    b. 上記細胞を請求項３３、４３、５４、６５または７４で同定した化合物と接触させ、それによりbbc3遺伝子発現をモジュレートするステップを含んでなる上記方法。
  84. 上記モジュレーションがbbc3遺伝子発現を阻害する、請求項８３に記載の方法。
  85. 上記モジュレーションはbbc3遺伝子発現を誘導する、請求項８３に記載の方法。
  86. アポトーシスのモジュレーターを作る方法であって、
    a. 請求項１、１１または２２に記載の方法を実施して、それによりアポトーシスのモジュレーターである化合物を同定するステップ、および
    b. 上記化合物を製造するステップを含んでなる上記方法。
  87. bbc3遺伝子発現をモジュレートする化合物を作る方法であって、
    a. 請求項３３、４３、５４、６５または７４の方法を実施して、それによりbbc3遺伝子発現のモジュレーターである化合物を同定するステップ、および
    b. 上記化合物を製造するステップを含んでなる上記方法。
  88. 請求項１、１１、２２、３３、４３、５４、６５、または７４に記載の方法により同定した化合物。
  89. 配列番号１の塩基1-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  90. 配列番号１の塩基1168-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  91. 配列番号１の塩基1934-2099のポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  92. 配列番号１の塩基1-2099と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  93. 配列番号１の塩基1168-2099と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  94. 配列番号１の塩基1934-2099と相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
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