JP2005519032A - 蛋白質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛋白質及びペプチドを精製する方法、さらに具体的には、シリコンカーバイドを用いる蛋白質及びペプチドの精製方法に関連する。
異種の混合物からの蛋白質の精製は、精製される蛋白質の物理的、化学的、及び電気的特性を利用する、複数段階の方法をしばしば含む。精製に関連する蛋白質の重要な特性は、(a)溶液中に維持されるか又は塩の存在下で沈殿する蛋白質の能力を決定する溶解性、(b)イオン交換クロマトグラフィ及び等電点電気泳動法に関連する重要な特性である電荷、(c)透析、ゲル濾過クロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、及び沈殿速度を含む工程に関連する大きさ、(d)リガンドへの結合に基づき蛋白質を精製させる特異的な結合、ならびに(e)抗体の沈殿のように、他の試薬の存在下、複合体を形成する能力である。蛋白質の検出及び精製は、機能的なジェノミクス及びプロテオミクスに関与する研究者が直面する問題点を考慮すると、研究活動の主要な焦点となっている。
シリコンカーバイドを蛋白質又はペプチドに結合させるために用いることにより、新規で便利な精製方法が、蛋白質及びペプチドのために提供される。封入体に隔離される組換えにより発現した蛋白質の回収及び精製の改良された方法もまた提供される。
少なくとも一つの蛋白質又はペプチドをシリコンカーバイドに結合させるため、少なくとも一つの蛋白質又はペプチドの結合pHにおいて、少なくとも一つの蛋白質又はペプチドを含む溶液をシリコンカーバイドに接触させる段階;及び
少なくとも一つの蛋白質又はペプチドをシリコンカーバイドから溶出する段階
を含む、溶液から少なくとも一つの蛋白質又はペプチドを回収する方法である。
蛋白質は、蛋白質の環境のpHの操作によりシリコンカーバイドに結合し溶出されうること、ならびに蛋白質及び/又は他の分子の混合物から関心対象の蛋白質を回収するため、溶液由来の蛋白質を濃縮するため、又は細胞溶解物のような混合物から全蛋白質を回収するための、新規、単純及び便利な方法を提供する目的でこの特性を使用することができる。ペプチドも本発明の方法により同様に精製又は回収されうる。
実施例は、本発明を説明する目的で開示されるものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
シリコンカーバイド
シリコンカーバイド1000又は1500グレードグリット(昭和電工、大阪、日本)は、ごみ及び他の外来物質を取り除くために脱イオン化された蒸留水で最低3回、洗浄され、その後、オートクレーブにより滅菌された。滅菌された材料は、必要になるまで、室温で水中に保存された。
結合溶液は、50mM酢酸ナトリウム、pH4.5〜7、又は50mMトリス、pH7〜10であった。結合溶液は2倍の濃度で調製され、蛋白質溶液と1対1の体積比で混合された。
溶出溶液は、1mM EDTA、50mMトリス、pH11〜12であった。
ウシ血清アルブミン(molecular biology grade BSA:Sigma Aldrich)の溶液を、必要なpH(pH3.5、4.0、5.5、6.0又は7.0)において、ストックBSA溶液(水を溶媒として10mg/mL)を100mM 酢酸ナトリウム緩衝液の等量で希釈することにより、様々なpHの緩衝液に調製した。シリコンカーバイドのアリコートは、シリコンカーバイドを適当なpHの酢酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄することにより、これらのpHの各々に平衡化された。
細胞培養培地における添加物として通常使用される市販のウシ血清(CanSera Toronto、ON)は、実施例1で確立された条件を用いて、ウシ血清アルブミンを精製するシリコンカーバイドの能力を示すために用いられた。
ウサギ免疫グロブリン(IgG+IgM; Jackson Laboratoriesから購入;pl 5.8〜7.3)の混合物に結合するアルカリフォスファターゼの生物学的活性は、シリコンカーバイドからの蛋白質の結合及び溶出の前後に調査された。免疫グロブリン/フォスファターゼ結合物の50μgアリコートを、pH4、5及び6において結合緩衝液と混合し、スピンカラムの0.5gのシリコンカーバイドと接触させ、溶出溶媒による溶出へと続けた。蛋白質の回収は図3に示す。
ニワトリ卵白リゾチーム(pl 10.76)のアリコートは、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5もしくは7、または50mMトリス緩衝液pH10に、1mg/mLの濃度で溶解され、実施例1に記載されるpHでシリコンカーバイドへ結合された。同じ結合緩衝液で洗浄した後、実施例1に開示されるように、蛋白質はpH12において溶出された。回収された蛋白質量は、280nm波長の分光光度的な吸光度により決定された。その結果は図5に示される。回収の最大値は、結合がpH10において行われたときに見られた。
3つの蛋白質(ウシ血清アルブミン(Sigma Aldrich)、ニワトリ卵白リゾチーム(Sigma)、及び膵臓ブタα-アミラーゼ(Sigma))を、各々、スピンカラム技術を用いて、様々なpHにおいてシリコンカーバイドに結合させた。結合量は、インプット量とフロースルーに残る蛋白質量との間の差として計算された。結合は、4から10の範囲のpHにおいて、1pHユニットの増大でなされた。結合プロファイルは図6に示される。
ニワトリ卵白リゾチーム:Genbankアクセッション番号230896;推定MW 14,313.07;理論的pl 10.76;
ブタα-アミラーゼ:Genbankアクセッション番号ALGP;推定MW 55,474.89;見かけのMW 50,000;理論的pl 5.73
様々なpHでのシリコンカーバイドとウシ血清アルブミンとの結合を、スピンカラムを用いて、カオトロープ、塩酸グアニジニウム(0.75M)の存在下又は非存在下において調査した。先に決定したように、シリコンカーバイドとBSAの結合は、pHがpH6よりも高くなった場合に、急激に低下した。対照的に、図8に示されるように、カオトロープの存在下、BSAとシリコンカーバイドの結合は、pHがpH7よりも高くなった場合に、増加した。
ポリリジン(Sigma Aldrich: MW 3,100; 約23リジン残基)及びポリアルギニン(Sigma Aldrich: MW 500; 約54アルギニン残基)は高いpl(推定pl ポリリジン 11.2、ポリアルギニン>13)を有し、広範囲のpH値においてシリコンカーバイドに結合することが見いだされた。
組換えにより発現された子ウシ胸腺リボヌクレアーゼAの精製は、シリコンカーバイドへの結合によって行われた。組換え蛋白質のplは、実施例4に記載されるように計算され、6.4であることがわかった。
スピンカラム(Axigen Scientific)はシリコンカーバイド(グリットサイズ2500)の25mgを含んで調製された。市販のBSA(Sigma)は、様々な濃度で50mM酢酸ナトリウムpH4.5に溶解され、2.5μg、5.0μg、10.0μg、15.0μg、25.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg及び150.0μgのBSAを各々含むこれらの溶液のアリコート250μlが、分離されたカラムに加えられた。カラムは、1分間、15,000×gでスピンされ、その後、同酢酸緩衝液で2回洗浄され、各々の洗浄段階で遠心分離された。カラムは25μlの100mMトリスpH12(溶出E1及びE2と示す)で2回溶出された。各々の溶出物の蛋白質の内容物は、Bio-Radプロテインアッセイ法によって決定され、全蛋白質の回収が計算された。その結果は、表1及び図12に示される。
Claims (27)
- 少なくとも一つの蛋白質又はペプチドをシリコンカーバイドに結合させるため、少なくとも一つの蛋白質又はペプチドの結合pHにおいて、少なくとも一つの蛋白質又はペプチドを含む溶液をシリコンカーバイドに接触させる段階、及び少なくとも一つの蛋白質又はペプチドをシリコンカーバイドから溶出させる段階を含む、少なくとも一つの蛋白質又はペプチドを溶液から回収する方法。
- 選択された蛋白質又はペプチドを溶液から回収する、請求項1記載の方法。
- 結合pHが、選択された蛋白質又はペプチドの等電点よりも低い、請求項2記載の方法。
- 結合pHが、選択された蛋白質又はペプチドの等電点よりも少なくとも約0.5pHユニット低く、且つ約pH4よりも大きい、請求項3記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドの等電点よりも少なくとも約1pHユニット高い溶出pHにおいて、蛋白質又はペプチドが溶出される、請求項2から4のいずれか一項記載の方法。
- 選択された蛋白質が血清アルブミンであり、結合pHがpH5.0であり、且つ溶出pHがpH7.5である、請求項5記載の方法。
- カオトロープの存在下、蛋白質又はペプチドを含む溶液をシリコンカーバイドに接触させ、結合pHが蛋白質又はペプチドの等電点よりも高い、請求項2記載の方法。
- 結合pHがplよりも少なくとも約0.5pHユニット高い、請求項7記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドが約pH5.0よりも大きなplを有する、請求項1から5のいずれか一項記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドが、血清アルブミン、リゾチーム、及び免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項2から5のいずれか一項記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドが約pH5.0よりも低いplを有する、請求項7または8記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドがリン蛋白質である、請求項7または8記載の方法。
- 溶液が細胞溶解物を含む方法であって、細胞溶解物から全蛋白質を回収する、請求項1記載の方法。
- 結合pHが細胞溶解物に含まれる蛋白質の等電点よりも低いpHである、請求項13記載の方法。
- 結合pHが約pH4.0である、請求項13または14記載の方法。
- 溶出pHが細胞溶解物に含まれる蛋白質の等電点よりも高いpHである、請求項13または14記載の方法。
- 溶出pHが約pH12.0である、請求項13から16のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも一つの蛋白質又はペプチドが、組換え宿主において発現した組換え蛋白質であって且つ封入体に隔離されたものであり、組換え蛋白質を含む溶液を提供するために、組換え蛋白質を含む封入体を可溶化剤に接触させる最初の段階を含む方法であって、その後、蛋白質の結合pHにおいて、該溶液をシリコンカーバイドに接触させる段階に続く、請求項1記載の方法。
- 可溶化剤が変性可溶化剤である、請求項18記載の方法。
- 可溶化剤が尿素である、請求項19記載の方法。
- 可溶化剤がグアニジウムイソシアネート又は塩酸グアニジウムであり、最初の溶液が、シリコンカーバイドに接触される前に約6倍から約10倍に希釈される、請求項19記載の方法。
- 可溶化剤が非変性可溶化剤である、請求項18記載の方法。
- 可溶化剤がスルホベタインである、請求項22記載の方法。
- 溶液とシリコンカーバイドとのスラリーを調製することにより、溶液をシリコンカーバイドに接触させる、請求項1から23のいずれか一項記載の方法。
- 溶液を支持体に含まれるシリコンカーバイドに接触させる、請求項1から23のいずれか一項記載の方法。
- シリコンカーバイドがスピンカラムに含まれる、請求項25記載の方法。
- シリコンカーバイドが約5μから約20μの範囲の粒子サイズを有する、請求項1から26のいずれか一項記載の方法。
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