JP2005516071A - DegPプロテアーゼ:大腸菌における切断部位の同定および天然標的のタンパク質溶解 - Google Patents
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Abstract
DegPプロテアーゼは細菌のペリプラズム空間からの変性タンパク質または凝集タンパク質の清掃に必須である。本発明は、DegPプロテアーゼ活性を変調することによる線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療および/または予防のための新規方法に関する。PapAピリンサブユニットにおけるDegP切断部位の同定およびDegP活性を変調する物質を同定するための方法をも開示する。本発明はさらに切断可能なDegPの基質である同定されたポリペプチドを提供する。本発明はDegPプロテアーゼ活性を増強するポリペプチドの同定を提供する。本発明によりDegPプロテアーゼをターゲッティングする新規クラスの抗感染薬の開発が容易になる。
Description
病原性グラム陰性細菌は多くの病理学的症状、例えば菌血症、細菌関連性の下痢、髄膜炎、および腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎などの尿路感染症を引き起こす。
尿路感染症(UTI)は女性の罹患率の主要な原因である。尿路感染症の全体的な重要性にかかわらず、これらの疾患の治療または防御のための新規の治療計画の開発にはほとんど努力が向けられていない。現在は、従来の抗生物質(例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、ニトロフラントイン、およびナリジクス酸)を用いてこれらの感染を治療する。抗生物質耐性の出現が、これらの感染の治療に対する重大な障害になることが予測される。実際に、尿路疾患における複数の抗生物質耐性が既に検出されており、そして増加しつつある。UTIの女性の評価および治療の年間コストは10億ドルを超えると推定される。さらに、院内感染に随伴される40億ドルの年間コストおよそ4分の1が、UTIの結果である。UTIのグラム陰性の原因細菌の中では、大腸菌が優勢である。
グラム陰性細菌(例えば大腸菌、インフルエンザ菌、腸炎菌、サルモネラ・チフィムリウム(ネズミチフス菌、Salmonella typhimurium、百日咳菌、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ(肺炎桿菌、Yersinia enterocolitica)、ヘリコバクター・ピロリおよびクレブシエラ菌)の種々の上皮組織に付着する能力は、感染性の重要な因子である。一例としては、大腸菌は腎臓からの尿の一方向性流出にかかわらず、上皮細胞に付着する。
多くの例えば前記した細菌感染の開始および持続は、細胞外コロニー形成、内部移行またはその他の細胞性応答が生じるかどうかを決定する結合事象を促進するアクセス可能な立体配置での微生物の表面での付着因子の提示を必要とすると考えられる。付着因子はしばしば、性線毛(pili)、繊毛(fimbriae)、またはフィブリル(fibrillae)としても知られている、長く細い繊維状のヘテロ多量体タンパク質付属器の構成要素である。細菌付着事象はしばしば線毛先端に位置する付着因子と、しばしば膜随伴複合糖質の炭水化物構造を含む宿主細胞の特異的レセプター構造との間の立体化学的適合性の結果である。
大腸菌の尿路疾患性株は、尿路上皮細胞に存在するレセプターに結合するP線毛を発現する。付着性P線毛は、大腸菌の腎盂腎炎株に随伴される毒性決定因子である。少なくとも11個の遺伝子が機能的P線毛の生合成および発現に関与している;全pap遺伝子クラスタのDNA配列は、決定されている。P線毛は線毛ロッドに末端同士で結合した柔軟性のある付着性フィブリルから構成されるヘテロ重合体繊維からなる。線毛ロッドは右回りのらせん円筒状に整列されたPapAタンパク質サブユニットの反復からなる。各線毛ロッドの遠位末端から伸びる先端フィブリルは大部分、開口らせん立体構造に整列されたPapEの反復サブユニットからなることが見出された。PapG付着因子は先端フィブリルの遠位末端に局在し、その位置は真核細胞の糖脂質レセプターを認識するその能力を最大にすると考えられる。2つのより少ない線毛構成要素であるPapFおよびPapKは先端フィブリルに見出された、特殊化されたアダプタータンパク質である。PapFは付着因子部分をフィブリルに連結するが、PapKはフィブリルを線毛ロッドに結合する。P線毛繊維の構成要素の構造により、PapG付着因子を提示する尿路疾患性大腸菌により用いられる真核細胞レセプターに対する計略が表らかになる。柔軟性のないPapAロッドは、付着因子を細菌細胞表面でLPSおよびその他の成分により引き起こされる干渉から遠ざかる方向に伸びるが、柔軟性のあるフィブリルにより、PapG立体自由性が尿路上皮のジガラクトシド部分を認識し、そして結合することが可能になる。
DegP(HtrA、プロテアーゼDo)プロテアーゼは、大腸菌のペリプラズムのミスフォールディングおよび凝集タンパク質の除去に必須の多機能タンパク質である。DegPは大腸菌における数十種のプロテアーゼの1つであり、そして事実上全てのグラム陰性細菌、シアノバクテリア、マイコバクテリアにおいて、および高等生物:酵母およびヒトにおいてホモログを有することが解っている(PallenおよびWren、Mol.Microbiol.26(2):209−221(1997))。DegPホモログはEnterococcus faecalis、Lactococcus lactis、Streptococcus pneumoniae、S.gordonii、S.pyogenes、S.mutans、Lactobacillus helveticus、Bacillus subtilis、およびStaphylococcus aureus(2つのホモログ)などの多くのグラム陽性細菌で記載されている(Jonesら、Infect.& Immun.69(9):5538−5545(2001);Nooneら、J.Bacteriol.182:1592−1599(2000);Poquetら、Mol.Microbiol.35:1042−1051(2000);Smedsら、J.Bacteriol.180:6148−6153(1998))。大腸菌にはDegPの2つのホモログ、DegQおよびDegSがある(Kolmarら、J.Bacteriol.178:5925−5929(1996);WallerおよびSauer、J.Bacteriol.178:1146−1153(1996))。KolmarらはDegQがDegPに対して類似の特異性を有することを示唆している。DegPは命名により示されるように、数回再発見されている(Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology、F.C.Niehardt編、ASM Press、Wshington DC、938−954頁(1996)のMiller、「Protein Degradation and Proteolytic Modification」;PallenおよびWren(1997);Seolら、Biochem.Biophys.Res.Comm.176:730−736(1991))。DegP(degradation:分解)の命名はペリプラズムにおける不安定融合タンパク質の蓄積を可能にする大腸菌における変異の最初のマッピングを意味する(StrauchおよびBeckwith、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1576−1580(1988);Strauchら、J.Bacteriol.171:2689−2696(1989))。Htr(heat shock regulated:熱ショック制御)の名称は、同一遺伝子におけるトランスポゾン挿入の結果、温度感受性増殖表現型に至ったことを示す(Lipinskaら、Nucl.Acids.Res.16:10053−10066(1988))。最後に、DegPもまた、大腸菌において温度感受性増殖表現型を付与する変異体であるので、同様にプロテアーゼ「Do」と称される(Seolら(1991))。「DegP」の名称は本明細書全体で、大腸菌タンパク質に言及する場合に用いる。
精製されたDegPは、基質としてカゼインを用いるインビトロアッセイにおいて機能的なプロテアーゼ活性を呈するが、この基質における活性は微弱である(Lipinskaら、J.Bacteriol.172:1791−1797(1990))。Lipinskaら(Lipinskaら(1990))は、カゼインにおける活性がフルオロリン酸ジイソプロピルにより抑制され、いずれかその他の公知のプロテアーゼインヒビターにより抑制されなかったことを実証し、これはDegPが活性部位セリン残基を含有することを示唆している。興味深いことに、DegPは古典的なセリンプロテアーゼインヒビターであるフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)により抑制されず、これはDegPの作用様式の相違を示唆している(Kolmar、Handbook of Protelytic Enzymes、Barrettら編、Academic Press、英国(1998)のKolmar、「DegP or Protease DO CLAN SA」;Lipinskaら(1990))。セリン210およびヒスチジン105(セリンプロテアーゼ触媒3つ組の2つの構成要素)での部位特異的変異誘発は、インビトロおよびインビボでDeg機能を危うくした;すなわちセリン210またはヒスチジン105変異を担持する株は、高温での成長に感受性があった(Skorko−Glenekら、Gene 163:47−52(1995))。最近の研究では、DegPはシャペロンおよびプロテアーゼの双方として機能することが示されている;低温(28℃)では、シャペロンの機能は優勢であろ、そして高温(45℃)にシフトした後、プロテアーゼ機能が活性化される(Spiessら、Cell 97:339−347(1999))。DegPの合成はσE:細胞外ストレスに直面して生存するのに必須である遺伝子を調節する、いわゆる「ストレス」σ因子により調節される(Rainaら、J.Bacteriol.175(8):5009−5921(1993);Rouviereら、EMBO J.14:1032−1042(1995))。この応答は部分的にCpxA/CpxR2成分制御系により制御される(DaneseおよびSilhavy、Genes & Develop.11:1183−1193(1997);Daneseら、Genes & Develop.9:387−398(1995))。最近、Jonesら(Jonesら、EMBO J.16:6394−6404(1997))は、線毛サブユニットの発現が対応する(cognate)ペリプラズムシャペロンの不在下で(このような条件が線毛サブユニット凝集を招く)degPプロモーターの活性化を招くことを実証した。
最初に同定されたDegPに関するインビボ標的は、コリシンA溶解(colicin A lysis)タンパク質(Cal)であった(Cavardら、J.Bacteriol.171:6316−6322(1989))。DegPは、Calのアシル化前駆体形態を2つのフラグメントに切り取ることが見出されている。成熟Calも、またdegP変異株において高レベルで蓄積された(Cavardら(1989))。同定されたDegP標的の第2のファミリーは、細菌ピリンである。K88およびK99ピリンサブユニットはdegP変異株において高レベルで蓄積されることが見出された(Bakkerら、Mol.Microbiol.5(4):875−886(1991))。この現象のより詳細な研究により、Pピリン、特にPapAおよびPapGはDegPプロテアーゼの基質であることが実証された(Jonesら(1997))。H.influenzae非線毛付着タンパク質HMW1およびHMW2もまたインビボでDegPの基質であることが見出された(St.Geme IIIおよびGrass、Mol.Microbiol.27:617−630(1998))。加えて、Spiessら(Spiessら(1999))は最近、大腸菌のMalSタンパク質がインビトロでDegPにより十分に分解されることを実証した。
ここ数年で、DegPがいくつかの病原性生物に有毒な因子であることを実証するかなり多くのデータが蓄積されている。Salmonella typhinurium、Salmonella typhi、Brucella abortus、Brucella melitensis、およびYersinia enterocoliticaでは、htrAヌル(null)は毒性が低減されるかまたは取り除かれていることが見出された(Elzerら、Res.Veterin.Sci.60:48−50(1996a);Elzerら、Infect.Immun.64:4838−4841(1996b);Johnsonら、Mol.Microbiol.5:401−407(1991);Liら、Infect.Immun.64:2088−2094(1996);Phillipsら、Res.Veterin.Sci.63:165−167(1997);Tacketら、Infect.Immun.65:452−456(1997))。htrAヌル変異は、酸化ストレスに対してより感受性があり、そして免疫細胞により死滅することが見出された。さらに、htrA損傷は、ワクチン株として実施するためのチフス菌(Salmonella typhi)(Tacketら(1997);Tacketら、Infect.Immun.68(3):1196−1201(2000))およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)(Robertsら、Infect.Immun.68(10):6041−6043(2000))の双方の弱毒化に有用であることが見出された。Boucherら(Boucherら、J.Bacteriol.178:511−523(1996))は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のムコイド型への変換、いわゆる嚢胞性繊維症表現型は2つのhtrAホモログに関連することが実証された。最近の報告では、Pedersonら(Pedersonら、Infect.Immun.69(4):2569−2579(2001))はレジオネラ菌(Legionella pneumophilia)におけるhtrAヌル変異が毒性に関して減弱化されることを実証した。最近では、degPは、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)において挿入により不活性化され、そして温度および酸化感受性に至り、並びにマウスモデルにおいて毒性が弱められることが見出された(Jonesら(2001))。
初期のインビボデータにより、いわゆるシャペロン先導物質集合体経路(chaperone−usher assembly pathway)のピリンサブユニットが、DegP基質であることが示唆された(Bakkerら(1991))。対応する(cognate)シャペロン(PapD)の不在下でのピリンサブユニットタンパク質の発現の結果、野生型(DegP+)細菌のペリプラズムにおけるサブユニットの蓄積に失敗し、そしてdegP変異株はペリプラズムにおける高レベルのピリンサブユニットタンパク質を蓄積することが見出された(Bakkerら(1991);Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology、F.C.Niehardt編、ASM Press、Wshington DC、2730−2756頁(1996)のHultgrenら、「Bacterial Adhesins and Their Assembly」;Hultgrenら、Annu.Rev.Microbiol.45:383−415(1991);Jonesら(1997))。毒性および蓄積の双方はペリプラズムシャペロンをコードするpapD、またはdegPでの補完により抑制された(Jonesら(1997))。以前に、我々はP線毛のPapAサブユニットの精製のためのスキームを開発し、そしてこのタンパク質がDegPプロテアーゼにより効率よく切断される天然の基質であることを実証した。本発明では、我々はまたPapA配列内の3つの切断部位を同定し、そしてペプチド基質の1つのタンパク質溶解性切断に必須である決定因子を特徴づけした。
本発明は、DegPプロテアーゼ活性を変調することにより線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療および/または予防の方法を提供する。本発明は、PapAピリンサブユニットのDegP切断部位の同定およびDegP活性を変調する基質を同定するための方法を提供する。本発明は、DegPの基質を切断する、同定されたポリペプチドを提供する。本発明は、DegPプロテアーゼ活性を増強するポリペプチドの同定を提供する。
一般的に言って、本出願で用いた用語は、これらの用語が当分野で理解されている様式に合致する。
「変調する(modulate)」とは酵素等の野生型活性を増強、増加、抑制または低減する方法、条件または作用物質を意味する。
「変調された活性」とは、タンパク質により変調されたいずれかの活性、条件、疾患または表現型を意味する。この変調は、例えば基質の抑制、活性化、結合、もしくは放出による、化学的、もしくは構造的のいずれかによる修飾のような、例えば直接アゴニストもしくはアンタゴニスト効果により、またはさらなる因子が関与し得る直接もしくは間接的相互作用により生じ得る。この変化は、触媒活性および/または基質に対する結合における増加/低減でよい。
「DegP」は、大腸菌のペリプラズムのミスフォールディングおよび凝集タンパク質の除去に必須である多機能タンパク質を意味する。DegPは、本発明では、HtrAおよびプロテアーゼDoとも称する。「DegPホモログ」は、DegPに対して高度な相同性を有する別の大腸菌タンパク質である別のプロテアーゼ、例えばDegQおよびDegSを意味する。実施例では大腸菌のDegPに言及するが、本発明はこの生物に限定するものではなく、そしてその他のDegPのグラム陰性ホモログ、クラミジアおよびDegPホモログを有する特定のグラム陽性細菌を包含することを意図している。
本発明は、切断可能な基質の存在下でDegPまたはDegPホモログに基質を添加し、そして該切断可能な基質の切断の増強または抑制を検出し、それにより該物質が該プロテアーゼ活性を変調するかどうかを決定することにより、DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質を同定するための方法を提供する。
好ましい実施形態では、この方法で用いる切断可能な物質はHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるポリペプチドであり、これはDegPにより切断されたとして同定されたPapAピリンサブユニットペプチドである。
好ましい実施形態では、DegPホモログはDegSおよびDegQである。
別の好ましい実施形態では、この方法の物質はプロテアーゼ活性を増強する。別の好ましい実施形態では、この物質はプロテアーゼ活性を抑制する。特に好ましい実施形態では、この物質はDegP活性を変調する。
本発明は、DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を防御、抑制または増強することを含む、線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療または予防のための方法を提供する。DegPが、細胞ペリプラズム空間からの変性または凝集タンパク質の分解に寄与する毒性因子であることは、前記の背景のセクションおよび以下の実施例から当業者には明白であろう。従って、DegPプロテアーゼ活性の抑制は、ペリプラズム空間におけるピリンサブユニットの有毒な蓄積に至り、これは罹患率および/または致死率の上昇、または細菌の感染性の低下に至り得る。しかしながら、DegPプロテアーゼ活性の増強はまた、細菌の有害な結果、例えば必要なピリンサブユニットの枯渇をも有し得る。このように、DegPプロテアーゼ活性の増強または抑制のいずれかは線毛形成細菌の病原性を低減し得る。
本発明では、DegPプロテアーゼにより効率よく切断される、PapAピリンサブユニットにおける切断部位が同定されている。従って、本発明はアミノ酸配列HYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)を含む単離されたポリペプチドを提供する。これらの配列は本発明で実施したアッセイにおいてPapAピリンサブユニットのDegPプロテアーゼ部位として同定された。本発明のペプチドを例えばアミノ安息香酸および/またはジアミノプロピオンアミドジニトロフェニルで修飾することができ、そしてさらに本発明に従って実施することができることは、当業者に明らかであろう。いずれかの修飾されたペプチドを、例えば実施例で詳記するアッセイで試験して、このような修飾がDegPプロテアーゼ活性の変調においてペプチドの活性に影響するかどうかを決定することができる。以下の実施例で記載するように、たいていの場合、DegPの切断可能な同定された基質は、疎水性残基対を含有することが観察された。
本発明のアミノ酸化合物は、指定されたクラスのアミノ酸残基に関して部分的に定義されたポリペプチドである。ポリペプチドホモログは、以下に記載するアミノ酸クラス内の保存アミノ酸置換体を含む。概してアミノ酸残基を以下のような4つの主なサブクラスに下位分類することができる。
酸性:残基は生理学的pHでのH+イオンの喪失により負の電荷を有し、そしてペプチドが生理学的pHで水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における表面位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
塩基性:残基は生理学的pHでのH+イオンとの会合により正の電荷を有し、そしてペプチドが生理学的pHで水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における表面位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
中性/無極性:残基は生理学的pHで荷電していないが、ペプチドが水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における内部位置を探し求めるために、残基は水溶液に追い払われる。これらの残基を「疎水性」とも称する。
中性/極性:残基は生理学的pHで荷電していないが、ペプチドが水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における外部位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
もちろん、個々の残基分子の統計学的収集において、いくつかの分子は荷電しており、いくつかは荷電しておらず、そして大なり小なりの程度で水性溶媒に引き寄せられるかまたはそこから追い払われる。「荷電した」の定義に適合するためには、有意なパーセンテージ(少なくともおよそ25%)の個々の分子が生理学的pHで荷電している。極性または無極性としての分類に必要な吸引または反発の程度は任意であり、従って、本発明により具体的に企図されるアミノ酸は一方または他方に分類されている。具体的には名前を挙げていないが、たいていのアミノ酸を公知の挙動に基づいて分類することができる。
アミノ酸残基を環状または非環状、および芳香性または非芳香性の、残基の側鎖置換基に関して自明の分類として、並びに小型または大型としてさらに下位分類することができる。残基が全部で4個またはそれ以下の炭素原子を含有する場合、小型であると考えられ、カルボキシル炭素を含む。小型残基はもちろん、必ず非芳香性である。
第2級アミノ酸プロリンは、技術的には天然/無極性/大型/環状および非芳香性の群に入るが、ペプチド鎖の第2級立体配置に及ぼすその公知の影響のために特別な場合であり、従って、この定義された群には含まれない。
その他のアミノ酸置換体を本発明の範囲内のペプチド化合物に含めることもでき、そしてその構造に従って、この一般的なスキーム内で分類することができる。
本発明の全ての化合物は医薬的に許容される塩またはエステルの形態でよい。塩は、例えばNa+、K+、Ca+2、Mg+2等でよく;エステルは概して1〜6炭素のアルコールのエステルである。
本発明は、DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調するのに十分な量の切断可能な基質の存在下で、切断不能な基質または切断可能な基質からなる群から選択される1つまたは複数の物質をDegPまたはDegPホモログに添加することを含む、DegPまたはDegPホモログの該プロテアーゼ活性を変調する方法を提供する。
好ましい実施形態では、DegPホモログはDegQまたはDegSである。別の好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性は抑制される。別の好ましい実施形態では、変調物質は切断可能な基質である。特に好ましい実施形態では、切断可能な基質はHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性が増強される。特に好ましい実施形態では、該物質はKSMCMKLSFS(配列番号13)のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明はDegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質およびそのキャリアを含む組成物を提供する。この組成物は診断用または医薬用用途を有し得る。例えば、本発明のアッセイにより同定されたDegPまたはDegPホモログ機能の小型分子インヒビターを新規抗感染薬として用いることができる。さらに、小型ペプチド分子、例えば本発明で切断部位として同定されたものを融合タンパク質「リンカー」として用いることができる。このようなリンカーは大腸菌での過剰発現および精製用に生成するのが困難であるタンパク質を安定化する。次いでDegPまたはDegPホモログを用いて、精製の間に融合タンパク質を切断することができる。
好ましい実施形態では、組成物の物質はHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、組成物はKSMCMKLSFS(配列番号13)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、組成物はさらに少なくとも1つの抗菌薬を含み、該薬物はペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ポリミキシン類、抗マイコバクテリア薬、および尿路防腐薬からなる群から選択される。
前記で開示した方法により検定される物質を無作為に選択するかまたは合理的に選択もしくは設計することができる。本明細書で用いるように、薬物をDegP単独の、またはその関連する物質等との関連性に関与する特定の配列を考慮することなく、無作為に選択する場合、物質は無作為に選択されたと言われる。無作為に選択された薬物の実例は化学的ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリー、または生物の増殖ブロスの使用である。
本発明の物質は例えばペプチド、小型分子、ビタミン誘導体、および炭水化物でよい。当業者は本発明の薬物の構造特性に関して制限がないことを容易に理解できる。
当分野で公知の標準的な固相(または液相)ペプチド合成方法を用いて本発明のペプチド物質を調製することができる。加えて、これらのペプチドをコードするDNAを市販入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成し、そして標準的な組換え生成系を用いて組換えにより生成することができる。核酸によりコードされていないアミノ酸を含める場合、固相ペプチド合成を用いるポリペプチドの生成が必要である。
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証することを意図するものであり、限定であると考えるものではない。
PapAのDegP切断部位およびタンパク質溶解の同定並びにDegPプロテアーゼ活性の増強
[材料および方法]
《株および遺伝子構築》
DH5α(Hanahan、J.Mol.Biol.166:557−580(1983))およびINVαF’(Invitrogen、Calsbad、カリフォルニア州)をクローニング工程で使用した。KS272(MC1000[F−Δ(ara−leu)7697 galE galK ΔlacX74 rpsL(strr)])をDegPの発現に使用した(Strauchら、J.Bacteriol.171:2689−2696(1989))。KS474(KS272 degP::kan)をPapA−6H4Aの生成に使用した。T.Silhavyから提供されたpKS17(Strauchら(1989))をDegPの過剰発現および精製に使用した。以前に記載されているように(MorrisonおよびDesrosiers、BioTechniques 14(3):454−457(1993))、PapAリーダープロセシング部位のすぐ下流に6個のヒスチジンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いてpapAのPCRクローニングを実施した。BamHIおよびEcoRI制限部位を含むように変異papA遺伝子を増幅し、pMMB566へのクローニングを促進し(Fursteら、Gene 48(1):119−131(1986))、pCL100を作製した。papA遺伝子のリーダープロセシング部位の下流で6個のヒスチジンコドンおよび2個のアラニンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いて、同一の様式でpCL101を構築した。PapD発現プラスミド、pHJ9203は以前に記載されている(Jonesら、EMBO J.16:6394−6406(1997))。
[材料および方法]
《株および遺伝子構築》
DH5α(Hanahan、J.Mol.Biol.166:557−580(1983))およびINVαF’(Invitrogen、Calsbad、カリフォルニア州)をクローニング工程で使用した。KS272(MC1000[F−Δ(ara−leu)7697 galE galK ΔlacX74 rpsL(strr)])をDegPの発現に使用した(Strauchら、J.Bacteriol.171:2689−2696(1989))。KS474(KS272 degP::kan)をPapA−6H4Aの生成に使用した。T.Silhavyから提供されたpKS17(Strauchら(1989))をDegPの過剰発現および精製に使用した。以前に記載されているように(MorrisonおよびDesrosiers、BioTechniques 14(3):454−457(1993))、PapAリーダープロセシング部位のすぐ下流に6個のヒスチジンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いてpapAのPCRクローニングを実施した。BamHIおよびEcoRI制限部位を含むように変異papA遺伝子を増幅し、pMMB566へのクローニングを促進し(Fursteら、Gene 48(1):119−131(1986))、pCL100を作製した。papA遺伝子のリーダープロセシング部位の下流で6個のヒスチジンコドンおよび2個のアラニンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いて、同一の様式でpCL101を構築した。PapD発現プラスミド、pHJ9203は以前に記載されている(Jonesら、EMBO J.16:6394−6406(1997))。
《PapA−6H4A発現および精製》
Luria−Bertani(LB)ブロス(Difco、Becton−Dickinson、Sparks、メリーランド州)中100μg/mlのアンピシリン、50μg/mlのカナマイシン、100μg/mlのスペクチノマイシンの存在下でKS474/pCL101/pHJ9203をA600=0.8まで増殖させ、そのときIPTGを1.0mMまで添加し、そしてアラビノースを0.5%まで添加した。培養物を90分間インキュベートし、細菌を収集し、そして以前に記載されたように(Jonesら(1997))およそ25g(湿重量)の細胞からペリプラズムを調製した。ペリプラズムを20mMのTris、pH=8.5に対して透析し、そして製造者(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)により記載されるようにバッチ処理でTalon金属アフィニティービーズに適用した。室温で60分間インキュベートし、そして20mMのTris、pH=8、100mMのNaClで3回洗浄した後、結合複合体を0.1Mのイミダゾールで溶出するか、または代替として、シャペロン−サブユニット複合体を20mMのTris、pH=8、100mMのNaCl、6.0MのグアニジンHCl(または8.0M 尿素)に再懸濁することにより変性し、45℃で60分間インキュベートした。グアニジンHClはシャペロン−サブユニット複合体の分解に関して我々の思い通りに最良に作用することが見出された。バッファーおよび変性剤での洗浄によりシャペロンを除去し、そして0.1Mのイミダゾールを用いてTalon樹脂からPapA−6H4Aを溶出した。DegPによる効率のよい切断のために、PapA−6H4Aを還元およびカルボキシメチル化に供した。400mMのTris、pH=8.5、5.0mMのEDTA、0.11Mの2−メルカプトエタノールからなるバッファー中でグアニジンHCl変性PapA−6H4Aを還元し、そして4℃で2時間インキュベートした。還元したタンパク質を0.21M ヨード酢酸と共に4℃で1時間インキュベートすることによりカルボキシメチル化した。次いで切断アッセイで使用するために、タンパク質を20mMのTris、pH=8.5に対して透析した。
Luria−Bertani(LB)ブロス(Difco、Becton−Dickinson、Sparks、メリーランド州)中100μg/mlのアンピシリン、50μg/mlのカナマイシン、100μg/mlのスペクチノマイシンの存在下でKS474/pCL101/pHJ9203をA600=0.8まで増殖させ、そのときIPTGを1.0mMまで添加し、そしてアラビノースを0.5%まで添加した。培養物を90分間インキュベートし、細菌を収集し、そして以前に記載されたように(Jonesら(1997))およそ25g(湿重量)の細胞からペリプラズムを調製した。ペリプラズムを20mMのTris、pH=8.5に対して透析し、そして製造者(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)により記載されるようにバッチ処理でTalon金属アフィニティービーズに適用した。室温で60分間インキュベートし、そして20mMのTris、pH=8、100mMのNaClで3回洗浄した後、結合複合体を0.1Mのイミダゾールで溶出するか、または代替として、シャペロン−サブユニット複合体を20mMのTris、pH=8、100mMのNaCl、6.0MのグアニジンHCl(または8.0M 尿素)に再懸濁することにより変性し、45℃で60分間インキュベートした。グアニジンHClはシャペロン−サブユニット複合体の分解に関して我々の思い通りに最良に作用することが見出された。バッファーおよび変性剤での洗浄によりシャペロンを除去し、そして0.1Mのイミダゾールを用いてTalon樹脂からPapA−6H4Aを溶出した。DegPによる効率のよい切断のために、PapA−6H4Aを還元およびカルボキシメチル化に供した。400mMのTris、pH=8.5、5.0mMのEDTA、0.11Mの2−メルカプトエタノールからなるバッファー中でグアニジンHCl変性PapA−6H4Aを還元し、そして4℃で2時間インキュベートした。還元したタンパク質を0.21M ヨード酢酸と共に4℃で1時間インキュベートすることによりカルボキシメチル化した。次いで切断アッセイで使用するために、タンパク質を20mMのTris、pH=8.5に対して透析した。
《DegPプロテアーゼの精製》
全ペリプラズムからDegPを精製し、これを以前に記載されたように調製した(Jonesら(1997))。およそ30g(湿重量)の細胞を用いてペリプラズムを調製した。33mMのMES、33mMのHEPES、33mMの酢酸塩、pH=5.9に対して透析した後、ペリプラズムをHiTrap Sカチオン交換カラム(Amersham−Pharmacia Biotech、Uppsala、スウェーデン)に適用した。DegPは直線的な塩グラジエントのおよそ100mMのNaClで溶出した。ピークタンパク質分画を0.5Mの硫酸アンモニウムに調整し、そしてHICブチルカラム(Amersham−Pharmacia)に適用した。DegPを約0.3Mの硫酸アンモニウムで疎水性カラムから溶出した。ブチルカラムから溶出したピーク分画に現れた6個全てのバンドをアミノ末端配列分析によりDegP種として同定した。
全ペリプラズムからDegPを精製し、これを以前に記載されたように調製した(Jonesら(1997))。およそ30g(湿重量)の細胞を用いてペリプラズムを調製した。33mMのMES、33mMのHEPES、33mMの酢酸塩、pH=5.9に対して透析した後、ペリプラズムをHiTrap Sカチオン交換カラム(Amersham−Pharmacia Biotech、Uppsala、スウェーデン)に適用した。DegPは直線的な塩グラジエントのおよそ100mMのNaClで溶出した。ピークタンパク質分画を0.5Mの硫酸アンモニウムに調整し、そしてHICブチルカラム(Amersham−Pharmacia)に適用した。DegPを約0.3Mの硫酸アンモニウムで疎水性カラムから溶出した。ブチルカラムから溶出したピーク分画に現れた6個全てのバンドをアミノ末端配列分析によりDegP種として同定した。
《全タンパク質切断アッセイ》
20mMのTris、pH=8からなるバッファー中45℃で30分から15時間までタンパク質溶解アッセイを実施した。5mMのMgCl2またはCaCl2を後者のアッセイに添加し、そして2価カチオンへの依存性を確認し、EDTAを10mMで添加した。指示される場合、PapG付着因子のカルボキシ末端から誘導した配列KSMCMKLSFSを有する切断不能ペプチドであるSPCJ1をアッセイに補充した(200μM)。
20mMのTris、pH=8からなるバッファー中45℃で30分から15時間までタンパク質溶解アッセイを実施した。5mMのMgCl2またはCaCl2を後者のアッセイに添加し、そして2価カチオンへの依存性を確認し、EDTAを10mMで添加した。指示される場合、PapG付着因子のカルボキシ末端から誘導した配列KSMCMKLSFSを有する切断不能ペプチドであるSPCJ1をアッセイに補充した(200μM)。
《ペプチドスキャニング(PepSpots(商標))》
3アミノ酸残基でシフトした、7merおよび12merの様式のPapA配列の重複ペプチドスキャニングライブラリーをSPOT合成技術により調製し、アミノ末端でアミノ安息香酸にコンジュゲートし、連続セルロース膜(ProteaseSpots(商標))に(カルボキシ末端を)連結し、そしてJerini AG(Berlin、ドイツ)により検定した。精製されたDegPを前記したように調製し、そして20mM リン酸塩バッファー、pH=7、5mM MgCl2を用いて96ウェルマイクロプレート様式で検定した(0.28mg/ml)。1、4、および28時間にアリコートをアッセイプレートから除去し、そして遊離した蛍光を定量した(発光−325nm、発光−420nm)。
3アミノ酸残基でシフトした、7merおよび12merの様式のPapA配列の重複ペプチドスキャニングライブラリーをSPOT合成技術により調製し、アミノ末端でアミノ安息香酸にコンジュゲートし、連続セルロース膜(ProteaseSpots(商標))に(カルボキシ末端を)連結し、そしてJerini AG(Berlin、ドイツ)により検定した。精製されたDegPを前記したように調製し、そして20mM リン酸塩バッファー、pH=7、5mM MgCl2を用いて96ウェルマイクロプレート様式で検定した(0.28mg/ml)。1、4、および28時間にアリコートをアッセイプレートから除去し、そして遊離した蛍光を定量した(発光−325nm、発光−420nm)。
《ペプチド切断アッセイ》
以下の3つのペプチドを蛍光近接ペプチド切断アッセイに使用した。
SPCJ−12−Abz−HYTAVVKKSSAV−DAP(Dnp)−NH2(配列番号14)
SPCJ−13−Abz−HYTAVVK−DAP(Dnp)−NH2(配列番号15)
SPCJ−14−Abz−HYTASSK−DAP(Dnp)−NH2(配列番号16)
(ここで、蛍光基Abzはアミノ安息香酸であり、そしてクエンチ基DAP(Dnp)−NH2はジアミノプロピオンアミドジニトロフェニルである。)200pMから1nMの範囲の濃度でペプチドをアッセイに使用した。0.5から5μgの範囲の濃度でDegPをアッセイに添加した。アッセイバッファーは25mMのHEPES、pH=7.5、5mMのCaCl2からなる。切断反応物を45℃でインキュベートし、そしてWallac Victor2V 1420 Multilabel HTS Counter(Wallac Oy、Turku、フィンランド)により30分間隔で読んだ。340nmでの励起を利用する蛍光検出および発光を420nmでモニター観察した。
以下の3つのペプチドを蛍光近接ペプチド切断アッセイに使用した。
SPCJ−12−Abz−HYTAVVKKSSAV−DAP(Dnp)−NH2(配列番号14)
SPCJ−13−Abz−HYTAVVK−DAP(Dnp)−NH2(配列番号15)
SPCJ−14−Abz−HYTASSK−DAP(Dnp)−NH2(配列番号16)
(ここで、蛍光基Abzはアミノ安息香酸であり、そしてクエンチ基DAP(Dnp)−NH2はジアミノプロピオンアミドジニトロフェニルである。)200pMから1nMの範囲の濃度でペプチドをアッセイに使用した。0.5から5μgの範囲の濃度でDegPをアッセイに添加した。アッセイバッファーは25mMのHEPES、pH=7.5、5mMのCaCl2からなる。切断反応物を45℃でインキュベートし、そしてWallac Victor2V 1420 Multilabel HTS Counter(Wallac Oy、Turku、フィンランド)により30分間隔で読んだ。340nmでの励起を利用する蛍光検出および発光を420nmでモニター観察した。
《切断部位マッピング》
ペプチドの精製および切断反応の生成物を100%のアセトニトリル/0.05%のトリフルオロ酢酸までのグラジエントによりC18 5μ ST 4.6/250 Sephasilカラム(Amersham−Pharmacia Biotech)で実施した。凍結乾燥した切断反応物(5ml)を2%のアセトニトリル/0.065%のトリフルオロ酢酸に再懸濁して、C18カラムに適用した。ペプチドおよび切断生成物を含有する分画を凍結乾燥して、MALDI TOF 質量分析器により質量を決定した。0.1%のトリフルオロ酢酸、33%のアセトニトリル中マトリックス?−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(HCCA)5mg/ml溶液を用いてMALDI分析を行った。分析物を1:3でマトリックスと混合した。特注のMALDI−TOF質量分析器を用いてスペクトルを生成した。
ペプチドの精製および切断反応の生成物を100%のアセトニトリル/0.05%のトリフルオロ酢酸までのグラジエントによりC18 5μ ST 4.6/250 Sephasilカラム(Amersham−Pharmacia Biotech)で実施した。凍結乾燥した切断反応物(5ml)を2%のアセトニトリル/0.065%のトリフルオロ酢酸に再懸濁して、C18カラムに適用した。ペプチドおよび切断生成物を含有する分画を凍結乾燥して、MALDI TOF 質量分析器により質量を決定した。0.1%のトリフルオロ酢酸、33%のアセトニトリル中マトリックス?−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(HCCA)5mg/ml溶液を用いてMALDI分析を行った。分析物を1:3でマトリックスと混合した。特注のMALDI−TOF質量分析器を用いてスペクトルを生成した。
《その他の方法》
以前に記載されているように(Dodsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3670−3674(1993);Slonimら、EMBO J.11(13):4747−4756(1992))タンパク質をPVDF膜に移してシークエンシングに備え、そしてアミノ末端配列決定のためにMidwest Analytical Inc,(St.Louis,ミズーリ州)に分配した。SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析を以前に記載されているように実施した(Dodsonら(1992);Slonimら(1992))。以前に記載されているように(Jonesら、(1997))毒性アッセイを実施した。EnzChekアッセイキット(Molecular Probes,eugene,オレゴン州)を製造者の指示書に従って使用し、適当なフィルターセットを有するTecanSpectrFluor Plus(Research Triangle Park、ノースキャロライナ州)を用いて読んだ。
以前に記載されているように(Dodsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3670−3674(1993);Slonimら、EMBO J.11(13):4747−4756(1992))タンパク質をPVDF膜に移してシークエンシングに備え、そしてアミノ末端配列決定のためにMidwest Analytical Inc,(St.Louis,ミズーリ州)に分配した。SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析を以前に記載されているように実施した(Dodsonら(1992);Slonimら(1992))。以前に記載されているように(Jonesら、(1997))毒性アッセイを実施した。EnzChekアッセイキット(Molecular Probes,eugene,オレゴン州)を製造者の指示書に従って使用し、適当なフィルターセットを有するTecanSpectrFluor Plus(Research Triangle Park、ノースキャロライナ州)を用いて読んだ。
[結果]
《PapA−6H4Aの構築および精製》
シャペロン媒介線毛生合成の研究のための大きな障害は、ペリプラズムシャペロン不在下でピリンサブユニットが精製できないことである。これは部分的にDegPプロテアーゼの不活性化により打破できる(Bakkerら、Mol.Microbiol.5(4):875−886(1991))。しかしながら、P(Pap)線毛由来のピリンサブユニットは、シャペロン不在下でKS474において発現された場合、毒性が高いことが見出された(degP::kan)(Jonesら、(1997))。変性条件下の金属アフィニティークロマトグラフィーおよびPapAのアミノ末端へのアフィニティタグの付加を利用することにより、ピリンサブユニットを生成し、そして精製した。MorrisonおよびDesrosiers(1993)の方法を用いて、ポリヒスチジンアフィニティータグ(6−hisタグ)をコードする配列をpapA遺伝子に挿入した。6−hisタグはリーダープロセシング部位の直ぐ下流に位置し、それによりリーダープロセシングタンパク質がアフィニティー精製のための暴露されたアミノ末端6−hisタグを含有するようになる。融合タンパク質をpMMB66にクローニングし、これをIPTG誘導Ptacプロモーターの調節下に置いた(Fursteら(1986))。最初の構築物であるPapA−6Hはうまくプロセシングされず、ペリプラズムに輸送されなかった(データは示していない)。我々は6−hisアフィニティタグがリーダープロセシングかまたはSec膜輸送機構との関与のいずれかを立体的に遮断するとの仮説をたてた。この遮断は2つのアラニン残基の添加により回避され、その結果4つのアラニン全てがPapAのリーダープロセシング部位から6−hisタグを分離するように位置した。この構築物から発現されたPapA−6H4Aはうまくプロセシングされ、そしてペリプラズムに輸送された(図1)。さらにPapA−6H4Aはペリプラズムの安定性に関するペリプラズムシャペロンであるPapDとの相互作用に依存した(図1A)。野生型PapAと同様にPapA−6H4Aタンパク質はPapDシャペロンの不在下で誘導された場合、毒性である(Jonesら、(1997))。毒性はピリンサブユニットの誘導の後の細菌の成長不全で明白である(図2)。先の研究により、「非シャペロン化」サブユニットが内膜分画で生じ、そして不溶性凝集物を形成することが示された(Jonesら、(1997))。PapA−6H4Aの毒性はPapD(図2A)またはDegP(図2B)のトランスでの同時発現により抑制された。
《PapA−6H4Aの構築および精製》
シャペロン媒介線毛生合成の研究のための大きな障害は、ペリプラズムシャペロン不在下でピリンサブユニットが精製できないことである。これは部分的にDegPプロテアーゼの不活性化により打破できる(Bakkerら、Mol.Microbiol.5(4):875−886(1991))。しかしながら、P(Pap)線毛由来のピリンサブユニットは、シャペロン不在下でKS474において発現された場合、毒性が高いことが見出された(degP::kan)(Jonesら、(1997))。変性条件下の金属アフィニティークロマトグラフィーおよびPapAのアミノ末端へのアフィニティタグの付加を利用することにより、ピリンサブユニットを生成し、そして精製した。MorrisonおよびDesrosiers(1993)の方法を用いて、ポリヒスチジンアフィニティータグ(6−hisタグ)をコードする配列をpapA遺伝子に挿入した。6−hisタグはリーダープロセシング部位の直ぐ下流に位置し、それによりリーダープロセシングタンパク質がアフィニティー精製のための暴露されたアミノ末端6−hisタグを含有するようになる。融合タンパク質をpMMB66にクローニングし、これをIPTG誘導Ptacプロモーターの調節下に置いた(Fursteら(1986))。最初の構築物であるPapA−6Hはうまくプロセシングされず、ペリプラズムに輸送されなかった(データは示していない)。我々は6−hisアフィニティタグがリーダープロセシングかまたはSec膜輸送機構との関与のいずれかを立体的に遮断するとの仮説をたてた。この遮断は2つのアラニン残基の添加により回避され、その結果4つのアラニン全てがPapAのリーダープロセシング部位から6−hisタグを分離するように位置した。この構築物から発現されたPapA−6H4Aはうまくプロセシングされ、そしてペリプラズムに輸送された(図1)。さらにPapA−6H4Aはペリプラズムの安定性に関するペリプラズムシャペロンであるPapDとの相互作用に依存した(図1A)。野生型PapAと同様にPapA−6H4Aタンパク質はPapDシャペロンの不在下で誘導された場合、毒性である(Jonesら、(1997))。毒性はピリンサブユニットの誘導の後の細菌の成長不全で明白である(図2)。先の研究により、「非シャペロン化」サブユニットが内膜分画で生じ、そして不溶性凝集物を形成することが示された(Jonesら、(1997))。PapA−6H4Aの毒性はPapD(図2A)またはDegP(図2B)のトランスでの同時発現により抑制された。
計画された実験用に十分なPapAを精製するために、KS474中PapDの存在下でPapA−6H4Aを合成した(degP::kan)(Jonesら、(1997))。金属アフィニティークロマトグラフィー(MAC)を用いて一括してPapD−PapA複合体を全ペリプラズムから精製した(図1B)。シャペロンとPapA−6H4Aサブユニットを分離するために、ビーズ結合複合体を6.0M グアニジンHClで変性した。シャペロンを除去するために10mMのTris、pH=8プラス変性剤で洗浄した後、純粋なPapA−6H4Aを0.1Mのイミダゾールで溶出した(図1B)。変性したPapA−6H4AがPapDの適当な結合パートナーであることを確認するために、シャペロンサブユニット複合体を再構築し、そしてMAVで精製した(図1C)。変性したPapA−6H4Aを金属アフィニティー樹脂に適用し、洗浄したが、変性剤を除去しなかった。次いでビーズ結合タンパク質をPapD富化ペリプラズム(データは示していない)または精製されたPapD(図1C)のいずれかに希釈した。シャペロンサブユニット複合体を洗浄し、そして0.1M イミダゾールでアフィニティー樹脂から溶出した(図1C、レーン3)。
DegPプロテアーゼの基質としての変性したPapA−6H4Aタンパク質を試験するために、樹脂結合、変性PapA−6H4AをDegP富化ペリプラズムまたは対照ペリプラズムに希釈し、そして室温で60分間インキュベートした。結合タンパク質を0.1M イミダゾールで溶出し、そしてクーマシーブルー染色および溶出した生成物のアミノ末端シークエンシングにより分析した(図1D)。2つの新規のバンドを同定した。〜48kDaバンドをDegPプロテアーゼとして同定した。DegP富化ペリプラズムで処理した後にのみ現れる〜12kDaバンド(PapA−NH2)をPapAのアミノ末端フラグメントとして同定した。このデータは、PapAの切断に至るPapAとDegPとの間の相互作用を定義する。
《DegPプロテアーゼの精製》
DegPを、飽和状態まで一晩(15から20時間)成長させた後、KS272/pKS17(Strauchら(1989))から精製し、これはDegPの高レベル発現を誘導するのに十分であった。培養物6リットルから調製した全ペリプラズムをSPセファロースのカチオン交換クロマトグラフィー(HiTrap SP、Amersham−Pharmacia Biotech)(図3A)により、続いてブチルセファロースの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HiTrapブチル、Amersham−Pharmacia Biotech)(図3B)で分別した。この2工程精製方法によりおよそ98% 純粋なDegPプロテアーゼが得られた。図3に示す、SDS−PAGE分析で認められた「夾雑バンド」(小型矢印)はアミノ末端配列分析によりDegPトランケートとして同定され、これは恐らく自己触媒切断の結果であろう(データは示していない)。DegPの精製された調製物を45℃でインキュベートすることにより、トランケートバンドの蓄積に至った(データは示していない)。
DegPを、飽和状態まで一晩(15から20時間)成長させた後、KS272/pKS17(Strauchら(1989))から精製し、これはDegPの高レベル発現を誘導するのに十分であった。培養物6リットルから調製した全ペリプラズムをSPセファロースのカチオン交換クロマトグラフィー(HiTrap SP、Amersham−Pharmacia Biotech)(図3A)により、続いてブチルセファロースの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HiTrapブチル、Amersham−Pharmacia Biotech)(図3B)で分別した。この2工程精製方法によりおよそ98% 純粋なDegPプロテアーゼが得られた。図3に示す、SDS−PAGE分析で認められた「夾雑バンド」(小型矢印)はアミノ末端配列分析によりDegPトランケートとして同定され、これは恐らく自己触媒切断の結果であろう(データは示していない)。DegPの精製された調製物を45℃でインキュベートすることにより、トランケートバンドの蓄積に至った(データは示していない)。
《プロテアーゼ活性のアッセイ》
市販により入手可能なプロテアーゼアッセイであるEnzChek(Molecular Probes、Eugene、オレゴン州)を用いてカゼイン基質に及ぼすDegP調製物の切断活性を試験した。カゼインに及ぼすDegP活性はLipinskaらにより以前に報告されている(J.Bacetriol.172:1791−1797(1990))。EnzChek基質におけるピーク切断に次いで2つのクロマトグラフィー工程によるDegPの溶出プロファイルが続く(データは示していない)。図4はカゼイン基質における精製されたDegPプロテアーゼおよびトリプシンの力価測定を示す。
市販により入手可能なプロテアーゼアッセイであるEnzChek(Molecular Probes、Eugene、オレゴン州)を用いてカゼイン基質に及ぼすDegP調製物の切断活性を試験した。カゼインに及ぼすDegP活性はLipinskaらにより以前に報告されている(J.Bacetriol.172:1791−1797(1990))。EnzChek基質におけるピーク切断に次いで2つのクロマトグラフィー工程によるDegPの溶出プロファイルが続く(データは示していない)。図4はカゼイン基質における精製されたDegPプロテアーゼおよびトリプシンの力価測定を示す。
《可溶性PapA切断アッセイ》
DegP切断活性の以前の研究により、好ましい基質は変性した、凝集したまたはフォールディングされていないタンパク質であることが示された(Kimら、J.Mol.Biol.295(5):1363−1374(1999);Kolmarら、J.Bacetriol.178:5925−5929(1996);PallenおよびWren、Mol.Microbiol.26(2):209−221(1997))。可溶性様式で切断に適した基質と共にDegPを提供するために、PapA−6H4Aを6MのグアニジンHClで変性し、還元し、そしてカルボキシメチル化(PapA−6H4A−rcm)し、そして20mMのTris、pH=8.5に透析した。PapA−6H4A−rcmをDegPと混合し、そして45℃で一晩インキュベートし、そして得られた反応生成物をSDS−PAGEで分離して、そしてさらに全Pap線毛に対して調製した抗血清を用いてウェスタンブロットにより可視化した(図5)。図5Aレーン4に認められるように、PapA−6H4A−rcmは、21kDa単量体に加えて、SDSにおいて安定である重合体(または凝集体)を形成する。PapA−6H4A−rcmの双方の形態はDegPプロテアーゼによる分解に感受性がある(図5A、レーン3および5)。
DegP切断活性の以前の研究により、好ましい基質は変性した、凝集したまたはフォールディングされていないタンパク質であることが示された(Kimら、J.Mol.Biol.295(5):1363−1374(1999);Kolmarら、J.Bacetriol.178:5925−5929(1996);PallenおよびWren、Mol.Microbiol.26(2):209−221(1997))。可溶性様式で切断に適した基質と共にDegPを提供するために、PapA−6H4Aを6MのグアニジンHClで変性し、還元し、そしてカルボキシメチル化(PapA−6H4A−rcm)し、そして20mMのTris、pH=8.5に透析した。PapA−6H4A−rcmをDegPと混合し、そして45℃で一晩インキュベートし、そして得られた反応生成物をSDS−PAGEで分離して、そしてさらに全Pap線毛に対して調製した抗血清を用いてウェスタンブロットにより可視化した(図5)。図5Aレーン4に認められるように、PapA−6H4A−rcmは、21kDa単量体に加えて、SDSにおいて安定である重合体(または凝集体)を形成する。PapA−6H4A−rcmの双方の形態はDegPプロテアーゼによる分解に感受性がある(図5A、レーン3および5)。
以前の報告では、DegPタンパク質溶解活性をモニター観察するのに適したいくつかの異なるバッファー系が記載されている(Kimら(1999);Kolmarら(1996);Lipinskaら(1990);Spiessら、Cell 97:339−347(1999))。2価カチオン(Mg2+)はいくつかの系で必要とされることが報告された(Kimら(1999))。従って、我々はMgCl2、MnCl2、およびCaCl2の、PapA−6H4A−rcmのDegP切断に及ぼす影響を試験した(図5B、および示していないデータ)。5mMのMgCl2(図5B)、MnCl2、またはCaCl2(データは示していない)の添加により、PapA−6H4A−rcmのDegP切断が刺激され、その結果4時間のインキュベーションで投入タンパク質の50%近くが分解された(図5B)。さらにEDTAの切断反応物への添加により切断活性が抑制される(図6、レーン3〜5および7〜10を比較)。
《カルボキシ末端ピリンサブユニットペプチドによるDegPの活性化》
DegPプロテアーゼは、触媒性セリン残基の下流に位置する2つのいわゆるPDZドメイン(Post−synaptic density 95,Discs−large,ZO−1)を有している(PallenおよびWren(1997))。PDZドメインは双方の基質認識および多くのタンパク質のタンパク質多量体化に関連している(Levchenkoら、Cell 91:939−947(1997);Sassoonら、Mol.Microbiol.33:583−589(1999);Songyangら、Science 275:73−77(1997))。Levchenkoら(1997)は最近ClpXシャペロンおよびClpXプロテアーゼ機構の制御サブユニットが基質認識においてPDZドメインを利用することを実証した。PDZドメインは標的タンパク質のカルボキシル末端で見出されたペプチド配列の乱れを特異的に認識する(Levchenkoら(1997);Songyangら(1997))。ピリンサブユニットのカルボキシル末端は線毛の究極的な構造における近隣サブユニットとの相互作用に重要な高度に保存されたモチーフ、およびペリプラズムシャペロンの認識モチーフである(Bullittら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12890−12895(1996);Choudhuryら、Science 285(5430):1061−1066(1999);Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology、F.C.Niehardt編、ASM Press、Washington DC、2730−2756頁(1996)のHultgrenら、「Bacterial Adhesins and Their Assembly」;Sauerら、Science 285(5430):1058−1061(1999))。カルボキシル末端モチーフは、報告されたところによると、PDZドメインにより認識されたモチーフに対していくらかの相同性を有する(Levchenkoら(1997);Songyangら(1997))。我々は、PapG付着タンパク質(SPCJ−1−KSMCMKLSFS)(配列番号13)からのカルボキシル末端ペプチドのDegP切断反応での力価測定はPDZドメインでの基質結合部位に関する競合によりPapA−6H4A−rcmタンパク質の切断を抑制すると仮定した。大変興味深いことに、SPCJ−1の切断反応への添加によりPapA−6H4A−rcmの分解が増強された(図6)。SPCJ−1の不在下では、PapAタンパク質の50%切断には45℃で4時間の消化が必要とされ(図5Bおよび示されていないデータ)、一方4倍少ない酵素および2倍ほどの基質を含有する反応において、活性化ペプチドの添加により60分で50% 切断に至り、そして4時間で90%近くの切断に至る(図6、レーン2〜5)。予想されるように、10mM EDTAの存在下、PapA−6H4A−rcmの切断は抑制された(1時間で7%切断)(図6、レーン7〜10)。
DegPプロテアーゼは、触媒性セリン残基の下流に位置する2つのいわゆるPDZドメイン(Post−synaptic density 95,Discs−large,ZO−1)を有している(PallenおよびWren(1997))。PDZドメインは双方の基質認識および多くのタンパク質のタンパク質多量体化に関連している(Levchenkoら、Cell 91:939−947(1997);Sassoonら、Mol.Microbiol.33:583−589(1999);Songyangら、Science 275:73−77(1997))。Levchenkoら(1997)は最近ClpXシャペロンおよびClpXプロテアーゼ機構の制御サブユニットが基質認識においてPDZドメインを利用することを実証した。PDZドメインは標的タンパク質のカルボキシル末端で見出されたペプチド配列の乱れを特異的に認識する(Levchenkoら(1997);Songyangら(1997))。ピリンサブユニットのカルボキシル末端は線毛の究極的な構造における近隣サブユニットとの相互作用に重要な高度に保存されたモチーフ、およびペリプラズムシャペロンの認識モチーフである(Bullittら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12890−12895(1996);Choudhuryら、Science 285(5430):1061−1066(1999);Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology、F.C.Niehardt編、ASM Press、Washington DC、2730−2756頁(1996)のHultgrenら、「Bacterial Adhesins and Their Assembly」;Sauerら、Science 285(5430):1058−1061(1999))。カルボキシル末端モチーフは、報告されたところによると、PDZドメインにより認識されたモチーフに対していくらかの相同性を有する(Levchenkoら(1997);Songyangら(1997))。我々は、PapG付着タンパク質(SPCJ−1−KSMCMKLSFS)(配列番号13)からのカルボキシル末端ペプチドのDegP切断反応での力価測定はPDZドメインでの基質結合部位に関する競合によりPapA−6H4A−rcmタンパク質の切断を抑制すると仮定した。大変興味深いことに、SPCJ−1の切断反応への添加によりPapA−6H4A−rcmの分解が増強された(図6)。SPCJ−1の不在下では、PapAタンパク質の50%切断には45℃で4時間の消化が必要とされ(図5Bおよび示されていないデータ)、一方4倍少ない酵素および2倍ほどの基質を含有する反応において、活性化ペプチドの添加により60分で50% 切断に至り、そして4時間で90%近くの切断に至る(図6、レーン2〜5)。予想されるように、10mM EDTAの存在下、PapA−6H4A−rcmの切断は抑制された(1時間で7%切断)(図6、レーン7〜10)。
《ペプチドスキャニングによるPapA内でのDegP認識部位の同定》
SPOT合成技術(Jerini AG、Berlin、ドイツ)を利用して、完全PapAアミノ酸配列の2つの重複ペプチドスキャニングライブラリーを構築し、そして検定して、DegPタンパク質溶解に適した基質である7merおよび12merペプチドを同定した(図7)。ペプチドはアミノ末端でアミノ安息香酸(Abz)蛍光タグを担持し、そしてセルロース膜に連結されたものを合成した。7merおよび12merProteaseSpot(商標)スキャンの双方で、PapAの3領域は、セルロース結合ペプチドからの蛍光カウントの放出により表されるように、DegPにより切断可能な配列を有しているとして同定された。興味深いことに、この分析により同定された切断領域は全てβ鎖内またはそれに対して近位に存在し、そしてピリンサブユニットタンパク質の高度に保存された領域にある(SotoおよびHultgren、J.Bacteriol.181:1059−1071(1999)の図4参照)。
SPOT合成技術(Jerini AG、Berlin、ドイツ)を利用して、完全PapAアミノ酸配列の2つの重複ペプチドスキャニングライブラリーを構築し、そして検定して、DegPタンパク質溶解に適した基質である7merおよび12merペプチドを同定した(図7)。ペプチドはアミノ末端でアミノ安息香酸(Abz)蛍光タグを担持し、そしてセルロース膜に連結されたものを合成した。7merおよび12merProteaseSpot(商標)スキャンの双方で、PapAの3領域は、セルロース結合ペプチドからの蛍光カウントの放出により表されるように、DegPにより切断可能な配列を有しているとして同定された。興味深いことに、この分析により同定された切断領域は全てβ鎖内またはそれに対して近位に存在し、そしてピリンサブユニットタンパク質の高度に保存された領域にある(SotoおよびHultgren、J.Bacteriol.181:1059−1071(1999)の図4参照)。
《ペプチド切断アッセイ》
DegPプロテアーゼ活性をモニター観察するための可溶性ペプチド切断アッセイを確立するために、配列−HYTAVVKKSSAV(配列番号3)により表される最も効率のよい切断領域をモデル基質として使用し、そしてペプチドSPCJ−12を蛍光クエンチ検出アッセイにおいて使用するために調製した。アミノ末端で蛍光部分であるアミノ安息香酸(Abz)基、およびカルボキシル末端でクエンチ部分であるジアミノプロピオンアミドジニトロフェニル(DAP(Dnp)−NH2)基を用いてSPCJ−12を調製した。図8Aで示すように、DegPは時間依存的様式でSPCJ−12を切断した。さらに認識配列を狭め、そして切断の決定因子を定義するために、2つのさらなるペプチド試薬、SPCJ−13およびSPCJ−14を調製した。SPCJ−13はHYTAVVK(配列番号4)(SPCJ−12の最初の7つの残基)を有し、一方SPCJ−14はHYTASSK(配列番号17)を有する。2重セリン置換を利用してSPCJ−13における疎水性残基対の不可欠性を試験した。図8Bに示すように、DegPは時間依存的様式でSPCJ−13を切断したが、SPCJ−14は切断しなかった。DegPの2重セリン置換ペプチドの切断の失敗を洞察するために、SPCJ−14がSPCJ−13の切断を遮断し得るかどうかを調べるために抑制アッセイを設定した。このような結果は、DegPが依然SPCJ−14を認識するが、ペプチドを切断できないことを示唆した。図8Cに示すように、10倍過剰のモル濃度で添加した場合、SPCJ−14はSPCJ−13の切断を遮断した。最後に、切断不能ペプチドSPCJ−1のペプチド切断アッセイへの添加によりSPCJ−13の切断が増強された(図8D)。
DegPプロテアーゼ活性をモニター観察するための可溶性ペプチド切断アッセイを確立するために、配列−HYTAVVKKSSAV(配列番号3)により表される最も効率のよい切断領域をモデル基質として使用し、そしてペプチドSPCJ−12を蛍光クエンチ検出アッセイにおいて使用するために調製した。アミノ末端で蛍光部分であるアミノ安息香酸(Abz)基、およびカルボキシル末端でクエンチ部分であるジアミノプロピオンアミドジニトロフェニル(DAP(Dnp)−NH2)基を用いてSPCJ−12を調製した。図8Aで示すように、DegPは時間依存的様式でSPCJ−12を切断した。さらに認識配列を狭め、そして切断の決定因子を定義するために、2つのさらなるペプチド試薬、SPCJ−13およびSPCJ−14を調製した。SPCJ−13はHYTAVVK(配列番号4)(SPCJ−12の最初の7つの残基)を有し、一方SPCJ−14はHYTASSK(配列番号17)を有する。2重セリン置換を利用してSPCJ−13における疎水性残基対の不可欠性を試験した。図8Bに示すように、DegPは時間依存的様式でSPCJ−13を切断したが、SPCJ−14は切断しなかった。DegPの2重セリン置換ペプチドの切断の失敗を洞察するために、SPCJ−14がSPCJ−13の切断を遮断し得るかどうかを調べるために抑制アッセイを設定した。このような結果は、DegPが依然SPCJ−14を認識するが、ペプチドを切断できないことを示唆した。図8Cに示すように、10倍過剰のモル濃度で添加した場合、SPCJ−14はSPCJ−13の切断を遮断した。最後に、切断不能ペプチドSPCJ−1のペプチド切断アッセイへの添加によりSPCJ−13の切断が増強された(図8D)。
SPCJ−12およびSPCJ−13の正確な切断部位をマッピングするために、切断反応の反応生成物をC18 Sephasilカラムを用いる逆相HPLCで分離した(図9A)。未処置SPCJ−13は53.06mlの保持容量を有する(データは示していない)が、切断後、45.72mlの保持容量を有する1本の新たなピークが認められ、そして53.06mlピークが大きく減少した(図9A)。新たなピークにおける材料の質量をMALDI−TOF質量分析器分析により決定した。新たなピークは、ペプチドのバリン残基対の間の切断に合致する質量(480.59=VK−DAP(Dnp)−NH2;708.99=ABZ−HYTAV)を有する2つの種を含有した(図9B)。確認のために、SPCJ−12の切断部位もまたMALDI MSによりマッピングし、そして再度DegPがバリン残基対の間で切断したことを実証した(データは示していない)。
[論考]
細胞質およびペリプラズムのミスフォールディングおよび/または誤集合タンパク質の分解および清掃は、細菌の盛んな増殖に必須である(Gottesman、Ann.Rev.Genet.30:465−506(1996);Laskowskaら、Mol.Microbiol.22:555−571(1996);PallenおよびWren(1997))。大腸菌およびたいていのグラム陰性生物のペリプラズムでは、この仕事はDegPプロテアーゼにかかっている(PallenおよびWren(1997))。DegPの機能的な複製の欠如により細菌は高温での増殖に失敗する(Lipinskaら(1990);PallenおよびWren(1997))。さらに最近のデータでは、degPヌル変異体は、高温での増殖が危ういのに加えて、酸化ストレスに対してさらに鋭敏であり、そして無毒性である(Boucherら、J.Bacteriol.178:511−523(1996);Elzerら、Res.Vet.Sci.60:48−50(1996a);Elzerら、Infect.& Immun.64:4838−4841(1996b);Liら、Infect.& Immun.64:2088−2094(1996);PallenおよびWren(1997);Pedersonら、Infect.& Immun.69(4):2569−2579(2001);Phillipsら、Res.Vet.Sci.63:165−167(1997);Robertsら、Infect.& Immun.68(10):6041−6043(2000);Tacketら、Infect.& Immun.65:452−456(1997);Tacketら、Infect.& Immun.68(3):1196−1201(2000))。現在のモデルは、病原体の侵入に対する宿主の酸化応答の結果、ペリプラズムのタンパク質の酸化的変性に至る。いくつかの最近記載された感染の動物モデルでは、degP変異株の変性タンパク質を清掃またはリフォールディングすることができないと、病原体に十分な負担を負わせ、毒性の低下に至る(Boucherら(1996);Elzerら(1996a);Elzerら(1996b);Liら(1996);PallenおよびWren(1997);Pedersonら(2001);Phillipsら(1997);Robertsら(2000);Tacketら(1997);Tacketら(2000))。
細胞質およびペリプラズムのミスフォールディングおよび/または誤集合タンパク質の分解および清掃は、細菌の盛んな増殖に必須である(Gottesman、Ann.Rev.Genet.30:465−506(1996);Laskowskaら、Mol.Microbiol.22:555−571(1996);PallenおよびWren(1997))。大腸菌およびたいていのグラム陰性生物のペリプラズムでは、この仕事はDegPプロテアーゼにかかっている(PallenおよびWren(1997))。DegPの機能的な複製の欠如により細菌は高温での増殖に失敗する(Lipinskaら(1990);PallenおよびWren(1997))。さらに最近のデータでは、degPヌル変異体は、高温での増殖が危ういのに加えて、酸化ストレスに対してさらに鋭敏であり、そして無毒性である(Boucherら、J.Bacteriol.178:511−523(1996);Elzerら、Res.Vet.Sci.60:48−50(1996a);Elzerら、Infect.& Immun.64:4838−4841(1996b);Liら、Infect.& Immun.64:2088−2094(1996);PallenおよびWren(1997);Pedersonら、Infect.& Immun.69(4):2569−2579(2001);Phillipsら、Res.Vet.Sci.63:165−167(1997);Robertsら、Infect.& Immun.68(10):6041−6043(2000);Tacketら、Infect.& Immun.65:452−456(1997);Tacketら、Infect.& Immun.68(3):1196−1201(2000))。現在のモデルは、病原体の侵入に対する宿主の酸化応答の結果、ペリプラズムのタンパク質の酸化的変性に至る。いくつかの最近記載された感染の動物モデルでは、degP変異株の変性タンパク質を清掃またはリフォールディングすることができないと、病原体に十分な負担を負わせ、毒性の低下に至る(Boucherら(1996);Elzerら(1996a);Elzerら(1996b);Liら(1996);PallenおよびWren(1997);Pedersonら(2001);Phillipsら(1997);Robertsら(2000);Tacketら(1997);Tacketら(2000))。
このモデルとの一致において、DegPの好ましい基質は全体的にまたは一過的に変性しているタンパク質であると考えられ、これはインビボでの役割がペリプラズムからミスフォールディングまたは変性したタンパク質を除去することであるという仮説を支持している(Kolmarら(1996))。Kolmarら(Kolmarら(1996))は、DegPがλレプレッサーおよびArcレプレッサーのフォールディング遅延変異体を切断し、そして切断部位P1残基は疎水性残基であり、たいていはバリンであることを実証した。疎水性切断部位は変性した標的においてのみ利用可能であるので、これらのデータは仮説を支持する。従って、タンパク質が「オフ経路」を進んだか、または環境侵襲のために変性した場合、DegP基質の認識部位が暴露される。魅力的なモデルではあるが、用いられたタンパク質がいずれもペリプラズムタンパク質でないという事実によりこの研究は妨害された。しかしながら、この知見を支持して、Laskowskaら(Laskowskaら(1996))はインビトロで、精製されたDegPタンパク質が、大腸菌抽出物から分別された熱凝集タンパク質を分解することを実証した。さらに、彼らはDnaJシャペロンがDegP分解を拮抗する;すなわちタンパク質がDegPによる分解の標的ではないように、シャペロンがタンパク質のリフォールディングを助けることを示した。
我々は、腎盂腎炎随伴線毛(Pap)由来のPapAピリンがインビトロでDegPの標的であることを明白に実証した。変性金属アフィニティークロマトグラフィーに結合したアミノ末端ポリヒスチジンアフィニティータグを用いて、可溶性切断アッセイを実施するために、十分なPapA−6H4Aをペリプラズムシャペロン、PapDから精製することができる(図1)。標準的なクロマトグラフィー手段によりDegPプロテアーゼを精製し(図3)、そしてカゼイン基質および変性し、還元し、そしてカルボキシメチル化したPapA−6H4Aの双方でタンパク質溶解活性を示した(図4および5)。還元し、そしてカルボキシメチル化していないPapA−6H4AにおけるDegP切断活性を、PapA−6H4A−rcmにおけるその活性と比較することにより最小にした(データは示していない)。しかしながら、PapDとの複合体形成または線毛への集合がない場合のPapAの正確な「フォールディング状態」を定義することは難しい提案である。最近の同時結晶化研究により、元来のフォールディングにおけるβシートを完了するのに必要な第7番目のカルボキシル末端鎖の不在のために、ピリンサブユニットが不完全な免疫グロブリンフォールディングを有することが示された(Choudhuryら(1999);Sauerら(1999))。線毛生合成の間に、この鎖欠損がペリプラズムシャペロンまたは近隣のピリンサブユニットのいずれかにより、各々供与鎖補完または供与鎖交換を介して提供される(Choudhuryら(1999);Sauerら(1999))。
切断されたPapAのアミノ末端切除断片(truncate)をアフィニティー樹脂上の、または可溶性切断アッセイの変性基質を用いて同定して、切断がタンパク質の中央近くで生じることが示唆された(図1Dおよび6)。DegP切断の特異性をさらに定義し、そしてPapA内で切断部位をマッピングするために、重複ペプチドスキャンを利用した(ProteaseSpot(商標)、Jerini AG、Berlin、ドイツ)(Peptides 2000:Proceedings of the 26th European Peptide Symposium、J.MartinezおよびJ.A.Fehrenetz編、(2000)のReinekeら、「High Throughput Screening Assay for the Identifiation of Protease Substrates」)。双方のスキャニングライブラリー(7merおよび12mer、図7)は固相アッセイにおいてDegPによる切断を増強しているPapAの3領域を同定した。蛍光クエンチアッセイ系を利用する可溶性切断アッセイにおいて、スキャニングの結果をカルボキシル末端の最大のペプチド配列であるSPCJ−12(HYTAVVKKSSAV)(配列番号3)およびより短い形であるSPCJ−13(HYTAVVK)(配列番号4)に関して確認した(図8)。この配列の切断の特異性を対象ペプチドであるSPCJ−14(HYTASSK)(配列番号17)を用いてさらに定義し、これはバリン残基対が不在の場合のペプチドを切断するようにプロテアーゼを誘発した。SPCJ−14の切断の欠如は、モデルDegP基質のP1残基がたいていバリン残基であることを示したSauer研究所からの以前に報告された研究と合致する(Kolmarら(1996))。ペプチドスキャニングにより同定されたその他の配列のうち、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、およびNVLHYTA(配列番号11)もまた疎水性残基対を有したが、NGHSDEL配列はこのパターンに従わない。明らかに、配列に加えてペプチド構造は、配列を共有する「近隣の」ペプチドが固相アッセイにおいて同等に切断されなかったいくつかの実例で認めることができるように、DegPによる認識において果たす役割を有している(図7)。
最初の固相切断アッセイにおいて同定されたPapD切断フラグメント(〜12kDa)(図1D)はアミノ末端シークエンシングによりPapAのアミノ末端フラグメントとして同定された。このフラグメントは再び固相アッセイで(図6)、アミノ末端シークエンシングにより決定された切断生成物の同定に至る。この切断生成物は上流部位、(LDIELVNCDITA)(配列番号5)、(FTGPIVNGHSDE)(配列番号8)の1つでの切断の可能性が非常に高い。
基質認識に関しては、Sonyangら(Sonyangら(1997))は最近PDZドメインにより認識された標的タンパク質におけるカルボキシル末端モチーフを同定した。この知見を考慮して、細菌プロテアーゼのPDZドメインは、プロテアーゼ切断部位とは異なるタンパク質のミスフォールディング状態をシグナル化する配列を認識することができる。Sonyangらにより同定されたモチーフの最も特筆すべき特徴は−3位置(同定された配列の>60%)での保存的残基(スレオニン、セリン、またはチロシン)および高度に保存された(>80%)疎水性カルボキシル末端残基(バリン、イソロイシン、またはロイシン)である。興味深いことに、44ピリンサブユニットのカルボキシル末端のアラインメントにより、−3位置がしばしばセリン、スレオニンまたはチロシンであることが示された(〜50%)(SotoおよびHultgren(1999))。シャペロン先導物質集合体経路(chaperone−usher assembly pathway)により集合した細菌線毛、例えばPap線毛が構造および配列特性に基づいて2つのファミリー:いわゆるFGSおよびFGLサブファミリーに最近分けられた(Hungら(1996))。FGLサブファミリーでは、−3位置での保存(セリロン、スレオニンまたはチロシン)は80%以上である。PapGのカルボキシル末端の10個の残基を確認するための、SPCJ−1(KSMCMKLSFS)(配列番号13)を用いた我々の最初の結果は、DegPのPDZドメインがカルボキシル末端配列との相互作用を介して基質認識において役割を果たすことを示している。SPCJ−1を添加し、そして不適切なペプチドを添加しない(データは示していない)ことによりプロテアーゼの切断活性が増強された(図5、6および8D)。2つの最近の文献で詳細に記載されており(Choudhuryら(1999);Sauerら(1999))、そして先の遺伝子データにより支持されているように(Bullittら(1996);Hultgrenら(1996);Kuehnら(1993);Slonimら(1992);SotoおよびHultgren(1999);Xuら(1995))、ピリンサブユニットのカルボキシル末端はシャペロン−サブユニット複合体形成のための認識部位の不可欠な成分である。前記で簡単に論じたように、免疫グロブリンフォールディングのカルボキシル末端第7鎖の欠如の結果、疎水性コアに暴露するピリンの表面で深い溝ができる。この溝の一方の縁はピリンのカルボキシル末端β鎖により線になる(F鎖)(完全な論考に関しては(Choudhuryら(1999);Sauerら(1999)参照)。供与鎖補完の間に、シャペロンはそのG鎖を提供してピリンの免疫グロブリンフォールディングを完成する。供与されたG鎖は溝の両側との相互作用によりピリンの疎水性コアを完了する。双方の遺伝子データおよび分子モデル化により、ピリンサブユニットのカルボキシル末端が線毛集合体を招くピリン−ピリン接触部分の一部であるモデルが支持される(Bullittら(1996);Hultgrenら(1996);Choudhuryら(1999);Sauerら(1999))。従って、このモチーフが溶媒に暴露されるのは稀である。ミスフォールディングまたは誤集合の事象におけるこのモチーフの暴露は、リフォールディングを触媒するためのシャペロンかまたはタンパク質を分解するためのプロテアーゼのいずれかの必要性をシグナル化する。
これらの研究は、主要なペリプラズムプロテアーゼであるDegPがミスフォールディングされたピリンサブユニットを切断するメカニズムを説明し、そしてDegP基質に関する一般的なタンパク質溶解経路に関係し得る。グラム陰性およびグラム陽性病原体の双方の病原性におけるDegPの役割は高速大量処理スクリーニングおよびこの重要な毒性標的の小型分子インヒビターの同定に適したアッセイを開発するための推進力を提供する。記載した研究によりDegPプロテアーゼに対して開発された新規クラスの抗感染薬の開発のための道が開かれる。
本明細書が参考にした全ての引用した特許および出版物はその全てを参照として本明細書に組み込まれる。
Claims (19)
- DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質を同定するための方法であって、
切断可能な基質の存在下でDegPまたはDegPホモログに物質を添加するステップと、
前記切断可能な基質の切断の増強または抑制を検出し、それにより前記物質が前記プロテアーゼ活性を変調するかどうかを決定するステップと
を含む、方法。 - 前記切断可能な基質がHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるポリペプチドである請求項1の方法。
- 前記DegPホモログがDegSまたはDegQである請求項1の方法。
- 前記物質が前記プロテアーゼ活性を増強する請求項1の方法。
- 前記物質が前記プロテアーゼ活性を抑制する請求項1の方法。
- 前記物質がDegP活性を変調する請求項1の方法。
- DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を防御、抑制または増強することを含む、線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療または予防のための方法。
- HYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調するための方法であって、
DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調するのに十分な量の切断可能な基質の存在下で、切断不能な基質または切断可能な基質からなる群から選択される1つまたは複数の物質をDegPまたはDegPホモログに添加することを含む、方法。 - 前記DegPホモログがDegQまたはDegSである請求項9に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ活性が抑制される請求項9に記載の方法。
- 前記物質が切断可能な基質である請求項9に記載の方法。
- 前記切断可能な基質がHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるポリペプチドである請求項12に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ活性が増強される請求項9に記載の方法。
- 前記物質がアミノ酸配列KSMCMKLSFS(配列番号13)を含むポリペプチドである請求項9に記載の方法。
- DegPまたはDegPホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質およびそのキャリアを含む組成物。
- 前記物質がHYTAVVKKSSAV(配列番号3)、HYTAVVK(配列番号4)、LDIELVNCDITA(配列番号5)、ELVNCDI(配列番号6)、KLAFTGPIVNGH(配列番号7)、FTGPIVNGHSDE(配列番号8)、TLKDGENVLHYT(配列番号9)、DGENVLH(配列番号10)、NVLHYTA(配列番号11)、およびNGHSDEL(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項16に記載の組成物。
- 前記物質がアミノ酸配列KSMCMKLSFS(配列番号13)を有するポリペプチドである請求項16に記載の組成物。
- ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ポリミキシン、抗マイコバクテリア薬、および尿路防腐薬からなる群から選択される少なくとも1つの抗菌物質をさらに含む請求項16に記載の組成物。
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