JP2005516015A - エポキシステロイドアルドステロン拮抗薬を用いる対象におけるアルドステロン媒介病原性効果を治療または予防する方法 - Google Patents

エポキシステロイドアルドステロン拮抗薬を用いる対象におけるアルドステロン媒介病原性効果を治療または予防する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、正常以下の内因性アルドステロン濃度、食塩感受性および食事ナトリウムの高摂取量からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有し、１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果に罹患または罹患しやすい対象における１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果を治療または予防する方法を提供する。これらの方法は、治療上有効な量の、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を対象に投与することを含む。

Description

本出願は、１９９９年１１月９日に出願した米国仮特許出願第６０／１６４３９０号の優先権を主張する、２０００年１１月８日に出願した米国特許出願第０９／７０９２５３号の一部継続出願である。本出願はまた、２０００年１１月１４日に出願した米国特許出願第０９／７１３３４８号の一部継続出願であり、２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１０６４号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１２５０号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１２５３号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１２６４号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１３１１号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１３４０号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１４５１号および２０００年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１４５９号および２０００年７月２７日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１３５８号および２０００年７月２７日に出願した米国仮特許出願第６０／２１１３６４号および２０００年９月１４日に出願した米国仮特許出願第６０／２３３０５６号の優先権を主張する。
本発明は、特にナトリウムレベルの上昇の存在下での内因性アルドステロンの作用に起因する対象における１つまたは複数の病原性効果を治療かつ／または予防する方法に関する。より詳細には、本発明は、正常以下のアルドステロンレベル、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有するヒト対象における高血圧、心血管疾患および／または腎機能不全の治療および／または予防のためのエプレレノンのようなアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物の使用に関する。
関連技術の説明
本態性高血圧症は、全世界の主要な血管疾患であり、重要な公衆衛生上の問題である。高血圧症に伴う血圧の上昇は、冠動脈性心疾患および脳卒中の発生に関連付けられている。例えば、Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ ＪＤおよびＬａｒａｇｈ ＪＨ、うっ血性心不全：病態生理、診断および管理（Ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ： ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）、第１版、Ｃａｄｄｏ（ＯＫ）：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９４年は、高血圧症は心不全を発現するリスクを３倍にすると報告した。同様に、ＭａｃＭａｈｏｎ Ｓ等：Ｌａｎｃｅｔ １９９０年、第３３５巻、７６５〜７１頁は、拡張期血圧のわずか５ｍｍＨｇの長期の降下が冠動脈性疾患を発現するリスクの少なくとも２０％、脳卒中を発現するリスクの少なくとも３３％の低下をもたらすことを報告した。
高血圧症はまた、末期腎疾患と関連付けられた。高血圧症および／または糖尿病性神経障害により引き起こされる末期腎疾患は、多大な公衆衛生上の負担であり、発現率と有病率は米国を含む多くの国において警戒心をいだかせるほどに増加しつつある。（米国腎データシステム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ）、米国腎データシステム１９９９年年次データ報告書（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ １９９９ Ａｎｎｕａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ）からの抜粋、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ、１９９９年、第３４巻、増刊第１号、Ｓ１〜Ｓ１７６頁）。血圧の認識とコントロールが改善されたため、脳卒中や冠動脈性疾患のような高血圧症の他の合併症が実質的に減少したにもかかわらず、高血圧により誘発される末期腎疾患の発現率は増加している（高血圧の予防、検出、評価および治療に関する全米合同委員会の第６次報告（Ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９７年、第１５７巻、２４１３〜４６頁）。
レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（「ＲＡＡＳ」）は、高血圧の発現と進行に重要な役割を果たしている。ＲＡＡＳは、細胞外液量の欠乏および低血圧に対するほぼすべての生理学的反応に中心的な役割を果たしている。血液量または動脈血圧の低下は、アンジオテンシノーゲンに作用して、アンジオテンシンＩを生成させる腎におけるレニンの放出をもたらす。次に、アンジオテンシン変換酵素がアンジオテンシンＩを、血液量と血圧を回復させるいくつかの末梢および中枢で媒介される反応を引き起こすアンジオテンシンＩＩに変換する。末梢では、アンジオテンシンＩＩは平滑筋細胞に作用して、血管収縮を引き起こし、血圧を上昇させる。中枢では、アンジオテンシンＩＩは交感神経流出とバソプレシン放出を増加させるように作用する。アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換は主として肺で起こり、アンジオテンシンＩＩは末梢および中枢中で循環して標的組織に達する。しかし、この変換は脳の領域においても起こり得る。
アンジオテンシンＩＩは、副腎皮質の球状帯も刺激して、鉱質コルチコイドであるアルドステロンの合成と分泌の増加をもたらす。アルドステロンは、遠位および集合尿細管に作用して、ナトリウムの貯留とカリウムおよび水素の排泄を引き起こす。そのようなナトリウム貯留は、血液量の増加をもたらす。アルドステロンは、心不全の病態生理に役割を果たし、高血圧、心臓肥大、心臓および血管線維症ならびに心室性不整脈に関連付けられた（Ｄｚａｕ ＶＬ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９８１年、第６３巻、６４５〜６５１頁）。心不全を有する患者では、高アルドステロンレベルはこれらの患者における死亡率の増加に対応するように思われる（Ｇｅｒｂｅ ＪＧ等、降圧薬および高血圧症の薬物療法（Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、Ｇｏｏｄｍａｎ ＬＳ、Ｇｉｌｍａｎ ＡＧ編、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９３年、７８４〜８１３頁）。
Ｗｅｂｅｒ ＫＴ等（Ｃｉｒ．、１９８７年、第７５巻（増刊１号）、Ｉ−４０〜Ｉ−４７頁）は、循環アルドステロンレベルの慢性上昇が、選択した動物における進行性心不全に寄与する、心臓および血管における線維性組織形成をもたらしたことを報告した。心筋コラーゲン産生の増加とその後の左室肥大は、心筋硬直、心室および血管コンプライアンス、拡張期充満の障害、拡張および収縮機能不全、虚血ならびに最終的に心不全をもたらす。Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ ＡＤ、Ｊ Ｃａｒｄｉａｃ Ｆａｉｌｕｒｅ、１９９６年、第２巻、４７〜５４頁によれば、そのような心筋線維症は不整脈および突然死をもたらし得る。アルドステロンは、心筋のノルエピネフリン取り込みを阻害し、血漿ノルエピネフリンを増加させ、心室異所性活動を促進する。Ｒｏｃｈａ Ｒ等、Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９９年、第１２巻、７６Ａ頁は、アルドステロンはラットにおける圧受容体機能に影響を及ぼし、脳および腎血管損傷ならびに内皮機能不全を引き起こすことを報告した。アルドステロンはまた、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質レベルを増加させ、それにより線維素溶解を妨げることがあることが報告された。
多くの臨床医がアンジオテンシン変換酵素阻害薬（「ＡＣＥ阻害薬」）によるＲＡＡＳの阻害はアルドステロンの生成を妨げると推定した。しかしながら、ＡＣＥ阻害薬の長期投与を受けている大多数の患者において著明な血漿中アルドステロン濃度が検出された。ＡＣＥ阻害薬はアルドステロンレベルを一時的に抑制するにすぎないことを示唆する証拠が増加しつつある（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ ＡＤ、Ｊ Ｃａｒｄｉａｃ Ｆａｉｌｕｒｅ、１９９６年、第２巻、４７〜５４頁）。血漿中アルドステロン濃度は、ＡＣＥ阻害薬投与により最初は低下するが、継続的な薬物投与の遵守が良好であるにもかかわらず、３〜６カ月間のＡＣＥ阻害薬療法の後に投与前のレベルに戻る（Ｓｔａｅｓｓｅｎ Ｊ等、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒ、１９８１年、第９１巻、４５７〜４６５頁）。この「アルドステロンエスケープ」の現象は、血清カリウムのようなアルドステロン放出の他の重要な決定因子が存在するために起こる（Ｐｉｔｔ Ｂ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５年、第９巻、１４５〜１４９頁）。Ｍａｒａｙｅｖ Ｖ等は、オランダのアムステルダムにおける１９９５年の心不全に関する国際会議における発表で、このエスケープ現象は心不全患者における高い死亡率に寄与する可能性があると提唱した。
Ｇｒｅｅｎ Ｅ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６年、第９８巻、１０６３〜８頁は、腎疾患の媒介へのアンジオテンシンＩＩの関与を示唆する多くの証拠が蓄積されているが、アルドステロンも血行動態への作用および直接的な細胞への作用により進行性腎疾患に関連している可能性があると主張した。高アルドステロン症および副腎肥大が残遺組織腎臓モデルに認められ、アルドステロンの血漿中濃度は約１０倍増加していた。さらに、臨床試験でアルドステロン濃度の増加と腎機能の悪化との間の関係が報告された（Ｈｅｎｅ ＲＪ等、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、１９８２年、第２１巻、９８〜１０１頁）。例えば、Ｂｅｒｌ Ｔ等（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、１９７８年、第１４巻、２２８〜３５頁）は、腎不全を有する血中カリウム正常患者８例中５例およびクレアチニンクリアランスが１５ｍＬ／分未満の患者６例中５例で血漿中アルドステロン濃度が高かったことを認めた。その後の試験で、Ｈｅｎｅ ＲＪ等（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、１９８２年、第２１巻、９８〜１０１頁）は、正常値の５０％未満のクレアチニンクリアランスを有する２８人の患者の血漿中アルドステロン濃度は、血清中カリウム濃度が正常で、血漿中レニン活性が正常であるにもかかわらず、高かったことを認めた。Ｉｂｒａｈｉｍ ＨＮ等（Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９７年、第１７巻、４３１〜４０頁）は、カリウムおよびアンジオテンシンＩＩ（腎不全患者では両方が高濃度である）が協力して、腎不全および進行性腎疾患を随伴するアルドステロン過剰を促進する可能性があることを示唆した。Ｑｕａｎ ＺＹ等（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、１９９２年、第４１巻、３２６〜３３頁）は、亜全腎摘出と副腎摘出を受けたラットにおける高血圧、蛋白尿および構造的腎損傷は部分腎摘出を受けたが、副腎は完全であったラットと比較して支配的でなかったことを報告した。この結果は、副腎摘出ラットにおいて大量のグルココルチコイドの補充（アルドステロンは補充しなかった）にもかかわらず発生した。
酢酸デオキシコルチコステロン（「ＤＯＣＡ」）−食塩高血圧症ラットモデルでは、ＤＯＣＡ投与動物への外因性鉱質コルチコイドの投与により悪性腎硬化症および脳卒中の病変が誘発された（Ｇａｖｒａｓ等、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、１９７５年、第３６巻、３００〜９頁）。Ｈｏｒｉｕｃｈｉ等は、食塩負荷なしに悪性腎硬化症の発現が起こった脳卒中易発性高血圧自然発症ラット（「ＳＨＲＳＰ」）の亜系の腎臓におけるアルドステロン受容体の濃度の増加を報告した（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｍ等、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９３年、第２６４巻、２８６〜９１頁）。さらに、Ｕｌｌｉａｎ等は、Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラット（アルドステロンの作用に不応性である）は亜全腎摘出に応じた腎症の発現に抵抗性を示すことを報告した（Ｕｌｌｉａｎ ＭＥ等、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９７年、第２７２巻、１４５４〜６１頁）。
Ｇｒｅｅｎｅ等は４処置群（偽手術ラット、無投与部分腎摘出［「残遺組織」］ラット、ロサルタンおよびエナラプリルを投与した残遺組織ラット、ならびにロサルタンおよびエナラプリルを投与した後、アルドステロンを注入した残遺組織ラット）を評価し、腎損傷の進行におけるアルドステロンの相対重要度を識別した（Ｇｒｅｅｎｅ Ｅ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６年、第９８巻、１０６３〜８頁）。報告された結果は、残遺組織ラットは偽手術ラットと比べてアルドステロンレベルの１０倍の上昇を有していたことを示していた。これに対して、ロサルタンおよびエナラプリルを投与した残遺組織ラットは、アルドステロンレベルの抑制を示し、これらの薬剤を投与しなかった残遺組織ラットと比べて蛋白尿、高血圧および糸球体硬化症の減少を示した。最後の群、すなわちロサルタンおよびエナラプリルを投与した後、アルドステロンを注入した残遺組織ラットでは、蛋白尿、高血圧および糸球体硬化症の程度は無投与残遺組織ラットと同様であった。
降圧薬の投与による血圧の抑制は、高血圧症に起因した罹病率および死亡率の劇的な低下に寄与している。例えば、脳卒中による年齢で補正した死亡率は米国において約６０％低下し、また冠動脈性心疾患による死亡率は５３％低下した（Ｈａｎｓｓｏｎ Ｌ等、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８年、第３５１巻、１７５５〜６２頁）。１報告書によれば、拡張期血圧の１０５ｍｍＨｇから８３ｍｍＨｇへの降下により１年当たりの治療患者１０００例当たり４例の重大な心血管事象を予防することができる。これによれば、６億９１００万人の高血圧患者が最適の降圧薬療法を受けていると推定するならば、２７６万４０００例の事象が予防されることになる（Ｈａｎｓｓｏｎ Ｌ等、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８年、第３５１巻、１７５５〜６２頁）。しかし、米国のような医療が発達した国においさえも降圧薬療法を受けている患者の２９％が１４０／９０ｍｍＨｇ以下に抑制されているにすぎない（全米合同委員会、高血圧の予防、検出、評価および治療に関する全米合同委員会の第６次報告、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９８−４０８０、１９９７年１１月）。
多種の薬剤クラスから選択される様々な薬剤を用いて高血圧、心不全および腎機能不全を治療することができる（全米合同委員会、高血圧の予防、検出、評価および治療に関する全米合同委員会の第６次報告、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９８−４０８０、１９９７年１１月）。これらの薬剤は、利尿薬（クロルタリドン、ヒドロクロロチアジド、メトラゾン等）、血管拡張薬（ヒドロラジン、ミノキシジル、ニトロプルシドナトリウム、ジザオキシド等）、β−アドレナリン受容体拮抗薬（プロプラノロール、メトプロロール、ラベタロール、アセブトロール等）、カルシウムチャンネル遮断薬（ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン等）およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ロサルタン等）ならびにＡＣＥ阻害薬（カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、キナプリル等）などである。個々の高血圧患者のための最初の薬物療法の選択は、一般的に年齢、人種および併発疾患のような共存因子に基づいている（Ｋａｐｌａｎ ＮＭ、Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９５年、第１３巻、増刊第２号、Ｓ１１３〜Ｓ１１７頁）。
ＡＣＥ阻害薬は、一般的に標準療法として用いられており、心不全患者における生存および入院に対して有用な効果を有することが示された。ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ（協同北スカンジナビアエナラプリル生存試験［Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｎｏｒｔｈ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｅｎａｌａｐｒｉｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｙ］）試験において、エナラプリル（ＡＣＥ阻害薬）と実質的なアルドステロン拮抗活性を有さない利尿薬を投与した重症心不全患者（ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能クラスＩＶ）における１年目の死亡率は、プラセボと実質的なアルドステロン拮抗活性を有さない利尿薬を投与した場合と比較して３１％低かった。ＣＯＮＳＥＮＳＵＳにおいて、基準の血漿中アルドステロン濃度が高かった患者は、基準濃度が低かった患者よりも死亡率が高かった。エナラプリルを投与した群では、血漿中アルドステロンの基準濃度が中央値より高かった群においてのみ死亡率が低下した。基準血漿中アルドステロン濃度が中央値より低かった群では、プラセボとの死亡率の差は認められなかった（Ｓｗｅｄｂｅｒｇ Ｋ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９０年、第８２巻、１７３０〜１７３６頁）。急性心筋梗塞を経験する患者は、しばしば心不全を発現し、その後に死亡する。ＡＣＥ阻害薬によるＲＡＡＳの遮断は、そのような患者におけるすべての原因による死亡率を低下させることが示された（Ｌａｎｃｅｔ、１９９３年、第３４２巻、８２１〜８２８頁）。
降圧薬スピロノラクトンは、ＡＣＥ阻害薬ほどには一般的に治療に用いられていない。この薬剤は、うっ血性心不全に随伴する高血圧および浮腫性状態ならびに肝硬変とともに発生し得る高アルドステロン症の治療用に開発されたアルドステロン受容体拮抗薬である（Ｓｗｅｄｂｅｒｇ Ｋ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９０年、第８２巻、１７３０〜６頁）。Ｐｉｔｔ Ｂ等（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．、１９９９年、第３４１巻、１０号、７０９〜７１７頁）は最近、ＡＣＥ阻害薬と実質的なアルドステロン拮抗活性を有さないループ利尿薬との併用の標準療法へのスピロノラクトンの追加によって、重症心不全患者における罹病率と死亡率が低下したことを報告した。しかし、スピロノラクトンの慢性使用については、その臨床的有害作用、特に女性型乳房、月経異常および不能症をもたらす黄体ホルモン性および抗男性ホルモン性である有害作用のため、多くの患者において制限されている（Ｔｈｅ ＲＡＬＥＳ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９年、第７８巻、９０２〜１２頁）。
しかし、高血圧、心不全および末期腎疾患を治療するための従来の薬物療法は、有意な例数の患者において必ずしも有効であるとは限らないか、あるいは有効性が低い。例えば、尿中タンパク質排泄の増加は、高血圧患者における心血管罹患および死亡の独立した予測因子である（Ｋａｎｎｅｌ ＷＢ、Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ、Ｃａｓｔｅｌｌｉ ＷＰ、Ｖｅｒｔｅｒ Ｊ、Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ、１９８４年、第１０８巻、１３４７〜５２頁）。ＡＣＥ阻害薬またはアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬である降圧薬は、腎疾患の存在またはそれらの総括的抗高血圧活性に無関係に、蛋白尿を一貫して減少させることが認められた（Ｍａｋｉ ＤＤ等、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９５年、第１５５巻、１０７３〜８２頁）。この蛋白尿の減少は、投与する薬剤の総括的抗高血圧活性に無関係に、ナトリウム摂取量が高い人では少ないか、存在しない（Ｈｅｅｇ ＪＥ等、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、１９８９年、第３６巻、２７２〜８０頁）。さらに、食事ナトリウムの減少はＡＣＥ阻害薬の抗高血圧および抗蛋白尿作用を増強する（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ＧＡ等、Ｅｘｐ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１９８３年、第５巻、１３６７〜８０頁）。高ナトリウム食を摂取している患者におけるＡＣＥ阻害薬の有効性の低下は、ヒドロクロロチアジドの追加により部分的に矯正することができる（Ｂｕｔｅｒ Ｈ等、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９９８年、第１３巻、１６８２〜５頁）。しかしながら、そのような併用療法は、併用薬剤の相加または相乗的副作用が存在するという欠点がある。
他の例において、選択した個人が低い血漿中レニン濃度または低い血漿中レニン活性を有するが、高血圧を発現する。この型の高血圧は、例えば、黒人、日本人および高齢者に認められる。そのような高血圧は、しばしば「低レニン高血圧」（または、ナトリウムがレニン系をダウンレギュレートするので、「ナトリウムおよび容積依存性低レニン高血圧」）と呼ばれている。これらの人々においては、レニンの血漿中濃度は正常であるか、低いにもかかわらず、ナトリウム摂取量の増加の後に血圧が上昇する。ＡＣＥ阻害薬やアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬のような本態性高血圧に治療に有効な薬剤は、低レニン高血圧の治療に比較的に有効でない（Ｗｅｉｒ Ｊ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９７年、第１１巻、１７〜２１頁）。したがって、低レニン高血圧は、食塩感受性高血圧の１つの型と記載された。
高血圧症、心不全、末期腎疾患および他の病原性状態を治療するために使用されている従来の薬物療法に対して十分に反応しない患者を対象とする薬物療法の改善は、望ましいと思われる。さらに、そのような病原性状態の罹患率が増加しつつあることは、現在のアプローチに取って代わる、あるいは補完する、より新規の治療的インターベンションおよび戦略が必要であることを示唆するものである。本発明は、この必要性に応え、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を特徴とする対象の集団における高血圧、心不全、末期腎疾患および他の病原性状態を治療するためのアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物の投与を含む新規の薬物療法を提供する。
本発明の様々な態様の主なものは、正常以下の内因性アルドステロンレベル、食塩感受性および食事ナトリウムの高摂取量からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有し、１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果に罹患または罹患しやすい対象における１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果を治療または予防する方法である。これらの方法は、治療上有効な量の、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を対象に投与することを含む。
他の態様において、本発明は、（ａ）１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果が高血圧、心血管疾患、腎不全、肝疾患、脳血管疾患、血管疾患、網膜症、神経障害、異常インスリン症、浮腫、内皮機能不全、圧受容体機能不全、片頭痛、のぼせおよび月経前緊張からなる群から選択され、（ｂ）対象が正常以下の内因性アルドステロンレベル、食塩感受性および食事ナトリウムの高摂取量からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する場合に、その１つまたは複数の病原性効果に罹患している、または罹患しやすい対象における１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果を予防する方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、食塩感受性または食事ナトリウムの高摂取量または両方を有し、高血圧症に罹患している、または罹患しやすい対象における高血圧症を治療または予防する方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、食塩感受性または食事ナトリウムの高摂取量または両方を有し、心血管疾患に罹患している、または罹患しやすい対象における心血管疾患を治療または予防する方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、食塩感受性または食事ナトリウムの高摂取量または両方を有し、心血管疾患に罹患している、または罹患しやすい対象における心不全を治療または予防する方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量のＡＣＥ阻害薬、実質的なアルドステロン拮抗活性を有さないループ利尿薬およびアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、食塩感受性の治療または予防を必要とする対象においてそれを行う方法を含む。これらの方法は、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を対象に治療上有効な量投与することを含む。
他の態様において、本発明は、ナトリウム摂取欲の減少を必要とする対象においてそれを行う方法を含む。これらの方法は、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を対象に摂取欲抑制量投与することを含む。
他の態様において、本発明は、食塩感受性に罹患している、または罹患しやすい対象における食塩感受性の進行を低減または逆転させる方法を含む。これらの方法は、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を対象に治療上有効な量投与することを含む。
他の態様において、本発明は、脳における異常なアルドステロンレベルに完全または部分的に起因する１つまたは複数の病原性効果を低減または予防するための対象の治療または予防の方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量の、アルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、腎臓における異常なナトリウム貯留に完全または部分的に起因する１つまたは複数の病原性効果を低減または予防するための対象の治療または予防の方法を含む。これらの方法は、対象に治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
他の態様において、本発明は、正常以下の内因性アルドステロンレベル、食塩感受性および食事ナトリウムの高摂取量からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有し、１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果を受けやすい対象における該病原性効果の予防の方法を含む。これらの方法は、対象に予防上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。
本発明の他の態様は、明らかであり、一部については後述する。
発明の一般的陳述
アルドステロンにより媒介される障害は、従来、一次性および二次性高アルドステロン症に限定されるとみなされていた。高アルドステロン症においては、過剰なレベルのアルドステロンが、上皮ナトリウムチャンネル（「ＥｎａＣ」）の活性化とナトリウム貯留の増加につながる、高レベルの鉱質コルチコイド受容体のアルドステロンによる占有に関係するメカニズムによる高血圧をもたらす原因であると一般的に考えられている。高アルドステロン症に罹患している人は、腎および心疾患に罹患する危険度も高い。これらの疾患は、以前には高血圧の結果であると考えられていた。
しかし、あらゆるレベル（高、正常または正常以下であるかを問わず）の内因性アルドステロンはヒト対象において病原性であることが発見された。ヒト対象における内因性アルドステロンにより媒介される病原性効果の発生、発症および発生の速度および／または重症度は、アルドステロンが高い、正常または正常以下のレベルで存在しているかどうかにかかわりなく、対象が高いレベルのナトリウムを有する場合にさらに増加することも発見された。内因性アルドステロンの病原性は、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有するヒト対象において特に著しい。
さらに、そのようなアルドステロン媒介病原性をヒト対象において低減または消失させることができる新規の方法が発見された。一般的に、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物をそれを必要とするヒト対象に投与して、正常以下のレベルの内因性アルドステロンの作用に起因する病原性効果を含む、内因性アルドステロンの作用に起因する１つまたは複数の病原性効果を治療または予防する。エポキシステロイド化合物は、好ましくはエプレレノンである。対象は、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有する個体・個人であることが好ましい。１つまたは複数の病原性効果は、高ナトリウムレベルの存在下での内因性アルドステロンの作用に起因することが好ましい。高いナトリウムレベルは、高レベルの細胞内ナトリウム、特に、心臓、腎臓および脳の１つまたは複数における高レベルの細胞内ナトリウムであることが好ましい。
一般的定義
本明細書で用いる「対象」という用語は、治療、観察または実験の対象であった哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトが哺乳動物の状態を直接的または間接的に改善する目的で医療援助を受ける場合の過程、行為、適用、療法、処置などを含む。
「予防」という用語は、臨床的に明らかな病原性効果の発現を全面的に予防すること、または、個体における病状発現前に明らかな段階の病原性効果の発現を予防することを含む。これらの用語は、高血圧症および心不全などの、これらに限定されない病原性効果を発現する、遺伝、環境、社会または他の因子におそらく起因する危険がある対象の予防的治療を含む。
「治療上有効な」という句は、代替療法に一般的に伴う有害な副作用を避けると同時に、状態または障害を改善するという目的を達成するアルドステロン拮抗薬の量を限定するものである。
本明細書で用いる「ナトリウム」または「食塩」という用語は、何らかの形態、特に、塩化ナトリウムの形態のナトリウムを含む。
「アルドステロン拮抗薬」および「アルドステロン受容体拮抗薬」という用語は、鉱質コルチコイド受容体へのアルドステロの結合を阻害し、それによりアルドステロの生物学的作用を遮断する化合物を含む。アルドステロン拮抗薬は、エプレレノンのような選択的アルドステロン拮抗薬であることが好ましい。選択的アルドステロン拮抗薬は、他のステロイドホルモン受容体と比較して鉱質コルチコイド受容体に選択的に結合するアルドステロン拮抗薬である。
想定されるメカニズム
特定の理論に拘束されることなく、病原性はほとんどの場合に微小血管機能不全により媒介されると想定されている。そのような微小血管機能不全は、微小血管収縮および微小虚血の結果であると考えられている。したがって、これらの微小血管の変化は、様々な病原性効果をもたらす適応不良メカニズムにより進行する。
正常レベル以下の内因性アルドステロンの病原性
上記のように、正常レベル以下を含むあらゆるレベルの内因性アルドステロンは、ヒト対象において、特に高レベルのナトリウムの存在下で病原性である。このレベルの内因性アルドステロンは、局所レベルで存在し得る（例えば、特定の臓器における細胞内レベルの内因性アルドステロン）か、またはより広範囲に存在するか、もしくは全身性であり得る。したがって、内因性アルドステロンの１種または複数の病原性作用は、部分的には限局（例えば、脳、心臓または腎臓）できるが、完全に限局することはできず、それどころか全身性となることもある。
対象の内因性アルドステロンレベルは、通常の試験方法を用いて測定することができる。例えば、内因性アルドステロンレベルは、対象において循環（血漿、血清または全血）アルドステロン、尿アルドステロンなどとして測定することができる。このような測定に種々の市販キットおよび／または公表されている標準測定法が利用可能である。例えば、血漿アルドステロンレベルは、ラジオイムノアッセイにより測定することができる。この測定には、血漿アルドステロンの測定用にＤｉｎａｂｏｔ Ｃｏ．（東京、日本）により市販されているラジオイムノアッセイキットのような市販キットが利用可能である。血清アルドステロンレベルは、例えば、通常のイムノアッセイ法により測定することができる。尿のアルドステロンレベルは、例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ．製の抗血清を用いるラジオイムノアッセイにより、同様に測定することができる。アルドステロンレベル−１８−グルクロニドは、一般的にｐＨ１で一夜加水分解して、遊離のアルドステロンを生成させ、これをＲＩＡにより測定する（Ｐｒａｔ ＪＨ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９９年、第３４巻、３１５〜３１９頁）。尿アルドステロンは、２４時間試料中への総排泄量として表すか、あるいは、クレアチニンに対して標準化してもよい。
アルドステロンの正常値は、特定のアッセイおよび選択される母集団群に依存するが、これらの値は一般的に文献に公表されており、当業者には容易に入手可能である。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌの１５２６〜２５２８頁（第１７版、１９９９年）にイムノアッセイに測定された血清アルドステロンの臨床検査正常値は一般的に仰臥位の対象で約１６ｎｇ／ｄＬ未満であり、立位の対象で約４〜３１ｎｇ／ｄＬであると報告されている（食事ナトリウム摂取量が約１００〜約２００ｍＥｑ／日の対象）。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌには、そのような値を健常母集団の平均値±２標準偏差として記載されている。同様に、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｆ Ｇａｎｏｎｇには正常アルドステロン値が一般的に３〜１０ｎｇ／ｄＬと示されている。
特定のアッセイの方法および母集団群に変動があるため、時として、臨床医または臨床センターがそれ自体の標準データを実験で確定することが必要であるか、または望ましいと思われる。当業者はこれを容易に行うことができるが、特別な配慮が払われる。例えば、遺伝的および環境上の（例えば、食事）差異が各地域の母集団に存在する。したがって、そのような地域における平均値は、世界的な平均値を反映しない可能性がある。この例として、主として黒人からなる地域における平均血漿アルドステロンは、主として白人からなる地域よりも低い。同様に、大部分の食塩感受性を有する人からなる国（例えば、日本）の平均値は、食塩感受性を有する人がわずかな割合を占める国（例えば、スウェーデン）よりも低い。さらに、地域の母集団は食事ナトリウム摂取量の差を有する可能性があり、これもアルドステロンレベルの差をもたらす。特に示さない限り、タンパク質（例えば、アルドステロンまたはレニン）の正常以下のレベルに言及する場合、世界母集団または問題の所望の亜集団を代表すると考えられる平均値より低い値を意味する。
本発明により治療または予防することができるアルドステロンにより媒介される病原性効果は、高血圧症、心血管疾患、腎機能不全、肝疾患、脳血管疾患、血管疾患、網膜症、神経障害（末梢神経障害のような）、異常インスリン症、浮腫、内皮機能不全、圧受容体機能不全、偏頭病、のぼせ、月経前緊張等を含むが、これらに限定されない。心血管疾患は、心不全（うっ血性心不全のような）、不整脈、拡張機能不全（左室拡張機能不全、拡張期心不全および拡張期充満障害のような）、収縮機能不全、虚血、肥大型心筋症、突然心臓死、心筋および血管線維症、動脈コンプライアンスの障害、心筋壊死病変、血管損傷、心筋梗塞、左室肥大、駆出分画の低下、心臓病変、血管壁肥大、内皮肥厚、冠動脈のフィブリノイド壊死等を含むが、これらに限定されない。腎機能不全は、糸球体硬化症、末期腎疾患、糖尿病性腎症、腎血流量の減少、糸球体濾過比の増加、蛋白尿、糸球体濾過率の低下、クレアチニンクリアランスの低下、ミクロアルブミン尿症（microalbumiuria）、腎動脈症、虚血性病変、血栓性病変、全体のフィブリノイド壊死、糸球体毛細血管の巣状血栓症、毛細血管内（内皮およびメサンギウム）および／または毛細管外細胞（半月）の腫脹および増殖、著しい細胞充実性を伴う、または伴わない細網性メサンギウムマトリックスの拡大、悪性腎硬化症（虚血性退縮、毛細血管ふさ状分岐の血栓壊死、細動脈フィブリノイド壊死、ならびに罹患糸球体および微小血管の血栓性微小血管症性病変のような）等を含むが、これらに限定されない。肝疾患は、肝硬変、肝性腹水、肝うっ血等を含むが、これらに限定されない。脳血管疾患は、脳卒中を含むが、これに限定されない。血管疾患は、血栓性血管疾患（壁在フィブリノイド壊死、赤血球の血管外遊出および断片化、ならびに管腔および／または壁在血栓症等）、増殖性動脈症（ムチン細胞外マトリックスに囲まれた腫脹性筋内膜細胞および結節性肥厚など）、アテローム動脈硬化症、血管コンプライアンスの低下（硬直、心室コンプライアンスの低下および血管コンプライアンスの低下のような）、内皮機能不全等を含むが、これらに限定されない。浮腫は、末梢組織浮腫、肝うっ血、脾うっ血、肝性腹水、呼吸器系または肺うっ血等を含むが、これらに限定されない。異常インスリン症は、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ブドウ糖感受性、前糖尿病状態、症候群Ｘ等を含むが、これらに限定されない。
病原性効果は、好ましくは、高血圧症、心血管疾患、腎機能不全、浮腫、脳血管疾患および異常インスリン症からなる群から選択され、より好ましくは、病原性効果は、高血圧症、心血管疾患、脳卒中およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択され、より好ましくは、病原性効果は、高血圧症、心不全（特に、心筋梗塞後心不全）左室肥大および脳卒中からなる群から選択される。
したがって、本発明の一実施形態において、方法は、正常以下の内因性アルドステロンレベルを有し、１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果に罹患している、または罹患しやすいヒト対象における該病原性効果を治療または予防するために治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。１つまたは複数の病原性効果は、好ましくは、高血圧症、心血管疾患、脳血管疾患およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択され、より好ましくは、病原性効果は、高血圧症、心不全（特に、心筋梗塞後心不全）、左室肥大および脳卒中からなる群から選択される。エポキシステロイド化合物は、好ましくはエプレレノンである。治療または予防の対象は、好ましくは食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有する個人である。
アルドステロン媒介性病状に対するナトリウムの影響
上記のように、ヒト対象における内因性アルドステロンにより媒介される病原性効果の発生、発症および発生の速度および／または重症度は、アルドステロンが高い、正常または正常以下のレベルで存在しているかどうかにかかわりなく、高いレベルのナトリウムの存在下でさらに増加することが発見された。内因性アルドステロンの病原性は、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有するヒト対象において特に著しい。高レベルの食事ナトリウム摂取は、特に食塩感受性を有する人における高血圧症を増悪させると以前に報告されたが、内因性アルドステロンの病原性の増強におけるナトリウムの役割については以前には理解されていなかった。
したがって、本発明の他の実施形態において、方法は、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有し、１つまたは複数のアルドステロン媒介性病原性効果に罹患している、または罹患しやすいヒト対象における該１つまたは複数の病原性効果を治療または予防するために、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬である１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与することを含む。１つまたは複数の病原性効果は、好ましくは前述したとおりであり、より好ましくは、高血圧症、心血管疾患、脳血管疾患およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択され、さらにより好ましくは、高血圧症、心不全（特に、心筋梗塞後心不全）、左室肥大および脳卒中からなる群から選択される。エポキシステロイド化合物は、好ましくはエプレレノンである。ヒト対象が高い食事ナトリウム摂取量を有する場合、対象によるナトリウムの平均１日摂取量は、少なくとも約５０ｍＥｑ、好ましくは少なくとも約１００ｍＥｑ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍＥｑ、さらにより好ましくは少なくとも約２００ｍＥｑである。
多くの高血圧症試験の結果に基づいて、医学界は、一般的にほとんどの人が食事ナトリウム摂取量を少なくすることを勧告した。例えば、米国心臓協会の栄養委員会は、成人１日当たり食塩３．０ｇの限界値を勧告した（米国心臓協会栄養委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、「健常アメリカ成人のための食事ガイドライン（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｄｕｌｔｓ）」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第７７巻、７２１〜７２４頁、１９８８年）。同様に、ＤＡＳＨ試験で、食塩摂取量を１．５ｇに減少させることにより食塩２．４ｇの食事と比べて血圧が降下したことが示された（ＮＩＨ Ｎｅｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０００年５月１７日、「ＮＨＬＢＩ試験は食事ナトリウムの減少による大きい血圧ベネフィットを示している」）。
ナトリウム摂取量の減少が有用であることが一般的に認められているにもかかわらず、多くの個人および集団は、一般的にナトリウム摂取量を減少させる意志がないか、それができない。自制の欠如と食事の変更を妨げる因子がそのような勧告ガイドラインの不遵守の一因になっている。食事の変更を妨げる因子としては、例えば、以下のものが挙げられる。（１）地理上または他の制約により低塩化ナトリウム食品の入手が妨げられているために、低塩化ナトリウム食品が入手できないこと、（２）冷蔵が行われないため、食品を保存するために高塩化ナトリウム濃度の使用（例えば、塩漬）が必要となること、（３）高レベルの塩化ナトリウムを含む食品の摂取につながる、食品の調製と内容に関する伝統的および宗教的要求事項を尊重する必要性があることなどの文化的環境、（４）塩化ナトリウム含量が低いより高価な食品（例えば、輸入食品）の購入を阻んでいる貧困による価格面の制約。そのような人々、特に食塩感受性を有する人々は、高塩化ナトリウム食品の摂取に代わるものを自給できず、生命を脅かす栄養不良や飢えにおちいる以外には、高塩化ナトリウム食を食すことによるこの病状で死ななければならない。しかしながら、本発明の方法は、食事ナトリウム摂取量の低減が達成されない、あるいはできない、そのような人々におけるアルドステロン媒介性病原性効果の治療または予防に用いることができる。
ナトリウムの影響は、食塩感受性を有する人々において特に顕著である。そのような人々は、圧ナトリウム利尿反応の障害またはナトリウムに対する血管反応の亢進を有し、高血圧になる危険がより高い可能性がある。多くの試験で、食塩感受性患者は、腎血流量の減少、糸球体濾過比の増加および蛋白尿に関するナトリウム摂取量の増加に対する反応の増悪を有することが示された（Ｂａｋｒｉｓ ＧＬ等、Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１９９６年、第９巻、２００Ｓ〜６Ｓ頁）。食塩感受性は、心血管疾患の危険因子でもある（Ｃａｍｐｅｓｅ ＶＭ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９２年、第１９巻、４０３〜１８頁）。本発明の方法は、同様に、そのような人々におけるアルドステロン媒介性病原性効果の治療または予防に用いることができる。
高ナトリウム摂取量は、薬物療法に対する対象の反応に対しても悪影響を与える可能性がある。例えば、軽度高血圧症の治療試験（Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｌｄ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ）（ＴＯＭＨＳ）において高血圧黒人患者を治療するために用いた５種類の薬剤が検討された（Ｎｅａｔｏｎ ＪＤ等、ＪＡＭＡ、１９９３年、第２７０巻、７１３〜２４頁）。この試験で、患者はＡＣＥ阻害薬やαアドレナリン受容体拮抗薬よりも、クロロチアジド、カルシウムチャンネル遮断薬または交感神経様の固有活性を有するβアドレナリン受容体拮抗薬に対して良好な反応を示した（Ｇｒｉｍ ＣＥ等、Ｊ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓ、１９８０年、第３３巻、８７〜９４頁）。黒人および白人患者がナトリウム摂取量の減少に伴う薬物療法の効果の相乗的な増加を示した。ナトリウム摂取量の減少は、薬物療法に対して他の効果を有する。例えば、そのような減少は、特に食塩感受性患者における降圧薬療法からの離脱症状の改善をもたらす（ｖａｎ Ｂｒｕｍｍｅｌｅｎ Ｐ、Ｓｃｈａｌｅｋａｍｐ Ｍ、ｄｅ Ｇｒａｅｆｆ Ｊ．、Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎｄ、１９７８年、第２０４巻、１５１〜７頁）。ナトリウムのわずかな減少でさえも、有効量の減少につながり得る（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＭＨ等、ＪＡＭＡ、１９８８年、第６巻、２５６１〜５頁）。しかし、本発明の方法は、例えば、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量のために治療対象に対して有効でない従来の薬物療法におけるように、単剤療法または併用療法において用いることができる。
例えば、一実施形態において本発明は食塩感受性を有するヒト対象における高血圧の治療または予防の方法を含む。この方法によれば、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物を高血圧症に罹患している、または罹患しやすい食塩感受性を有する人に投与する。食塩感受性を有する人における高血圧症は、一般的な食事成分である塩化ナトリウムによって誘発される点が、他の型の高血圧症と異なっている。治療せずに放置した場合、この状態に罹患している患者は高頻度の心筋梗塞、脳卒中、心不全、腎機能不全、臓器機能不全および他の心血管の病状にも罹患する。
食塩感受性高血圧は、例えば低塩化ナトリウム摂取量（数日間にわたり約１〜３ｇ／日のような）に続いて高塩化ナトリウム摂取量（約１２〜１５ｇ／日のような）の条件下の患者の血圧の変化を測定することにより、容易に診断することができる。塩化ナトリウム摂取量の増加に伴う約１０％以上の血圧の上昇は、食塩感受性高血圧症であることを示す。あるいは、対象の血圧の変化を携帯型血圧測定装置を用いて２４時間にわたりモニターすることができる。食塩感受性高血圧症を有する患者は、睡眠期中に通常起こる血圧の概日降下（または「ディップ」）を示さない。その代わりに、食塩感受性高血圧症患者の血圧は、２４時間の全期間中上昇したままである。食塩感受性患者が最大限に高血圧のままであるこの付加的な期間は、この状態により引き起こされる血管および臓器への病理学的損傷を加えるものとなる。
そのような状態は塩化ナトリウム摂取量の減少により改善される可能性があるが、塩化ナトリウム摂取量の減少は、上で論じたように様々な理由のために実際的でない場合がある。食事療法が行われていない状態で、治療的介入が試みられた。交感神経活性およびカテコールアミンレベルの増加を伴う食塩感受性高血圧症の生化学的プロファイルに基づき、βアドレナリン遮断薬の使用がしばしば推奨されている。しかし、この療法は、ほとんど成功を収めず、重度の副作用を引き起こすことがあり、多くの患者に対してほとんど、またはまったく軽減をもたらさない。塩化ナトリウムレベルが高い食事はレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系も抑制するので、食塩感受性高血圧症患者および高食塩摂取量を有する患者におけるアルドステロンレベルは通常、正常または低いことが認められる。その結果、食塩感受性高血圧症を治療するためのアルドステロン拮抗薬の使用については、医療従事者が無視するか、または思いとどまっていた。
他の実施形態において、したがって、本発明は食事ナトリウムの高摂取量を有するヒト対象における高血圧症を治療または予防する方法を含む。この方法によれば、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物を食事ナトリウムの高摂取量を有し、高血圧症に罹患または罹患しやすい対象に投与する。
特に興味深い他の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象における心血管疾患、特に心筋梗塞後心不全を治療または予防する方法を含む。この方法によれば、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物を食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有し、心血管疾患に罹患または罹患しやすい対象に投与する。
特に興味深い他の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象における腎機能不全を治療または予防する方法を含む。この方法によれば、治療上有効な量のアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物を食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有し、腎機能不全に罹患または罹患しやすい対象に投与する。
食塩感受性
実験的試験および臨床試験でナトリウム摂取量と血圧との関係が示されたが、一般集団は、この関係に関して実施的な異質性を示す。異なる反応を示す２つの一般集団群が認められている。第１の一般群は、食塩非感受性者（「食塩抵抗性者」とも称される）である。食塩非感受性者では、食事ナトリウム摂取量の増加は、ナトリウム排泄量の増加をもたらし、血圧の測定し得る増加を伴わないか、ごくわずかな増加を伴うにすぎない。同様に、食塩非感受性者によるナトリウム摂取量の減少は、血圧または高血圧の発生率を実質的に低下させない。実際、そのようなナトリウム摂取量の制限は食塩非感受性者にとって有害なことがある。
第２の一般群は、食塩感受性者である。食塩感受性者では、血圧は、ナトリウムの摂取量の増加および減少に伴ってそれぞれ一般的に上昇および降下する。食塩感受性正常血圧者は、典型的な北米の食事を摂っている場合、時間の経過に伴って高血圧になる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＭ、１９９１年、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ、第１７巻（増刊号１）、１６１〜６８頁）。ナトリウム摂取量が増加するとき、血管抵抗および濾過比が増加するように、腎血流量は増加しないか、または減少し、糸球体濾過率は変化しないままか、または増加する（Ｗｅｉｒ ＭＲ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９０年、第１６巻、２３５〜４４頁）。
食塩感受性者の特定
食塩感受性を判定するための適切な試験、例えば、食塩誘発試験は、これに限定されないが、当業者に一般的に知られている。例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｋ．、「ヒトおよび実験的高血圧の食塩感受性型と食塩非感受性型とを区別する方法（Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｓａｌｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｎｏｎ−ｓａｌｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１９９３年５月、第２巻、第３号、３４１〜３４９頁を参照）。そのような特定は、例えば、臨床試験（食塩誘発試験など）により、あるいは家族歴および／または民族の検討により実現することができる。臨床試験は、一方向または二方向解析を用いて行うことができる。
食塩誘発試験
食塩感受性を判定する１つの実例となる非限定的な方法は、食塩誘発試験によるものである。一方向食塩誘発試験は、個人に低ナトリウム食（例えば、４０ミリモル／日を１週間、「低食塩生活規則」）を摂取させることにより行うことができる。ナトリウムを自由に摂取できる人は不十分な遵守を示すことが多いため、試験のこの相は、入院患者環境で実施することが最善である。入院患者環境は、試験される人がナトリウム源を自由に摂取せず、ナトリウム含量を決定するために食事が栄養士または当業者によって決定されるものである。さらに、摂取されたナトリウムのすべての食事源が注意深く測定される。低食塩生活規則の終了後に、収縮期および拡張期血圧を安静状態で３回測定する。低食塩生活規則の終了直後に、個人を再び、総ナトリウム摂取量が２２０ミリモル／日（「高食塩生活規則」）である管理された食事生活規則に従わせる。１週間の高食塩生活規則の終了時に、低食塩生活規則時のように収縮期および拡張期血圧を測定する。収縮期血圧または拡張期血圧または両方の５ｍｍＨｇを超える上昇を示す対象は、食塩感受性とみなされる。
二方向食塩誘発試験は、一方向試験について上述したように個人を低食塩生活規則および高食塩生活規則に従わせ、次に、ただちに個人を低食塩生活規則と同様な管理された低ナトリウム食を摂取させ、次いで、一方向試験について述べたように収縮期および拡張期血圧を測定する。高食塩生活規則の終了時に収縮期または拡張期血圧または両方の５ｍｍＨｇ以上の上昇と、その後の管理された低ナトリウム食の終了時に収縮期または拡張期血圧または両方の５ｍｍＨｇ以上の降下を示す個人は、食塩感受性とみなす。
食塩感受性者を特定する他の方法は、個人を最初に高ナトリウム生活規則に従わせた後、低ナトリウム生活規則に従わせる、逆一方向解析を実施することである。低ナトリウム生活規則の終了時に収縮期または拡張期血圧または両方の１０％の降下を示す個人は、食塩感受性とみなす。
上述の一方向、二方向および逆一方向食塩誘発試験は、所望の場合、さらに修正することができる。例えば、入院患者環境の代わりに、対象に、他の点では対象の通常の環境における通常の活動を行うこと（すなわち、食べる、眠る、働くなど）を許容することができる。食事生活規則の遵守は、２４時間蓄尿の分析により判定される。あるいは、遵守は、主観的質問票と試験対象による記録の保管によりモニターすることができる。上記の試験法の他の修正としては、試験の各生活規則の１週間の期間を３、４、５または６日に短縮することなどがある。上記の試験の他の修正としては、ナトリウムの高食塩生活規則での摂取量を、例えば、８〜１６ｇナトリウム／日に調節することなどがある。さらに、収縮期または拡張期血圧の変化のより低い閾値（５、６、７、８または９％のような）を用いることができ、また所望の場合、２つの独立した一方向試験での測定でそのようなより低い閾値に適合している場合、個人を食塩感受性について陽性と評価することができる。
急速体積膨張および収縮試験
食塩感受性を判定する他の実例となる非限定的な方法は、例えば、プロトコールがＧｒｉｍ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９７９年、第１巻、４７６〜８５頁に記載され、Ｓｔｒａｚｚｕｌｌｏ等、Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０００年、第１３巻、４６〜５３頁により修正された急速体積膨張および収縮試験によるものである。一般的に、対象を４日間入院させ、５０ミリモル／日のナトリウムを投与する。１日目に、対象にＳｌｏｗ−Ｎａ錠剤の形で追加のナトリウムも投与して、１５０ミリモルのナトリウム総摂取量を達成させる。２日目に、ナトリウム摂取量を再び１５０ミリモルに固定し、対象に４時間にわたり２Ｌの０．９％塩化ナトリウムの一定速度の静脈内注入を行う。血圧測定（３分間隔での５回の測定の平均）を塩化ナトリウムの注入の開始時と終了時に自動血圧記録計を用いて行う。尿中ナトリウム排泄を食塩水注入の前の３時間と注入中に測定する。体重、ヘマトクリット、血漿レニン活性およびアルドステロンを注入前後に測定する。３日目に、食事中ナトリウム制限（５０ミリモル／日）と午前１０：００時、午後０２：００時および午後０６：００時の３７．５ｍｇのフロセミドの３回の投与により、ナトリウム欠乏と容積の減少をもたらす。対象には体重１ｋｇ当たり２５ｍＬ以下の水道水を飲むように要求する。４日目の午前８：００時に、血圧を測定する。試験に対する反応は、注入の終了時に測定した平均血圧から塩化ナトリウム欠乏後の血圧を引いて計算する。反応が５ｍｍＨｇより大きい場合、対象は食塩感受性とみなされる。
家族歴または民族性
家族歴および／または民族性も食塩感受性の危険にさらされている対象を確定するうえで助けとなり得る。そのような危険因子は、１人または複数の親族が高血圧を有することからなる家族歴または全世界の一般集団よりも大きい食塩感受性の罹患率を示す民族に起源をたどることができる系統を含むが、これらに限定されない。そのような系統は、例のみとして、黒人、アメリカ黒人、アメリカインディアンおよび日本人である（Ｐｏｗｅｒｓ ＤＲ等、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９８年、第１５８巻、７９３〜８００頁）。
分子による特定
適切な遺伝学的試験法による食塩感受性表現型の分子による特定も個人における食塩感受性を確定するために用いることができる。例えば、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ等は、アフリカ系アメリカ人におけるこの表現型と心房性利尿ペプチドにおけるＨｐａ１１突然変異との関連を述べた（Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１９９５年、第１３巻、９５３〜５頁）。Ｓｖｅｔｋｅｙ等は、アフリカ系アメリカ人におけるナトリウム負荷／体積減少に対する拡張期血圧反応とβ２アドレナリン受容体遺伝子座との一致を報告した（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９７年、第２９巻、９１８〜２２頁）。イタリアにおける同胞対の試験で、α−アドゥシン突然変異（１４６０Ｔｒｐ）と食塩感受性との一致が報告された（Ｃｕｓｉ Ｄ等、Ｌａｎｃｅｔ、１９９７年、第３４９巻、１３５３〜７頁）。２型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１βＨＳＤ２）遺伝子のエキソン３におけるＡｌｕｌ多形性がスイス人集団における食塩感受性と関連していると報告された（Ｌｏｖａｔｉ Ｅ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、１９９９年、第８４巻、３７４５〜９頁）。さらに、本態性高血圧症を有する非選択患者の同じ遺伝子におけるＣＡ多復対立遺伝子ミクロサテライト多形性が食塩感受性と相関していると報告された（Ｆｅｒｒａｒｉ Ｐ等、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、２０００年、第５７巻、１３７４〜８１頁）。さらに、尿中コルチゾール対コルチゾン代謝物の比の平均値の上昇によって示される１１βＨＳＤ２の活性は、食塩感受性対象において食塩抵抗性対象と比較して低かった。スペインにおける高血圧患者の試験で、ＡＣＥ遺伝子における２８７塩基対挿入の１または２コピーの存在と食塩感受性との関連が報告された（Ｇｉｎｅｒ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２０００年、第３５巻、５１２〜５１７頁）。
血漿中免疫反応性エンドセリン濃度
内皮細胞は、血管緊張および恒常性の調節に重要な機能を果たしている。この機能は、一部は、血管作用性物質の分泌により媒介される。エンドセリン（内皮細胞により産生される）は、強力な血管収縮物質であり、３種の遺伝子によりコードされるペプチドである（Ｙａｎａｇｉａｗａ Ｍ等、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、４１１〜５頁）。エンドセリン−１（「ＥＴ−１」）は、内皮により産生される支配的なメンバーであり、オートクリンおよびパラクリンとしての挙動で作用する。平滑筋細胞上のＥＴ−１受容体（すなわち、ＥｔＡおよびＥＴＢ）は、ＥＴ−１の収縮、増殖および肥大誘発作用を媒介する（Ｄｅ Ｎｕｃｃｉ Ｇ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８８年、第８５巻、９７９７〜８００頁）。
食塩抵抗性高血圧患者では、エンドセリンの血漿中濃度は通常正常である（Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ ＥＬ等、Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１９９１年、第４巻、３０３〜８頁）。しかしながら、重症高血圧症患者および黒人では、血漿中免疫反応性ＥＴ−１が上昇していることが多い。食塩感受性を有する人は、血漿中ＥＴ−１濃度の上昇を示すことによって、食塩負荷の増加に反応する（Ｅｌｉｊｏｖｉｃｈ Ｆ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９９年、第３３巻、１０７５頁）。したがって、食塩感受性者を特定する他の方法は、血漿中免疫反応性エンドセリン濃度の試験によるものである。血漿中免疫反応性エンドセリン濃度の上昇、特に、血漿中免疫反応性エンドセリンＥＴ−１濃度の上昇が食塩感受性者にしばしば存在する。
治療を必要とする対象
ヒト対象における正常以下のレベルの内因性アルドステロンの病原性は、以前には認識されていなかった。同様に、高レベルのナトリウムの存在によって引き起こされる、ヒトにおける内因性アルドステロンにより媒介される病原性効果の発生、発症および発生の速度および／または重症度の増加は、以前には認識されていなかった。ナトリウム負荷は一般的に内因性アルドステロンレベルの非病原性レベルへの低下をもたらすと通常考えられていた。したがって、本発明による治療または予防から利益を得ることができる対象は、一般的に、（ｉ）正常以下の内因性アルドステロンレベル、（ｉｉ）内因性アルドステロンレベルにかかわりなく食塩感受性、および／または（ｉｉｉ）内因性アルドステロンレベルにかかわりなく高いナトリウム摂取量を有するヒト対象である。これらの対象の各群内で、本発明の療法から利益を得る対象のサブグループを特定するために、さらにプロファイリングおよび／またはフェノタイピングを行うことは有用であり得る。
したがって、本発明の方法による治療または予防から利益を得ることができる対象は、一般的に以下の１つまたは複数の特性を示すヒト対象である。
（ａ）対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が少なくとも約４ｇであり、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされている。対象によるナトリウムの平均１日摂取量は、好ましくは少なくとも約６ｇであり、より好ましくは少なくとも約８ｇであり、さらにより好ましくは少なくとも約１２ｇである。
（ｂ）対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が約３ｇ／日未満から少なくとも約１０ｇ／日に増加するとき、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％の収縮期血圧および／または拡張期血圧の増加を示す対象。
（ｃ）対象における血漿中アルドステロン（ｎｇ／ｄＬ）対血漿中レニン（ｎｇ／ｍｌ／時間）の活性比が約３０より大きく、好ましくは約４０より大きく、より好ましくは約５０より大きく、さらにより好ましくは約６０より大きい。
（ｄ）対象が低い血漿中レニン濃度を有する。例えば、対象における朝の血漿中レニン活性が約１．０ｎｇ／ｄＬ／時間未満であり、かつ／または、対象における活性レニン値が約１５ｐｇ／ｍＬ未満である。
（ｅ）対象が高い収縮期および／または拡張期血圧を有する、または有しやすい。一般的に、対象の収縮期血圧（例えば、座位カフ水銀血圧計により測定）が少なくとも約１３０ｍｍＨｇ、好ましくは少なくとも約１４０ｍｍＨｇ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍｍＨｇであり、対象の拡張期血圧（例えば、座位カフ水銀血圧計により測定）が少なくとも約８５ｍｍＨｇ、好ましくは少なくとも約９０ｍｍＨｇ、より好ましくは少なくとも約１００ｍｍＨｇである。
（ｆ）対象の尿中ナトリウム対カリウム比（ミリモル／ミリモル）が約６未満、好ましくは約５．５未満、より好ましくは約５未満、さらにより好ましくは約４．５未満である。
（ｇ）対象の尿中ナトリウムレベルが少なくとも６０ミリモル／日で、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされている場合。対象の尿中ナトリウムレベルは、好ましくは少なくとも約１００ミリモル／日、より好ましくは少なくとも約１５０ミリモル／日、さらにより好ましくは２００ミリモル／日である。
（ｈ）対象における１つまたは複数のエンドセリンの血漿中濃度、特に、血漿中免疫反応性ＥＴ−１濃度が高い。ＥＴ−１の血漿中濃度は、好ましくは約２．０ピコモル／Ｌより大きく、より好ましくは約４．０ピコモル／Ｌより大きく、さらにより好ましくは約８．０ピコモル／Ｌより大きい。
（ｉ）対象がＡＣＥ阻害薬の投与に対して実質的に不応性である血圧を有する。特に、対象の血圧が、降圧療法を受けていない対象の血圧と比べて、１０ｍｇ／日のエナラプリルに反応して約８ｍｍＨｇ未満、好ましくは５ｍｍＨｇ未満、より好ましくは３ｍｍＨｇ未満降下する。
（ｊ）対象が血液量膨張性高血圧または血液量膨張性境界域高血圧、すなわち、ナトリウム貯留の増加の結果としての血液量の増加が血圧に寄与する高血圧を有する。
（ｋ）対象が非調節者である。すなわち、対象がナトリウム摂取量の増加またはアンジオテンシンＩＩ投与に対する腎血流速および／またはアルドステロンの副腎での産生の陽性反応の鈍化を示し、特に、反応が地理的一般集団から抽出された人（例えば、対象の母国または対象が在住している国から抽出された人）の反応より小さい場合、好ましくは、反応が集団の平均値の４０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満である場合。
（ｌ）対象が腎機能不全、特に、糸球体濾過率の低下、ミクロアルブミン尿症および蛋白尿からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される腎機能不全を有するか、罹患しやすい。
（ｍ）対象が心血管疾患、特に、心不全、左室拡張機能不全、肥大型心筋症および拡張期心不全からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される心血管疾患を有するか、罹患しやすい。
（ｎ）対象が肝疾患、特に、肝硬変を有するか、罹患しやすい。
（ｏ）対象が浮腫、特に、末梢組織浮腫、肝または脾うっ血、肝性腹水および呼吸器または肺うっ血からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される浮腫を有するか、罹患しやすい。
（ｐ）対象がインスリン抵抗性、特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病および／またはブドウ糖感受性を有するか、有しやすい。
（ｑ）対象が少なくとも５５歳、好ましくは少なくとも約６０歳、より好ましくは少なくとも約６５歳である。
（ｒ）対象が完全または部分的に、アジア（特に日本人）民族、アメリカインディアン民族および黒人民族から選択される少なくとも１つの民族のメンバーである。
（ｓ）対象が食塩感受性に関連する１つまたは複数の遺伝標識形質を有する。
（ｔ）対象が肥満であり、好ましくは２５％を超える体脂肪、より好ましくは３０％を超える体脂肪、さらにより好ましくは３５％を超える体脂肪を有する。
（ｕ）対象が食塩感受性であるか、またはかつてそうであった一親等、二親等または三親等の親族を１人もしくは複数有する。ここで、一親等は親または同じ親の１人もしくは複数を共有する親族を意味し、二親等は祖父母および同じ祖父母の１人もしくは複数を共有する親族を意味し、三親等は曽祖父母および同じ曽祖父母の１人もしくは複数を共有する親族を意味する。好ましくは、そのような人は４人以上の食塩感受性の一親等、二親等または三親等の親族、より好ましくは８人以上のそのような親族、さらにより好ましくは１６人以上のそのような親族、さらにより好ましくは３２人以上のそのような親族を有する。
そうでないと特に示さない限り、上記の値は好ましくは平均値を表し、より好ましくは少なくとも２回の測定に基づく１日平均値である。
好ましくは、治療を必要とする対象は、少なくとも２つ以上の上記の特性を、より好ましくは、少なくとも３つ以上の上記の特性を、さらにより好ましくは、少なくとも４つ以上の上記の特性を満たしている。
したがって、本発明の一実施形態において、治療を必要とする対象は、食塩感受性であり、以下の条件のうちの２つ以上の条件を満たしている。すなわち、（ｉ）対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が少なくとも約４ｇで、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされていて、かつ／または（ｉｉ）対象における血漿中アルドステロン（ｎｇ／ｄＬ）対血漿中レニン（ｎｇ／ｍｌ／時間）の活性比が約３０より大きく、（ｉｉｉ）対象における朝の血漿中レニン活性が約１．０ｎｇ／ｄＬ／時間未満であり、かつ／または、対象における活性レニン値が約１５ｐｇ／ｍＬ未満であり、かつ／または（ｉｖ）対象の収縮期血圧が少なくとも約１３０ｍｍＨｇで、対象の拡張期血圧が少なくとも約８５ｍｍＨｇであり、かつ／または（ｖ）対象が心血管疾患、特に、心不全、左室拡張機能不全、肥大型心筋症および拡張期心不全からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される心血管疾患を有するか、罹患しやすい。
本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、食塩感受性であり、以下の条件を満たしている。すなわち、（ｉ）対象における血漿中アルドステロン（ｎｇ／ｄＬ）対血漿中レニン（ｎｇ／ｍｌ／時間）の活性比が約３０より大きく、かつ、（ｉｉ）対象における朝の血漿中レニン活性が約１．０ｎｇ／ｄＬ／時間未満であり、かつ／または、対象における活性レニン値が約１５ｐｇ／ｍＬ未満である。
本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、食塩感受性であり、以下の条件のうちの少なくとも２つの条件を満たしている。すなわち、（ｉ）対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が少なくとも約４ｇで、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされていて、かつ／または（ｉｉ）対象の収縮期血圧が少なくとも約１３０ｍｍＨｇで、対象の拡張期血圧が少なくとも約８５ｍｍＨｇであり、かつ／または（ｉｉｉ）対象が心血管疾患、特に、心不全、左室拡張機能不全、肥大型心筋症、虚血性心疾患および拡張期心不全からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される心血管疾患を有するか、罹患しやすい。
実例となる表現型
上の実施形態のそれぞれにおいて、対象は好ましくは、完全または部分的に、日本人民族または黒人種の一員である、日本における高血圧症は、重大な問題である。１つの最近の推定で、約３０００万人の日本人成人が高血圧症に罹患していることが示唆されている（Ｓａｒｕｔａ Ｔ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ Ｍｅｄ、１９９７年、第１３巻、４０２４〜９頁）。日本における血圧抑制状態は最近改善されたが、高血圧症の管理は依然として不十分であると考えられる（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ、日本人症例（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｓｅｓ）、Ｎｉｈｏｎ Ｒｉｎｓｙｏ（日本における臨床医学）、２０００年、第５８巻（増刊号）、５９３〜６頁）。日本における血圧および尿中ナトリウムおよびカリウム排泄の傾向：Ｉｎｔｅｒｓａｌｔ試験後８年目における再調査。Ｎａｋａｇａｗａ Ｈ等（Ｈｕｍ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１９９９年１１月、第１３巻（１１号）、７３５〜４１頁）は、日本人集団は食事カリウムを増加させ、食事ナトリウムを減少させることを推奨した。
しかし、日本におけるナトリウム制限生活規則は、不十分な遵守により混乱をきたしている。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等による日本人試験でも５〜８ｇ／日への食事制限が規定されたが、良好な遵守は達成されなかった（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ等、Ｊｐｎ Ｃｉｒｃ Ｊ、１９８３年、第４７巻、２６８〜７５頁）。日本厚生省は、ナトリウムを１０ｇ／日未満に制限することを勧告した（高齢者における高血圧の治療に関するガイドライン、１９９５年−の暫定的計画−日本厚生省加齢および健康に関する包括的研究プロジェクト「高齢者における高血圧の治療に関するガイドライン」の研究班委員）。Ｏｇｉｈａｒａ Ｔ等、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｏｎｅｎ Ｉｇａｋｋａｉ Ｚａｓｓｈｉ、１９９６年、第３３巻（第１２号）、９４５〜７５頁。公衆を教育する１０年の主導にもかかわらず、日本では正常者および高血圧患者における尿中ナトリウムレベルにより測定される高率の不遵守（約５０％より大きいと推定される）が依然として存在する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ等、Ｊｐｎ Ｃｉｒｃ Ｊ、第４７巻（第２号）、２６８〜７５頁）。
さらに、日本人は、食塩感受性と食塩非感受性の２つの広い群を示す（疫学における予防的栄養因子：ナトリウムとカルシウムとの相互作用（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ）、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９９年、第２６巻、５７３頁）。多くの日本人高血圧患者は、食塩感受性であると考えられている。したがって、食塩感受性、高ナトリウム摂取量およびナトリウム摂取の自発的な制限の不履行の組合せを示す日本民族のメンバーは、特に、本発明の療法による恩恵を受ける。
本発明の他の実施形態において、したがって、治療を必要とする対象は、完全または部分的に、日本民族のメンバーである食塩感受性者であり、とりわけ、高血圧症および／または心血管疾患、特に、心不全、左室拡張機能不全、肥大型心筋症および拡張期心不全からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される心血管疾患を有するか、罹患しやすい。
本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、完全または部分的に、日本民族のメンバーである食塩感受性者であり、とりわけ、対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が少なくとも約４ｇであり、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされている。
黒人における高血圧症も重大な問題である。多くの高血圧および正常血圧患者は、食塩感受性である（Ｓｖｅｔｋｅｙ ＬＰ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９６年、第２８巻、８５４〜８頁）。蓄積された疫学的データは、黒人における高血圧症の罹患率がほぼすべての年齢および性一致群について白人よりも大きいことを示している。高血圧症の黒人は、一般的に高血圧症の白人よりも高い発現率の左室機能不全、脳卒中および腎損傷を有する（しかし、虚血性心疾患の発現率はより低い）（Ｅｉｓｎｅｒ ＧＭ、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ、１９９０年、第１６巻（４増刊１）、３５〜４０頁）。アメリカ黒人における流行性高血圧の原因は主として環境的なものであり、高ナトリウムおよびアルコール摂取量、肥満、身体的不活発ならびに心理社会的ストレスがすべて原因として特定された（Ｆｌａｃｋ ＪＭ等、Ｊ Ａｓｓｏｃ Ａｃａｄ Ｍｉｎｏｒ Ｐｈｙｓ、１９９１年、第２巻、１４３〜５０頁）。
黒人および白人集団における問題の原因は不確実であるが、ナトリウムの取扱いの差異が黒人高血圧症患者の特定の血行動態およびホルモンプロファイルに寄与していると思われる。ナトリウム利尿能力を制限する内因性または高血圧誘発性腎異常、Ｎａ＋、Ｋ（＋）−ＡＴＰアーゼポンプ活性の低下、他の膜イオン輸送の障害、心理的ストレス因子への特異な曝露量、より大きいインスリン抵抗性および食事因子（カルシウムおよびカリウム摂取量の低下）がおそらく役割を果たしていると示唆された（Ｆｌａｃｋ ＪＭ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９１年、第１７巻（１増刊）、Ｉ１１５〜２１頁）。１試験で遺伝的差異も黒人における食塩感受性の基礎をなしている可能性があることが示された（Ｓｖｅｔｋｅｙ ＬＰ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９６年、第２８巻、８５４〜８頁）。
黒人における高血圧症は一般的に、最初に食事におけるナトリウム摂取の制限により管理されている。食事の管理が困難である場合、２４時間有効性を有し、末梢血管抵抗を低下させ、ナトリウム排泄を促進し、腎の血行動態を潜在的に改善する降圧薬の投与が推奨されている（Ｅｉｓｎｅｒ ＧＭ、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ、１９９０年、第１６巻（４増刊１）、３５〜４０頁）。しかし、黒人は一般的に、白人と比較して降圧薬に対して異なった反応を示す。一般的に、βアドレナリン受容体拮抗薬またはＡＣＥ阻害薬単剤療法は、黒人のほうが白人よりも有効性が低い。黒人男性は、黒人女性よりもＡＣＥ阻害薬に対して反応性が低い傾向がある（Ｅｉｓｎｅｒ ＧＭ、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ、１９９０年、第１６巻（４増刊１）、３５〜４０頁）。したがって、食塩感受性、高ナトリウム摂取量およびナトリウム摂取の自発的な制限の不履行の組合せを示す黒人種の一員は、特に、本発明の療法による恩恵を受ける。
本発明の他の実施形態において、したがって、治療を必要とする対象は、完全または部分的に、黒人種の一員である食塩感受性者であり、とりわけ、高血圧症および／または心血管疾患、特に、心不全、左室拡張機能不全、肥大型心筋症および拡張期心不全からなる群の１つまたは複数のメンバーから選択される心血管疾患を有するか、罹患しやすい。
本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、完全または部分的に、黒人種の一員である食塩感受性者であり、とりわけ、対象による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が、少なくとも約４ｇであり、特に、この条件が年間の所与の期間にわたり少なくとも１カ月ごとまたは複数カ月ごとの１カ月間にわたり満たされている。
本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、完全または部分的に、黒人種の一員である食塩感受性者であり、とりわけ、標準降圧療法に反応して低い血圧降下を示す。これは、特に、そのような療法がＡＣＥ阻害薬の投与を含む場合に当てはまる。
非調節性者
上記のように、非調節性者は高ナトリウム摂取量またはアンジオテンシンＩＩ投与に対する腎血流速およびアルドステロンの副腎での産生の陽性反応の鈍化を示す。そのような非調節性者は、さらに空腹時インスリンレベルの増加とブドウ糖刺激性インスリンレベルの増加を示すことがある（Ｆｅｒｒｉ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９９年、第４８巻、１６２３〜３０頁）。インスリン抵抗性はまた、心筋梗塞の危険の増加を伴う。
したがって、本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、とりわけ、（ｉ）インスリン抵抗性、特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病および／またはブドウ糖感受性を有するか、有しやすく、かつ／または（ｉｉ）心血管疾患を有するか、罹患しやすい食塩感受性および非調節性者である。
高齢者
食塩感受性者では、ナトリウムの食事摂取量の所与の増加に対する血圧上昇反応は年齢とともに増加する。同様に、食塩感受性は高齢者により頻繁に認められる。さらに、インスリン抵抗性は、年齢に伴う同様な増加を示す。
したがって、本発明の一実施形態において、治療を必要とする対象は、少なくとも５５歳、好ましくは少なくとも約６０歳、より好ましくは少なくとも約６５歳である食塩感受性者であり、とりわけ、インスリン抵抗性、特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病および／またはブドウ糖感受性を有するか、有しやすい。
解毒および回復アルコール中毒者
解毒および回復アルコール中毒者も一般に食塩感受性である（Ｇｅｎａｒｏ Ｃ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２０００年、８６９〜８７４頁）。したがって、本発明の一実施形態において、治療を必要とする対象は、食塩感受性者であり、とりわけ、解毒処置を受けた、アルコール中毒者または回復中のアルコール中毒者である。
肥満
肥満者は、一般的に食塩感受性である。Ｂｏｎｎｅｒによる研究（ＭＭＷ Ｆｏｒｔｓｃｈｒ Ｍｅｄ、１９９９年、第１４巻、３４〜６頁）ですべての高血圧患者の４４％が体重過多であり、さらに食塩感受性、細胞内カルシウムの増加、ナトリウム貯留および心は駆出量の増加を伴っていると推定された。さらに、Ｄｉｍｓｄａｔｅ等（Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１９９０年、第３巻、４２９〜３５頁）は、肥満患者は食塩負荷に反応して収縮期圧を上昇させる可能性があることを報告した。さらに、食塩感受性小児も肥満および心血管疾患の高い可能性を有する（Ｆａｌｋｎｅｒ Ｂ等、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ、１９９７年、第６５巻、６１８Ｓ〜６２１Ｓ頁）。正常血圧者でさえも、ナトリウム感受性者はナトリウム抵抗性対象よりも体重が多い傾向がある（Ｒｏｃｃｈｉｎｉ ＡＰ等、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ、１９９４年、第３０７巻、増刊１、Ｓ７５〜８０頁）。したがって、本発明の他の実施形態において、治療を必要とする対象は、食塩感受性者であり、しかも、とりわけ肥満である。
食塩感受性の治療
本発明はまた、食塩感受性の進行を低減し、かつ／または逆転するためのアルドステロン拮抗薬であるエポキシステロイド化合物の使用に関する。食塩感受性者が高血圧であるか、喫煙するか、あるいは高コレステロールを有するかにかかわりなく、食塩感受性は脳卒中を含む心血管疾患による死亡の独立した危険因子である（Ｍｙｒｏｎ Ｈ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、米国心臓協会の高血圧研究に関する審議会の第５４回年会（５４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ワシントンＤＣ、２０００年）。
したがって、本発明の一実施形態において、治療を必要とする対象は、多かれ少なかれ、正常な臨床像を有する食塩感受性者である。正常な臨床像とは、本明細書で用いているように、著しく高血圧でなく、腎臓、心臓、心血管、脳血管の持続的疾患または異常インスリン症の発生の顕著な証拠を有さない人を意味する。そのような人における本発明によるエプレレノンの使用により、アルドステロン／食塩媒介性病状の発現が予防される。
一般的に、食塩感受性の年齢に関連する進行はほとんどの人に起こる。この状態の進行は、一部はいくつかのアルドステロン媒介性現象に起因すると考えられている。第１に、高食塩食を摂取している非調節者では、高血圧につながるアルドステロン放出および腎血液供給の異常なアンジオテンシン媒介性制御が存在する。第２に、対象が高齢になると、アルドステロン媒介性血管硬化により血管のコンプライアンスが損なわれ、その結果として、血圧の一部を吸収する血管の能力が失われる。第３に、年齢に関連するインスリン産生の増加がＥＮａＣ活性のアルドステロン媒介性増加を亢進させる。
本発明によるエポキシステロイド化合物の投与により、食塩感受性ならびにナトリウム摂取量の増加に反応しての血圧の上昇、腎、心血管および脳の病状のような（これらに限定されないが）関連する状態の進行が低減かつ／または逆転する。エポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の投与により、年齢に関連する効果の進行が低減かつ／または逆転する。さらに、そのような投与により、腎、心血管および脳の病状の進行に対するそのような人における食塩感受性の遺伝および食事の影響も低減かつ／または逆転する。
ナトリウム摂取欲の抑制
本発明はまた、それを必要とする人におけるナトリウム摂取欲を抑制するためのエポキシステロイド化合物の使用に関する。多数の医学的状態の多数の病的結果は食事ナトリウム摂取の制限により低減させることはできるが、そのような制限の遵守は不十分であることが多い。そのような遵守が達成される場合、たとえ一部であるにすぎないとしても、そのような制限を試みる人はしばしば食塩渇望と生活の質の低下を経験する。したがって、本発明は、そのような医学的状態の他の治療の補助としてそのような人を利するものであり、さらに生活の質の改善をもたらす。
アルドステロン媒介中枢病状の治療および／または予防
食塩感受性を有する人は、一部、アルドステロンの中枢作用の結果として、血圧の上昇を経験すると推定される。ＲＡＡＳの活性化が脳の脳室内領域（「ＩＣＶ」）における昇圧または交感神経応答を引き起こす。アルドステロンは、特に脳内の細胞内ナトリウムレベルが高い人における脳において高血圧誘発性である。そのようなアルドステロンのレベルの上昇は、食塩感受性者において特に起こる可能性がある。個人の脳内のアルドステロン（「中枢アルドステロン」）の高血圧誘発作用は、一部は、神経原性血管運動性緊張の増加と動脈圧反射の障害により媒介されると考えられている。さらに、中枢アルドステロンは、視床下部−下垂体−副腎（「ＨＰＡ」）軸のストレス／不安誘発性活性化における中心的なものであると考えられている。そのような人における標準的な抗高血圧療法は食事ナトリウム摂取量の増加により混乱をきたすが、本発明は、ナトリウム摂取量の増加にもかかわらず有効であり、高血圧症の管理の改善をもたらす療法を提供する。
したがって、本発明は、人、特に、脳内の高い細胞内ナトリウムレベルを有する、または有しやすい人の脳内のアルドステロンを機能的に不活性化するためのエポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の使用を含む。そのような高いレベルは、食塩感受性を有する人および食事ナトリウム摂取量が多い人に特に発生する可能性がある。「機能的に不活性化する」とは、アルドステロンによって媒介される１つまたは複数の作用を部分的または完全に遮断することを意味する。
本発明は特に、次の、ＨＰＡ軸の活性化、神経原性血管運動性緊張の増加または動脈圧反射の障害のうちの、１つまたは複数の結果として高血圧である人の治療または予防におけるエポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の使用を含む。
本発明はさらに、脳内の異常なアルドステロンレベルの有害な影響を低減かつ／または予防するための食塩感受性高血圧患者の治療または予防におけるエポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の使用を含む。
アルドステロン媒介腎病状の治療および／または予防
本発明はまた、高レベルの細胞内ナトリウムを有する高血圧症対象を治療し、それにより異常な腎ナトリウム貯留を予防するためのエポキシステロイド化合物の使用に関する。したがって、本発明は、ヒト対象の腎臓において、特に、食塩感受性および／または食事ナトリウムの高摂取量を有する対象におけるアルドステロンを機能的に不活性化するためのエポキシステロイド化合物の使用を含む。「機能的に不活性化する」とは、アルドステロンによって媒介される１つまたは複数の作用を部分的または完全に遮断することを意味する。
ナトリウム摂取量の増加は、食塩感受性を有する人におけるナトリウムレベルの増加と高血圧の期間の延長をもたらすことがある。そのような人では、一部はナトリウム貯留が必要でないため、ＲＡＡＳは一般的に刺激されず、レニンおよびアルドステロンレベルは比較的低い。したがって、アルドステロンの上流のＲＡＡＳの阻害薬（例えば、ＡＣＥ阻害薬およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬）は、限られた有効性を有する。低レニン／食塩感受性高血圧症の基礎をなす基本的な生化学的欠陥は明らかでないが、これらの人々における異常な腎ナトリウム貯留が高血圧の一因である。十分な治療的管理の試みはしばしば併用療法を伴うものであり、これは単剤療法と比べて負の副作用の増加をもたらすことがある。アルドステロンは、特に、高レベルの細胞内ナトリウムを有する人の腎臓において高血圧誘発性を示す。そのような人には、特に食塩感受性を有する人が含まれる。しかしながら、本発明の新規の方法は、非刺激性ならびに刺激性アルドステロンの高血圧作用を効果的に遮断する。本発明によるエポキシステロイド化合物の投与により、標準的な抗高血圧療法を混乱させる高ナトリウム摂取量にもかかわらず、腎臓における不完全なナトリウム利尿調節が矯正され、血圧を回復させることができる。
したがって、本発明の他の実施形態において、病原性効果は、高レベルのナトリウムの存在下でのアルドステロンの作用に、完全または部分的に、起因する。好ましくは、病原性効果は、高レベルの細胞内ナトリウムの存在下でのアルドステロンの作用に、完全または部分的に、起因する。
本発明の他の実施形態において、病原性効果は、脳内に存在するアルドステロンにより、完全または部分的に、媒介される。好ましくは、病原性効果は、高レベルの細胞内ナトリウムの存在下でのアルドステロンの作用に、完全または部分的に、起因する。より好ましくは、病原性効果は、高血圧症および脳卒中から選択される。
本発明の他の実施形態において、病原性効果は、腎臓に存在するアルドステロンにより、完全または部分的に、媒介される。好ましくは、病原性効果は、高レベルの細胞内ナトリウムの存在下でのアルドステロンの作用に、完全または部分的に、起因する。より好ましくは、病原性効果は、腎性高血圧症および腎硬化症から選択される。
本発明の他の実施形態において、病原性効果は、対象におけるアルドステロンと食事ナトリウムの高摂取量の複合作用に、完全または部分的に、起因する。
追加の実施形態
一実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、アルドステロンにより完全または部分的に媒介される臓器障害（心臓、腎臓、脳、肝臓および肺におけるような）を治療または予防する。好ましくは、対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象における以前に記載した１つまたは複数の特性を示す。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象としては以下の対象が挙げられる。
（ａ）インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象。
（ｂ）ミクロアルブミン尿症、軽度ないし中等度の高血圧症および低血漿レニンレベル（特に、対象が低レニン性高血圧症も示す場合）からなる群から選択される１つまたは複数の状態を示す対象。
（ｃ）黒人であり、好ましくは、軽度ないし中等度の高血圧症を示す対象。
（ｄ）アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ロサルタンのような）による治療に反応して少なくとも約４％、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約６％より少ない血圧の降下を示す対象。より好ましくは、エポキシステロイド化合物をアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬とともにそのような対象に投与する。
（ｅ）少なくとも約６０歳の年齢、収縮期高血圧、脈圧の拡大およびミクロアルブミン尿症からなる群から選択される１つまたは複数の状態を示す対象。そのような対象に、エポキシステロイド化合物を、例えば脈圧、頚動脈−大腿動脈脈波伝播速度、ミクロアルブミン尿、末梢浮腫または苦痛の臨床的に意味のある症状からなる臨床像の群の１つまたは複数の程度を低減させるのに有効な用量で投与することができる。
終末器官障害を治療または予防するために投与するエポキシステロイド化合物は好ましくは、対象における尿中アルブミンの対クレアチニン比（「ＵＡＣＲ」）を、治療開始前の基準ＵＡＣＲと比べて、治療開始後１２週間以内に少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％低下させるのに有効な量で投与する。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、糸球体濾過率の低下、ミクロアルブミン尿症および蛋白尿（特にミクロアルブミン尿症）からなる群から選択される腎機能不全を治療または予防する。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の１群は、インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象である。好ましくは、エポキシステロイド化合物は、ＵＡＣＲを治療開始前の基準ＵＡＣＲと比べて治療開始後１２週間以内に少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％低下させるのに有効な量で投与する。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、末期腎疾患を治療または予防する。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の１群は、インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象である。好ましくは、エポキシステロイド化合物は、ＵＡＣＲを治療開始前の基準ＵＡＣＲと比べて治療開始後１２週間以内に少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％低下させるのに有効な量で投与する。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、左室肥大を治療または予防する。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の１群は、インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象である。好ましくは、エポキシステロイド化合物は、ＡＣＥ阻害薬（エナラプリルのような）とともに投与することができる。一般的に、エポキシステロイド化合物をそのような対象に以下の１つまたは両方を達成するのに十分な量で投与する。すなわち、（ａ）治療開始前の基準コラーゲンターンオーバーと比べて治療開始後１２週間以内に少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％のコラーゲンターンオーバーの尺度の低下、および（ｂ）治療開始前の基準ＵＡＣＲと比べて治療開始後１２週間以内に少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％のＵＡＣＲの減少。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）を投与して、対象における血管コンプライアンスを改善する。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の１群は、インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象である。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）を投与して、対象における収縮期血圧を降下させる。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の１群は、インスリン抵抗性（特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）および／またはブドウ糖感受性を有する、または有しやすい対象である。好ましくは、エポキシステロイド化合物は、収縮期血圧を治療開始前の基準収縮期血圧と比べて治療開始後１２週間以内に少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、さらにより好ましくは少なくとも約７％、さらにより好ましくは少なくとも約８％、さらにより好ましくは少なくとも約９％、さらにより好ましくは少なくとも約１０％降下させるのに有効な量で投与する。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、対象におけるアルドステロンの全身性効果を治療または予防する。そのような全身性効果としては、心臓、腎臓、脳、肝臓、肺および血管系からなる群から選択される２つ以上の臓器に作用する、アルドステロンに対する全身性の病的反応などが挙げられる。対象は、治療または予防から利益を得ることができる対象について以前に記載した１つまたは複数の特性を示すことが好ましい。特に関心がもたれる対象の１群は、ミクロアルブミン尿症を示し、特に、対象は、血圧の上昇、心血管機能不全、左室肥大、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、網膜症および末期腎疾患からなる群から選択される１つまたは複数の状態をさらに示す。
他の実施形態において、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物（特にエプレレノン）をそれを必要とする対象に投与して、先天性障害、心臓弁障害、冠動脈疾患、院内障害、手術により誘発される障害、心筋症性障害、ウイルス誘発性障害、細菌誘発性障害、解剖学的障害、血管疾患、移植誘発性障害、虚血性障害、不整脈性障害、伝導障害、血栓性障害、大動脈障害、凝固障害、結合組織障害、神経筋障害、血液学的障害、低圧障害、内分泌障害、肺障害、非悪性腫瘍障害、悪性腫瘍障害および妊娠誘発性障害からなる群から選択される心血管障害を治療または予防する。関心の対象となる心血管障害の群は、冠動脈疾患、心筋症性障害、大動脈障害および結合組織障害からなる群から選択される心血管障害を含む。関心の対象となる心血管障害の他の群は、先天性障害、心臓弁障害、院内障害、手術により誘発される障害、ウイルス誘発性障害、細菌誘発性障害、解剖学的障害、移植誘発性障害、伝導障害、凝固障害、神経筋障害、血液学的障害、低圧障害、内分泌障害、肺障害、非悪性腫瘍障害、悪性腫瘍障害および妊娠誘発性障害からなる群から選択される心血管障害を含む。
上の実施形態のそれぞれにおいて、そのような治療が有効である特に関心がもたれる対象の他の群は、心臓または腎臓に関連する状態に対する標準的療法（例えば、利尿薬、カルシウムチャンネル遮断薬、βアドレナリン受容体遮断薬、α遮断薬としての活性を有する、あるいはＲＡＡＳの拮抗薬（ＡＣＥ阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬など）としての活性を有する１つまたは複数の化合物の投与を含む高血圧または心不全を治療するための単独療法または併用療法）による治療に対して実質的に不応性である対象である。そのような不応性対象がエポキシステロイド化合物による単独療法に対して十分に制御されない、もしくは十分に満たない反応を示す場合、エポキシステロイド化合物は、有用な効果を得るために、標準的療法（特に、チアジドと併用または併用せずにＡＣＥ阻害薬の投与）と併用することができる。十分に満たない反応は、例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ロサルタンのような）による治療に反応して少なくとも約４％、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約６％より少ない対象における血圧の降下および／またはＵＡＣＲの進行を含むようなものであろう。
エポキシステロイド化合物
本発明の方法で用いるエポキシステロイド性アルドステロン拮抗化合物は、一般的にエポキシ型部分で置換されたステロイド核を有する。「エポキシ型」部分という用語は、２つの炭素原子間の橋かけとしての酸素原子を含むことを特徴とする部分を含むことを意味するものであり、その例は以下の部分を含む。
「エポキシステロイド性」という句で用いている「ステロイド性」という用語は、通常の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」および「Ｄ」環を有するシクロペンテノフェナントレン部分によってもたらされる核を意味する。エポキシ型部分は、シクロペンテノフェナントレン核に結合可能または置換可能な位置で結合させることができる。すなわち、ステロイド核の環の１つに融合させることができる。あるいは、エポキシ型部分を環系の環員上で置換させることができる。「エポキシステロイド性」という句は、それに結合した１つまたは複数のエポキシ型部分を有するステロイド核を含むことを意味する。
本発明の方法における使用に適するエポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬は、ステロイド核の「Ｃ」環に融合されたエポキシ部分を有する化合物のファミリーを含む。特に好ましいものは、９α，１１α−置換エポキシ部分の存在を特徴とする２０−スピロキサン化合物である。以下の表１に示す化合物１〜１１は、本発明の方法で用いることができる実例となる９α，１１α−エポキシステロイド化合物である。これらのエポキシステロイドは、Ｇｒｏｂ等の米国特許第４５５９３３２号に記載されている手順により調製することができる。９，１１−エポキシステロイド化合物とそれらの塩を調製する別の方法は、Ｎｇ等の国際出願公開第９７／２１７２０号およびＮｇ等の国際出願公開第９８／２５９４８号に開示されている。
特に興味深いものは、上に示した化合物１であるＵＳＡＮ名エプレレノン（エポキシメクスレノンとしても知られている）を有する化合物である。エプレレノンは、アルドステロン受容体拮抗薬であり、アルドステロン受容体に対して、例えば、スピロノラクトンよりも高い特異性を有する。本発明の方法におけるアルドステロン拮抗薬としてのエプレレノンの選択は、より低い特異性を有するアルドステロン拮抗薬の使用に伴って発生する女性化乳房のような特定の副作用を低減させるのに有用であると思われる。
エポキシステロイド性アルドステロン受容体拮抗薬の固体状態の形
選択されるエポキシステロイド化合物は、それ自体の１つまたは複数の固体状態の形としてのそのいずれかの固体状態の形で、あるいは、１つまたは複数の固体状態の形のエプレレノンを含む薬剤組成物の形態で投与することができる。これらの新規の固体状態の形は、溶媒和した結晶形、非溶媒和結晶形および無定形を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の方法により投与するエポキシステロイド化合物は、下の表１Ａに示す粉末Ｘ線回折パターンを有するエプレレノンの非溶媒和結晶形である（本明細書では「高融点多形」または「Ｆｏｒｍ Ｈ」と称する）。
本発明の他の実施形態において、本発明の方法により投与するエプレレノンは、下の表１Ｂに示す粉末Ｘ線回折パターンを有するエプレレノンの非溶媒和結晶形である（本明細書では「低融点多形」または「Ｆｏｒｍ Ｌ」と称する）。
未配合のＦｏｒｍ Ｈは、例えば、未配合のＦｏｒｍ Ｌよりも低い温度（すなわち、後に述べる互変遷移温度以下の温度）で、速い溶解速度（約３０％高い）を示す。消化管内でのエプレレノンの溶解が標的細胞へのエプレレノンの送達の律速段階である場合、より速い溶解は、一般的に生物学的利用能の改善をもたらすものである。したがって、Ｆｏｒｍ Ｈは、Ｆｏｒｍ Ｌと比較して生物学的利用能プロファイルの改善をもたらすことができる。さらに、より速い溶解速度を有するエプレレノンの固体状態形を選択することにより、同様に、より遅い溶解速度を有する他の固体状態形と比較して、賦形剤の選択および即放性薬剤組成物の調合に際して大きい柔軟性をもたせることが可能になる。
Ｆｏｒｍ Ｌは、例えば、Ｆｏｒｍ Ｈよりも低い温度（すなわち、後に述べる互変遷移温度以下の温度）で大きい物理的安定性を有する。特別な処理または貯蔵条件を用いる必要がなく、頻繁な在庫交換の必要を回避できるＦｏｒｍ Ｌのようなエプレレノンの固体状態形が望ましい。例えば、製造工程中（粒径が小さく、表面積が大きい材料を得るためのエプレレノンの摩砕時のような）に物理的に安定なエプレレノンの固体状態形を選択することにより、特殊な処理条件の必要とそのような特殊な処理条件に一般的に伴う費用の増加を避けることができる。同様に、種々の貯蔵条件（エプレレノン製品の有効期間中の種々の可能な貯蔵条件を特に考慮した）で物理的に安定なエプレレノンの固体状態形の選択は、製品損失または製品の有効性の低下をもたらす可能性のあるエプレレノンの多形または他の分解性変化を回避する助けとなり得る。したがって、より大きい物理的安定性を有するＦｏｒｍ Ｌのようなエプレレノンの固体状態形を選択することにより、エプレレノンの安定性が低い形よりも意義のある利点が得られる。
本発明の他の実施形態において、本発明の方法により投与するエプレレノンは、溶媒和結晶形のエプレレノンである。好ましくは、溶媒和結晶形は、製薬上許容できる溶媒でない溶媒を実質的に含まない。Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌは、一般的に室温、大気圧のもとでは結晶性溶媒和物よりも物理的に安定であるので、そのような組成物に用いる溶媒和結晶形は一般的に、ブタノール（これに限定されないが）のような製薬上許容できるより高沸点および／または水素結合性溶媒を含む。溶媒和結晶形は集合的に一連の異なる溶解速度をもたらし得ると考えられており、消化管内でのエプレレノンの溶解が標的細胞へのエプレレノンの送達の律速段階である場合、生物学的利用能はＦｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌに相関する。
本発明の他の実施形態において、本発明の方法により投与するエプレレノンは、無定形エプレレノンである。無定形エプレレノンは異なる溶解速度を有すると想定され、消化管内でのエプレレノンの溶解が標的細胞へのエプレレノンの送達の律速段階である場合、生物学的利用能はＦｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌに相関する。
本発明の他の実施形態において、本発明の方法により投与するエプレレノンは、第１の固体状態形のエプレレノンと第２の固体状態形のエプレレノンを含む配合物である。一般的に、第１および第２の固体状態形のエプレレノンは、Ｆｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌ、溶媒和エプレレノンおよび無定形エプレレノンから選択される。そのような配合物は、さらに別の固体状態形のエプレレノンを含んでいてよく、例えば、放出制御組成物を含む異なる溶解プロファイルを有する薬剤組成物の調製に有用である。一般的に、前記第１の固体状態形と前記第２の固体状態形との重量比は、好ましくは少なくとも約１：９、より好ましくは少なくとも約１：１、より好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは少なくとも約５：１、より好ましくは少なくとも約９：１である。
他の実施形態において、エプレレノンを、含まれるエプレレノンの全量が純相Ｆｏｒｍ Ｈとして存在する薬剤組成物の形で投与する。
他の実施形態において、エプレレノンを、含まれるエプレレノンの全量が純相Ｆｏｒｍ Ｌとして存在する薬剤組成物の形で投与する。
他の実施形態において、エプレレノンを、含まれるエプレレノンの全量が純相溶媒和結晶性エプレレノンとして存在する薬剤組成物の形で投与する。
他の実施形態において、エプレレノンを、含まれるエプレレノンの全量が無定形エプレレノンとして存在する薬剤組成物の形で投与する。
他の実施形態において、エプレレノンを、Ｆｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌ、溶媒和エプレレノンおよび無定形エプレレノンから選択される第１および第２の固体状態形のエプレレノンを含む薬剤組成物の形で投与する。一般的に、前記第１の固体状態形と前記第２の固体状態形との重量比は、好ましくは少なくとも約１：９、より好ましくは少なくとも約１：１、より好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは少なくとも約５：１、より好ましくは少なくとも約９：１である。
他の実施形態において、エプレレノンを、Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌを含む薬剤組成物の形で投与する。組成物におけるＦｏｒｍ ＬとＦｏｒｍ Ｈとの量の比は、一般的に約１：２０〜２０：１である。他の実施形態において、例えば、この比は、約１０：１〜約１：１０、約５：１〜約１：５、約２：１〜約１：２、または約１：１である。
上の実施形態のそれぞれは広範囲のエプレレノン粒径にわたる固体状態形のエプレレノンの投与を含むが、エプレレノン粒径が小さい固体状態形のエプレレノンの選択を加えることにより、未配合エプレレノンおよび固体状態形のエプレレノンを含む薬剤組成物の生物学的利用能を改善することができることが発見された。
そのような一実施形態において、未配合エプレレノンまたは薬剤組成物の出発材料として用いるエプレレノンのＤ９０粒径は、一般的に約４００μｍ未満、好ましくは約２００μｍ未満、より好ましくは約１５０μｍ未満、さらにより好ましくは約１００μｍ未満、さらにより好ましくは約９０μｍ未満である。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約４０μｍ〜約１００μｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約３０μｍ〜約５０μｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約５０μｍ〜約１５０μｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約７５μｍ〜約１２５μｍである。
そのような他の実施形態において、未配合エプレレノンまたは薬剤組成物の出発材料として用いるエプレレノンのＤ９０粒径は、一般的に約１５μｍ未満、好ましくは約１μｍ未満、より好ましくは約８００ｎｍ未満、さらにより好ましくは約６００ｎｍ未満、さらにより好ましくは約４００ｎｍ未満である。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約１０ｎｍ〜約１μｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約１００ｎｍ〜約８００ｎｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約２００ｎｍ〜約６００ｎｍである。他の実施形態において、Ｄ９０粒径は約４００ｎｍ〜約８００ｎｍである。
約１５μｍ未満の粒径を有する固体状態形のエプレレノンは、当技術分野で知られている適用可能な粒径低減技術により調製することができる。そのような技術は、米国特許第５１４５６８４号、第５３１８７６７号、第５３８４１２４号および第５７４７００１号に記載されているものを含むが、これらに限定されない。米国特許第５１４５６８４号、第５３１８７６７号、第５３８４１２４号および第５７４７００１号は、詳細に記載している場合、参照により特に組込まれる。例えば、米国特許第５１４５６８４号の方法によれば、適切な大きさの粒子は、エプレレノンを液体分散媒に分散させ、粉砕媒体の存在下で混合物を湿式粉砕を行って、粒子を所望の大きさまで粉砕する。必要または都合がよい場合、表面改質剤の存在下で粒子の大きさを低減させることができる。
固体状態の定義
エプレレノンに適用される「無定形」という用語は、エプレレノン分子が無秩序な配列状態で存在し、識別できる結晶格子また単位格子を形成しない固体状態を意味する。粉末Ｘ線回折に供するとき、無定形エプレレノンは何らの特有な結晶ピークをもたらさない。
本願書において物質または溶液の「沸点」に言及する場合、「沸点」という用語は、適用可能な処理条件下の物質または溶液の沸点を意味する。
エプレレノンに適用される「結晶形」という用語は、（ｉ）識別できる単位格子を含み、（ｉｉ）Ｘ線をあてたとき回折ピークを生ずる識別できる結晶格子を形成するようにエプレレノン分子が配列している固体状態形を意味する。
本願書を通して用いる「結晶化」という用語は、エプレレノン出発材料の調製に関連する該当する状況に応じて、結晶化および／または再結晶化を意味する。
「温浸」という用語は、溶媒または溶媒の混合物中固体エプレレノンのスラリーを適用可能な処理条件下の溶媒または溶媒の混合物の沸点で加熱する処理を意味する。
本明細書で用いる「直接結晶化」という用語は、エプレレノンの中間溶媒和結晶性固体状態形の生成および脱溶媒和を伴わずに適切な溶媒からエプレレノンを直接結晶化することを意味する。
本明細書で用いる「粒径」という用語は、レーザー光散乱法、沈降場流動分画、光子相関分光法またはディスク遠心分離のような当技術分野でよく知られている通常の粒径測定技術により測定される粒径を意味する。
「Ｄ９０粒径」という用語は、そのような通常の粒径測定技術により測定される粒子の少なくとも９０％の粒径を意味する。
「純度」という用語は、通常のＨＰＬＣ定量法によるエプレレノンの化学的純度を意味する。本明細書で用いているように、「低純度エプレレノン」は、一般的に、有効な量のＦｏｒｍ Ｈ成長促進因子および／またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害因子を含むエプレレノンを意味する。本明細書で用いているように、「高純度エプレレノン」は、一般的に、有効に満たない量のＦｏｒｍ Ｈ成長促進因子および／またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害因子を含まない、または含むエプレレノンを意味する。
「相純度」という用語は、本明細書に記載する赤外分光分析法により測定される特定の結晶または無定形のエプレレノンに関するエプレレノンの固体状態純度を意味する。
「ＸＰＲＤ」という用語は、粉末Ｘ線回析を意味する。
「Ｔｍ」という用語は、融解温度を意味する。
固体状態形のキャラクタリゼーション
１．分子の立体配座
単結晶Ｘ線解析から、エプレレノン分子の立体配座はＦｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌとで、特にステロイド環の７位のエステル基の配向に関して異なっていることがわかっている。エステル基の配向は、Ｃ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角により定義することができる。
Ｆｏｒｍ Ｈ結晶格子においては、エプレレノン分子は、エステルのメトキシ基が７位のＣ−Ｈ結合とほぼ並び、カルボニル基がＢステロイド環の中心上にほぼ位置している立体配座をとる。この立体配座ではＣ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角は、約−７３．０°である。この配向では、エステル基のカルボニル酸素原子（０１）は、９，１１−エポキシ環の酸素原子（０４）と密に接触している。０１−０４距離は、約２．９７Åであり、これはファンデルワールス接触距離３．０Åよりわずかに小さい（酸素のファンデルワールス半径を１．５Åと仮定）。
Ｆｏｒｍ Ｌ結晶格子においては、エプレレノン分子は、エステル基がＦｏｒｍ Ｈのエステル基に対して約１５０°回転し、約＋７６．９°のＣ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角を有する立体配座をとる。この配向では、エステルのメトキシ基がＡステロイド環の４，５−アルケン部分の方向を向いている。この配向では、エステル基のいずれかの酸素原子（０１、０２）と９，１１−エポキシ環の酸素原子との距離は、Ｆｏｒｍ Ｈについて測定された距離と比べて増加している。０２−０４距離は、約３．０４Åで、これはファンデルワールス接触距離よりわずかに大きい。０１−０４距離は、約３．４５Åである。
エプレレノン分子は、現在までに単結晶Ｘ線回折により分析した溶媒和結晶形においてはＦｏｒｍ Ｌに特徴的な立体配座をとると思われる。
２．粉末Ｘ線回折
種々の結晶形のエプレレノンをＳｉｅｍｅｎｓ Ｄ５０００粉末回折計またはＩｎｅＩ Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを用いて分析した。Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄ５００粉末回折計の場合、生データは、２〜５０の２θ値について、０．０２０のステップを用い、ステップ時間を２秒として測定した。ＩｎｅＩ Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒの場合、試料をアルミニウム試料ホルダーに入れ、すべての２θ値における生データを３０分間にわたり同時に収集した。
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに、それぞれエプレレノンのＦｏｒｍ Ｈ（低純度エプレレノンの温浸によって得られたエタノール溶媒和物の脱溶媒和により調製）、Ｆｏｒｍ Ｌ（高純度エプレレノンの再結晶によって得られたメチルエチルケトン溶媒和物の脱溶媒和により調製）およびメチルエチルケトン溶媒和物（メチルエチルケトン中高純度エプレレノンの室温スラリー変換により調製）結晶形の２θ値および強度に関する主ピークの重要なパラメーターを示す（１．５４０５６オングストロームの波長のＸ線）。
Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌの製造の経路（すなわち、溶媒和物の脱溶媒和）に起因した結晶の回折面の間隔の不完全の結果として、Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌの回折パターンにおけるピーク位置のわずかな変化が存在する可能性がある。さらに、Ｆｏｒｍ Ｈは、粗エプレレノンの温浸により調製された溶媒和物から分離される。この方法は、Ｆｏｒｍ Ｈのより低い総化学的純度（約９０％）をもたらす。最後に、溶媒和形のエプレレノンは、結晶格子中の溶媒チャンネル内の溶媒分子の高い移動度のため、回折ピークの位置のある程度の変化を示すと予想される。
Ｆｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌおよびメチルエチルケトン溶媒和結晶形のエプレレノンのＸ線回折パターンの図による例をそれぞれ図１−Ａ、図１−Ｂおよび図１−Ｃに示す。Ｆｏｒｍ Ｈは、７．０±０．２、８．３±０．２および１２．０±０．２度の２θにおける特徴的ピークを示す。Ｆｏｒｍ Ｌは、８．０±０．２、１２．８±０．２、１２．４±０．２および１３．３±０．２度の２θにおける特徴的ピークを示す。メチルエチルケトン溶媒和結晶形は、７．６±０．２、７．８±０．２および１３．６±０．２度の２θにおける特徴的ピークを示す。
３．融解／分解温度
非溶媒和エプレレノン結晶形の融解／分解温度をＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ２９２０示差走査型熱量計を用いて測定した。各試料（１〜２ｍｇ）を密閉または非密閉アルミニウム皿に入れ、１０℃／分で加熱した。融解／分解範囲は、融解／分解吸熱の極大への開始の外挿により定めた。
非溶媒和エプレレノン結晶形（Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌ）の融解は、化学的分解と結晶格子からの捕捉溶媒の消失に関連していた。融解／分解温度は、分析前の固体の取り扱いの影響も受けた。例えば、適切な溶媒からの直接的結晶化により、または適切な溶媒もしくは溶媒の混合物中高純度エプレレノンの結晶化により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕のＦｏｒｍ Ｌ（おおよそのＤ９０粒径が約１８０〜４５０μｍ）は、一般的に約２３７〜２４２℃の範囲の融解範囲を有していた。粉砕したＦｏｒｍ Ｌ（おおよそのＤ９０粒径が約８０〜１００μｍ）（適切な溶媒もしくは溶媒の混合物中高純度エプレレノンの溶液から溶媒和物を結晶化し、溶媒和物を脱溶媒和してＦｏｒｍ Ｌを生成させ、得られたＦｏｒｍ Ｌを粉砕して調製したＦｏｒｍ Ｌ）は、一般的に約２２３〜２３４℃のより低く、より広い融解／分解範囲を有していた。低純度エプレレノンの温浸により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕のＦｏｒｍ Ｈ（おおよそのＤ９０粒径が約１８０〜４５０μｍ）は、一般的に約２４７〜２５１℃のより高い融解／分解範囲を有していた。（ａ）メチルエチルケトンからの直接結晶化した未粉砕のＦｏｒｍ Ｌ、（ｂ）メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの結晶化により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕のＦｏｒｍ Ｌ、（ｃ）メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの結晶化により得られた溶媒和物を脱溶媒和したものを粉砕して調製したＦｏｒｍ Ｌ、および（ｄ）メチルエチルケトンからの低純度エプレレノンの温浸により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕のＦｏｒｍ ＨのＤＳＣサーモグラムの例をそれぞれ図２−Ａ、２−Ｂ、２−Ｃおよび２−Ｄに示す。
溶媒和形のエプレレノンのＤＳＣサーモグラムは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｙｒｉｓ １示差走査型熱量計を用いて測定した。各試料（１〜１０ｍｇ）を非密閉アルミニウム皿に入れ、１０℃／分で加熱した。低温での１つまたは複数の事象は、溶媒が溶媒和結晶格子から失われたときに起こったエンタルピー変化に関連していた。最高温度での吸熱は、Ｆｏｒｍ ＬまたはＦｏｒｍ Ｈエプレレノンの融解／分解に関連していた。
４．赤外吸収分光法
非溶媒和形のエプレレノン（Ｆｏｒｍ ＬおよびＦｏｒｍ Ｈ）の赤外吸収スペクトルは、Ｎｉｃｏｌｅｔ ＤＲＩＦＴ（拡散反射赤外フーリエ変換）Ｍａｇｎａ Ｓｙｓｔｅｍ ５５０分光光度計を用いて得た。Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｔｅｃｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒシステムおよび微量試料カップを用いた。試料（５％）を臭化カリウムに混入して分析し、４００〜４０００ｃｍ−１の範囲で走査した。希クロロホルム溶液中（３％）または溶媒和結晶形中のエプレレノンの赤外吸収スペクトルは、Ｂｉｏ−ｒａｄ ＦＴＳ−４５分光光度計を用いて得た。クロロホルム溶液試料は、塩化ナトリウム塩プレートを備えた光路長が０．２ｍｍの溶液セルを用いて分析した。溶媒和物のＦＴＩＲスペクトルは、ＩＢＭ ｍｉｃｒｏ−ＭＩＲ（多重内部反射）付属品を用いて収集した。試料は４００〜４０００ｃｍ−１の範囲で走査した。（ａ）Ｆｏｒｍ Ｈ、（ｂ）Ｆｏｒｍ Ｌ、（ｃ）メチルエチルケトン溶媒和物および（ｄ）クロロホルム溶液中エプレレノンの赤外吸収スペクトルの例をそれぞれ図３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃおよび３−Ｄに示す。
表２にＦｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌおよびメチルエチルケトン溶媒和物結晶形中のエプレレノンの例証となる吸収バンドを示す。クロロホルム溶液中のエプレレノンの例証となる吸収バンドも比較のために示す。Ｆｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌまたはメチルエチルケトン溶媒和物の間に差異が、例えば、スペクトルのカルボニル領域に認められた。Ｆｏｒｍ Ｈは、約１７３９ｃｍ−１のエステルカルボニル伸縮を有しているのに対して、Ｆｏｒｍ Ｌおよびメチルエチルケトン溶媒和物はそれぞれ約１７２４および１７２２ｃｍ−１の対応する伸縮を有している。クロロホルム溶液中のエプレレノンでは、エステルカルボニル伸縮は約１７２７ｃｍ−１で起こる。Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌとの間のエステルカルボニルの伸縮振動数の変化は、２つの結晶形の間のエステル基の配向の変化を反映している。さらに、Ａステロイド環における共役ケトンのエステルの伸縮は、Ｆｏｒｍ Ｈまたはメチルエチルケトン溶媒和物の約１６６４〜１６６７ｃｍ−１からＦｏｒｍ Ｌの約１６５５ｃｍ−１に変化する。希薄溶液中の対応するカルボニルの伸縮は、約１６６５ｃｍ−１で起こる。
Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌとの他の差異は、Ｃ−Ｈ変角領域に認められた。Ｆｏｒｍ Ｈは、Ｆｏｒｍ Ｌ、メチルエチルケトン溶媒和物またはクロロホルム溶液中エプレレノンには認められない約１３９９ｃｍ−１での吸収を有する。１３９９ｃｍ−１伸縮は、カルボニル基に隣接するＣ２およびＣ２１メチレン基のＣＨ２はさみ振動の領域で起こる。
５．核磁気共鳴
１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、３１．９４ＭＨｚの磁場で得られた。Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌエプレレノンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルの例をそれぞれ図４および５に示す。図４に反映されているデータを得るために分析したＦｏｒｍ Ｈエプレレノンは、純相でなく、少量のＦｏｒｍ Ｌエプレレノンを含んでいた。Ｆｏｒｍ Ｈは、約６４．８ｐｐｍ、２４．７ｐｐｍおよび１９．２ｐｐｍにおける炭素共鳴によって最も明確に識別される。Ｆｏｒｍ Ｌは、約６７．１ｐｐｍおよび１６．０ｐｐｍにおける炭素共鳴によって最も明確に識別される。
６．熱重量分析
溶媒和物の熱重量分析をＴＡ機器ＴＧＡ２９５０熱重量分析装置を用いて実施した。試料は、窒素パージ下の非密閉アルミニウム皿に入れた。開始温度を２５℃とし、約１０℃／分の速度で昇温した。メチルエチルケトン溶媒和物の熱重量分析プロファイルの例を図６−Ａに示す。
７．単位格子パラメーター
以下の表３Ａ、３Ｂおよび３ＣにＦｏｒｍ Ｈ、Ｆｏｒｍ Ｌおよびいくつかの溶媒和結晶形について測定した単位格子パラメーターを要約する。
選択した溶媒和結晶形のエプレレノンに関する追加情報を下の表４に報告する。メチルエチルケトン溶媒和物について上の表３Ａに報告した単位格子データもこれらの多くの追加のエプレレノンの結晶性溶媒和物の単位格子パラメーターを代表するものである。試験した大部分のエプレレノンの結晶性溶媒和物は、互いに実質的に同じ構造であった。組込まれた溶媒分子の大きさに起因した、１つの溶媒和結晶形の粉末Ｘ線回折ピークと他の溶媒和結晶形とのわずかな差異が存在することがあるが、試験したほとんんどの溶媒和物について、全般的な回折パターンは実質的に同じであり、単位格子パラメーターおよび分子位置は実質的に同じである。
溶媒和物の単位格子は、４つのエプレレノン分子からなっている。単位格子におけるエプレレノン分子と溶媒分子の化学量論も多くの溶媒和物について上の表４に報告する。Ｆｏｒｍ Ｈの単位格子は、４つのエプレレノン分子からなっている。Ｆｏｒｍ Ｌの単位格子は、２つのエプレレノン分子からなっている。溶媒和物の単位格子は、脱溶媒和時にエプレレノン分子が溶媒分子によって残された空間を満たすために並進および回転を受けるときに、Ｆｏｒｍ Ｈ単位格子および／またはＦｏｒｍ Ｌ単位格子に変換される。表４に多種の溶媒和物について脱溶媒和温度も報告する。
８．不純物分子の結晶特性
エプレレノン中の選択した不純物は、溶媒和物の脱溶媒和時にＦｏｒｍ Ｈの生成を誘発する可能性がある。特に、次の２種の不純物分子の影響を評価した。すなわち、７−メチル水素４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトン３（「ジエポキシド」）および７−メチル水素１１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトン４（「１１，１２−エポキシド」）。
脱溶媒和に起因するエプレレノン結晶形に対するこれらの不純物分子の影響は、本願書の実施例により詳細に記載する。
７−メチル水素１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，９（１１）−ジエン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトン５（「９，１１−オレフィン」）とＦｏｒｍ Ｈの単結晶構造の類似性を考慮すれば、９，１１−オレフィンも溶媒和物の脱溶媒和時のＦｏｒｍ Ｈの生成を誘発することができると想定される。
ジエポキシド、１１，１２−オレフィンおよび９，１１−オレフィンは、例えば、Ｎｇ等の国際出願公開第９８／２５９４８号のそれぞれ実施例４７Ｃ、４７Ｂおよび３７Ｈに示されているように調製することができる。
各不純物化合物について単結晶形を分離した。ジエポキシド、１１，１２−エポキシドおよび９，１１−オレフィンの分離された結晶形の代表的な粉末Ｘ線回折パターンをそれぞれ図７、８および１０に示す。各不純物分子の粉末Ｘ線回折パターンはＦｏｒｍ Ｈの粉末Ｘ線回折パターンと類似しており、Ｆｏｒｍ Ｈと３種の不純物化合物が類似した単結晶構造を有することが示唆される。
これらの３種の化合物がＦｏｒｍ Ｈと類似した単結晶構造をとることを立証するために、各不純物化合物の単結晶も分離し、Ｘ線構造測定に供した。ジエポキシドの単結晶は、メチルエチルケトンから分離した。１１，１２−エポキシドの単結晶は、イソプロパノールから分離した。９，１１−オレフィン単結晶は、ｎ−ブタノールから分離した。各不純物化合物の結晶形について測定された結晶構造データを表５に示す。得られた結晶系および単位格子パラメーターは、Ｆｏｒｍ Ｈ、ジエポキシド、１１，１２−エポキシドおよび９，１１−オレフィン結晶形について実質的に同じであった。
表５に報告する４種の化合物は、同じ空間群に結晶化し、同様な単位格子パラメーターを有している（すなわち、それらは等構造性である）。ジエポキシド、１１，１２−エポキシドおよび９，１１−オレフィンは、Ｆｏｒｍ Ｈ立体配座をとると予想される。各不純物化合物についてＦｏｒｍ Ｈ型充填の分離（溶液から直接的に）が比較的に容易であることは、Ｆｏｒｍ Ｈ格子がこのシリーズの構造的に同様な化合物の安定な充填様式であることを示している。
エプレレノンの調製
本発明の新規の結晶形を調製するために用いるエプレレノン出発原料は、Ｎｇ等の国際出願公開第９７／２１７２０号およびＮｇ等の国際出願公開第９８／２５９４８号に記載されている方法、特に、国際出願公開第９７／２１７２０号および国際出願公開第９８／２５９４８号に記載されているスキーム１を用いて調製することができる。
結晶形の調製
１．溶媒和結晶形の調製
溶媒和結晶形のエプレレノンは、適切な溶媒または適切な溶媒の混合物からのエプレレノンの結晶化により調製することができる。適切な溶媒または適切な溶媒の混合物は、一般的に高温度でエプレレノンと不純物を可溶化するが、冷却した時に溶媒和物を選択的に結晶化させる有機溶媒または有機溶媒の混合物を含む。そのような溶媒または溶媒の混合物におけるエプレレノンの溶解度は、一般的に室温で約５〜約２００ｍｇ／ｍＬである。溶媒または溶媒の混合物は、好ましくは、エプレレノン出発原料を調製する方法に以前に用いた溶媒、特に、エプレレノン結晶形を含む最終薬剤組成物に含まれている場合に製薬上許容できるような溶媒から選択される。例えば、塩化メチレンを含む溶媒和物を生ずる塩化メチレンを含む溶媒系は、一般的に望ましくない。
用いる各溶媒は好ましくは、製薬上許容できる溶媒、特に、「不純物：残留溶媒に関するガイドライン」、医薬品規制ハーモニゼーション国際会議（ＩＣＨ運営委員会による１９９７年７月１７日付けＩＣＨプロセスのステップ４の採択に関する勧告）に規定されているクラス２またはクラス３溶媒である。より好ましくは、溶媒または溶媒の混合物は、メチルエチルケトン、１−プロパノール、２−ペンタノン、酢酸、アセトン、酢酸ブチル、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、酢酸イソブチル、酢酸メチル、プロピオン酸エチル、ｎ−ブタノール、ｎ−オクタノール、イソプロパノール、酢酸プロピル、プロピレングリコール、ｔ−ブタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、メタノールおよび酢酸ｔ−ブチルからなる群から選択される。より好ましくは、溶媒は、メチルエチルケトンおよびエタノールからなる群から選択される。
溶媒和結晶形のエプレレノンを調製するために、一定の量のエプレレノン出発原料を一定の容積の溶媒に溶解し、結晶が生成するまで冷却する。エプレレノンを溶媒に加える溶媒温度は、一般的に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、この溶媒温度は一般的に少なくとも約２５℃で、好ましくは、約３０℃から溶媒の沸点まで、より好ましくは溶媒の沸点の約２５℃下から溶媒の沸点までである。
あるいは、熱溶媒をエプレレノンに加え、結晶が生成するまで混合物を冷却することができる。エプレレノンに加えるときの溶媒の温度は、一般的に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、この溶媒温度は一般的に少なくとも２５℃で、好ましくは、約５０℃から溶媒の沸点まで、より好ましくは溶媒の沸点の約１５℃下から溶媒の沸点までである。
所与の容積の溶媒と混合するエプレレノン出発原料の量は、同様に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。一般的に、溶媒に加えるエプレレノンの量は室温でその容積の溶媒に完全には溶けない。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、所与の容積の溶媒と混合するエプレレノン出発原料の量は、通常、室温でその容積の溶媒に溶解するエプレレノンの量の少なくとも約１．５〜約４．０倍、好ましくは約２．０〜約３．５倍、より好ましくは約２．５倍である。
エプレレノン出発原料が溶媒に完全に溶解した後、溶液を一般的に緩やかに冷却し、溶媒和した結晶形のエプレレノンを結晶化させる。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、溶液を約２０℃／分より遅い速度で、好ましくは約１０℃／分またはそれより遅い速度で、より好ましくは約５℃／分またはそれより遅い速度で、さらにより好ましくは約１℃／分またはそれより遅い速度で冷却する。
溶媒和結晶形を収集する終点温度は、溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、終点温度は、一般的に約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、より好ましくは約−５℃未満である。終点温度を低下させることは、一般的に溶媒和結晶形の生成に有利である。
あるいは、他の技術を用いて溶媒和物を調製することができる。そのような技術の例は、（ｉ）エプレレノン出発原料を１つの溶媒に溶解し、溶媒和物結晶形の結晶化を助けるための共溶媒を加える、（ｉｉ）溶媒和物の蒸気拡散成長、（ｉｉｉ）回転蒸発のような蒸発による溶媒和物の分離、および（ｉｖ）スラリー変換を含むが、これらに限定されない。
上記のように調製した溶媒和結晶形の結晶は、濾過または遠心分離のような通常の適切な手段により溶媒から分離することができる。結晶化時に溶媒系の撹拌を増加することにより、一般的により小さい結晶粒径が得られる。
２．溶媒和物からのＦｏｒｍ Ｌの調製
Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンは、脱溶媒和により溶媒和結晶形から直接に調製することができる。脱溶媒和は、溶媒和物の加熱、溶媒和物を取り囲む周囲圧力を減少させること、またはその組合せのような適切な脱溶媒和手段により行うことができるが、これらに限定されない。溶媒和物を例えばオーブン中で加熱して、溶媒を除去する場合、この処理中の溶媒和物の温度は一般的に、Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌの互変遷移温度を超えない。この温度は、好ましくは約１５０℃を超えない。
脱溶媒和圧力および脱溶媒和の時間は、厳密に重要なものでない。脱溶媒和圧力は、好ましくは約１気圧またはそれ以下である。しかし、脱溶媒和圧力が低いとき、脱溶媒和を行うことができる温度および／または脱溶媒和の時間も同様に減少する。特に、より高い脱溶媒和温度を有する溶媒和物については、真空下での乾燥により、より低い乾燥温度の使用が可能になる。必要とする脱溶媒和の時間は、脱溶媒和、およびしたがってＦｏｒｍ Ｌの生成が完了するのに十分なものである。
実質的にすべてのＦｏｒｍ Ｌを含む生成物の調製を保証するためには、エプレレノン出発原料は一般的に高純度エプレレノンであり、好ましくは実質的に純粋なエプレレノンである。Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンを調製するために用いるエプレレノン出発原料は、一般的に少なくとも９０％純粋、好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である。本願書の他所でより詳細に論ずるように、エプレレノン出発原料中の特定の不純物は、処理により得られる生成物の収率とＦｏｒｍ Ｌ含量に悪影響を及ぼす可能性がある。
高純度のエプレレノン出発原料からこのようにして調製される結晶化エプレレノン生成物は、一般的に少なくとも１０％のＦｏｒｍ Ｌ、好ましくは少なくとも５０％のＦｏｒｍ Ｌ、より好ましくは少なくとも７５％のＦｏｒｍ Ｌ、より好ましくは少なくとも９０％のＦｏｒｍ Ｌ、より好ましくは少なくとも約９５％のＦｏｒｍ Ｌ、より好ましくは実質的に純相のＦｏｒｍ Ｌである。
３．溶媒和物からのＦｏｒｍ Ｈの調製
Ｆｏｒｍ Ｈを含む生成物は、（ｉ）高純度エプレレノン出発原料の代わりに低純度エプレレノン出発原料を用いること、（ｉｉ）純相Ｆｏｒｍ Ｈ結晶を含む溶媒系をシード添加すること、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せにより、Ｆｏｒｍ Ｌの調製について上で述べたのと実質的に同じ方法で調製することができる。
Ａ．成長促進物質および阻害物質としての不純物の使用
エプレレノン出発原料中の全不純物の全量ではなく、エプレレノン出発原料中の選択される不純物の存在と量が溶媒和物の脱溶媒和時のＦｏｒｍ Ｈの結晶生成の可能性に影響を及ぼす。選択される不純物は、一般的にＦｏｒｍ Ｈ成長促進物質またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害物質である。それは、エプレレノン出発原料に含め、エプレレノン出発原料を加える前の溶媒もしくは溶媒混合物に含め、かつ／またはエプレレノン出発原料を加えた後に加えることができる。Ｂｏｎａｆｅｄｅ等、Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、１９９５年、第１１７巻、３０頁は、多形系における成長促進物質と成長阻害物質の使用を論じており、参照により本明細書に組込まれる。本発明では、不純物は一般的にＦｏｒｍ Ｈの単結晶構造と実質的に同じ単結晶構造を有する化合物を含む。不純物は、好ましくはＦｏｒｍ Ｈの粉末Ｘ線回折パターンと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを有する化合物であり、より好ましくは、ジエポキシド、１１，１２−エポキシド、９，１１−オレフィンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
Ｆｏｒｍ Ｈ結晶を調製するのに必要な不純物の量は、一般的に一部は、溶媒または溶媒混合物およびエプレレノンに対する不純物の溶解度に依存する。メチルエチルケトン溶媒からのＦｏｒｍ Ｈの結晶化において、例えば、ジエポキシドと低純度エプレレノン出発原料との重量比は、一般的に少なくとも約１：１００、好ましくは少なくとも約３：１００、より好ましくは約３：１００〜約１：５、さらにより好ましくは約３：１００〜約１：１０である。１１，１２−エポキシドは、ジエポキシドよりもメチルエチルケトンに対して高い溶解度を有しており、Ｆｏｒｍ Ｈ結晶の調製に一般的に必要な量より、多量の１１，１２−エポキシドが一般に必要である。不純物が１１，１２−エポキシドを含んでいる場合、ジエポキシドと低純度エプレレノン出発原料との重量比は、一般的に少なくとも約１：５、より好ましくは約３：２５、さらにより好ましくは約３：２５〜約１：５である。ジエポキシドと１１，１２−エポキシドの両方の不純物をＦｏｒｍ Ｈ結晶の調製に用いる場合、各不純物とエプレレノン出発原料との重量比は、単独の不純物をＦｏｒｍ Ｈ結晶の調製に用いる場合の対応する比よりも低くてよい。
選択される不純物を含む溶媒和物を脱溶媒和するとき、Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌとの混合物が一般的に得られる。溶媒和物の最初の脱溶媒和から得られる生成物中のＦｏｒｍ Ｈの重量分率は、一般的に約５０％未満である。下記のような結晶化または温浸によるこの生成物のさらなる処理によって、一般的に生成物中のＦｏｒｍ Ｌの重量分率が増加する。
シード添加
Ｆｏｒｍ Ｈ結晶は、エプレレノンの結晶化の前に純相Ｆｏｒｍ Ｈ結晶（または以前に上で述べたようにＦｏｒｍ Ｈ成長促進物質および／またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害物質）を含む溶媒系をシード添加することによっても調製することができる。エプレレノン出発原料は、低純度エプレレノンまたは高純度エプレレノンであってよい。いずれかの出発原料から調製した溶媒和物を脱溶媒和するとき、生成物中のＦｏｒｍ Ｈの重量分率は、一般的に少なくとも約７０％であり、約１００％と大きいこともある。
溶媒系に加えるＦｏｒｍ Ｈ種結晶と溶媒系に加えるエプレレノン出発原料との重量比は、一般的に少なくとも約０．７５：１００、好ましくは約０．７５：１００〜１：２０、より好ましくは約１：１００〜約１：５０である。Ｆｏｒｍ Ｈ種結晶は、Ｆｏｒｍ Ｈ結晶の調製、特に、下記のような温浸によるＦｏｒｍ Ｈ結晶の調製について本願書において述べる方法のいずれかにより調製することができる。
Ｆｏｒｍ Ｈ種結晶は、１回で、複数回に分けて、またはある時間にわたり実質的に連続的に加えることができる。しかし、Ｆｏｒｍ Ｈ種結晶の添加は、一般的に、エプレレノンが溶液から晶出し始める前に完了させる。すなわち、シード添加は曇点（準安定域の下限）に達する前に完了させる。シード添加は、一般的に溶液の温度範囲が曇点より約０．５℃〜１０℃高い温度範囲、好ましくは、曇点より約２℃〜３℃高い温度範囲にあるときに実施する。種を加える曇点より上の温度が高くなるにつれて、Ｆｏｒｍ Ｈ結晶の結晶化に必要なシード添加の量は一般的に増加する。
シード添加は、曇点より上の温度においてだけでなく、準安定域内でも行うことも好ましい。曇点および準安定域は、エプレレノンの溶解度および溶媒または溶媒の混合物中の濃度に依存する。例えば、メチルエチルケトンの１２倍希釈の場合には、準安定域の上限は一般的に約７０℃〜約７３℃であり、準安定域の下限（すなわち、曇点）は約５７℃〜６３℃である。８倍濃度のメチルエチルケトンの場合には、溶液は過飽和であるで、準安定域はより狭い。この濃度では、溶液の曇点は約７５℃〜７６℃である。メチルエチルケトンの沸点は周囲条件では約８０℃であるため、この溶液のシード添加は一般的に約７６．５℃から沸点までの範囲で行う。
Ｆｏｒｍ Ｈに関するシード添加の実例としての非限定的な例は、下の実施例Ｃ−７に示す。
Ｆｏｒｍ Ｈ成長促進物質またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害物質および／またはＦｏｒｍ Ｈシード添加を用いて得られる結晶化エプレレノン生成物は、一般的に少なくとも２％のＦｏｒｍ Ｈを、好ましくは少なくとも５％のＦｏｒｍ Ｈを、より好ましくは少なくとも７％のＦｏｒｍ Ｈを、さらにより好ましくは少なくとも約１０％のＦｏｒｍ Ｈを含む。残りの結晶化エプレレノン生成物は、一般的にＦｏｒｍ Ｌである。
エプレレノンの粉砕により調製されたＦｏｒｍ Ｈ
他の代替法において、エプレレノンを適切に粉砕することにより少量のＦｏｒｍ Ｈを調製することができることが発見された。粉砕エプレレノン中のＦｏｒｍ Ｈの濃度は約３％と高いことが認められた。
４．低純度エプレレノンから調製された溶媒和物からのＦｏｒｍ Ｌの調製
上述のように、低純度エプレレノンを結晶化して溶媒和物を生成させた後、溶媒和物を脱溶媒和することにより、Ｆｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌを含む生成物が一般的に得られる。より大きいＦｏｒｍ Ｌ含量を有する生成物は、純相Ｆｏｒｍ Ｌ結晶を含む溶媒系をシード添加することにより、またはＦｏｒｍ Ｌ成長促進物質および／またはＦｏｒｍ Ｈ成長阻害物質を用いて、Ｆｏｒｍ Ｈの調製について上述したのと実質的に同じ方法で低純度エプレレノンから調製することができる。シード添加プロトコール、および溶媒系に加えるＦｏｒｍ Ｌ種結晶の量と溶媒系に加えるエプレレノン出発原料の量の重量比は、一般的に、純相Ｆｏｒｍ Ｈ結晶のシード添加によるＦｏｒｍ Ｈエプレレノンの調製について以前に上で述べた比と同様である。
この方法で調製される結晶化エプレレノン生成物は、一般的に少なくとも１０％のＦｏｒｍ Ｌを、好ましくは少なくとも５０％のＦｏｒｍ Ｌを、より好ましくは少なくとも７５％のＦｏｒｍ Ｌを、より好ましくは少なくとも９０％のＦｏｒｍ Ｌを、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のＦｏｒｍ Ｌを、さらにより好ましくは実質的に純相のＦｏｒｍ Ｌを含む。
この項およびＦｏｒｍ Ｈの調製に関する前の項で述べたシード添加プロトコールは、結晶化エプレレノンの粒径の制御の改善も可能にするものである。
５．溶液からの直接的なＦｏｒｍ Ｌの結晶化
Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンは、中間溶媒和物の生成と付随する脱溶媒和を必要とせずに、適切な溶媒または溶媒の混合物からのエプレレノンの直接結晶化によっても調製することができる。一般的に、（ｉ）溶媒は溶媒和物結晶格子中の利用可能なチャンネル空間に不適合な分子サイズを有し、（ｉｉ）エプレレノンおよびすべての不純物は高温度で溶媒に溶け、（ｉｉｉ）冷却するとき、非溶媒和Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンの結晶化がもたらされる。溶媒または溶媒の混合物中のエプレレノンの溶解度は、一般的に、室温で約５〜約２００ｍｇ／ｍＬである。溶媒または溶媒の混合物は、メタノール酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、ニトロベンゼン、水およぴエチルベンゼンからなる群から選択される１つまたは複数の溶媒を含むことが好ましい。
Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンを溶液から直接結晶化させるために、一定量のエプレレノン出発原料を一定容積の溶媒に溶解し、結晶が生成するまで冷却する。エプレレノンを溶媒に加える溶媒温度は、一般的に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、この溶媒温度は一般的に少なくとも約２５℃で、好ましくは、約３０℃から溶媒の沸点まで、より好ましくは溶媒の沸点の約２５℃下から溶媒の沸点までである。
あるいは、熱溶媒をエプレレノンに加え、結晶が生成するまで混合物を冷却することができる。エプレレノンに加えるときの溶媒の温度は、一般的に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、この溶媒温度は一般的に少なくとも２５℃で、好ましくは、約５０℃から溶媒の沸点まで、より好ましくは溶媒の沸点の約１５℃下から溶媒の沸点までである。
所与の容積の溶媒と混合するエプレレノン出発原料の量は、同様に溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。一般的に、溶媒に加えるエプレレノンの量は室温でその容積の溶媒に完全には溶けない。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、所与の容積の溶媒と混合するエプレレノン出発原料の量は、通常、室温でその容積の溶媒に溶解するエプレレノンの量の少なくとも約１．５〜約４．０倍、好ましくは約２．０〜約３．５倍、より好ましくは約２．５倍である。
実質的に純相のＦｏｒｍ Ｌを含む生成物の調製を保証するためには、エプレレノン出発原料は一般的に高純度エプレレノンである。エプレレノン出発原料は、好ましくは少なくとも６５％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９％純粋である。
エプレレノン出発原料が完全に溶媒に溶解した後、溶液を一般的に緩やかに冷却し、溶媒和した結晶形のエプレレノンを結晶化させる。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、溶液を約１．０℃／分より遅い速度で、好ましくは約０．２℃／分またはそれより遅い速度で、より好ましくは約５℃／分〜約０．１℃／分の速度で冷却する。
Ｆｏｒｍ Ｌ結晶を収集する終点温度は、溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、終点温度は、一般的に約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、より好ましくは約−５℃未満である。
あるいは、他の技術を用いてＦｏｒｍ Ｌ結晶を調製することができる。そのような技術の例は、（ｉ）エプレレノン出発原料を１つの溶媒に溶解し、Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンの結晶化を助けるための共溶媒を加える、（ｉｉ）Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンの蒸気拡散成長、（ｉｉｉ）回転蒸発のような蒸発によるＦｏｒｍ Ｌエプレレノンの分離、および（ｉｖ）スラリー変換を含むが、これらに限定されない。
上記のように調製した溶媒和結晶形の結晶は、濾過または遠心分離のような通常の適切な手段により溶媒から分離することができる。
さらに、Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンは、メチルエチルケトン中高純度エプレレノンのスラリーを温浸し（下記のように）、スラリーの沸点で温浸済みエプレレノンを濾過して調製することもできる。
６．溶液からの直接的なＦｏｒｍ Ｈの調製
Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌの互変遷移温度（Ｔｔ）以上で結晶化を行う場合、特に、Ｆｏｒｍ Ｈ成長促進物質またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害物質が存在するか、または純相Ｆｏｒｍ Ｈ結晶を含む溶媒をシード添加する場合、Ｆｏｒｍ Ｈはこれらのより高い温度で安定性がより高いので、Ｆｏｒｍ Ｈは溶液から直接結晶化すると想定される。用いる溶媒系は、ニトロベンゼンのような高沸点溶媒を含むことが好ましい。適切なＦｏｒｍ Ｈ成長促進物質は、ジエポキシドおよび１１，１２−オレフィンを含むが、これらに限定されないであろう。
７．溶媒によるエプレレノンの温浸
エプレレノンの溶媒和した結晶形、Ｆｏｒｍ ＨおよびＦｏｒｍ Ｌは、適切な溶媒または溶媒の混合物中でのエプレレノン出発原料の温浸によっても調製すことができる。温浸過程において、エプレレノンのスラリーを溶媒または溶媒の混合物の沸点で加熱する。例えば、一定の量のエプレレノン出発原料を一定の容積の溶媒または溶媒の混合物と合わせ、加熱して還流させ、留出物を除去し、留出物の除去と同時に追加量の溶媒を加える。あるいは、温浸処理中に留出物を凝縮させ、さらなる溶媒を加えずに再循環することができる。一般的に、最初の容積の溶媒を除去し、または凝縮させて、再循環させた後に、スラリーを冷却すると、溶媒和した結晶が生成する。溶媒和した結晶は、濾過または遠心分離のような通常の適切な手段により溶媒から分離することができる。前述のように溶媒和物の脱溶媒和により、溶媒和結晶における選択される不純物の存在また非存在によってＦｏｒｍ ＨエプレレノンまたはＦｏｒｍ Ｌエプレレノンが得られる。適切な溶媒または溶媒の混合物は、一般的に本明細書に先に開示した１つまたは複数の溶媒を含む。溶媒は、例えば、メチルエチルケトンおよびエタノールからなる群から選択することができる。
温浸処理に用いる溶媒に加えるエプレレノン出発原料の量は、一般的に溶媒または溶媒の混合物の沸点でスラリーを維持するのに十分なものである（すなわち、溶媒または溶媒の混合物中のエプレレノンは完全には可溶化されない）。実例としての値は、４ｍＬのメチルエチルケトン当たりエプレレノン約１ｇおよび８ｍＬのエタノール当たりエプレレノン約１ｇを含むが、これらに限定されない。
溶媒ターンオーバーが完了したならば、溶液を一般的に徐々に冷却して、溶媒和した結晶形のエプレレノンを結晶化させる。例えば、試験した溶媒の場合、溶液を約２０℃／分より遅い速度で、好ましくは約１０℃／分またはそれより遅い速度で、より好ましくは約５℃／分またはそれより遅い速度で、さらにより好ましくは約１℃／分またはそれより遅い速度で冷却する。
溶媒和結晶形を収集する終点温度は、溶媒または溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載するほとんどの溶媒については、終点温度は、一般的に約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、より好ましくは約−５℃未満である。
主としてまたはもっぱらＦｏｒｍ Ｌを含む生成物が望ましい場合、高純度のエプレレノン出発原料を一般的に温浸する。高純度のエプレレノン出発原料は、好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９．５％純粋である。この方法で調製される温浸済みエプレレノン生成物は、一般的に少なくとも１０％のＦｏｒｍ Ｌを、好ましくは少なくとも５０％のＦｏｒｍ Ｌを、より好ましくは少なくとも７５％のＦｏｒｍ Ｌを、より好ましくは少なくとも９０％のＦｏｒｍ Ｌを、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のＦｏｒｍ Ｌを、さらにより好ましくは実質的に純相のＦｏｒｍ Ｌを含む。
主としてまたはもっぱらＦｏｒｍ Ｈを含む生成物が望ましい場合、低純度のエプレレノン出発原料を一般的に温浸する。低純度のエプレレノン出発原料は、一般的に、Ｆｏｒｍ Ｈを得るのに必要な程度のＦｏｒｍ Ｈ成長促進物質および／またはＦｏｒｍ Ｌ成長阻害物質を含む。好ましくは低純度のエプレレノン出発原料は、少なくとも６５％純粋、より好ましくは少なくとも７５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋である。この方法で調製される温浸済みエプレレノン生成物は、一般的に少なくとも１０％のＦｏｒｍ Ｈを、好ましくは少なくとも５０％のＦｏｒｍ Ｈを、より好ましくは少なくとも７５％のＦｏｒｍ Ｈを、より好ましくは少なくとも９０％のＦｏｒｍ Ｈを、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のＦｏｒｍ Ｈを、さらにより好ましくは実質的に純相のＦｏｒｍ Ｈを含む。
８．無定形エプレレノンの調製
無定形エプレレノンは、破砕、粉砕および／または微粉化のような固体エプレレノンの適切な粉砕により少量調製することができる。純相の無定形エプレレノンは、例えば、エプレレノンの溶液、特に、エプレレノンの水溶液を凍結乾燥することにより調製することができる。これらの方法は、下の実施例Ｃ−１３およびＣ−１８に例示する。
用量および投与計画
本発明の方法における投与するアルドステロン拮抗薬の量と投与計画は、対象の年齢、体重、性別および医学的状態、病原性効果の重症度、投与経路および頻度ならびに用いる個々のアルドステロン拮抗薬を含む様々な因子に依存し、したがって、広く変化する可能性がある。対象への１日投与量は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは約０．００５〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重が適切であると思われる。ヒト対象に投与するアルドステロン拮抗薬の量は、一般的に約０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは約０．５〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約０．７５〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１〜１００ｍｇである。対象における実質的な利尿および／または抗高血圧効果をもたらさないアルドステロン拮抗薬の１日用量を、本発明の方法で特に採用する。１日用量は、１日１回から４回投与することができる。
アルドステロン拮抗薬の投与は、血圧または適切な代用マーカー（ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリンおよび下記の他の代用マーカーなど）の測定に基づいて決定し、調節することができる。アルドステロン拮抗薬の投与後の血圧および／または代用マーカーレベルをアルドステロン拮抗薬の投与前の対応する基準レベルに対して比較して、本発明の方法の有効性を判定し、必要に応じて調節することができる。この方法において有用な主要な代用マーカーは、腎および心血管疾患の代用マーカーである。
一般的に、高レベルの細胞内ナトリウムを有する対象（特に、食塩感受性および／または高ナトリウム摂取量を有するヒト対象）におけるアルドステロンの病原性の程度および本発明にしたがったエポキシステロイド化合物の適切な投与法の決定は、最初は既存の病状の存在に依存する。したがって、対象は、最初に高血圧、微小血管機能不全および微小血管機能不全に関連する病状について評価する。そのような病状としては、腎臓および心臓の病状、神経障害および網膜症などを挙げることができる。
予防的投与
特に、対象が高いナトリウムレベルの存在下でアルドステロンによって媒介される１つまたは複数の病原性効果を受けやすい場合に、前記の病原性効果の診断の前にアルドステロン拮抗薬を予防的に投与し、対象が病原性効果を受けやすい期間中にアルドステロン拮抗薬の投与を継続することは有用である。注目すべき臨床症状を有さないが、それにもかかわらず病原性効果を受けやすい対象は、したがって、予防投与量のエポキシステロイド化合物の投与を継続することができる。アルドステロン拮抗薬のそのような予防投与量は、問題の特定の病原性効果を治療するために用いる用量よりも低くしてもよいが、低くする必要はない。
高血圧投与
食塩感受性および／または高ナトリウム摂取量を有するヒト対象の高血圧症の治療のために、対象を最初に血圧測定（座位カフ水銀血圧計）に基づいて正常血圧者、境界域高血圧患者または高血圧患者と特定する。例えば、収縮期血圧および拡張期血圧がそれぞれ１２５ｍｍＨｇより低く、８０ｍｍＨｇより低い場合には対象は正常血圧者、収縮期血圧および拡張期血圧がそれぞれ約１２５〜１４０ｍｍＨｇおよび８０〜９０ｍｍＨｇの範囲にある場合には境界域高血圧患者、収縮期血圧および拡張期血圧がそれぞれ１４０ｍｍＨｇおよび９０ｍｍＨｇより高い場合には高血圧患者とみなすことができる。高血圧状態の重症度が増加するにつれて、投与するエポキシステロイド化合物の用量を増加させる。投与後血圧測定に基づいて、投与するエポキシステロイド化合物の用量を調節する。治療に対する個人の反応の最初の評価後に、所望の血圧降下作用を達成するために、それに応じて用量を増減させることができる。
例えば、収縮期血圧をモニタリングすることによって適切な投与法を決定することができる。図１０に示すように、エプレレノンの用量を増加させることにより、収縮期血圧が降下する。したがって、対象は、同時にカリウムの血清レベルも正常範囲内に維持しながら、最小レベルの収縮期血圧の降下が達成されるまで、本発明による１つまたは複数のエポキシステロイド化合物をその用量を段階的に増加させて投与することにより治療することができる。
同様に、拡張期血圧をモニタリングすることによっても適切な投与法を決定することができる。図１１に示すように、エプレレノンの用量を増加させることにより、拡張期血圧が降下する。したがって、対象は、同時にカリウムの血清レベルも正常範囲内に維持しながら、最小レベルの拡張期血圧の降下が達成されるまで、本発明による１つまたは複数のエポキシステロイド化合物をその用量を段階的に増加させて投与することにより治療することができる。
心血管病状投与
ナトリウム利尿ペプチドの血中濃度の測定に基づいて、心血管機能の病状を治療するための投与を決定し、調節することができる。ナトリウム利尿ペプチドは、心血管、腎臓および内分泌の恒常性における多様な作用を有する構造的には類似であるが、遺伝的には異なるペプチドの群である。心房性ナトリウム利尿ペプチド（「ＡＮＰ」）および脳ナトリウム利尿ペプチド（「ＢＮＰ」）は、心筋細胞に由来するものであり、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（「ＣＮＰ」）は内皮に由来するものである。ＡＮＰとＢＮＰは、３’，５’−サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を介してナトリウム利尿、血管拡張、レニン阻害、抗有糸分裂誘発および変弛緩特性を媒介するナトリウム利尿ペプチドＡ受容体（「ＮＰＲ−Ａ」）に結合する。血中利尿ペプチド濃度、特に血中ＢＮＰ濃度の上昇が一般的に血液量膨張および急性心筋梗塞のような血管障害後の状態にある対象に認められ、梗塞後長期間にわたり高値に留まる（Ｕｕｓｉｍａａ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９年、第６９巻、５〜１４頁）。
アルドステロン拮抗薬の投与前に測定した基準と比べてナトリウム利尿ペプチドレベルが減少することは、アルドステロンの病原性効果の低減を意味するものであり、したがって、その病原性効果の阻害と相関していることがわかる。したがって、所望のナトリウム利尿ペプチドのレベルの血中濃度をアルドステロン拮抗薬の投与前の対応する基準値と比較して、病原性効果の治療における本発明の方法の有効性を判定することができる。そのようなナトリウム利尿ペプチドのレベルの測定に基づいて、心血管病原性効果を低減するようにアルドステロン拮抗薬の投与を調節することができる。
同様に、循環および尿中ｃＧＭＰレベルに基づいて、心臓の病状も確認し、適切な投与を決定することができる。ｃＧＭＰの血漿中濃度の上昇は、平均動脈圧の降下に対応する。ｃＧＭＰの尿中排泄の増加は、ナトリウム利尿と相関する。
心臓の病状は、駆出率の低下または心筋梗塞の存在または心不全または左室肥大によっても確認することができる。左室肥大は、心エコー検査または磁気共鳴画像法により確認することができ、治療の経過および投与の妥当性をモニターするのに用いることができる。
本発明の他の実施形態において、したがって、本発明の方法を用いてナトリウム利尿ペプチドレベル、特にＢＮＰレベルを低減させ、それにより関連する心血管の病状も治療することができる。
腎病状投与
蛋白尿、ミクロアルブミン尿の測定、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の低下またはクレアチニンクリアランスの低下に基づいて、腎機能の病状を治療するための投与を決定し、調節することができる。蛋白尿は、２４時間蓄尿中の０．３ｇを超える尿蛋白の存在によって確認される。ミクロアルブミン尿は、イムノアッセイで検出可能な尿中アルブミンの増加によって確認される。そのような測定に基づいて、アルドステロン拮抗薬の投与を調節して、腎における病原性効果を低減させることができる。
神経障害病状投与
神経障害、特に、末梢神経障害は、感覚欠損または感覚運動能力の神経学的検査に基づいて確認し、投与を調節することができる。
網膜症病状投与
網膜症は、眼科学的検査に基づいて確認し、投与を調節することができる。
血漿中レニンまたは血清中アルドステロン濃度に基づく投与
一般的に、本発明により治療する対象に最初に、最初の評価期間（すなわち、対象に１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を初回１日用量で投与する期間）中にある一定量の１つまたは複数のエポキシステロイド化合物を投与する。最初の評価期間は、約１〜４週間、好ましくは約１〜２週間の期間である。最初の評価期間の後、血液および尿試料を採取して常用の評価（すなわち、一般的に血液および尿化学検査として知られている）に供する。用量の増量に対する禁忌（例えば、高カリウム血症）が存在しない場合、必要ならば、１つまたは複数のエポキシステロイド化合物の１日用量を増量する。
適切な投与は、血漿レニン活性をモニタリングすることによっても決定することができる。図１２に示すように、エプレレノンの用量を増加させることにより、血漿レニン活性が増加する。したがって、対象は、同時にカリウムの血清レベルも正常範囲内に維持しながら、所望のレベルの血漿レニン活性が達成されるまで、本発明による１つまたは複数のエポキシステロイド化合物をその用量を段階的に増加させて投与することにより治療することができる。
適切な投与は、血清中アルドステロン濃度をモニタリングすることによっても決定することができる。図１２に示すように、エプレレノンの用量を増加させることにより、血清中アルドステロン濃度が増加する。したがって、対象は、同時にカリウムの血清レベルも正常範囲内に維持しながら、所望のレベルの血清中アルドステロン濃度が達成されるまで、本発明による１つまたは複数のエポキシステロイド化合物をその用量を段階的に増加させて投与することにより治療することができる。
薬剤組成物
投与は、経口投与、または静脈内、筋肉内もしくは皮下注射による投与のような適切な経路により行うことができる。
経口投与のために、薬剤組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁剤または液剤の形態であってよい。薬剤組成物は、特定の量の有効成分を含む用量単位の形で調製することが好ましい。そのような用量単位の例は、錠剤またはカプセル剤である。哺乳類に対する適切な１日用量は、患者の状態および他の因子によって広く異なる可能性がある。
同様に、有効成分は、例えば、食塩水、デキストロースまたは水を適切な担体として用いることいができる組成物として注射により投与することができる。製剤は、ボーラスの形、または水性もしくは非水性等張性滅菌注射液剤もしくは懸濁剤の形であってよい。これらの液剤および懸濁剤は、１つまたは複数の製薬上許容できる担体もしくは希釈剤またはゼラチンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースのような結合剤を、１つまたは複数の滑沢剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と共に有する滅菌散剤または粒剤から調製することができる。
「製薬上許容できる」という用語は、修飾される名詞が医薬品用として適切であることを意味するように本明細書で形容詞的に用いる。製薬上許容できる陽イオンは、金属イオンおよび有機イオンなどである。より好ましい金属イオンは、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理的に許容できる金属イオンを含むが、これらに限定されない。具体例としてのイオンは、通常の原子化のアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛などである。好ましい有機イオンは、一部、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインを含むプロトン化第三級アミンおよび第四級アンモニウム陽イオンなどである。具体例としての製薬上許容できる酸は、制限なしに、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸等である。
治療の目的のために、本発明の活性化合物は通常、指定される投与経路に適した１つまたは複数の補助剤と配合する。経口投与する場合、化合物を乳糖、ショ糖、デンプン粉末、アルカン酸のセルロールエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合し、次いで、投与の簡便のために錠剤にするか、カプセルに封入する。そのようなカプセルまたは錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散により実現できるような放出制御製剤を含んでいてよい。非経口投与用の製剤は、水性または非水性等張性滅菌注射液剤または懸濁剤の形であってよい。これらの液剤または懸濁剤は、経口投与用の製剤における使用について述べた１つまたは複数の担体または希釈剤を有する滅菌散剤または粒剤から調製することができる。成分は、水、ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油，ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウムおよび／または種々の緩衝剤に溶解させることができる。他の補助剤および投与方法は、製薬技術分野で十分かつ広く知られている。
併用療法
本発明の方法はさらに、エポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の投与と併用する他の有効成分の投与または療法を含む。
例えば、本発明の方法に用いるアルドステロン拮抗薬は、高血圧症ならびに心血管および腎状態および障害の治療に用いられる他の活性薬物と併用して対象に投与することができる。アルドステロン拮抗薬とともに投与する活性薬物は、例えば、レニン阻害薬、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬、ＡＣＥ阻害薬、実質的なアルドステロン拮抗作用を有さない利尿薬およびレチノイン酸からなる群から選択される薬剤などでよい。「併用療法」（または「共同療法」）という句は、薬剤の併用に関して用いる場合、薬剤の併用の有用な効果をもたらす投与方法で逐次的に各薬剤を投与することを含むことを意味し、また、一定の比率のこれらの活性薬剤を含む単一カプセルまたは注射剤、あるいは各薬剤の複数の別個のカプセルまたは注射剤などを用いて、これらの薬剤を実質的に同時に併用投与することを含むことも意味する。
「アンジオテンシンＩＩ拮抗薬」は、例えば、国際出願公開第９６／４０２５７号に記載されているアンジオテンシンＩＩ拮抗薬を含む。
「アンジオテンシン変換酵素」（「ＡＣＥ阻害薬」）は、アンジオテンシンのデカペプチド形（「アンジオテンシンＩ」）のアンジオテンシンの血管収縮性オクタペプチド形（「アンジオテンシンＩＩ」）への酵素変換を部分的または完全に遮断する能力を有する薬剤もしくは化合物、または２つ以上の薬剤もしくは化合物の組合せを含む。アンジオテンシンＩＩの生成の遮断は、アンジオテンシンＩＩの主要な作用を除去することにより、体液および電解質バランス、血圧および血液量の調節に影響を与える可能性がある。これらのアンジオテンシンＩＩの主要な作用としては、副腎皮質によるアルドステロン受容体の合成および分泌の刺激ならびに細動脈平滑筋の直接的収縮による血圧の上昇などがある。
併用療法に用いることができるＡＣＥ阻害薬の例は、以下の化合物を含むが、これらに限定されない。すなわち、ＡＢ−１０３、アンコベニン、ベナゼプリラート、ＢＲＬ−３６３７８、ＢＷ−Ａ５７５Ｃ、ＣＧＳ−１３９２８Ｃ、ＣＬ−２４２８１７、ＣＶ−５９７５、Ｅｑｕａｔｅｎ、ＥＵ−４８６５、ＥＵ−４８６７、ＥＵ−５４７６、ホロキシミチン、ＦＰＬ６６５６４、ＦＲ−９００４５６、Ｈｏｅ−０６５、Ｉ５Ｂ２、インドラプリル、ケトメチル尿素、ＫＲＩ−１１７７、ＫＲＩ−１２３０、Ｌ−６８１１７６、リベンザプリル、ＭＣＤ、ＭＤＬ−２７０８８、ＭＤＬ−２７４６７Ａ、モベルチプリル、ＭＳ−４１、ニコチアナミン、ペントプリル、フェナセイン、ピボプリル、レンチアプリル、ＲＧ−５９７５、ＲＧ−６１３４、ＲＧ−６２０７、ＲＧＨ−０３９９、ＲＯＯ−９１１、ＲＳ−１００８５−１９７、ＲＳ−２０３９、ＲＳ５１３９、ＲＳ８６１２７、ＲＵ−４４４０３、Ｓ−８３０８、ＳＡ−２９１、スピラプリラート、ＳＱ−２６９００、ＳＱ−２８０８４、ＳＱ−２８３７０、ＳＱ−２８９４０、ＳＱ−３１４４０、Ｓｙｎｅｃｏｒ、ウチバプリル、ＷＦ−１０１２９、Ｗｙ−４４２２１、Ｗｙ−４４６５５、Ｙ−２３７８５、Ｙｉｓｓｕｍ Ｐ−０１５４、ザビシプリル、Ａｓａｈｉ Ｂｒｅｗｅｒｙ ＡＢ−４７、アラトリオプリル、ＢＭＳ１８２６５７、Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ−１１１、Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ−１１２、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ ＤＵ−１７７７、ミクサンプリル、Ｐｒｅｎｔｙｌ、ゾフェノプリラート、１−（−（１−カルボキシ−６−（４−ピペリジニル）ヘキシル）アミノ）−１−オキソプロピルオクタヒドロ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、Ｂｉｏｐｒｏｊｅｃｔ ＢＰ１．１３７、Ｃｈｉｅｓｉ ＣＨＦ１５１４、Ｆｉｓｏｎｓ ＦＰＬ−６６５６４、イドラプリル、Ｍａｒｉｏｎ Ｍｅｒｒｅｌｌ Ｄｏｗ ＭＤＬ−１００２４０、ペリンドプリラートおよびＳｅｒｖｉｅｒ Ｓ−５５９０、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、ホシノプリラート、イミダプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、酢酸サララシン、テモカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、モエキシプリル、キナプリラートおよびスピラプリル。
特に興味深いＡＣＥ阻害薬の群は、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、ホシノプリラート、イミダプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、酢酸サララシン、テモカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、モエキシプリル、キナプリラートおよびスピラプリルからなっている。
これらのＡＣＥ阻害薬の多くは市販されている。例えば、非常に好ましいＡＣＥ阻害薬であるカプトプリルは、錠剤当たり１２．５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量の錠剤剤形の「ＣＡＰＯＴＥＮ」という商標で、現在はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂの一部であるＥ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州プリンストン）により販売されている。エナラプリルまたはマレイン酸エナラプリルおよびリシノプリルは、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．（ペンシルベニア州ウェストポイント）により販売されている２つのより高度に好ましいＡＣＥ阻害薬である。エナラプリルは、錠剤当たり２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇおよび２０ｍｇの用量の錠剤として「ＶＡＳＯＴＥＣ」という商標のもとに販売されている。リシノプリルは、錠剤当たり５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇおよび４０ｍｇの用量の錠剤として「ＰＲＩＮＩＶＩＬ」という商標のもとに販売されている。
利尿薬は、チアジド系および関連スルホンアミド、カリウム保持性利尿薬、ループ利尿薬および有機水銀利尿薬のようないくつかの既知のクラスから選択することができる。チアジド系の非限定的な例は、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、シクロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ポリチアジドおよびトリクロルメチアジドである。チアジド系に関連するスルホンアミドの非限定的な例は、クロルタリドン、キネタゾンおよびメトラゾンである。カリウム保持性利尿薬の非限定的な例は、トリアメテレンおよびアミドライドである。ループ利尿薬、すなわち、腎のヘンレ係蹄の上行脚に作用する利尿薬の非限定的な例は、フロセミドおよびエチンアクリル酸である。有機水銀系利尿薬の非限定的な例は、メルカプトメリンナトリウム、メレトキシリン、プロカインおよびテオフィリンを添加したマーサリルである。
一実施形態において、併用療法は、食塩感受性および／または高ナトリウム摂取量を有するヒト対象へＡＣＥ阻害薬、アルドステロン受容体拮抗薬であるエポキシステロイド化合物および実質的なアルドステロン拮抗活性を有しないループ利尿薬を投与することを含み、ＡＣＥ阻害薬、エポキシステロイド化合物およびループ利尿薬を併用により以下の１つまたは複数をもたらす用量で投与する。すなわち、（１）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して死亡率の統計的に有意な低下、（２）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して非致命的入院の件数の統計的に有意な低下、（３）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して死亡率または非致命的入院の件数の統計的に有意な低下、（４）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して心拍数変動性の増加に苦しむまたはそれを発現しやすい対象の突然死に起因する死亡率の統計的に有意な低下、（５）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して心不全の進行に起因する死亡による死亡率の統計的に有意な低下、（６）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して約２６％より大きい左室駆出率を有する対象における死亡率または非致命的入院の件数の統計的に有意な低下、（７）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して約２６％より小さい左室駆出率を有する対象における死亡率または非致命的入院の件数の統計的に有意な低下、および／または（８）エポキシステロイド化合物を含まない前記併用療法と比較して対象における肺動脈線維症の増加または肺血圧のレベルの上昇に起因する臨床的に意味のある咳の抑制。好ましくは、併用療法を受ける対象は、（１）突然死しやすく、（２）併用療法の前にニューヨーク心臓協会クラスＩＩＩまたはクラスＩＶと分類され、（３）約２６％より大きい左室駆出率を有し、かつ／または（４）肺動脈線維症の増加または肺血圧の低いレベルに起因する臨床的に意味のある咳を発現しやすいまたは罹患している。
そのような併用療法は、例えば、食塩感受性および／または高ナトリウム摂取量を有する対象における死亡率または非致命的入院の件数を低減、または本態性高血圧症または心筋梗塞後の心臓の状態により一般的に発生する心不全の発現を予防または遅延させるのに有用であると思われる。実質的なアルドステロン拮抗活性を有さない利尿薬もＡＣＥ阻害薬およびエポキシステロイド化合物とともに用いることができる。
あるいは、併用療法は、食塩感受性および／または高ナトリウム摂取量を有するヒト対象への治療上有効な量のＡＣＥ阻害薬、治療上有効な量のエポキシステロイド化合物、治療上有効な量の実質的なアルドステロン拮抗活性を有さないループ利尿薬および治療上有効な量のジゴキシンの投与を含んでいてよい。
以下の実施例は、本発明の方法の詳細な記述を含む。この詳細な記述は、本発明の範囲内に入り、また本発明を例示する役割を果たしている。この詳細な記述は、例示のために示したものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。各実施例で用いたエプレレノン出発原料は、主としてＦｏｒｍ Ｌ多形を、また約１０％未満のＦｏｒｍ Ｈ多形を含み、または含んでいた。ほとんどの実施例において、用いたエプレレノン原料は、検出可能な量のＦｏｒｍ Ｈ多形を含んでおらず、または含んでいなかった（すなわち、Ｆｏｒｍ Ｈ多形は約３％未満）。
Ａ．生物学的実施例
実施例Ａ−１．心筋梗塞および腎動脈症を血圧とは無関係に阻止するためのエプレレノンの使用
エプレレノンが心臓におけるアルドステロン／食塩媒介性初期心血管障害を予防することを実証するために、ラットにおける血圧上昇、中等度の高食塩摂取量、ＲＡＡＳの活性化および酸化窒素酸性の抑制を合わせた実験モデルを用いた。このモデルは、１％ＮａＣｌを飲ませたラットにおける１４日間にわたるＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（「Ｌ−ＮＡＭＥ」）による酸化窒素合成の慢性阻害と１１〜１４日目におけるアンジオテンシンＩＩの３日間の注入を必要とした。この実験では、心臓および腎臓に対する鉱質コルチコイドの初期の病理学的作用を、心臓障害の１４日間Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌモデルにおける切除／アルドステロンによる置換実験により検討した。特に、副腎摘出術または選択的アルドステロン受容体遮断薬であるエプレレノンによる薬理学的拮抗作用による鉱質コルチコイドの低減がこのモデルにおける心および腎障害を予防するのかどうか、また副腎摘出ラットにおけるアルドステロン置換が障害を回復させるのかどうかを試験した。さらに、どのようなタイプの心臓障害がＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与によって誘発されるかを検討し、これらの変化を腎臓において起こったものと比較した。
動物 体重が２００〜２２５ｇで、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手した雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝４４）をこの試験に用いた。すべての動物を１日１２時間照明し、周囲温度が２２±１℃の室内に収容した。動物は、搬入後１週間回復させ、実験開始までＰｕｒｉｎａ Ｌａｂ Ｃｈｏｗ ５００１飼料（Ｒａｌｓｔｏｎ Ｐｕｒｉｎａ Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）および水道水を自由に摂取させた。プロトコールの開始後、すべての群の動物を個別代謝ケージにいれ、１日１回手を触れ、体重を測定した。２４時間液体摂取量、飼料摂取量および尿排出量を毎日測定した。収縮期血圧をＬ−ＮＡＭＥ投与の開始３日前と１、５、８および１３日目に測定した。Ｌ−ＮＡＭＥ投与１４日目に、動物を断頭し、体幹の血液をエチレンジアミン四酢酸を含む試験管に採取し、心臓と腎臓を摘出し、体液を吸い取って乾燥し、ただちに重量を測定した。心臓と腎臓を１０％リン酸緩衝ホルマリンに保存し、光学顕微鏡評価のために後に処理した。
薬剤 エプレレノンは、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ミズーリ州セントルイス）により供給され、０．５％メチルセルロースに溶解し、１日２回強制胃管投与した。デキサメタゾンは、ゴマ油に溶解し、毎日１回皮下投与した（１２μｇ／ｋｇ／日）。この用量のデキサメタゾンは、副腎摘出ラットにおける正常な体重増加、糸球体濾過率ならびに空腹時血漿ブドウ糖およびインスリン濃度を維持すると報告された（Ｓｔａｎｔｏｎ Ｂ．、Ｇｉｅｂｉｓｃｈ Ｇ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８５年、第７５巻、１３１７〜１３２６頁）。実験は、Ｌ−ＮＡＭＥ投与の１４日目に行った。アンジオテンシンＩＩおよびアルドステロンは、イソフルオレンで麻酔した動物の頚頂部の皮下に埋め込んだＡｌｚｅｔ浸透ミニポンプ（それぞれＭｏｄｅｌ２００１および２００２、Ａｌｚａ Ｃｏ．、カリフォルニア州パロアルト）により投与した。ポンプに満たすために用いたアンジオテンシンＩＩおよびアルドステロンの濃度は、製造業者により供給された平均ポンプ速度、ポンプの埋め込みの前日の動物の体重および計画された用量に基づいて計算した。アンジオテンシンＩＩ（ヒト、ペプチド純度９９％）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）から購入し、以前に報告したように（Ｈｏｕ Ｊ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９５年、第９６巻、２４６９〜２４７７頁）、２２５μｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。アルドステロンの用量（４０μｇ／ｋｇ／日）は、アルドステロン誘発性心血管障害の試験に以前に用いた用量より約５０％低い。この低い用量は、脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおける病変を誘発した（Ｒｏｃｈａ Ｒ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９９年、第３３巻、２３２〜２３７頁）。デキサメタゾン、アルドステロンおよびＬ−ＮＡＭＥは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から購入した。飲料水中のＬ−ＮＡＭＥの濃度は、ラットの毎日の液体摂取量と体重に基づいて４０ｍｇ／ｋｇ／日の用量が得られるように毎日調節した。
手術の手順 Ｌ−ＮＡＭＥの投与の開始３日前に群４および５のラットをペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ、６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。両側副腎摘出術は、腰背アプローチを用い、各側について別個の切開を行って実施した。副腎摘出ラットに、手術後に１％ＮａＣｌを自由に飲ませた。手術後に死亡は発生しなかった。
検定および分析 収縮期血圧は、Ｎａｔｓｕｍｅ ＫＮ−２１０マノメータおよびタコメータ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ベルモント）を用いてテイルカフ（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ）容積変動記録法により覚醒動物において測定した。ラットは、血圧測定の前に３７℃で１０分間加温し、Ｌｕｃｉｔｅチャンバー内で鎮静させた。尿蛋白濃度は、スルホサリチル酸濁度法を用いて実験最終日に採取した尿について測定した。尿中蛋白排泄は、尿中濃度と２４時間尿排出量との積として計算した。血漿中アルドステロン濃度は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．（カリフォルニア州ロスアンジェルス）から入手した標準ラジオイムノアッセイキットを用いて測定した。血漿レニン活性（「ＰＲＡ」）は、発生したアンジオテンシンＩのラジオイムノアッセイ検出（ＤｉａＳｏｒｉｎ Ｉｎｃ．、ミネソタ州スティルウォーター）により測定した。
組織検査 心臓を他の文献（Ｙｏｕｎｇ Ｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９５年、第２６９巻、Ｅ６５７〜Ｅ６６２頁）に報告されているように線維症の判定のためにコラーゲン特異色素Ｓｉｒｉｕｓレッドで染色した。間質コラーゲンを自動画像解析装置を用いて測定した。心臓はまた、光学顕微鏡分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各動物の右心室と左心室を含む心臓の異なる部位の２または３枚の切片を分析した。０〜４のスケールを用いて心筋損傷の程度を採点した。０は損傷なしを表す。評点１は、核凝縮または核溶解、非収縮性辺縁波状線維ならびに散在性好中球浸潤を伴う細胞質の好酸性染色のような初期壊死性変化を示す心筋細胞の存在を表す。評点２は、１つの明らかな壊死の部位（著しい好中球浸潤を伴う心筋細胞の消失）が認められる場合に割り当てた。２つ以上の別個の壊死の部位が認められた（同じ心臓における２箇所の心筋梗塞の存在を意味する）が、これらの部位は限局性であり、心室壁の５０％未満が障害されている場合、心臓に評点３を割り当てた。左室または右室のいずれかの５０％以上に障害を与える広範な壊死の部位を示した心臓には評点４を割り当てた。
腎臓の冠状断面を３〜４ｍｍに切り出し、これらのうちの少なくとも３〜４個をパラフィン包埋ブロックとして調製した。組織学的切片（２〜３μｍ）を過ヨウ素酸−シッフ試薬で染色し、種々の実験プロトコールを知らされていなかった病理学者が１０倍および４０倍の光学顕微鏡により検査した。糸球体損傷は、存在した場合、虚血性または血栓性変化に伴う部分的または全体的梗塞の存在として特徴付けを行った。腎動脈および細動脈損傷は、血管壁のフィブリノイド壊死の存在として分類した。損傷を示した腎動脈および細動脈プロファイルを数え、検査した組織の量について標準化するために、切片当たりの損傷血管の数を同じ切片における糸球体の数で割った。腎血管病変は、糸球体１００個当たりの損傷血管数として表した。
統計解析 コルモゴロフ−スミルノフ検定を用いてデータの正規性を検定した。収縮期血圧は、時間および投与群について反復測定分散分析を用いて解析した。１つのグループ分け変数を有する正規分布データについては、一元配置分散分析を用いた。事後解析は、Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ多重対照検定を用いて行った。正規分布していなかったデータは、クラスカル−ウォリス検定を用いて解析した。その後、選択した対比較を精密なウィルコクソン検定を用いて行った。データは、正規分布データについては平均値±ＳＥとして、正規分布していなかったデータについては中央値と上および下四分位数として報告した。
投与プロトコール １％ＮａＣｌを飲ませたＷｉｓｔａｒラットを以下の投与プロトコールの１つに割付けた。（１）対照として用いたラットに対する１％ＮａＣｌのみ（ＮａＣｌ、ｎ＝８）、（２）Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ：１４日間にわたる飲用溶液に混入したＬ−ＮＡＭＥ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与（ｎ＝８）。Ｌ−ＮＡＭＥ投与の１１日目に、アンジオテンシンＩＩ（０．２２５？ｇ／ｋｇ／日）を含む浸透ミニポンプを各動物の皮下に埋め込んだ。（３）Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ＋エプレレノン：Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットに、さらにエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ．、ｎ＝８）を０〜１４日目に投与した。ＮａＣｌを飲んでいたラットの別の２群について、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ投与開始３日前に副腎を摘出した。群４（Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ＋ＡＤＸ、ｎ＝１１）に手術直後から開始したデキサメタゾンによるグルココルチコイド置換を受けさせた。群５（Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ＋ＡＤＸ／ＡＬＤＯ、ｎ＝９）にＬ−ＮＡＭＥ投与と同時に０日目に開始してアルドステロンをデキサメタゾンに加えて投与した。
結果
血圧に対する効果
基準収縮期血圧はすべての群で同様であった。Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与を受けたすべての動物がＮａＣｌを飲ませた対照と比較して収縮期血圧の漸進性かつ有意な上昇を示した（Ｐ＜０．０１）。実験の終了時に認められた高血圧の程度は、エプレレノン投与または副腎摘出術の影響を認め得るほどには受けなかった（図Ａ−１）。
血漿レニン活性およびアルドステロンレベル
ＰＲＡおよび循環アルドステロンレベルに関するデータを図Ａ−２に示す。Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与は、食塩水飲対照と比較して副腎完全ラットにおけるＰＲＡを有意に低下させた。副腎を摘出したＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットで認められた最高レベルのＰＲＡは、アルドステロンの投与によって妨げられた（図Ａ−２Ａ）。Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌまたはＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ＋エプレレノンを投与した副腎完全動物で認められたＰＲＡの顕著な阻害にもかかわらず、血漿アルドステロンは食塩水飲対照と同様であった（図Ａ−２Ｂ）。予想通り、血漿アルドステロンレベルは副腎摘出ラットで検出不能なレベルに低下したのに対して、副腎を摘出し、アルドステロンを注入したラットは高いアルドステロンレベルを有していた。
心臓障害におけるアルドステロンの役割
実験の終了時に得られたデータを下の表Ａ−１Ａに要約する。体重は、副腎完全動物の３群で異なっていなかった。しかし、副腎摘出ラットの両群は、副腎完全群と比較して有意に低い体重を示した。総心臓重量と総体重との比を心臓肥大の指標として用いた。心臓肥大の指標は、ＮａＣｌ飲対照と比較してＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌを投与した動物のすべての群で高かった。エプレレノン投与および副腎摘出は、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットで認められたのと比較して心臓肥大を有意に低下させた。アルドステロンの注入は、心臓肥大指標に対する副腎摘出の影響を逆転させ、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ群と異ならないレベルまでそれを回復させた。
心臓の組織検査で、投与群間の有意差が明らかになった、Ｐ＜０．０００１（図Ａ−３およびＡ−４）。Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットは、血管損傷および心筋壊死を発現した。これらの病変の代表的な顕微鏡写真を図Ａ−３Ａに示す。心筋壊死は、筋線維の交差線条の消失、細胞質の均一化、細胞膜の消失、核濃縮と最終的に核の溶解、多形核細胞および単球を含む炎症性細胞の流入によって特徴付けられる。フィブリノイド壊死は、小冠動脈および細動脈に存在していた（示さず）。これに対して、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌの投与に反応しての心臓障害は、エプレレノンを長期投与した動物または副腎摘出術を実施した動物では著しく低減した（図Ａ−３Ｂ、Ａ−４）。これらの２群は、ＮａＣｌ飲対照で認められたのと同様なレベルの心筋壊死を示した。副腎摘出の防護効果は、アルドステロンの注入の追加によって完全に逆転した。
Ｓｉｒｉｕｓレッド（コラーゲン特異色素）による染色では、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌを投与したいずれの群においても心臓において間質コラーゲン容積率の増加は示されなかった（データは示さず）。さらに、心筋壊死の部位におけるコラーゲン沈着の増加はなかった（図Ａ−３ＡおよびＡ−３Ｃ、それぞれヘマトキシリン−エオシンおよびＳｉｒｉｕｓレッドによる隣接切片の染色）。
腎障害におけるアルドステロンの役割
２週間の期間の終了時に測定した尿中蛋白排泄量（２４時間）は、ＮａＣｌ群では正常であった（図Ａ−５）。Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌの投与は、尿中蛋白排泄量を著明に増加させた。エプレレノンの投与および副腎摘出は、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌを投与した動物における蛋白尿症の発現を予防した。これに対して、副腎摘出ラットへのアルドステロンの投与は、蛋白尿に対するＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与の効果を完全に回復させた。
腎臓の組織病理学的評価においても群間の有意差が示された、Ｐ＜０．００１（図Ａ−６および図Ａ−７）。腎動脈症はＮａＣｌ飲対照の腎臓では認められなかったが、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌを投与した動物は、主として弓状および小葉間動脈および細動脈に及ぶ重度の腎血管損傷を示した（図Ａ−６）。これらの血管は、内側の肥厚と血管周囲結合組織の増殖を伴う血管壁のフィブリノイド壊死を示した。いくつかの単独性糸球体が限局性血栓症の部位を有していた。遠位尿細管のレベルでの蛋白様円柱および近位尿細管における再吸収蛋白顆粒がＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットに頻繁に認められた。腎動脈症は、エプレレノンの投与を受けた動物で減少の傾向があった。しかし、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットと比較したこの障害の６０％の減少は、組織病理学的評点の解析では統計的に有意とはならなかった（Ｐ＝０．１）。副腎摘出は、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与によって引き起こされる腎動脈症をＮａＣｌ飲対照と有意に異なっていなかったレベルまで有意に低減させた（図Ａ−７）。心臓で認められたように、アルドステロンを副腎を摘出したＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットに注入したとき、腎臓における損傷が有意に減少した。
高ナトリウム食を与えたラットへのアンジオテンシンＩＩと酸化窒素合成の阻害物質であるＬ−ＮＡＭＥとの併用投与は、高血圧症、心臓肥大、心筋壊死、蛋白尿症および腎動脈症の発現をもたらすことがわかった。これに対して、一般的に慢性心血管障害に伴う心筋線維症の証拠はなかった。心筋壊死、蛋白尿および血管病変は、アルドステロンの存在を除去した副腎摘出術により予防された。副腎摘出術の防護効果は、副腎摘出ラットにアルドステロンを注入したとき、失われた。同様に、エプレレノンによるアルドステロンの拮抗作用は、心血管障害を低減した。したがって、エポキシステロイド化合物は、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与ラットにおける急性心血管病変の発現を予防または低減させる。
この試験から、Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ投与は高血圧症ならびに心臓および腎臓のレベルの終末器官障害の誘発に非常に有効であることがわかる。エプレレノンは、そのような作用の予防に有効である。さらに、エプレレノンは収縮期血圧を認め得るほどに変化させないので、その治療効果は、ナトリウム貯留、容積膨張および高血圧に対するその作用と無関係である。最後に、データから、エプレレノンの作用は線維症を予防しないが、小動脈および細動脈における内側のフィブリノイド壊死と続く組織壊死を低減することが示唆される。線維症は、修復過程であると思われる。
実施例Ａ−２ ラットおよびイヌにおけるアルドステロン誘発性食塩貯留の阻害に対する急性作用
方法：抗鉱質コルチコイド薬理活性をアルドステロンを投与した食塩水負荷副腎摘出ラットにおいて検討した。アルドステロンの注入の３０分前に試験化合物を胃管により投与した。尿中ナトリウム、カリウムおよび水排泄量を測定した。結果は、排泄された尿中ナトリウムとカリウムとの比として表す（Ｎａ／Ｋ）±ＳＥＭ（表Ａ−２Ａ）。
抗鉱質コルチコイド薬理活性は、アルドステロンを静脈内注入し、エプレレノンを経口投与した食塩水水和覚醒イヌ（ｎ＝６）においても評価した。排泄された尿中ナトリウムおよびカリウム濃度を測定した。結果は、尿中ナトリウムおよびカリウムならびにＮａ／Ｋ比の変化として表し、アルドステロン単独投与と比較した（表Ａ−２Ｂ）。
結果：これらの結果は、２種の動物種におけるｉｎ ｖｉｖｏでのアルドステロン誘発性ナトリウムおよび水貯留ならびにカリウム損失のエプレレノンによる薬理学的逆転を示している。これらのモデルでは、エプレレノンは、単回経口投与後に有意なナトリウム利尿をもたらす。
実施例Ａ−３：ラットへのエプレレノンの皮下投与と経口投与との比較
方法：エプレレノンの抗鉱質コルチコイド薬理活性をアルドステロンを投与した食塩水負荷副腎摘出ラットにおいて検討した。エプレレノンは、アルドステロンの注射の３０分前に強制経口投与または皮下注射した。尿中ナトリウム、カリウムおよび水排泄量を測定した。結果は、排泄された尿中ナトリウムとカリウムとの比として表す（Ｎａ／Ｋ）±ＳＥＭ。
結果：これらの結果は、腎におけるアルドステロン媒介性作用に拮抗するエプレレノンのｉｎ ｖｉｖｏ効力を示している（表Ａ−３Ａ）。皮下注射は、経口投与よりも有効性が高い（表ＸＶＩＩＩおよびＸＩＸ）。
実施例Ａ−４：高血圧モデル：容積膨張性高血圧ラット
方法：１腎摘出ラットに１％ＮａＣｌ飲料水を与え、Ａｌｚａ浸透ポンプ（Ｍｏｄｅｌ２００２）によりアルドステロン（０．５ｇ／ｋｇ／時間）を皮下注入した。試験化合物は、１日２回皮下注射した。血圧および心拍数は、腹部大動脈にカニューレ挿入により取り付けた圧力変換器に接続した植込み式送信機を介する遠隔測定により連続的に評価した。
結果：エプレレノンは、遠隔測定を用いた連続モニタリングにより測定したとき、試験した両用量でこのげっ歯類モデルにおける血圧を降下させた（表Ａ−４Ａ、３週間後に２４時間にわたり平均したデータ）。エプレレノンは、心拍数の有意な変化をもたらさなかった。
実施例Ａ−５：脳卒中易発性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ−ＳＰ）におけるエプレレノンの効果、高血圧および脳卒中の遺伝モデル
脳卒中易発性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ−ＳＰ）の血圧に対するエプレレノンの作用
方法：ＳＨＲ−ＳＰは、ニューヨーク医科大学の動物施設で繁殖させ、通常のラット飼料と非食塩水性飲料水（すなわち、水道水）を与えて飼育した。１３週齢時に動物（ｎ＝７〜８）にエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口、１日２回）または溶媒を投与した。収縮期血圧の間接測定をテイルカフ容積変動記録法により評価した。
結果：結果を表Ａ−５Ａに示す。両群の動物は、試験開始時に同様な高い収縮期血圧を有していた。溶媒のみを投与した動物では３週間の実験期間中収縮期血圧は上昇し続けた。これに対して、エプレレノンを投与した動物の収縮期血圧は投与前のレベルに留まっていた。これらのデータは、エプレレノンが遺伝的高血圧および脳卒中のこのモデルにおいて有効な抗高血圧薬であることを示している。
実施例Ａ−６：心筋損傷を治療するためのアルドステロン受容体拮抗薬
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ）の１側の腎を摘出し、唯一の水供給源としての１％ＮａＣｌ溶液を与えた。次いで、ラットにアルドステロン（０．７５μｇ／時間）または溶媒を皮下に送達するＡｉｚｅｔミニポンプを埋め込んだ。これらの２投与群をさらに、通常のラット飼料またはエプレレノン（１００ｍｇ／ｋ／日）を含む飼料を与える群に分けた。ラットは、心臓の検査のために屠殺した。
図Ａ−８に示すように、この高食塩／１腎摘出ラットでは、アルドステロンは組織病理学的に実証可能な心臓病変を引き起こした。２〜４の投与後に、心臓は、血管周囲炎症、血管壁肥大、内皮肥大（新内膜）、冠動脈のフィブリノイド壊死を特徴的に示した。ごくわずかな心筋細胞の変化があり、明らかな線維症はなかった。６〜８週間の投与後に、組織学的に明らかな心筋細胞壊死、修復性線維症（瘢痕）および反応性間質線維症が存在していた。これに対して、ラット飼料へのエプレレノンの添加により、さもなければ認められる組織学的損傷が予防されている（図Ａ−９）。
図Ａ−１０に示すように、１腎摘出ラットにおける心筋損傷は、高食塩摂取量とアルドステロンとを必要とする。ナトリウムのみでは心筋損傷は引き起こされず、エプレレノンの投与によるアルドステロンの遮断によりアルドステロンと高ナトリウムとによる心筋損傷が予防される。
実施例Ａ−７：脳卒中および脳血管障害を予防するためのエプレレノンの使用
１５匹の９週齢の雄食塩水摂取ＳＨＲＳＰを実験に含めた。図Ａ−１１に示すように、溶媒投与ＳＨＲＳＰ（ｎ＝８）はすべて１５．２±０．６週齢で脳卒中の徴候を発現し、死亡したのに対して、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝７）は、さらなる評価のために屠殺した１８．５週齢まで脳卒中の徴候を示さなかった（Ｐ＜０．００５）。エプレレノンの投与は、著明な蛋白尿の発生も予防した（３８±１８対１３６±１９ｍｇ／日、Ｐ＜０．００５）が、重度の高血圧は予防しなかった（２３７±３対２４２±４ｍｍＨｇ）（図Ａ−１２）。図Ａ−１３に示すように、脳の組織病理学的分析から、すべての溶媒投与ＳＨＲＳＰにおける限局性出血を伴う大脳動脈および細動脈におけるフィブリノイド壊死を随伴した液状壊死の存在が明らかになった。これらの病変は、エプレレノンの投与により著しく低減した。大脳損傷に関する０〜４の半定量的採点システム（図Ａ−１４）を用いた場合、溶媒投与ラットで３．５±３の評点が認められたのに対して、エプレレノンを投与した動物では０．５±２の評点が認められた（Ｐ＜０．００１）。したがって、エプレレノンは、動脈血圧の降下に関連しないメカニズムにより、食塩水摂取ＳＨＲＳＰの脳における血管防護作用をもたらす。結果は、脳卒中の発現におけるナトリム摂取ラットの内因性鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）のこれまで認識されていない役割を示している。さらに、エプレレノンの投与は、食事ナトリウムの高摂取量のラットにおけるアルドステロンに起因する脳卒中の発現を予防する。
実施例Ａ−８：脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおけるエプレレノンの血管防護作用
第１のプロトコールでは、食塩水を飲ませているＳＨＲＳＰ（ｎ＝９）にエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を５〜６週間にわたり経口投与した。エプレレノンは、溶媒（ｎ＝９）と比較して、蛋白尿（１６±２対８５±１１ｍｇ／日、Ｐ＜０．００１）および腎病変（１±１対４０±５％、Ｐ＜０．０００５）の発生を予防したが、重度高血圧症（２１９±６対２２７±４ｍｍＨｇ）は予防しなかった。第２のプロトコールでは、血管病変の発生に対する鉱質コルチコイドの寄与を内因性アンジオテンシンＩＩの生成を抑制し、溶媒または外因性アンジオテンシンＩＩを慢性的に注入した条件下でカプトプリル投与ＳＨＲＳＰにおいて検討した。カプトプリル投与ＳＨＲＳＰに次の３種の投与方法のうちの１つにより投与した。（ｉ）アンジオテンシンＩＩを溶解するために用いるエプレレノンを含まない溶媒の注入（ｎ＝５）、（ｉｉ）アンジオテンシンＩＩ注入（２５ｎｇ／分、皮下、ｎ＝７）と２ｍｌ／ｋｇ／日の０．５％メチルセルロースの強制経口投与、（ｉｉｉ）アンジオテンシンＩＩ注入（２５ｎｇ／分、皮下、ｎ＝７）とエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日強制経口投与）。２週後に、ＳＨＲＳＰの３群すべてにおける収縮期血圧は同等であり、著しく高かった。カプトプリルと溶媒を投与したＳＨＲＳＰでは、血漿中アルドステロン濃度は低く、腎の病状は認められなかった。アンジオテンシンＩＩを加えることにより、血漿中アルドステロン濃度が上昇し、蛋白尿（それぞれ９６±１３対１４±１ｍｇ／日）および腎障害に対するカプトプリル防護が逆転された。アンジオテンシンＩＩの持続注入にもかかわらず、エプレレノンの投与は、溶媒と比較して蛋白尿（２８±５対９６±１３ｍｇ／日、Ｐ＜０．００１）および腎障害（３±１対１８±４％、Ｐ＜０．０００１）を著しく低減させた。これらの所見は、内因性鉱質コルチコイドは、アンジオテンシンＩＩおよびその血圧に対する作用に無関係に、食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける腎障害の進行を媒介することを示している。
材料および方法
動物 試験は、我々の現地コロニーからの雄ＳＨＲＳＰ／Ａ３Ｎ（世代Ｆ−７５〜Ｆ−７８）（ｎ＝３７）を用いて施設内ガイドラインに従って実施した。これらの動物は、最初にＯｋａｍｏｔｏと共同研究者（Ｏｋａｍｏｔｏ Ｋ等、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、第３４および３５巻（増刊Ｉ）、Ｉ−１４３〜Ｉ−１５３頁）により記載されたＳＨＲＳＰ／Ａ３Ｎ亜系統由来のＮＩＨストックから繁殖させた。すべての動物をニューヨーク医科大学の動物施設の１２時間−１２時間照明−消灯サイクルと２２±１℃の周囲温度が維持された室内に収容した。ラットは、４週齢で離乳させ、実験プロトコールの開始までＰｕｒｉｎａ（実験用飼料） Ｌａｂ Ｃｈｏｗ ５００１（Ｒａｌｓｔｏｎ Ｐｕｒｉｎａ、ミズーリ州セントルイス）および水道水を自由に摂取させた。
プロトコール１：腎の病理変化に対するエプレレノンの効果
１８例のＳＨＲＳＰに、８．１週齢から１％ＮａＣｌを飲ませ、脳卒中易発性げっ歯類用飼料（Ｓｔｒｏｋｅ−Ｐｒｏｎｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ）（＃３９−２８８、Ｚｅｉｇｌｅｒ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ガードナー）を与えた。この飼料は、標準飼料よりもカリウム（重量で０．７％対１．２％）および蛋白（重量で１７％対２２％）が少なく、ＳＨＲＳＰの脳卒中発生率を高める（Ｓｔｉｅｒ ＣＴ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、第１３巻、１１５〜１２１頁）。８．４週齢時に、動物を均等に２群に分け、エプレレノンまたは溶媒の長期投与を開始した。エプレレノン（ＳＣ−６６１１０）は、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ ＆ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）により供給された。エプレレノンを５０ｍｇ／ｍｌで０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）の溶液に懸濁し、１００ｍｇ／ｋｇの総１日投与量で１日２回胃管により投与した。エプレレノンは、スピロノララクトンと異なり、活性代謝物を生じないので、より高用量を用いた。溶媒対照動物には２ｍｌ／ｋｇ／日の０．５％メチルセルロースを投与した。２４時間尿排出量と蛋白排泄量を測定することができるように、動物を代謝ケージに個別収容した。脳卒中の神経徴候について動物を毎日検査した。覚醒ラットにおける動脈圧と心拍数を毎週測定した。実験は、動物が１３．１週齢になった５週間の投与後に終了させた。午前１０：００時から午後１２：００時の間に動物の速やかな断頭の後に体幹血液を冷却したＥＤＴＡ管に採取した。血液は、後の血漿中アルドステロン濃度の測定に備えて−２０℃で保存した。腎族を速やかに摘出し、重量を測定し、後の組織検査のために固定液に保存した。
プロトコール２：ＳＨＲＳＰにおけるアンジオテンシンＩＩにより誘発される腎障害に対するエプレレノンの効果
第２のシリーズの１９例のＳＨＲＳＰにおいて、アンジオテンシンＩＩにより誘発される腎障害の発生に対する内因性鉱質コルチコイドの寄与を評価した。ＳＨＲＳＰに８．３週齢から脳卒中易発性げっ歯類用飼料（Ｓｔｒｏｋｅ−Ｐｒｏｎｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ）（＃３９−２８８、Ｚｅｉｇｌｅｒ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ガードナー）と１％ＮａＣｌ飲料溶液を自由に摂取させた。動物における内因性アンジオテンシンＩＩレベルの一貫したバックグラウンド抑制をもたらすために、カプトプリル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量が得られるようにすべての動物の飲料溶液に加えた。この用量のカプトプリルは、アンジオテンシンＩＩの注入の非存在下では、食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける腎および脳血管病変の発生を予防することが以前に示された（Ｒｏｃｈａ Ｒ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、第３３巻、２３２〜２３７頁）。９．３週齢時に、アンジオテンシンＩＩ（ヒト型、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サニーベール）またはその溶媒（無菌０．９％ＮａＣｌ）を含むＡｌｚｅｔ浸透ミニポンプ（Ｍｏｄｅｌ ２００２）（Ａｉｚａ Ｃｏ．、カリフォルニア州パロアルト）をイソフルラン（Ｏｈｍｅｄａ Ｃａｒｉｂｅ Ｉｎｃ．、プエルトリコ グアヤマ）による吸入麻酔下のＳＨＲＳＰの頚部の頂部の皮下に埋め込んだ。ラットを代謝ケージに個別収容し、次の３種の投与方法のうちの１つにより投与した。（ｉ）アンジオテンシンＩＩを溶解するために用いるエプレレノンを含まない溶媒の注入（ｎ＝５）、（ｉｉ）アンジオテンシンＩＩ注入（２５ｎｇ／分、皮下、ｎ＝７）と２ｍｌ／ｋｇ／日の０．５％メチルセルロースの強制経口投与、（ｉｉｉ）アンジオテンシンＩＩ注入（２５ｎｇ／分、皮下、ｎ＝７）とエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日強制経口投与）。予備実験において、２５ｎｇ／分の用量のアンジオテンシンＩＩは食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおけるエナラプリルによるＡＣＥ阻害薬投与の血管防護効果を逆転させることが示された。選択したエプレレノンの用量は、収縮期血圧の変化に無関係に１３週齢まで食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける蛋白尿および腎障害に対するほぼ完全な防護作用が示されたプロトコール１における実験の結果に基づくものであった。動物に１日１回手を触れ、体重を測定した。蛋白尿の評価のために尿試料を採取した。収縮期血圧および心拍数を毎週測定した。２週間の投与後に、動物を断頭し、体幹血液を冷却したＥＤＴＡ管に採取し、腎臓を摘出し、体液を吸い取って乾燥し、ただちに重量を測定した。腎臓の冠状断面を固定し、光学顕微鏡評価のために後に処理した。
検定および分析 覚醒動物の収縮期血圧および心拍数をＮａｔｓｕｍｅ ＫＮ−２１０マノメータおよびタコメータ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ベルモント）を用いてテイルカフ容積変動記録法により測定した。ラットは、血圧測定の前に３７℃で１０分間加温し、Ｌｕｃｉｔｅチャンバー内で鎮静させた。尿量の測定は、重量法により行った。尿蛋白濃度は、スルホサリチル酸濁度法を用いて測定した。血漿アルドステロンは、１２５Ｉ−アルドステロン（Ｃｏａｔ−ａ Ｃｏｕｎｔアルドステロン、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．、カリフォルニア州ロスアンジェルス）をトレーサーとして用いたラジオイムノアッセイにより測定した。
組織検査 腎臓を１０％リン酸緩衝ホルマリンに保存した。冠状切片（２〜３μｍ）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、前述のように盲検法により光学顕微鏡により検査した（Ｓｔｉｅｒ ＣＴ等、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ（１９９２年）、第２６０巻、１４１０〜１４１５頁）。糸球体損傷を虚血性または血栓性と分類した。虚血性病変は、メサンギウム融解を伴うまたは伴わない糸球体毛細管ふさ状分岐の退縮と定義した。糸球体血栓性病変は、次の組合せのいずれか１つと定義した。すなわち、分節性ない全体的フィブリノイド壊死、糸球体毛細管の限局性血栓症、毛細管内の腫脹および増殖（内皮およびメサンギウム）および／または毛細管内細胞（半月体）、ならびに有意な細胞充実性を伴うまたは伴わない細網状メサンギウムマトリックスの拡大と定義した。いずれかのカテゴリーの病変を示す糸球体の数を各腎臓について数え、中央冠状切片当たり存在する糸球体の総数に対する割合として表した（プロトコール１については平均値±ＳＥＭ＝２１８±７動物当たりの糸球体、範囲＝１６２〜２６１糸球体、およびプロトコール２については２２９±７動物当たりの糸球体、範囲＝１９６〜２９０糸球体）。血管損傷は、同じ中央冠状切片における血栓性および／または増殖性動脈症を示した動脈および細動脈プロファイルの総数を数えて評価した。血管の血栓性病変は、次の組合せのいずれか１つと定義した。すなわち、壁在フィブリノイド壊死、赤血球の血管外遊出および断片化ならびに管腔および／または壁在血栓症。増殖性動脈症は、しばしば結節性肥厚をもたらすムチン細胞外マトリックスにより囲まれた腫脹した円形または卵形小胞性核（「タマネギ外皮」）を含む腫脹した筋内膜細胞の増殖により特徴付けられる。血管損傷は、１００個の糸球体当たりの病変を有する動脈および細動脈の数として表した。円柱ならびに尿細管（虚血性）退縮および単純化の存在を半定量的に評価した。
統計解析 投与および時間に関する有意な効果は、二元配置分散分析により判定した。１つのグループ分け変数のみを含むデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔの対応のないｔ検定により統計的に解析した。２群以上を比較するとき、一元配置分散分析を行った後に、事後Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌの多重対照検定を行った。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウエアパッケージのバージョン２．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンジエゴ）を用いて解析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
結果
プロトコール１
図Ａ−１５にエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）または溶媒を慢性的に投与したＳＨＲＳＰにおける終了前の収縮期血圧および尿中蛋白排泄に関する結果を示す。この棒グラフは、８．４週齢から１３．１週齢までエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）または溶媒の長期投与を受けた脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおける終了前の（Ａ）収縮期血圧（ＳＢＰ）および（Ｂ）尿中蛋白排泄（ＵＰＥ）を示す。動物には８．１週齢から１％ＮａＣｌを飲ませ、脳卒中易発性げっ歯類用飼料を自由に摂取させた。＊＊＊Ｐ＜０．００１溶媒対照同腹児との比較。値は平均値±ＳＥＭである。
エプレレノンは、同腹児対照と比較して蛋白尿症の発生（８５±１１対１６±２ｍｇ／日、Ｐ＜０．００１）を予防したが、重度の高血圧症（２２７±４対２１９±６ｍｍＨｇ）は予防しなかった。収縮期血圧および心拍数も試験中エプレレノン投与群と溶媒対照群とで異なっていなかった。
表Ａ−８Ａに腎病変の組織学的分析の結果を要約する。溶媒を投与し、食塩水を飲ませたＳＨＲＳＰの腎臓は、図Ａ−１６Ａに示すように糸球体の３５±５％における虚血性または血栓性損傷を示し、小動脈および細動脈における広範な血栓性および増殖性損傷を示した。この図は、８週齢で開始した５週間のエプレレノンまたは溶媒の投与後の食塩水を飲んでいた脳卒中易発性高血圧自然発症ラットのヘマトキシリンおよびエオシン染色中央冠状腎切片の代表的な顕微鏡写真（最初の倍率、×１３０）を示す。溶媒を投与した動物の腎皮質は、虚血性退縮（小矢印）、毛細管ふさ状分岐の血栓壊死（大矢印）ならびに赤血球の断片化および血管外遊出を伴う細動脈フィルリノイド壊死、ならびに同心性増殖性動脈症（矢じり）のような悪性腎硬化症の典型的な所見を示している。いくつかの小動脈および細動脈は、内側肥大（二重矢印）に起因する著明な壁肥厚を示している。尿細管の斑状退縮と単純化が存在する。他の尿細管は蛋白円柱で拡張している。これに対して、５週間のエプレレノンの投与後に、年齢一致同腹児は、虚血性または血栓性糸球体のまれな例を示したにすぎなかった（図Ａ−１６Ｂ、エプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を投与した動物の腎皮質は有意な病状を示していない）。
蛋白円柱は、溶媒投与ＳＨＲＳＰの尿細管の１０±５％に、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰの尿細管の０．１１±０．０４％に存在していた。同様に、溶媒投与ＳＨＲＳＰの尿細管の４８±７％が虚血性退縮と単純化を示したのに対して、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰの尿細管の０．５±０．２％が示したにすぎなかった（Ｐ＜０．００１）。アルドステロンの血漿中濃度は、群間で有意差はなく、溶媒投与ＳＨＲＳＰで平均３０５±６８ｐｇ／ｍｌで、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰで３１５±３５ｐｇ／ｍｌであった。溶媒投与ＳＨＲＳＰの９匹中６匹が脳卒中の明らかな徴候を示したのに対して、どのエプレレノン投与ＳＨＲＳＰも脳卒中の証拠を示さなかった（Ｐ＜０．０１、Ｆｉｓｈｅｒの直説法）。
体重は、最初の３週間の投与までエプレレノンによる影響を受けなかった（データは示さず）。その後、体重は溶媒投与群では減少したが、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰでは維持または増加した。剖検時の絶対腎重量の平均値は、溶媒投与ＳＨＲＳＰで２．４２±０．１１ｇ、エプレレノン投与ＳＨＲＳＰで２．５８±０．０６ｇであり、エプレレノンの長期投与の影響を受けなかった。終了時体重は、溶媒投与ＳＨＲＳＰのほうがエプレレノン投与ＳＨＲＳＰよりも低く（２２０±７ｇ対２７９±７ｇ、Ｐ＜０．００１）、腎重量対体重比はその群で有意に高かったからである。
プロトコール２
図Ａ−１７に、溶媒（食塩水）またはエプレレノンの併用経口投与を伴うまた伴わないアンジオンシンＩＩの注入を受けたカプトプリル投与食塩水摂取ＳＨＲＳＰの収縮期血圧を示す。図Ａ−１７は、カプトプリル＋溶媒（ＣＡＰ）、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ（ＣＡＰ＋アンジオテンシンＩＩ）またはカプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン（ＣＡＰ＋アンジオテンシンＩＩ＋ＥＰＬ）の投与中の食塩水摂取の脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおける（Ａ）収縮期血圧および（Ｂ）尿中蛋白排泄量を示す線グラフを含む。カプトプリル投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）は、８．３週齢で開始した。アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分）を含むＡｌｚｅｔ浸透ミニポンプを９．３週齢時に皮下に埋め込み、溶媒（ｎ＝５）、アンジオテンシンＩＩ単独（ｎ＝７）またはアンジオテンシンＩＩ＋ＥＰＬ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝７）の併用投与を開始した。＊＊＊Ｐ＜０．００１ＣＡＰまたはＣＡＰ＋アンジオテンシンＩＩ＋ＥＰＬとの比較。値は平均値±ＳＥＭである。すべてのＳＨＲＳＰが重度の高血圧症を発現し、これらは群間で有意に異なっていなかった。終了前の収縮期血圧の平均値は、カプトプリル＋溶媒投与群で２２４±６ｍｍＨｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋溶媒投与群で２２４±４ｍｍＨｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与ＳＨＲＳＰで２３１±５ｍｍＨｇであった。結果は、カプトプリルへのアンジオテンシンＩＩの追加によってカプトプリル＋溶媒と比べて血圧がさらに上昇しなかったことを示している。さらに、アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノンの投与を受けたカプトプリル投与ＳＨＲＳＰで血圧測定は同様であった。尿中蛋白排泄量は、アンジオテンシンＩＩ注入の開始の２日後の９．５週齢まで３群すべてにおいて低いレベルに留まっていた（図Ａ−１７Ｂ）。その後、カプトプリル＋溶媒投与のＳＨＲＳＰは蛋白尿症を発現しなかった。しかし、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋溶媒を投与したＳＨＲＳＰは著明な蛋白尿症を発現した。これに対して、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノンを投与したＳＨＲＳＰでは蛋白尿症は予防された。尿中蛋白排泄量の平均値は、試験終了時にカプトプリル群で１４±１ｍｇ／日、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ群で９６±１３ｍｇ／日、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与群で２８±５ｍｇ／日であった（Ｐ＜０．００１、カプトプリルまたはカプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン対カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩについて）。血漿中アルドステロン濃度の平均値は、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ投与群で４０４±１６０ｐｇ／ｍｌ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与群で２３１±３７ｐｇ／ｍｌであった（Ｐ＝ＮＳ、図Ａ−１８）。図Ａ−１８は、８．３週齢でカプトプリル（５０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与を開始し、１％ＮａＣｌ／脳卒中易発性げっ歯類用飼料の摂取を開始した脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおける血漿中アルドステロン濃度を示す棒グラフである。溶媒またはアンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分）を含むＡｌｚａｔ浸透ミニポンプを９．３週齢に皮下に埋め込み、エプレレノンの存在下または非存在下での併用投与を開始した。動物は２週間後に屠殺した（＊Ｐ＜０．０５、カプトプリル単独投与動物との比較）。これらの値は、カプトプリルのみを投与した群（１０７±２６ｐｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０５）と比較して有意に高く、プロトコール１で認められた値と同様であった。
蛋白尿の高いレベルと調和して、２週間の終了時のカプトプリル投与食塩水摂取ＳＨＲＳＰの腎臓は、障害を示さなかった。カプトプリル投与ＳＨＲＳＰへのアンジオテンシンＩＩ＋溶媒の投与は、糸球体および微小血管を冒す悪性腎硬化症の顕著な血栓性微小血管障害病変の発生を誘発した（表Ａ−８Ｂ）。これに対して、アンジオテンシンＩＩに反応しての腎硬化性病変は、エプレレノンの併用投与を受けたカプトプリル投与動物において著しく減弱した。図Ａ−１９に、食塩水摂取カプトプリル投与ＳＨＲＳＰの腎における組織学的変化の顕微鏡写真を示す（食塩水摂取脳卒中易発性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲＳＰ）のヘマトキシリンおよびエオシン染色腎皮質）（最初の倍率、×１３０）。カプトプリル＋溶媒投与は、腎の病状の発生を予防した（図Ａ−１９Ａ）。アンジオテンシンＩＩ＋溶媒を注入したカプトプリル投与ＳＨＲＳＰ（図Ａ−１９Ｂ）は、溶媒を投与した食塩水摂取ＳＨＲＳＰ（図Ａ−１６Ａ参照）と同様の腎病変を示した。これに対して、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノンを投与した動物における腎血管および糸球体損傷の発生率は著しく低かった（図Ａ−１９Ｃ）。尿細管虚血の存在をプロトコール１と同様に半定量的に評価した。これらの変化は、カプトプリル＋溶媒を投与したＳＨＲＳＰには存在しなかった。カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋溶媒投与ＳＨＲＳＰにおける尿細管の２１±３％は虚血性退縮および単純化を示したのに対して、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与ＳＨＲＳＰでは尿細管の２．５±０．９％が同様の変化を示したにすぎなかった（Ｐ＜０．０００１）。
体重は、試験中群間で差を示さず、実験の終了時にカプトプリル＋溶媒投与群で２５８±６ｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋溶媒投与群で２２３±７ｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与群で２３４±５ｇであった。剖検時の絶対腎重量は、カプトプリル＋溶媒投与群で２．５６±０．０６ｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋溶媒投与群で２．１２±０．０６ｇ、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン投与群で２．００±０．０３ｇであった。絶対腎重量または体重に対する割合（％）として表した腎重量は、エプレレノンの投与の影響を受けなかった。
エプレレノンを投与した食塩摂取ＳＨＲＳＰは、著しく低い蛋白尿を示し、糸球体および腎血管損傷のほぼ完全な予防を示した。溶媒投与動物で認められた尿細管の斑状のおそらく虚血性収縮（退縮）および単純化も、エプレレノンの投与により著しく防止された。食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける腎病変の発生を防御するエプレレノンの能力と調和することは、これらのラットと重度高血圧症の低レニンモデルである鉱質コルチコイド−食塩高血圧症を有するラットで発生する悪性腎硬化症が非常に類似していることである。
エプレレノンの有益な作用は、血圧降下と無関係である。鉱質コルチコイド誘発性高血圧症のラットでは、病状（血栓性微小血管障害性病変）の原因が重度高血圧による直接的な機械的傷害であるのか、高血圧と無関係の鉱質コルチコイドの直接的な作用であるのか、その両方なのか、あるいは他の因子であるのかは、不確実である。動脈圧の上昇は、アルドステロンに反応しての血栓性微小血管障害性病変の発生の先行条件である。我々の結果は、高血圧のみでは血管損傷の発生に十分でなく、内因性鉱質コルチコイドがＳＨＲＳＰにおける悪性腎硬化症の発生を媒介していることを示している。重度の腎血管病変の発現は、食塩負荷ＳＨＲＳＰにおいて非常に早期に起こり、これらの動物における病変発生の食塩感受性を示している。同様に、鉱質コルチコイド投与（デオキシコルチコステロン酢酸塩）ラットにおける腎病変の誘導には、高食塩摂取量が必要である。我々の所見は、高食塩摂取量は、高血圧と同様に、アルドステロン誘発性病変形成の先行条件であるが、病変の発生には十分ではないことを示している。
一般的にＳＨＲＳＰにおける脳卒中の結果である死亡は本試験における終点ではないが、脳卒中の神経徴候の発生に対するエププレノンの非常に明確な防護作用が認められた。エププレノンは、血漿中アルドステロン濃度に対する作用を有さなかった（エププレノン投与ＳＨＲＳＰで３１５±３５ｐｇ／ｍｌ、溶媒投与ＳＨＲＳＰで３０５±６８ｐｇ／ｍｌ）。これは、アルドステロン合成ではなく、アルドステロン作用の阻害に一致する。全体として、本試験の結果は、ＳＡＲＡが食塩摂取ＳＨＲＳＰにおける血管保護をもたらすことを示している。
これらの条件下では、内因性アンジオテンシンＩＩの生成が抑制され、外因性アンジオテンシンＩＩの注入は一定であるので、これらの群の両方におけるアンジオテンシンＩＩのレベルは同様であるはずである。低用量のアンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分）の注入は、カプトプリルの併用投与にもかかわらず、蛋白尿、ならびに糸球体の虚血性ならびに血栓性病変を伴う血栓性および増殖性動脈症の誘発に有効であった。予備試験で、低用量のアンジオテンシンＩＩ（すなわち、２５ｎｇ／分）はＳＨＲＳＰにおける血圧を上昇させなかった。カプトプリルを投与しなかった食塩摂取ＳＨＲＳＰにおける我々の所見（プロトコール１）と同様に、カプトプリル投与食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおけるアンジオテンシンＩＩによる腎血管損傷の発生に対する、血圧降下を伴わなかったエプレレノンの顕著な防護作用が認められた。これらの所見は、このＡＣＥ阻害薬の血管防護作用が、特に内因性ＲＡＡＳの妨害に関連しており、また、アンジオテンシンＩＩにより誘発される腎障害の進行に重要な役割を果たしているものとして鉱質コルチコイドを特定するという見解と一致している。
アンジオテンシンＩＩは、高血圧性血管疾患における病原性因子としての確立された役割を有する。アンジオテンシンＩＩは、強力な血管収縮物質としてだけでなく、アドレナリン作動性反応の促進因子としても作用する。ＡＣＥ阻害薬の有用な効果は、一般的にアンジオテンシンＩＩの血管作用の低減に着せられているが、これらの薬剤は血漿中アルドステロン濃度も抑制することもできる。エプレレノンと併用または併用せずにアンジオテンシンＩＩを投与したＳＨＲＳＰは、カプトプリル投与ＳＨＲＳＰと比べて有意に高く、プロトコール１における溶媒投与ＳＨＲＳＰで認められた値と同様な血漿中アルドステロン濃度を維持していた。さらに、アンジオテンシンＩＩの注入は、エプレレノンによるＭＲ拮抗作用により著しく減弱される作用である、腎病変の発生を随伴した。我々の試験は、高食塩食を与えたときＲＡＡＳの阻害の障害を一般的に示すＳＨＲＳＰにおいて実施した。この現象は、我々の実験において認められた差の原因であったと思われる。本試験により、内因性鉱質コルチコイドが、低用量のアンジオテンシンＩＩの注入により誘発されたＳＨＲＳＰにおける腎障害の進行の重要な寄与因子であることが明らかになった。これらの所見は、鉱質コルチコイドがＳＨＲＳＰにおけるアンジオテンシンＩＩの血管毒性作用の重要なメディエータであることを示唆しており、アルドステロンの注入が、アンジオテンシンＩＩを注入しない条件下の血管損傷のカプトプリルによる防御を逆転させるという我々の以前の所見と一致している。合わせて考えると、これらの所見は、エプレレノンの投与はＲＡＡＳの活性化に二次的に起こる可能性があるＳＨＲＳＰにおける病変の発生を予防するための有効な治療法であることを示している。
要約すると、エプレレノンの長期投与は、食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける蛋白尿、悪性腎硬化症の腎病変および脳卒中の徴候の低減に有効である。さらに、低用量の外因性アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分）の長期投与は、食塩水摂取ＳＨＲＳＰにおける血漿中アルドステロン濃度を低下させ、腎血管損傷の発生を妨げるカプトプリル投与の既知の能力を逆転させた。しかし、アンジオテンシンＩＩの腎病変誘発能は、エプレレノンによる選択的なアルドステロン遮断により著しく減少した。これらの作用は、血圧の大きな変化とは無関係であった。
実施例Ａ−９：作用機序および作用の特異性：ｉｎ ｖｉｖｏでの鉱質コルチコイド受容体結合
エプレレノンの薬物動態および代謝を、１５ｍｇ／ｋｇの用量の水溶液としての［１４Ｃ］エプレレノンの静脈内および経口投与後に雌雄ラットにおいて検討した。血漿、尿および糞試料における放射能を分析した。非酸性化プール血漿中のエプレレノンおよびラクトン環が開環形のエプレレノンの濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により分析した。さらに、酸性化プール血漿中の「総エプレレノン」（ラクトン環が閉じた形と開いた形）の濃度を別のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により分析した。
［１４Ｃ］エプレレノンの静脈内投与後では、放射能の消失半減期は、雄および雌ラットでそれぞれ１．９および１．６時間であった。水溶液としての［１４Ｃ］エプレレノンの経口投与後では、総放射能の平均最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は雄および雌でそれぞれ投与１．１および０．８時間後に到達したことから、放射性投与物の吸収速度が速やかであったことがわかる。雄および雌ラットにおける平均Ｃｍａｘ値は、それぞれ７．６４および７．６７μｇ相当量／ｍＬであった。［１４Ｃ］エプレレノンの経口投与後の総放射能の全身利用率は雄および雌ラットでそれぞれ５９．６％および６６．４％であったことから、エプレレノンの吸収は良好であることがわかる。
静脈内投与後のエプレレノンの消失半減期は、雄および雌ラットでそれぞれ０．８０３および１．１４時間であった。総エプレレノンの対応する値は、それぞれ１．０１および１．１４時間であった。エプレレノンの血漿クリアランス（ＣＬ）は、雄および雌ラットでそれぞれ１．２２および１．２０Ｌ／ｋｇ／時間であった。総エプレレノンの対応する値は、それぞれ０．９８３および０．６９４Ｌ／ｋｇ／時間であった。
経口投与後に、親薬物の血漿中濃度に注目に値する性差があり、雌でより高値であった。エプレレノンは速やかに吸収され、雄ラットで０．５時間後に１．７１μｇ／ｍＬ、雌ラットで１時間後に３．５４μｇ／ｍＬのＣｍａｘに到達した。エプレレノンの全身利用率は、雄および雌ラットでそれぞれ２５．６％、６６．１％であった。全エプレレノンのＣｍａｘは、雄および雌ラットでそれぞれ３．２０と６．３５μｇ／ｍＬであった。エプレレノンの全身利用率は、雄および雌ラットでそれぞれ２９．４％および７４．２％であった
分布
ラット組織分布試験を、有色雄ラット（Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ Ｈｏｏｄｅｄ）への水溶液としての２０ｍｇ／ｋｇの用量の［１４Ｃ］エプレレノンの経口投与後に行った。放射性投与物の組織への取り込みの速度は速やかであり、ほとんどの組織が０．５時間後にＣｍａｘに到達した。血液および血漿中の平均Ｃｍａｘは、それぞれ４．９０および８．６４μｇ当量／ｇであった。消化管組織を除く最高平均Ｃｍａｘ値を有する組織は、肝臓、膵臓および腎臓であり、それぞれ４１．１、１２．１および１０．１μｇ当量／ｇの濃度を示した。最低Ｃｍａｘ値を有する組織は、眼（水晶体を除く）、脳および脊髄であり、それぞれ０．０４５、０．５１６および０．６３０μｇ当量／ｇの濃度を示した。投与９６時間後までに、放射能の濃度は、すべてが０．０２４μｇ当量／ｇ未満の値を示した盲腸、腎臓、大腸および肝臓を除くすべての組織で検出限界以下となった。
実施例Ａ−１０：選択的アルドステロン受容体遮断は飼料誘発性アテローム動脈硬化症における内皮機能を改善する
エプレレノンがアテローム動脈硬化症に伴って起こる内皮機能不全を改善または予防するかどうかを検討するために、酸化窒素の生物学的利用能を改善することに関するエプレレノンの有効性を試験した。
方法：ニュージーランドホワイト種ウサギを４投与群に無作為化した。３２匹のウサギに正常（ＮＣ）または１％コレステロール飼料（ＨＣ）を８週間にわたり与えた。最初の２週間の後に、１６匹のウサギをさらなる６週間にわたる胃管による食塩水（Ｓ）またはエプレレノン（Ｅ、５０ｍｇ／ｋｇ１日２回）の投与を受けるように無作為化した。８週間の終了時にウサギを安楽死させ、等尺性張力試験およびルシゲニン化学発光（２５０μＭ）による血管セグメントにおけるスーパーオキシド（Ｏ２ −）の発生の推定のために大動脈を抜き取った。血管をフェニレフリン（３×１０−７）で最大収縮の約５０％に前収縮させ、アセチルコリン（Ａｃｈ）およびニトログリセリン（ＮＴＧ）に対する用量反応を試験した。
結果：Ａｃｈ、ＮＴＧに対する最大弛緩、ＥＤ５０（Ｍ）値およびＯ２ −カウント（乾燥重量ｍｇ当たり）を下の表Ａ−１０に示す。
結論：エプレレノンは、飼料誘発性アテローム動脈硬化症における内皮機能を改善し、Ｏ２ −の発生を減少させる。これらのデータは、エプレレノンが内皮機能が損なわれている状態に対する追加の治療戦略を提供するという証拠を提供している。
薬物動態データの表示に用いた略語：
ＡＮＣＯＶＡ 共分散分析
ＡＵＣ 血漿中濃度時間曲線下面積
Ｃｍａｘ 最高血漿中濃度
Ｃｍｉｎ 最低血漿中濃度
ＣＩ 信頼区間
ＣＬ／Ｆ 見かけの血漿クリアランス
ＣＲＦ 症例報告書
ＣＶ 変動係数
Ｋｅｌ 終末相消失速度定数
ｌｑｃ 最終定量可能濃度
Ｔ１／２ 血漿消失半減期
Ｔｍａｘ 最高血漿中／血中濃度到達時間
ＸＵ 尿中収集分析物の全量
実施例Ａ−１１：薬物動態試験
エプレレノンの薬物動態データを得るために、５種の試験（日本人（日本）およびヨーロッパ人（日本以外）において実施された単回および多回投与許容度ならびに食物影響試験を含む）を実施した。合計７６人のヨーロッパ人被験者と３８人の日本人被験者が単回および多回投与許容度ならびに食物影響試験に参加した。これらのうちの３種の試験は、日本以外の試験で、１０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の用量が含まれていた。他の２種の試験は、日本において実施され、５０ｍｇ〜６００ｍｇの範囲の用量が含まれていた。
日本以外の試験は、（ｉ）単回投与許容度試験、および（ｉｉ）多回投与許容度試験、および（ｉｉｉ）食物影響試験を含んでいた。単回投与の日本以外の試験は、１０、５０、１００、３００または１０００ｍｇの用量のエプレレノンの投与を検討した。エプレレノンの単回経口投与は、４０人の健常男性被験者に行った。日本以外の多回投与許容度試験は、１００、３００および１０００ｍｇの用量で１１日間にわたり投与したエプレレノンの多回投与の影響を検討した。エプレレノンを２４人の健常男性被験者に用量漸増法で投与した。日本以外の食物影響試験は、１２人の健常男性において実施し、２つの別の時期にクロスオーバー法で一夜絶食後または高脂肪（７５ｇ）食の摂取直後に１００ｍｇのエプレレノンを単回経口投与した。
単回投与および多回投与許容度試験を健常男性日本人被験者を用いて日本で実施した。日本人単回投与許容度試験は、３２人の被験者における５０、１００、２００、４００および６００ｍｇのエプレレノンの単回経口投与を検討した。１００ｍｇの用量の投与を受けた６人の被験者は、単回投与許容度試験の食物影響投与群にも参加した。これらの６人の被験者には、２つの別の時期にクロスオーバー法で一夜絶食後または脂肪食の摂取直後に１００ｍｇのエプレレノンを単回経口投与した。多回投与許容度試験（ＪＥ３−９９−０６−４０１）は、６人の健常男性被験者において実施し、エプレレノン４００ｍｇを１日１回７日投与した。
５試験すべての単回投与絶食薬物動態データを合わせること、国（日本、日本以外）を因子とする分散分析、国内での試験、用量で正規化したＣｍａｘおよびＡＵＣ値に基づいて投与を行い、国（母集団）の効果を評価した。用量正規化は最低用量（単回投与の場合１０ｍｇ、多回投与の場合１００ｍｇ）に対して行った。静脈内データがないので、分布容積（Ｖ／Ｆ）およびクリアランス（ＣＬ／Ｆ）パラメーターは、見かけの値として表し、体重７０ｋｇに対して正規化した。解析した薬物動態パラメーターのいずれについても日本の試験と日本以外の試験とで統計的に有意差はなかった。多回投与データについては、日本人試験では用量として４００ｍｇエプレレノンのみを用いたのに対して、日本以外の試験では３用量を用いたため、正式な統計解析および比較は行わなかった。
図Ａ−２０〜Ａ−２４およびＡ−２５〜Ａ−２９に図上で得られた単回投与薬物動態パラメーター対用量をそれぞれエプレレノンおよび不活性なラクトン環が開いた形のエプレレノンについて示す。
表Ａ−１１ＡおよびＡ−１１Ｂに日本の試験と日本以外の試験におけるエプレレノンおよびその不活性なラクトン環が開いた形の単回投与薬物動態パラメーターの最小二乗平均を示す。評価した誘導パラメーターのいずれについても日本母集団と日本以外母集団との間に統計的に有意差は認められなかった。
表Ａ−１１Ｃに、日本および日本以外の食物影響試験における給食および絶食食事規則における相乗最小二乗平均値、平均値の比および平均値の比の対応する９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。ＣｍａｘおよびＡＵＣパラメーターを解析し、結果として、相乗最小二乗平均値、平均値の比および平均値の比の９５％ＣＩを得るために、順序、順序内で枝分れした被験者、期間および食事規則の効果の分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを用いた。
表Ａ−１１ＤおよびＡ−１１Ｅに、日本以外の１００、３００および１０００ｍｇエプレレノン投与および日本の４００ｍｇ投与試験における用量正規化薬物動態データの算術平均を示す。正式な統計解析は行わず、実際の誘導データを比較のみのために示す。
日本および日本以外の単回投与薬物動態データの比較では、誘導薬物動態パラメーター間に統計的に有意差はない。ＡＵＣパラメーターに反映される総曝露量に関する日本データに認められた食物の影響は、日本以外の試験で認められたものと同様である。日本の試験（４００ｍｇ）における多回投与薬物動態パラメーターの平均値は、日本以外の試験から得られたデータとかなりよく対応している。
本試験は、４０人の健常日本人男性被験者を５パネルのエプレレノン用量（５０、１００、２００、４００および６００ｍｇ）の１つに曝露させた単純盲検、無作為化、プラセボ対照経口用量漸増逐次のパネル試験であった。各パネルは、エプレレノンを投与した６人の被験者とプラセボを投与した２人の被験者からなっていた。食物の影響も６人の被験者における同じ試験においてクロスオーバー法で絶食および給食状態で１００ｍｇのエプレレノンを単回投与して評価した。エプレレノンの薬物動態を評価するために、順次血液および尿試料を４８時間にわたって採取した。
測定した臨床検査パラメーターのいずれについても臨床的に重要な異常は認められず、試験に参加したいずれの志願者からも有害事象は報告されなかった。
実施例Ａ−１２：多回投与日本人薬物動態試験
日本人被験者における多回投与安全性および薬物動態試験を日本において実施した。これは、単純盲検、無作為化、プラセボ対照試験であった。合計８人の日本人男性被験者がこの試験に参加した（そのうちの６人は４００ｍｇのエプレレノンの１日１回の投与を、２人はプラセボの投与を７日間にわたり連日受けた）。１日目の１回投与後と７日間の投与後の薬物動態、腎およびホルモンパラメーターの測定のために試験中に順次血液および尿試料を採取した。
エプレレノンの投与を受けた１人の被験者が２日目に軽度の疲労を経験したが、他の有害事象は他の７人の被験者のいずれからも報告されなかった。
実施例Ａ−１３：肝障害
これは、１６人の正常健常被験者および中等度肝障害を有する１６人の被験者において実施された非盲検多回投与試験であった。被験者の障害の程度は、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類システムに基づいてクラスＢ（腹水を伴う）であった。これらの肝障害者は、、性別、年齢、体重および喫煙状態に基づいて正常健常志願者に対応させた。
すべての試験参加者が１日目の朝に４００ｍｇのエプレレノンの１回の投与を受けた。２日目には被験薬の投与を受けなかった。被験者は３〜７日目に４００ｍｇのエプレレノンの１回の投与を受けた。１日目と７日目の投与前と投与後に薬物動態解析のための血液および尿試料を採取した。
肝障害を有する被験者については、被験者の肝疾患またはその合併症に関連した薬物は許容した。試験の結果に影響を与える可能性のある薬物は許容しなかった。併用薬の投与は、試験中一貫性のある投与方法で行った。
被験者には被験薬の初回投与の５日前から投与期間の終了時まで塩規制食（１日当たり５０ｍＥｑナトリウムおよび８０ｍＥｑカリウム）を供給した。クレアチニンクリアランス率およびナトリウム排泄率を基準時および被験薬の投与中の各２４時間にわたり測定した。
主として対数正規薬物動態反応変数の相乗平均の比および平均の比の９５％信頼区間に基づいて、中等度肝障害被験者におけるエプレレノンの生物学的利用能を健常被験者におけるそれを比較した。相乗平均の比および平均の比の９５％信頼区間は、次の手順に従って求めた。ＳＡＳ ＧＬＭ手順のＬＳＭＥＡＮＳオプションを用いて最小差を求め、それらの対応する標準誤差推定値をＡＮＣＯＶＡから求めて、平均差の９５％信頼区間を得る。平均差および平均差の９５％信頼区間の終点を真数変換して、相乗平均の比と平均の比の９５％信頼区間を求める。
２つの肝臓群について別個に４〜８日目のエプレレノンの血漿中濃度谷値（Ｃｍｉｎ）データをまとめた。エプレレノン４００ｍｇ１日１回の多回投与の４日目までにエプレレノンの定常状態が達成されていたかどうかを評価するために、６〜８日目のエプレレノンのＣｍｉｎデータについて反復測定解析を行った。
多回投与ＡＵＣ０−２４と単回投与ＡＵＣ０−∞との相乗平均の比、および対数変換ＡＵＣデータを用いた対応のあるｔ検定から得られた平均の比の９５％信頼区間を用いた多回投与ＡＵＣ０−２４と単回投与ＡＵＣ０−∞との比較に基づいて、線型動態を評価した。
正常被験者を肝障害を有する被験者に対応させたので、肝障害を有する被験者と対応する正常被験者との間に性別、体重および年齢に関する統計的に有意差はなかった。肝機能および対応する正常群のそれぞれにおいて、被験者は主として白人であった（８２％以上）。被験者の年齢範囲は３２〜６４歳で、各群の平均年齢は約４６〜５１歳であった。各群の被験者の大多数が男性であった（６５％以上）。
肝障害の病因は、主としてアルコール性肝硬変（５６％）であると判断され、続いて感染性肝硬変（１７％）、慢性活動性肝炎（６％）およびその他（１７％）の順であった。中等度肝障害を有する被験者は、平均６．６年間診断されていた。喫煙は、中等度肝障害を有する被験者の２８％（５／１８）で報告されたのに対して、対応する正常被験者では３５％（６／１７）であった。
エプレレノンの薬物動態パラメーターの相乗最小二乗平均、９５％信頼区間および対応するｐ値を表Ａ−１３Ｂに示す。
６日目から８日目までの血漿中谷値濃度に関する連続測定解析の結果は、エプレレノンの定常状態濃度はエプレレノン４００ｍｇ１日１回（ＱＤ）の多回投与の４日目までに達成されたことを示すものであった（日効果に関するｐ値は、正常被験者で０．０７６１、中等度肝障害を有する被験者で０．１１１８であった）。
エプレレノンの血漿中濃度は、単回投与後３時間以後および多回投与後すべての時点で中等度肝障害被験者のほうが正常被験者よりも一貫して高かった（図Ａ−３０）。
この試験で、エプレレノンの代謝が中等度肝障害による不利な影響を受けなかったことが示された。エプレレノンの単回（４００ｍｇ）および多復（４００ｍｇＱＤ）投与後に血漿中エプレレノンの曝露量（ＡＵＣによって表される）は中等度肝障害を有する被験者のほうが対応する正常被験者よりも統計的に有意に大きかった（エプレレノンについて４１〜５０％大きかった）。エプレレノンの定常状態血漿中濃度は、エプレレノンの多復４００ｍｇＱＤ投与後４日目までに達した。
中等度肝障害を有する被験者は、対応する正常被験者と比較して単回（ＡＵＣ０−∞、４３５７８．３対２９１１４．１ｎｇ／ｍＬ・時間）および多復（ＡＵＣ０−２４、４３７６５．９対３００６６．４ｎｇ／ｍＬ・時間）投与後にＡＵＣの統計学に有意な増加を経験した。中等度障害を有する被験者では平均エプレレノンＡＵＣ値は、対応する正常被験者と比較して単回投与後に４１〜５０％高く、多回投与後に４６％高かった。しかし、エプレレノンの平均最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）およびエプレレノンのＣｍａｘ到達時間（Ｔｍａｘ）は、被験者群間で統計的に有意差はなかった。エプレレノン４００ｍｇＱＤの多回投与後の線型動態がエプレレノンについて確認された。平均ＡＵＣ値の比（ＡＵＣ０−２４／ＡＵＣ０−∞）の９５％信頼区間は、両分析物について同等点１．０を含んでいた。６〜８日目の血漿中谷値濃度に関する反復測定解析で、エプレレノンの定常状態濃度が両被験者群でエプレレノン４００ｍｇＱＤ投与の４日目までに達成された（日効果のｐ値≧０．０７６１）。
中等度障害を有する被験者における総曝露量は正常被験者より大きかったが、被験薬は被験者群の中で同等に許容度が良好であった。有害事象は、正常肝機能被験者の３５％と中等度肝障害被験者の４４％で報告された。有害事象は、主として軽度から中等度であり、被験薬と関連性が不確実もの、または関連性がある可能性があるものであった。中止の原因となった有害事象または重篤な有害事象は報告されなかった。
エプレレノンの投与で血漿中エプレレノンの曝露量（ＡＵＣによって表される）は中等度肝障害を有する被験者のほうが対応する正常被験者よりも統計的に有意に大きかった（エプレレノンについて４１〜５０％大きかった）。エプレレノンの定常状態血漿中濃度は、エプレレノンの多復４００ｍｇＱＤ投与後４日目までに達した。中等度障害を有する被験者におけるエプレレノン曝露量は正常被験者より大きかったが、被験薬は２被験者群で同等に許容度が良好であった。
実施例Ａ−１４：高血圧症の治療におけるエプレレノンの臨床的有効性
高血圧患者における多施設共同、二重盲検、並行群試験を実施した。本試験は、一定の用量範囲のエプレレノン（ＥＰＬ）の血圧（ＢＰ）に対する効果、許容度および安全性をプラセボ（ＰＬ）と比較するためにデザインされた。スピロノラクトン（ＳＰＬ）を実薬対照として投与した。試験は、スクリーニング処置と現行の抗高血圧薬の中止のための投与前期間からなっていた。スクリーニング期間に続いて、４週間の単純盲検プラセボ導入投与期間を設けた。無作為化の後に、８週間の二重盲検実薬またはプラセボ投与期間を設けた。
有効性の主要な尺度は、プラセボと比較したときの谷値で測定したカフ拡張期血圧の基準からの変化であった。有効性の副次的尺度は、カフで評価した谷値収縮期血圧の変化ならびに携帯型血圧測定により評価した平均２４時間拡張期および収縮期血圧の変化などであった。安全性は、常用臨床検査、理学的検査、ＥＣＧおよび有害事象のモニタリングにより行った。
合計４１７人の患者を次の３種の１日用量のうちの１つの投与を受けるように無作為に割付けた。すなわち、（１）エプレレノン（５０、１００または４００ｍｇ、ＱＤまたは分割投与）、（２）スピロノラクトン（１００ｍｇ／日、分割投与）または（３）プラセボ。基準から最終来院時までの血圧の調整後平均変化は表Ａ−１４Ａに示してある。
これらの反応は、プラセボと有意に異なっていた（ｐ±０．０５）。２４時間ＡＢＰＭ ＤＢＰおよび谷値でのＳＢＰ（最後の４時間）の降下は、ＥＰＬがＱＤ投与か、またはＢＩＤ投与かにかかわりなく同様であった。ＱＤおよびＢＩＤ投与方法におけるピーク対谷値比はすべての用量で同様（１．０４〜１．１０）であったことから、エプレレノンの１日１回の投与で降圧有効性が２４時間にわたり持続することがわかる。エプレレノンは許容度が良好であり、有害事象の発生率はプラセボと同様で、女性化乳房の報告はなかった。
例えば、人種（黒人、非黒人、日本人等）、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、高血圧の病歴、心不全の病歴、腎機能不全の病歴等の因子の基準記録に基づくサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−１５：左室肥大および本態性高血圧症を有する患者におけるエプレレノンおよびエナラプリル単独ならびに互いの併用の有効性および安全性の対照試験
左室肥大（ＬＶＨ）および本態性高血圧症を有する患者における血圧（ＢＰ）の変化および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により測定した左室重量（ＬＶＭ）の変化に対する９カ月間の投与後の単独または相互併用投与したエプレレノンおよびエナラプリルの効果を評価するために臨床試験を実施する。この試験は、ＬＶＨおよび本態性高血圧症を有する最小限１５０人の終了患者を対象とする多施設共同、無作為化、二重盲検、プラセボ予備試験、並行群試験であり、１〜２週間の投与前スクリーニング期間の後の２週間の単純盲検プラセボ予備試験期間および９カ月間の二重盲検投与期間からなっている。
単純盲検プラセボ予備試験期間に入る患者は、（１）（ａ）Ｓｏｋｏｌｏｗ Ｌｙｏｎ電位基準（Ｓｏｋｏｌｏｗ Ｍ等、Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ、１９４９年、第３７巻、１６１頁）による、または（ｂ）Ｄｅｖｅｒｅｕｘ基準（ＬＶＭＩ＝男性で１３４ｇ／ｍ２、女性で＝１１０ｇ／ｍ２、Ｎｅａｔｏｎ ＪＤ等、ＪＡＭＡ、１９９３年、第２７巻、７１３〜７２４頁を参照）によるＬＶＨを示す事前の心電図を有し、（２）次のような座位血圧を有する。（ａ）現在降圧薬療法を受けている場合、ｓｅＤＢＰ＜１１０ｍｍＨｇで、ｓｅＳＢＰ＝１８０ｍｍＨｇ、または（ｂ）現在降圧薬療法を受けていない場合、ｓｅＤＢＰ＝８５ｍｍＨｇおよび＜１１４ｍｍＨｇで、ｓｅＳＢＰ＞１４０ｍｍＨおよび＝２００ｍｍＨｇ。
第２回来院時の単純盲検プラセボ予備試験期間中にすべての患者がＤｅｖｅｒｅｕｘ基準によるＬＶＨを有する心エコー図を有さなければならない。２週間の単純盲検プラセボ予備試験期間の終了後、ＭＲＩを受け、中核試験施設により許容できると承認された後、患者をエプレレノン、エナラプリルまたはエプレレノン＋エナラプリル１０ｍｇの３群の１つに無作為に割付ける。最初の２週間の二重盲検投与期間中に患者は（１）エプレレノン５０ｍｇ＋プラセボ、（２）エナラプリル１０ｍｇ＋プラセボ、または（３）エプレレノン５０ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇの投与を受ける。２週間目に被験薬の用量をすべての患者について（１）エプレレノン１００ｍｇ＋プラセボ、（２）エナラプリル２０ｍｇ＋プラセボ、または（３）エプレレノン１００ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇに強制的に調節する。４週間目に被験薬の用量をすべての患者について（１）エプレレノン２００ｍｇ＋プラセボ、（２）エナラプリル４０ｍｇ＋プラセボ、または（３）エプレレノン２００ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇに強制的に調節する。表Ａ−１５Ａに上述の投与スキームを示す。
８週目にＢＰが抑制されていない場合（ＤＢＰ＝９０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ）、非盲検ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）１２．５ｍｇを追加する。１０週目にＢＰが抑制されない場合、（１）８週目にＨＣＴＺを開始していたならば、ＨＣＴＺの用量を２５ｍｇに増量するか、または（２）８週目にＨＣＴＺを開始していなかったならば、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加する。１２週目にＢＰが抑制されない場合、（１）以前に８または１０週目に追加していなかったならば、非盲検ＨＣＴＺ １２．５ｍｇを追加するか、または（２）１０週目に行っていなかったならば、ＨＣＴＺの用量を２５ｍｇに増量するか、または（３）患者がＨＣＴＺ２５ｍｇの投与を受けている場合、アムロジピン１０ｍｇを追加する。１６週目またはその後のいずれかの来院時に患者が持続的に抑制されないＤＢＰ（すなわち、３〜１０日隔たった２回の連続する来院時に持続するｓｅＤＢＰ＝９０ｍｍＨｇまたはｓｅＳＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ）を示すならば、患者の試験参加を中止する。
患者が二重盲検投与のみを受け、試験中いずれかの時点に低血圧を経験する場合、患者の試験を中止する。非盲検薬剤を服用している患者は、低血圧が消失するまで、非盲検薬剤を追加したときと逆の順序で漸減させる。すべての非盲検薬剤を中止した後に症候性低血圧が依然として存在している場合、患者の試験を中止する。試験中いずれかの時点に、血清中カリウム濃度が１〜３日隔たった２回の連続する来院時の反復測定（ＢＵＮおよびクレアチニン濃度も検査、試料を分割し、現地および中央検査施設に送り、現地の値に基づき投与を決定）で高い（＞５．５ｍＥｑ／Ｌ）場合、患者の試験を中止する。注：ＢＵＮおよび／またはクレアチニン濃度が基準と比べて有意に高い場合（クレアチニン＝２．０ｍｇ／ｄＬまたは＝１．５×基準値またはＢＵＮ＝３５ｍｇ／ｄＬまたは＝２×基準値）、解消するまで薬剤投与下で患者の経過観察をすべきである。
患者は０、２，４、６、８、１０、１２、１６週目およびその後は９カ月間にわたり月１回、評価のために診療所に再来する。心拍数、ＢＰ、血清中カリウム濃度および有害事象を毎回の来院時に評価する。ＢＵＮおよびクレアチニン濃度は、２および６週目に測定する。臨床的安全性に関する血液の追加の臨床検査評価を月１回行う。通常の尿検査を３カ月ごとに行う。神経ホルモンプロファイル（血漿レニン［総および活性］、血清アルドステロンおよび血漿コルチゾール）および特殊試験（ＰＩＩＩＮＰ、ＰＡＩ、ミクロアルブミン尿症およびｔＰＡ）を０および１２週目と６および９カ月目に行う。遺伝子型決定用血液試料を０週目に採取する。スクリーニング時と９カ月目に１２誘導ＥＣＧおよび理学的検査を行う。ＬＶ筋重量の変化を評価するためのＭＲＩ、保存用の血液試料採取、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の検査用の血液試料採取、ならびにアルブミン、カリウム、ナトリウムおよびクレアチニンの検査のための２４時間蓄尿を０週目と９カ月目に行う。尿中アルドステロンの検査のための２４時間蓄尿は、０および１２週目と６および９カ月目に行う。早期終了の場合、ＭＲＩおよびＴＳＨの検査用の血液試料採取は、少なくとも３カ月間にわたり二重盲検投与を受けた患者について行う。０および１２週目と６および９カ月目に薬物動態データをすべての患者について収集する。
試験プロトコールの概略図を下に示す。
有効性の主要な尺度は、エプレレノン群対エナラプリル群におけるＭＲＩにより評価したＬＭＶの基準からの変化である。さらに、有効性を患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に測定する）。
有効性の副次的尺度は次の通りとする。（１）３投与群におけるＬＭＶの基準からの変化、（２）３投与群の各々における座位谷値カフＤＢＰ（ｓｅＤＢＰ）およびＳＢＰ（ｓｅＳＢＰ）の基準からの変化、（３）大動脈コンプライアンスおよび心室充満パラメーターおよび（４）特殊試験（ＰＩＩＩＮＰ、ミクロアルブミン尿、ＰＡＩおよびｔＰＡ）。さらに、３投与群の長期安全性および許容度を比較する。
試験の主要な目的は、ＬＶＨおよび本態性高血圧を有する患者における左室重量（ＬＶＭ）の変化に対するエナラプリルとエプレレノンの効果を比較することである。試験の副次的な目的は、次の通りである。すなわち、（１）３投与群におけるＬＶＭの基準からの変化を比較すること、（２）座位谷値カフＤＢＰおよびＳＢＰによって測定される３投与群における抗高血圧効果を比較すること、（３）ＭＲＩにより測定される大動脈コンプライアンスおよび心室充満パラメーターに対する３投与群の効果を比較すること、（４）ＩＩＩ型コラーゲンのアミノ末端ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）を測定することにより線維症の血漿マーカー、ミクロアルブミン尿を測定することにより腎糸球体機能、およびプラスミノーゲン活性化因子抑制物質（ＰＡＩ）および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を測定することにより線維素溶解バランスに対する３投与群の効果を比較すること、ならびに（５）３投与群の長期安全性および許容度を比較することである。
例えば、性別、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、高血圧の病歴、心不全の病歴、腎不全の病歴等の因子の基準記録に基づく他のサブグループに関する他の主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続的尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−１６：低レニン性高血圧症患者におけるエプレレノンとロサルタンの対照試験
低レニン性高血圧症患者におけるエプレレノンとロサルタンの抗高血圧作用を比較するために臨床試験を行う。試験は、最小限１５０人の終了患者を対象とする多施設共同、二重盲検、無作為化、プラセボ予備試験、並行群試験である。各患者を食塩投与一方向試験により食塩感受性について試験する。試験はまた、１〜３週間の投与前スクリーニング期間に続く、２〜３週間の単純盲検プラセボ予備試験期間および１６週間の二重盲検投与期間からなる。プラセボ予備試験期間を完了し、２回の連続する予備試験来院時に参加血圧（ＢＰ）基準（平均座位拡張期ＢＰ［ｓｅＤＢＰ］＝９０ｍｍＨｇおよび＝１１５ｍｍＨｇならびに平均座位収縮期ＢＰ［ｓｅＳＢＰ］＜２００ｍｍＨｇ）を満たした後、患者をエプレレノンまたはロサルタンの投与を受けるように無作為化する。患者に最初の４週間はエプレレノン１００ｍｇまたはロサルタン５０ｍｇを投与する。４週目にＢＰが抑制されていない（ＤＢＰ＝９０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をエプレレノン２００ｍｇまたはロサルタン１００ｍｇに増量する。８週目にＢＰが抑制されていない場合、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）１２．５ｍｇを追加する。１２週目にＢＰが抑制されていない場合、８週目にＨＣＴＺの追加を行っていないならば、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加するか、または８週目にそれを開始しているならば、ＨＣＴＺの用量を２５ｍｇに増量する。患者は１６週目まで治療を続ける。表Ａ−１６に上記の投与スキームを示す。
心拍数、ＢＰ、血清中カリウム濃度および有害事象を毎回の来院時（０、２、４、６、８、１０、１２、１４および１６週目）に評価する。０週目に、遺伝子型決定および保存用の血液試料、ならびにアルドステロン、カリウム、ナトリウム、クレアチニンおよびクレアチニンクリアランスの評価のための２４時間尿を採取する。０週目の２４時間蓄尿の一部試料を保存のために確保しておく。スクリーニング時に血漿レニンを測定し、０、８および１６週目に血清アルドステロン、血漿レニンおよび血漿コルチゾールを測定する。０、４、８、１２および１６週目に臨床安全性に関する追加の臨床検査評価（血液学的検査、血液化学検査および尿検査）を行う。０および１６週目に１２誘導心電図検査を行う。スクリーニング時および１６週目に理学的検査を完了する。
以下のスキームはプロトコールを示す。
有効性の主要な尺度は、８および１６週目のエプレレノンとロサルタンとの間の谷値カフｓｅＤＢＰの基準からの平均変化とする。さらに、有効性は、三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に測定する）。
有効性の副次的尺度は次の通りとする。すなわち、（１）８および１６週目の谷値カフｓｅＳＢＰの基準からの平均変化、（２）追加ＨＣＴＺを必要とする患者の割合、および（３）目標ＢＰ（ＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇ）またはＤＢＰの１０ｍｍＨｇの降下を満たす患者の割合。他の副次的尺度を用いて、エプレレノンおよびロサルタン投与患者におけるｓｅＤＢＰの基準からの平均変化と投与前のアルドステロン／レニン比および２４時間尿検査（尿中アルドステロン、カリウム、ナトリウムおよびクレアチニンならびにクレアチニンクリアランス）との関連を評価し、報告される有害事象、臨床検査評価、理学的検査および心電図により評価されるエプレレノンとロサルタンの安全性および許容度を評価することができる。
低レニン性高血圧症患者のこの試験では、エプレレノンの有効性を選択的なアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬ロサルタンの有効性と比較する。８および１２週目に、両群の抑制されていない高血圧を有する患者についてヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）を追加することができる。ＨＣＴＺは、ＲＡＡＳを活性化し、それにより、いずれかの薬剤の成功裏での活性化の役割を示す。この試験の主要な目的は、８および１６週目の低レニン性高血圧症患者におけるエプレレノンとロサルタンとの座位谷値カフ拡張期ＢＰ（ｓｅＤＢＰ）の基準からの平均変化を比較することである。この試験の副次的目的は、次の通りである。すなわち、（１）エプレレノン投与患者とロサルタン投与患者における８および１６週目の座位カフ収縮期ＢＰ（ｓｅＳＢＰ）の基準からの平均変化、追加ＨＣＴＺを必要とする患者の割合、および目標ＢＰ（ＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇまたはＤＢＰの１０ｍｍＨｇの降下）を満たす患者の割合を比較すること、（３）エプレレノン投与患者とロサルタン投与患者におけるｓｅＤＢＰの基準からの変化と投与前のアルドステロン／レニン比および投与前の２４時間尿検査（尿中アルドステロン、カリウム、ナトリウムおよびクレアチニン濃度ならびにクレアチニンクリアランス）との関連を評価すること、および（３）報告される有害事象、臨床検査評価、理学的検査および心電図により評価されるエプレレノンとロサルタンの安全性および許容度を評価することである。
例えば、人種（黒人、非黒人、日本人等）、性別、年齢、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、高血圧の病歴、心不全の病歴、腎不全の病歴等の因子の基準記録に基づく他のサブグループに関する他の主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−１７：黒人および白人高血圧症患者におけるエプレレノン対プラセボ対ロサルタンの抗高血圧作用および安全性の対照試験
高血圧症黒人患者および高血圧症白人患者におけるエプレレノン対プラセボ対ロサルタンの抗高血圧作用ならびに安全性および許容度を比較するために臨床試験を実施する。この試験では、高血圧は、座位拡張期血圧（ＤＢＰ）＝９５ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍｍＨｇならびに座位収縮期血圧（ＳＢＰ）＜１８０ｍｍＨｇと定義する。この試験は、最小限５００例の軽度から中等度高血圧症を有する黒人および白人患者を対象とする多施設共同、無作為化、二重盲検、プラセボおよび実薬対照、プラセボ予備試験、並行群試験である。各患者を食塩投与一方向試験により食塩感受性について試験する。試験はさらに、１〜２週間の投与前スクリーニング期間に続く、２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間および１６週間の二重盲検投与期間からなる。黒人患者と白人患者は、約２：１の比で試験に参加させ、各センター内で層別化する。単純盲検プラセボ予備試験期間を完了した後、適格患者をエプレレノン、プラセボまたはロサルタンの投与を受けるように無作為化する。
最初の４週間の二重盲検投与期間中に患者にエプレレノン５０ｍｇ、ロサルタン５０ｍｇまたは対応するプラセボを投与する。４、８または１２週目に血圧（ＢＰ）が抑制されていない（ＤＰＢ＝９０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ＝１４０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をエプレレノン１００ｍｇ、ロサルタン１００ｍｇまたは対応するプラセボに増量する。ＢＰコントロールが十分な患者については用量を変更しない。８または１２週目にＢＰが抑制されておらず（ＤＰＢ＝９０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ＝１４０ｍｍＨｇ）、患者がエプレレノン１００ｍｇ、ロサルタン１００ｍｇまたは対応するプラセボの投与を受けている場合、用量をエプレレノン２００ｍｇ、ロサルタン１００ｍｇまたは対応するプラセボに増量する。２、６、１０および１４週目には、当時の用量の十分な効果が得られるための時間を設けるために被験薬の用量の上方調節は行わない。表Ａ−１７Ａに上記の投与スキームを示す。
１２週目またはそれ以後にＢＰが抑制されておらず（ＤＢＰ＝９５ｍｍＨｇまたはＳＢＰ＝１５０ｍｍＨｇ）、患者が最高耐量の投与を受けている場合、彼／彼女の試験を中止する。症候性低血圧症（すなわち、低ＢＰに伴うふらつき感、めまいまたは失神）が試験中いずれかの時点に発生する場合、被験薬は次の低用量に減量してもよいが、患者が被験薬の最低用量（エプレレノン５０ｍｇ、ロサルタン５０ｍｇまたは対応するプラセボ）の投与を受けているか、または試験中いずれかの時点の１〜３日隔たった２回の連続する来院時にＤＢＰ＝１１０ｍＨｇまたはＳＢＰ＝１８０ｍｍＨｇである場合、患者の試験を中止する。患者は合計１６週間にわたり被験薬の投与を受ける。
患者は、０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１７週目に評価を受けるために診療所に再来する。毎回の来院時に心拍数、ＢＰ、血清中カリウム濃度および有害事象を評価する。０、１６および１７週目または最終来院時に安全性に関する血液学および生化学評価ならびに尿検査を行う。さらに、０および１６週目または最終来院時に神経ホルモンプロファイル（血漿レニン［総および活性］、血清アルドステロンおよび血漿コルチゾール）を収集する。０および１６週目または最終来院時にミクロアルブミン尿の測定のためのスポット尿検査を行う。スクリーニング時および１７週目または最終来院時に１２誘導心電図および理学的検査を行う。
この試験の一部として、集団薬物動態を決定する群当たり１００人の患者（全体で３００例）について小試験を実施する。エプレレノンの血漿中濃度の測定のための来院を０日目と３Ａおよび５Ａ来院時に行う。０日目と３Ａおよび５Ａ来院時に２つの７ｍＬ血液試料を採取する。０日目には最初の血液試料を０時間（投与前）に採取し、第二の血液試料は被験薬の初回投与の１時間後に採取する。３Ａおよび５Ａ来院の場合には、患者は朝の診療所に再来する前の彼／彼女の正規に予定された時点に被験薬を服用し、１時間間隔で２つの血液試料を採取する。３Ａおよび５Ａ来院時に、患者は朝１回または午後１回の来院を予定するものとする。
下の概略図に試験プロトコールを示す。
有効性の主要な尺度は、すべての患者（黒人および白人）における１６週目のエプレレノン対プラセボ間の座位谷値カフＤＢＰの基準からの平均変化とする。さらに、有効性を患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に測定する）。主要な安全性終点は、１６週間にわたる重篤な有害事象および重篤でない有害事象、試験中止ならびに臨床検査異常である。
副次的終点は次の通りである。すなわち、（１）１６週目の人種群内および群間のエプレレノン対プラセボ間の座位谷値カフＤＢＰの基準からの平均変化、（２）１６週目の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対ロサルタン間の座位谷値カフＤＢＰの基準からの平均変化、（３）１６週目の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対プラセボまたはロサルタン間の座位谷値カフＳＢＰの基準からの平均変化、（４）１６週目の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対プラセボまたはロサルタン間の尿中アルブミンの対クレアチニン比により測定したミクロアルブミン尿の基準からの平均変化、（６）１６週目の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対プラセボまたはロサルタン間の血清カリウム、マグネシウム、ナトリウム、アルブミンおよびクレアチニンの基準からの平均変化、（７）１６週目の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対プラセボまたはロサルタン間の神経ホルモンプロファイル（血漿レニン［総および活性］、血清アルドステロンおよび血漿コルチゾール）の基準からの平均変化、（８）選択した亜集団、例えば、女性、高齢者（＝６５歳）、肥満体（肥満指数＝３０ｋｇ／ｍ２）、ミクロアルブミン尿症患者（尿中アルブミンの対クレアチニン比＞０．０４１ｍｇアルブミン／ｍｇクレアチニン）および特定の高血圧患者（ＳＢＰ＝１６０ｍｍＨｇ）における神経ホルモン、代謝、腎および抗高血圧作用の全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノン対プラセボまたはロサルタン間の基準からの平均変化、および（９）薬物の見かけのクリアランスに影響を及ぼす患者因子（共変量）に関連するエプレレノンの血漿中濃度時間プロファイル。
この試験の主要な目的は、（１）１６週目に座位拡張期血圧（ＤＢＰ）により測定される軽度から中等度の高血圧症を有するすべての患者（黒人および白人）におけるエプレレノンの抗高血圧作用をプラセボと比較すること、および（２）１６週間の治療中のすべての患者におけるエプレレノンの安全性および許容度をプラセボと比較することである。
この試験の副次的な目的は、（１）ＤＢＰにより測定される黒人および白人高血圧患者内および間のエプレレノンの抗高血圧作用をプラセボと比較すること、（２）ＤＢＰにより測定される全患者ならびに黒人および白人高血圧患者内および間におけるエプレレノンの抗高血圧作用をロサルタンと比較すること、（３）座位収縮期血圧（ＳＢＰ）より測定される全患者ならびに黒人および白人高血圧患者内および間におけるエプレレノンの抗高血圧作用をプラセボまたはロサルタンと比較すること、（４）ミクロアルブミン尿の測定のためのスポット尿により測定される腎に対する作用について全患者ならびに黒人および白人高血圧患者内および間におけるエプレレノンの作用をプラセボまたはロサルタンと比較すること、（５）血清中カリウム、マグネシウム、ナトリウム、アルブミンおよびクレアチニンにより測定される腎に対する作用について全患者ならびに黒人および白人高血圧患者内および間におけるエプレレノンの作用をプラセボまたはロサルタンと比較すること、（６）神経ホルモンプロファイル（血漿レニン［総および活性］、血清アルドステロンおよび血漿コルチゾール）に対する全患者ならびに黒人および白人高血圧患者内および間におけるエプレレノンの作用をプラセボまたはロサルタンと比較すること、（８）選択した亜集団、例えば、ａ）女性、ｂ）高齢者（＝６５歳）、ｃ）肥満体（肥満指数＝３０ｋｇ／ｍ２）、ｄ）ミクロアルブミン尿症患者（ミクロアルブミン尿＞０．０４１ｍｇアルブミン／ｍｇクレアチニン）およびｅ）特定の高血圧患者（ＳＢＰ＝１６０ｍｍＨｇ）における神経ホルモン、代謝、腎および抗高血圧作用に対する全患者ならびに人種群内および群間におけるエプレレノンの作用をプラセボまたはロサルタンと比較すること、および（９）エプレレノンの血漿中濃度時間プロファイルをモデル化し、薬物の見かけのクリアランスに影響を及ぼす患者因子（共変量）を特定することである。
例えば、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、高血圧の病歴、心不全の病歴、腎機能不全の病歴等の因子の基準記録に基づくサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−１８：２型糖尿病、アルブミン尿症および高血圧症を有する患者におけるエプレレノンとエナラプリルの抗高血圧、腎および代謝作用の対照試験
２型糖尿病、アルブミン尿症および高血圧症を有する患者におけるエプレレノンおよびエナラプリルならびに併用の抗高血圧、腎および代謝作用を比較するために臨床試験を実施する。試験は、２型糖尿病、アルブミン尿症および高血圧症を有する最小限２００人の患者を対象とする多施設共同無作為化二重盲検実薬対照プラセボ予備試験並行群試験である。各患者を食塩投与一方向試験により食塩感受性について試験する。試験はさらに、１〜２週間の投与前スクリーニング期間に続く、２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間および２４週間の二重盲検投与期間からなる。単純盲検プラセボ予備試験期間を完了した後、適格患者を、エプレレノン＋プラセボ、エナラプリル＋プラセボまたはエプレレノン＋エナラプリルの３群のうちの１群に無作為化する。最初の２週間の二重盲検投与期間中に患者にエプレレノン５０ｍｇ＋プラセボ、エナラプリル１０ｍｇ＋プラセボまたはエプレレノン５０ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇを投与する。２週目に被験薬の用量を強制的にエプレレノン１００ｍｇ＋プラセボ、エナラプリル２０ｍｇ＋プラセボまたはエプレレノン１００ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇに増量する。４週目に被験薬の用量を強制的にエプレレノン２００ｍｇ＋プラセボ、エナラプリル４０ｍｇ＋プラセボまたはエプレレノン２００ｍｇ＋エナラプリル１０ｍｇに増量する。表Ａ−１８Ａに上記の投与スキームを示す。
８週目に血圧（ＢＰ）が抑制されていない（拡張期ＢＰ［ＤＢＰ］＝９０ｍｍＨｇ）場合、アムロジピン１０ｍｇを最初の非盲検薬剤として追加する。１０週目にＤＢＰが抑制されていない場合、以前に追加しなかったならば、アムロジピン１０ｍｇを追加するか、またはアムロジピン１０ｍｇを以前に追加したならば、ヒドロクロロサイアジン（ＨＣＴＺ）１２．５ｍｇを第二の非盲検薬剤として追加する。１２週目またはその後にＢＰが抑制されていない場合、以前に追加しなかったならば、アムロジピン１０ｍｇを追加するか、またはアムロジピン１０ｍｇを以前に追加し、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを以前に追加しなかったならば、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加するか、またはＨＣＴＺ１２．５ｍｇを以前に追加したならば、ＨＣＴＺの用量を２５ｍｇに増量する。１５週目またがその後にいずれかの来院時に患者が３〜１０日隔たった２回の連続する来院時で変わらない持続的な抑制されていないＤＢＰ＝９５ｍｍＨｇを示し、患者が上記のようなすべての追加非盲検薬剤の投与を受けていた場合、患者の試験を中止する。
症候性低血圧が発生し、患者が非盲検追加薬剤の投与を受けている場合、低血圧が消失するまで、追加薬剤を追加したときと逆の順序で使用を中止してよい。患者が非盲検薬剤を服用していない場合、彼／彼女の試験を中止しなければならない。
試験中のいずかの時点に、ＤＢＰ＝１１０または収縮期ＢＰ［ＳＢＰ］＝１８０ｍｍＨが３〜１０日隔たった２回の連続する来院時に持続しているか、または反復測定（試料を分割し、現地および中央検査施設に送付）で血清中カリウム濃度が高い（＞５．５ｍＥｑ／Ｌ）場合、患者の試験を中止する。
患者は、０、２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２１、２４および２５週目に評価のために診療所に再来するものとする。毎回の来院時に心拍数、ＢＰ、体重、血清カリウムおよび有害事象を評価する。０、４、６、８、１０、１５、１８、２１、２４および２５週目に安全性に関する血液学および生化学評価ならびに尿検査を行う。０、８、１５および２４週目にコラーゲンマーカー（ＩＩＩ型コラーゲンのアミノ末端プロペプチド［ＰＩＩＩＮＰ］、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン［７ＳＩＶＣ］およびＩ型コラーゲンテロペプチド［ＩＣＴＰ］）、線維素溶解バランス（プラスミノーゲン活性化因子抑制物質［ＰＡＩ−１］および組織プラスミノーゲン活性化因子［ｔ−ＰＡ］）、インスリンおよびグリコシル化ヘモグロビンを測定する。０、８、１５および２４週目に薬物経済データを収集する。０、８、および２４週目に２４時間蓄尿によるアルブミン尿を測定する。スクリーニング時および２５週目に１２誘導心電図および理学的検査を行う。０週目に遺伝型、腰周り、血漿レニン（総および活性）および血清アルドステロンを測定する。
以下の概略図に試験プロトコールを示す。
有効性の主要な尺度は、２４週目のエプレレノンおよびエナラプリルまたは併用の間の尿中アルブミン排泄量の基準からの変化である。さらに、有効性を患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に測定する）。
有効性の副次的尺度は次の通りである。すなわち、（１）８および２４週目のエプレレノンおよびエナラプリルまたは併用の間の座位谷値カフＤＢＰ（「ｓｅＤＢＰ」）およびＳＢＰ（ｓｅＳＢＰ）の基準からの平均変化、（２）２４週目のエプレレノンおよびエナラプリルまたは併用の間のコラーゲンマーカー（ＰＩＩＩＮＰ、７ＳＩＶＣおよびＩＣＴＰ）、線維素溶解バランス（ＰＡＩ−１およびｔ−ＰＡ）および代謝作用（インスリン、グリコシル化ヘモグロビン、空腹時血清ブドウ糖および脂質［トリグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロール］）の基準からの平均変化、（３）遺伝子型、基準躯幹肥満、基準血漿中レニン濃度（総および活性）または基準血清中アルドステロン濃度に起因するエプレレノンおよびエナラプリルまたは併用の間の抗高血圧、代謝または尿中アルブミン排泄反応の基準からの平均変化、および（４）安全性および許容度を有害事象、臨床検査値、理学的検査、バイタルサインおよび心電図により評価する。
この二重盲検実薬対照試験は、ＮＩＤＤＭおよびアルブミン尿症を有する高血圧患者のインスリン抵抗性、血糖コントロール、腎機能および脂質プロファイルに対するエプレレノンの正味の効果をエナラプリルと比較して検討するためにデザインされている。この試験の主要な目的は、エプレレノン対エナラプリルまたは併用により治療した患者における２４週目の尿中アルブミン排泄の基準からの平均変化を比較することである。この試験の副次的目的は、（１）８および２４週目のエプレレノン対エナラプリルまたは併用の谷値カフｓｅＤＢＰおよびｓｅＳＢＰの基準からの平均変化に対する効果を比較すること、（２）２４週目のコラーゲンマーカー（ＩＩＩ型コラーゲンのアミノ末端プロペプチド［ＰＩＩＩＮＰ］、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン［７ＳＩＶＣ］およびＩ型コラーゲンテロペプチド［ＩＣＴＰ］）、線維素溶解バランス（プラスミノーゲン活性化因子抑制物質［ＰＡＩ−１］、組織プラスミノーゲン活性化因子［ｔ−ＰＡ］）および代謝作用（インスリン、グリコシル化ヘモグロビン、空腹時血清ブドウ糖および脂質［トリグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロール］）の基準からの平均変化により測定されるエプレレノン対エナラプリルまたは併用の作用を比較すること、（３）遺伝子型、基準躯幹肥満（腰周り）、基準血漿中レニン濃度（総および活性）または基準血清中アルドステロン濃度に起因するエプレレノン対エナラプリルまたは併用の抗高血圧、代謝または尿中アルブミン排泄反応の基準からの平均変化の差を測定し、報告される有害事象、臨床検査値、理学的検査、バイタルサインおよび心電図により評価されるエプレレノン対エナラプリルまたは併用の安全性および許容度を比較することである。
例えば、人種（黒人、非黒人、日本人等）、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、心不全の病歴等の因子の基準記録に基づくサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−１９：高収縮期血圧を有する患者におけるエプレレノン対アムロジピンの抗高血圧作用の対照試験
収縮期高血圧を有する患者におけるエプレレノン対アムロジピンの作用を比較するために臨床試験を実施する。これは、１）座位収縮期血圧（ＳＢＰ）＝１５０ｍｍＨｇおよび＜１６５ｍｍＨｇならびに脈圧（ＰＰ）＝７０ｍｍＨｇ、または２）ＳＢＰ＝１６５ｍｍＨｇおよび＜２００ｍｍＨｇならびに座位拡張期血圧（ＤＢＰ）＜９５ｍｍＨｇと定義される収縮期高血圧を有する最小限２００例の無作為化患者を対象とする多施設共同、無作為化、二重盲検、実薬対照、プラセボ予備試験、並行試験である。各患者を食塩投与一方向試験により食塩感受性について試験する。試験はさらに、１〜２週間の投与前スクリーニング期間に続く、２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間および２４週間の二重盲検投与期間からなる。単純盲検プラセボ予備試験期間を完了した後、適格患者を、エプレレノンまたはアムロジピンのいずれかの投与を受けるように無作為化する。患者に最初の２週間の二重盲検投与期間中エプレレノン５０ｍｇまたはアムロジピン２．５ｍｇを投与する。２週目にＳＢＰが抑制されていない（ＳＢＰ＝１４０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をエプレレノン１００ｍｇまたはアムロジピン５ｍｇに１用量レベル増量する。十分なＢＰコントロールを有する患者については、用量を変更しない。６週目またはその後にＳＢＰが抑制されていない（ＳＢＰ＝１４０ｍｍＨｇ）場合、２週目に増量しなかったならば、被験薬の用量をエプレレノン１００ｍｇまたはアムロジピン５ｍｇに、または２週目に既に増量したならば、エプレレノン２００ｍｇまたはアムロジピン１０ｍｇに１用量レベル増量する。十分なＳＢＰコントロールを有する患者については、用量を変更しない。１０週目またはその後に、１〜３日隔たった２回の連続する来院時にＳＢＰが１７０ｍｍＨｇで、患者が最高用量の被験薬の投与を受けている場合、彼／彼女の試験を中止しなければならない。患者は合計２４週間にわたり二重盲検被験薬投与を受けるものとする。表Ａ−１９Ａに上記の投与スキームを示す。
症候性低血圧症（ＳＨ）（すなわち、低ＢＰに伴うふらつき感、めまいまたは失神）が試験中いずれかの時点に発生し、患者が被験薬の最低用量の投与を受けていない場合、患者は用量漸減処置を受けることができる。ＳＨが被験薬の最低用量で発生する場合、患者の試験を中止しなければならない。
試験中のいずれかの時点に、１〜３日隔たった２回の連続する来院時にＳＢＰ＝２００ｍｍＨｇまたはＤＢＰ＝１１０ｍｍＨｇである場合、患者を撤退させなければならない。患者は合計２４週間の二重盲検被験薬投与を受けるものとする。
患者は０、２、６、１０、１４、１９、２４および２５週目に評価のために診療所に再来するものとする。毎回の来院時に心拍数、ＢＰ、血清中カリウム濃度、併用薬および有害事象を評価する。０、２４および２５週目に安全性に関する血液学および生化学評価ならびに尿検査を実施する。０、１４および２４週目または最終来院時に、特殊試験、すなわちコラーゲンマーカー［ＩＩＩ型コラーゲンのアミノ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（７ＳＩＶＣ）およびＩ型コラーゲンテロペプチド（ＩＣＴＰ）］、血漿活性化因子抑制物質（ＰＡＩ−１）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、微小アルブミン尿、ならびに選択した施設における、携帯型血圧測定（ＡＢＰＭ）および銅脈コンプライアンスを実施する。２Ａ来院時（単純盲検の開始）と０、１４および２４週目または最終来院時に、生活の質質問票調査を行う。ＤＮＡの遺伝子型決定は、基準で行う。スクリーニング時、２５週目または最終来院時に、１２誘導心電図および理学的検査を行う。
以下の概略図に試験プロトコールを示す。
有効性の主要な尺度は、２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の座位カフＳＢＰ谷値の基準からの平均変化である。副次的評価項目は次の通りである。すなわち、（１）２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の脈圧（ＳＢＰ−ＤＢＰ）の基準からの平均変化、（２）２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の座位カフ拡張期ＢＰ（ＤＢＰ）谷値の基準からの平均変化、（３）２４週目のＡＢＰＭ記録により測定されるエプレレノン対アムロジピン間の心拍数（ＨＲ）、ＰＰ、ＳＢＰおよびＤＢＰの基準からの平均変化、（４）２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の動脈コンプライアンスの基準からの平均変化、（５）２４週目のエプレレノン対アムロジピン間のＰＡＩ−１、ｔ−ＰＡおよびコラーゲンマーカーの基準からの平均変化、（６）２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の尿中アルブミンの対クレアチニン比により測定されるミクロアルブミン尿の基準からの平均変化、（７）遺伝型に関連するエプレレノンおよびアムロジピンに対する反応、（８）エプレレノン対アムロジピンの安全性および許容度、および（９）１４および２４週目のエプレレノン対アムロジピン間の生活の質の評価の基準からの平均変化。
さらに、有効性（上の項目１から９）を患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に測定する）。
収縮期高血圧を有する集団におけるこの試験は、エプレレノンの抗高血圧作用をアムロジピン治療と比較して検討し、エプレレノン治療とアムロジピン治療での生活の質を比較し、高齢者におけるエプレレノンとアムロジピンの副作用プロファイルを比較し、２群における動脈コンプライアンス、血漿活性化因子阻害物質（ＰＡＩ−１）およびコラーゲン代謝のマーカーを評価するために設計されている。この試験の主要な目的は、２４週目の座位カフＳＢＰ谷値の基準からの平均変化により測定されるＳＢＰに対するエプレレノンとアムロジピンの作用を比較することである。この試験の副次的な目的は、（１）２４週目の脈圧（ＳＢＰ−ＤＢＰ）の基準からの平均変化に基づきエプレレノンとアムロジピンの作用を比較すること、（２）２４週目の座位カフＤＢＰ谷値の基準からの平均変化により測定されるエプレレノンとアムロジピンの抗高血圧作用を比較すること、（３）２４週目にエプレレノンとアムロジピンとをＡＢＰＭ記録、ＨＲ、ＰＰ、ＳＢＰおよびＤＢＰの基準からの平均変化により比較すること、（４）２４週目の基準からの平均変化により測定される動脈コンプライアンスに対するエプレレノンとアムロジピンの作用を比較すること、（５）２４週目の基準からの平均変化により測定されるＰＡＩ−１、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびコラーゲンマーカー［ＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（７ＳＩＶＣ）およびＩ型コラーゲンテロペプチド（ＩＣＴＰ）］に対するエプレレノンとアムロジピンの作用を比較すること、（６）２４週目の基準からの平均変化により測定される尿中アルブミンの対クレアチニン比として表されるミクロアルブミン尿に対するエプレレノンとアムロジピンの作用を比較すること、（７）遺伝型に関連するエプレレノンとアムロジピンに対する反応を比較すること、（８）２４週間の治療中の報告される有害事象、臨床検査値、理化学的検査、バイタルサインおよび心電図により評価されるエプレレノンとアムロジピンの安全性および許容度を比較すること、および（９）１４および２４週目の基準からの平均変化により評価される生活の質に関連する患者の健康に対するエプレレノンとアムロジピンの影響を比較することである。
例えば、人種（黒人、非黒人、日本人等）、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、心不全の病歴、腎機能不全の病歴等の因子の基準記録に基づく他のサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−２０：症候性心不全を有する患者におけるエプレレノン対プラセボの用量範囲試験
現在ＡＣＥ阻害薬およびループ利尿薬による治療を受けている心不全の患者における一連の用量のエプレレノンの安全性および許容度を評価し、神経ホルモン機能に対するそれらの作用を評価し、それら薬剤が徴候と症状を改善する可能性を評価するために臨床試験を行う。さらに、上のパラメーターのそれぞれを患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に決定する）。この試験は、エプレレノン対プラセボの３種の１日投与量を評価する無作為化二重盲検多施設共同プラセボ対照並行群試験である。この試験では少なくとも１００人の患者を登録する。各患者を食塩投与一方向試験により食塩感受性について評価する。
試験集団は、参加時に心駆出率＝４０％およびニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類ＩＩ〜ＩＶを有する症候性心不全患者である。試験に適格な患者は次の投与のうちの１つを受ける。すなわち、１２週間にわたるエプレレノン２５ｍｇＱＤ、５０ｍｇＱＤ、１００ｍｇＱＤまたはプラセボ。神経ホルモンの評価のための尺度は、Ｎ末端心房性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ末端ＡＮＰ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰおよびプロＢＮＰ）、血漿レニン（総および活性）ならびに血漿および尿アルドステロンの測定値である。患者の徴候および症状の評価は、ＮＹＨＡ機能分類を用いて行う。安全性は、高カリウム血症および症候性低血圧、他の有害事象および臨床検査異常の発生率の評価により評価する。この試験は、エプレレノン投与とプラセボ投与との間の神経ホルモンレベルならびに臨床的徴候および症状の重大な変化の差を検出するように構成されている。
この試験の主要な目的は、（１）現在ＡＣＥ阻害薬およびループ利尿薬による治療を受けている心不全患者における一連の用量のエプレレノンの安全性および許容度を評価し、（２）現在ＡＣＥ阻害薬およびループ利尿薬による治療を受けている心不全患者における神経ホルモン機能の尺度［Ｎ末端心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびそのプロ形（プロＢＮＰ）、血漿および尿アルドステロンならびに血漿レニン（総および活性）］に対する投与した一連の用量のエプレレノンの作用を評価し、（３）ＮＹＨＡ機能分類の基準からの変化により評価されるＨＦの徴候および症状を改善する点について１２週間にわたって投与した一連の用量のエプレレノンの有効性を評価することである。この試験の副次的目的は、（１）心拍数（ＨＲ）、ＢＰおよび体重に対するＡＣＥ阻害薬およびループ利尿薬と併用投与する一連の用量のエプレレノンの作用を評価し、（２）エプレレノンと併用投与したときのＡＣＥ阻害薬およびループ利尿薬の投与の変更に対するエプレレノンの影響を評価することである。
以下の概略図に試験プロトコールを示す。
患者が被験薬に対して不耐性になった場合、被験薬の用量の調節の前に、併用薬（例えば、カリウム補給剤、ＡＣＥ−Ｉ等）の用量の変更を考慮すべきである。試験中のいずれかの時点に血清中カリウム濃度が＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬を一時的に差し控える。血清中カリウム濃度が持続的に＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、患者に被験薬を中止させるべきである。＜６．０ｍＥｑ／Ｌの高いナトリウム濃度が認められる場合、もしあるならば、カリウム補給剤を停止し、患者に被験薬を投与し続けるべきである。被験薬を中止する場合、併用薬を検討し、可能ならば、臨床試験の実施に関する基準に従って用量を調節すべきである。
表Ａ−２０Ａに、血清中カリウム濃度に対する必要な投与変更について要約する。血清カリウムは、投与開始後１週間以内に、また、用量の変更後１週間以内に測定する。試験中のいずれかの時点に血清カリウムが＞５．５ｍＥｑ／Ｌとなった場合、被験薬の用量を次の低用量レベル、すなわち、１錠ＱＤから１錠ＱＯＤに、または１錠ＱＯＤから一時的に中止へと減量する。血清カリウムが＜５．５ｍＥｑ／Ｌとなった場合、被験薬投与を１錠ＱＯＤで再開し、表Ａ−２０Ｂに示すスキームに従って増量する。カリウムの上昇が擬似的である（溶血またはカリウム補給剤による最近の投与に起因する）と考えられた場合、カリウム濃度の測定を繰り返してもよい。
例えば、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、高血圧の病歴、腎不全の病歴のような因子の基準記録に基づく他のサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−２１：軽度から中等度高血圧症の治療における一連の用量のエプレレノンの有効性および安全性の評価
３種の総１日投与量（５０、１００および２００ｍｇ）のエプレレノンの安全性と有効性をプラセボと比較して評価するために、多施設共同無作為化二重盲検プラセボ対照並行群試験を実施する。試験は、現在の降圧薬のウォッシュアウトおよびスクリーニング処置の完了のための２週間の投与前期間からなっている。各患者を、ウォッシュアウトの後に食塩投与一方向試験により食塩感受性について試験する。食塩感受性試験に続く４週間の単純盲検プラセボ予備試験投与の後に、８週間の二重盲検実薬対プラセボ投与期間に無作為化する。表Ａ−２１Ａに上記の投与スキームを示す。
試験中のいずれかの時点に症候性低血圧（ＳＨ）、すなわち、低血圧（ＢＰ）に伴うふらつき感、めまいまたは失神が発生した場合、患者に試験を中止しなければならない。二重盲検投与期間中のいずれかの時点に、１〜３日隔たった２回の連続する来院時の収縮期血圧（ＳＢＰ）＝１８０ｍｍＨｇまたは拡張期血圧（ＤＢＰ）＝１１０ｍｍＨｇである場合、患者の試験を中止しなければならない。試験中のいつでも、１〜３日隔たった２回の連続する来院時の反復測定（試料を分割し、現地および中央検査施設に送付し、治療上の決定は現地の測定値に基づく）で血清中カリウム濃度が高い（＞５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）場合、患者の試験を中止する。
主要な有効性尺度は、プラセボと比較した谷値で測定したカフＤＢＰの基準からの変化である。副次的有効性尺度は、カフ評価ＳＢＰ谷値の変化、ならびに携帯型ＢＰ測定により評価した平均２４時間ＤＢＰおよびＳＢＰの変化（選択した治験施設においてのみ実施）などである。８週間の投与後の神経ホルモン（血漿レニン、血清アルドステロン）の変化も副次的有効性尺度である。有効性はまた患者の三分位値による食塩感受性の程度に関して評価する（三分位値は食塩投与に対する血圧反応の増加により経験的に決定する）。
この試験の主要な目的は、カフＤＢＰ谷値の測定値の基準からの変化を用いて、軽度から中等度高血圧症患者に８週間投与したときの１日投与量５０、１００および２００ｍｇのエプレレノンの抗高血圧作用をプラセボと比較して評価することである。プラセボと比較したエプレレノンの８週間の投与後のこの試験の副次的な目的は、（１）カフＳＢＰ谷値の基準からの変化を評価すること、（２）携帯型血圧測定（ＡＢＰＭ）を用いてプラセボと比較してエプレレノンの２４時間抗高血圧作用を検討すること、（３）血漿中レニンと血清中アルドステロンの濃度変化を評価すること、（４）報告される有害事象、臨床検査値、理学的検査、バイタルサインおよび心電図により評価される抗高血圧療法用のエプレレノンの安全性と許容度を確認することである。
以下の概略図に試験プロトコールを示す。
例えば、性別、年齢、血漿中レニン濃度、アルドステロン／レニン活性比、尿中ナトリウム対カリウム比、糖尿病の存在、心不全の病歴、腎不全の病歴のような因子の基準記録に基づく他のサブグループに関する主要および副次的有効性尺度のサブグループ解析を行うことができる。年齢のような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−２２：急性心筋梗塞後の心不全を有する患者におけるエプレレノンの安全性および有効性
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の心不全（ＨＦ）を有する患者において、すべての原因による死亡の発生率に対するエプレレノン＋標準療法とプラセボ＋標準療法の影響を比較するために臨床試験を行う。副次的評価項目は、心血管罹病率および死亡率などである。この試験は、平均約２．５年間にわたり追跡する約６２００人の患者を必要とすると推定される、１０１２例の死亡が発生するまで継続する多施設共同無作為化二重盲検プラセボ対照２群並行群試験である。
この試験に適格な患者は、（１）（ａ）異常な心臓酵素（クレアチンホスホキナーゼ［ＣＰＫ］＞２×正常範囲の上限［ＵＬＮ］および／またはＣＰＫ−ＭＢ＞総ＣＰＫの１０％）および（ｂ）ＭＩの徴候を示す心電図（ＥＣＧ）（病的Ｑ波の存在を伴う、または伴わない、ＡＭＩと一致するＳＴ部分およびＴ波の進行性変化）の発生により実証されるＡＭＩ（指数事象）、および（２）ＡＭＩの後、無作為化の前に測定されたＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）＝４０％により実証される左室（ＬＶ）機能不全、および（３）次の少なくとも１つにより実証されるＨＦの臨床的証拠、すなわち、（ａ）肺浮腫（重大な慢性肺疾患の非存在下の肺野の少なくとも１／３に及ぶ両側性咳後水泡音）または（ｂ）間質または肺胞浮腫を伴う肺静脈うっ血を示す胸部Ｘ線または（ｃ）持続性頻脈（＞１００拍／分）を伴う第３心音（Ｓ３）の聴診証拠を有する。適格患者は、救急外来評価および推定に基づくＨＦを伴うＡＭＩの診断の後に随時含めるために特定する。この試験に適格であるとされる患者は、臨床状態が安定である場合、すなわち、昇圧薬、変力性薬、大動脈内バルーンポンプ、低血圧（収縮期血圧［ＳＢＰ］＜９０ｍｍＨｇ）または急性冠動脈造影につながる多復性胸痛が存在しない場合、ＡＭＩ後３（＞４８時間）〜１０日に無作為化する。心臓除細動器が植え込まれている患者は除外する。
患者は、ＡＣＥ阻害薬、利尿薬、硝酸塩およびβ遮断薬を含んでいてよい標準療法を受け、抗凝固薬および抗血小板薬の投与を受けてよく、また、血栓溶解薬の投与または緊急血管形成術を受けることができる。患者は、エプレレノン２５ｍｇＱＤ（１日１回）またはプラセボの投与を受けるように無作為化する。４週目に、血清カリウムが＜５．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬の用量を５０ｍｇＯＤ（２錠）に増量する。試験中のいずれかの時点に血清カリウムが＞５．５ｍＥｑ／Ｌで、＜６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬の用量を次の低用量レベル、すなわち、５０ｍｇＱＤから２５ｍｇＱＤ（１錠）に、２５ｍｇＱＤから２５ＱＯＤ（１日おき）に、または２５ｍｇＱＯＤから一時的に中止に、減量する。試験中のいずれかの時点に血清カリウムが＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬投与を一時的に中止すべきであり、血清カリウムが＜５．５ｍＥｑ／Ｌであるときに２５ｍｇＱＯＤで再開することができる。試験中のいずれかの時点に血清カリウムが持続的に＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬投与を永久に中止すべきである。患者が被験薬に対して不耐性となった場合、被験薬の用量の調節の前に併用薬の用量の変更を考慮すべきである。血清カリウムは、投与開始４８時間後、１および５週目、他のすべての予定の試験来院時、および用量の変更後１週間以内に測定する。
試験来院は、スクリーニング時、基準（無作為化）、１および４週、３カ月、その後は試験終了時まで３カ月ごとに行う。病歴聴取、心臓酵素、キリップ分類、再灌流までの時間（該当する場合）、ＡＭＩおよびＨＦの記録、ＬＶＥＦの測定、妊娠の可能性のある女性に対する血清妊娠検査をスクリーニング時に行う。理学的検査および１２誘導ＥＣＧをスクリーニング時と最終来院時（被験薬の停止）に行う。安全性に関する血液学および生化学評価ならびに尿検査をスクリーニング時、４週目、３および６カ月目、その後は試験終了時まで６カ月ごとに行う。ＤＮＡ分析のための追加の血液試料をスクリーニング時に採取する。バイタルサイン（座位心拍数およびＢＰ）、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類、有害事象および選択される併用薬を毎回の来院時に記録する。生活の質評価は、スクリーニング時、４週目、３、６および１２カ月目ならびに最終来院時に記入させる。すべての無作為化患者を試験終了時まで３カ月ごとに評価項目について追跡する。
下の概略図に試験プロトコールを示す。
主要な評価項目は、すべての原因による死亡である。試験は、すべての原因による死亡の１８．５％の減少を検出するように構成され、試験終了までに１０１２例の死亡を必要とする。副次的評価項目は、（１）心血管死、（２）突然死、（３）進行性心不全に起因する死亡、（４）すべての原因による入院、（５）心血管入院、（６）心不全入院、（７）すべての原因による死亡およびすべての原因による入院、（８）心血管死および心血管入院、（９）心血管死および心不全入院、（１０）新規の心房細動の診断、（１１）多復性非致命的ＡＭＩおよび致命的ＡＭＩのための入院、（１２）脳卒中のための入院、および（１３）生活の質である。
この試験の主要な目的は、ＡＭＩ後のＨＦを有する患者におけるすべての原因による死亡の発生率に対するエプレレノン＋標準療法とプラセボ＋標準療法の影響を比較することである。この試験の副次的な目的は、（１）心血管死、（２）突然死、（３）進行性心不全に起因する死亡、（４）すべての原因による入院、（５）心血管入院、（６）心不全入院、（７）すべての原因による死亡およびすべての原因による入院、（８）心血管死および心血管入院、（９）心血管死および心不全入院、（１０）新規の心房細動の診断、（１１）多復性非致命的ＡＭＩおよび致命的ＡＭＩのための入院、（１２）脳卒中のための入院、および（１３）生活の質などについて２投与群を比較することである。
患者に治療の最初の４週間はエプレレノン２５ｍｇＱＤまたはプラセボ（１錠）を投与する。４週目に、血清カリウムが＜５．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬の用量を５０ｍｇＱＤ（２錠）に増量する。４週目に血清カリウムが＝５．０ｍＥｑ／Ｌであるが、５週目に＜５．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬の用量を５０ｍｇＱＤ（２錠）に増量する。この場合、血清カリウムを６週目に検査する。
表Ａ−２２Ａに血清中カリウム濃度に対する義務付けられる用量の変更を要約する。血清カリウムは、投与開始４８時間後、１および５週目、ならびに用量の変更後１週間以内に測定する。試験中のいずれかの時点に血清カリウムが＞５．５ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬の用量を次の低用量レベル、すなわち、５０ｍｇＱＤから２５ｍｇＱＤに、２５ｍｇＱＤから２５ｍｇＱＯＤに、または２５ｍｇＱＯＤから一時的に中止に、減量する。血清カリウムが＜５．５ｍＥｑ／Ｌであるときに、被験薬投与を２５ｍｇＱＯＤで再開し、表Ａ−２２Ａに示すスキームに従って増量すべきである。カリウムの上昇が擬似的である（溶血またはカリウム補給剤による最近の投与に起因する）と考えられた場合、カリウム濃度の測定を繰り返してもよい。
患者が被験薬に対して不耐性になった場合、被験薬の用量の調節の前に、併用薬（例えば、カリウム補給剤、ＡＣＥ−Ｉ等）の用量の変更を考慮すべきである。試験中のいずれかの時点に血清中カリウム濃度が＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、被験薬を一時的に差し控える。血清中カリウム濃度が持続的に＝６．０ｍＥｑ／Ｌである場合、患者に被験薬を中止させるべきである。＜６．０ｍＥｑ／Ｌの高いカリウム濃度が認められる場合、もしあるならば、カリウム補給剤を停止し、患者は被験薬の投与を受け続けるべきである。被験薬を中止する場合、併用薬を検討し、可能ならば、臨床試験の実施に関する基準に従って用量を調節すべきである。
主要および副次的評価項目のサブグループ解析を行う。サブグループは、人種（黒人、非黒人）、性別、年齢、糖尿病の存在、駆出率、血清カリウム、血清クレアチニン、β遮断薬の使用、ジゴキシンの使用、カリウム補給剤の使用、最初対その後のＡＭＩ、キリップ（ｋｉｌｌｉｐ）分類、再灌流状態、高血圧の病歴、ＨＦの病歴、喫煙歴、狭心症の病歴、指数ＡＭＩから無作為化までの時間および地理上の区分の基準記録に基づくものとする。年齢、駆出率、血清カリウムおよび血清クレアチニンのような連続尺度に基づくサブグループは、中央値で二分することができる。
実施例Ａ−２２：内皮機能不全を予防または治療するためのエプレレノン
仰臥位での安静の２０分後に、局所麻酔下で非優性上腕動脈にカニューレを挿入した。生理食塩水の注入の３０分後に、前腕静脈閉塞容積変動記録法により基準前腕血流量を測定した。次いで、定速注入器で薬剤を試験腕に注入する。前腕血流量は、各基準時と毎回の薬剤注入の最後の２分に測定する。血圧は、注入を行わない（対照）腕で試験中規則的な時間間隔で行う。
薬剤注入 最初にアセチルコリン（内皮依存性血管拡張物質）を２５、５０および１００ｍモル／分でそれぞれ５分間にわたり注入する。これに続いて、ニトロプルシドナトリウム（内皮非依存性血管拡張物質）を４．２、１２．６および３７．８ｎモル／分でそれぞれ５分間にわたり、次いで、Ｎ−モノエチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、競合的ＮＯ合成阻害物質）を１、２および４μモル／分でそれぞれ５分間にわたり注入する。これに続いて、アンジオテンシンＩ（アンジオテンシンＩＩへの変換によってのみ血管収縮物質）を６４、２５６および１０２４ｐモル／分でそれぞれ７分間にわたり注入する。異なる薬剤の間に、薬剤注入を２０〜３０分間生理食塩水でフラッシュし、前腕血流量が基準値に戻るのに十分な時間をおく。
結果 エプレレノンはアセチルコリンに対する前腕血流反応を有意に増大させ（前腕血流量の変化率）、Ｌ−ＮＭＭＡに起因する血管収縮の随伴する増大を伴うと予想される。さらに、アンジオテンシンＩ反応もエプレレノンにより有意に減少し、アンジオテンシンＩＩ反応は変化しないと予想される。この試験はさらに、アルドステロンが心不全患者における内皮機能不全に関連し、ＮＯ生物活性を低下させることを示す。さらに、エプレレノンはそのような機能不全と結果として起こる他の病理変化を予防すると予想される。
Ｂ．組成実施例
以下の例は、本発明の態様を例示するものであるが、限定するものと解釈すべきではない。データを得るために用いた実験手順は、以下でより詳細に述べる。これらの実施例において用いた記号および表記法は、最近の薬理学文献で用いられているものと一致している。特に断らない限り、（ｉ）これらの実施例に示すすべての％は、総組成物重量に基づく重量％であり、（ｉｉ）カプセル剤の総組成物重量は、総カプセル充填重量であって、用いた実際のカプセルの重量を含まず、（ｉｉｉ）コーティング錠は、Ｏｐａｄｒｙ Ｗｈｉｔｅ ＹＳ−１−１８０２７Ａのような従来のコーティング材料でコーティングされており、コーティングの重量分率はコーティング錠の総重量の約３％である。
実施例Ｂ−１
経口剤は、ふるい分けし、次いで、下記の成分と以下に示す量で混合して調製することができる。次いで、この用量を硬ゼラチンカプセルに入れる。
成分 量
エプレレノン １２．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
実施例Ｂ−２
経口剤は、１０％ゼラチン溶液と混合して果粒化することにより調製することができる。湿潤果粒をふるい分けし、乾燥し、デンプン、タルクおよびステアリン酸と混合し、ふるい分けし、錠剤に圧縮成形する。
成分 量
エプレレノン １２．５ｍｇ
硫酸カルシウム二水和物 １００ｍｇ
ショ糖 １５ｍｇ
デンプン ８ｍｇ
タルク ４ｍｇ
ステアリン酸 ２ｍｇ
実施例Ｂ−３
経口剤は、ふるい分けし、次いで、下記の成分と以下に示す量で混合して調製することができる。次いで、この用量を硬ゼラチンカプセルに入れる。
成分 量
エプレレノン １２．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
実施例Ｂ−４
経口剤は、１０％ゼラチン溶液と混合して果粒化することにより調製することができる。湿潤果粒をふるい分けし、乾燥し、デンプン、タルクおよびステアリン酸と混合し、ふるい分けし、錠剤に圧縮成形する。
成分 量
エプレレノン １２．５ｍｇ
硫酸カルシウム二水和物 １００ｍｇ
ショ糖 １５ｍｇ
デンプン ８ｍｇ
タルク ４ｍｇ
ステアリン酸 ２ｍｇ
実施例Ｂ−５：２５ｍｇ用量即放性錠剤
以下の組成を有する２５ｍｇの用量の即放性錠剤（錠剤直径０．３３７ｃｍ（７／３２”））を調製した。
実施例Ｂ−６：５０ｍｇ用量即放性錠剤
以下の組成を有する５０ｍｇの用量の即放性錠剤（錠剤直径０．３９４ｃｍ（９／３２”））を調製した。
実施例Ｂ−７：１００ｍｇ用量即放性錠剤
以下の組成を有する１００ｍｇの用量の即放性錠剤（錠剤直径０．５７８ｃｍ（１２／３２”））を調製した。
実施例Ｂ−８：１０ｍｇ用量即放性カプセル剤
以下の組成を有する１０ｍｇの用量の即放性カプセル処方を調製した。
実施例Ｂ−９：２５ｍｇ用量即放性カプセル剤
以下の組成を有する２５ｍｇの用量の即放性カプセル処方を調製した。
実施例Ｂ−１０：５０ｍｇ用量即放性カプセル剤
以下の組成を有する５０ｍｇの用量の即放性カプセル処方を調製した。
実施例Ｂ−１１：１００ｍｇ用量即放性カプセル剤
以下の組成を有する１００ｍｇの用量の即放性カプセル処方を調製した。
実施例Ｂ−１２：２００ｍｇ用量即放性カプセル剤
以下の組成を有する２００ｍｇの用量の即放性カプセル処方を調製した。
Ｃ．固体状態実施例
以下の実施例は、本願書に記載する種々の固体状態の形のエプレレノンの調製方法の詳細な記述を含む。これらの詳細な記述は、本発明の範囲内にあり、本発明を例示する役割を果たす。これらの詳細な記述は、例示のために示したものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。特に示さない限り、すべての部は重量単位で示し、温度はセ氏で示す。以下の各実施例で用いたエプレレノン出発原料は、Ｎｇ等による国際出願公開第９８／２５９４８号に記載されているスキーム１に従って調製された。
実施例Ｃ−１：（ａ）高純度エプレレノン出発原料からのメチルエチルケトン溶媒和物および（ｂ）得られた溶媒和物からのＦｏｒｍ Ｌ結晶性エプレレノンの調製
Ａ．メチルエチルケトン溶媒和物の調製
高純度エプレレノン（４３７ｍｇ、純度９９％以上、０．２％未満のジエポキシドおよび１１，１２−エポキシドが存在）をメチルエチルケトン１０ｍＬに９００ｒｐｍで磁気撹拌しながらホットプレート上で沸騰するまで加熱して溶解した。得られた溶液を連続的に磁気撹拌しながら室温に冷却した。室温になった後、溶液を１℃の浴に移し、１時間撹拌する。１時間後、真空濾過により固体メチルエチルケトン溶媒和物を収集する。
Ｂ．Ｆｏｒｍ Ｌ結晶性エプレレノンの調製
上の段階Ａで調製したメチルエチルケトン溶媒和物をオーブン中１００℃で大気圧下で４時間乾燥する。乾燥固体は、ＤＳＣおよびＸＰＲＤ分析により純粋なＦｏｒｍ Ｌであると判断された。
実施例Ｃ−２：高純度エプレレノン出発原料からの追加の溶媒和物の調製
次の溶媒、ｎ−プロパノール、２−ペンタノン、酢酸、アセトン、酢酸ブチル、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、酢酸イソブチル、イソプロパノール、酢酸メチル、プロピオン酸エチル、ｎ−ブタノール、ｎ−オクタノール、酢酸プロピル、プロピレングリコール、ｔ−ブタノール、テトラヒドロフランおよびトルエンのうちの１つをメチルエチルケトンの代わりに用い、実施例Ｃ−１の段階Ａで上述したのと実質的に同様に結晶化を行って、追加の溶媒和結晶形を調製した。Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンが、実施例Ｃ−１の段階Ｂで上述したのと実質的に同様に溶媒和物のそれぞれから生成した。
実施例Ｃ−３：蒸気拡散成長によるメチルエチルケトン溶媒和物の調製
エプレレノン（４００ｍｇ、純度９９．９％以上）を２０ｍＬのメチルエチルケトンにホットプレート上で加温して溶解して、保存溶液を調製した。８ｍＬの保存溶液を第１の２０ｍＬシンチレーションバイアルに移し、メチルエチルケトンで１０ｍＬに希釈した（８０％）。１０ｍＬの保存溶液を第２の２０ｍＬシンチレーションバイアルに移し、メチルエチルケトンで１０ｍＬに希釈した（４０％）。最後の２ｍＬの保存溶液をメチルエチルケトンで１０ｍＬに希釈した（２０％）。希釈物を含む４つのバイアルを、抗溶媒としての少量のヘキサンを含むデシケータジャーに移した。デシケータジャーを密閉し、ヘキサン蒸気をメチルエチルケトン溶液中に拡散させた。翌日までにメチルエチルケトン溶媒和物結晶が８０％希釈物試料中で成長した。
実施例Ｃ−４：ロータリーエバポレーターによるメチルエチルケトン溶媒和物の調製
約４００ｍｇのエプレレノン（純度９９．９％以上）を２５０ｍＬ丸底フラスコに秤取する。溶媒（１５０ｍＬ）をフラスコに加え、必要な場合、固体が溶解するまで溶液を緩やかに加熱する。得られた透明な溶液を浴温度が約８５℃のＢｕｃｈｉロータリーエバポレーターに設置し、真空下で溶媒を除去する。丸底フラスコに約１０ｍＬの溶媒が残ったとき、溶媒除去を停止する。得られた固体を適切な方法（ＸＰＲＤ、ＤＳＣ、ＴＧＡ、顕微鏡等）で分析して、形態を確認する。
実施例Ｃ−５：スラリー変換
約１５０ｍｇのＦｏｒｍ Ｌエプレレノンと１５０ｍｇのＦｏｒｍ Ｈエプレレノンを５ｍＬの酢酸エチルに加える。得られたスラリーを一夜３００ｒｐｍ（磁気撹拌）で撹拌する。翌日、濾過により固体の試料を収集する。ＸＰＲＤによる試料の分析により、試料がＦｏｒｍ Ｌエプレレノンから完全に構成されていることが示された。
実施例Ｃ−６：（ａ）低純度エプレレノン出発原料からの溶媒和物および（ｂ）得られた溶媒和物からのＦｏｒｍ Ｈ結晶性エプレレノンの調製
種々の量の不純物７−メチル水素４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトン（「ジエポキシド」）または不純物７−メチル水素１１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトン（「１１，１２−エポキシド」）を含む試料を、所望の量の不純物を１００ｍｇの総試料量を得るのに十分な量のエプレレノンとともに７ｍＬシンチレーションバイアルに加えて調製した。各試料中のジエポキシドまたは「１１，１２−エポキシドの重量％を表Ｃ−６ＡおよびＣ−６Ｂに示す。ｍｉｃｒｏ−ｆｌｅａマグネチックスターラーを１ｍＬのメチルエチルケトンとともに各シンチレーションバイアルに加えた。バイアルにゆるく蓋をし、ホットプレート上で磁気撹拌しながら還流するまで加熱して固体を溶解する。固体が溶解した後、溶液をホットプレート上で室温まで冷却する。冷却期間中、磁気撹拌を維持する。溶液が室温に達した後、真空濾過により固体を収集し、ただちに粉末Ｘ線回折（ＸＰＲＤ）により分析した。次いで、固体を１００℃のオーブンに入れ、大気圧下で１時間乾燥した。乾燥固体をＸＰＲＤにより約１２．１°の２θでのＦｏｒｍ Ｈ回折ピークの面積をモニタリングしてＦｏｒｍ Ｈ含量を分析した。すべてのＸＰＲＤ回折パターンをＭｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを用いて記録した。
Ａ．ジエポキシドの結果
図Ｃ−１に（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％および（ｄ）５％ジエポキシドドープメチルエチルケトン結晶化から得られた湿潤ケーキ（メチルエチルケトン溶媒和物）の粉末Ｘ線回折パターンを示す。比較を容易にするためにピーク強度を正規化した。回折パターンにはＦｏｒｍ Ｈまたはジエポキシドに特有なピークは存在しない。回折パターンはエプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物に特有なものである。
図Ｃ−２に（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％および（ｄ）５％ジエポキシドドープメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固体の粉末Ｘ線回折パターンを示す。比較を容易にするためにピーク強度を正規化した。０および１％のドーピング量で実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥試料ではＦｏｒｍ Ｈは検出されなかった。３および５％のドーピング量で実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥試料ではＦｏｒｍ Ｈが検出された。約１２．１°の２θでのＦｏｒｍ Ｈ回折ピークの面積と各試料の推定されたＦｏｒｍ Ｈ含量を以下の表Ｃ−６Ｃに示す。
表Ｃ−６Ｃに報告する結果から、脱溶媒和時にＦｏｒｍ Ｈの生成に影響を及ぼすジエポキシドの存在が確認される。これらの結果から、ジエポキシドは、メチルエチルケトン溶媒和物結晶に取り込まれ、かつ／または吸着されるとき、Ｆｏｒｍ Ｈエプレレノンの生成の誘導に有効であることがわかる。
脱溶媒和時に生成するＦｏｒｍ Ｈの量に対する調製の経路の影響を解析するために、３％ジエポキシドドーピング実験を繰り返した。この実験では、ドープ結晶化から得られたメチルエチルケトン溶媒和物を２つの部分に分けた。第１の部分を無処理のままとし、第２の部分を乳鉢と乳棒で軽く粉砕して、高度の結晶欠陥を誘発した。２つの部分を大気圧下１００℃で１時間乾燥した。乾燥固体をＸＰＲＤにより分析した。（ａ）乾燥の前の溶媒和物の粉砕を伴わない、および（ｂ）乾燥の前の溶媒和物の粉砕を伴う、ジエポキシドの３％ドーピングを伴うメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固体のＸＰＲＤパターンを図Ｃ−３に示す。ＸＰＲＤパターンから、粉砕試料中には未粉砕試料と比べて多量のＦｏｒｍ Ｈが含まれていた。これらの結果は、メチルエチルケトン溶媒和物を分離し、処理する条件が脱溶媒和から得られる結晶形に影響を及ぼす可能性があることを示している。
Ｂ．１１，１２−エポキシドの結果
図Ｃ−４に（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％および（ｄ）１０％１１，１２−エポキシドドープメチルエチルケトン結晶化から得られた湿潤ケーキ（メチルエチルケトン溶媒和物）の粉末Ｘ線回折パターンを示す。比較を容易にするためにピーク強度を正規化した。回折パターンにはＦｏｒｍ Ｈまたは１１，１２−エポキシドに特有なピークは存在しない。回折パターンはエプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物に特有なものである。
図Ｃ−５に（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％および（ｄ）１０％１１，１２−エポキシドドープメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固体の粉末Ｘ線回折パターンを示す。比較を容易にするためにピーク強度を正規化した。０、１％および５％のドーピング量で実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥試料ではＦｏｒｍ Ｈは検出されなかった。１０％のドーピング量で実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥試料ではＦｏｒｍ Ｈが検出された。約１２．１°の２θでのＦｏｒｍ Ｈ回折ピークの面積と各試料の推定されたＦｏｒｍ Ｈ含量を以下の表Ｃ−６Ｄに示す。
表Ｃ−６Ｄに報告する結果から、脱溶媒和時にＦｏｒｍ Ｈの生成に影響を及ぼす１１，１２−エポキシドの存在が確認される。Ｆｏｒｍ Ｈエプレレノンの生成を誘導するために必要なメチルエチルケトン結晶化における不純物の割合は、１１，１２−エポキシドのほうがジエポキシドよりも大きいと思われる。
実施例Ｃ−７：最終結晶形に対する結晶化および乾燥の影響
最終結晶形に対する結晶化および乾燥の影響を解析する以下の４つの実験を実施した。すなわち、（ｉ）エプレレノンのメチルエチルケトン結晶化（２３＋３の統計的実験計画）、（ｉｉ）低品質母液残留物の結晶化、（ｉｉｉ）Ｆｏｒｍ Ｈのシード添加を伴う高純度エプレレノンの結晶化、および（ｉｖ）Ｆｏｒｍ Ｌのシード添加を伴う低純度エプレレノンの結晶化。実験の設計における変数は、冷却速度、出発原料の純度レベルおよび結晶化の終点温度などであった。この実施例の目的のために、高純度エプレレノンは、超高純度の粉砕エプレレノン（ＨＰＬＣ分析でこの材料の純度は１００．８％であることが示された）と定義し、低純度エプレレノンは、８９％の純度のエプレレノンと定義した。低純度エプレレノンを調製するために、エプレレノンの調製の工程からのストリップダウン母液を分析し、６１．１％エプレレノン、１２．８％ジエポキシドおよび７．６％ １１，１２−エポキシドの材料が得られるように混合した。次いで、この材料を８９％エプレレノンを得るのに十分な量の高純度エプレレノンと混合した。
メチルエチルケトン結晶化
メチルエチルケトン結晶化実験では、すべての実験を６０ｇの高純度エプレレノンを用いて行った。高終点は、４５℃と定義し、低終点は、５℃と定義した。高冷却速度は、３℃／分冷却と定義し、低冷却速度は、０．１℃／分冷却と定義した。中点は、１．５℃／分冷却、９４．５％純度エプレレノンおよび２５℃終点であった。
ＦＴＩＲによりバックグラウンドの読み取りを行った後、２５０ｍＬのメチルエチルケトンを１Ｌ Ｍｅｔｔｌｅｒ ＲＣ−１、ＭＰ１０反応器に入れ、１００ｒｐｍで撹拌した。数回のスキャンの後にエプレレノンを、続いて、４７０ｍＬのメチルエチルケトンを反応器に入れた。撹拌を５００ｒｐｍに増大させて、固体を懸濁し、バッチ温度を８０℃に上昇させた。エプレレノンの溶解を確保するためにバッチ温度を８０℃に保持した。得られた透明溶液中に黒色および白色小粒子が一般的に見えた。次いで、バッチ温度を所望の速度で所望の終点まで冷却し、移送フラスコに吸引し、濾過する前に終点を１時間維持した。反応器を真空にし、フラスコに移し、ケーキを１２０ｍＬのメチルエチルケトンで洗浄した。洗浄液をケーキを通して吸引した後、停止した。約１０ｇの各湿潤ケーキを真空オーブン中で軽く窒素を流しながら７５℃の通常の条件下で乾燥した。下記の「高、高、高」および「低、低、低」実験のために、流動層乾燥を高および低条件下で操作した。高流動層乾燥は、送風機設定を「４」に設定した１００℃と定義し、低流動層乾燥は、送風機設定を「１」に設定した４０℃と定義した。
低品質母液残留物の結晶化
低品質母液残留物の結晶化実験では、６０ｇの純度６１．１％の材料と７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１Ｌ Ｍｅｔｔｌｅｒ ＲＣ−１、ＭＰ１０反応器に直接入れた。純度６１．１％の材料は、反応器に入れる前に高純度エプレレノンと混合しなかった。得られた混合物を８０℃に加熱したところ、この温度では不透明なスラリーであった。結晶化を継続し、混合物を急速冷却条件下で４５℃で濾過した。
Ｆｏｒｍ Ｈシード添加
Ｆｏｒｍ Ｈシード添加実験では、６０ｇの純粋な（１００．８％）エプレレノンと７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１Ｌ Ｍｅｔｔｌｅｒ ＲＣ−１、ＭＰ１０反応器に入れた。混合物を８０℃に加熱し、次いで、１．５℃／分の速度で２５℃に冷却した。溶液が６２℃に冷却したとき、３ｇの純相Ｆｏｒｍ Ｈ結晶をシード添加して、結晶化を開始した。Ｆｏｒｍ Ｈ種結晶は、下の実施例Ｃ−９に記載する温浸法により調製した。
Ｆｏｒｍ Ｌシード添加
Ｆｏｒｍ Ｌシード添加実験では、６６．６ｇの８９．３％エプレレノン（４８．３ｇの１００％エプレレノンと１８．３ｇの６１．１％エプレレノンとを混合して調製した）と７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１Ｌ Ｍｅｔｔｌｅｒ ＲＣ−１、ＭＰ１０反応器に入れた。混合物を８０℃に加熱し、次いで、１．５℃／分の速度で２５℃に冷却した。溶液が６３℃に冷却されたとき、３ｇの純相Ｆｏｒｍ Ｌ結晶をシード添加して、結晶化を開始した。Ｆｏｒｍ Ｌ種結晶は、上の実施例Ｃ−１に記載した結晶化および脱溶媒和法により調製した。
実験の結果を表Ｃ−７Ａに報告する。ｎ＋１結晶化実験では、生成物がジエポキシドを含んでいた、低純度エプレレノンを用いた実験においてのみＦｏｒｍ Ｈが検出された。最終生成物中の高いレベルのジエポキシドも高い冷却速度で認められた。
低品質母液残留物の結晶化実験で、粉末Ｘ線回折により分析したときジエポキシドとＦｏｒｍ Ｈとの混合物であると思われた不十分な質の物質が得られた。
Ｆｏｒｍ Ｈシード添加実験（高純度エプレレノンにＦｏｒｍ Ｈをシード添加した）で、粉末Ｘ線回折分析では７７％Ｆｏｒｍ Ｈであったが、ＤＳＣでは完全にＦｏｒｍ Ｈであった生成物が得られた。しかし、Ｘ線回折分析は、約１５％を超えるＦｏｒｍ Ｈについて直線性が検定されていなかった。この実験は、Ｆｏｒｍ Ｈがジエポキシドの非存在下で生成したこの実施例の４つの実験のうちの唯一のものであった。
Ｆｏｒｍ Ｌシード添加実験（低純度エプレレノンにＦｏｒｍ Ｌをシード添加した）で、完全にＦｏｒｍ Ｌのみであった生成物が得られた。
エプレレノンの高流動層乾燥で得られたデータは、真空オーブン乾燥で得られたデータに対応しているように思われた。低流動層乾燥では、真空オーブン乾燥での結果と異なる結果が得られた。
Ａ．原料の純度
表Ｃ−７Ａに報告したデータに基づく生成物純度、出発原料純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを図Ｃ−６に示す。立方体プロットから、結晶化の開始時に純度がより高い原料を使用することによって純度がより高い生成物が得られることが示唆される。結晶化の終点温度は、生成物の純度にさほど影響しないように思われる。しかし、冷却速度は、冷却速度が速いほど生成物の純度がわずかに低くなるという影響を有すると思われた。実際、ジエポキシドのレベルは、一般的に冷却速度が速いほど高かった。
図Ｃ−７に、もしあるならば、どの変数が生成物の純度に統計的に有意な影響を及ぼすかを検討するために立方体プロットの結果を用いて作製した半正規プロットを示す。冷却速度および冷却速度と出発原料の純度との相互作用も統計的に有意な影響として認められたが、出発原料の純度が生成物純度に対して最も大きい統計的に有意な影響を有していた。
図Ｃ−８は、これらの結果に基づく相互作用グラフであり、生成物純度に関する出発原料の純度と冷却速度との相互作用を示す。高純度エプレレノン（１００．８％エプレレノン出発原料）を用いた場合、冷却速度は最終純度にほとんどまたは全く影響を及ぼさないように思われる。しかし、低純度エプレレノン（８９．３％エプレレノン出発原料）を用いた場合、生成物純度は冷却速度が増加するにつれて低下する。この結果から、より高い冷却速度で行わせたエプレレノンの結晶化においてはより多くの不純物が晶出することが示唆される。
Ｆｏｒｍ Ｈ含量
表Ｃ−７Ａに報告したデータに基づくＦｏｒｍ Ｈ重量分率、出発原料純度および生成物、冷却速度および終点温度の立方体プロットを図Ｃ−９に示す。立方体プロットから、結晶化の開始時に使用するエプレレノンの純度が高いほど、Ｆｏｒｍ Ｈの生成量少ないことが示唆される。結晶化の終点温度も最終生成物の形に影響を及ぼすように思われる。一部のＦｏｒｍ Ｈは不純物の存在下で低い終点温度でより早い冷却により生ずるが、冷却速度はＦｏｒｍ Ｈの生成にさほど影響を及ぼさないように思われる。
図Ｃ−１０に、もしあるならば、どの変数が最終材料中のＦｏｒｍ Ｈの量に統計的に有意な影響を及ぼしたかを検討するための立方体プロットの結果を用いて作製した半正規プロットを示す。出発原料の純度、結晶化の終点温度および２つの変数の間の相互作用が統計的に有意な影響として認められた。
図Ｃ−１１は、これらの結果に基づく相互作用グラフであり、最終のＦｏｒｍ Ｈ含量に関する出発原料の純度と終点温度との相互作用を示す。高純度エプレレノン（１００．８％エプレレノン出発原料）を用いた場合、終点温度はＦｏｒｍ Ｈ含量にほとんど影響を及ぼさないように思われる。純粋なエプレレノンではいずれの場合にもＦｏｒｍ Ｈは生じなかった。しかし、低純度エプレレノン（８９．３％エプレレノン出発原料）を用いた場合、Ｆｏｒｍ Ｈは両方の場合に存在し、終点温度が高いほど、Ｆｏｒｍ Ｈが有意に多かった。
表Ｃ−７Ｂに、流動層（ＬＡＢ−ＬＩＮＥ／Ｐ．Ｒ．Ｌ．Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ流動層乾燥装置、Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）または真空オーブン（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ真空乾燥オーブン、Ｍｏｄｅｌ ＤＰ−３２）を用いて乾燥した材料について測定したＦｏｒｍ Ｈの重量分率を報告する。高流動層または真空オーブンで乾燥した同等な材料で、同様なＦｏｒｍ Ｈ含量が認められた。しかし、乾燥に供した同等な材料で、低流動層と真空オーブンとで差が認められた。
実施例Ｃ−８：溶媒和物を調製するためのメチルエチルケトンからのＦｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌの混合物の結晶化、および（Ｂ）Ｆｏｒｍ Ｌを調製するための溶媒和物の脱溶媒和
Ｆｏｒｍ Ｈエプレレノン（１０ｇ）を８０ｍＬのメチルエチルケトンと混合した。混合物を還流（７９℃）するまで加熱し、この温度で約３０分間撹拌した。次いで、得られたスラリーを、６５℃、５０℃、３５℃および２５℃に各温度で約９０分間維持することによる段階的温度保持プロトコールにより冷却した。スラリーを濾過し、約２０ｍＬのメチルエチルケトンで洗浄した。分離した固体を最初はフィルター上で、次いで、真空オーブン中で４０〜５０℃で乾燥した。乾燥を真空オーブン中で９０〜１００℃で完了させた。溶媒和固体を８２％の回収率で得た。ＸＰＲＤ、ＭＩＲおよびＤＳＣにより、固体がＦｏｒｍ Ｌ結晶構造を有していたことが確認された。
実施例Ｃ−９：Ｆｏｒｍ Ｈを調製するための溶媒による低純度エプレレノン出発原料の温浸
エタノール溶媒による温浸：
低純度エプレレノン（２４．６ｇ、ＨＰＬＣによる分析で６４重量％）を１２６ｍＬのエタノール３Ａと混合した。スラリーを加熱して還流し、留出物を除去した。常圧蒸留により１２６ｍＬの溶媒が除去されたとき、追加の１２６ｍＬのエタノール３Ａを同時に加えた。溶媒ターンオーバーの完了後に、混合物を２５℃に冷却し、１時間撹拌した。固体を濾過し、エタノール３Ａで洗浄した。固体を風乾してエタノール溶媒和物を得た。溶媒和物をさらに真空オーブン中９０〜１００℃で６時間乾燥して、１４．９ｇのＦｏｒｍ Ｈエプレレノンを得た。
メチルエチルケトン溶媒による温浸
別の温浸法において、１ｇの低純度エプレレノン（純度約６５％）を４ｍＬのメチルエチルケトンに約２時間温浸させた。２時間後に混合物を室温に冷却した。冷却後、固体を真空濾過により収集した。ＸＰＲＤ分析によりメチルエチルケトン溶媒和物であることが確認された。固体を１００℃で３０〜６０分間乾燥した。乾燥固体は、ＸＰＲＤにより純粋なＦｏｒｍ Ｈであると判断された。
実施例Ｃ−１０：Ｆｏｒｍ Ｌを調製するための溶媒による高純度エプレレノン出発原料の温浸
エタノール溶媒による温浸：
高純度エプレレノン（１ｇ）を８ｍＬのエタノールに約２時間温浸させた。次いで、溶液を室温に冷却し、真空濾過により固体を収集した。濾過直後のＸＰＲＤによる固体の分析により、固体が溶媒和物（おそらくエタノール溶媒和物）であることが示された。その後、固体を大気圧下１００℃で３０分間乾燥した。乾燥固体をＸＰＲＤにより分析したところ、主としてＦｏｒｍ Ｌであることが確認された（Ｆｏｒｍ Ｈは検出されず）。
メチルエチルケトン溶媒による温浸：
高純度エプレレノン（１ｇ）を４ｍＬのメチルエチルケトンに約２時間温浸させた。２時間後に溶液を室温に冷却し、固体を真空濾過により収集した。固体をただちにＸＰＲＤにより分析したところ、エプレレノンの溶媒和物（おそらくメチルエチルケトン溶媒和物）であることが確認された。その後、溶媒和物を大気圧下１００℃で３０〜６０分間乾燥した。乾燥固体をＸＰＲＤにより分析したところ、主としてＦｏｒｍ Ｌであることが確認され、Ｆｏｒｍ Ｈの回折ピークは存在しなかった。
実施例Ｃ−１１：溶液からのＦｏｒｍ Ｌの直接的結晶化
方法Ａ：エプレレノン（２．５ｇ）を酢酸エチルに７５℃に加熱して溶解した。エプレレノンが溶解した後、完全な溶解を保証するために、溶液を７５℃に３０分間保持した。次いで、溶液を１℃／分で１３℃に冷却した。１３℃になったとき、スラリーをオーバーヘッド撹拌機で７５０ｒｐｍで２時間撹拌した。結晶を真空濾過で集め、真空オーブン中で４０℃、１時間乾燥した。固体のＸＰＲＤパターンおよびＤＳＣ熱重量変化記録図は、Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンに特有なものであった。固体の熱重量分析（ＴＧＡ）は、２００℃まで固体の減量を示さなかった。
方法Ｂ：別の方法において、２ｇのエプレレノンを３５０ｍＬの１５／８５％アセトニトリル／水にホットプレート上で磁気撹拌しながら加熱して溶解した。エプレレノンが溶解した後、溶液を磁気撹拌しながら一夜室温まで冷却した。得られた固体を真空濾過により収集した。結晶は、複屈折性で、三角形の板状晶癖を有していた。固体は、Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンに特有のＸＰＲＤおよびＤＳＣ特性を有していた。ＴＧＡは、２００℃まで減量を示さなかった。
方法Ｃ：別の方法において、６４０ｍｇのエプレレノンを２０ｍＬのエチルベンゼンを含む５０ｍＬフラスコに入れた。得られたスラリーを１１６℃に加熱したところ、透明な溶液になった。透明な溶液を３０分間にわたり２５℃に冷却した。冷却期間中８４℃で核生成が起こった。得られた固体を溶液からろ別し、風乾して、５３０ｍｇの固体を得た（回収率８３％）。ホットステージ鏡検とＸＰＲＤにより固体がＦｏｒｍ Ｌ結晶であることが確認された。
方法Ｄ：別の方法において、１．５５ｇのエプレレノンを２．０ｍＬのニトロベンゼンに加え、２００℃に加熱した。得られたスラリーを２００℃で一夜撹拌した。翌日、溶液を室温に冷却し（自然空気対流）、固体を分離した。固体は、ＸＰＲＤおよび偏光顕微鏡によりＦｏｒｍ Ｌエプレレノンであると判定された。
方法Ｅ：別の方法において、５．０ｇのエプレレノン（純度９９％以上）を８２ｇのメタノール（１０４ｍＬ）に溶解した。撹拌状態（２１０ｒｐｍ）のもとで、溶液を６０℃に加熱し、その温度に２０分間保持して完全な溶解を確保した。次いで、溶液を撹拌しながら０．１６℃／分の速度で−５℃に冷却した。結晶を濾過により収集し、真空オーブン中４０℃で２０時間にわたり乾燥した。乾燥固体は、ＤＳＣおよびＸＰＲＤ分析により純粋なＦｏｒｍ Ｌエプレレノンであると判定された。
方法Ｆ：別の方法において、６．０ｇのエプレレノン（９％エタノールを含み、９５．２％の補正純度を有するエタノール溶媒和物）を８２ｇのメタノール（１０４ｍＬ）に加えた。撹拌状態（２１０ｒｐｍ）のもとで、溶液を６０℃に加熱し、その温度に２０分間保持して完全な溶解を確保した。次いで、溶液を０．１４℃／分の速度で５０℃に冷却し、その温度に約２．５時間保持した。次いで、溶液を撹拌しながら０．１３℃／分の速度で−５℃に冷却した。結晶を濾過により収集し、真空オーブン中４０℃で１６時間にわたり乾燥した。乾燥固体は、ＤＳＣおよびＸＰＲＤ分析により純粋なＦｏｒｍ Ｌエプレレノンであると判定された。
実施例Ｃ−１２：溶液からのＦｏｒｍ Ｈの直接的結晶化
１５０．５ｍｇのジエポキシドと２．８５ｇのエプレレノンを１．５ｍＬのニトトロベンゼンに加えた。混合物を２００℃で数時間にわたり磁気撹拌した。次いで、スラリーを自然空気対流により室温に冷却した。試料を乾燥し、偏光顕微鏡およびＸＰＲＤにより分析した。ＸＰＲＤにより、試料がＦｏｒｍ ＨとＦｏｒｍ Ｌとの混合物であることが示された。結晶は、鏡検により半透明であったことから、脱溶媒和（およびＦｏｒｍ ＨまたはＦｏｒｍ Ｌへの変換）が起こっていなかったことがわかる。
実施例Ｃ−１３：粉砕による無定形エプレレノンの調製
鋼製Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ容器の約１／２に約６０ｇのエプレレノン（純度９９．９％以上）で満たした。鋼球を試料容器に入れ、蓋をして、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ装置により３０秒間撹拌した。エプレレノンをＷｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ容器の表面からかきとり、容器をさらに３０秒間撹拌した。得られた固体をＸＰＲＤとＤＳＣにより分析したところ、無定形エプレレノンとＦｏｒｍ Ｌ結晶性エプレレノンとの混合物であることが確認された。
実施例Ｃ−１４：凍結乾燥による無定形の調製
約１００ｍｇの粗エプレレノンを４００ｍＬの水を含むビーカーに秤取した。溶液を５分間わずかに加熱し、次いで、音波処理し、撹拌しながらさらに５分間加熱した。約３５０ｍＬのエプレレノン溶液を、５０ｍＬのＨＰＬＣ水を含む１０００ｍＬ丸底フラスコに濾過して入れた。溶液をドライアイス／アセトン浴中で１〜２分間にわたりフラッシュ凍結させた。フラスコをＬａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５凍結乾燥機に取り付け、一夜乾燥した。フラスコ中の固体を小褐色ビンに移した。そのうちの少量を偏光顕微鏡下で１０×、１．２５× ｏｐｔｉｖａｒ ｉｎ ｃａｒｇｉｌｌｅ ｏｉｌ（１．４０４）で観察したところ、少なくとも９５％無定形エプレレノンであることが認められた。図Ｃ−１２およびＣ−１３に無定形エプレレノンについて得られたＸＰＲＤパターンとＤＳＣ熱重量変化記録図を示す。図Ｃ−１２の３９°の２θに認められるピークは、アルミニウム試料容器に帰せられる。
実施例Ｃ−１５：エプレレノン多形組成物
２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇおよび２００ｍｇの用量のＦｏｒｍ Ｌエプレレノンを含み、以下の組成を有する錠剤を調製する。
実施例Ｃ−１６：エプレレノン多形組成物
１００ｍｇの用量のエプレレノンを含み、以下の組成を有するカプセル剤（硬ゼラチンカプセル、＃０）を調製する。
実施例Ｃ−１７：エプレレノン多形組成物
２００ｍｇの用量のエプレレノンを含み、以下の組成を有するカプセル剤（硬ゼラチンカプセル、サイズ＃０）を調製する。
実施例Ｃ−１８：摩砕エプレレノンの調製
乾燥メチルエチルケトン溶媒和物を、最初にＦｉｔｚｍｉｌｌ上の２０メッシュのスクリーンに通して塊をなくした。塊状体を含まない固体を、約２５０ｋｇ／時間の供給速度で液体窒素冷却下で操作するＡｌｐｉｎｅ Ｈｏｓａｋａｗａスタッドディスクピンミルを用いてピン型ミルで粉砕する。ピン型ミルで粉砕により、約６５〜１００μｍのＤ９０粒径を有する摩砕エプレレノンが得られた。
上のことを考慮して、本発明のいくつかの目的が達成されることが了解されるであろう。本発明の上記の方法、組合せおよび組成物について、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができるので、上の記述に含まれるすべての事項は説明としてであって、限定的な意味を有するものではない。本願書で言及するすべての文書は、十分詳細に示されている場合、本明細書で特に参考として援用する。
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は、１つまたは複数の要素が存在することを意味するものである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」なる語は、含むことを意味し、列挙した要素以外の別の要素が存在する可能性があることを意味する。
実施例Ｄ−１：軽度から中等度の高血圧症の治療における一連の用量のエプレレノンの有効性および安全性評価
エプレレノンは、１日１回（ＱＤ）、または分割量を例えば、１日２回（ＢＩＤ）もしくは１日３回（ＴＩＤ）投与したとき、広範囲の用量（５０〜４００ｍｇ）にわたり安全かつ許容度が良好であった。図Ｄ−１および図Ｄ−２に示すように、エプレレノンは、評価方法に無関係に、プラセボと比較して広範囲の用量にわたり拡張期血圧（ＤＢＰ）および収縮期血圧（ＳＢＰ）の有意な降下をもたらした。エプレレノンは、最終投与後２４時間レニン−アルドステロン−アンジオテンシン系（ＲＡＡＳ）を増加させたことから、ＱＤ投与の有効性が確認された。血圧（ＢＰ）およびＲＡＡＳに対する作用の大きさは、用量に依存していたが、投与頻度に依存しなかった。
実施例Ｄ−２：エプレレノン用量範囲要因配置実験
これは、１〜２週間の投与前スクリーニング期間の後の、８週間の二重盲検投与期間への無作為化の前の２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間からなる多施設無作為化二重盲検プラセボおよび実薬対照並行群エプレレノン用量範囲試験であった。図Ｄ−３を参照のこと。患者は、０、２、４および８週目に評価した。プトコールに規定された時点の試験評価は、血圧（ＢＰ）、心拍数、臨床検査、バイタルサイン、理学的検査、１２誘導ＥＣＧおよび有害事象のモニタリングなどであった。
合計６１４人の患者を無作為化した。軽度から中等度の高血圧症の病歴または新規に診断された高血圧症（座位ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍｍＨｇ）を有する１８歳以上の男性または女性であった。
２５ｍｇ、５０ｍｇもしくは２００ｍｇの１日投与量を用いたエプレレノン単剤療法または１２．５ｍｇもしくは２５ｍｇの１日投与量を用いたヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）単剤療法は、ＤＢＰの用量依存的降下をもたらした。２５ｍｇ、５０ｍｇもしくは２００ｍｇの１日投与量を用いたエプレレノン単剤療法または１２．５ｍｇもしくは２５ｍｇの１日投与量を用いたＨＣＴＺ単剤療法は、ＳＢＰの用量依存的降下をもたらした。図Ｄ−４および図Ｄ−５に示すように、エプレレノンとＨＣＴＺとの併用療法は、基準から最終来院時までのＤＢＰおよびＳＢＰの用量依存的平均降下をもたらした。エプレレノン２００／ＨＣＴＺ１２．５、およびエプレレノンと２５ｍｇＨＣＴＺとのすべての併用については、これらの降下はプラセボより有意に大きかった。
エプレレノンとＨＣＴＺとの併用は、対応する単剤療法と比較したとき、ＤＢＰおよびＳＢＰのより大きい降下をもたらした。
有害事象、安全性臨床検査結果およびバイタルサインにより評価したとき、単剤療法またはＨＣＴＺとの併用療法として８週間にわたり投与したエプレレノンは、安全かつ許容度が良好であった。女性化乳房は認められず、不能症および月経異常の発生率はプラセボと同等であった。
実施例Ｄ−３：本態性高血圧症患者におけるエプレレノン対エナラプリルの抗高血圧および腎保護作用
この１２カ月間の二重盲検効果対滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ−ｔｏ−ｅｆｆｅｃｔ）試験では、高血圧症の治療における選択的アルドステロン遮断薬であるエプレレノン（ＥＰＬ）とＡＣＥ阻害薬であるエナラプリル（ＥＮＡＬ）の有効性と安全性を比較した。
試験設計を図Ｄ−６に示す。軽度から中等度の高血圧症（拡張期血圧［ＤＢＰ］≧９５ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍｍＨｇ）を有する患者を最初にＥＰＬ５０ｍｇＱＤ（ｎ＝２５３）またはＥＮＡＬ１０ｍｇＱＤ（ｎ＝２４６）の投与を受けるように無作為化した。４、８、１２、１６または２０週目にＤＢＰ≧９５ｍｍＨｇであった場合、被験薬の用量をＥＰＬ１００ｍｇおよび２００ｍｇＱＤ、またはＥＮＡＬ２０ｍｇＱＤおよび４０ｍｇＱＤに増量した。投与が高血圧疾患状態の長期の変化をもたらしたかどうかを検討するために、２４週目に血圧（ＢＰ）が抑制されていたすべての患者について１用量段階減量し、さらに６カ月間にわたり月１回追跡した（減量がＢＰ抑制の消失をきたした場合には、被験薬の用量を２４週目の用量段階へ再増量した）。２４週目と１２カ月目にＢＰの変化、ＲＡＡＳホルモンプロファイル、尿中アルブミン排泄（尿中アルブミン：クレアチニン比［ＵＡＣＲ］）、臨床検査、安全性および有害事象（ＡＥｓ）を評価した。
図Ｄ−７および図Ｄ−８に示すように、ＳＢＰ／ＤＢＰが両薬剤により２４週目（ＥＰＬ−１４．５／−１１．２ｍｍＨｇ、ＥＮＡＬ−１２．７／−１１．３ｍｍＨｇ）および１２カ月目（ＥＰＬ−１６．５／−１３．３ｍｍＨｇ、ＥＮＡＬ−１４．８／−１４．１ｍｍＨｇ）に降下した。ＥＰＬおよびＥＮＡＬ群の患者は、漸減された用量で１２カ月目に抑制されたＢＰを有し続けていた。
高い基準ミクロアルブミン尿（ＵＡＣＲ≧３０ｍｇ／ｇ）を有する患者では、２４週目にＥＰＬ投与でＥＮＡＬよりもＵＡＣＲの有意に大きい低下が認められた（−６１．５％対−２５．７％、Ｐ＝０．０１）。有意に大きい割合のＥＮＡＬ患者が咳（６．５％対２．４％、Ｐ＝０．０２９）、高血糖（２．８％対０．０％、Ｐ＝０．００７）および尿路感染（ＵＴＩ）（２．８％対０．４％、Ｐ＝０．０３５）を経験した。
エプレレノンによるアルドステロン遮断は、ＢＰの抑制に有効であった。エプレレノン投与患者は、終末器官障害の予後予測因子であるＵＡＣＲのより大きい低下を示し、より少ない有害事象を経験した。軽度から中等度の高血圧症を有する患者では、エプレレノンとエナラプリルの抗高血圧作用（ＤＢＰおよびＳＢＰ）は、２４週間の投与後に同様であった。
エプレレノンとエナラプリルの抗高血圧作用（ＤＢＰおよびＳＢＰ）の維持は、強制用量漸減後の６カ月間に同様であった。
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、重炭酸塩および尿酸を含む血清化学検査項目の臨床的に重要な変化はなかった。エプレレノンとエナラプリルは、安全かつ許容度が良好であった（図Ｄ−９）。
実施例Ｄ−４：左室肥大を有する患者におけるエプレレノン、エナラプリルおよびエプレレノン／エナラプリル併用療法の有効性および許容度
この９カ月間の二重盲検強制用量漸増試験では、選択的アルドステロン遮断薬であるエプレレノン（ＥＰＬ）とＡＣＥ阻害薬であるエナラプリル（ＥＮＡＬ）、およびＥＰＬ＋ＥＮＡＬ併用療法の心臓保護活性と許容度を比較した。
試験設計を図Ｄ−１０に示す。軽度から中等度の高血圧症および心エコー図により診断された左室肥大（ＬＶＨ）を有する患者をＥＰＬ５０ｍｇＱＤ（ｎ＝６４）、ＥＮＡＬ１０ｍｇＱＤ（ｎ＝７１）またはＥＰＬ５０ｍｇ／ＥＮＡＬ１０ｍｇ（ｎ＝６７）の投与を受けるように無作為に割付けた。薬剤を２週目にＥＰＬ１００ｍｇ、ＥＮＡＬ２０ｍｇおよびＥＰＬ１００ｍｇ／ＥＮＡＬ１０ｍｇに、４週目にＥＰＬ２００ｍｇ、ＥＮＡＬ４０ｍｇおよびＥＰＬ２００ｍｇ／ＥＮＡＬ１０ｍｇに強制漸増させた。８週目にＢＰが抑制されていないまま（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ）であった場合、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加し、１０週目に必要な場合、ＨＣＴＺ２５ｍｇに増量した。９カ月の終点で左室重量（ＬＶＭ）（ＭＲＩにより測定）、ＢＰ、コラーゲンターンオーバーおよび許容度を評価した。
ＬＶＭの低下を表Ｄ−４および図Ｄ−１１〜Ｄ−１３に示し、ＢＰの降下を図Ｄ−１４に示す。
すべての投与群でコラーゲンターンオーバー（ＥＰＬ−７．３％、ＥＮＡＬ−７．３％およびＥＰＬ／ＥＮＡＬ−１０．２％）およびＵＡＣＲ（ＥＰＬ−２８．７％、ＥＮＡＬ−３９．１％およびＥＰＬ／ＥＮＡＬ−５０．７％）の基準からの有意な低下が認められた。図Ｄ−１５に示すように、ＥＰＬ患者よりも有意に大きい割合のＥＮＡＬ患者が咳を経験した（３．１％対１４．１％、Ｐ＝０．０３３）。
エプレレノン単剤療法は、ＬＶＨの退縮およびコラーゲンターンオーバーの低下にエナラプリル単剤療法と同様に有効であった。エプレレノンは、補助療法としてエナラプリルの有効性を増大させた。
実施例Ｄ−５：低レニン性高血圧症を有する患者におけるエプレレノンとロサルタンとの比較
低い血漿レニンを有する高血圧患者は食塩／体積感受性であり、したがって、ＡＣＥ阻害薬またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬に対するよりもエプレレノンに対して良好な反応を示すという仮説を検定するために、低レニン性高血圧症患者における１６週間の無作為化二重盲検試験では、選択的アルドステロン遮断薬であるエプレレノン（ＥＰＬ）とアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬であるロサルタン（ＬＯＳ）の有効性と安全性を比較した。
試験設計を図Ｄ−１６に示す。低レニン性高血圧症患者（朝血漿レニン活性≦１．０ｎｇ／ｍＬ／時間または活性レニン値≦２５ｐｇ／ｍＬ）を最初にＥＰＬ１００ｍｇＱＤ（ｎ＝８６）またはロサルタン（ＬＯＳ）５０ｍｇＱＤ（ｎ＝８２）の投与を受けるように無作為化した。４週目に、ＢＰが抑制されていなかった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇ）場合、被験薬をＥＰＬ２００ｍｇＱＤまたはＬＯＳ１００ｍｇＱＤに増量した。８週目に、ＢＰが抑制されていないままであった場合、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加し、必要な場合、１２週目に２５ｍｇに漸増させた。８および１６週目に、ＢＰ、ＲＡＡＳホルモンプロファイルおよび安全性を評価した。
基準における平均レニン活性は、ＥＰＬおよびＬＯＳ群でそれぞれ１１．７ｍＵ／Ｌおよび１２．７ｍＵ／Ｌであった。図Ｄ−１７に示すように、試験の単剤療法の終了時（８種目）におけるＳＢＰ／ＤＢＰの基準からの平均変化は、ＥＰＬ群のほうがＬＯＳ群よりも有意に大きかった（ＥＰＬ−１５．８／−９．３ｍｍＨｇ、ＬＯＳ−１０．１／−６．７ｍｍＨｇ、Ｐ＝０．０１７／０．００１）。
図Ｄ−１８に示すように、１６週目のＨＣＴＺの追加の許容後にＳＢＰ／ＤＢＰの基準からの平均変化は、ＥＰＬ群（−１８．３／−１０．８ｍｍＨｇ）のほうがＬＯＳ群（−１５．０／−９．８ｍｍＨｇ）よりも良好であった。さらに、ＨＣＴＺ追加療法を必要とした患者の累積％は、ＥＰＬ群（３２．５％）のほうがＬＯＳ群（５５．６％）よりも低かった（図Ｄ−１９）。活性レニンレベルの増加は、８週目（ＥＰＬ＋５０．１％、ＬＯＳ＋６３．８％、Ｐ＝０．４１６）および１６週目（ＥＰＬ＋７３．０％、ＬＯＳ＋８３．８％、Ｐ＝０．６３５）に２群で同様であった。血清アルドステロンレベルの増加は、８週目（ＥＰＬ＋７４．７％、ＬＯＳ−１８．７％、Ｐ＜０．００１）および１６週目（ＥＰＬ＋８９．８％、ＬＯＳ−５．５％、Ｐ＜０．００１）にＥＰＬ群においてより大きかった。ＥＰＬ群とＬＯＳ群の間に治療中に発生した有害事象の総発生率および治療中に発生した特定の有害事象の発生率の有意差はなかった。
エプレレノンは、低レニン性高血圧症の治療にロサルタンよりも有効で、同様な許容度を示した。したがって、エプレレノンは、高血圧患者のこの重要な亜集団にとって実現性のある治療選択肢である。
低レニン性高血圧症患者では、エプレレノン単剤療法の抗高血圧作用（ＤＢＰおよびＳＢＰ）は投与８週目にロサルタン単剤療法よりも大きかった。８週目の後にＨＣＴＺを許容した場合、１６週目に評価したエプレレノンとロサルタンの抗高血圧作用は同等であった。
ロサルタン患者と比べて小数のエプレレノン患者が血圧の抑制を維持するために追加ＨＣＴＺを必要とした。８週目には血圧はロサルタン単剤療法よりもエプレレノン単剤療法を受けた多くの患者で抑制されており、図Ｄ−２０に示すように８週目の後にＨＣＴＺを許容した場合、血圧抑制は両治療群である程度類似していた。
基準アルドステロン：レニンレベルとＤＢＰの変化との間の相関は示されなかった。図Ｄ−２１に示すようにエプレレノンは、安全であり、許容度が良好である。
実施例Ｄ−６：高血圧黒人および白人患者におけるエプレレノンおよびロサルタンの有効性および許容度
黒人高血圧患者は、低いレニンレベルを有する可能性がより大きく、したがって、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬による単剤療法に対して反応性が低い可能性がある。エプレレノン（ＥＰＬ）は、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬ロサルタン（ＬＯＳ）よりも低レニン性高血圧患者におけるＢＰを十分に降下させることが最近示され、これがＥＰＬは黒人高血圧患者においても優れているという仮説につながった。この仮説を検定するために、１６週間の二重盲検無作為化試験で、軽度から中等度の高血圧を有する黒人および白人患者におけるＥＰＬ、ＬＯＳおよびプラセボ（ＰＢＯ）の有効性と安全性を比較した。
試験設計を図Ｄ−２２に示す。軽度から中等度の高血圧を有する黒人（ｎ＝３４８）および白人（患者ｎ＝２０３）を最初にＥＰＬ５０ｍｇＱＤ、ＬＯＳ５０ｍｇまたはＰＢＯの投与に無作為に割付けた。４、８または１２週目にＢＰが抑制されていなかった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をＥＰＬ１００ｍｇまたは２００ｍｇＱＤ、ＬＯＳ１００ｍｇＱＤまたはＰＢＯに１用量段階増量した。１６週目に、ＢＰ、血液化学検査項目、ＵＡＣＲにより測定したミクロアルブミン尿および安全性を評価した。
ＳＢＰ／ＤＢＰおよび活性レニンの基準から１６週目までの変化を表Ｄ−６および図Ｄ−２３〜Ｄ−２５に示す。
基準活性レニンレベルは、黒人患者（ＥＰＬ１０．９ｍＵ／Ｌ、ＬＯＳ９．６ｍＵ／Ｌ、ＰＢＯ１０．４ｍＵ／Ｌ）において白人患者（ＥＰＬ１２．０ｍＵ／Ｌ、ＬＯＳ１４．４ｍＵ／Ｌ、ＰＢＯ１５．４ｍＵ／Ｌ）よりも低かった。ＵＡＣＲの基準からの調整済み平均変化率は、ＥＰＬで−２１．６％、ＬＯＳで−１８．２％、ＰＢＯで５．２％であった（ＥＰＬ対ＰＢＯについてＰ＝０．００３）。
図Ｄ−２６に示すように、ＥＰＬ、ＬＯＳおよびＰＢＯ間に治療中に発生した有害事象の総発生率および治療中に発生した特定の有害事象の発生率の有意差は認められなかった。
黒人高血圧患者では、エプレレノンは、軽度から中等度の高血圧の治療においてロサルタンより優れており、また白人患者において有効性が優れている傾向があった。両薬剤は、ミクロアルブミン尿、終末器官障害の予後予測因子および心血管疾患を低減し、安全かつ許容度が良好であった。
エプレレノンの投与は、すべての患者（黒人および白人）においてプラセボより優れた、ＤＢＰおよびＳＢＰにより測定される抗高血圧作用をもたらした。エプレレノンの投与は、ＤＢＰおよびＳＢＰを降下させる点について黒人患者と白人患者において同等に有効であった。
エプレレノンの投与は、すべての患者および黒人患者においてロサルタンと比べて大きい、また白人患者においてロサルタンと同等な、ＤＢＰおよびＳＢＰにより測定される抗高血圧作用をもたらした。エプレレノンおよびロサルタンの投与は、すべての患者、黒人患者および白人患者においてプラセボと比較してミクロアルブミン尿の低下をもたらした。
エプレレノン治療によるＲＡＡＳホルモン（神経ホルモン）に対する効果は、アルドステロン受容体拮抗作用およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗作用を有するロサルタン治療と一致していた。プラセボによるＲＡＡＳホルモンの変化は認められなかった。
実施例Ｄ−７：抗蛋白尿：ミクロアルブミン尿を有する糖尿病性高血圧症患者におけるエプレレノン、エナラプリルおよびエプレレノン／エナラプリル併用療法の有効性
この２４週間の二重盲検試験では、糖尿病および蛋白尿症を有する高血圧患者における選択的抗アルドステロン遮断薬であるエプレレノン（ＥＰＬ）、ＡＣＥ阻害薬であるエナラプリル（ＥＮＡＬ）およびＥＰＬ＋ＥＮＡＬ併用療法の腎および抗高血圧作用ならびに許容度を比較した。
最初の試験設計を図Ｄ−２７に示す。軽度から中等度高血圧症（ＤＢＰ≧９５ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍＨｇ、ＳＢＰ＜１８０ｍｍＨｇ）およびミクロアルブミン尿症（ＵＡＣＲ≧５０ｍｇ／ｇ）を有する２型糖尿病患者をＥＰＬ２００ｍｇＱＤ、ＥＮＡＬ４０ｍｇＱＤまたはＥＰＬ２００ｍｇ／ＥＮＡＬ１０ｍｇ（用量は４週間にわたる強制漸増により到達した）の投与を受けるように無作為に割付けた。８週目またはその後に、ＢＰが抑制されていないままであった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇ）場合、ＨＣＴＺ１２．５ｍｇを追加し、必要な場合、２５ｍｇに増量した。
この試験の主要な目的は、エプレレノン対エナラプリルまたは併用を投与した患者における２４週目の尿中アルブミン：クレアチニン比（ＵＡＣＲ）により測定される尿中アルブミン排泄量の基準からの平均変化を比較することであった。この試験の副次的な目的は次のとおりであった。
１．８および２４週目のエプレレノン対エナラプリルまたは併用のカフ座位ＤＢＰ（ｓｅＤＢＰ）および座位ＳＢＰ（ｓｅＳＢＰ）谷値の基準からの平均変化を比較すること、
２．２４週目のコラーゲンマーカー（ＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド［ＰＩＩＩＮＰ］、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン［７ＳＩＶＣ］およびＩ型コラーゲンテロペプチド［ＩＣＴＰ］）、線維素溶解バランス（プラスミノーゲン活性化因子抑制物質［ＰＡＩ−１］および組織プラスミノーゲン活性化因子［ｔ−ＰＡ］）および代謝作用（インスリン、グリコシル化ヘモグロビン、空腹時血清ブドウ糖および脂質［トリグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロール］の基準からの平均変化により測定されるエプレレノン対エナラプリルまたは併用の作用を比較すること、
３．基準躯幹肥満（腰周り）、基準血漿中レニン濃度（総および活性）または基準血清アルドステロン濃度と相関するエプレレノン対エナラプリルまたは併用の抗高血圧、代謝または尿中アルブミン排泄反応の基準からの平均変化の差を測定すること、
４．報告される有害事象、臨床検査値、理学的検査、バイタルサインおよび心電図により評価されるエプレレノン対エナラプリルまたは併用の安全性と許容度を比較すること。
プロトコールに規定された時点の試験評価は、ＢＰ、心拍数、体重、コラーゲンマーカー（ＰＩＩＩＮＰ、７ＳＩＶＣおよびＩＣＴＰ）、線維素溶解バランス（ＰＡＩ−１およびｔ−ＰＡ）、インスリンおよびグリコシル化ヘモグロビン、薬物経済データおよびＵＡＣＲなどであった。試験中、血清カリウムを含む常用臨床検査値、バイタルサイン、理学的検査、体重、１２誘導ＥＣＧおよび有害事象のモニタリングにより安全性を評価した。
最初は１６５人の患者について計画した（図Ｄ−２７）が、実際には２６６人の患者を無作為化した。すなわち、９３例をエプレレノンに、８４例をエナラプリルに、８９例をエプレレノン／エナラプリルに無作為化した。ＳＢＰ／ＤＢＰの調整済み平均変化を表Ｄ−７および図Ｄ−３０〜Ｄ−３１に示す。
ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）の追加は、８４例中３６例のＥＰＬ患者、８１例中４３例のＥＮＡＬ患者および７９例中２５例のＥＰＬ＋ＥＮＡＬ患者により要求された。Ｋ＋の上昇（≧６．０ｍＥｑ／Ｌ）が８例のＥＰＬ、２例のＥＮＡＬおよび８例のＥＰＬ＋ＥＮＡＬ患者で認められた。ＥＰＬ（６例）およびＥＮＡＬ（２例）群よりも多いＥＰＬ＋ＥＮＡＬ群（１４例）の患者が高カリウム血症のために中止した。他のＡＥは処置群間で同様であった。
エプレレノンは、エナラプリルよりもミクロアルブミン尿の大きい低下をもたらし、エプレレノンとエナラプリルの併用は、いずれかの薬剤単独よりも大きい程度にミクロアルブミン尿を低下させた。ＵＡＣＲにより評価されるミクロアルブミン尿の低下は、ＢＰ降下の程度と無関係であった。このことから、エプレレノンによる選択的なアルドステロン遮断が２型糖尿病を有する高血圧患者における腎保護作用を有することがわかる。
エプレレノン、エナラプリルおよび併用の投与は、８週目にＤＢＰおよびＳＢＰの同様な降下をもたらした（追加薬剤を用いずに）。２４週目に（必要に応じてＨＣＴＺ／アムロジピンの追加後）エプレレノンとエナラプリルとの併用はエプレレノンの投与と比べてＤＢＰの大きい降下をもたらした。
基準躯幹肥満、血漿中レニン濃度または血清アルドステロンと、エプレレノン、エナラプリルまたは併用投与に反応しての抗高血圧、代謝または尿中アルブミン排泄の変化との間に相関はなかった。
図Ｄ−３２に示すように、糖尿病を有する高血圧患者では、エプレレノンの投与は、エナラプリルを投与した患者と比較して、血清中カリウム濃度の上昇と高カリウム血に関連した有害事象を随伴した。
同じ集団において、ミクロアルブミン血症を有さない集団と比較して、投与に反応した高カリウム血症の発生率の増加があった。これらの結果は、カリウムを排泄する腎の能力の障害を示している。しかしながら、高カリウム血症を経験した多くの患者は、高カリウム血症を悪化させることなく、エプレレノンまたはエプレレノン／エナラプリルによる治療を続けることができた。これらの所見はさらに、これらの高カリウム血性糖尿病患者において進行中のエプレレノン投与が患者のミクロアルブミン血症を退縮させるだけでなく、カリウムを排泄する患者の能力も改善したことを示している。
エプレレノン、エナラプリルおよび併用の投与は、許容度が良好であった。
実施例Ｄ−８：高齢者における収縮期高血圧における血圧、血管コンプライアンスおよびミクロアルブミン尿に対するエプレレノンとカルシウム拮抗との比較
高齢者では、収縮期ＢＰの上昇と広い脈圧が拡張期ＢＰよりもよく心血管リスクを予測するものである。血管コンプライアンスの低下と糸球体内高血圧は、一般的に高齢者における単独性収縮期高血圧を伴う。収縮期高血圧および／または脈圧の拡大（ＳＢＰ≧１５０ｍｍＨｇおよび＜１６５ｍｍＨｇならびにＰＰ≧７０ｍｍＨｇ、またはＳＢＰ≧１６５ｍｍＨｇおよび＜２００ｍｍＨｇならびにＤＢＰ＜９５ｍｍＨｇ）を有する高齢患者（平均年齢６７．７歳）における２４週間の二重盲検効果対滴定試験においてＢＰ、血管コンプライアンスおよびミクロアルブミン尿に対するエプレレノンと標準的ジヒドロピリジンカルシウム拮抗薬アムロジピンの作用を比較した。
試験設計を図Ｄ−３３に示す。患者をエプレレノン５０ｍｇＱＤ（Ｎ＝１３４）またはアムロジピン２．５ｍｇＱＤ（Ｎ＝１３５）の投与を受けるように無作為化し、ＳＢＰを≦１４０ｍｍＨｇに降下させるための可能な２漸増段階（２および６週目にそれぞれ、エプレレノン１００および２００ｍｇＱＤとアムロジピン５および１０ｍｇＱＤ）を設けた。脈波速度により測定される動脈コンプライアンス、ミクロアルブミン尿および有害事象（ＡＥｓ）の変化を基準および２４週間の治療後に評価した。
表Ｄ−８および図Ｄ−３４〜Ｄ−３８に示すように、ＥＰＬとＡＭＬは、ＳＢＰ（−２０．５ｍｍＨｇ対−２０．１ｍｍＨｇ）、脈圧（−１５．９ｍｍＨｇ対−１３．４ｍｍＨｇ）および頚動脈−大腿動脈脈波速度（−２．１ｍ秒対−２．４ｍ秒）の同様な低下をもたらした。基準でミクロアルブミン尿（＞３０ｍｇ／ｇ）を有する患者では、ＥＰＬはＵＡＣＲをＡＭＬよりも著しく低下させた（−２７．１％対−３．３％、Ｐ＝０．００２）。
患者により評価された生活の質（ＱＯＬ）は、ＡＭＬ群の２１症状における基準からの窮迫の有意かつ臨床的に意味のある悪化を示していたが、ＥＰＬ群では窮迫の悪化は認められなかった。これらの２１症状のうち、ＥＰＬは、足およびくるぶしの腫脹、体重増加、夜間多尿、頻尿および息切れの５症状に対して有意な正の影響を有していた。末梢浮腫は、ＥＰＬでＡＭＬよりはるかに頻度が低かった（３．７％対２５．２％、Ｐ≦０．０５）（図Ｄ−３９）。
これらの所見は、エプレレノンがアムロジピンと同様に収縮期ＢＰ、脈圧および血管コンプライアンスを低下させたことを示している。これに対して、エプレレノンは、ＣＶ罹患および終末器官障害の確立された危険因子であるミクロアルブミンをアムロジピンよりも大きい程度に低下させ、アムロジピンと比較して有意に少ない末梢浮腫を随伴した。
エプレレノンは、安全であり、ＳＢＰを降下させる点においてアムロジピンと同等である。エプレレノンとアムロジピンは、脈圧を降下させる点において同等である。アムロジピンは、ＤＢＰを降下させる点ではエプレレノンよりも大きい作用を有していた。エプレレノンは、アムロジピンよりもミクロアルブミン尿の大きい低下を随伴した。血管コンプライアンスの測定を受けた患者のサブセットにおいて、エプレレノンとアムロジピンは改善を随伴した。携帯型血圧測定（ＡＢＰＭ）を有していた患者のサブセットにおいて、エプレレノンとアムロジピンはＨＲ、ＳＢＰ、ＤＢＰおよび脈圧の降下を随伴した。
エプレレノンとアムロジピンは、安全で、許容度が良好であった。アムロジピンは、末梢浮腫のより大きい発生率を随伴した。
実施例Ｄ−９：軽度から中等度の高血圧を有する患者におけるエプレレノンとアンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシンＩＩ拮抗薬との併用投与
ＡＣＥ阻害薬（ＡＣＥ−Ｉ）およびアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）は、高血圧症の薬物療法に一般的に用いられている薬剤である。これらの薬剤のいずれかによる単剤療法は、十分な血圧の抑制を達成するのにはしばしば不十分である。ＡＣＥ−ＩもＡＲＢも（併用も）アルドステロンレベルを長期にわたり十分には抑制しない。アルドステロンは、血圧上昇などの独立した有害な心血管作用を有する。したがって、アルドステロン遮断は、ＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢの投与で抑制が不十分である高血圧患者に対する合理的な追加療法となる可能性がある。
この試験の目的は、１）軽度から中等度の高血圧を有する患者にＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢとともに併用投与したときの新規の選択的アルドステロン受容体拮抗薬（ＳＡＲＡ）、エプレレノンの安全性と、２）バックグラウンドＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢ療法で抑制が不十分である患者に追加したエプレレノンの血圧に対する作用を検討することであった。
試験設計を図Ｄ−４０に示す。この試験で検討した患者は、現在ＡＣＥ−Ｉおよび／またはＡＲＢによる治療を受け、ＤＢＰ≧９５ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍｍＨｇならびにＳＢＰ＜１８０ｍｍＨｇ）を有していた患者であった。固定量の単一ＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢを除き、以前の抗高血圧療法を中止した。
ＢＰがＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢによる単剤療法で抑制されなかった高血圧患者において、エプレレノンの追加は以下のことをもたらした。
（１）ＡＣＥ−Ｉの投与を現在受けている患者のＳＢＰの有意な降下（図Ｄ−４１〜Ｄ−４３）、
（２）ＡＲＢの投与を現在受けている患者のＳＢＰおよびＤＢＰの有意な降下（図Ｄ−４２〜Ｄ−４４）、
（３）関連臨床検査異常（図Ｄ−４５）、特にＫ＋（図Ｄ−４６およびＤ−４７）の有意な増加または有害事象（図Ｄ−４８およびＤ−４９）の増加なし、
（４）いずれの群についても心拍数の変化なし（図Ｄ−５０）、
（５）活性レニンおよび血清アルドステロンレベルの変化はアルドステロン受容体拮抗薬の作用と一致している（図Ｄ−５１およびＤ−５２）、
（６）試験中止例がより少ない（図Ｄ５３）、および
（７）投与に反応した患者の割合が高い（ＤＢＰ）（図Ｄ−５４）。
エプレレノンは、ＢＰが単剤療法で非抑制の軽度から中等度の高血圧を有する患者にＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢとともに併用投与したとき、有効かつ安全である。
ここでの結果に基づき、有害な心血管作用の予防におけるエプレレノンの重要性と、ＡＣＥ−ＩとＡＲＢがこのホルモンを十分に抑制することができないことは、エプレレノンが、ＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢの投与で十分に抑制されていない高血圧患者に対する有用な追加療法であることを示すものである。
実施例Ｄ−１０：エプレレノンのＣＣＢまたはβ遮断薬との併用投与
このエプレレノン試験の設計を図Ｄ−５５に示す。これは、多施設共同二重盲検無作為化プラセボ対照プラセボ予備試験並行群試験であった。試験は、８週間の二重盲検投与期間への無作為化の前の１〜２週間の投与前スクリーニング期間に続く２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間からなっていた。患者をカルシウムチャンネル遮断薬（ＣＣＢ）またはβアドレナリン受容体遮断薬（ＢＢ）による治療に従って層別化し、次いで、同じ比率でエプレレノン５０ｍｇまたはプラセボの投与に割付けた。２週目にＢＰが抑制されていなかった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をエプレレノン１００ｍｇＱＤまたはプラセボに増量した。４または６週目にＢＰが抑制されておらず、被験薬の用量が以前に増量されていなかった場合、用量をエプレレノン１００ｍｇＱＤまたはプラセボに増量した。用量は、試験中１回だけ増量するものとした。試験中のいずれかの時点に症候性低血圧（すなわち、低ＢＰに伴うふらつき感、めまいまたは失神）が発生した場合、患者を中止させなければならなかった。
プトコールに規定された時点の試験評価は、ＢＰ、心拍数、臨床検査、ＥＣＧおよび併用薬などであった。試験中安全性は、常用臨床検査、バイタルサイン、理学的検査、１２誘導ＥＣＧおよび有害事象のモニタリングにより評価した。試験中のいずれかの時点に、患者のカリウム濃度および多復値が＞５．５ｍＥｑ／Ｌであった場合、患者の試験を中止した。
試験は、各群および各コホートに６０例の無作為化患者を含むように設計された。２７２人の患者が実際に次のように無作為化された。すなわち、ＣＣＢコホートに１３７例（プラセボ６７例、エプレレノン７０例）が、ＢＢコホートに１３５例（プラセボ６６例、エプレレノン６９例）が無作為化された。
ＢＢまたはＣＣＢによりＢＰが抑制されていなかった患者では、ＢＢへのエプレレノンの追加はＤＢＰおよびＳＢＰを降下させるのに有効であり、ＣＣＢへのエプレレノンの追加はＳＢＰを降下させるのに有効であった（図Ｄ−５６およびＤ−５７）。
有害事象、理学的検査、心拍数およびＥＣＧの評価に基づいて、エプレレノンは、追加降圧薬として安全かつ許容度が良好であった。選択した臨床検査値（すなわち、ナトリウム、マグネシウム、ＢＵＮ、クレアチニン、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＧＧＴ、尿酸、ブドウ糖、脂質［総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリド］）の臨床的に重要な変化はなかった（図Ｄ−５８）。
表Ｄ−１０に示すように、ＣＣＢコホート内では、プラセボ投与患者と比較して多くのエプレレノン投与患者が各時点に投与に対して応答した（ｓｅＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇまたは基準からの≧１０ｍｍＨｇの降下）。ＢＢホート内では、プラセボ投与患者と比較して有意に大きい割合のエプレレノン投与患者が各時点に投与に対して応答した（ｐ≦０．０１１）。
実施例Ｄ−１１：エプレレノンは軽度から中等度高血圧症の長期治療用として安全かつ有効である
試験設計を図Ｄ−５９に示す。これは、軽度から中等度の高血圧症を有する患者におけるＥＰＬの安全性、許容度および有効性を評価した６〜１６カ月間の非盲検単一群効果対滴定試験であった。
ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇおよび＜１１０ｍｍＨｇ、またはＳＢＰ≧１４０ｍｍＨｇおよび＜１８０ｍｍＨｇを有する患者（ｎ＝５８６）にＥＰＬ５０ｍｇＱＤを投与した。２または４週目にＢＰが抑制されていなかった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ≧１４０ｍｍＨｇ）場合、ＥＰＬを１００ｍｇＱＤおよび必要な場合、２００ｍｇＱＤに増量した。６週目から３カ月目の終了時までのいずれかの時点にＢＰが抑制されないままであった場合、治験責任医師が選択した別の降圧薬を追加した。プロトコールに規定された時点に安全性、許容度およびＢＰを評価した。
図Ｄ−６０およびＤ−６１に示すように、ＤＢＰおよびＳＢＰの降下がすべての用量群で認められた。治療の終了時に合計４３３人の患者（５８２例の７４．３％）が応答患者（すなわち、ｓｅＤＢＰ＜９０ｍｍＨｇまたは基準からの≧１０ｍｍＨｇの降下）と分類された。投与患者のうち、４４．８％（５８２例中２６１例）の患者がエプレレノン単剤療法に応答した。基準から治療の終了時までの、応答患者のｓｅＤＢＰおよびｓｅＳＢＰの平均および平均変化を表Ｄ−１２に示す。
被験薬との関係が「不確実」または「確実」とみなされた治療中に発生した有害事象（ＡＥｓ）を報告した患者の割合は、それぞれ２１．５％および８．４％であった。図Ｄ−６２に示すように、不能症、女性化乳房および月経異常が５０、１００および２００ｍｇの用量を投与した患者のそれぞれ３．０％、０．７％および２．５％に認められたが、これらの事象の大部分が被験薬との関係が不確実またはないとみなされた。
Ｋ＋レベルの上昇が患者の２．４％、主としてＥＰＬ２００ｍｇの投与を受けた患者で認められた。基準ＳＢＰ／ＤＢＰからの平均変化は、最終用量レベルがＥＰＬ５０ｍｇ（Ｎ＝６８）であった患者で−１５．９／−１０．６、ＥＰＬ１００ｍｇ（Ｎ＝８９）で−１８．１／−１２．２、ＥＰＬ２００ｍｇ（Ｎ＝１０４）で−１９．１／−１２．５、ＥＰＬ２００ｍｇ＋追加療法（Ｎ＝１７２）で−２４．９／−１４．６であった。
エプレレノンによる軽度から中等度高血圧症の長期治療は、単剤療法として、または他の降圧薬と併用して用いた場合、安全かつ有効である。
単独で５０〜２００ｍｇの１日投与量で、または他の降圧薬とともに２００ｍｇ／日で最長１４カ月間投与したエプレレノンは、安全で、許容度が良好であった。
実施例Ｄ−１２：携帯型血圧測定（ＡＢＰＭ）におけるエプレレノン対アムロジピン
この試験プロトコールを図Ｄ−６３に示す。これは、多施設共同無作為化二重盲検実薬対照プラセボ予備試験並行群試験であった。試験は、１６週間の二重盲検無作為化投与期間への無作為化の前の１〜２週間の投与前スクリーニング期間に続く２〜４週間の単純盲検プラセボ予備試験期間からなっていた。患者をエプレレノン５０ｍｇまたはアムロジピン２．５ｍｇの投与を受けるように無作為化した。
２週目にＤＰＢが抑制されていなかった（ＤＢＰ≧９０ｍｍＨｇ）場合、被験薬の用量をエプレレノン１００ｍｇまたはアムロジピン５ｍｇに１用量段階増量した。４、６，８または１２週目にＢＰが抑制されていなかった場合、被験薬の用量を１用量段階増量した（エプレレノン１００ｍｇもしくは２００ｍｇまたはアムロジピン５ｍｇもしくは１０ｍｇに）。これらの来院時に、患者がエプレレノン２００ｍｇまたはアムロジピン１０ｍｇの投与を少なくとも１４日間受け、ＢＰが抑制されていなかった場合、患者の試験を中止しければならなかった。症候性低血圧症（すなわち、低ＢＰに伴うふらつき感、めまいまたは失神）が４、６，８または１２週目に発生し、患者が用量レベル２または３の投与を受けていた場合、用量を１用量段階減量した（用量レベル１または２に）。２週目または４、６，８または１２週目に症候性低血圧症が発生し、患者が最低用量（用量レベル１）の投与を受けていた場合、患者の試験を中止しなければならなかった。
プトコールに規定された時点の試験評価は、ＢＰ、心拍数、ＡＢＰＭ、ホルター記録、血清中カリウム濃度を含む臨床検査および併用薬などであった。試験中安全性は、常用臨床検査、バイタルサイン、理学的検査、１２誘導ＥＣＧおよび有害事象のモニタリングにより評価した。試験中のいずれかの時点に、患者のカリウム濃度および反復測定値が＞５．５ｍＥｑ／Ｌであった場合、患者の試験を中止した。
２４時間拡張期ＡＢＰＭにより評価したアムロジピンの抗高血圧作用は、エプレレノンのそれより大きかった（図Ｄ−６４）。２４時間収縮期ＡＢＰＭにより評価したエプレレノとアムロジピンの抗高血圧作用は同等であった（図Ｄ−６５）。
ＡＢＰＭにより評価したアムロジピンの血圧降下作用は、昼間はエプレレノンより大きく、夜間および谷値はエプレレノンと同等であった（図Ｄ−６５〜Ｄ−６７）。
１時間ごとの基準平均ＳＢＰ（図Ｄ−６８）およびＤＢＰ（図Ｄ−６９）ならびに１時間ごとの終点平均ＳＢＰ（図Ｄ−７０）およびＤＢＰ（図Ｄ−７１）は、アムロジピンまたはエプレレノンの投与後に同等であった。心拍数×収縮期血圧（ＨＲ×ＳＢＰ）に対するアムロジピンとエプレレノの作用は同等であった。
活性レニンおよび血清中アルドステロン濃度は、鉱質コルチコイド受容体の遮断とＲＡＡＳの代償性フィードバック活性化を示すものであった。
アムロジピンがより大きい発生率の末梢浮腫を随伴したこと以外は、エプレレノンとアムロジピンは安全かつ許容度が良好であった（図Ｄ−７２）。
実施例Ｄ−１３：収縮期高血圧を有する４００人の患者における携帯型および臨床ＢＰを用いた新規の選択的アルドステロン遮断薬エプレレノンの評価
この試験のプロトコールを図Ｄ−７３に示す。全身性高血圧におけるエプレレノンの有用性を評価するために、１２週間の二重盲検プラセボ対照並行群固定量試験をステージＩ〜ＩＩＩ高血圧の治療における一連の用量にわたり実施した。基準臨床および形態型ＢＰ測定（ＡＢＰＭ）を得るための３〜４週間の単純盲検プラセボ治療の後に、４００人の患者をプラセボまたはエプレレノンの４用量（２５、５０、１００および２００ｍｇＱＤ）のうちの１用量の投与を受けるように無作為化した。１２週間の治療の終了時に臨床および携帯型ＢＰを用いて患者を再評価した。
エプレレノン投与での臨床および携帯型ＢＰの基準からの変化を表Ｄ−１３および図Ｄ−７４〜Ｄ−７５に示す。カフｓｅＤＢＰ（図Ｄ−７６）およびカフｓｅＳＢＰ（図Ｄ−７７）の基準からの変化も示す。
図Ｄ−７８に示すように、エプレレノン投与患者に女性化乳房、月経異常または乳房痛の報告はなかった。エプレレノンに帰せられたＡＥｓおよび中止率は、プラセボのそれと同様であった。したがって、これらのデータは、エプレレノンはＡＢＭＰでは１日当たり２５ｍｇと低い用量で有効であったことを示している。さらに、臨床および携帯型ＢＰに基づくステージＩ〜ＩＩＩ高血圧における最高有効量は１日当たり１００ｍｇであった。
Ｆｏｒｍ Ｈエプレレノンの粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンの粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 メチルエチルケトンから直接結晶化させた未粉砕Ｆｏｒｍ Ｌの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱重量変化記録図を示す図である。 メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの結晶化により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕Ｆｏｒｍ Ｌの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱重量変化記録図を示す図である。 高純度エプレレノンのメチルエチルケトン溶液から溶媒和物を結晶化させ、溶媒和物を脱溶媒和してＦｏｒｍ Ｌを生成させ、得られたＦｏｒｍ Ｌを粉砕して、調製したＦｏｒｍ Ｌの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱重量変化記録図を示す図である。 適切な溶媒からの低純度エプレレノンの温浸により得られた溶媒和物の脱溶媒和により調製した未粉砕Ｆｏｒｍ Ｈの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱重量変化記録図を示す図である。 Ｆｏｒｍ Ｈエプレレノンの赤外スペクトル（拡散反射、ＤＲＩＦＴＳ）を示す図である。 Ｆｏｒｍ Ｌエプレレノンの赤外スペクトル（拡散反射、ＤＲＩＦＴＳ）を示す図である。 エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の赤外スペクトル（拡散反射、ＤＲＩＦＴＳ）を示す図である。 クロロホルム溶液中のエプレレノンの赤外スペクトル（拡散反射、ＤＲＩＦＴＳ）を示す図である。 エプレレノンのＦｏｒｍ Ｈの１３ＣＮＭＲを示す図である。 エプレレノンのＦｏｒｍ Ｌの１３ＣＮＭＲを示す図である。 メチルエチルケトン溶媒和物の熱重量分析プロファイルを示す図である。 メチルエチルケトンから分離した７−メチル水素４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトンの結晶形の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 イソプロパノールから分離した７−メチル水素１１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトンの結晶形の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 ｎ−ブタノールから分離した７−メチル水素１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，９（１１）−ジエン−７α，２１−ジカルボン酸，γ−ラクトンの結晶形の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 ヒト対象におけるエプレレノンの用量の関数としてプロットした収縮期血圧の変化を示す図である。 ヒト対象におけるエプレレノンの用量の関数としてプロットした拡張期血圧の変化を示す図である。 １ヒト対象におけるにおけるエプレレノンの用量の関数としてプロットした血漿レニン活性および血清アルドステロンの変化を示す図である。 １、５、９および１３日目のＬ−ＮＡＭＥの投与開始の前後の収縮期血圧を示す図である。 屠殺後に測定した血漿レニン活性（Ａ）および血清中アルドステロン濃度（Ｂ）を示す図である。 （Ａ）Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ処理により誘発された心筋壊死、（Ｂ）壊死病変を示さない、鉱質コルチコイド受容体拮抗薬エプレレノンの存在下でのＬ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌの投与を受けた動物の心筋、Ｃコラーゲン特異色素による図Ａの心臓の染色、および（Ｄ）コラーゲン特異色素による図２７Ｂの心臓の染色に関する、心臓の組織病理を示す図である。 心筋壊死に関する組織病理学的評点を示す図である。 屠殺当日（１４日目）に収集した試料中の尿蛋白排泄を示す図である。 （Ａ）Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌの投与を受けた動物の中央冠状断面腎切片のＰＡＳで染色した腎の組織病理検査、および（Ｂ）Ｌ−ＮＡＭＥ／アンジオテンシンＩＩ／ＮａＣｌ＋エプレレノンの投与を受けたラットの腎皮質を示す図である。 腎血管損傷に関する組織病理学的評点を示す図である。 アルドステロン／食塩による単腎摘出ラットの冠動脈における炎症性病変を示す図である。 アルドステロン／食塩による単腎摘出ラットのエプレレノン投与冠動脈における炎症性病変を示す図である。 アルドステロン／食塩による単腎摘出ラットにおける心筋損傷を示す図である。 食塩水摂取脳卒中易発性ＳＨＲラットの生存率を示す図である。 食塩水摂取脳卒中易発性ＳＨＲラットのＳＢＰを示す図である。 食塩水摂取脳卒中易発性ＳＨＲラットの脳損傷を示す図である。 食塩水摂取脳卒中易発性ＳＨＲラットの脳損傷を示す図である。 ８．４週齢から１３．１週齢までエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）または溶媒の長期投与を受けた脳卒中易発性高血圧自然発生ラットにおける試験終了前の（Ａ）収縮期動脈血圧（ＳＢＰ）および（Ｂ）尿蛋白排泄量を示す図である。 ８週齢から開始した５週間のエプレレノンまたは溶媒の投与の後の食塩水摂取脳卒中易発性高血圧自然発生ラットのヘマトキシリンおよびエオシンで染色した中央冠状断面腎切片の代表的な顕微鏡写真。 カプトプリル＋溶媒（ＣＡＰ）、カプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ（ＣＡＰ＋アンジオテンシンＩＩ）またはカプトプリル＋アンジオテンシンＩＩ＋エプレレノン（ＣＡＰ＋アンジオテンシンＩＩ＋ＥＰＬ）の投与中の食塩水摂取脳卒中易発性高血圧自然発生ラットにおける（Ａ）収縮期動脈血圧および（Ｂ）尿蛋白排泄量を示す図である。 ８．３週齢で開始したカプトプリル投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）および１％ＮａＣｌ／脳卒中易発性飼料で開始された脳卒中易発性高血圧自然発生ラットにおける血漿中アルドステロン濃度を示す図である。 （Ａ）カプトプリル＋溶媒を投与したおよび食塩水摂取脳卒中易発性高血圧自然発生ラットおよび（Ｂ）カプトプリルを投与した動物のヘマトキシリンおよびエオシンで染色した腎皮質の代表的な顕微鏡写真。 エプレレノンのＰＫプロファイル（Ｃｍａｘ）に対する集団の影響を示す図である。 エプレレノンのＰＫプロファイル（ＡＵＣｌｑｃ）に対する集団の影響を示す図である。 エプレレノンのＰＫプロファイル（ＡＵＣｉｎｆ）に対する集団の影響を示す図である。 エプレレノンのＰＫプロファイル（ＣＬ／Ｆ）に対する集団の影響を示す図である。 エプレレノンのＰＫプロファイル（Ｖｏｌ／Ｆ）に対する集団の影響を示す図である。 ラクトン環が開環形のエプレレノンのＰＫプロファイル（Ｃｍａｘ）に対する集団の影響を示す図である。 ラクトン環が開環形のエプレレノンのＰＫプロファイル（ＡＵＣｌｑｃ）に対する集団の影響を示す図である。 ラクトン環が開環形のエプレレノンのＰＫプロファイル（ＡＵＣｉｎｆ）に対する集団の影響を示す図である。 ラクトン環が開環形のエプレレノンのＰＫプロファイル（ＣＬ／Ｆ）に対する集団の影響を示す図である。 ラクトン環が開環形のエプレレノンのＰＫプロファイル（Ｖｏｌ／Ｆ）に対する集団の影響を示す図である。 多回投与後のエプレレノンの平均血漿中濃度を示す図である。 （ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％および（ｄ）５％ジエポキシドドープメチルエチルケトン結晶化により得られた湿潤ケーキ（メチルエチルケトン溶媒和物）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 （ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％および（ｄ）５％ジエポキシドドープメチルエチルケトン結晶化により得られた乾燥固体の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 （ａ）乾燥前に溶媒和物を粉砕しなかった場合、および（ｂ）乾燥前に溶媒和物を粉砕した場合の３％ジエポキシドドーピングを伴うメチルエチルケトン結晶化により得られた乾燥固体の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 （ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％および（ｄ）１０％の１１，１２−エポキシドドープメチルエチルケトン結晶化により得られた湿潤ケーキ（メチルエチルケトン溶媒和物）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 （ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％および（ｄ）１０％の１１，１２−エポキシドドープメチルエチルケトン結晶化により得られた乾燥固体の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 表７Ａに報告したデータに基づく生成物純度、出発原料純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを示す図である。 最終材料の純度に対して統計的に有意な影響を有する変数を決定するために図１５の立方体プロットを用いて作製した半正規プロットを示す図である。 最終材料純度に関する出発原料純度と冷却速度との間の相互作用を示す表７Ａに報告した結果に基づく相互作用グラフを示す図である。 表７Ａに報告したデータに基づくＦｏｒｍ Ｈ重量分率、出発原料純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを示す図である。 最終材料の純度に対して統計的に有意な影響を有する変数を決定するために図１８の立方体プロットを用いて作製した半正規プロットを示す図である。 最終材料純度に関する出発原料純度と終点温度との間の相互作用を示す表７Ａに報告した結果に基づく相互作用グラフを示す図である。 無定形エプレレノンの粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。 無定形エプレレノンのＤＳＣサーモグラムを示す図である。 ＤＢＰの基準からの平均変化を示す図である。 ＳＢＰの基準からの平均変化を示す図である。 用量範囲要因設計試験設計を示す図である。 用量範囲要因設計、最終来院時のＤＢＰの平均変化を示す図である。 用量範囲要因設計、最終来院時のＳＢＰの平均変化を示す図である。 エプレレノン対エナラプリルの滴定用量、試験設計を示す図である。 エプレレノン対エナラプリルの滴定用量、ＢＰの基準からの平均変化（２４週目）を示す図である。 エプレレノン対エナラプリルの滴定用量、ＢＰの基準からの平均変化（１２カ月目）を示す図である。 エプレレノン対エナラプリルの滴定用量、特別な関心を引く有害事象を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、試験設計を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、基準ｌｖｍからの平均変化を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、基準ＬＶＭからの平均変化：最終来院を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、ＬＶＭの基準からの平均変化を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、基準ＢＰからの平均変化、ＬＶＨ患者最終来院を示す図である。 （ＬＶＨ）に関するエプレレノン対エナラプリル対併用、特別な関心を引く事象を示す図である。 低レニン高血圧、ＢＰの基準からの平均変化、８週目（単剤療法終点）を示す図である。 低レニン高血圧、ＢＰの基準からの平均変化、１６週目（最終来院）を示す図である。 低レニン高血圧、追加ｈｃｔｚの投与を受けた患者の割合を示す図である。 低レニン高血圧、応答患者率を示す図である。 低レニン高血圧、特別な関心を引く有害事象を示す図である。 黒人および白人集団における比較、試験設計を示す図である。 黒人および白人集団における比較、基準からの平均変化、白人、最終来院を示す図である。 黒人および白人集団における比較、基準からの平均変化、黒人、最終来院を示す図である。 黒人および白人集団における比較、基準からの平均変化、全患者最終来院を示す図である。 黒人および白人集団における比較、特別な関心を引く有害事象を示す図である。 試験設計を示す図である。 基準からの平均変化、２４週目のｕａｃｒを示す図である。 ８週目および２４週目のｕａｃｒ（μｇ／ｇ）の相乗平均を示す図である。 ８週目および２４週目のＳＢＰの基準からの平均変化を示す図である。 ８週目および２４週目のＤＢＰの基準からの平均変化を示す図である。 特別な関心を引く有害事象を示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、試験設計を示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、ＢＰの基準からの平均変化（２４週目）を示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、２４時間平均ＢＰ ＡＢＰＭ測定の基準からの平均変化を示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、２４時間平均ｐｐ ＡＢＰＭ測定、脈圧の基準からの平均変化を示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、基準からの平均変化、頚動脈−大腿動脈ＰＷＷを示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン、基準からの平均変化、頚動脈−撓骨動脈ＰＷＷを示す図である。 高ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピンを示す図である。 特別な関心を引く有害事象を示す図である。 ＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢとの併用投与、試験設計を示す図である。 ＡＣＥ−Ｉにより抑制されなかった患者におけるＢＰの平均変化（各来院）を示す図である。 ＡＣＥ−ＩまたはＡＲＢとの併用投与、ＢＰの基準からの平均変化、８週目（最終来院）を示す図である。 ８週目（最終来院）のＢＰの基準からの平均変化を示す図である。 ＡＲＢにより抑制されなかった患者におけるＢＰの平均変化（各来院）を示す図である。 基準からの平均変化：臨床検査値を示す図である。 ＡＣＥ−Ｉにより抑制されなかった患者における血清カリウム値の変化を示す図である。 ＡＲＢにより抑制されなかった患者における血清カリウム値の変化を示す図である。 関心を引く有害事象を示す図である。 重篤な有害事象を示す図である。 心拍数の平均変化を示す図である。 活性レニンおよびアルドステロン濃度の平均値を示す図である。 活性レニンおよびアルドステロン濃度の平均値を示す図である。 試験中止の理由を示す図である。 治療に対して応答した患者の割合：ＤＢＰを示す図である。 ＡＣＥ−ＩおよびＡＲＢとの併用投与を示す図である。 ＣＣＢまたはβ遮断薬との併用投与を示す図である。 ＣＣＢまたはβ遮断薬との併用投与を示す図である。 ＣＣＢまたはβ遮断薬との併用投与を示す図である。 非盲検長期安全性試験設計を示す図である。 ＤＢＰの平均変化を示す図である。 ＳＢＰの平均変化を示す図である。 特別な関心を引く有害事象を示す図である。 ＡＢＰＭにおけるエプレレノン対アムロジピン試験設計を示す図である。 ＡＢＰＭ ＤＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：基準からの平均変化（ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：基準からの平均変化（ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：基準からの平均変化（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＤＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：基準からの平均変化（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：１時間ごとの基準平均値（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＤＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：１時間ごとの基準平均値（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：１時間ごとの終点平均値（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭ ＳＢＰにおけるエプレレノン対アムロジピン：１時間ごとの終点平均値（２４時間ＡＢＰＭ）を示す図である。 ＡＢＰＭにおけるエプレレノン対アムロジピン特別な関心を引く有害事象を示す図である。 試験概略図を示す図である。 基準からの平均変化：カフＢＰ１２週目（最終来院）を示す図である。 基準からの平均変化（ＡＢＰＭ）を示す図である。 カフｓｅＤＢＰの基準からの調整済み平均変化を示す図である。 カフｓｅＳＢＰの基準からの調整済み平均変化を示す図である。 特別な関心を引く事象を示す図である。

Claims (26)

  1. 以下の条件
    （ａ）対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい、
    （ｂ）対象がミクロアルブミン尿症、軽度から中等度の高血圧および低血漿レニンレベルからなる群から選択される１つまたは複数の状態を示す、
    （ｃ）対象が黒人である、
    （ｄ）対象がアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬による治療に反応して少なくとも約４％未満の血圧降下を示す、あるいは
    （ｅ）対象が、少なくとも約６０歳の年齢、収縮期高血圧、脈圧の拡大およびミクロアルブミン尿症からなる群から選択される、１つまたは複数の状態を示す、
    のうちの１つまたは複数の条件を満たす対象に治療上有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含む、臓器障害に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の臓器障害を治療または予防する方法。
  2. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項１に記載の方法。
  3. 臓器が心臓、腎臓、脳、肝臓および肺からなる群から選択される臓器である請求項１に記載の方法。
  4. 対象における尿中アルブミンの対クレアチニン比を治療開始後１２週間以内に、治療開始前の基準尿中アルブミンの対クレアチニン比と比較して、少なくとも約１０％低下させるのに有効な量でエポキシステロイド化合物を投与する請求項１に記載の方法。
  5. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項１に記載の方法。
  6. 対象に治療上有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含み、糸球体濾過率の低下、ミクロアルブミン尿症および蛋白尿からなる群から選択される腎機能障害に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の腎機能障害を治療または予防する方法。
  7. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項６に記載の方法。
  8. 対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい請求項６に記載の方法。
  9. 対象における尿中アルブミンの対クレアチニン比を治療開始後１２週間以内に、治療開始前の基準尿中アルブミンの対クレアチニン比と比較して、少なくとも約１０％低下させるのに有効な量でエポキシステロイド化合物を投与する請求項６に記載の方法。
  10. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項６に記載の方法。
  11. 対象に治療上有効な量、すなわち対象における尿中アルブミンの対クレアチニン比を治療開始後１２週間以内に、治療開始前の基準尿中アルブミンの対クレアチニン比と比較して、少なくとも約１０％低下させるのに有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含む、末期腎疾患を罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の末期腎疾患を治療または予防する方法。
  12. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項１１に記載の方法。
  13. 対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい請求項１１に記載の方法。
  14. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項１１に記載の方法。
  15. 対象に治療上有効な量、すなわち、
    （ａ）治療開始前の基準コラーゲンターンオーバーと比較して、治療開始後１２週間以内のコラーゲンターンオーバーの少なくとも約５％の量的低下、または
    （ｂ）治療開始前の基準尿中アルブミン対クレアチニンと比較して、治療開始後１２週間以内の尿中アルブミン対クレアチニンの少なくとも約１０％の低下、
    の少なくとも１つを達成するのに有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含む、左室肥大に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の左室肥大を治療または予防する方法。
  16. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項１５に記載の方法。
  17. 対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい請求項１５に記載の方法。
  18. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項１５に記載の方法。
  19. 対象に治療上有効な量、すなわち収縮期血圧を治療開始後１２週間以内に、治療開始前の基準収縮期血圧と比較して、少なくとも約１％低下させるのに有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含む、ヒト対象における収縮期血圧を降下させる方法。
  20. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項１９に記載の方法。
  21. 対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい請求項１９に記載の方法。
  22. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項１９に記載の方法。
  23. 対象に治療上有効な量のエポキシステロイド化合物を投与することを含む、先天性障害、弁障害、冠動脈障害、院内疾患、外科的に誘発された障害、心筋症性障害、ウイルス誘発性障害、細菌誘発性障害、解剖学的障害、血管障害、移植誘発性障害、虚血性障害、不整脈障害、伝導障害、血栓性障害、大動脈障害、凝固障害、結合組織障害、神経筋障害、血液学的障害、低比重障害、内分泌障害、肺障害、非悪性腫瘍障害、悪性腫瘍障害および妊娠誘発性障害からなる群から選択される心血管障害に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の心血管障害を治療または予防する方法。
  24. エポキシステロイド化合物がエプレレノンである請求項２３に記載の方法。
  25. 対象がインスリン抵抗性またはブドウ糖感受性を有するか、または有しやすい請求項２３に記載の方法。
  26. 心臓または腎臓に関連する状態に対する標準療法による治療に対して、対象が実質的に不応性である請求項２３に記載の方法。
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