JP2005515772A - 多重ウィルスレプリコン培養システム - Google Patents
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Abstract
レプリコンおよびミニゲノムのようなサブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を使用する、候補抗ウィルス剤をスクリーニングするための方法および組成物が、提供される。本方法は、１つ以上のサブゲノムウィルス複製システムの同時アッセイを含んでいる。本方法に有用な組成物も、提供される。
Description
本発明は一般に、細胞培養を使用する、抗ウィルス化合物を求めてスクリーニングする方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、複数のサブゲノムウィルス複製システムを有する複数の細胞培養の使用に関し、抗ウィルス活性に関して化合物を評価する。
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抗ウィルス活性を有する化合物を発見および同定するための１次スクリーニング・プログラムは、種々の方法で設計され得る。しかしながら全てのプログラムが、２つの一般的なアプローチの内の１つに入ってしまう。この標的とされるアプローチでは、１つの特異的な生化学的な標的が選ばれ、候補抗ウィルス化合物が該標的の阻害に関してスクリーニングされる。該標的はしばしば、ウィルスの複製プロセスに必須であるものと知られ、または必須であるものと考えられている酵素または受容体（レセプター）である。この代わりのアプローチはバイアスがかかっていないので、ウィルス複製の阻害剤は、該標的に関して、予め分かっている関連情報なしに探索される。このバイアスのかかっていないアプローチは一般に細胞培養の使用を含んでおり、これは、必要な細胞内病原として、ウィルスが細胞内でのみ複製可能だからである。細胞を基盤としたスクリーニングは、薬剤発見の分野全体に亘り成功裏に使用されて来たが、抗ウィルス剤に関してスクリーングする場合には問題がある。これは、それが細胞上への感染ウィルスの播種および更なる感染ウィルスの子孫の産生を要求するからである。特に、このような感染材料を取り扱うことは、化合物の大きなライブラリーをスクリーニングするハイ・スループット（ＨＴ）・プロセスとは容易に相容れない。
これ故に、抗ウィルス化合物をスクリーニングして分析するのに有用な改善された方法および組成物に対しての必要性がある。特に、これらの方法および組成物は、ＨＴの抗ウィルススクリーニングに有用であるべきである。本明細書中で記載される本発明は、この必要性を満足するものである。
従って、本発明は、サブゲノムウィルス複製システムを利用する方法および組成物を提供し、潜在的な抗ウィルス化合物を評価するものである。これらの方法および組成物の使用は、同時に複数のウィルスに対してのこれらの潜在的な抗ウィルス化合物の速いスクリーニングを可能にする。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗ウィルス活性に関する候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法に関する。該方法は、遺伝子的にお互いに区別可能な、少なくとも２つのサブゲノムウィルス複製システムの使用を含む。該方法は、第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を調製し、該候補抗ウィルス剤を各細胞培養に加え、これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、該細胞培養をインキュベートし、各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を決定することを含んでいる。
本発明に関する実施形態は、抗ウィルス活性に関して候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法に関する。該方法もまた、遺伝子的にお互いに区別可能な、少なくとも２つのサブゲノムウィルス複製システムの使用を含む。該方法は、第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を組み合わせて混合細胞培養を調製し、該候補抗ウィルス剤を該混合細胞培養に加え、これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、該混合細胞培養をインキュベートし、各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を決定することを包含する。
本発明は、第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を包含する混合細胞培養にも関する。
本発明は、抗ウィルス活性について候補抗ウィルス剤を評価するに有用な新規な方法および組成物を提供する。該方法は、１つより多いサブゲノムウィルス複製システムに関して、該候補抗ウィルス剤の抗ウィルス活性を評価することを同時に含む。これらの方法において、各サブゲノムウィルス複製システムは、細胞培養の細胞中で複製を行うことが出来、それで該候補抗ウィルス剤の抗ウィルス活性が、該細胞培養へ該候補抗ウィルス剤を適用すること、および該細胞培養中で該サブゲノムウィルス複製システムの複製に関しての該候補抗ウィルス剤の効果を決定することにより、評価される。
本明細書中で使用される場合、サブゲノムウィルス複製システムは、複製を行うことは出来るが、感染性ウィルス粒子を産生するに必須である１つ以上の遺伝子要素に欠けている。
２つのタイプのサブゲノムウィルス複製システム：レプリコン（replicon）および不完全ゲノム（ミニゲノム）がある。
ウィルスレプリコンはサブゲノムウィルス複製システムであり、ウィルスゲノムに由来し、これはｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養された細胞内で複製を行うことが出来る（Ａｇａｐｏｖら、１９９８年）。それらは、細胞内でのウィルスゲノムの複製および転写に要求されるｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−にて作用するウィルス成分の全てを典型的にコード化するが、ウィルスの完全な複製に要求される機能要素を１つ以上欠いている。該要素は、その機能をコード化する配列の全部または一部の欠損により、欠損させることが出来るであろうし、あるいは、該要素は、点突然変異のような、該要素を非機能的にする突然変異により、欠損させることが出来るであろう。
最近、幾つかの報告が、細胞中での恒常的な複製が可能なレプリコンの選択を記載した（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９９年）。これ故に、数多くのウィルスについて、ウィルスレプリコンを恒常的に複製することを含有する細胞株を創出することが出来る。表１は、レプリコンが調製されたかまたは過度な実験なしに調製され得るウィルスの、部分的なリストを提示するものである。
レプリコンを含む細胞培養は、抗ウィルス剤の発見および分析において、数多くの利益をもたらす。それらは、生存細胞に関して観察される抗ウィルス剤の効果を実現させ、それで、抗ウィルス活性を示す該抗ウィルス剤は、生存細胞内に必ず入り作用する。レプリコン含有細胞培養もまた、よく確立された細胞毒性アッセイを使用して、明らかに望まれない細胞毒性を有する抗ウィルス剤を直ぐに同定することを可能にする。これらの細胞培養はまた、従来ｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養され得ない、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）やヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）のようなウィルスに対して行われる、細胞を基盤とした薬剤発見や他の研究を可能にする。感染性に関連したウィルス機能は、ウィルスゲノム複製については典型的には要求されないため、感染性に関連した少なくとも１つの配列を欠くレプリコンは遙かにより安全であり、これ故に感染性ウィルスよりも、これを用いて作業するのはより容易である。本明細書中で使用される場合、感染性に関連した配列は、ウィルスが細胞に感染するのに要求される配列である。
レプリコン含有細胞培養のもう１つ別の利点は、該レプリコンを遺伝子的に操作し、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質（ＭａｃＤｏｎａｌｄおよびＪｏｈｎｓｏｎ、２０００年）のようなレポーター遺伝子をコード化するもののような異種接合配列を含ませることが出来、これらはウィルスゲノムのコピー数のＨＴ自動化分析を簡単化することである（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６年）。
非感染性ウィルス複製システムを開発する代替アプローチは、不完全ゲノムを使用することである。不完全ウィルスゲノムは、ウィルスゲノム複製および転写に要求される全てのｃｉｓ作用性要素（因子）を含有するが、複製に要求されるｔｒａｎｓ作用性要素をコード化する遺伝子要素を１つ以上欠いている。このような不完全ウィルスはこれ故に、それら自体では複製出来ない（すなわち、それらはレプリコンではない）が、それらは、もしこれらの欠損した要素（単数または複数）がｔｒａｎｓにて供給されれば、複製され得るものである。該不完全ゲノムに加えてこれら必要なｔｒａｎｓ作用性因子を含有する細胞は、部分的なウィルスレプリコンが該細胞内で生じ、感染性ウィルスが産生されないレプリコンに似た機能を呈する。複製レプリコンを含有する細胞培養を用いる場合は、複製する不完全ウィルスゲノムを含有する細胞培養は、抗ウィルス薬剤の発見に有用なツールを代表するものである。不完全ゲノムの例は、それぞれαウィルス（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス）およびヘルペスウィルス（例えば、１型ヘルペス単式ウィルス）のような、多くのＲＮＡおよびＤＮＡウィルスに関して観察されている不完全干渉ウィルス粒子内に含有されるゲノムを包含する。
不完全ゲノムのもう１つ別の例は、ミニゲノムである。これは、気道多核ウィルス（ＲＳＶ）、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス等のような、数多くの（−）鎖ＲＮＡウィルスに関して構築されている人工ゲノムの１タイプである。これらのウィルスのミニゲノムは、前記ウィルスＲＮＡゲノムの複製に要求されるｃｉｓ作用性配列要素の全ては含有する不完全ゲノムであるが、完全なウィルスゲノムのコード領域の１つまたは全てを欠いている。
不完全ウィルスゲノムのもう１つ別の例は、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ−１）のようなＤＮＡウィルスの、およびパポバウィルス（例えば、サルのウィルス４０（ＳＶ４０））のような他のＤＮＡウィルスの、いわゆるアンプリコン（amplicon）である。このようなアプリコンは、ウィルス由来の複製開始点（単数または複数）を含有し、該ウィルスにより要求されるｔｒａｎｓ作用性複製因子（開始点結合タンパク質、複製酵素等）により細胞内で複製される環状ＤＮＡ分子である。
これらのサブゲノムウィルス複製システムを利用するスクリーニングのプロセスは、ウィルスゲノム複製およびウィルス遺伝子の転写に含まれている如何なる生化学経路の阻害剤をも同定し得る。該経路に関しての候補抗ウィルス剤の効果を測定可能な、興味ある該経路に関しての該効果を評価するスクリーニング手順を選択することだけが、必要である。例えば、複製に含まれている如何なる経路を標的とする物質をも同定するためには、複製の末端産物（例えば、その複製されたゲノム）が、該物質を用いた処理の後に、例えば定量的ＰＣＲを行って、存在している該ゲノムの代表部分の量を定量することにより、測定される。あるいは、複製に含まれている特異的な経路、例えば、ＲＮＡポリメラーゼの翻訳を標的とする物質を同定するためには、その特定成分の測定、例えば、抗体アッセイによるＲＮＡポリメラーゼの定量が、可能であろう。
本発明は、同時に複数のウィルスに対して候補抗ウィルス剤をスクリーニングするサブゲノムウィルス複製システムの利点を利用する方法および組成物を提供する。候補抗ウィルス剤を用いて１つより多いサブゲノムウィルス複製システムを同時に処理することにより、候補抗ウィルス剤は、より速くスクリーニングされ得る。この複数処理アプローチはまた、テストされる各ウィルスに関しての候補抗ウィルス剤の効果を同時に比較出来る能力を提供するものである。これ故に、このシステムは、該ウィルス効果の特異性に関しての情報を提供する。この情報は、例えば、該効果が特異的なウィルス標的に、または細胞標的に作用しているのかどうかを査定し、これ故に該ウィルス（単数または複数）に関してのそれの効果を間接的に発揮させることにおいて、助けとなる。加えてこのアプローチは、広範な抗ウィルス活性を呈し、これ故に多くのウィルスに対して効果的であり得るであろう化合物の同定を見越したものである。
本発明の好ましい実施形態において、サブゲノムウィルス複製システムを有する細胞培養は、混合ウィルスレプリコン培養（ＭＶＲＣ）としても言及される多重サブゲノム複製培養（ＭＳＲＣ）中へと組み合わせられる。これは、本発明に有用な該レプリコンおよびミニゲノムが、細胞から細胞へと広まらないので可能である。これ故に、各細胞を自立性単位として考えることが出来、各ウィルスに関しての候補抗ウィルス剤の効果の決定は、これらの種々のサブゲノムウィルスレプリコンシステムが、例えば、これらのサブゲノム複製システムの内の１つの断片を増幅させることだけ可能なＰＣＲ法または他の如何なる方法によっても区別可能であることだけを要求する。
ＭＳＲＣは、抗ウィルス剤の発見において、１つのサブゲノム複製システムだけを含有する培養の使用を凌駕する、更なる、および区別可能な利点を提供するスクリーニングシステムを与えるものである。候補抗ウィルス剤をスクリーニングするためにＭＳＲＣを使用することの１つの利点は、それが、一連の区別可能なウィルスに関しての、大きな一覧表に纏められる程の候補抗ウィルス剤の効果を分析するのに要求されるコストおよび労力を抑えるということである。ＭＳＲＣを使用することのもう１つ別の利点は、それが全てのレプリコンが同じ培養条件下に同じ化合物量に晒されたことを保証するものなので、それが区別可能なウィルスレプリコンに関しての薬剤効果の比較を簡単化するということである。
抗ウィルス剤スクリーニングのためにＭＳＲＣを使用するもう１つ別の利点は、ＭＳＲＣシステムが、単一のウィルススクリーニングシステムであれば、見過ごされてしまうであろう抗ウィルス剤の検出を可能にすることである。単一のウィルスに影響を及ぼす抗ウィルス剤が、閾値の阻害濃度を上回る抗ウィルス効果により一般に同定される標準的な単一のウィルススクリーニングシステムであれば。それらの手順では、そのスクリーニングされるウィルス標的に対する閾値レベルを下回る活性を有する抗ウィルス剤は、却下される。ＭＳＲＣシステムをスクリーニングすることにより、それらの複数の標的の内のいずれか１つを標的とする特異的な阻害剤と、複数のウィルスに影響する広範なスペクトルの物質との両方が、同定され得る。区別可能な種々のウィルスレプリコンについての阻害データの同時の回収が、これ故に、他の場合では見過ごされることがあるかも知れないであろう抗ウィルス剤の同定を可能にする。
抗ウィルス剤の発見においてＭＳＲＣを使用することの創出、分析、および利点はまだ記載されていないが、単一のサンプルにおける複数のウィルスの定量を可能にする多重化されたウィルス検出アッセイが知られており、ウィルス感染診断用にまず使用されている。例えば、単一のサンプルにおける複数のウィルスについての、定量的な逆転写ポリメレース・チェーン・リアクション（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による検出アッセイが、記載されている（Elnifro et al., 2000; Grondahl et al., 1999; Fan et al., 1998; Jungkind et al., 1996; Burgart et al., 1992）。分子を足がかりとすることを基盤としたハイブリダイゼーション・プローブも、単一のサンプルにおける複数のウィルスを検出するのに用いられている（Vet et al., 1999）。単一培養ウェルの内容物から独立にアッセイされ得る区別可能なレポーター遺伝子についての多重アッセイも、記載されている（Parsons et al., 2000; Grentzmann et al., 1998）。多重化されたウィルス検出アッセイがＭＳＲＣに関しての候補抗ウィルス剤の効果の分析を容易にするかも知れない一方で、それらはＭＳＲＣを想定したり、またはそれらを明らかにしたりせず、あるいはＭＳＲＣを使用する抗ウィルススクリーニング方法をどのように開発するかを教示するものではないが、これは、それらがサブゲノムウィルス複製システムと共に与えられるこれらの利点を利用しないことによる。加えて、該多重アッセイはやはり、ＭＳＲＣを利用する本発明の抗ウィルススクリーニングアッセイを実行するには要求されないが、これは、複数の単一ウェルアッセイ中へＭＳＲＣの内容物を分割するためのスキームが容易に工夫され得るからである。
これ故に、幾つかの実施形態では、本発明は、抗ウィルス活性について候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法に関する。該方法は、以下のステップ：
（ａ）第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を調製し；
（ｂ）該候補抗ウィルス剤を各細胞培養に加え；
（ｃ）これらの細胞培養を、これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、インキュベートし；および
（ｄ）各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を検出すること
を含む。
（ａ）第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を調製し；
（ｂ）該候補抗ウィルス剤を各細胞培養に加え；
（ｃ）これらの細胞培養を、これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、インキュベートし；および
（ｄ）各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を検出すること
を含む。
たとえこれらのサブゲノムウィルス複製システムを含有するこれらの細胞が、本方法を実行する間に分けられているとしても、幾つかの利点は本発明により達成されるが、これらの培養は、ステップ（ｂ）の前にＭＳＲＣ中へと一緒に混合されることが好ましい。それらの実施形態では、該ＭＳＲＣは、２〜１０以上のサブゲノムウィルス複製システムを含有し得るが、但し個々の各サブゲノムウィルス複製システムに関しての候補抗ウィルス剤の効果は、認識され得る。１つの細胞中に１つより多いサブゲノムウィルス複製システムを持たせることも、可能である（実施例２参照）。
これ故に、各細胞は、サブゲノムウィルス複製システムを有する独立単位であるので、各細胞は、該候補抗ウィルス剤に関する独立した情報を潜在的に提供すると考えられ得る。これ故に、ＭＳＲＣ中で組み合わせられ得る異なるサブゲノムウィルス複製システムの数は、該ＭＳＲＣ中の細胞数と同じくらい多いことがあり得、各細胞中でウィルス複製を評価する方法が使用可能である。このような方法の１例は、各レポーター遺伝子が、例えば異なる蛍光性末端産物を提供する各サブゲノムウィルス複製システムを有する、異なるレポーター遺伝子の準備である（例えば、各ウィルスＲＮＡに特異的な分子の足がかり、あるいは異なる蛍光タンパク質および／または該サブゲノムウィルス複製システムによりコード化される酵素の蛍光産物を使用する）。各細胞はその後、その細胞中のサブゲノムウィルス複製システムと関連したその蛍光部分の蛍光強度を定量化することにより、分析され得る。任意に、このようなデータは、各細胞から、例えば蛍光活性化細胞選別子（sorter）を使用して、得られる。
該ＭＳＲＣはまた、これらの細胞自体に関しての該候補抗ウィルス剤の効果を直接測定するために、サブゲノムウィルス複製システムを含有しないコントロールである細胞培養を含み得る。
本発明に有用なこれらの細胞は、培養中で成育され得、サブゲノムウィルス複製システムを有することが可能な如何なる細胞でもある。これは、植物、菌類、昆虫、および原生生物を包含する如何なる真核細胞ファミリー由来の細胞をも包含するであろう。殆どの実施形態では、これらの細胞は、興味あるウィルスを宿すことが可能な同一の微生物からのものであろう。好ましい実施形態では、これらの細胞は動物細胞であり、好ましくは哺乳類細胞であり；最も好ましい実施形態では、これらの細胞はヒト細胞である。
これらの方法に有用なこれらの細胞は、初代細胞または樹立された細胞株からのものであり得る。ＭＳＲＣ中で一緒に成育される場合、これらの細胞は、各細胞がそれが含有するサブゲノムウィルス複製システムの複製をサポートするような、同様の成育条件を持っていなくてはならない。
これらの細胞中のサブゲノムウィルス複製システムは、これらの細胞中に、一時的、または安定的に維持され得る。該サブゲノムウィルス複製システムが、複製が該候補抗ウィルス剤により阻害されるかどうかを評価できるに充分な時間複製出来ることだけが、要求される。
本発明の方法および組成物において使用される各サブゲノムウィルス複製システムは、評価されるその他のサブゲノムウィルス複製システム（単数または複数）とは遺伝子的に区別出来なくてはならない。これらのサブゲノムウィルス複製システムは、複数の異なるウィルスファミリーまたは同じウィルスファミリー中にあり得、それらは同じウィルスであり得るが異なる遺伝子型でもあり得、あるいは同じウィルスの異なる突然変異体でさえあり得る。唯一の要求は、それらが、前記の２つの細胞培養が一緒に混合される実施形態では、お互い区別可能でなくてはならないことだけである。幾つかの実施形態では、これらのサブゲノムウィルス複製システムは、１塩基対程度と少ない塩基対により異なり得る。このような方法は、例えば１つのサブゲノムウィルス複製システムにおいては突然変異され、その他のシステムにおいては突然変異されない特定のタンパク質が、該候補抗ウィルス剤の標的であるかどうかを決定することにおいて、有用であり得るであろう。
本発明の方法は、ＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、レトロウィルス、およびウィロイドを包含するサブゲノムウィルス複製システム中へと調製され得る如何なるウィルスにも有用である。本発明の方法が、今はサブゲノムウィルス複製システム中へと調製され得ないが、将来はこのようなシステム中へと調製され得るであろう如何なるウィルスに関しても適応可能であろうということも、目論まれる。
本発明に有用なウィルスは、サブゲノムウィルス複製システムが由来し得る如何なるウィルスをも包含する。これは、植物、菌類、昆虫、および原生生物を包含する如何なる真核細胞界、族（門）、またはファミリー由来の微生物の細胞に感染するウィルスを包含するであろう。好ましい実施形態では、該ウィルスは動物細胞、好ましくは哺乳類細胞に感染し；最も好ましい実施形態では、該ウィルスはヒト細胞に感染する。好ましいウィルスの例は表１に包含され、実施例において利用されるようなＣ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスを包含する。
小さなものから大きなものまで如何なる有機または無機分子をも包含する如何なる候補抗ウィルス剤も、本発明の方法を使用して評価され得るが、但し該候補抗ウィルス剤は、前記培養へと加えられる場合に、これらの細胞により取り込まれ得る。この取り込みにおいて補助するために、該候補抗ウィルス剤は、当業界においてよく知られているように、リポソーム、両親媒性化合物等のような賦形剤を含む組成物中へ製剤され得る。前記サブゲノムウィルス複製システムを有するこれらの細胞も、例えばポリエチレン・グリコールまたは電気穿孔法装置により処理され、該候補抗ウィルス剤の取り込みにおいて補助することが出来る。
候補抗ウィルス剤の非限定例は、ヌクレオチドまたはヌクレオシド（例えばＡＺＴ）；アンチセンス化合物のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アンチセンスを含むベクター、あるいは、プラスミド、ウィルスベクターを包含する抗ウィルス性タンパク質をコード化する遺伝子等を包含する。ペプチド核酸のような核酸を模倣したもの（例えば、Corey, 1997 参照）および他の核酸結合化合物（例えば、Geierstanger et al., 1996 に記載されたもの）も、候補抗ウィルス剤として利用され得る。加えて、抗体および抗体結合部位を含む化合物、酵素、構造タンパク質、成長因子、転写因子等を包含する、２次的な代謝物および他の小さな化学物質、生物活性なアミノ酸、オリゴペプチド、またはポリペプチドが、抗ウィルス活性に関してテストされ得る。
該候補抗ウィルス剤を前記細胞培養に加えた後、これらの細胞は、該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、インキュベートされる。該ウィルス、何が抗ウィルス活性を評価するために測定されているのかということ、および前記サブゲノムウィルス複製システムを有するこれらの細胞の性質に依存して、インキュベートの最適時間は、１分〜４８時間、またはこれより長い如何なる場合もあり得るであろう。より短い時間期間が、例えば該候補抗ウィルス剤の抗ウィルス活性が、該候補抗ウィルス剤が例えば酵素のような特定のタンパク質へ結合するかどうかを評価することにより測定される場合、酵素活性の阻害、または該候補抗ウィルス剤の該酵素への結合が測定される場合、目論まれる。
該候補抗ウィルス剤の抗ウィルス活性が、複製が該候補抗ウィルス剤により阻害されているかどうかを決定することにより測定される場合、前記細胞培養は、測定可能な量の複製が起きるように充分長くインキュベートされなくてはならないが、これらの細胞がこの培養皿を超えて成育する程長くなくてよい。以下の実施例において使用されるもののようなウィルス／細胞の組み合わせを用いて（Ｈｕｈ７肝細胞中のＣ型肝炎ウィルスレプリコン；ＢＨＫ腎線維芽細胞中のＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコン；Ｈｕｈ７細胞中の黄熱病ウィルスレプリコン；Ｓｉｎｄｂｉｓレプリコンを有する前記のＢＨＫ細胞中で一時的に発現された、気道多核ウィルスのミニゲノム）、２０〜２４時間のインキュベートが最適であると決定された。
本発明の幾つかの態様では、該候補抗ウィルス剤の抗ウィルス効果は、起こった複製の量の査定により決定される。これらの決定を下す方法の非限定例は、ＲＮＡもしくはＤＮＡの如何なる定量法をも包含し、これは、定量的ＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲのような標的の増幅、または転写媒介増幅；または非増幅ＤＮＡもしくはＲＮＡ定量法、特に分岐鎖ＤＮＡのようなシグナル増幅を含むものを含むが、ノーザンもしくはサザン・ハイブリダイゼーション、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、分子の足がかり等も含む。レプリコンのコピー数を知るために、ＲＮＡ標準との比較を行うことが出来る。
如何なる特定のサブゲノムウィルス複製システムに関しても、ウィルス複製を測定するためのこの適切なアッセイは、当業者が過度な実験なしに決定出来る範囲内にあるであろう。
候補抗ウィルス剤の活性も、複製に関して要求されるウィルスの特定成分を標的とする方法により、決定され得る。このようなアッセイは、例えばもし該候補抗ウィルス剤がウィルス複製に必須な酵素のようなタンパク質をコード化する遺伝子に結合するアンチセンス・オリゴヌクレオチドであった場合に、所望されるものであるかも知れないであろう。これらの標的化アッセイ、例えば、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、免疫蛍光、または免疫沈降のような免疫アッセイ；例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヘリカーゼ（ヘリックスを巻かせる酵素）、チミジンキナーゼ（チミジンリン酸化酵素）、リボヌクレオチド還元酵素等の、特定のウィルスの酵素の酵素活性に関するアッセイ；あるいは、特定のウィルスタンパク質に融合されているか、さもなくばそのゲノム中へと挿入されているレポーター遺伝子産物のアッセイに関しては、この特定のタンパク質の如何なる定量方法もが、有用であり得るであろう。これらのレポータータンパク質の非限定例は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびβ−ガラクトシダーゼを包含する。
他の実施形態では、本発明は、第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養と、第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養とを含む、混合細胞培養に関する。これらは前に、多重サブゲノム複製培養またはＭＳＲＣと名付けられた。前記候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法に有用なこれらの混合細胞培養のいずれもが、これらの実施形態の範囲内にあるものと目論まれ得る。該培養中の細胞数までの如何なる数のサブゲノムウィルス複製システムをも、例えば、３、４、５、１０、２０、またはより多くの独立サブゲノムウィルス複製システムを有する混合細胞培養も、包含される。
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例に記載される。本願の請求項の範囲内の他の実施形態は、本明細書中で開示されるような本発明の明細または実施の斟酌から、当業者には明らかであろう。これらの実施例と一緒にこの明細は、実施例に伴う本願請求項により指し示される本発明の範囲および精神と共に、例示的なだけであるものと考慮されるべきであることが、意図される。
［実施例１．］
混合ウィルスレプリコン培養中でのＨＣＶ／ＹＦＲ／ＳＩＮＤＢＩＳの多重スクリーニング
よく特徴が出た抗ウィルス剤の効果がＭＶＲＣ中で観察され得るかどうかを決定するため、ＨＣＶ、黄熱病、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンを含有する細胞株が独立に、および混合培養としての両方の場合について、固定された量のα−インターフェロン（ＩＮＦα）、よく特徴が出た抗ウィルス剤（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ、１９９１年）の存在下および非存在下に培養された。インターフェロンは以前に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ両方において、ＨＣＶの複製を阻害することが示されている（Ｐｏｄｅｖｉｎら、２００１年；ＳｔｅｗａｒｔおよびＳｈｅａｆｆ、１９６９年；Ｒｙｍａｎら、２０００年；Ｓａｉｔｏ、１９９０年；Ａｒｒｏｙｏら、１９８８年）。該抗ウィルス剤に晒した後、ＲＮＡがこれらの細胞から抽出され、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを介してウィルスレプリコンの濃度が決定された。
混合ウィルスレプリコン培養中でのＨＣＶ／ＹＦＲ／ＳＩＮＤＢＩＳの多重スクリーニング
よく特徴が出た抗ウィルス剤の効果がＭＶＲＣ中で観察され得るかどうかを決定するため、ＨＣＶ、黄熱病、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンを含有する細胞株が独立に、および混合培養としての両方の場合について、固定された量のα−インターフェロン（ＩＮＦα）、よく特徴が出た抗ウィルス剤（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ、１９９１年）の存在下および非存在下に培養された。インターフェロンは以前に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ両方において、ＨＣＶの複製を阻害することが示されている（Ｐｏｄｅｖｉｎら、２００１年；ＳｔｅｗａｒｔおよびＳｈｅａｆｆ、１９６９年；Ｒｙｍａｎら、２０００年；Ｓａｉｔｏ、１９９０年；Ａｒｒｏｙｏら、１９８８年）。該抗ウィルス剤に晒した後、ＲＮＡがこれらの細胞から抽出され、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを介してウィルスレプリコンの濃度が決定された。
［材料および方法］
ウィルスレプリコン培養
ＢＨＫ／ＳＲ１９／ｐａｃとして言及されるＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンシステムおよびＨＣＶレプリコンＡｖａ．５細胞株が、以前に記載されたように（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９９年；Ｂｌｉｇｈｔら、２０００年；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３年；Ｒｉｃｅら、１９８７年）発生された。黄熱病ウィルス（ＹＦＲ）レプリコン含有Ｈｕｈ７細胞が、同様のストラテジー（戦略）を使用して（Ｒｉｃｅら、１９８９年）調製された。
ウィルスレプリコン培養
ＢＨＫ／ＳＲ１９／ｐａｃとして言及されるＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンシステムおよびＨＣＶレプリコンＡｖａ．５細胞株が、以前に記載されたように（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９９年；Ｂｌｉｇｈｔら、２０００年；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３年；Ｒｉｃｅら、１９８７年）発生された。黄熱病ウィルス（ＹＦＲ）レプリコン含有Ｈｕｈ７細胞が、同様のストラテジー（戦略）を使用して（Ｒｉｃｅら、１９８９年）調製された。
細胞が、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＤ）＋１０％胎児牛血清中、指し示された濃度の抗ウィルス剤であるインターフェロンα（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を有する標準１２穴マイクロタイター皿（約５ｃｍ２）中に播かれ、標準条件下に３７℃にてインキュベートされた。各ウェルに播かれた細胞の総数は、２００，０００であった。これらの３つの培養が混合され、各々の相対割合、３０％ＨＶＣ、４０％Ｓｉｎｄｂｉｓ、３０％ＹＦＲレプリコンを含有する細胞となった。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
これらの細胞培養から得られたＲＮＡは、市販のキット（ＲＮＡｅａｓｙＪ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を介して調製された。ＲＮＡは引き続き、１０μＬの５ＸＥＺ緩衝液、２５μＬの１０Ｘ酢酸マンガン、５μＭの３μＬの各プライマー、１０ｍＭの１．５μＬの各ｄＮＴＰ；０．５μＬのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（供給されたそのまま）；２．０μＬのｒＴｔｈポリメラーゼ（２．５ｕ／ｌμＬ）（ＥＺｒＴｔｈＲＮＡＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、および５μＬの１：１０，０００希釈ＳＹＢＲ緑色蛍光染料（供給されたそのまま）（ＳＹＢＲ緑色Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）からなるｑＲＴ−ＰＣＲ水溶液（５０μＬ）ヘ加えられた。
これらの細胞培養から得られたＲＮＡは、市販のキット（ＲＮＡｅａｓｙＪ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を介して調製された。ＲＮＡは引き続き、１０μＬの５ＸＥＺ緩衝液、２５μＬの１０Ｘ酢酸マンガン、５μＭの３μＬの各プライマー、１０ｍＭの１．５μＬの各ｄＮＴＰ；０．５μＬのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（供給されたそのまま）；２．０μＬのｒＴｔｈポリメラーゼ（２．５ｕ／ｌμＬ）（ＥＺｒＴｔｈＲＮＡＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、および５μＬの１：１０，０００希釈ＳＹＢＲ緑色蛍光染料（供給されたそのまま）（ＳＹＢＲ緑色Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）からなるｑＲＴ−ＰＣＲ水溶液（５０μＬ）ヘ加えられた。
ＨＣＶ３’ＮＴＲ配列の増幅用プライマーは：
５’−ｇｇｃｔｃｃａｔｃｔｔａｇｃｃｃｔａｇｔｃ（配列ＩＤ番号：１）および
３’−ａｇｔａｔｃｇｇｃａｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｔ（配列ＩＤ番号：２）
である。前記ＹＦＲレプリコンは、プライマー：
５’−ｇｇａｔｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｔａｇａａ（配列ＩＤ番号：３）および
３’−ｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｇａｔｔ（配列ＩＤ番号：４）
により、同定された。前記Ｓｉｎｄｂｉｓレプリコンは、プライマー：
５’−ｇａｇａｇｃｇｃｃａｃｇｔｔａｇｔｇｔａ（配列ＩＤ番号：５）および
３’−ａｃｃｔｔｇｔａｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｔｃ（配列ＩＤ番号：６）
により同定された。
５’−ｇｇｃｔｃｃａｔｃｔｔａｇｃｃｃｔａｇｔｃ（配列ＩＤ番号：１）および
３’−ａｇｔａｔｃｇｇｃａｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｔ（配列ＩＤ番号：２）
である。前記ＹＦＲレプリコンは、プライマー：
５’−ｇｇａｔｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｔａｇａａ（配列ＩＤ番号：３）および
３’−ｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｇａｔｔ（配列ＩＤ番号：４）
により、同定された。前記Ｓｉｎｄｂｉｓレプリコンは、プライマー：
５’−ｇａｇａｇｃｇｃｃａｃｇｔｔａｇｔｇｔａ（配列ＩＤ番号：５）および
３’−ａｃｃｔｔｇｔａｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｔｃ（配列ＩＤ番号：６）
により同定された。
該ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイムの蛍光モニタリングが達成され、ＢｉｏＲａｄ Ｉ−回転機の使用を介するその閾値のＰＣＲ増幅サイクル（すなわち、その反応産物の検出可能な指数関数的増幅が観測される加熱反応サイクル）の帰属が達成された。既知の濃度におけるＲＮＡ標的標準の希釈物を用いた実験は、該閾値サイクルがウィルスレプリコンレベルの精確な測定であることを確かめるものである。インターフェロンなしのコントロールに関してのこの閾サイクル値は、インターフェロン存在下のネガティブ・コントロールのパーセンテージとして表現されるような値と共に、１００％（すなわち、コントロールの１００％）に恣意的に設定された。
［結果］
表２は、リアルタイムの定量的ポリメレース・チェーン・リアクション（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、混合ウィルスレプリコン培養中でアッセイされた３つのウィルスレプリコンに関してのＩＦＮαの効果を測定した実験の結果を示す。各レプリコン含有細胞は全て、厳密に同一の条件下にＩＦＮαに晒されたので、区別可能な（異なる）レプリコンに関してのＩＦＮαの相対的な効果は、容易に決定される。この実施例では、ＩＦＮαの阻害効果がＳｉｎｄｂｉｓにおいてほぼ発揮されていることは容易に明らかであり（１００μ／ｍｌのＩＦＮαにて＞９８％阻害）、ＨＣＶに関しては１００μ／ｍｌにて＞９１％、ＹＦＲに関しては１００μ／ｍｌにて＞８１％であった。これらの結果は、別個に培養された場合の各ウィルスレプリコンに関してのＩＦＮαの効果に、非常に類似している（図１、２、および３）。
表２は、リアルタイムの定量的ポリメレース・チェーン・リアクション（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、混合ウィルスレプリコン培養中でアッセイされた３つのウィルスレプリコンに関してのＩＦＮαの効果を測定した実験の結果を示す。各レプリコン含有細胞は全て、厳密に同一の条件下にＩＦＮαに晒されたので、区別可能な（異なる）レプリコンに関してのＩＦＮαの相対的な効果は、容易に決定される。この実施例では、ＩＦＮαの阻害効果がＳｉｎｄｂｉｓにおいてほぼ発揮されていることは容易に明らかであり（１００μ／ｍｌのＩＦＮαにて＞９８％阻害）、ＨＣＶに関しては１００μ／ｍｌにて＞９１％、ＹＦＲに関しては１００μ／ｍｌにて＞８１％であった。これらの結果は、別個に培養された場合の各ウィルスレプリコンに関してのＩＦＮαの効果に、非常に類似している（図１、２、および３）。
リバビリン（ribavirin）が該混合培養中でテストされた時は、テストされた最高濃度（１００μ／ｍｌ）においてさえ、ＨＣＶの複製に関しての効果は観測されなかった（表３）。しかしながら、リバビリンは該混合培養中で、Ｓｉｎｄｂｉｓレプリコンの複製を正に阻害した。このことは、抗ウィルス剤が多重サブゲノム複製培養において、種々のサブゲノムウィルス複製システムに独立に作用することを更に示すものである。
［実施例２］
混合培養中での、安定および一時的ウィルスレプリコン：ＨＣＶ／ＲＳＶ／Ｓｉｎｄｂｉｓの多重スクリーニング
実施例１では、単一のウェル中で培養された複数のウィルスレプリコンをアッセイすることの実現性が実証された。実施例１において分析された各々のウィルスレプリコンは、それが安定に維持される細胞株内では自己複製可能である。しかしながら、安定には維持されない他のサブゲノムウィルス複製システムが存在する。これらのシステムは、該ウィルスゲノムがトランスフェクションまたは電気穿孔法を介してこれらの細胞中へと導入される一時的な細胞培養の使用を要求するものである。一旦導入されてしまうと、これらの一時的なレプリコンまたはミニゲノムは、ウィルス配列を欠く細胞が該培養内で増殖し優性となる前の限られた時間に、ウィルスタンパク質媒介サブゲノム複製を示すであろう。安定なウィルスレプリコンまたはミニゲノムシステムは所定のウィルスについてはまだ確立される必要性があるので、一時的なレプリコンまたはミニゲノムシステムに関しての抗ウィルス剤の効果を分析出来ることにおいて、明らかな価値がある。
混合培養中での、安定および一時的ウィルスレプリコン：ＨＣＶ／ＲＳＶ／Ｓｉｎｄｂｉｓの多重スクリーニング
実施例１では、単一のウェル中で培養された複数のウィルスレプリコンをアッセイすることの実現性が実証された。実施例１において分析された各々のウィルスレプリコンは、それが安定に維持される細胞株内では自己複製可能である。しかしながら、安定には維持されない他のサブゲノムウィルス複製システムが存在する。これらのシステムは、該ウィルスゲノムがトランスフェクションまたは電気穿孔法を介してこれらの細胞中へと導入される一時的な細胞培養の使用を要求するものである。一旦導入されてしまうと、これらの一時的なレプリコンまたはミニゲノムは、ウィルス配列を欠く細胞が該培養内で増殖し優性となる前の限られた時間に、ウィルスタンパク質媒介サブゲノム複製を示すであろう。安定なウィルスレプリコンまたはミニゲノムシステムは所定のウィルスについてはまだ確立される必要性があるので、一時的なレプリコンまたはミニゲノムシステムに関しての抗ウィルス剤の効果を分析出来ることにおいて、明らかな価値がある。
気道多核ウィルス（ＲＳＶ）は、一時的なミニゲノムシステムだけが現在入手可能であるウィルスの１例である。安定および一時的両方のサブゲノムウィルス複製システムを含有する多重サブゲノム複製培養が、抗ウィルス剤の効果をアッセイするのに使用され得るであろうかどうかを決定するために、安定なＨＣＶレプリコン含有細胞が、一時的なＲＳＶミニゲノムシステムでトランスフェクションされた安定なＳｉｎｄｂｉｓレプリコンを含有する細胞と混合された。この多重サブゲノム複製培養は、リバビリンおよびα−インターフェロン両方による処理、その後レプリコン／ミニゲノムのレベルに関してのｑＲＴ−ＰＣＲ解析に付された。
［材料および方法］
ウィルス培養
ＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃとして言及されるＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンシステム、およびＨＣＶレプリコンＡｖａ．５細胞株が、前記のように発生された。該ＲＳＶミニゲノムシステムは、以下の５つのプラスミドから成った：Ｃ２−ＬＵＣ ＲＳＶミニゲノムｃＤＮＡ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９６年）；ｐＴＭ１−Ｎ、ｐＴＭ１−Ｐ、ｐＴＭ１−Ｌ（Ｇｒｏｓｆｅｌｄら、１９９５年）；およびｐＭ２−１。該ｐＭ２−１ベクターは、プライマーｃｃａａｇｇａｔａｔｔｔｇｔｃａｇｇ（配列ＩＤ番号：７）およびｇｇｇｇｃａａａｔａｔｇｔｃａｃｇａａｇｇａａｔｃｃ（配列ＩＤ番号：８）を用いた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＲＳＶ（株２）Ｍ２−１ｃＤＮＡを増幅させることにより、構築された。このＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローニングされ、ＥｃｏＲＩを用いて切り出され、Ｔ７発現ベクターｐＭＨ４のＥｃｏＲＩ部位中へクローニングされた。該ｐＭＨ４発現ベクターは、そのＮｃｏＩ部位の除去により、ｐＴＭ１（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９８９年；Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｍｏｓｓ、ＮＩＨの好意により提供された）に由来した。
ウィルス培養
ＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃとして言及されるＳｉｎｄｂｉｓウィルスレプリコンシステム、およびＨＣＶレプリコンＡｖａ．５細胞株が、前記のように発生された。該ＲＳＶミニゲノムシステムは、以下の５つのプラスミドから成った：Ｃ２−ＬＵＣ ＲＳＶミニゲノムｃＤＮＡ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９６年）；ｐＴＭ１−Ｎ、ｐＴＭ１−Ｐ、ｐＴＭ１−Ｌ（Ｇｒｏｓｆｅｌｄら、１９９５年）；およびｐＭ２−１。該ｐＭ２−１ベクターは、プライマーｃｃａａｇｇａｔａｔｔｔｇｔｃａｇｇ（配列ＩＤ番号：７）およびｇｇｇｇｃａａａｔａｔｇｔｃａｃｇａａｇｇａａｔｃｃ（配列ＩＤ番号：８）を用いた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＲＳＶ（株２）Ｍ２−１ｃＤＮＡを増幅させることにより、構築された。このＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローニングされ、ＥｃｏＲＩを用いて切り出され、Ｔ７発現ベクターｐＭＨ４のＥｃｏＲＩ部位中へクローニングされた。該ｐＭＨ４発現ベクターは、そのＮｃｏＩ部位の除去により、ｐＴＭ１（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９８９年；Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｍｏｓｓ、ＮＩＨの好意により提供された）に由来した。
ＲＳＶミニゲノムＣ２−ＬＵＣを一時的に発現する細胞株ＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃ／Ｃ２−ＬＵＣを発生させるために、３×１０６のＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃ細胞が、１０ｃｍ２の皿の中へ植え付けられた。１６時間後、これらの細胞は、トランスフェクション試薬リポフェクタミン（lipofectamine）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、１０ｃｍ２の皿につき、６μｇのＣ２−ＬＵＣ、１．２μｇのｐＴＭ１−Ｎ、０．６μｇのｐＴＭ１−Ｐ、１．２μｇのｐＴＭ１−Ｌ、および０．６μｇのｐＭＨ４−Ｍ２−１により、トランスフェクションされた。５〜６時間後、このトランスフェクション培地は、新たな成育培地により置き換えられた。トランスフェクションの１６時間後、これらの細胞はトリプシンを与えられ、数えられて、これら２つの細胞株の各々につき８×１０３個の細胞／ウェルにて、９６穴プレート中へと植え付けられた。ＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃ／Ｃ２−ＬＵＣ、ＢＨＫ／ＳＲ１９／Ｔ７／ｐａｃ、およびＡｖａ．５細胞は、８×１０３個の細胞／ウェルにて植え付けられ、コントロール群として機能された。全ての細胞群が、種々の濃度のリバビリンまたはα−インターフェロンの存在下に立ち上げられた。２４時間後、これらの細胞は、ＲＮＡ抽出のために採取された。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、実施例１においてと同様であった。
［結果］
これらの安定なレプリコン（ＨＣＶ、ＹＦＲ、およびＳｉｎｄｂｉｓ）を用いた場合、ＲＳＶの一時的なミニゲノム細胞培養は、単一ウィルス培養中であっても混合培養中であっても、リボビリンまたはα−インターフェロンに対しての同様の感受性を示した（表４）。
これらの安定なレプリコン（ＨＣＶ、ＹＦＲ、およびＳｉｎｄｂｉｓ）を用いた場合、ＲＳＶの一時的なミニゲノム細胞培養は、単一ウィルス培養中であっても混合培養中であっても、リボビリンまたはα−インターフェロンに対しての同様の感受性を示した（表４）。
以上に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点も得られることが分かるであろう。
本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更が以上の方法および組成物においてなされ得るであろうから、以上の記載に含有され、添付の図面に示される全ての事項は、例示的なものとされ、限定する意味合いにはないものとされることが、意図される。
本明細書中で引用された全ての文献が、援用される。本明細書中でのこれらの引用文献に関する議論は、それらの著者によりなされた主張を要約することだけ意図されており、如何なる引用文献も先行技術を構成するものであるという資格は与えられない。出願人は、これらの引用文献の精確さおよび適切さに挑む権利を保っている。
［配列ＩＤ番号］
配列ＩＤ番号：１−ＨＣＶ３’ＮＴＲ５’プライマーＣＢ３Ｎ５１
ｇｇｃｔｃｃａｔｃｔｔａｇｃｃｃｔａｇｔｃ
配列ＩＤ番号：２−ＨＣＶ３’ＮＴＲ３’プライマーＣＭ３８Ｂ５
ａｇｔａｔｃｇｇｃａｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｔ
配列ＩＤ番号：３−ＹＦＲ５’プライマー２５３５
ｇｇａｔｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｔａｇａａ
配列ＩＤ番号：４−ＹＦＲ３’プライマー２６３８
ｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｇａｔｔ
配列ＩＤ番号：５−Ｓｉｎｄｂｉｓ５’プライマーＳＶ１９３８
ｇａｇａｇｃｇｃｃａｃｇｔｔａｇｔｇｔａ
配列ＩＤ番号：６−Ｓｉｎｄｂｉｓ３’プライマーＳＶ２０４４
ａｃｃｔｔｇｔａｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｔｃ
配列ＩＤ番号：７−ＲＳＶ Ｍ２−１クローニングプライマー１
ｃｃａａｇｇａｔａｔｔｔｇｔｃａｇｇ
配列ＩＤ番号：８−ＲＳＶ Ｍ２−１クローニングプライマー２
ｇｇｇｇｃａａａｔａｔｇｔｃａｃｇａａｇｇａａｔｃｃ
配列ＩＤ番号：９−ルシフェラーゼ５’プライマー
ｃａｔｃａｃｇｔａｃｇｃｇｇａａｔａｃｔ
配列ＩＤ番号：１０−ルシフェラーゼ３’プライマー
ｃｇｃａａｃｔｇｃａａｃｔｃｃｇａｔａａ
配列ＩＤ番号：１−ＨＣＶ３’ＮＴＲ５’プライマーＣＢ３Ｎ５１
ｇｇｃｔｃｃａｔｃｔｔａｇｃｃｃｔａｇｔｃ
配列ＩＤ番号：２−ＨＣＶ３’ＮＴＲ３’プライマーＣＭ３８Ｂ５
ａｇｔａｔｃｇｇｃａｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｔ
配列ＩＤ番号：３−ＹＦＲ５’プライマー２５３５
ｇｇａｔｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｔａｇａａ
配列ＩＤ番号：４−ＹＦＲ３’プライマー２６３８
ｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｇａｔｔ
配列ＩＤ番号：５−Ｓｉｎｄｂｉｓ５’プライマーＳＶ１９３８
ｇａｇａｇｃｇｃｃａｃｇｔｔａｇｔｇｔａ
配列ＩＤ番号：６−Ｓｉｎｄｂｉｓ３’プライマーＳＶ２０４４
ａｃｃｔｔｇｔａｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｔｃ
配列ＩＤ番号：７−ＲＳＶ Ｍ２−１クローニングプライマー１
ｃｃａａｇｇａｔａｔｔｔｇｔｃａｇｇ
配列ＩＤ番号：８−ＲＳＶ Ｍ２−１クローニングプライマー２
ｇｇｇｇｃａａａｔａｔｇｔｃａｃｇａａｇｇａａｔｃｃ
配列ＩＤ番号：９−ルシフェラーゼ５’プライマー
ｃａｔｃａｃｇｔａｃｇｃｇｇａａｔａｃｔ
配列ＩＤ番号：１０−ルシフェラーゼ３’プライマー
ｃｇｃａａｃｔｇｃａａｃｔｃｃｇａｔａａ
Claims (69)
- 抗ウィルス活性に関して候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を調製し；
（ｂ）該候補抗ウィルス剤を各細胞培養に加え；
（ｃ）これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、該細胞培養をインキュベートし；
（ｄ）各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を決定すること
を含み、ここで、この第１ウィルス複製システムが、この第２ウィルス複製システムから遺伝子的に区別可能である方法。 - 前記第１および第２細胞培養が、前記ステップ（ｂ）の前に組み合わせられる、請求項１に記載の方法。
- サブゲノムウィルス複製システムを含有しない細胞培養を更に含む、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムがレプリコンである、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムが不完全ゲノムである、請求項１に記載の方法。
- 前記第１および第２細胞培養中の細胞が哺乳類細胞であり、前記第１および第２サブゲノムウィルス複製システムが哺乳類のウィルスである、請求項１に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞であり、前記哺乳類のウィルスがヒトのウィルスである、請求項６に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、アデノ関連ウィルス、ヴェネズエラ脳炎ウィルス、風疹、コクサッキーウィルス、エンテロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、デング熱ウィルス、西ナイルウィルス、ダニ脳炎ウィルス、アストロウィルス、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルスＡ、インフルエンザウィルスＢ、気道多核ウィルス、麻疹、おたふく風邪、エボラウィルス、マールブルクウィルス、ラ・クロス・ウィルス、カリフォルニア脳炎ウィルス、ハンターンウィルス、クリミア−コンゴウィルス、リフト・ヴァレー熱、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱ウィルス、ボリビア出血熱ウィルス、コロラドダニ熱、ＪＣウィルス、ＢＫウィルス、ヘルペス単式２型ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、ヒトヘルペス単式６型ウィルス、ヒトヘルペス単式７型ウィルス、ヒトヘルペス単式８型ウィルス、ヒトアデノウィルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、およびヒトパルボウィルスからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、およびアデノ関連ウィルスからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含まない化学物質である、請求項１に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、抗体結合ドメインを含む、請求項１４に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記候補抗ウィルス剤の効果が、この少なくとも１つのサブゲノムウィルス複製システムの核酸の一部分の定量により決定される、請求項１に記載の方法。
- 前記定量が核酸増幅により行われる、請求項１６に記載の方法。
- 前記核酸増幅がＲＴ−ＰＣＲによるものである、請求項１７に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記抗ウィルス剤の効果が、レポーター遺伝子、または他のウィルスタンパク質に沿って転写される融合タンパク質のアッセイ可能な部分の定量により決定される、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記抗ウィルス剤の効果が、ウィルスタンパク質の定量により決定される、請求項１に記載の方法。
- 前記ウィルスタンパク質が酵素であり、前記定量が該酵素の活性のアッセイによるものである、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持される、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持されない、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記細胞培養が初代細胞を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞培養が、少なくとも２０時間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法であって、第３サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第３細胞培養を少なくとも１つ更に含み、ここでこの第３細胞培養も前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に付され、ここで各サブゲノムウィルス複製システムが、他のサブゲノムウィルス複製システム毎に遺伝子的に区別可能である方法。
- サブゲノムウィルス複製システムを含む全ての細胞培養が、前記ステップ（ｂ）の前に組み合わされる、請求項２６に記載の方法。
- 抗ウィルス活性に関して候補抗ウィルス剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を組み合わせて、混合細胞培養を調製し；
（ｂ）該候補抗ウィルス剤を該混合細胞培養に加え；
（ｃ）これらのサブゲノムウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤による抗ウィルス効果を検出するに充分な条件下および時間、該混合細胞培養をインキュベートし；
（ｄ）各ウィルス複製システムに関しての該候補抗ウィルス剤の効果を決定すること
を含み、ここで、この第１ウィルス複製システムが、この第２ウィルス複製システムから遺伝子的に区別可能である方法。 - 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムがレプリコンである、請求項２８に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムが不完全ゲノムである、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養の全細胞が同一の細胞株である、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養の細胞が１つ以上の細胞株を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養中の全細胞が哺乳類細胞であり、全ての前記サブゲノムウィルス複製システムが哺乳類のウィルス由来である、請求項２８に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞であり、前記哺乳類のウィルスがヒトのウィルスである、請求項３３に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、アデノ関連ウィルス、ヴェネズエラ脳炎ウィルス、風疹、コクサッキーウィルス、エンテロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、デング熱ウィルス、西ナイルウィルス、ダニ脳炎ウィルス、アストロウィルス、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルスＡ、インフルエンザウィルスＢ、気道多核ウィルス、麻疹、おたふく風邪、エボラウィルス、マールブルクウィルス、ラ・クロス・ウィルス、カリフォルニア脳炎ウィルス、ハンターンウィルス、クリミア−コンゴウィルス、リフト・ヴァレー熱、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱ウィルス、ボリビア出血熱ウィルス、コロラドダニ熱、ＪＣウィルス、ＢＫウィルス、ヘルペス単式２型ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、ヒトヘルペス単式６型ウィルス、ヒトヘルペス単式７型ウィルス、ヒトヘルペス単式８型ウィルス、ヒトアデノウィルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、およびヒトパルボウィルスからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、およびアデノ関連ウィルスからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含まない化学物質である、請求項２８に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、タンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記候補抗ウィルス剤が、抗体結合ドメインを含む、請求項４１に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記候補抗ウィルス剤の効果が、この少なくとも１つのサブゲノムウィルス複製システムの核酸の一部分の定量により決定される、請求項２８に記載の方法。
- 前記定量が核酸増幅により行われる、請求項４３に記載の方法。
- 前記核酸増幅がＲＴ−ＰＣＲによるものである、請求項４４に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記抗ウィルス剤の効果が、レポーター遺伝子、または他のウィルスタンパク質に沿って転写される融合タンパク質のアッセイ可能な部分の定量により決定される、請求項２８に記載の方法。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムに関しての前記抗ウィルス剤の効果が、ウィルスタンパク質の定量により決定される、請求項２８に記載の方法。
- 前記ウィルスタンパク質が酵素であり、前記定量が該酵素の活性のアッセイによるものである、請求項４７に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持される、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持されない、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が初代細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が、少なくとも２０時間インキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が、第３サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第３細胞培養を更に含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記混合細胞培養が、第４サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第４細胞培養を更に含む、請求項５３に記載の方法。
- 第１サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第１細胞培養、および第２サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第２細胞培養を含む、混合細胞培養。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムがレプリコンである、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 少なくとも１つの前記サブゲノムウィルス複製システムが不完全ゲノムである、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養の全細胞が同一の細胞株である、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養の細胞が１つ以上の細胞株を含む、請求項２８に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養中の全細胞が哺乳類細胞であり、全ての前記サブゲノムウィルス複製システムが哺乳類のウィルス由来である、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞であり、前記哺乳類のウィルスがヒトのウィルスである、請求項６０に記載の混合細胞培養。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、アデノ関連ウィルス、ヴェネズエラ脳炎ウィルス、風疹、コクサッキーウィルス、エンテロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、デング熱ウィルス、西ナイルウィルス、ダニ脳炎ウィルス、アストロウィルス、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルスＡ、インフルエンザウィルスＢ、気道多核ウィルス、麻疹、おたふく風邪、エボラウィルス、マールブルクウィルス、ラ・クロス・ウィルス、カリフォルニア脳炎ウィルス、ハンターンウィルス、クリミア−コンゴウィルス、リフト・ヴァレー熱、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱ウィルス、ボリビア出血熱ウィルス、コロラドダニ熱、ＪＣウィルス、ＢＫウィルス、ヘルペス単式２型ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、ヒトヘルペス単式６型ウィルス、ヒトヘルペス単式７型ウィルス、ヒトヘルペス単式８型ウィルス、ヒトアデノウィルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、およびヒトパルボウィルスからなる群から選択される、請求項６１に記載の混合細胞培養。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウィルス、ポリオウィルス、日本脳炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ヘルペス単式１型ウィルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、およびアデノ関連ウィルスからなる群から選択される、請求項６１に記載の混合細胞培養。
- 前記ヒトのウィルスが、Ｃ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、気道多核ウィルス、およびＳｉｎｄｂｉｓウィルスからなる群から選択される、請求項６１に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持される、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養が細胞を含み、ここで前記サブゲノムウィルス複製システムが安定に維持されない、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養が初代細胞を含む、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養が、第３サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第３細胞培養を更に含む、請求項５５に記載の混合細胞培養。
- 前記混合細胞培養が、第４サブゲノムウィルス複製システムを含有する細胞を含む第４細胞培養を更に含む、請求項６８に記載の混合細胞培養。
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