JP2005514071A - Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells - Google Patents

Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells Download PDF

Info

Publication number
JP2005514071A
JP2005514071A JP2003560222A JP2003560222A JP2005514071A JP 2005514071 A JP2005514071 A JP 2005514071A JP 2003560222 A JP2003560222 A JP 2003560222A JP 2003560222 A JP2003560222 A JP 2003560222A JP 2005514071 A JP2005514071 A JP 2005514071A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
positive
cell
negative
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003560222A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2005514071A5 (en
Inventor
ジョン ピー． チュテ、
アブハ エイ． サイニ、
Original Assignee
ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ レプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ ユー．エス． デパートメント オブ ザ ネイビー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ レプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ ユー．エス． デパートメント オブ ザ ネイビー filed Critical ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ レプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ ユー．エス． デパートメント オブ ザ ネイビー
Publication of JP2005514071A publication Critical patent/JP2005514071A/en
Publication of JP2005514071A5 publication Critical patent/JP2005514071A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Abstract

本発明は、インビトロ下単離した、特にＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性である造血および前駆幹細胞に遺伝子を導入する方法に関し、（ブタ脳の微小血管内皮細胞、ヒト脳の血管内皮細胞のような、そして少なくとも一種類のサイトカインを含みうる）内皮細胞を含んだ培地に当該造血幹細胞を増殖させることによって達成される。この造血幹細胞は、マロニ−白血病ウィルスベクタ−のような適宜なベクタ−によって形質導入される。コントロ−ルに比べ、この方法による結果は遺伝子の移植効率を大きく増強させることができる。この方法は、遺伝子治療の臨床応用にかかる可能性を示している。  The present invention relates to a method for introducing genes into hematopoietic and progenitor stem cells isolated in vitro, in particular CD34 positive and CD38 negative (such as porcine brain microvascular endothelial cells, human brain vascular endothelial cells, and at least This is accomplished by growing the hematopoietic stem cells in a medium containing endothelial cells (which may contain a single cytokine). The hematopoietic stem cells are transduced with an appropriate vector such as a Maroni-leukemia virus vector. Compared to control, the results of this method can greatly enhance the efficiency of gene transfer. This method has shown the potential for clinical application of gene therapy.

Description

（発明の分野）
（関連する出願の参照）
本出願は、２００１年１２月２１日に出願された、第６０/３４１,８６８号米国仮出願で、表題「内皮細胞との前培養による遺伝子転移効率の上昇」の優先権を主張するものである。 (Field of Invention)
(Refer to related applications)
This application is a US provisional application No. 60 / 341,868, filed on Dec. 21, 2001, and claims the title “Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells”. is there.

（発明の背景）
発明の属する分野
本発明は広くは幹細胞への遺伝子導入に関するものであり、さらに厳密にはヒト幹細胞への遺伝子導入に関するものである。 (Background of the Invention)
The present invention relates generally to gene transfer into stem cells, and more precisely to gene transfer into human stem cells.

（発明の背景）
骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のような幹細胞は、生体内での長期再構築を説明する、多機能分化性前駆細胞に非常に富んでいる（Terstappen他、１９９１；Huang他、１９９４；Bhatia他、１９９７）。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の生体外での増殖は遺伝子療法プロトコ−ルへの適応のために広範に渡って研究されてきた（Zandstra他、１９９７；Von Kalle他、１９９４；Reems他、１９９５；Shah他、１９９６；Tisdale他、１９９８；Brugger他、１９９５）。しかしながら、幹細胞、特に骨髄造血前駆細胞の増殖に対する従来の方法は、増殖細胞における移植欠損の誘引だけでなく、幹細胞集団の分化にも関係していた（Peters他、１９９５；Yonemura他、１９９６；Traycoff他、１９９６；Ramshaw他、１９９５；Peters他、１９９６；Dannaeus他、１９９８；Veiby他、１９９７）。生体外で培養後の造血幹細胞における再構築能の喪失は、増殖された造血細胞上の細胞周期の誘引、および接着分子あるいはホ−ミングレセプタ−の変化によるものである（Ramshaw他、１９９５；Peters他、１９９６；van der Loo他、１９９５；Agrawal他、１９９６）。さらに、最近の研究ではもっとも初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、インビトロで短時間（７２−９６時間）、様々なサイトカイン化合物にさらされた後もG０期にとどまっており（Agrawal他、１９９６；Jordan他、１９９６）、さらにこれらの細胞ではレトロウィルス形質導入に必要な細胞表面レセプタ−の発現が低かったり、みられなかったりした（Orlic他、１９９６；Horwitz他、１９９９）。ヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞での細胞周期の静止およびレトロウィルスレセプタ−の欠如は、造血幹細胞を用いたレトロウィルスベ−スの遺伝子療法の二大障害となっている（Knaan−Shanzer他、１９９５；Miller他、１９９０；Roe他、１９９３；Emmons他、１９９７）。 (Background of the Invention)
Stem cells such as bone marrow CD34 positive CD38 negative cells are very rich in multifunctional progenitor cells that explain long-term remodeling in vivo (Terstappen et al., 1991; Huang et al., 1994; Bhatia et al., 1997). ). In vitro proliferation of CD34 positive CD38 negative cells has been extensively studied for adaptation to gene therapy protocols (Zandstra et al., 1997; Von Kalle et al., 1994; Reems et al., 1995; Shah et al. 1996; Tisdale et al. 1998; Brugger et al. 1995). However, conventional methods for proliferation of stem cells, particularly myeloid hematopoietic progenitor cells, have been implicated not only in attracting transplant defects in proliferating cells but also in differentiation of stem cell populations (Peters et al., 1995; Yonemura et al., 1996; 1996; Ramshaw et al., 1995; Peters et al., 1996; Dannaeus et al., 1998; Veiby et al., 1997). Loss of remodeling ability in hematopoietic stem cells after in vitro culture is due to cell cycle attraction on expanded hematopoietic cells and changes in adhesion molecules or homing receptors (Ramshaw et al., 1995; Peters Et al., 1996; van der Loo et al., 1995; Agrawal et al., 1996). Furthermore, the earliest CD34-positive CD38-negative cells in recent studies, short in vitro (72-96 hours), and remained at G 0 phase even after being exposed to various cytokines compound (Agrawal et al., 1996; Jordan et al., 1996), and in these cells, the expression of cell surface receptors required for retroviral transduction was low or absent (Orlic et al., 1996; Horwitz et al., 1999). Cell cycle quiescence and lack of retroviral receptors on human CD34 positive CD38 negative cells are two major obstacles to retroviral based gene therapy using hematopoietic stem cells (Knaan-Shanzer et al., 1995; Miller et al., 1990; Roe et al., 1993; Emmons et al., 1997).

短期間（７日間）の培養で、ＣＤ３４陽性細胞群で１０〜１５倍への増殖、および、より初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のサブセットでユニ−クな１５０倍への増加をもたらす、ブタ脳微小管内皮細胞（ブタ脳微小管内皮細胞）共培養系がすでに記述されている（Davis他、１９９５；Chute他、１９９９）。内皮細胞培養の準備の方法と培養条件もまた、米国特許第５５９９７０３号のコラム１４の３０〜６７行目、コラム１５の１〜１３行目に記載されており、参考のためこの明細書に引用する。ブタ脳微小管内皮細胞共培養系で増殖したヒトＣＤ３４陽性細胞が、SCID−Huモデルにおいて完全な造血再構築を提供することが可能であること（Brandt他、１９９８）、および、ブタ脳微小管内皮細胞単層で増殖した自家移植の骨髄ＣＤ３４陽性細胞は移植可能であり、致死量の放射線照射されたヒヒで血液学的に救済可能である（Brandt他、１９９９）、ことも証明されている。   Porcine brain in short-term (7 days) culture results in a 10-15 fold expansion in the CD34 positive cell population and a unique 150 fold increase in a subset of earlier CD34 positive CD38 negative cells A microtubule endothelial cell (porcine brain microtubule endothelial cell) co-culture system has already been described (Davis et al., 1995; Chute et al., 1999). Endothelial cell culture preparation methods and culture conditions are also described in US Pat. No. 5,599,703, column 14, lines 30-67 and column 15, lines 1-13, which are incorporated herein by reference. To do. That human CD34 positive cells grown in a porcine brain microtubule endothelial cell co-culture system can provide complete hematopoietic reconstruction in the SCID-Hu model (Brandt et al., 1998) and in porcine brain microtubules Autologous bone marrow CD34-positive cells grown in skin cell monolayers can also be transplanted and hematologically rescued with lethal doses of irradiated baboons (Brandt et al., 1999). .

（発明の要旨）
それゆえに、本発明の目的は、造血幹細胞へ遺伝物質を導入する際の効率を改善することである。 (Summary of the Invention)
Therefore, an object of the present invention is to improve the efficiency in introducing genetic material into hematopoietic stem cells.

本発明の更なる目的は、造血幹細胞のレトロウィルス形質導入の効率を高めることである。   A further object of the present invention is to increase the efficiency of retroviral transduction of hematopoietic stem cells.

また、本発明の他の目的は、遺伝子療法における幹細胞の有用性を高めることである。   Another object of the present invention is to increase the usefulness of stem cells in gene therapy.

これらおよびその他の本発明における目的は、レトロウィルス形質導入前に、哺乳動物内皮細胞を含む細胞培養液中で、幹細胞を増殖することで達成される。   These and other objects in the present invention are achieved by growing stem cells in a cell culture medium containing mammalian endothelial cells prior to retroviral transduction.

（好ましい実施形態）
本詳細な説明および請求項中で使われているように、「造血幹細胞」とは分化過程を完了していない細胞のことである。本発明中で用いられる造血幹細胞は一般的に成人の造血幹細胞である。多くの場合、本発明で用いられる造血幹細胞は造血性であり、そして様々な細胞のタイプに分化する能力を保持している。これらの造血幹細胞は骨髄中に含まれ、骨髄から採取されることが多い。本発明にそって増殖され形質導入された造血幹細胞の一つの典型的な種類は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞である。通常、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性を示すのは、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の小さなサブセットのみである。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞を用いるときに必要な事ではないが、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、本発明により増殖される前にＣＤ３４陽性造血幹細胞から単離されてもかまわない。目的の造血幹細胞を採取および精製する方法は、本発明においては重要事項ではない。 (Preferred embodiment)
As used in this detailed description and claims, a “hematopoietic stem cell” is a cell that has not completed the differentiation process. The hematopoietic stem cells used in the present invention are generally adult hematopoietic stem cells. In many cases, the hematopoietic stem cells used in the present invention are hematopoietic and retain the ability to differentiate into various cell types. These hematopoietic stem cells are contained in the bone marrow and are often collected from the bone marrow. One typical type of hematopoietic stem cell grown and transduced in accordance with the present invention is a CD34 positive CD38 negative progenitor cell. Normally, only a small subset of CD34 positive hematopoietic stem cells show CD34 positive CD38 negative. Although not necessary when using CD34 positive CD38 negative cells, CD34 positive CD38 negative cells may be isolated from CD34 positive hematopoietic stem cells prior to being expanded according to the present invention. The method for collecting and purifying the target hematopoietic stem cells is not important in the present invention.

採取および（オプションで）精製の後、造血幹細胞は内皮細胞を含む培養培地で増殖される。培養培地もまた、一般的に、造血幹細胞の増殖を刺激するサイトカインを含んでいる。例えば、培養培地は顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、幹細胞因子、あるいはインタ−ロイキン６やflt−３リガンド、およびしばしばそれらの混合物を含む。   After harvesting and (optionally) purification, hematopoietic stem cells are grown in a culture medium containing endothelial cells. The culture medium also typically contains cytokines that stimulate the growth of hematopoietic stem cells. For example, the culture medium contains granulocyte-macrophage-coloni-stimulating factor, interleukin 3, stem cell factor, or inter-leukin 6 and flt-3 ligand, and often mixtures thereof.

増殖する際、造血幹細胞は内皮細胞と接触していなければならない。一般的に、内皮細胞は単一層の形態をとっている。内皮細胞は、一般的に、ヒト脳血管内皮細胞（HUBEC）あるいはブタ微小血管内皮細胞（PMVEC）のような血管脳細胞である。考えられるブタからヒトへのウィルスの転移を防ぐため、人間へ形質導入した細胞を移植するにはHUBECが好ましい。Chute他、米国特許出願番号第０９/４５２,８５５号、１９９９年１２月３日に出願された、「ヒト脳内皮細胞および初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性骨髄幹細胞増殖のための培地と方法」では、HUBEC、HUBECに基づく培養培地、およびHUBECにおける造血幹細胞の培養の合成と特徴について述べており、参考のため本明細書に引用する。   When proliferating, hematopoietic stem cells must be in contact with endothelial cells. In general, endothelial cells take the form of a single layer. Endothelial cells are generally vascular brain cells such as human cerebral vascular endothelial cells (HUBEC) or porcine microvascular endothelial cells (PMVEC). HUBEC is preferred for transplanting cells transduced into humans to prevent possible porcine to human viral transfer. In Chute et al., US Patent Application No. 09 / 452,855, filed December 3, 1999, “Medium and Methods for Human Brain Endothelial Cells and Early CD34 Positive CD38 Negative Bone Marrow Stem Cell Growth” HUBEC, the culture medium based on HUBEC, and the synthesis and characteristics of the culture of hematopoietic stem cells in HUBEC are described and incorporated herein by reference.

ここで用いられる形質導入ベクタ−は、選択された種類の細胞の形質導入に有用なベクタ−のどれにでもなり得る。例えば、amph/（MLV）およびGaLV擬似型LAPSN（GaLV/MLV）ウィルスベクタ−のようなマロニ−白血病ウィルス（Maloney leukemia virus）レトロウィルスベクタ−は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の形質導入において有用である。   The transduction vector used herein can be any vector useful for transduction of selected types of cells. For example, Maloney leukemia virus retroviral vectors such as amph / (MLV) and GaLV pseudo-LAPSN (GaLV / MLV) virus vectors are useful in transduction of CD34 positive CD38 negative cells. .

ここまで本発明について記述してきたが、以下の例は、現時点でわかっている本発明を実施する最適の方法を含めた、本発明の具体的な適用を説明するものである。これらの具体例は、この適用に記載された発明の範囲を制限しようとするものではない。   Having described the invention so far, the following examples illustrate specific applications of the invention, including the best way of practicing the invention as currently known. These examples are not intended to limit the scope of the invention described in this application.

（実施例）
例１
ＣＤ３４陽性細胞の精製
ヒト脊椎体骨髄は臓器ドナ−から調達し、ＣＤ３４陽性細胞は海軍医療研究所の治験審査委員会で承認されたプロトコ−ルの下に前述（Davis他、１９９５）のように単離した。ＣＤ３４陽性骨髄前駆細胞は、低密度骨髄単層細胞と、ビオチン標識された抗ＣＤ３４モノクロ−ナル抗体（K値６.１）でコ−トされた磁気ビ−ズ（Dynal Incorporated, Great Neck, NY）とをロゼット形成させるという、免疫磁気ビ−ズ法によって精製した。磁気引力の３から４サイクルの後、ビ−ズは過剰のビオチン（Gibco, Grand Island, NY）とともに細胞から解離され、磁気的に細胞から分離され低温保存された。本手順による細胞は、フロ−サイトメトリック解析による、第２次非架橋CD陰性特異的モノクロ−ナル抗体（HPCA−２FITC, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA）のブロッキングで、９７％以上が陽性反応を示した。 (Example)
Example 1
Purification of CD34-positive cells Human vertebral bone marrow is procured from organ donors, and CD34-positive cells are obtained as described above (Davis et al., 1995) under the protocol approved by the Navy Medical Research Laboratory Trial Review Board. Isolated. CD34 positive bone marrow progenitor cells consist of low density bone marrow monolayer cells and magnetic beads (Dynal Incorporated, Great Neck, NY) coated with biotin-labeled anti-CD34 monoclonal antibody (K value 6.1). And rosette formation by immunomagnetic beads method. After 3-4 cycles of magnetic attraction, the beads were dissociated from the cells with excess biotin (Gibco, Grand Island, NY), magnetically separated from the cells and stored cryopreserved. Cells by this procedure were blocked by a second non-crosslinked CD negative specific monoclonal antibody (HPCA-2FITC, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA) by flow cytometric analysis, and 97% or more were positive A reaction was shown.

低温保存したＣＤ３４陽性細胞を、迅速に３７℃で解凍し、３７℃に前もって温められた１０倍量の完全培養培地で希釈した。この完全培地は１０％非働化ウシ胎児血清（FCS、Hyclone, Logan, UT）、１００ug/mL L−グルタミン（Gibco, Grand Island, NY）および１００U/mL ペニシリン/ストレプトマシン（Gibco, Grand Island, NY）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's modified Dulbecco's medium）から成る。他に記載がない限りこの培養培地を完全培養培地と呼ぶ。解凍されたＣＤ３４陽性骨髄細胞を完全培養培地で２度洗い、１x１０６cell/mL になるように再び懸濁した。細胞の生存率は、９５％以上であることがトリパンブル−色素排除テストによりわかった。 Cryopreserved CD34 positive cells were quickly thawed at 37 ° C and diluted with 10 volumes of complete culture medium pre-warmed to 37 ° C. This complete medium consists of 10% inactivated fetal calf serum (FCS, Hyclone, Logan, UT), 100 ug / mL L-glutamine (Gibco, Grand Island, NY) and 100 U / mL penicillin / streptmachine (Gibco, Grand Island, NY). ) And Iscove's modified Dulbecco's medium. Unless otherwise stated, this culture medium is called a complete culture medium. The thawed CD34 positive bone marrow cells were washed twice with complete culture medium and resuspended to 1 × 10 6 cells / mL. Cell viability was found to be greater than 95% by trypan blue-dye exclusion test.

ＣＤ３４陽性細胞を加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養
ブタ脳微小管内皮細胞は前述（Davis他、１９９５）のように培養した。簡単に説明すると、１０％非働化ウシ胎児血清（FCS、Hyclone, Logan, UT）、１００mcg/mL のL−グルタミン、５０mcg/mLのヘパリン、３０mcg/mL内皮細胞成長因子補助剤（Sigma, St. Louis, MO）および１００mcg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加したM１９９培養液を５mL含んでいる、ゼラチンでコ−ティングされた６ウェル組織培養プレ−ト（Costar, Cambridge, MA）に、ブタ脳微小管内皮細胞を１x１０５cells/wellの細胞濃度でまいた。４８〜７２時間後、接着ブタ脳微小管内皮細胞単層（７０−８０％コンフルエント）を、接着していないブタ脳微小管内皮細胞を取り除くために完全培地で２度洗い、培地を完全培養培地７ｍLで置き換えた。 Porcine brain microtubule endothelial cell coculture with CD34 positive cells Porcine brain microtubule endothelial cells were cultured as previously described (Davis et al., 1995). Briefly, 10% inactivated fetal bovine serum (FCS, Hyclone, Logan, UT), 100 mcg / mL L-glutamine, 50 mcg / mL heparin, 30 mcg / mL endothelial growth factor supplement (Sigma, St. Louis, MO) and 6-well tissue culture plate coated with gelatin (Costar, Cambridge, Mass.) Containing 5 mL of M199 medium supplemented with 100 mcg / mL penicillin / streptomycin solution. Microtubule endothelial cells were seeded at a cell concentration of 1 × 10 5 cells / well. After 48-72 hours, the adherent porcine brain microtubule endothelial cell monolayer (70-80% confluent) was washed twice with complete medium to remove non-adhered porcine brain microtubule endothelial cells, and the medium was completely cultured medium Replaced with 7 mL.

２x１０５の精製ＣＤ３４陽性細胞を各ウェルに加えた。培養細胞を２ng/mLの顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、５ng/mLのインタ−ロイキン３、 ５ng/mLインタ−ロイキン６、１２０ng/mLの幹細胞因子、および５０ng/mLのFlt−３リガンド（R&D System, Minneapolis, MN）で処理し、３７℃、５％CO２条件下でインキュベ−トした。培養７日後、単層を完全培地で２度洗って、接着および非接着の造血細胞をともに取り除いた。トリパンブル−色素を用いて、血球計算盤による手動の細胞計測を行った。 2 × 10 5 purified CD34 positive cells were added to each well. The cultured cells were treated with 2 ng / mL granulocyte macrophage colony stimulating factor, 5 ng / mL interleukin 3, 5 ng / mL interleukin 6, 120 ng / mL stem cell factor, and 50 ng / mL Flt-3 ligand ( R & D System, Minneapolis, Minn.) And incubated at 37 ° C., 5% CO 2 . After 7 days in culture, the monolayer was washed twice with complete medium to remove both adherent and non-adherent hematopoietic cells. Manual cell counting with a hemocytometer was performed using trypan blue-dye.

ストロ−マ不在の懸濁液培養
細胞培養は上述のように培地中で、ブタ脳微小管内皮細胞単層なしで行った。 Suspension culture without stroma Cell culture was performed in medium as described above, without porcine brain microtubule endothelial cell monolayers.

細胞周期解析
表面、細胞内のDNA（SID）解析はJordan他（Jordan他、１９９６）が記述しているように行った。簡単に説明すると、０日目、および、ブタ脳微小管内皮細胞共培養あるいはサイトカインを加えた液体培養のそれぞれの５日目において、ＣＤ３４陽性細胞を採取し、一度洗い、そして１.０％FCSを加えたPBSで懸濁した。細胞表面の染色は、ＣＤ３４−APC（Becton−Dickinson, San Jose, CA）およびＣＤ３８陰性PE（Becton−Dickinson, San Jose, CA）を用いて行った。細胞表面の染色を完了した後、細胞をPBSおよび０.４％ホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences, E−M grade, Ft. Washington、PA）中で懸濁した。さらに細胞を氷上で３０分間インキュベ−トし、０.２％トライトンX−１００（Sigma, St. Louis, MO）を加えた同量のPBSを加え、そしてそれら試料を４℃に一晩おいた。固定し膜透過性を高めた細胞を、１％FCSを加えたPBSで洗って懸濁し、Ki−６７FITC（MIB−１ clone, Immunotech, Westbrook, ME）で染色した。さらに細胞を０.５mcg/mLの７−アミノアクチノマイシンD（７−AAD, Sigma, St. Louis, MO）を含んだ１％FCSを加えたPBS中で洗い、懸濁した。試料を解析前に７−アミノアクチノマイシンD中で一晩インキュベ−トした。 Cell cycle analysis Surface and intracellular DNA (SID) analysis was performed as described by Jordan et al. (Jordan et al., 1996). Briefly, CD34 positive cells were harvested, washed once, and 1.0% FCS on day 0 and on each 5th day of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture or liquid culture plus cytokine. Suspended in PBS with Cell surface staining was performed using CD34-APC (Becton-Dickinson, San Jose, Calif.) And CD38 negative PE (Becton-Dickinson, San Jose, Calif.). After completion of cell surface staining, the cells were suspended in PBS and 0.4% formaldehyde (Electron Microscopy Sciences, E-M grade, Ft. Washington, PA). The cells were further incubated on ice for 30 minutes, the same volume of PBS plus 0.2% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) was added, and the samples were placed at 4 ° C overnight. . Cells that had been fixed and enhanced membrane permeability were washed and suspended in PBS supplemented with 1% FCS, and stained with Ki-67 FITC (MIB-1 clone, Immunotech, Westbrook, ME). Further, the cells were washed and suspended in PBS supplemented with 1% FCS containing 0.5 mcg / mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Sigma, St. Louis, MO). Samples were incubated overnight in 7-aminoactinomycin D prior to analysis.

ヒト骨髄ＣＤ３４陽性サブセットにおけるレトロウィルスレセプタ−ｍRNA発現のPCR基盤のハイブリダイゼ−ション解析
全細胞内RNAを、使用説明書に従い、RNA−STAT６０（Tel−Test, Friendswood, TX）を用いてヒトLin−ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性あるいはLin−ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の成体集団から単離した。結合を１００％確実にするために、モロニ−マウス白血病ウィルス逆転写酵素（MMLV−RT）を用いた以下の二つの反応によって、最初のcDNAを同量のmRNAから合成した（Stratagene Cloning System, LaJolla, CA）。cDNAは、レトロウィルスレセプタ−のプライマ−で、プログラムで制御できる温度調節機（MJ Research, Inc., Watertown, MA）の中で９４℃１分間、６０℃１分間、そして７２℃２分間、３５回のサイクルで以下のプライマ−を用いて増殖した。ヒトamphoR（センス鎖プライマ−、５’ CGG AAC ATC TTC GTG GCC TG ３’（SEQ ID NO:１）；アンチセンス鎖プライマ−、５’ GCT GGT CAT GAG AGA GCC GTG ３’（SEQ ID NO:２）；フラグメントの大きさ、２２０bp）、ヒトGaLVR （センス鎖プライマ−、５’ GTA GTC CTT CTG AAA GCC CC ３’（SEQ ID NO:３）；アンチセンス鎖プライマ−、５’ CAC TGG AGT TTA TTT GGT TGC ３’（SEQ ID NO:４）；フラグメントの大きさ、３３０bp）。前述のように（Blair他、１９９８）、実験用cDNAロ−ディングを評価するためにGAPDH PCRを用いた。PCR産物の液体ハイブリダイゼ−ションも前述のように（Blair他、１９９８）以下のプライマ−を用いて処理した：amphoR （５’ ATG GCT CTT CTC ATG TAT GGG ３’）（SEQ ID NO:５）, GaLVR （５’ CCT GCC ACT GTG CCC CTC C ３’）（SEQ ID NO:６）, GAPDH （５’ TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT ３’）（SEQ ID NO:７）。ハイブリダイゼ−ション後、サンプルを１０％アクリルアミドゲルに流して、１４０Vで３時間泳動にかけ、さらにＸ線フィルムに撮った。バンドの半定量的解析を分子変移濃度計システム（Molecular Dynamics Densitometer System, Sunnyvale, CA）を用いて行った。ＣＤ３４陽性サブセット中のAmphoRおよびGaLVRmRNAのレベルは、Orlic他（Orlic他、１９９８）による調節方法を用い、HeLa細胞中のAmphoRおよびGaLVRmRNAレベルを基準にして合わせた。

Figure 2005514071
PCR-based hybridization analysis of retroviral receptor-mRNA expression in human bone marrow CD34 positive subsets Total intracellular RNA was human Lin-CD34 using RNA-STAT60 (Tel-Test, Friendswood, TX) according to the instructions for use. Isolated from adult populations of positive CD38 negative or Lin-CD34 positive CD38 negative cells. To ensure 100% binding, the first cDNA was synthesized from the same amount of mRNA (Stratagene Cloning System, LaJolla) by the following two reactions using Moroni-murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RT): , CA). The cDNA is a retroviral receptor primer, 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes in a programmable temperature controller (MJ Research, Inc., Watertown, Mass.), 35 Growing with the following primers in one cycle. Human amphoR (sense strand primer, 5 ′ CGG AAC ATC TTC GTG GCC TG 3 ′ (SEQ ID NO: 1); antisense strand primer, 5 ′ GCT GGT CAT GAG AGA GCC GTG 3 ′ (SEQ ID NO: 2 ); Fragment size, 220 bp), human GaLVR (sense strand primer, 5 ′ GTA GTC CTT CTG AAA GCC CC 3 ′ (SEQ ID NO: 3); antisense strand primer, 5 ′ CAC TGG AGT TTA TTT GGT TGC 3 ′ (SEQ ID NO: 4); fragment size, 330 bp). As previously described (Blair et al., 1998), GAPDH PCR was used to evaluate experimental cDNA loading. Liquid hybridization of PCR products was also processed as described above (Blair et al., 1998) using the following primer: amphoR (5 ′ ATG GCT CTT CTC ATG TAT GGG 3 ′) (SEQ ID NO: 5), GaLVR (5 ′ CCT GCC ACT GTG CCC CTC C 3 ′) (SEQ ID NO: 6), GAPDH (5 ′ TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT 3 ′) (SEQ ID NO: 7). After hybridization, the sample was run on a 10% acrylamide gel, subjected to electrophoresis at 140 V for 3 hours, and further taken on an X-ray film. A semi-quantitative analysis of the bands was performed using a Molecular Dynamics Densitometer System (Sunnyvale, CA). The levels of AmphoR and GaLVR mRNA in the CD34 positive subset were combined based on the AmphoR and GaLVR mRNA levels in HeLa cells using the method of regulation by Orlic et al. (Orlic et al., 1998).
Figure 2005514071

モロニ−白血病ウィルス（MLV）レトロウィルスベクタ−の生成
ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ（HPAP）レポ−タ−遺伝子を運ぶ、アンホトロピック（ampho/MLV）およびGaLV擬似LAPSN（GaLV/MLV）のウィルスベクタ−を、前述（Miller他、１９９４；Kiem他、１９９８）のような方法により、ＰＡ３１７およびＰＧ１３パッケ−ジング細胞株を用いて生成した。端的にいえば、プラスミドpLAPSN（Miller他、１９９４）を用いたカルシウムホスファタ−ゼ方法で、パッケ−ジング細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションされたパッケ−ジング細胞株は、１０％ウシ胎児血清を加えたDMEM（Gibco, Grand Island, NY）中で４００−８００ug/ml のジェネティシン（Geneticin, Gibco−BRL）を用いてG４１８（ネオマイシン）耐性により選択した。産生細胞株は、１０％ウシ胎児血清を加えたDMEM（Gibco−BRL）を用い、３７℃、５％CO２の条件下で T２２５組織培養フラスコ（Gibco, Grand Island, NY）で増殖された。ウィルス含有培地（VCM）の収集は、パッケ−ジング細胞が約８０％コンフルエントになった際、開始した。この段階で１０％ウシ胎児血清を含むDMEM２５mlで培地を交換し、細胞を３２℃で培養した２４時間後、培地を収集し、０.４５uMで濾過し−７０℃で冷凍した。ウィルス含有培地は８ug/ml ポリブレンの連続１０倍希釈、および２４時間HT180細胞にさらすことで適定した。 Generation of Moroni-leukemia virus (MLV) retroviral vectors Amphotropic (ampho / MLV) and GaLV pseudo-LAPSN (GaLV / MLV) viral vectors carrying the human placental alkaline phosphatase (HPAP) reporter gene Was generated using the PA317 and PG13 packaging cell lines by methods such as those previously described (Miller et al., 1994; Kiem et al., 1998). Briefly, packaging cell lines were transfected by the calcium phosphatase method using plasmid pLAPSN (Miller et al., 1994). Transfected packaging cell lines were prepared using G418 (neomycin) with 400-800 ug / ml Geneticin (Geneticin, Gibco-BRL) in DMEM (Gibco, Grand Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum. ) Selected by resistance. The production cell line was grown in a T225 tissue culture flask (Gibco, Grand Island, NY) using DMEM (Gibco-BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Collection of virus-containing medium (VCM) began when the packaging cells were approximately 80% confluent. At this stage, the medium was replaced with 25 ml of DMEM containing 10% fetal calf serum, and after 24 hours of culturing the cells at 32 ° C., the medium was collected, filtered at 0.45 uM and frozen at −70 ° C. Virus-containing medium was titrated by serial 10-fold dilution of 8 ug / ml polybrene and exposure to HT180 cells for 24 hours.

感染後、細胞をG４１８耐性（抵抗性）で選別し、その後７−１０日間、ニトロブル−テトラゾリウムおよびBCIP（５−ブロモ−４−クロノ−３−インドリルフォスヘイト）（BIORAD, Hercules, CA）を用いてHPAP活性の有無についてコロニ−を調べた。本実験には、HT１０８０細胞で大量のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性コロニ−を産生可能なパッケ−ジング細胞株を選んだ。アンホトロピックおよび擬似タイプのGaLV MLVの力価は、全てのトランスフェクション実験において１x１０５CFU/mL −３x１０５CFU/mL の範囲であった。 Following infection, cells were sorted for G418 resistance (resistance), followed by 7-10 days with nitrobull-tetrazolium and BCIP (5-bromo-4-chrono-3-indolyl phosphate) (BIORAD, Hercules, CA). The colonies were examined for the presence or absence of HPAP activity. For this experiment, a packaging cell line capable of producing a large amount of human placental alkaline phosphatase positive colony with HT1080 cells was selected. Amphotropic and titer of the pseudo-type GaLV MLV ranged from 1x10 5 CFU / mL -3x10 5 CFU / mL in all transfection experiments.

レトロウィルス上澄みを用いたヒト造血ＣＤ３４陽性細胞サブセットの形質導入
ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼをコ−ドするモロニ−マウス白血病ウィルスベクタ−は上述のように（Miller他、１９９４；Kiem他、１９９８）パッケ−ジング細胞株ＰＡ３１７およびＰＧ１３を用いて用意した。新しく用意されたレトロウィルスベクタ−の上澄みは、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン/ストレプトマイシンを加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中で−７０℃で低温保存した。０日目、液体培地の５日間、およびブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日間からの骨髄造血細胞を収集し、洗い、そしてインタ−ロイキン−３（５ng/mL）、幹細胞因子（１２０ng/mL）、および８mcg/mLのポリブレンを加えた温かいＰＧ１３またはＰＡ３１７VCM（形質導入培地）で、２ｘ１０５cell/mLの濃度になるように懸濁した。トランスフェクション後の解析のため十分量の細胞を確保するために各実験の開始時に最小量の２ｘ１０６ＣＤ３４陽性細胞を利用した。各細胞の懸濁液の２mlを、１４mL丸底ポリプロピレンチュ−ブ（Falcon, Franklin Lakes, NJ）に等分し、３７℃で２時間、２０００rpmで遠心にかけた。遠心後、沈殿を穏やかに懸濁し、チュ−ブを３７℃の５％CO２インキュベ−タに一晩置いた。次にチュ−ブを１０分間、１２００rpmで遠心にかけた。重層形質導入培地を取り除き、新しい形質導入培地で細胞を懸濁した。これを２４時間毎に３日間繰り返した。３日後、造血細胞を完全培地で２度洗い、細胞数計測および生存能力テストを実施した。これらの細胞をＣＤ３４−FITCおよびＣＤ３８−PEで染色し、蛍光細胞選別装置（FACS）によってＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞群を選別した。次に各細胞群についてサイトスピン（cytospin）スライドを用意し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性で選別した細胞群を染色することにより形質導入効率を計測した。 Transduction of human hematopoietic CD34 positive cell subsets using retroviral supernatant Moroni-murine leukemia virus vector encoding human placental alkaline phosphatase is as described above (Miller et al., 1994; Kiem et al., 1998). It was prepared using packaging cell lines PA317 and PG13. The freshly prepared retroviral vector supernatant was cryopreserved at −70 ° C. in Iskov modified Dulbecco medium (IMDM) supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin. Bone marrow hematopoietic cells from day 0, 5 days in liquid medium, and 5 days of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture were collected, washed, and interleukin-3 (5 ng / mL), stem cell factor (120 ng / mL) mL), and warm PG13 or PA317VCM (transduction medium) supplemented with 8 mcg / mL polybrene to a concentration of 2 × 10 5 cells / mL. A minimal amount of 2 × 10 6 CD34 positive cells was utilized at the start of each experiment to ensure a sufficient amount of cells for analysis after transfection. 2 ml of each cell suspension was aliquoted into 14 ml round bottom polypropylene tubes (Falcon, Franklin Lakes, NJ) and centrifuged at 2000 rpm for 2 hours at 37 ° C. After centrifugation, the pellet was gently suspended and the tube was placed in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator overnight. The tube was then centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes. The stratified transduction medium was removed and the cells were suspended in fresh transduction medium. This was repeated every 24 hours for 3 days. Three days later, hematopoietic cells were washed twice with complete medium and subjected to cell counting and viability testing. These cells were stained with CD34-FITC and CD38-PE, and a CD34-positive CD38-negative and CD34-positive CD38-positive cell group was selected by a fluorescent cell sorter (FACS). Next, cytospin slides were prepared for each cell group, and transduction efficiency was measured by staining the cell group selected with human placental alkaline phosphatase activity.

レトロウィルスヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色
ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞を蛍光細胞選別装置で選別し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色およびメチルセルロ−スコロニ−形成アッセイのために収集した。サイトスピンを２−５x１０４のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞および２−５x１０４のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞から用意し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を前述（Kiem他、１９９８）のようにテストした。簡単に説明すると、サイトスピンをPBSですすぎ、２％ホルムアルデヒドで固定し、蒸留水で２度すすぎ、内因性のアルカリホスファタ−ゼ活性を不活性化するために６５℃で３０分間インキュベ−トした。次にスライドを蒸留水ですすぎ、pH１０.０の１００mM トリス−HCl、１mg/mlのX−リン酸塩および１mg/mlのニトロブル−テトラゾリウム中で、３７℃で３時間インキュベ−トした。このインキュベ−ションの最後は蒸留水ですすいだ。ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼは他の内因性アルカリホスファタ−ゼと比較して熱安定性であり（Kiem他、１９９８）、この熱不活性化段階で生き残ることができる。ニトロブル−テトラゾリウム（BIORAD）以外の試薬は全てSigma Chemical（St. Louis, MO）から入手した。 Retroviral human placental alkaline phosphatase staining CD34 positive CD38 negative and CD34 positive CD38 positive cells were sorted on a fluorescent cell sorter and collected for human placental alkaline phosphatase staining and methylcellulose colonization assay. Cytospins were prepared from 2-5 × 10 4 CD34 positive CD38 negative cells and 2-5 × 10 4 CD34 positive CD38 positive cells and tested for human placental alkaline phosphatase activity as previously described (Kiem et al., 1998). Briefly, the cytospin is rinsed with PBS, fixed with 2% formaldehyde, rinsed twice with distilled water, and incubated at 65 ° C. for 30 minutes to inactivate endogenous alkaline phosphatase activity. did. The slides were then rinsed with distilled water and incubated at 37 ° C. for 3 hours in 100 mM Tris-HCl, pH 10.0, 1 mg / ml X-phosphate and 1 mg / ml nitroblue-tetrazolium. The last of this incubation was rinsed with distilled water. Human placental alkaline phosphatase is thermostable compared to other endogenous alkaline phosphatases (Kiem et al., 1998) and can survive this heat inactivation step. All reagents were obtained from Sigma Chemical (St. Louis, MO) except for nitrobull-tetrazolium (BIORAD).

クロ−ン産生性前駆細胞のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ解析
形質導入後、５x１０２−１x１０３の選別されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞群を、５U/mLエリスロポエチン、２ng/mL顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、５ng/mLインタ−ロイキン３、５ng/mLインタ−ロイキン６、および１２０ng/mLの幹細胞因子（R and D Systems, Minneapolis, MN）を加えたメチルセルロ−ス半流動培地に１４日間おいた。コロニ−形成細胞は、上述と同様の方法でヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を計測した。１４日目のコロニ−形成アッセイ皿を水浴槽で６５℃に熱し、次に４℃で１時間冷やした。次に、メチルセルロ−ス層を３７℃で３時間、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色液で覆った。３時間後、染色液を吸引して除き、コロニ−数を計測した。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成した形質導入コロニ−を、形質導入していないＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成したコロニ−と比較した。各実験の個々のデ−タポイントに対して三回測定を行った。 Human Placental Alkaline Phosphatase Analysis of Clonogenic Progenitor Cells After transduction, 5 × 10 2 −1 × 10 3 sorted CD34 positive CD38 negative and CD34 positive CD38 positive cell groups were collected at 5 U / mL erythropoietin, 2 ng / mL Methylcellulose semi-flow with granulocyte macrophage colony stimulating factor, 5 ng / mL interleukin 3, 5 ng / mL interleukin 6, and 120 ng / mL stem cell factor (R and D Systems, Minneapolis, Minn.) The medium was left for 14 days. Colony-forming cells were assayed for human placental alkaline phosphatase activity in the same manner as described above. Day 14 colony-forming assay dishes were heated to 65 ° C. in a water bath and then cooled at 4 ° C. for 1 hour. Next, the methylcellulose layer was covered with human placental alkaline phosphatase staining solution at 37 ° C. for 3 hours. After 3 hours, the staining solution was removed by suction, and the number of colonies was counted. Transduced colonies generated from CD34 positive CD38 negative cells were compared to colonies generated from non-transduced CD34 positive CD38 negative cells. Three measurements were taken for each data point in each experiment.

統計分析
異なる処理条件下でのＣＤ３４陽性細胞群の間の統計的な比較は、スチュ−デントｔテストを用いて行った。 Statistical analysis Statistical comparisons between groups of CD34 positive cells under different treatment conditions were made using the Student t test.

結果
ブタ脳微小管内皮細胞共培養および液体懸濁液培養後の細胞周期（SID）解析およびＣＤ３４陽性細胞表現型
前述で、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン−３、インタ−ロイキン−６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養が、ＣＤ３４陽性細胞および初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞副次集団（Davis他、１９９５）の効果的な増殖を支持することを示した。本研究では、まず初めに、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞、および、同じサイトカインを加えた液体培養におけるＣＤ３４陽性サブセットの細胞周期段階を比較して調べた。０日目（定常状態）では、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の大多数（９７.５％±１.８）がG０期にとどまり、２.１％±１.５がG１期に、そして０.３％±０.３がG２/S/M期にあることがわかった（n=３、図１）。ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後では、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の９３.５％±０.７がG１もしくはG２/S/M期に進み、G０期にとどまっていたのはわずか６.４％±０.７だった。対して、液体懸濁培養の５日目では、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の７３.０％±２.２がG１あるいはG２/S/M期に進み、しかしながら２６.７％±２.２がG０期にとどまっていた。細胞周期に入ったＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合は、液体培養群よりもブタ脳微小管内皮細胞共培養群にあるほうが統計的に明らかに多かった（p<０.００１）。０日目、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目、および続く液体培養の５日目におけるG０、G１、およびG２/S/M期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合を示す、典型的な蛍光細胞選別法のヒストグラムを図２a−cに示す。 Results Cell cycle (SID) analysis and CD34 positive cell phenotype after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture and liquid suspension culture. Macrophage colony-stimulating factor, interleukin-3, interleukin-6 Porcine brain microtubule endothelial cell co-culture with addition of stem cell factor, flt-3 ligand supports effective proliferation of CD34 positive cells and early CD34 positive CD38 negative cell subpopulations (Davis et al., 1995) Indicated. In this study, first of all, porcine brain microtubule endothelial cells added with macrophage colony-stimulating factor, interleukin 3, interleukin 6, stem cell factor, flt-3 ligand, and fluid added with the same cytokine The cell cycle stages of CD34 positive subsets in culture were compared and examined. In day 0 (steady state), remain in the majority (97.5% ± 1.8) is G 0 phase of bone marrow CD34 + CD38-negative cells, 2.1% ± 1.5 1 phase G, and 0.3% ± 0.3 was found to be in the G 2 / S / M phase (n = 3, Figure 1). After 5 days of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, 93.5% ± 0.7 of CD34 positive CD38 negative cells advanced to G 1 or G 2 / S / M phase and remained in G 0 phase. Only 6.4% ± 0.7. In contrast, on day 5 of liquid suspension culture, 73.0% ± 2.2 of CD34 positive CD38 negative cells progressed to G 1 or G 2 / S / M phase, however 26.7% ± 2.2. Remained in the G0 period. The proportion of CD34-positive CD38-negative cells entering the cell cycle was statistically higher in the porcine brain microtubule endothelial cell co-culture group than in the liquid culture group (p <0.001). Shows the percentage of CD34 positive CD38 negative cells in G 0 , G 1 , and G 2 / S / M phases on day 0, day 5 of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, and day 5 of subsequent liquid culture A histogram of a typical fluorescent cell sorting method is shown in FIGS. 2a-c.

ブタ脳微小管内皮細胞共培養中にＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で生じた高レベルの細胞分割に協調して、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合の顕著な上昇が５日間の培養期間に観察された。対して、同様のサイトカインを加えた液体懸濁培養ではＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は維持できなかった。図３は、３つの異なる実験の結果を示しており、このとき骨髄細胞のスタ−ト時の細胞群の平均は、ＣＤ３４陽性細胞で９７％±２.６、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で１.４％±１.０であった。ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後において造血細胞の３７.７％±１.７％がＣＤ３４陽性であり（３ａ）、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群は全細胞数の６.５％±１.３にまで増加していた（３ｂ）。対して、液体培養後では、最終細胞数の２２.５％±８.８がＣＤ３４陽性細胞であったが、しかしＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞はわずか０.７％±０.４にまで減少した。同様に、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後において、全細胞で６.５倍の増加が、ＣＤ３４陽性細胞で２.６倍の増加が、そしてＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセットで３０倍の増加が観察された（表１）。液体培養では、全細胞で５.７倍の増加が、ＣＤ３４陽性細胞で１.４倍の増加が観察されたが、しかし、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型細胞ではわずか３.３倍の増加しか観察されなかった。ＣＤ３４およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型を発現する細胞の割合は、統計的に明らかにブタ脳微小管内皮細胞共培養後のほうが液体培養後よりも大きかった（ＣＤ３４陽性細胞、ｐ＝０.０３；ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞、ｐ＝０.０１）。図４は、０日目（４ａ）、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後の５日目（４ｂ）および液体懸濁培養下の５日目（４ｃ）における標本実験での骨髄ＣＤ３４陽性細胞の表現型を示している。

Figure 2005514071
A significant increase in the proportion of CD34 positive CD38 negative cells was observed over the 5 day culture period, in concert with the high level of cell division that occurred with CD34 positive CD38 negative cells during porcine brain microtubule endothelial cell co-culture. In contrast, CD34-positive CD38-negative cells could not be maintained in the liquid suspension culture with the same cytokine added. FIG. 3 shows the results of three different experiments, where the mean of the cell population at the start of the bone marrow cells was 97% ± 2.6 for CD34 positive cells and 1. for CD34 positive CD38 negative cells. It was 4% ± 1.0. Five days after swine brain microtubule endothelial cell co-culture, 37.7% ± 1.7% of hematopoietic cells were CD34 positive (3a), and the CD34 positive CD38 negative cell group was 6.5% ± 1 of the total number of cells. Increased to 3 (3b). In contrast, after liquid culture, 22.5% ± 8.8 of the final cell number was CD34 positive cells, but CD34 positive CD38 negative cells were reduced to only 0.7% ± 0.4. Similarly, a 6.5-fold increase in total cells, a 2.6-fold increase in CD34 positive cells, and a 30-fold increase in CD34 positive CD38 negative subsets after 5 days of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture Was observed (Table 1). In liquid culture, a 5.7-fold increase was observed in all cells and a 1.4-fold increase in CD34 positive cells, but only a 3.3 fold increase was observed in CD34 positive CD38 negative phenotype cells. Was not. The proportion of cells expressing CD34 and CD34 positive CD38 negative phenotypes was statistically clearly higher after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture than after liquid culture (CD34 positive cells, p = 0.03; CD34 positive CD38 negative cells, p = 0.01). FIG. 4 shows bone marrow CD34-positive cells in specimen experiments on day 0 (4a), day 5 after pig brain microtubule endothelial cell co-culture (4b) and day 5 in liquid suspension culture (4c). Shows the phenotype.
Figure 2005514071

０日目およびブタ脳微小管内皮細胞共培養後、液体培養後の骨髄ＣＤ３４陽性副次集団におけるAmphoRおよびGaLVRの発現
ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞の分類された個体群におけるamphoRおよびGaLVRの発現に、ブタ脳微小管内皮細胞共培養がどのような影響をもたらすのかについて解析するために、０日目、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後および液体懸濁液培養後のＣＤ３４陽性サブセットサンプルから取り出したmRNAについて、半定量的RT−PCRを行い、前述（Orlic他、１９９８）のようにこれらのmRNAのレベルをHeLa細胞と比較した。図５に示すように、０日目の骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセット中のアンホトロピックレセプタ−ｍRNAおよびGaLVRの発現はHeLa細胞での発現と比較して非常に低かった。ブタ脳微小管内皮細胞共培養後、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞サブセット中のamphoRmRNAおよびGaLVRの発現は、HeLamRNAレベルと比較して顕著な変化はなかった。同様に、液体懸濁液培養の５日後の、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセットでのamphoRおよびGaLVRｍRNAの発現は非常に低いままであった。さらに、全てのサンプルにおいて、GaLVRの発現は同サンプル内のamphoRの発現と比較して一様に低いことが観察され、骨髄ＣＤ３４陽性サブセット内のこれら二つのレトロウィルスレセプタ−の転写率が異なることが示唆された。表２は、レトロウィルスレセプタ−ｍRNAの HeLa細胞での発現に対する、骨髄ＣＤ３４陽性サブセットでの発現の計算値を示している。０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞中のamphoRおよびGaLVRmRNAの平均値は、それぞれHeLa細胞の平均値の５％および１１％であったのに対し、ブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞では平均値がHeLa細胞の平均値の１６％および８％であった。また、液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のAmphoRおよびGaLVRmRNAの平均値はそれぞれ１％および３％と低かった。

Figure 2005514071
Expression of AmphoR and GaLVR in bone marrow CD34 positive subpopulations after day 0 and porcine brain microtubule endothelial co-culture followed by liquid culture amphoR in sorted populations of CD34 positive CD38 negative cells and CD34 positive CD38 positive cells To analyze the effects of porcine brain microtubule endothelial cell co-culture on the expression of GaLVR, CD34 positive on day 0, after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture and liquid suspension culture Semi-quantitative RT-PCR was performed on mRNAs taken from the subset samples and the levels of these mRNAs were compared to HeLa cells as previously described (Orlic et al., 1998). As shown in FIG. 5, the expression of amphotropic receptor mRNA and GaLVR in the bone marrow CD34 positive CD38 negative subset on day 0 was very low compared to the expression in HeLa cells. After porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, the expression of amphoRmRNA and GaLVR in the CD34 positive CD38 negative cell subset did not change significantly compared to the HeLamRNA level. Similarly, the expression of amphoR and GaLVR mRNA in the CD34 positive CD38 negative subset remained very low after 5 days of liquid suspension culture. Furthermore, in all samples, GaLVR expression was observed to be uniformly low compared to amphoR expression in the same sample, and the transcription rates of these two retroviral receptors in the bone marrow CD34 positive subset were different. Was suggested. Table 2 shows the calculated expression in the bone marrow CD34 positive subset relative to the expression of retroviral receptor-mRNA in HeLa cells. The mean values of amphoR and GaLVR mRNA in the CD34 positive CD38 negative cells on day 0 were 5% and 11% of the average values of HeLa cells, respectively, whereas CD34 positive grown on porcine brain microtubule endothelial cells The average values for CD38 negative cells were 16% and 8% of the average values for HeLa cells. Moreover, the average value of AmphoR and GaLVR mRNA of CD34 positive CD38 negative cells after liquid culture was as low as 1% and 3%, respectively.
Figure 2005514071

ブタ脳微小管内皮細胞共培養または液体培養における０日目および増殖後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞へのレトロウィルス遺伝子導入
精製した骨髄ＣＤ３４陽性細胞を、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養で５日間増殖させた。そして増殖された細胞群を、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼレポ−タ−遺伝子を運び、高い力価（>１x１０５ CFU/mL）のモロニ−白血病ウィルスベクタ−を用いて３日間形質導入した。比較のため、０日目のＣＤ３４陽性細胞、および同一のサイトカインを加えた液体培養で処理されたＣＤ３４陽性細胞を、ＰＡ３１７およびＰＧ１３ベクタ−上清を用いて同一の方法で形質導入した。ＰＧ１３（レトロウィルスＰＧ１３）からのベクタ−を用い、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後に形質導入したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の１０.９％±５.２が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を示した（表３）。ＰＡ３１７（レトロウィルスＰＡ３１７）のベクタ−を用いて、ブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の１１.４％±５.６が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性であった。形質導入３日後の二つの実験からのブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のWrights−Geimsa染色は、高い、核：細胞質の比率および細かいクロマチンパタ−ンと共に、典型的な芽細胞形態を示した（図６ａ）。図６ｂは、ブタ脳微小管内皮細胞増殖およびレトロウィルスＰＧ１３を用いた形質導入後の二つの実験から集めたヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞における、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を示している。

Figure 2005514071
Figure 2005514071
 表３Ａでも示したように、０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞、および液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、ブタ脳微小管内皮細胞増殖のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞と比較すると明らかに形質導入レベルが低かった。また、０日目、液体培養、およびブタ脳微小管内皮細胞共培養でのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への形質導入効率も表３に示した。０日目、または液体培養、あるいはブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後でのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞への形質導入効率には、有意差が見られなかった（表３Ｂ）。 Retroviral gene transfer into day 34 and post-proliferation CD34 positive CD38 negative cells in porcine brain microtubule endothelial cell co-culture or liquid culture Purified bone marrow CD34 positive cells The cells were grown for 5 days in porcine brain microtubule endothelial cell co-culture supplemented with interleukin-6, stem cell factor, and flt-3 ligand. The expanded cells were then transduced for 3 days using a human placental alkaline phosphatase reporter gene and a high titer (> 1 × 10 5 CFU / mL) Moroni-leukemia virus vector. For comparison, CD34 positive cells on day 0 and CD34 positive cells treated with liquid culture supplemented with the same cytokine were transduced in the same way using PA317 and PG13 vector-supernatant. 10.9% ± 5.2 of CD34 positive CD38 negative cells transduced after co-culture with porcine brain microtubule endothelial cells using a vector from PG13 (retrovirus PG13) exhibited human placental alkaline phosphatase activity. (Table 3). Using the vector of PA317 (retrovirus PA317), 11.4% ± 5.6 of CD34 positive CD38 negative cells grown on porcine brain microtubule endothelial cells were positive for human placental alkaline phosphatase. . Wrights-Geimsa staining of CD34 positive CD38 negative cells grown on porcine brain microtubule endothelial cells from two experiments 3 days after transduction is typical with high nuclei: cytoplasm ratio and fine chromatin pattern. The blast morphology was shown (Figure 6a). FIG. 6b shows human placental alkaline phosphatase activity in human CD34 positive CD38 negative cells collected from two experiments after porcine brain microtubule endothelial cell proliferation and transduction with retrovirus PG13.
Figure 2005514071
Figure 2005514071
 As also shown in Table 3A, CD34 positive CD38 negative cells on day 0 and CD34 positive CD38 negative cells after liquid culture are clearly transduced when compared to CD34 positive CD38 negative cells of porcine brain microtubule endothelial cell proliferation. The level was low. Also shown in Table 3 are the transduction efficiencies of CD34 positive CD38 negative cells in day 0, liquid culture, and porcine brain microtubule endothelial cell co-culture. There was no significant difference in transduction efficiency into CD34 positive CD38 positive cells on day 0, or in liquid culture or 5 days after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture (Table 3B).

コロニ−形成細胞へのレトロウィルス遺伝子導入
１４日目のコロニ−形成細胞におけるヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ発現を解析するために、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後に集め、３日間レトロウィルスＰＧ１３およびレトロウィルスＰＡ３１７にさらしたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞をメチルセルロ−ス中に撒いた。１４日目に、レトロウィルスＰＡ３１７で形質導入したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞の３５.１％±１５.５％が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性であった。同様に、レトロウィルスＰＧ１３にさらしたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞の３８.１％±１７.５が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性を示した（表４Ａ）。ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ発現を示す典型的な単能性骨髄幹細胞を図６ｃに示す。コントロ−ルとして、非形質導入のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞で、熱不活性化後のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性をテストし、（その結果）これらのコロニ−はヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陰性であった（デ−タ示さず）。比較として、０日目および液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞もまたレトロウィルスＰＧ１３およびレトロウィルスＰＡ３１７で３日間形質導入し、メチルセルロ−スコロニ−形成解析にかけた。形質導入したコロニ−の平均数は０日目および液体培養群の両方とも、ブタ脳微小管内皮細胞共培養群に比べて明らかに少なかった（表４）。それぞれのベクタ−を用いてＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成した、コロニ−形成細胞におけるヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼの発現は、０日目群では８.３％−２１.４％、液体培養群では４５.４％−５８.１％、そしてブタ脳微小管内皮細胞共培養群では６２.５％−６４.２％であった。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成したコロニ−形成細胞への、レトロウィルスＰＡ３１７あるいはレトロウィルスＰＧ１３（p<０.０１およびp<０.０１；表４b）を用いた形質導入の効率は、液体培養後あるいはブタ脳微小管内皮細胞共培養後で、明らかに０日目群より高かった。

Figure 2005514071
Figure 2005514071
 考察
ヒト骨髄内のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群は、生体内での長期細胞増殖能力をもつ細胞に富んでおり（Bhatia他、１９９７；Berardi他、１９９５；Hao他、１９９５）、それゆえに、これらの細胞は遺伝子導入療法に理想的である。しかしながら、これらの細胞へのレトロウィルス遺伝子導入の効率は、一貫して低いものであった（Landsdorp他、１９９３；Dao他、１９９８；McCowage他、１９９８）。これらの残念な結果は、細胞が初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型を保持している時、細胞周期を促進するような生体外の条件が不十分であることによる。加えて、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞表面上のレトロウィルスレセプタ−数を増加するような生体外の条件もまた有効であると考えられるだろう（Gentry他、１９９９；Crooks他、１９９３）。短期間の生体外液体培養下で、造血幹細胞の細胞周期を延ばしたり誘発したりする方法は、決められた前駆細胞への造血幹細胞の分化（Varas他、１９９８；Veiby他、１９９７）と共に、増殖移植片における移植拒絶の獲得に関連していた（Peters他、１９９５；Yonemura他、１９９６；Traycoff他、１９９６）。我々は、最近、サイトカインを補ったブタ脳内皮細胞層が、SCID−Hu骨の再生の能力（Brandt他、１９９８）や致死量の放射線照射されたヒヒを救う能力を持つ、造血前駆細胞の生体外での増殖を助けるということを報告した。本実験で、３日間のレトロウィルスベクタ−上清との形質導入後の、ヒト骨髄ＣＤ３４陽性細胞のブタ脳微小管内皮細胞単層との５日間の共培養で、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群へのレトロウィルス遺伝子導入の効率が明らかに上昇することがわかった。対して、増殖していない（０日目の）骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞および液体懸濁培養後に収集したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のレトロウィルス遺伝子導入効率は非常に低かった。 Retroviral gene transfer into colony-forming cells To analyze human placental alkaline phosphatase expression in colony-forming cells on day 14, collected 5 days after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, 3 days retro CD34 positive CD38 negative cells exposed to virus PG13 and retrovirus PA317 were seeded in methylcellulose. On day 14, 35.1% ± 15.5% of colony-forming cells derived from CD34 positive CD38 negative cells transduced with retrovirus PA317 were positive for human placental alkaline phosphatase. Similarly, 38.1% ± 17.5 of colony-forming cells derived from CD34 positive CD38 negative cells exposed to retrovirus PG13 were positive for human placental alkaline phosphatase (Table 4A). A typical unipotent bone marrow stem cell exhibiting human placental alkaline phosphatase expression is shown in FIG. 6c. As controls, colony-forming cells derived from non-transduced CD34 positive CD38 negative cells were tested for human placental alkaline phosphatase activity after heat inactivation, and as a result, these colonies were human. The placental alkaline phosphatase was negative (data not shown). For comparison, CD34 positive CD38 negative cells on day 0 and after liquid culture were also transduced with retrovirus PG13 and retrovirus PA317 for 3 days and subjected to methylcellulose colonization analysis. The average number of transduced colonies was clearly lower in both day 0 and liquid culture groups compared to the swine brain microtubule endothelial cell co-culture group (Table 4). Expression of human placental alkaline phosphatase in colony-forming cells generated from CD34-positive CD38-negative cells using the respective vectors was 8.3% -21.4% in the day 0 group, and the liquid culture group 45.4% -58.1% and 62.5% -64.2% in the swine brain microtubule endothelial cell co-culture group. The efficiency of transduction with retrovirus PA317 or retrovirus PG13 (p <0.01 and p <0.01; Table 4b) to colony-forming cells generated from CD34 positive CD38 negative cells is Or after pig brain microtubule endothelial cell co-culture, it was clearly higher than day 0 group.
Figure 2005514071
Figure 2005514071
 DISCUSSION The CD34 positive CD38 negative cell population in human bone marrow is rich in cells with long-term cell growth ability in vivo (Bhatia et al., 1997; Berardi et al., 1995; Hao et al., 1995), and therefore Cells are ideal for gene transfer therapy. However, the efficiency of retroviral gene transfer into these cells was consistently low (Landsdorp et al., 1993; Dao et al., 1998; McCowage et al., 1998). These unfortunate results are due to insufficient in vitro conditions that promote the cell cycle when the cells retain an early CD34 positive CD38 negative phenotype. In addition, in vitro conditions that increase the number of retroviral receptors on the surface of CD34 positive CD38 negative cells would also be considered effective (Gentry et al., 1999; Crooks et al., 1993). Methods for extending or inducing the cell cycle of hematopoietic stem cells in short-term in vitro liquid cultures, along with the differentiation of hematopoietic stem cells into defined progenitor cells (Varas et al., 1998; Veiby et al., 1997) It was associated with the acquisition of transplant rejection in grafts (Peters et al., 1995; Yonemura et al., 1996; Traycoff et al., 1996). We recently described a hematopoietic progenitor cell layer in which a porcine brain endothelial cell layer supplemented with cytokines has the ability to regenerate SCID-Hu bone (Brandt et al., 1998) and to save lethal doses of irradiated baboons. It was reported that it helps growth outside. In this experiment, human bone marrow CD34 positive cells were cocultured with porcine brain microtubule endothelial monolayer for 5 days after transduction with a retroviral vector-supernatant for 3 days, to a CD34 positive CD38 negative cell group. It was found that the efficiency of retroviral gene transfer in the plant increased obviously. In contrast, retroviral gene transfer efficiency of non-proliferating (day 0) bone marrow CD34 positive CD38 negative cells and CD34 positive CD38 negative cells collected after liquid suspension culture was very low.

本システムで観察された遺伝子導入効率の上昇に寄与する、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の影響は二つある：第一に、ブタ脳微小管内皮細胞の共培養は、非常に高い割合（>９３％）のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞がわずか短期間（５日間）の共培養の後で細胞分割を開始する要因となっている。対して、骨髄から採取した０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の９５％以上がG０期にあり、これらの細胞は同様の形質導入方法では効率的に形質導入をすることはできないだろう。造血幹細胞での細胞周期のレベルは、一貫して前述の研究（Knnan−Shanzer他、１９９５；Miller他、１９９０）におけるレトロウィルス遺伝子導入の効率の高さと関係していた。第二に、サイトカインを加えたブタ脳微小管内皮細胞単層上でのヒトＣＤ３４陽性細胞の短期間（５−１０日間）の共培養は、細胞の分割が進行中の際、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞の増殖を促進する。対して、同一のサイトカインを補った液体懸濁培養は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で顕著に細胞周期を誘発するが、しかし、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞は５日目までにごくわずかのレベルにまで減少する。液体懸濁培養と比較してブタ脳微小管内皮細胞共培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞の有意な増加は、内皮細胞との接触が培養中のより初期的な再構築細胞の維持を促進することを示唆している。Glimm等（Glimm他、１９９９）は、最近、インタ−ロイキン３＋インタ−ロイキン６＋顆粒球コロニ−刺激因子＋幹細胞因子＋Flt−３リガンドという、サイトカインの最適な組み合わせが、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で重要な細胞分割を引き起こすことを示しているが、しかし、我々の結果では、ブタ脳微小管内皮細胞単層が存在しないときにはこのサイトカインの組み合わせはＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の急速な分化を引き起こすことを示している。その他の研究者は、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子を加えた、ネズミストロ−マ細胞株であるAFT０２４（Theimann他、１９９８）が、３−１０日間の培養で低いレベルのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞（範囲０.１１−２.３０％）を保持することを示している。これらの著者は、AFT０２４が、前駆細胞プ−ルでアポト−シスあるいは分化を阻害することにより、初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞を維持できるのかもしれないと仮説を立てた。インタ−ロイキン３＋インタ−ロイキン６＋顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子＋幹細胞因子＋Flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞単層は、生体移植可能な細胞群を維持する間、短期間培養中のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で高レベルの細胞周期を促進することにより、遺伝子導入の適用に対して特異的なアドバンテ−ジをもたらしている。それゆえに、レトロウィルス形質導入後のブタ脳微小管内皮細胞単層上でのヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の増殖が、遺伝子標識された細胞が生体内で長期的な再構築を引き起こす可能性を高めるのももっともである。 There are two effects of co-culture of porcine brain microtubule endothelial cells that contribute to the increase in gene transfer efficiency observed in this system: First, the co-culture of porcine brain microtubule endothelial cells has a very high rate ( > 93%) CD34 positive CD38 negative cells are the factor that initiates cell division after co-culture for only a short period (5 days). Against it, more than 95% of the day 0 of CD34 + CD38-negative cells from the bone marrow is at 0 phase G, these cells will not be able to efficiently transduce the same transduction process. The level of cell cycle in hematopoietic stem cells was consistently associated with the high efficiency of retroviral gene transfer in the previous study (Knnan-Shanzer et al., 1995; Miller et al., 1990). Second, short-term (5-10 days) co-culture of human CD34-positive cells on porcine brain microtubule endothelial cell monolayers with added cytokines is negative for CD34-positive CD38 when cell division is ongoing. Promotes phenotypic cell growth. In contrast, liquid suspension cultures supplemented with the same cytokines markedly induce cell cycle in CD34 positive CD38 negative cells, however, cells with CD34 positive CD38 negative phenotype have negligible levels by day 5. Decrease to A significant increase in cells with a CD34 positive CD38 negative phenotype after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture compared to liquid suspension culture is the maintenance of reconstituted cells earlier in contact with the endothelial cells in culture. Suggests to promote. Glimm et al. (Glimm et al., 1999) recently found that the optimal cytokine combination of inter-leukin 3 + inter-leukin 6 + granulocyte colony-stimulating factor + stem cell factor + Flt-3 ligand is important in CD34 positive CD38 negative cells. Although it has been shown to cause cell division, our results show that this cytokine combination causes rapid differentiation of CD34 positive CD38 negative cells in the absence of porcine brain microtubule endothelial cell monolayers Yes. Other researchers have reported that AFT024 (Theimann et al., 1998), a murine stromal cell line supplemented with interleukin 3, interleukin 6, and stem cell factor, produced low levels of CD34 in 3-10 days of culture. It shows holding positive CD38 negative cells (range 0.11-2.30%). These authors hypothesized that AFT024 may be able to maintain early CD34 positive CD38 negative progenitor cells by inhibiting apoptosis or differentiation in the progenitor pool. Porcine brain microtubule endothelial cell monolayer added with interleukin 3 + interleukin 6 + granulocyte macropha-dicoroni-stimulating factor + stem cell factor + Flt-3 ligand is cultured for a short period of time while maintaining the transplantable cells. Promoting a high level of the cell cycle with CD34 positive CD38 negative cells in it provides a specific advantage for gene transfer applications. Therefore, proliferation of human CD34-positive CD38-negative cells on porcine brain microtubule endothelial cell monolayers after retroviral transduction increases the likelihood that gene-labeled cells will cause long-term remodeling in vivo Of course.

我々の研究では、定常状態のヒト骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群におけるAmphoRおよびGaLVRmRNAのレベルは共に非常に低く、そしてこれらのレベルはブタ脳微小管内皮細胞共培養あるいは液体懸濁培養のどちらの後でも顕著な上昇は見られないことを示している。これらの結果は、低温保存したヒト臍帯血のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞（２２倍）（Orlic他、１９９８）および顆粒球コロニ−刺激因子結集抹消血液（４倍）（Horwitz他、１９９９）と比較して、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞ではレトロウィルスｍRNAの発現レベルが低いという最近の観察と一致している。しかしながら、我々のデ−タはさらに、標的細胞中のAmphoRおよびGaLVRmRNAの低い発現レベルは、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への遺伝子導入効率の改善を制限する絶対的な要因ではないかもしれないことを示唆している。我々の研究は、両細胞株および初期抹消血液ＣＤ３４陽性細胞におけるアンホトロピックなレトロウィルスを用いた形質導入の効率が細胞表面上のアンホトロピックレセプタ−（PiT−２）の発現に依存しているという最近の分析（Macdonald他、２０００）と対照的である。我々の研究では、ブタ脳微小管内皮細胞共培養で、AmphoRmRNAのレベルが非常に控えめに上昇する、あるいは全く上昇せず、さらに、０日目と比較して骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞中のGaLVRmRNAの発現レベルが著しい変化を見せないことがわかっている。それゆえに、我々の研究では、ブタ脳微小管内皮細胞増殖ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への著しく高い形質導入効率は、ほとんどもっぱら、標的細胞群中の細胞周期が高まることによって引き起こされたと思われる。代わりに、レトロウィルスは確認されているエンベロ−プレセプタ−（例えばamphoRあるいはGaLVR）とは異なったレトロウィルスセプタ−を通じて標的細胞に感染することができるため、ブタ脳微小管内皮細胞共培養中に起こる未知のレセプタ−の変化もまた、観察された形質導入効率の上昇の説明となるかもしれない。特筆すべきは、本研究で用いたレトロウィルスの力価（１−３x１０５CFU/mL）は、有効な形質導入効率のために重要と考えられてきた“高力価”濃度（>１x１０６CFU/ｍL）（van Hennick他、１９９８）よりも低かった（Mulligan他、１９９３）。これはさらに標的造血細胞の内皮細胞層との前培養でこれらの細胞への形質導入効率が増したことを示している。 In our study, both levels of AmphoR and GaLVR mRNA in the steady state human bone marrow CD34 positive CD38 negative cell population were very low, and these levels were either after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture or liquid suspension culture. But it shows no significant increase. These results are compared to cryo-preserved human umbilical cord blood CD34 positive CD38 negative cells (22 fold) (Orlic et al., 1998) and granulocyte colony-stimulating factor-concentrated peripheral blood (4 fold) (Horwitz et al., 1999). Thus, it is consistent with recent observations that bone marrow CD34 positive CD38 negative cells have low levels of retroviral mRNA expression. However, our data further indicate that low expression levels of AmphoR and GaLVR mRNA in target cells may not be an absolute factor limiting improvement in gene transfer efficiency into bone marrow CD34 positive CD38 negative cells. Suggests. Our study shows that the efficiency of transduction with an amphotropic retrovirus in both cell lines and early peripheral blood CD34 positive cells is dependent on the expression of an amphotropic receptor (PiT-2) on the cell surface Contrast with recent analysis (Macdonald et al., 2000). In our study, in porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, the level of AmphoRmRNA increases very modestly or not at all, and GaLVR mRNA in bone marrow CD34 positive CD38 negative cells compared to day 0 It has been found that the expression level of is not significantly changed. Therefore, in our study, it is likely that the remarkably high transduction efficiency of porcine brain microtubule endothelial cell proliferating CD34 positive CD38 negative cells was caused almost exclusively by the increased cell cycle in the target cell population. Instead, it occurs during porcine brain microtubule endothelial cell co-culture because retroviruses can infect target cells through a different retroviral receptor than a recognized enveloper receptor (eg, amphoR or GaLVR). Unknown receptor changes may also explain the observed increase in transduction efficiency. It should be noted that the titer of retrovirus used in this study (1-3 × 10 5 CFU / mL) is a “high titer” concentration (> 1 × 10 6 ) that has been considered important for effective transduction efficiency. CFU / mL) (van Hennick et al., 1998) (Mulligan et al., 1993). This further indicates that transduction efficiency of these cells was increased by pre-culture of the target hematopoietic cells with the endothelial cell layer.

これらの研究で、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞がブタ脳微小管内皮細胞共培養後に形質導入に成功することが証明されたが、しかし、成人骨髄ＣＤ３４陽性細胞とは対照的に役立つ臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いることで遺伝子導入効率はさらに増加したかもしれない。臍帯血ＣＤ３４陽性細胞へのレトロウィルス遺伝子導入効率が４７−５４％と高いことが報告されている（Hennemann他、１９９９；Van Hennic他、１９９８）。これら臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた高い導入効率は、おそらくある部分は、始原細胞の出現率およびそれら細胞の自己増殖能の潜在性の相違と同様、レトロウィルスレセプタ−の発現の違いに関する、骨髄ＣＤ３４陽性細胞および臍帯血ＣＤ３４陽性細胞間の明らかな個体発生の相違のためであるかもしれない。（Orlic他、１９９８；Zandstra他、１９９８；Weeks他、１９９８）。それでもなお、自己由来のＣＤ３４陽性細胞は、ヒトへの遺伝子療法適応のための造血幹細胞の主たる好ましい材料であり続けるだろう。前述で示しているように、生体外ブタ脳微小管内皮細胞層上で増殖したヒトおよび霊長類骨髄前駆細胞は、移植受容体で長期再構築が可能であることから、内皮細胞とのヒト骨髄前駆細胞の前培養を含む形質導入プロトコ−ルで、遺伝子標識細胞の長期移植の見込みが向上することを楽観視している。   These studies demonstrated that bone marrow CD34 positive CD38 negative cells were successfully transduced after porcine brain microtubule endothelial cell co-culture, but cord blood CD34 positive served in contrast to adult bone marrow CD34 positive cells Gene transfer efficiency may be further increased by using cells. It has been reported that retroviral gene transfer efficiency into cord blood CD34 positive cells is as high as 47-54% (Hennemann et al., 1999; Van Hennic et al., 1998). The high transduction efficiency using these cord blood CD34 positive cells is probably due in part to the bone marrow, which is related to the difference in the expression of retroviral receptors as well as the difference in the appearance rate of progenitor cells and the potential for their self-proliferation ability. This may be due to a clear ontogenetic difference between CD34 positive cells and cord blood CD34 positive cells. (Orlic et al., 1998; Zandstra et al., 1998; Weeks et al., 1998). Nevertheless, autologous CD34 positive cells will continue to be the main preferred material for hematopoietic stem cells for gene therapy applications in humans. As indicated above, human and primate bone marrow progenitor cells grown on porcine brain microtubule endothelial cell layers in vitro can be reconstituted for a long time with transplant recipients, so human bone marrow with endothelial cells We are optimistic that the potential for long-term transplantation of gene-tagged cells will improve with transduction protocols involving preculture of progenitor cells.

上記の教示を考慮すると明らかに、本発明の多くの応用および変形が可能である。それゆえに、本発明は付記の請求項の範囲内で、明確に記述したものとは別の方法で行うこともできる。   Obviously, many applications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings. Therefore, the invention may be practiced otherwise than as specifically described within the scope of the appended claims.

文献
AGRAWAL, Y.P., AGRAWAL, R.S., SINCLAIR, A.M., YOUNG, D., MARUYAMA, M., LEVINE, F., HO, A.D.（１９９６）、「血液由来のＣＤ３４陽性細胞における細胞周期キネティクスおよびVSV−G擬似型レトロウィルス仲介遺伝子導入」Exp Hematol ２４, ７３８−７４７。 Literature
AGRAWAL, YP, AGRAWAL, RS, SINCLAIR, AM, YOUNG, D., MARUYAMA, M., LEVINE, F., HO, AD (1996), “Cell cycle kinetics and VSV-G simulation in blood-derived CD34 positive cells Type retrovirus-mediated gene transfer "Exp Hematol 24, 738-747.

BERARDI, A.C., WANG, A., LEVINE, J., LOPEZ, P., SCADDEN, D.T. （１９９５）、「ヒト造血幹細胞の機能的な単離および特色付け」Science ２６７, １０４−１０８。 BERARDI, A.C., WANG, A., LEVINE, J., LOPEZ, P., SCADDEN, D.T. (1995), "Functional isolation and characterization of human hematopoietic stem cells" Science 267, 104-108.

BHATIA, M., WANG, J., KAPP, U., BONNET, D., DICK, J.E（１９９７）、「免疫不全マウスの再構築が可能な始原ヒト造血細胞の精製」 Proc Natl Acad Sci USA ９４, ５３２０−５３２５。 BHATIA, M., WANG, J., KAPP, U., BONNET, D., DICK, JE (1997), "Purification of primitive human hematopoietic cells capable of reconstructing immunodeficient mice" Proc Natl Acad Sci USA 94 , 5320-5325.

BLAIR, P.J., RILEY, J.L., LEVINE, B.L., LEE, K.P., CRAIGHEAD, N., FRANCOMANO, T., PERFETTO, S.J., GRAY, G.S., CARRENO, B.M., JUNE,C.H. （１９９８）、「最新技術：CTLA−４ライゲ−ションがインタ−ロイキン２の分泌を阻害するがBcl−xLを誘導する特有のシグナルを休止CD４T細胞へ伝える」 J. Immunol. １６０, １２−１６。 BLAIR, PJ, RILEY, JL, LEVINE, BL, LEE, KP, CRAIGHEAD, N., FRANCOMANO, T., PERFETTO, SJ, GRAY, GS, CARRENO, BM, JUNE, CH (1998), “Latest Technology: CTLA -4 ligation inhibits the secretion of interleukin 2 but delivers a unique signal that induces Bcl-xL to resting CD4 T cells "J. Immunol. 160, 12-16.

BRANDT, J.E., GARY, A., LUENS, K., TRAVIS, M., YOUNG, J., TONG, J., CHEN, S., DAVIS, T.A., LEE, K., CHEN, B., TUSHINSKI, R., HOFFMAN, R.（１９９８）、「ブタ内皮細胞株における長期増殖培養後のヒト骨髄幹細胞による骨髄再生」 Exp Hematol ２６, ９５０−９６１。 BRANDT, JE, GARY, A., LUENS, K., TRAVIS, M., YOUNG, J., TONG, J., CHEN, S., DAVIS, TA, LEE, K., CHEN, B., TUSHINSKI, R., HOFFMAN, R. (1998), “Bone marrow regeneration with human bone marrow stem cells after long-term growth culture in porcine endothelial cell lines” Exp Hematol 26, 950-961.

BRANDT, J.E., BARTHOLEMEW, A., FORTMAN, J., NELSON, M., BRUNO, E., CHEN, L.,TURIAN, J., DAVIS, T., CHUTE, J.P., HOFFMAN, R.（１９９９）、「生体外でのブタ脳微小管内皮細胞との自家骨髄幹細胞の増殖が、致死量放射線照射したヒヒを救済する移植を可能にする」 Blood ９４, １０６−１１３。 BRANDT, JE, BARTHOLEMEW, A., FORTMAN, J., NELSON, M., BRUNO, E., CHEN, L., TURIAN, J., DAVIS, T., CHUTE, JP, HOFFMAN, R. (1999) "In vitro proliferation of autologous bone marrow stem cells with porcine brain microtubule endothelial cells allows transplantation to rescue lethal doses of irradiated baboons." Blood 94, 106-113.

BRUGGER, W., HEIMFELD, S., BRENSON, R.J., MERTELSMANN, R., KANZ, L.（１９９５）、「生体外で生成された自家前駆細胞による、大量化学療法後の造血細胞の再構成」 N Engl J Med ３３３, ２８３−２８７。 BRUGGER, W., HEIMFELD, S., BRENSON, RJ, MERTELSMANN, R., KANZ, L. (1995), “Reconstitution of hematopoietic cells after high-dose chemotherapy with autologous progenitor cells generated in vitro” N Engl J Med 333, 283-287.

CHUTE, J.P., SAINI, A., KAMPEN, R., WELLS, M., DAVIS, T.A.（１９９９）、「ストロ−マ不在のブタ脳微小管内皮細胞培養におけるヒトＣＤ３４陽性細胞の細胞周期段階および始原細胞接着分子プロファイルの比較研究」 Exp Hematol ２７, ３７０−３７９。 CHUTE, JP, SAINI, A., KAMPEN, R., WELLS, M., DAVIS, TA (1999), “Cell cycle stages and primitives of human CD34 positive cells in porcine brain microtubule endothelial cell culture without stroma. Comparative study of cell adhesion molecule profiles "Exp Hematol 27, 370-379.

CROOKS, G.M., KOHN, D.B. （１９９３）、「成長因子がヒトＣＤ３４陽性骨髄前駆細胞へのアンホトロピックなレトロウィルス結合を増大する」Blood ８２, ３２９０−３２９７。 CROOKS, G.M., KOHN, D.B. (1993), “Growth factors increase amphotropic retroviral binding to human CD34-positive bone marrow progenitor cells” Blood 82, 3290-3297.

DANNAEUS, K., NILSSON, K., JONSSON, J.I.（１９９８）、「骨髄系選択、および顆粒球細胞またはマクロファ−ジの成熟におけるＦlt−３リガンドおよび幹細胞因子の異なる動作」Exp Hematol ２６, ３４５−３５２。 DANNAEUS, K., NILSSON, K., JONSSON, JI (1998), "Myeloid selection and differential behavior of Flt-3 ligand and stem cell factor in granulocyte or macrophage maturation" Exp Hematol 26, 345- 352.

DAO, M.A., SHAH, A.J., CROOKS, G.M., NOLTA, J.A.（１９９８）、「免疫不全マウスで評価されたＣＤ３４陽性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性のヒト造血前駆細胞の移植およびレトロウィルス合成」Blood ８５, １７５１−１７６１。 DAO, MA, SHAH, AJ, CROOKS, GM, NOLTA, JA (1998), “Transplantation and retroviral synthesis of CD34-positive and CD34-positive CD38-negative human hematopoietic progenitor cells evaluated in immunodeficient mice” Blood 85, 1751 -1761.

DAVIS, T., ROBINSON, D., LEE, K., KESSLER, S.（１９９５）、「ブタ脳微小管内皮細胞がヒト始原造血骨髄前駆細胞のインビトロでの増殖を高い潜在性でサポ−トする：細胞間相互作用およびコロニ−刺激因子の必要条件」Blood ８５,１７５１−１７６１。 DAVIS, T., ROBINSON, D., LEE, K., KESSLER, S. (1995), “Pig brain microtubule endothelial cells support in vitro proliferation of human primitive hematopoietic bone marrow progenitors with high potential. Yes: Prerequisites for cell-cell interactions and colony-stimulating factors "Blood 85,1751-1761.

EMMONS, R.V., DOREN, S., ZUJEWSKI, J., COTTLER−FOX, M., CARTER, C.S., HINES, K., O’SHAUGHNESSY, J.A., LEITMAN, S.F., GREENBLATT, J.J., DUNBAR, C.E.（１９９７）、「成長因子不在あるいは自家ストロ−マ上での、成人の抹消血または骨髄由来の６時間にわたるＣＤ３４陽性細胞のレトロウィルス遺伝子導入は生体内の標識効率の改善につながらない」 Blood ８９, ４０４０−４０４６。 EMMONS, RV, DOREN, S., ZUJEWSKI, J., COTTLER-FOX, M., CARTER, CS, HINES, K., O'SHAUGHNESSY, JA, LEITMAN, SF, GREENBLATT, JJ, DUNBAR, CE (1997) "Retroviral gene transfer of CD34 positive cells over 6 hours from adult peripheral blood or bone marrow in the absence of growth factors or on autologous stroma does not lead to improved in vivo labeling efficiency" Blood 89, 4040-4046 .

GENTRY, T., SMITH, C.（１９９９）、「臍帯血ＣＤ３４brＣＤ３８陰性CD３３陰性細胞へのレトロウィルスベクタ−仲介の遺伝子導入」 Exp Hematol ２７, １２４４−５４。 GENTRY, T., SMITH, C. (1999), “Retroviral vector-mediated gene transfer into cord blood CD34brCD38 negative CD33 negative cells” Exp Hematol 27, 1244-54.

GLIMM, H., EAVES, C.J.（１９９９）、「短期間培養におけるヒト生体内再構築細胞の多機能自己再生分裂の直接的証拠」 Blood ９４, ２１６１−２１６８。 GLIMM, H., EAVES, C.J. (1999), "Direct evidence of multifunctional self-renewal of human in vivo reconstructed cells in short-term culture" Blood 94, 2161-2168.

HAO, Q.L., SHAH, A.J., THEIEMANN, F.T., SMOGORZEWSKA, E.M., CROOKS, G.M. （１９９５）、「臍帯血および骨髄中のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の機能比較」 Blood ８６, ３７４５−３７５３。 HAO, Q.L., SHAH, A.J., THEIEMANN, F.T., SMOGORZEWSKA, E.M., CROOKS, G.M. (1995), “Functional comparison of CD34-positive CD38-negative cells in cord blood and bone marrow” Blood 86, 3745-3753.

HUANG, S., TERSTAPPEN, W.M.（１９９４）、「単球ヒトＣＤ３４陽性、HLA−DR陽性、ＣＤ３８陰性造血幹細胞のリンパ球および白血球の分化」 Blood ８３, １５１５−１５２６。 HUANG, S., TERSTAPPEN, W.M. (1994), "Monocyte human CD34 positive, HLA-DR positive, CD38 negative hematopoietic stem cell lymphocyte and leukocyte differentiation" Blood 83, 1515-1526.

HENNEMANN, B., CONNEALLY, E., PAWLIUK, R., LEBOULCH, P., ROSE−JOHN, S., REID, D., CHUO, J., HUMPHRIES, R., EAVES, C.J.（１９９９）、「プロトコ−ル変異の体系的な解析による、ヒトNOD/SCIDマウス再構築臍帯血細胞へのレトロウィルス仲介遺伝子導入の最適化」Exp Hematol ２７, ８１７−８２５。 HENNEMANN, B., CONNEALLY, E., PAWLIUK, R., LEBOULCH, P., ROSE−JOHN, S., REID, D., CHUO, J., HUMPHRIES, R., EAVES, CJ (1999), “ Optimization of retrovirus-mediated gene transfer into reconstructed umbilical cord blood cells of human NOD / SCID mice by systematic analysis of protocol mutations "Exp Hematol 27, 817-825.

HORWITZ, M., MALECH, H., ANDERSON, S., GIRARD, L., BODINE, D., ORLIC, D. （１９９９）、「顆粒球コロニ−刺激因子により染色体起動した抹消血幹細胞は細胞周期のG１期に移行し、より高レベルのアンホトロピックなレトロウィルスレセプタ−mRNAを発現する」Exp Hematol ２７, １１６０−１１６７。 HORWITZ, M., MALECH, H., ANDERSON, S., GIRARD, L., BODINE, D., ORLIC, D. (1999), “Granulocyte colony-stimulated peripheral blood stem cells are cell cycle Go to G1 phase and express higher levels of amphotropic retroviral receptor-mRNA "Exp Hematol 27, 1160-1167.

JORDAN, C.T., YAMASAKI, G., MINAMOTO, D.（１９９６）、「始原ヒト造血細胞群内の特定表現型サブセットの高分解能細胞周期解析」 Exp Hematol ２４, １３４７−１３５５。 JORDAN, C.T., YAMASAKI, G., MINAMOTO, D. (1996), “High-resolution cell cycle analysis of specific phenotypic subsets within primitive human hematopoietic cell populations” Exp Hematol 24, 1347-1355.

KIEM, H.P., ANDREWS, R.G., MORRIS, J., PETERSON, L., HEYWARD, S., ALLEN, J., RASKO, J., POTTER, J., MILLER, A.D.（１９９８）、「インタ−ロイキン−６、幹細胞因子、flt−３リガンド、および巨大核細胞成長および発達因子の組み合わせで組み換え型ヒトフィブロネクチン断片CH−２９６を用いた、ヒヒ骨髄再構築細胞への遺伝子導入の改善」 Blood ９２, １８７８−１８８６。 KIEM, HP, ANDREWS, RG, MORRIS, J., PETERSON, L., HEYWARD, S., ALLEN, J., RASKO, J., POTTER, J., MILLER, AD (1998), “Interleukin- 6. Improving gene transfer into baboon bone marrow reconstructed cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with stem cell factor, flt-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factors "Blood 92, 1878- 1886.

KANAAN−SHANZER, S., VALERIO, D., VAN BEUSECHEM, V.W.（１９９５）、「ヒト造血幹細胞の細胞周期段階、造血成長因子への応答、およびレトロウィルスベクタ−仲介の形質導入」Gene Ther ３,３２３−３３３。 KANAAN-SHANZER, S., VALERIO, D., VAN BEUSECHEM, VW (1995), “Cell cycle stage of human hematopoietic stem cells, response to hematopoietic growth factors, and retroviral vector-mediated transduction” Gene Ther 3, 323-333.

LANDSDORP, P.M., DRAGOWSKA, W.（１９９３）、「血清なしの骨髄培養における造血細胞の維持は休止前駆細胞の連続した増加を伴う」Exp Hematol ２１,１３２１−１３２７。 LANDSDORP, P.M., DRAGOWSKA, W. (1993), "Maintenance of hematopoietic cells in serum-free bone marrow culture is accompanied by a continuous increase in resting progenitor cells" Exp Hematol 21, 1321-1327.

MACDONALD, C., WALKER, S., WATTS, M., INGS, I., LINCH, D., DEVEREUX, S.（２０００）、「形質導入効率およびウィルス性力価におけるアンホトロピックなレトロウィルスレセプタ−PiT−２の発現変化の影響：遺伝子療法への密接な関係」 Hum Gene Ther １１, ５８７−５９５。 MACDONALD, C., WALKER, S., WATTS, M., INGS, I., LINCH, D., DEVEREUX, S. (2000), “Amphotropic retroviral receptors on transduction efficiency and viral titer. Effects of altered expression of PiT-2: Close implications for gene therapy "Hum Gene Ther 11, 587-595.

MCCOWAGE, G.B., PHILLIPS, K.L., GENTRY, T.L., HULL, S., KURTZBERG, J., GILBOA, E., SMITH, C.（１９９８）、「原始臍帯血細胞へのレトロウィルスベクタ−遺伝子導入の多パラメ−タ−蛍光活性化細胞分離解析」 Exp Hematol ２６, ２８８−２９８。 MCCOWAGE, GB, PHILLIPS, KL, GENTRY, TL, HULL, S., KURTZBERG, J., GILBOA, E., SMITH, C. (1998), “Retroviral vectors into primitive umbilical cord blood cells— -Fluorescence activated cell separation analysis "Exp Hematol 26, 288-298.

MILLER A.D.（１９９６）、「レトロウィルスに対する細胞表面レセプタ−および遺伝子導入への示唆」Proc Natl Acad Sci USA ９３, １１４０７−１１４１３。 MILLER A.D. (1996), "Cell surface receptors for retroviruses and suggestions for gene transfer" Proc Natl Acad Sci USA 93, 11407-11413.

MILLER, D.G., ADAM, M.A., MILLER, A.D.（１９９０）、「レトロウィルスベクタ−による遺伝子導入は、感染時に活発に複製する細胞中においてのみ生じる」Ｍol Cell Biol １０, ４２３９−４２４２。 MILLER, D.G., ADAM, M.A., MILLER, A.D. (1990), "Gene transfer by retroviral vectors only occurs in cells that replicate actively upon infection," Mol Cell Biol 10, 4239-4242.

MILLER,D.G., EDWARDS, R.H., MILLER,A.D.（１９９４）、「アンホトロピックなマウスレトロウィルスに対する細胞内レセプタ−のクロ−ニングは、テナガザル白血球ウィルスに対するものとの相同性を示した」Proc Natl Acad Sci USA ９１, ７８−８２。 MILLER, DG, EDWARDS, RH, MILLER, AD (1994), “Cloning of intracellular receptors against amphotropic murine retroviruses showed homology to that of gibbon leukocytes” Proc Natl Acad Sci USA 91, 78-82.

MULLIGAN, R.C.（１９９３）、「遺伝子療法の基礎科学」Science ２６０, ９２６−９３２。 MULLIGAN, R.C. (1993), "Basic Science of Gene Therapy" Science 260, 926-932.

NOLTA, J.A., SMOGORZEWSKA, E., KOHN, D.（１９９５）、「始原ヒト造血細胞のレトロウィルス仲介形質導入のための最適条件の解析」Blood ８６, １０１−１１０。 NOLTA, J.A., SMOGORZEWSKA, E., KOHN, D. (1995), "Analysis of Optimal Conditions for Retrovirus-Mediated Transduction of Primordial Human Hematopoietic Cells" Blood 86, 101-110.

ORLIC, D., GIRARD, L., JORDAN, C., ANDERSON, S., CLINE, A., BORDINE, A.（１９９６）、「マウスおよびヒト造血幹細胞中のアンホトロピックなレトロウィルスレセプタ−をコ−ドするmRNAのレベルは低く、レトロウィルス形質導入の効率と相互に関係している」Proc Natl Acad Sci USA ９３, １１０９７−１１１０２。 ORLIC, D., GIRARD, L., JORDAN, C., ANDERSON, S., CLINE, A., BORDINE, A. (1996), “Coordinated amphotropic retroviral receptors in mouse and human hematopoietic stem cells. -The level of mRNA being transferred is low and correlates with the efficiency of retroviral transduction "Proc Natl Acad Sci USA 93, 11097-11102.

ORLIC, D., GIRALD, L.J., ANDERSON, S.M., PYLE, L.C., YODER, M.C., BROXMEYER, H.E., BODINE, D.M.（１９９８）、「レトロウィルスレセプタ−をコ−ドするmRNAを高レベルで発現するヒトおよびマウス造血幹細胞群の同定」Blood ９１, ３２４７−３２５４。 ORLIC, D., GIRALD, LJ, ANDERSON, SM, PYLE, LC, YODER, MC, BROXMEYER, HE, BODINE, DM (1998), “Human expressing high level of mRNA encoding retroviral receptor And identification of mouse hematopoietic stem cell populations "Blood 91, 3247-3254.

PETERS, S., KITTLER, E., RAMSHAW, H., QUESENBERRY, P.（１９９５）、「インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、インタ−ロイキン１１、および幹細胞因子を含む培養で増殖されたマウス骨髄細胞は、正常な宿主で移植拒絶を獲得する」Exp Hematol ２３, ４６１−４６９。 PETERS, S., KITTLER, E., RAMSHAW, H., QUESENBERRY, P. (1995), “Mice grown in culture containing interleukin 3, interleukin 6, interleukin 11, and stem cell factor. Bone marrow cells acquire transplant rejection in normal hosts "Exp Hematol 23, 461-469.

PETERS, S.O., KITTLER, E.L., RAMSHAW, H.S., QUESENBERRY, P.J.（１９９６）、 「インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、インタ−ロイキン１１、および幹細胞因子とのマウス骨髄細胞の生体外増殖は、放射線照射された宿主で不十分な移植を導く」Blood ８７, ３０−３７。 PETERS, SO, KITTLER, EL, RAMSHAW, HS, QUESENBERRY, PJ (1996), “In vitro proliferation of mouse bone marrow cells with interleukin 3, interleukin 6, interleukin 11, and stem cell factor is radiation. Leading to poor transplantation with irradiated hosts "Blood 87, 30-37.

RAMSHAW, H.S., RAO, S., CRITTENDEN, R., PETERS, S., WEIER, H., QUESENBERRY, P.（１９９５）、「正常な無処理の宿主への骨髄細胞の移植：フルオロウラシル５および細胞周期段階の作用」Blood ８６, ９２４−９２９。 RAMSHAW, HS, RAO, S., CRITTENDEN, R., PETERS, S., WEIER, H., QUESENBERRY, P. (1995), “Transplantation of bone marrow cells into normal untreated hosts: fluorouracil 5 and cells Period Stage Action "Blood 86, 924-929.

REEMS, J.A., TOROK−STORB, B.（１９９５）、「インビトロでサイトカインにさらされた後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８高発現およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８低発現ヒト骨髄細胞間の細胞周期および機能的な相違」Blood ８５, １４８０−１４８７。 REEMS, JA, TOROK-STORB, B. (1995), "Cell cycle and functional differences between human bone marrow cells with high CD34 positive CD38 expression and low CD34 positive CD38 expression after exposure to cytokines in vitro" Blood 85 , 1480-1487.

ROE, T., REYNOLD, T.C., YU, G., BROUN, P.O.（１９９３）、「マウス白血球ウィルスDNAの組み込みは有糸核分裂に依存する」EMBO J １２, ２０９９−２１０８。 ROE, T., REYNOLD, T.C., YU, G., BROUN, P.O. (1993), "Mouse leukocyte virus DNA integration depends on mitotic fission" EMBO J 12, 2099-2108.

SHAH, A.J., SMOGORZEWSKA, E.M., HANNUM, C., CROOKS, G.M.（１９９６）、「Flt−３リガンドはインビトロで休止ヒト骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の増殖を誘引し、前駆細胞を維持する」Blood ８７, ３５６３−３５７０。 SHAH, AJ, SMOGORZEWSKA, EM, HANNUM, C., CROOKS, GM (1996), “Flt-3 ligand induces proliferation of dormant human bone marrow CD34 positive CD38 negative cells in vitro and maintains progenitor cells” Blood 87 , 3563-3570.

TERSTAPPEN, L.W., HUANG, S., SAFFORD, M., LANSDORP, P., LOKEN, M.（１９９１）、「一つの無系統の委任ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞から得た造血細胞コロニ−の連続継代」Blood ７７, １２１８−１２２７。 TERSTAPPEN, LW, HUANG, S., SAFFORD, M., LANSDORP, P., LOKEN, M. (1991), “Continuous passage of hematopoietic cell colonies obtained from one lineage of committed CD34-positive CD38-negative progenitor cells. Teenagers "Blood 77, 1218-1227.

THIEMANN, F.T., MOORE, SMOGORZEWSKA, E.M., LEMISHKA, I.R., CROOKS, G.M.（１９９８）、「マウスストロ−マ細胞株AFT０２４は、初期の機能および免疫表現型を維持するヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞に特異的に作用する」Exp Hematol ２６, ６１２−６１９。 THIEMANN, FT, MOORE, SMOGORZEWSKA, EM, LEMISHKA, IR, CROOKS, GM (1998), “The mouse stromal cell line AFT024 is specific for human CD34-positive CD38-negative progenitors that maintain their initial function and immunophenotype Exp Hematol 26, 612-619.

TISDALE, J.F., HANAZONO, Y., SELLERS, S., AGRICOLA, B., METZGER, M., DONAHUE, R., DUNBAR, C.E. （１９９８）、「遺伝子的に標識されたリ−サス抹消血前駆細胞の生体外増殖により、長期再構築能が減退する」Blood ９２, １１３１−１１４１。 TISDALE, JF, HANAZONO, Y., SELLERS, S., AGRICOLA, B., METZGER, M., DONAHUE, R., DUNBAR, CE (1998), “genetically labeled Lysus peripheral blood progenitor cells In vitro growth reduces long-term remodeling ability "Blood 92, 1131-1141.

TRAYCOFF, C.M., CORNETTA, K., YODER, M.C., DAVIDSON, A., SROUR, E.F.（１９９６）、「マウス造血前駆細胞の生体外増殖で、異なるレベルの骨髄再構築能を持つ増殖細胞が生じる」 Exp Hematol ２４, ２９９−３０６。 TRAYCOFF, CM, CORNETTA, K., YODER, MC, DAVIDSON, A., SROUR, EF (1996), "In vitro proliferation of mouse hematopoietic progenitor cells produces proliferating cells with different levels of bone marrow remodeling ability." Exp Hematol 24, 299-306.

VAN DER LOO, J.C., AMD PLOEMACHER, R.E. （１９９５）、「全てのマウス造血幹細胞サブセットの骨髄および脾臓の播種効率は造血成長因子との前インキュベ−ションにより低下する」 Blood ９, ２５９８−２６０６。 VAN DER LOO, J.C., AMD PLOEMACHER, R.E. (1995), “Bone marrow and spleen seeding efficiency of all mouse hematopoietic stem cell subsets is reduced by pre-incubation with hematopoietic growth factors” Blood 9, 2598-2606.

VAN HENNIK, P., VERSTEGEN, M., BIERHUIZEN, M., LIMON, A., WONGNUM, A., CANCELAS, J., BARQUINERO, R., WAGEMARKER, G. （１９９８）、「長期培養および免疫不全マウスの多系統移植において敷石形成可能なヒト臍帯血幹細胞における緑色蛍光タンパク遺伝子の高効率な形質導入」Blood ９２, ４０１３−４０２２。 VAN HENNIK, P., VERSTEGEN, M., BIERHUIZEN, M., LIMON, A., WONGNUM, A., CANCELAS, J., BARQUINERO, R., WAGEMARKER, G. (1998), “Long-term culture and immunodeficiency Highly efficient transduction of the green fluorescent protein gene in human umbilical cord blood stem cells capable of paving in mouse multilineage transplantation "Blood 92, 4013-4022.

VARAS, F., BERNALD, A., BUEREN, J.A. （１９９８）、「短期再構築前駆細胞の生体外増殖後のマウス骨髄移植の幹細胞機能における制約」Exp Hematol ２６, １００−１０９。 VARAS, F., BERNALD, A., BUEREN, J.A. (1998), “Restrictions in stem cell function of mouse bone marrow transplantation after in vitro expansion of short-term reconstructed progenitor cells”, Exp Hematol 26, 100-109.

VEIBY, O, P., MIKHAIL, A.A., SNODGRASS, H.R. （１９９７）。「成長因子および造血幹細胞」Hematol Oncol Clin North Am １１, １１７３−１１８４。 VEIBY, O, P., MIKHAIL, A.A., SNODGRASS, H.R. (1997). “Growth factors and hematopoietic stem cells” Hematol Oncol Clin North Am 11, 1173-1184.

VON KALLE, C., KIEM, H., GOEHLES, S., DAROVSKY, B., HEINFELD, S., TOROK−STORB, B., STORB, R., SCHEUMING, G. （１９９４）、「インビトロでの擬似型レトロウィルスベクタ−への広範な曝露により増加したヒト造血前駆細胞への遺伝子導入」Blood, ８４, ２８９０−２８９７。 VON KALLE, C., KIEM, H., GOEHLES, S., DAROVSKY, B., HEINFELD, S., TOROK-STORB, B., STORB, R., SCHEUMING, G. (1994), “In vitro Increased gene transfer into human hematopoietic progenitor cells by extensive exposure to pseudotyped retroviral vectors "Blood, 84, 2890-2897.

WEEKX, S.F., VON BOCKSTAELE, D., PLUM, J., MOULIJN, A., RODRIGUS, I., LAUDON, F., DE SMEDT, M., NIHS, G., LENJOU, M., LOQUET, P., BERNEMAN, Z., SNOECK, H. （１９９８）、「胎児肝臓、臍帯血、および成人骨髄からのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陰性ＣＤ３８陰性ヒト造血前駆細胞は、発生源によって造血サイトカインに異なる反応を示す」Exp Hematol ２６, １０３４−１０４２。 WEEKX, SF, VON BOCKSTAELE, D., PLUM, J., MOULIJN, A., RODRIGUS, I., LAUDON, F., DE SMEDT, M., NIHS, G., LENJOU, M., LOQUET, P. , BERNEMAN, Z., SNOECK, H. (1998), “CD34 positive CD38 negative and CD34 negative CD38 negative human hematopoietic progenitor cells from fetal liver, umbilical cord blood, and adult bone marrow respond differently to hematopoietic cytokines depending on the source. Show "Exp Hematol 26, 1034-1042.

YONEMURA, Y., KU, H., HIRAYAMA, F., SOUZA, L., OGAWA, M. （１９９６）、「インタ−ロイキン３あるいはインタ−ロイキン１は造血幹細胞の再構成能を抑制する」Proc Natl Acad Sci USA ９３, ４０４０−４０４４。 YONEMURA, Y., KU, H., HIRAYAMA, F., SOUZA, L., OGAWA, M. (1996), “Interleukin 3 or Interleukin 1 inhibits the ability to reconstitute hematopoietic stem cells” Proc Natl Acad Sci USA 93, 4040-4044.

ZANDSTRA, P.W., CONNEALLY, E., PETZER, A.L., PIRET, J.M., EAVES, C.J. （１９９７）、「始原ヒト造血細胞自己増殖のサイトカイン操作」Proc Natl Acad Sci USA ９４,４６９８−４７０３。 ZANDSTRA, P.W., CONNEALLY, E., PETZER, A.L., PIRET, J.M., EAVES, C.J. (1997), "Manipulation of cytokines in primary human hematopoietic cell self-proliferation" Proc Natl Acad Sci USA 94, 4698-4703.

ZANDSTRA, P.W., CONNEALLY, E., PIRET, J.M., EAVES, C.J.（１９９８）、「始原ヒト造血細胞のサイトカイン応答における個体発生関連の変化」Br J Haematol １０１, ７７０−７７８。 ZANDSTRA, P.W., CONNEALLY, E., PIRET, J.M., EAVES, C.J. (1998), “Ontogenesis-related changes in cytokine response of primitive human hematopoietic cells” Br J Haematol 101, 770-778.

本発明は、下記の「好ましい実施形態の説明」および異なる図中の同じ数字が同じ構造あるいは要素を表している、以下のような添付図面を参照することで、容易により完全に理解できる。
図１は、０日目、顆粒球顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子+インタ−ロイキン３+インタ−ロイキン６+幹細胞因子+Flt−３リガンドを補ったブタ脳微小管内皮細胞共培養で５日後、そして同一のサイトカインを補った液体培養で５日後のヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の細胞周期の状態を示している。各棒グラフは３つの異なる実験でのG０、G１、G２/S/M期における細胞の平均の百分率を表している。 図２は、０日目（a）、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目（b）、そして液体培養で５日目（c）のヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞とＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のサブセットの細胞周期状態を表した典型的な蛍光細胞選別装置（FACS）ヒストグラムを示している。数字は、各四分領域で細胞の割合を表している。左下の領域は、G０期、左上領域はG１期、右上はG２/S/M期にある細胞を表している。 図３は、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目および液体懸濁液培養の５日目に存在するＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合を表した棒グラフである(n=３)。 The present invention can be more readily understood with reference to the following "Description of Preferred Embodiments" and the accompanying drawings, in which like numerals represent like structures or elements in the different figures.
FIG. 1 shows, on day 0, 5 days after co-culture of porcine brain microtubule endothelial cells supplemented with granulocyte granulocyte macrophage colony-stimulating factor + interleukin 3 + interleukin 6 + stem cell factor + Flt-3 ligand And shows the state of the cell cycle of human CD34-positive CD38-negative cells after 5 days in liquid culture supplemented with the same cytokine. Each bar represents the average percentage of cells in G0, G1, G2 / S / M phases in three different experiments. FIG. 2 shows human CD34 positive CD38 negative cells and CD34 positive CD38 negative cells on day 0 (a), day 5 (b) of pig brain microtubule endothelial cell co-culture, and day 5 (c) in liquid culture. 2 shows a typical fluorescent cell sorter (FACS) histogram representing a subset of cell cycle states. Numbers represent the percentage of cells in each quadrant. The lower left region represents cells in the G0 phase, the upper left region represents the G1 phase, and the upper right region represents cells in the G2 / S / M phase. FIG. 3 is a bar graph showing the proportion of CD34 positive cells and CD34 positive CD38 negative cells present on day 5 of pig brain microtubule endothelial cell co-culture and day 5 of liquid suspension culture (n = 3). ).

ブタ脳微小管内皮細胞培養および液体培養間の差に対する*p値は０.０３である。 The * p value for the difference between porcine brain microtubule endothelial cell culture and liquid culture is 0.03.

ブタ脳微小管内皮細胞培養および液体培養間の差に対する**p値は０.０１である。
図４は、０日目（a）、ブタ脳微小管内皮細胞培養５日目（b）、および液体培養５日目（c）の骨髄ＣＤ３４陽性細胞の表現型を示したものである。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、イソタイプであるコントロ−ルと比較するとＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８の発現がみられない細胞と定義された。 図５は０日目、ブタ脳微小管内皮細胞培養５日目、および液体培養５日目での異なるヒトＣＤ３４陽性サブセットからのRT−PCR産物の半定量比較を提供している。一番上はGaLVRmRNA、２列目はamphoRｍRNA、そして一番下の列はGAPDHｍRNAの、各サンプルにおける発現のレベルを表している。右側はHeLa細胞におけるそれぞれの転写発現である。 図６（a）から図６（c）は、それぞれ以下のようである。a） ブタ脳微小管内皮細胞培養５日間およびＰＧ１３の形質導入３日後の二つの実験からのヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のライト・ギムサ（Wrights Geimsa）染色、b） ブタ脳微小管内皮細胞共培養での増殖およびＰＧ１３の形質導入に続く二つの実験からのHPAP陽性ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の高倍率顕微鏡像（４００倍）、およびc）ＰＧ１３形質導入に続くHPAP活性を示すブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生じた単能性骨髄幹細胞（CFU−GM）。 The ** p value for the difference between porcine brain microtubule endothelial cell culture and liquid culture is 0.01.
FIG. 4 shows the phenotypes of bone marrow CD34 positive cells on day 0 (a), day 5 (b) of porcine brain microtubule endothelial cell culture, and day 5 (c) of liquid culture. CD34 positive CD38 negative cells were defined as cells that expressed CD34 and no CD38 expression compared to the isotype control. FIG. 5 provides a semi-quantitative comparison of RT-PCR products from different human CD34 positive subsets on day 0, porcine brain microtubule endothelial cell culture day 5 and liquid culture day 5. The top row shows the level of expression in each sample of GaLVR mRNA, the second row is amphoR mRNA, and the bottom row is GAPDH mRNA. On the right is the respective transcriptional expression in HeLa cells. FIG. 6A to FIG. 6C are as follows. a) Wrights Geimsa staining of human CD34 positive CD38 negative cells from two experiments 5 days after porcine brain microtubule endothelial cell culture and 3 days after PG13 transduction, b) Porcine brain microtubule endothelial cell co-culture High magnification micrograph (400X) of HPAP positive CD34 positive CD38 negative cells from two experiments following growth on PG13 and transduction of PG13, and c) porcine brain microtubule endothelial cells showing HPAP activity following PG13 transduction Pluripotent bone marrow stem cells (CFU-GM) generated from CD34 positive CD38 negative cells grown in

【配列表】

Figure 2005514071
[Sequence Listing]
Figure 2005514071

Claims (15)

以下、
ａ． ドナ−の骨髄からの上記造血および前駆幹細胞を単離するステップと、
ｂ． 上記幹細胞および前駆幹細胞と接触する内皮細胞を含んだ培地における上記単離幹細胞および前駆細胞を増殖するステップと、
ｃ． 上記増殖された幹細胞を形質導入するステップと、
からなる造血および前駆幹細胞への遺伝子導入のインビトロの方法。 Less than,
a. Isolating said hematopoietic and progenitor stem cells from donor bone marrow;
b. Expanding the isolated stem and progenitor cells in a medium containing endothelial cells in contact with the stem and progenitor stem cells;
c. Transducing the expanded stem cells;
An in vitro method of gene transfer into hematopoietic and progenitor stem cells comprising. 上記培地が少なくとも一種類のサイトカインを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the culture medium contains at least one kind of cytokine. 上記少なくとも一種類のサイトカインは、顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、幹細胞因子およびインタ−ロイキン６、flt−３リガンド（flt−3 ligand）、およびそれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。   The at least one cytokine is selected from the group consisting of granulocyte macrophage colony-stimulating factor, interleukin 3, stem cell factor and interleukin 6, flt-3 ligand, and mixtures thereof. 3. The method of claim 2, wherein: 上記培地が内皮細胞の単層を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the medium comprises a monolayer of endothelial cells. 上記培地がブタ脳の微小血管内皮細胞を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the culture medium contains microvascular endothelial cells of porcine brain. 上記培地がヒト脳の血管内皮細胞を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。   2. The method according to claim 1, wherein the culture medium contains human brain vascular endothelial cells. 上記幹細胞がＣＤ３４陽性であることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the stem cells are CD34 positive. 上記幹細胞がＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性であることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the stem cells are CD34 positive and CD38 negative. 上記段階（c）の形質導入がベクタ−を用いて達成されることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the transduction of step (c) is accomplished using a vector. 上記ベクタ−がマロニ−白血病ウィルス（Maloney Leukemia Virus）ベクタ−であることを特徴とする請求項９記載の方法。   10. The method of claim 9, wherein the vector is a Maloney Leukemia Virus vector. 上記ベクタ−がＰＡ３１７およびＰＧ１３細胞株にパッケ−ジされることを特徴とする請求項１０記載の方法。   11. The method of claim 10, wherein the vector is packaged into PA317 and PG13 cell lines. 上記ステップ（b）の増殖が５日間実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the growth in step (b) is carried out for 5 days. 上記ステップ（a）における単離段階の後に、幹細胞の精製が実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the purification of the stem cells is performed after the isolation step in the step (a). 上記ステップ（c）の形質導入が３日間実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the transduction in step (c) is carried out for 3 days. 上記方法で、５日後にレトロウィルス形質導入を示す全てのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性幹細胞群が、３５.１％±１５.５〜６２.５％±４.７増加する結果となることを特徴とする請求項１記載の方法。   According to the above method, the total number of CD34 positive CD38 negative stem cells showing retroviral transduction after 5 days is increased by 35.1% ± 15.5-62.5% ± 4.7. The method of claim 1.
JP2003560222A 2001-12-21 2002-12-20 Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells Pending JP2005514071A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34186801P 2001-12-21 2001-12-21
PCT/US2002/040719 WO2003060138A1 (en) 2001-12-21 2002-12-20 In increasing gene transfer efficiency by pre-incubation with endothelial cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005514071A true JP2005514071A (en) 2005-05-19
JP2005514071A5 JP2005514071A5 (en) 2006-04-13

Family

ID=23339354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003560222A Pending JP2005514071A (en) 2001-12-21 2002-12-20 Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1463821A4 (en)
JP (1) JP2005514071A (en)
AU (1) AU2002360674A1 (en)
WO (1) WO2003060138A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016539659A (en) * 2013-10-24 2016-12-22 オスペダーレ サン ラファエレ エス．アール．エル Method

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5174656B2 (en) * 2005-04-21 2013-04-03 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Materials and methods for modifying an immune response against exogenous and endogenous immunogens, including syngeneic or non-syngeneic cells, tissues or organs
CN101735979B (en) * 2009-12-31 2014-04-30 浙江中赢控股集团有限公司 Method for in vitro amplification of hemopoietic stem cells and precursor cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811297A (en) * 1996-03-07 1998-09-22 Amba Biosciences, Llc Immortalized hematopoietic cell lines, cell system thereof with stromal cells, in vitro, ex vivo and in vivo uses, & in vitro generation of dendritic cells and macrophages
CA2381459A1 (en) * 2000-06-09 2001-12-13 Universitatsklinikum Charite Medizinische Fakultat Der Humboldt-Universitat Zu Berlin Akademische Verwaltung-Forschung Genetically modified t-cells, method for producing them and use thereof
WO2002078449A2 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Advanced Cell Technology, Inc. Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016539659A (en) * 2013-10-24 2016-12-22 オスペダーレ サン ラファエレ エス．アール．エル Method
JP2020124200A (en) * 2013-10-24 2020-08-20 オスペダーレ サン ラファエレ エス．アール．エル Method

Also Published As

Publication number Publication date
EP1463821A1 (en) 2004-10-06
AU2002360674A1 (en) 2003-07-30
EP1463821A4 (en) 2006-05-31
WO2003060138A1 (en) 2003-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6645489B2 (en) Methods and devices for the long-term culture of hematopoietic progenitor cells
US6225119B1 (en) Production of megakaryocytes by the use of human mesenchymal stem cells
AU717783B2 (en) Methods for use of Mpl ligands with primitive human stem cells
CN106062201B (en) Method of producing a composite material
JPWO2003038076A1 (en) Immortalized mesenchymal cells and their use
JP2002527101A (en) Improved transduction of hematopoietic stem cells and promotion of self-renewal by histone deacetylase inhibitors
US5837507A (en) Hox-induced enhancement of in vivo and in vitro proliferative capacity and gene therapeutic methods
Hennemann et al. High-efficiency retroviral transduction of mammalian cells on positively charged surfaces
Suzuki et al. Homeostasis of hematopoietic stem cells regulated by the myeloproliferative disease associated-gene product Lnk/Sh2b3 via Bcl-xL
Ng et al. Selective in vitro expansion and efficient retroviral transduction of human CD34+ CD38–haematopoietic stem cells
JP2005514071A (en) Increase in gene transfer efficiency by preculture with endothelial cells
Ali et al. Ex vivo expansion of functional human UCB-HSCs/HPCs by coculture with AFT024-hkirre cells
US20020086383A1 (en) Hematopoietic stem cell expansion enhancing factor and method of use
Sellers et al. The presence of the carboxy-terminal fragment of fibronectin allows maintenance of non-human primate long-term hematopoietic repopulating cells during extended ex vivo culture and transduction
Kyba et al. Development of hematopoietic repopulating cells from embryonic stem cells
Cohen-Haguenauer et al. Efficient transduction of hemopoietic CD34+ progenitors of human origin using an original retroviral vector derived from Fr-MuLV-FB29: in vitro assessment
Chute et al. Preincubation with endothelial cell monolayers increases gene transfer efficiency into human bone marrow CD34+ CD38-progenitor cells
WO2004033672A2 (en) Stem cell expansion factor blocking a gene limiting hox-induced expansion and method using such factor
Berger et al. Efficient retrovirus-mediated transduction of primitive human peripheral blood progenitor cells in stroma-free suspension culture
US20100209396A1 (en) Method of Enhancing Proliferation and/or Hematopoietic Differentiation of Stem Cells
Zhang et al. Mesenchymal stem cells
Bertolini et al. Gene transfer-mediated generation of drug-resistant hemopoiesis
Chen Selective expansion of GP 91phox gene-modified murine haematopoeitic stem cells
Sharma The role of the hiwi gene in human hematopoiesis
Antonchuk Functional analysis of the homeobox gene HOXB4 in primitive hematopoietic cells

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051219

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060203

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080805

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090106