JP2005512501A - Kinases and phosphatases - Google Patents

Abstract

The present invention provides polynucleotides that identify and encode human kinases and phosphatases (KAP) and KAP. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with abnormal expression of KAP.

Description

【００９１】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【００９２】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００９３】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００９４】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【００９５】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００９６】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンがコードされたタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９７】
用語「断片」は、KAP またはKAP をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００９８】
SEQ ID NO:21-40 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:21-40 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:21-40のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:21-40を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO：21-40の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO：21-40の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９９】
SEQ ID NO:1-20 の断片は、SEQ ID NO:21-40の断片によってコードされる。 SEQ ID NO:1-20 の断片には、SEQ ID NO:1-20を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ ID NO:1-20 の断片は、SEQ ID NO:1-20を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 SEQ ID NO:1-20 の断片及び断片に対応するSEQ ID NO:1-20 の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１００】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１０１】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【０１０２】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１０３】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１０４】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０５】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０６】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１０７】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１０８】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０９】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１１０】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１１１】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１１２】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１１３】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１１４】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C₀tまたはR₀t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１５】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１１６】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１１７】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすKAP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なKAP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１１８】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１９】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１２０】
用語「調節」は、KAPの活性の変化を指す。調節することによって例えば、KAPのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【０１２１】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１２２】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１２３】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１２４】
KAP の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾が含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、KAPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１２５】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、KAPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１２６】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１２７】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１２８】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２９】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１３０】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１３１】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１３２】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１３３】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１３４】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。KAP、KAPをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１３５】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１３６】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合する他の構成要素の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が無いものを指す。
【０１３７】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３８】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３９】
「転写イメージ」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１４０】
「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１４１】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989) 等の参考文献に与えられている。
【０１４２】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１４３】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１４４】
（発明）
本発明は、新規のヒトキナーゼおよびホスファターゼ（KAP）、並びにKAPをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した心血管系疾患、免疫系疾患、神経系疾患、発生または発達障害、脂質障害、細胞増殖異常および癌の診断、治療、及び予防に関する。
【０１４５】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１４６】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号（GenBank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１４７】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４８】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドがキナーゼおよびホスファターゼであることを確立している。例えば、SEQ ID NO:1はラットタンパク質チロシンホスファターゼTD14 (GenBank ID g3598974) と７9％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。（表2参照）BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:1はまた、タンパク質チロシンホスファターゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。(表3参照)BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:1 がタンパク質チロシンホスファターゼである、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１４９】
更に別の例では、SEQ ID NO:3はFagus sylvatica のプロテインホスファターゼ２C(PP2C, GenBank ID g7768151)と３４％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。（表2参照）BLAST確率スコアは6.4e-17であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3 もまた、BLAST 分析によると推定線虫PP2C (GenBank ID g2804429)と45%の同一性を有し、その確率スコアは2.4e-71である。SEQ ID NO:3はまた、タンパク質ホスファターゼ２Cドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）BLIMPS解析よりのデータは、SEQ ID NO:3 がタンパク質ホスファターゼ２Cである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５０】
別の例において、SEQ ID NO:5 はBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって同定されるように、ヒトタンパク質キナーゼPAK5(GenBank ID g7649810) に25%の同一性がある。（表2参照）BLAST確率スコアは7.2e-14であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:5はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）TMAP 解析のデータと、PRODOM およびDOMO データベースのBLIMPS および BLAST 解析によると、SEQ ID NO:5 が膜結合キナーゼである実証的証拠が更に得られる。
【０１５１】
更に別の例では、SEQ ID NO:6 は1511の長さのアミノ酸残基をもち、ヒトMEK キナーゼ I (GenBank ID g2815888) と1494残基にわたって97%の同一性を有しており、これはBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって決定された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:6はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:6 がプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
別の例において、SEQ ID NO:9 はマウスプロテインキナーゼ (GenBank ID g406058) )に87%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された。（表2参照）BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:9はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインとPDZドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:9 がプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５２】
別の例において、SEQ ID NO:16 はBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって同定されるように、ヒト分裂促進因子活性化キナーゼキナーゼキナーゼ５(GenBank ID g1679668) に61%の同一性がある。（表2参照）BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:16はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:16 が分裂促進因子活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５３】
別の例において、SEQ ID NO:18 はマウスプロテインキナーゼ (GenBank ID g406058)に残基4から３７２までの83%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された。（表2参照）BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:18はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインとPDZドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表3参照）BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:18 がセリン/トレオニンプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５４】
例えば、SEQ ID NO:19は、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で決定されるようにラットの筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連Cdc42結合キナーゼ(GenBank ID g2736151)に残基M1から残基V988までの95％同一である（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:19はまた、プロテインキナーゼC末端ドメインと真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。(表3参照)BLIMPS、MOTIFS、及び追加のBLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:19 がプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５５】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 、SEQ ID NO:10−15 、SEQ ID NO:17およびSEQ ID:20は同様にして解析し、注釈付けをした。SEQ ID NO:1-20の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７に記述されている。
【０１５６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列、またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列の構築、並びに、例えば、SEQ ID NO:21-40 を同定するか、あるいはSEQ ID NO:21-40 と関連するポリヌクレオチド配列をSEQ ID NO:21-40 と区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片のcDNA配列および/またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１５７】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に、例えば組織特異的ｃDNAライブラリから由来する、あるいはプールされたｃDNAライブラリから由来するIncyte cDNAを指す。或いは列2のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベース(即ち「ENST」命名を含む配列)から由来した配列を同定し得る。或いは、列2のポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり(即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列)、またNCBI RefSeq Protein Sequence Records(即ち「NP」の命名を含む配列)から由来する場合もある。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合を指す場合もある。例えば、FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄ として同定されるポリヌクレオチド配列は「スティッチされた」配列であり、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが生成する予測の数であり、N_1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンである（実施例５を参照）。RefSeq 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、RefSeq 識別子(「NM 」、「NP」または「 NT」と表示された)はGenBank 識別子(すなわち、gBBBBB)の代わりに使われる場合もある。
【０１５８】
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。

【０１５９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１６０】
表５はIncyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１６１】
本発明はまた、KAP の変異体も含む。好適なKAP の変異体は、KAP の機能的或いは構造的特徴の少なくとも一つを有し、かつKAP アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１６２】
本発明はまた、KAPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、KAPをコードするSEQ ID NO:21−40からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。SEQ NO ID:21-40のポリヌクレオチド配列は、配列表に示すように等価RNA配列を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１６３】
本発明はまた、KAPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、KAPをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:21−40からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:21−40からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、KAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１６４】
さらに、あるいは別方法において、本発明のポリヌクレオチド変異体はKAPをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体はKAPをコードするポリヌクレオチド配列に配列相同性の高い部分を有し得るが、mRNA プロセッシング時にエキソンの選択的スプライシングから生じた配列ブロックの付加または欠失により、ヌクレオチドの数はより多くなるか、またはより少なくなる。スプライス変異体はその全長についてKAP をコードするポリヌクレオチド配列とのポリヌクレオチド配列相同性が約７０％以下、あるいは約６０％、あるいは約５０％以下でありえるが、そのスプライス変異体のある部分はKAP をコードするポリヌクレオチド配列のある部分とのポリヌクレオチド配列相同性が少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも９５％、あるいは１００％になっている。上記したスプライス変異配列は何れも、KAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１６５】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るKAPをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明は、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のKAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されているとみなす。
【０１６６】
KAP をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、適切に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のKAP のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するKAP 或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、KAP 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１６７】
本発明はまた、KAP 及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。 更に、合成化学を用いてKAP またはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１６８】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:21-40 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１６９】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページを参照）。
【０１７０】
KAP をコードする核酸配列は、当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で部分的なヌクレオチド配列を利用して伸長し、プロモーターや調節因子などの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(例えば、 Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318322を参照。)別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186。)第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１７１】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１７２】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１７３】
本発明の別の実施例では、KAPをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にKAP、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ、これらの配列をKAPの発現に利用可能である。
【０１７４】
種々の目的でKAPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１７５】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797、Christians, F.C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術の対象となり、KAPの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指示された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１７６】
別の実施例によれば、KAP をコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Symp. Ser. 7:225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてKAP 自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60頁、Roberge, J.Y.他 (1995) Science 269:202204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にKAPのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを、または、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０１７７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421などを参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページなどを参照）。
【０１７８】
生物学的に活性なKAPを発現させるために、KAPをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコード配列の転写および翻訳の制御に必要な因子を含む。これらの因子には、ベクター及びKAPをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、KAPをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。KAP をコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要とされなくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサー類を含めることにより、発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【０１７９】
当業者に周知の方法を用いて、KAP をコードする配列、好適な転写及び翻訳調節因子を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, および１6-17章; およびAusubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章および16章を参照)。
【０１８０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、KAPをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１８１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、KAPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、KAP をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Life Technologies）などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成できる。ベクターの多数のクローニング部位にKAP をコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のKAP が必要な場合は、KAP の発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１８２】
酵母の発現系を使用してKAPを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、発芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. ら (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 121−181-184.を参照)。
【０１８３】
植物系を使用してKAPを発現することも可能である。KAP をコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, R. 他 (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページなどを参照）。
【０１８４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にKAP をコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、宿主細胞にKAP を発現する感染性ウイルスを得ることが可能である（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１８５】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために、約６kb〜１０MbのHACが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:345-355.を参照)。
【０１８６】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のKAP の安定発現が望ましい。例えば、発現ベクター群を用いて、KAP をコードする配列群を株化細胞群に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、複製因子および／または内因性の発現因子のウイルス性の起源や、或る選択可能マーカー遺伝子を、同じベクター上あるいは別のベクター上に有し得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１８７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; ColbereGarapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(例えば、 Hartman, S.C. 及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:80478051参照。)可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121131等を参照)。
【０１８８】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、KAP をコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、KAP をコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子をKAP をコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１８９】
一般に、KAP をコードする核酸配列を含み、KAP を発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。 これらの方法には、DNA−DNAあるいはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸あるいはタンパク質の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてKAP の発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。KAP 上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０１９１】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。PCR をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、KAPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１９２】
KAP をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。KAP をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するKAP の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１９３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１９４】
本発明の別の実施例では、KAP をコードする天然核酸配列、変更された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳を生じるような異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識される異種部分を含むキメラKAP タンパク質が、KAP 活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを容易にする。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、KAP をコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、KAP が精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１９５】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したKAP の合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば³⁵Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１９６】
本発明のKAP またはその断片を用いて、KAP に特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、KAPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１９７】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのKAPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、KAP が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてKAPを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。KAP を発現する細胞またはKAP を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、KAP または化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１９８】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたKAP と混合するステップと、KAP とこの化合物との結合を検出するステップを含む場合がある。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１９９】
本発明のKAPまたはその断片を用いて、KAPの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。ある実施態様では、KAP の活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をKAP と混合し、試験化合物の存在下でKAP の活性を試験化合物不在下でのKAP の活性と比較する。試験化合物の存在下でのKAP の活性の変化は、KAP の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をKAP 活性に適した条件下でKAP を含むin vitroまたは無細胞再構成系と混合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、KAP の活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要はない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングできる。
【０２００】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、KAP またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊された目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性物質で検査することができる。
【０２０１】
KAP をコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０２０２】
KAP をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、KAP をコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばKAPを乳汁内に分泌するなどKAPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源ともなり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２０３】
（治療）
KAP のある領域と、キナーゼおよびホスファターゼの領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。さらに、KAPを発現する組織の例として表６に示す。したがって、KAPは心臓血管系疾患、免疫系疾患、神経疾患、発生および発達に影響する疾患、脂質障害、細胞の異常増殖および癌に関与すると考えられる。KAP の発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、KAP の発現または活性を低下させることが望ましい。また、KAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、KAP の発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２０４】
従って、或る実施例において、KAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にKAP またはその断片や誘導体を投与することが可能である。そのような疾患の例としては、限定するものではないが、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、バイパス手術、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれ、免疫疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症が含まれ、また発生および発達障害の中には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、G_{M ２}にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症が含まれ、また、細胞増殖異常では日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発性骨髄腫のような白血病およびホジキンス病のようなリンパ腫が含まれる。
【０２０５】
別の実施例では、KAP またはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むKAP の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２０６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、KAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたKAP を含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２０７】
更に別の実施例では、KAP の活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むKAP の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２０８】
更なる実施例では、KAP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にKAP のアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した心血管系疾患、免疫系疾患、神経疾患、発生または発達障害、脂質障害、細胞増殖異常および癌が含まれる。一実施態様では、KAP と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはKAP を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２０９】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むKAP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、KAP をコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２１０】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２１１】
KAP のアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたKAP を用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、KAP と特異結合するものを同定することが可能である。KAPの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２１２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、KAP または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２１３】
KAP に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。KAPのアミノ酸群の短い区間を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２１４】
KAP に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他. (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２１５】
更に、、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発された技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いることができる。（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:68516855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、KAP特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２１６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２１７】
KAP のための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')₂ 断片と、F(ab')₂ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２１８】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、KAP とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性KAP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２１９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、KAPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でKAP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のKAP エピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、KAP に対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のKAP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０^９〜１０^１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、KAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０^６〜１０^７liter／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、KAPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２２０】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、KAP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２２１】
本発明の別の実施例では、KAPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、KAPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA及びRNA、PNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはより大きな断片が、KAPをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。(Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照。)
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296.等を参照）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０２２２】
本発明の別の実施例では、KAP をコードするポリヌクレオチドを体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. ら (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. ら (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. ら (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosomacruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。KAP の発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からKAP を発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２２３】
本発明の更なる実施例では、KAPの欠損による疾患や異常症を、KAPをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってKAP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用がある（Morgan, R.A. 及び W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. 及びH. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２２４】
KAP の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。KAP を発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するKAP をコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２２５】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２２６】
本発明の別の実施例では、KAP の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でATRS をコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4⁺ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２２７】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、KAPの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にKAPをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（"Adenovirus vectors for gene therapy"）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２８】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、KAP の発現に関連する１つあるいは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にKAP をコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細胞にKAP を導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（"Herpes simplex virus swains for gene transfer"）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２９】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてKAP をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、KAP をコードする配列をキャプシッドをコードする領域の代わりにαウイルスゲノムに導入することによって、ベクター導入細胞において多数のKAP をコードするRNAが産生され、高いレベルでKAP が合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にKAP を導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２３０】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177頁等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２３１】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、KAPをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２３２】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２３３】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、KAPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２３４】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を加えることでできる。
【０２３５】
本発明の更なる実施例は、KAPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、KAP の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、KAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、KAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、KAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２３６】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。KAP をコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。KAP をコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、KAP をコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性についてオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２３７】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466.等を参照）。
【０２３８】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３９】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、KAP、KAPの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはKAPのインヒビターなどからなる。
【０２４０】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２４１】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２４２】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２４３】
KAP またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。或いは、KAP またはその断片をHIV Tat-1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２４４】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２４５】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（たとえばKAP またはその断片、KAP の抗体、KAP のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）の量を意味する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED₅₀（集団の５０％の治療有効量）またはLD₅₀（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD₅₀/ED₅₀比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED₅₀を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２４６】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２４７】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２４８】
（診断）
別の実施例では、KAPに特異的に結合する抗体が、KAPの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはKAPやKAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。KAP の診断アッセイには、抗体および標識を用いてヒトの体液あるいは細胞や組織から採取されたものからKAP を検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４９】
KAPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのKAPの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なKAP の発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とKAP に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのKAP の発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２５０】
本発明の別の実施例によれば、KAP をコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るKAP を発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、KAP の存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のKAP 値の調節を監視する。
【０２５１】
一実施形態では、KAP または近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、KAP をコードする核酸配列を同定することが可能である。
【０２５２】
プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、そのプローブがKAPをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列をコードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２５３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、KAP をコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:21−40の配列、或いはＨＰＤＥ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２５４】
KAP をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、KAP 及びKAP 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、³²Pまたは³⁵S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２５５】
KAP をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、KAP の発現に関連する疾患を診断することが可能である。そのような疾患の例としては、限定するものではないが、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、バイパス手術、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれ、免疫疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症が含まれ、また発生および発達障害の中には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、G_{M ２}にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症が含まれ、また、細胞増殖異常では日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発性骨髄腫のような白血病およびホジキンス病のようなリンパ腫が含まれる。KAP をコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異ATRS の発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２５６】
ある実施態様では、KAP をコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。KAP をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のKAP をコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２５７】
KAPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、KAPをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２５８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２５９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２６０】
KAP をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはKAPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはKAPをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２６１】
或る実施態様において、KAP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。SSCPでは、KAP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２６２】
KAP の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229236を参照。)目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２６３】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２６４】
別の実施例では、KAP、KAPの断片、KAPに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２６５】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Seilhamer 他、米国特許第5,840,484号の「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。これらを引用することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２６６】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２６７】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２６８】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６９】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２７０】
プロテオームのプロファイルは、KAP に特異的な抗体を用いてKAP 発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２７１】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２７２】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２７３】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２７４】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２７５】
本発明の別の実施例ではまた、KAP をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(例えば、 Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149154を参照。)一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を作製できる。(例えば、 Lander, E.S. および D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照。)
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, 他 (1995) in Meyers, 965-968頁等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のKAPをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２７６】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２７７】
本発明の別の実施例では、KAP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。KAP と検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７８】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照。)この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、KAP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したKAP を検出する。 精製したKAP はまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７９】
別の実施例では、KAP と特異結合可能な中和抗体がKAP との結合について試験用化合物競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、KAPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０２８０】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、KAPをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０２８１】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２８２】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/254.034号、第60/255.756号、第60/251.814号、第60/256.172号、第60/257.416号、第60/260.912、第60/264.344および第60/266.017は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２８３】
(実施例)
１ cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）に記載されたcDNAライブラリに由来するものである。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２８４】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２８５】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズの選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に結合させた。 好適なプラスミドは例えば、PBLUESCRIPT プラスミド (Stratagene)、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド(Stratagene)、 PCR2-TOPOTA (Invitrogen)、 PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)または pINCY (Incyte Genomics)、あるいはその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２８６】
２ cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２８７】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８８】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２８９】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群より選択した１つに対して行った。すなわち、公共のデータベース群、例えばGenBankの霊長類およびげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM、PROTEOMEの、ヒト、ラット、マウス、線虫（Caenorhabditis elegans）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびCandida albicans（Incyte Genomics, Palo Alto CA）からの配列群を持つデータベース群、および、PFAM等の、隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群である（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照のこと）。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）の選択に対するIncyte cDNA配列またはその翻訳を問い合わせた。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２９０】
Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０２９１】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:21-40のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表2の列４に示した。
【０２９２】
４ ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
推定上のキナーゼおよびホスファターゼは、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94 及びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列がキナーゼおよびホスファターゼをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいてキナーゼおよびホスファターゼについて問合せて分析した。潜在的なキナーゼおよびホスファターゼは、またキナーゼおよびホスファターゼとして注釈が付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０２９３】
5 cDNA 配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（ Stiched Sequence ）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０２９４】
ストレッチ配列（ Stretched Sequence ）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２９５】
６ KAP をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:21-40を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:21-40と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrap（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前にマッピングされていたかを確認した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２９６】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する。）cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２９７】
この方法で、SEQ ID NO:33は、97,10〜113,30センチモルガンの間隔内で染色体12にマッピングされた。SEQ ID NO:35 は、16,50〜30,40センチモルガン以内の間隔で染色体3にマッピングする。SEQ ID NO:29 は11.60 から 22.80センチモルガン以内の間隔で染色体13に、また72,30 から 77,30センチモルガン以内の間隔で染色体15にマップし、さらに、 57.70 から 64.10センチモルガン以内の間隔で 染色体20にマップした。SEQ ID NO:29については一つ以上のマップ位置が報告され、異なったマップ位置を持つ配列が、一つのクラスターに構築されたことを示す。この状態は、例えば、極めて類似しているが、完全に同一でない配列が一つのクラスターに構築される場合に発生する。
【０２９８】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. 他, 4章及び16章等を参照）。
【０２９９】
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３００】
【数１】

【０３０１】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３０２】
或いは、KAP をコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、KAPをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３０３】
８ KAP をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３０４】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３０５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg^{２ +}と(NH₄)₂SO₄と2−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。_} ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃、5 分、ステップ7: 4℃で保存する。
【０３０６】
1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するためにプレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３０７】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。T4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いて伸長させたクローンをpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３０８】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステップ6: 72℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３０９】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５'調節配列を得る。
【０３１０】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ ID NO:21−40由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-³²P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３１１】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３１２】
１０ マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に周知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. 他 (1995) Science 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。
【０３１３】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３１４】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)⁺RNAを精製する。各ポリ(A)⁺RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1X 第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害剤、５００μMのdATP、５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)⁺RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)⁺RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３１５】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。
【０３１６】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３１７】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３１８】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３１９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１.８cm² のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC、０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３２０】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８８nm、Cy５の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ（Coherent, Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。
【０３２１】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３２２】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３２３】
光電子増倍管の出力は、IBM互換性PCコンピュータにインストールされた１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲への直線的２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３２４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３２５】
１１ 相補的ポリヌクレオチド
KAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のKAPの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びKAPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがKAPをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３２６】
１２ KAP の発現
KAP の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でKAP が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節因子に関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとKAP を発現する。真核細胞でのKAP の発現は、一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、KAP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３２７】
殆どの発現系では、KAP が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でKAP からタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したKAP を直接用いて以下の実施例１６、１７、１８、および１９のアッセイを行うことができる。
【０３２８】
１３ 機能的アッセイ
KAP 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのKAP をコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択ベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０３２９】
遺伝子発現におけるKAP の影響は、KAP をコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。KAP および目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３３０】
１４ KAP に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたKAP を用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３３１】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてKAP アミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３３２】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。例えば、ペプチドまたはKAP を基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させて、得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗KAP 活性を検査する。
【０３３３】
１５ 特異的抗体を用いる天然 KAP の精製
天然KAP 或いは組換えKAP を、KAP に特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗KAP 抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３３４】
KAP を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、KAP を優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とKAP との結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、KAP を回収する。
【０３３５】
１６ KAP と相互作用する分子の同定
KAPまたは生物学的に活性であるKAP断片を、¹²⁵Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えば Bolton A.E. および W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照。)マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したKAPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したKAP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なKAP 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したKAP の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３３６】
別法では、KAP と相互作用する分子を、Fields, S.およびO. Song（1989, Nature 340:245-246）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）やMATCHMAKERシステム（Clontech）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３３７】
KAP はまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号）。(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３３８】
１７ KAP 活性の実証
通常、プロテインキナーゼ活性は、[γ-³²P]ATPの存在で、KAP によりタンパク質基質のリン酸化を定量化することで測定される。KAP はタンパク質基質、³²P-ATP、及び適切なキナーゼバッファと共にインキュベートされる。基質に組み込まれた³²Pは、電気泳動法で遊離³²P-ATPより分離され、組み込まれた³²Pはラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた³²Pの量は、KAPの活性に比例する。リン酸化された特異的アミノ酸残基の定量は、加水分解タンパク質のホスホアミド酸解析によってなされる。
【０３３９】
或る実施態様では、プロテインキナーゼ活性はガンマリン酸塩がアデノシン三リン酸（ATP）からタンパク質基質中のセリン、トレオニン、またはチロシン残基に転移する量を定量化することによって測定される。反応はビオチン標識されたペプチド基質を有するプロテインキナーゼサンプルとガンマ³²P-ATPとの間で起こる。反応に続き、溶液中のアビジンがビオチン標識された³²Pペプチド生成物に結合させる目的で添加される。結合試料は、次に生成物アビジン複合体を保持し、遊離のガンマ³²P-ATPの透過させる膜を用いて、遠心限外濾過プロセスを行う。残余として³²Pペプチド生成物を含む遠心分離ユニットのリザーバーは、次にシンチレーションカウンタでカウントされる。この方法は、選択されたペプチド基質及びキナーゼ反応バッファによってあらゆるタイプのプロテインキナーゼのアッセイを可能とする。このアッセイは、キット形態(ASUA, Affinity Ultrafiltration Separation Assay, Transbio Corporation, Baltimore MD,米国特許番号 5, 869, 275)で提供される。示唆される基質及びその各々の酵素は、限定するものではないが、ヒストンH1(シグマ)及びp34^cdc2キナーゼ、アネキシンI、アンギオテンシン(シグマ)及びEGF受容体キナーゼ、アネキシンII 及びsrcキナーゼ、ERK1及びERK2基質及びMEK、ミエリン塩基性蛋白質及びERKが含まれる(Pearson, J. D. 他、(1991) Methods Enzymol. 200 : 62-81)。
【０３４０】
別の実施態様では、KAPのタンパク質活性は、KAP、50μlのキナーゼバッファー、1μgの基質（例えば、ミエリン塩基性蛋白質（MBP）若しくは合成ペプチド基質）、1mMのDTT、10μgのATP、及び0.5μCiの[γ-³²P]ATPを含むアッセイに於いてin vitroで示される。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、ピペットでP81ペーパーに移して反応を停止させる。組み込まれていない[γ-³²P]ATP は、洗浄によって取り除かれ、組み込まれた放射活性はシンチレーションカウンタを用いて測定される。別法では、SDSローディングバッファーの存在下で１００℃に加熱して反応を停止し、オートラジオグラフにより12％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離させる。組み込まれた³²Pの量は、KAPの活性に比例する。
【０３４１】
さらに別の実施例では、KAPのアデニレートキナーゼ若しくはグアニル酸キナーゼ活性が、ガンマラジオアイソトープカウンターを用いて、[γ-³²P]ATP からのADP若しくはGDPへ³²P のの取り込みによって測定でき得る。キナーゼバッファー中のKAPは、適切なヌクレオチドモノリン酸塩基質（AMP若しくはGMP）及びリン酸塩ドナーとしての³²p標識ATPと共にインキュベートされる。反応は３７℃でインキュベートされ、トリクロロ酢酸の添加によって終了される。酸抽出物は、中和され、ゲル電気泳動にかけられて、一リン酸、二リン酸、三リン酸のヌクレオチド画分に分離する。二リン酸ヌクレオチド画分が取り除かれ、カウントされる。回復した放射性活性はKAPの活性に比例する。
【０３４２】
さらに別の実施例では、KAP のための別のアッセイは、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、シンチレーションプレート技術、及びフィルタ結合アッセイを含む。有用な基質はグルタチオントランスフェラーゼで標識された組みかえタンパク質、またはビオチンで標識された合成ペプチド基質を含む。 小さな有機分子、タンパク質、及びペプチドのようなKAP の活性の阻害剤は、そのようなアッセイで識別される。
【０３４３】
KAP 活性は、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解によって測定する。KAP は0.1%のβ-メルカプトエタノールの存在で、pH７．５のHEPES バッファーでPNPPと共に37℃で60分間インキュベートする。この反応を6 mlの10規定の水酸化ナトリウムを加えて停止させる(Diamond, R.H. 他 (1994) Mol. Cell. Biol. 14:375262)。或るいは、KAP の酸性ホスファターゼ活性は、ｐH4.5の0.1Mクエン酸ナトリウム、及び50μlの40ｍM塩化ナトリウム中にKAPを含む抽出液と100μlの10ｍM PNPPを37℃で20分インキュベートして実証する。この反応は0.5 mlの0.4M グリシン／NaOH（ｐH10.4）を加えて止める（Saftig, P. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:1862818635）。PNPPの加水分解によって起こる410nmでの光吸収の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がKAP の活性に比例する。
【０３４４】
別法では、KAP 活性は、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。反応は、60mM Tris（pH7.6）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％のβ-メルカプトエタノールおよび、セリン／トレオニンまたはチロシンで標識された10μM 基質を含む最終容量30μl中に２nM或いは4nMのKAP を含めて行なう。反応は基質で開始し、30℃で10〜15分間インキュベートする。0.6 M HC1、90mM Na₄P₂O₇、および2mM NaH₂PO₄中の4％(w/v)活性化木炭450μlで停止させ、次に12,000×gで5分間遠心分離する。酸可溶性³²Piを液体シンチレーションカウンターで定量する（Sinclair, C. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:2366623672）。
【０３４５】
18 キナーゼ結合アッセイ
KAP のFLAG-CD44cyt融合タンパク質への結合は、KAPを抗KAPを抱合した免疫親和性ビーズとインキュベートした後、ビーズの一部を、 ¹²⁵I-標識化 FLAG-CD44cyt 融合タンパク質 (5,000 cpm/ng のタンパク)の存在下で、0.5mlの結合バッファ (20 mM Tris-HCL (pH 7.4)、150 mMの NaCl、 0.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.05% Triton X-100)で4℃ で、５時間インキュベートすることによって測定できる。結合させた後、ビーズは結合バッファー中でよく洗浄し、ビーズ結合放射活性をシンチレーションカウンタで測定する(Bourguignon, L.Y.W. 他 (2001) J. Biol. Chem. 276:7327-7336)取り込まれた³²Pの量は、結合したKAPの量に比例する。
【０３４６】
１９ KAP インヒビターの同定
実施例１ 7のアッセイで説明したように、検査されるべき化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に様々な濃度で384-ウェルプレートのウェルに注入する。KAP 活性はそれぞれのウェルについて測定し、KAP 活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および容量反応動態（dose-response kinetics）を決定することができる。KAP 活性を促進する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０３４７】
２０ KAP 基質の同定
KAP の「基質トラッピング（substrate-trapping）」アッセイは、タンパク質チロシンホスファターゼのPTPシグネチャ配列における特定の突然変異によって付与され得る基質親和性の上昇を利用する。このような突然変異を有するKAP は、それらの基質と安定した複合体を形成し、このような複合体を生化学的に単離し得る。KAP の触媒ドメインをコードするクローンのPTPシグネチャ配列における不変な残基の特定部位の突然変異誘発を、当分野で周知の方法或いはBIO-RADが販売するMUTA-GENEキットなどの市販のキットを用いて行うことができる。大腸菌においてKAP 突然変異を誘発するために、突然変異を含むDNA断片を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-KAP 融合タンパク質或いはKAP をコードする配列を有する発現ベクターの対応する野生型配列と交換する。KAP 突然変異体が大腸菌で発現され、それを生化学的に精製する。
【０３４８】
発現ベクターを、10cmのシャーレ１枚に付き20μgのCsCl-精製DNA、6cmのシャーレ１枚に付き8μgのCsCl-精製DNAを用いたリン酸カルシウム仲介性形質移入によってCOS1または293細胞に形質転換する。形質移入から48時間経過した後に、細胞を100ng/mlの上皮成長因子で刺激すると、チロシンキナーゼEGFRがCOS細胞に多量に存在するため、細胞におけるチロシンのリン酸化が増大する。細胞を、50mM Tris HCl（pH7.5）／5mM EDTA／150mM NaCl／1％ Triton X-100／5 mMヨード酢酸／10mM リン酸ナトリウム／10mM NaF／5μg/mlロイペプチン／5μg/mlアプロチニン／1mM ベンズアミジンで溶解する（10cmのシャーレ１枚に付き1ml、6cmのシャーレ１枚に付き0.5ml）。KAP を、好適な抗体で溶解物から免疫沈降させる。GST-KAP 融合タンパク質を、細胞溶解物1mgにつきそれぞれ、グルタチオン−セファロース、4μgのmAbまたは10μlのビーズで沈降させる。複合体をポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）で視覚化することができるが、更に精製して基質分子を同定することもできる(Flint, A. J.他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1680-1685)。
【０３４９】
２１ プロテインキナーゼ活性の強化／抑制
KAP 活性化若しくは抑制のアゴニスト若しくはアンタゴニストは、実施例１７で記述したアッセイを用いてテストしても良い。アゴニストは、KAP 活性の増加を引き起こし、アンタゴニストはKAP 活性の減少を引き起こす。
【０３５０】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明に記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３５１】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３５２】
表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３５３】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３５４】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３５５】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３５６】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３５７】
表7は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【表４０】

【表４１】

【表４２】

【表４３】

【配列表】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to the nucleic acid and amino acid sequences of kinases and phosphatases. The present invention also relates to the diagnosis / treatment / prevention of cardiovascular diseases, immune system diseases, neurological diseases, disorders affecting development or development, lipid disorders, cell proliferation abnormalities and cancer using these sequences. The invention further relates to the evaluation of the effects of foreign compounds on the expression of kinase and phosphatase nucleic acid and amino acid sequences.
[0002]
(Background of the Invention)
Reversible protein phosphorylation is widely used to regulate various phenomena in eukaryotic cells. It is estimated that 10% or more of active proteins in general mammalian cells are phosphorylated. Kinases transfer high-energy phosphate groups from adenosine triphosphate (ATP) to the target protein's hydroxy amino acid residues, serine, threonine, or tyrosine. In contrast, phosphatase removes these phosphate groups. Extracellular signals including hormones, neurotransmitters, growth factors, and differentiation factors activate kinases that exist as cell surface receptors or activators of the final effector protein, and It is also present at other sites along the signal transduction pathway. There are cascaded kinases, and there are also kinases that are sensitive to second messenger molecules. This system allows for the amplification of weak signals (eg, growth factor molecules that are only slightly present) and integration of many weak signals into an all-or-nothing response. Second, phosphatases are essential for determining the degree of phosphorylation in cells and, together with kinases, regulate important cellular processes such as metabolic enzyme activity, cell proliferation, cell growth and differentiation, cell adhesion, and cell cycle progression .
[0003]
Kinase
Kinases constitute the largest known enzyme superfamily and have a wide variety of target molecules. Kinases catalyze the transfer of high energy phosphate groups from phosphate donors to phosphate acceptors. Nucleotides usually serve as phosphate donors in these reactions, and most kinases utilize adenosine triphosphate (ATP). The phosphate receptor can be a variety of molecules, including nucleosides, nucleotides, lipids, carbohydrates, and proteins. Proteins are phosphorylated at hydroxy amino acids. When phosphate groups are added, the local charge on the acceptor molecule changes, thereby changing the internal structure and causing intermolecular contact. Reversible protein quality phosphorylation is the main method of regulation of protein activity in eukaryotic cells. In general, proteins are activated by phosphorylation in response to extracellular signals such as hormones, neurotransmitters, growth factors, and differentiation factors. Activated proteins initiate cellular cellular responses by intracellular signaling pathways and second messenger molecules such as cyclic nucleotides that regulate protein phosphorylation, calcium-calmodulin, inositol, and various mitogenic factors.
[0004]
Kinases are involved in all cellular functions ranging from basic metabolic processes such as glycolysis to cell cycle regulation, differentiation, and information exchange with the extracellular environment through signal transduction cascades. Inappropriate phosphorylation of proteins within cells is associated with changes in cell cycle progression and cell differentiation. Changes in the cell cycle have been shown to be associated with induction of apoptosis and induction of cancer. Changes in cell differentiation have been shown to be associated with diseases and disorders of the reproductive system, immune system, and skeletal muscle.
[0005]
There are two classes of protein kinases. One class of protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylates tyrosine residues, and the other class, protein serine / threonine kinase (STK), phosphorylates serine and threonine residues. Certain PTKs and STKs have structural features of both families and have specificity (bispecificity) for both tyrosine and serine / threonine residues. Almost all kinases contain a conserved 250-300 amino acid catalytic domain containing specific residues and a kinase family-specific sequence motif. The protein kinase catalytic domain can be further divided into 11 subdomains. The N-terminal subdomain I-IV folds into a two lobed structure that binds and directs the ATP donor molecule, and subdomain V spans the bilobal structure. The C-terminal subdomain VI-XI binds to a protein substrate and transfers gamma phosphate from ATP to the hydroxyl group of a tyrosine, serine, or threonine residue. Each of the eleven subdomains contains an amino acid motif or a specific catalytic residue characteristic of the subdomain. For example, subdomain I contains a high glycine ATP-binding common motif of 8 amino acids, subdomain II contains important lysine residues necessary to maximize catalytic activity, and subdomains VI to IX are highly advanced Containing a conserved catalyst center. PTKs and STKs also contain sequence motifs unique to subdomains VI and VIII that can confer hydroxy amino acid specificity.
[0006]
In addition, kinases can be classified by an additional amino acid sequence consisting of residues usually contained within or adjacent to the kinase domain, usually in the range of 5-100. These additional amino acid sequences modulate kinase activity and determine substrate specificity. (Hardie, G. and S. Hanks (1995)The Protein Kinase Facts Book, Vol I, pages 17-20 Academic Press, San Diego CA.) Specifically, two protein kinase signature sequences were identified in the kinase domain. The first protein kinase signature sequence contains an active site of lysine residues involved in ATP binding, and the second protein kinase signature sequence contains aspartic acid residues important for catalytic activity. If the protein to be analyzed contains these two protein kinase signatures, the probability that the protein is a protein kinase is close to 100% (PROSITE: PDOC00100, November 1995).
[0007]
Protein tyrosine kinase
Protein tyrosine kinases (PTKs) can be classified as either transmembrane receptor PTK proteins or non-transmembrane non-receptor PTK proteins. Transmembrane tyrosine kinases function as receptors for most growth factors. Growth factors bind to receptor tyrosine kinases (RTKs), whereby the receptor phosphorylates self (autophosphorylation) and certain intracellular second messenger proteins. Growth factors (GF) that bind to the receptor PTK are epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, insulin growth factor, insulin-like growth factor, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor , And macrophage colony stimulating factor.
[0008]
The non-transmembrane non-receptor PTK forms a signaling complex with the cytoplasmic domain of the cell membrane receptor instead of containing the transmembrane region. Receptors that function via non-receptor PTKs include cytokine receptors and hormone receptors (growth hormone and prolactin), and antigen-specific receptors on T and B lymphocytes.
[0009]
Many PTKs were first identified as oncogene products in cancer cells whose PTK activity does not undergo normal cellular control. In fact, about one third of oncogenes encode PTK. Furthermore, cell transformation (carcinogenesis) is often accompanied by an increase in tyrosine phosphorylation activity (Charbonneau, H. and Tonks, N. K. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8: 463-93). Thus, modulation of PTK activity can be an important tool for controlling certain types of cancer.
[0010]
Protein serine / threonine kinase
Protein serine / threonine kinase (STK) is a non-transmembrane protein. A subclass of STK, known as ERK (extracellular signal-regulated kinase) or MAP (mitogen-activated protein kinase), is activated by cell stimulation with various hormones and growth factors. Cell stimulation induces a signaling cascade that leads to phosphorylation of MEK (MAP / ERK kinase), and after phosphorylation of MEK, ERK is activated by phosphorylation of serine and threonine. Since many proteins are downstream effectors for active ERK, they may be involved in the regulation of cell proliferation and differentiation and the regulation of the cytoskeleton. Activation of ERK is usually transient and cells have a bispecific phosphatase that is involved in its down-regulation (downregulation) and various studies have shown that ERK activity is associated with certain cancers Other STKs include second messenger-dependent proteins such as cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA), calcium-calmodulin (CaM) -dependent protein kinase, and mitogen-activated protein kinase (MAP). Kinases, cyclin-dependent protein kinases, checkpoint and cell cycle kinases, Numb-related kinases (Nak), human fusion (hFu), proliferation-related kinases, 5'-AMP-activated protein kinases, and kinases involved in apoptosis included.
[0011]
ERK7, a member of the MAP kinase ERK family, is a novel 61-kilodalton protein with a motif similar to ERK1 and ERK2, but not activated by extracellular stimuli like ERK1 and ERK2. It is also not activated by the normal activators of cJun N-terminal kinase (JNK) and p38 kinase. ERK7 regulates its nuclear localization and growth inhibition by its C-terminal tail, not by the kinase domain (typical of other MAP kinases) (Abe, MK (1999) Mol. Cell. Biol. 19 : 13011312).
[0012]
Second messenger-dependent protein kinases include cyclic AMP (cAMP), cyclic GMP, inositol triphosphate, phosphatidylinositol, 3,4,5-triphosphate, cyclic ADP ribose, arachidonic acid, diacylchryserol and calcium -Mediates mainly the effects of second messengers such as calmodulin. PKA is involved in mediating hormone-induced cellular responses and is activated by cAMP produced in cells in response to hormone stimulation. cAMP is an intracellular mediator of hormonal action in all animal cells studied. Hormone-induced cellular responses include thyroid hormone secretion, cortisol secretion, progesterone secretion, glycogenolysis, bone resorption, heart rate regulation, and myocardial contractility regulation. PKA is found in all animal cells and appears to be related to the effect of cAMP in most of these cells. Changes in PKA expression are associated with cancer, thyroid disease, diabetes, atherosclerosis, and cardiovascular disease (Isselbacher, K. J. et al., (1994)Harrison's Principles of Internal MedicineMcGraw-Hill, New York, NY, pages 416-431, 1887).
[0013]
The casein kinase I (CKI) gene family is another subfamily of serine / threonine protein kinases. This continuing expansion of the kinase family is involved in the regulation of various cellular and nuclear processes, including cellular metabolism, DNA replication, and DNA repair. CKI enzymes are present on the membrane, nucleus, cytoplasm and cytoskeleton of eukaryotic cells and on the spindles of mammalian cells (Fish, KJ et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 14875-14883.) .
[0014]
All CKI family members contain a short amino terminal domain consisting of 9-76 amino acids, a highly conserved kinase domain consisting of 284 amino acids, and a variable carboxyl terminal domain consisting of more than 24-200 amino acids ( Cegielska, A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 1357-1364.). This CKI family consists of highly related proteins. This has been confirmed by the identification of casein kinase I isoforms from various sources. There are at least five mammalian isoforms of α, β, γ, δ, and ε. Fish et al. Identified CKIε from a human placenta cDNA library. This CKIε is a basic protein consisting of 416 amino acids and is most similar to CKI delta. Recombinant expression revealed that CKIε phosphorylates a known CKI substrate and is suppressed by CKI-7, a CKI-specific inhibitor. The human gene for CKIε can rescue yeast with a slow-growth phenotype caused by deletion of the yeast CKI locus, HRR250 (Fish et al., Supra).
[0015]
The mammalian mutant circadian tau was found to be a semidominant chromosomal allele of CKIε that significantly shortens the circadian rhythm cycle in Syrian hamsters. The tau locus is encoded by casein kinase Iε and is also a homologue of the Drosophila circadian gene double-time. Studies of both the wild-type and tau mutant CKIε enzymes showed that the mutant enzyme is significantly reduced in its maximum rate and is in an autophosphorylated state. Furthermore,in vitroWhile CKIε in has the ability to interact with the mammalian PERIOD protein, the mutant enzyme lacks the ability to phosphorylate PERIOD. Lowrey et al. Proposed that CKIε is an important factor in delaying negative feedback signals within the self-regulatory loop of the transcription-translation system that is central to the circadian mechanism. Thus, CKIε enzymes are ideal candidates for pharmaceutical compositions that affect circadian rhythms, jet lag and sleep, as well as other physiological and metabolic processes under circadian regulation (Lowrey, PL et al., ( 2000) Science 288: 483-491.).
[0016]
Calcium-calmodulin-dependent protein kinase
Calcium-calmodulin (CaM) -dependent kinases are involved in the regulation of smooth muscle contraction, glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM-dependent protein kinase is activated by calmodulin, an intracellular calcium receptor, in response to the concentration of free calcium in the cell. Many CaM kinases are also activated by phosphorylation. Certain CaM kinases are also activated by autophosphorylation or other regulatory kinases. CaM kinase I phosphorylates a variety of substances including synapsin I and II, neurotransmitter-related proteins, CREB, a gene transcriptional regulator, and CFTR, a cystic fiber conductance regulatory protein (Haribabu, B. et al. (1995) EMBO Journal 14: 3679-3686). CaM kinase II also phosphorylates synapsin at various sites and regulates catecholamine synthesis in the brain by phosphorylation and activation of tyrosine hydroxylase. CaM kinase II also regulates the synthesis of catecholamines and serotonin by phosphorylation / activation of tyrosine hydroxylase and tryptophan hydroxylase (Fujisawa, H. (1990) BioEssays 12: 27-29). A large amount of mRNA encoding a calmodulin-binding protein kinase-like protein was found in the mammalian frontal lobe. This protein binds to vesicles in both axons and dendrites and accumulates mainly after birth. The amino acid sequence of this protein is similar to CaM-dependent STK, and this protein binds calmodulin in the presence of calcium (Godbout, M. et al. (1994) J. Neurosci. 14: 1-13).
[0017]
Homeodomain-interacting protein kinase (HIPK) is a serine / threonine kinase, a new member of the DYRK kinase subfamily (Hofmann, TG et al., (2000) Biochimie 82: 1123-1127). Contains a conserved protein kinase domain separated from the domain in which it acts. HIPK is a nuclear kinase and HIPK2 is highly expressed in neural tissues (Kim, YH et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 25875-25879; Wang, Y. et al., (2001) Biochim Biophys. Acta 1518: 168-172). HIPK acts as a co-suppressor of homeodomain transcription factors. This co-suppressor activity is found in post-translational modifications such as ubiquitin binding and phosphorylation that are important for the regulation of cellular protein function (Kim, YH et al., (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 12350-12355).
The human hwarts protein, a homologue of the Drosophila wart tumor suppressor gene, maps to chromosome 6q2425.1. It has a serine / threonine kinase domain and localizes to the centrosome of quiescent cells. It is involved in mitosis and functions as a component of the mitotic apparatus (Nishiyama, Y. et al. (1999) FEBS Lett. 459: 159165).
[0018]
Calcium-calmodulin-dependent protein kinase
Calcium-calmodulin (CaM) -dependent kinases are involved in the regulation of smooth muscle contraction, glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM-dependent protein kinase is activated by calmodulin, an intracellular calcium receptor, in response to the concentration of free calcium in the cell. Many CaM kinases are also activated by phosphorylation. Certain CaM kinases are also activated by autophosphorylation or other regulatory kinases. CaM kinase I phosphorylates a variety of substances including synapsin I and II, neurotransmitter-related proteins, CREB, a gene transcription regulator, and CFTR, a cystic fiber conductance regulator (Haribabu, B. et al. (1995) EMBO Journal 14: 3679-3686). CaM kinase II also phosphorylates synapsin at various sites and regulates catecholamine synthesis in the brain by phosphorylation and activation of tyrosine hydroxylase. CaM kinase II also regulates the synthesis of catecholamines and serotonin by phosphorylation / activation of tyrosine hydroxylase and tryptophan hydroxylase (Fujisawa, H. (1990) BioEssays 12: 27-29). A large amount of mRNA encoding a calmodulin-binding protein kinase-like protein was found in the mammalian frontal lobe. This protein binds to vesicles in both axons and dendrites and accumulates mainly after birth. The amino acid sequence of this protein is similar to CaM-dependent STK, and this protein binds calmodulin in the presence of calcium (Godbout, M. et al. (1994) J. Neurosci. 14: 1-13).
[0019]
Mitogen-activated protein kinase
Mitogen-activated protein kinase (MAP) mediates signal transduction from the cell surface to the nucleus through a phosphorylation cascade. MAP is another STK family that regulates intracellular signaling pathways. Several subgroups have been identified, each having a different substrate specificity and responding to unique extracellular stimuli (Egan, S. E. and Weinberg, R. A. (1993) Nature 365: 781-783). There are three kinase modules that make up the MAP kinase cascade, MAPK (MAP), MAPK kinase (MAP2K, MAPKK, or MKK) and MKK kinase (MAP3K, MAPKKK or MEKK) (Wang, XS et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 33-37). The extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway is a growth factor or mitogen (mitogenic) such as epidermal growth factor (EGF), ultraviolet light, hypertonic medium, heat shock, or endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Activated by a factor). Closely related but distinct parallel pathways, c-Jun N-terminal kinase (JNK), the kinase activated by stress (SAPK) pathway, and the P38 kinase pathway, are stimulated by stress and tumors It is activated by pro-inflammatory cytokines such as necrosis factor (TNF) and interleukin-1 (IL-1). Changes in MAP kinase expression are implicated in a variety of diseases, including cancer, inflammation, immune diseases, and diseases that affect growth and development. The MAP kinase signaling pathway is present in mammalian cells and yeast.
[0020]
The p21-activated protein kinase (PAK) family is thought to exist in all organisms with Cdc42-like GTPases. In mammalian cells, PAK is thought to be involved in the cascade activity of mitogen-activated protein kinases. PAK function also includes lysis of cytoskeletal stress fibers (tensile fibers) and reconstitution of adhesion plaque complexes (Manser, E. et al. (1997) Mol. Cell Biol. 17 (3): 11291143).
[0021]
Cyclin-dependent protein kinase
Cyclin-dependent protein kinase (CDK) is an STK that regulates cell progression through the cell cycle. Cells enter and exit mitosis by regulation of synthesis and degradation of an activated protein family called cyclins. Cyclin, a small regulatory protein, binds to and activates the CDK. Thereby, the selected proteins involved in the mitotic process are phosphorylated and activated. CDK is unique in that it requires a large number of inputs to activate. In addition to cyclin binding, CDK activation requires phosphorylation of specific threonine residues and dephosphorylation of specific tyrosine residues in the CDK.
[0022]
NIMA (short for never in mitosis) -related kinases (Neks) are another family of STKs related to the cell cycle. Both CDK and Nek are involved in the separation of centrosomes, which are replication, maturation, and microtubule formation centers in animal cells (Fry, A. M. et al., (1998) EMBO J. 17: 470-481).
[0023]
Checkpoints and cell cycle kinases
In the process of cell differentiation, the order and timing of cell cycle transitions are under the control of cell cycle checkpoints. This cell cycle checkpoint ensures that critical processes such as DNA replication and chromosome segregation are performed correctly. For example, when DNA is damaged by radiation or the like, the checkpoint pathway is activated and the cell cycle is stopped to provide time for repair. If the damage is large, apoptosis is induced. In the absence of such checkpoints, damaged DNA can be inherited by abnormal cells and cause growth abnormalities such as cancer. Protein kinases play an important role in this process. For example, a specific kinase, checkpoint kinase 1 (Chk1), has been identified in yeast and mammals. This Chk1 is activated by DNA damage in yeast. When Chk1 is activated, cells arrest at the G2 / M transition. (Sanchez, Y. et al., (1997) Science 277: 1497-1501.) Specifically, Chk1 phosphorylates the cell division cycle phosphatase CDC25, thereby dephosphorylating and activating the cyclin-dependent kinase Cdc2. The normal function of CDC25 is inhibited. Activation of Cdc2 regulates cells from entering mitosis (Peng, C-Y et al. (1997) Science 277: 1501-1505.). Thus, Chk1 activation prevents damaged cells from entering mitosis. A deficiency in a checkpoint kinase such as Chk1 can also cause cancer by failing to stop cells damaged by DNA at other checkpoints such as G2 / M.
[0024]
Cell proliferation-related kinase
Cell proliferation-related kinases are serum / cytokine-induced STKs that are involved in the regulation of cell cycle and cell proliferation in human megakaryocytes (Li, B. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19402-19408 ). Growth-related kinases are STK polo (s) involved in cell divisionDrosophilarelated to the family (derived from the polo gene). Growth-related kinases are down-regulated in lung tumor tissue and appear to be proto-oncogenes. If proto-oncogene is expressed uncontrolled in normal tissues, normal tissues can become cancerous.
[0025]
5'-AMP- Activated protein kinase
One ligand-activated STK protein kinase is 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) (Gao, G. et al. (1996) J. Biol Chem. 271: 8675-8681). Mammalian AMPK is a regulator of fatty acid and sterol synthesis by phosphorylation of the enzymes acetyl-CoA carboxylase and hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, and against intracellular stresses such as heat shock and glucose and ATP depletion Mediates the response of these pathways. AMPK is a heterotrimeric complex consisting of a catalytic α subunit and two non-catalytic β and γ subunits that are thought to regulate the activity of this α subunit. AMPK subunits are more widely distributed than expected in non-fatty tissues such as the brain, heart, spleen, and lung. This distribution may play a role other than the regulation of lipid metabolism.
[0026]
RET (short for rearranged during transfection) proto-oncogene encodes a tyrosine kinase receptor, which is a multiple endocrine dysplasia type 2, genetic cancer syndrome, and development of enteric neurons Involved in deficient Hirschsprung disease. The glial cell line-derived neurotrophic factor RET and its functional ligand play an important role in the development of the human enteric nervous system (Pachnis, V. et al. (1998) Am. J. Physiol. 275: G183- G186).
[0027]
Kinases in apoptosis
Apoptosis is a highly regulated signaling pathway that leads to cell death and plays a pivotal role in tissue development and homeostasis. Dysregulation of this process is associated with the pathogenesis of various diseases including autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, and cancer. Various STKs play an important role in this process. ZIP kinase is an STK that contains a C-terminal leucine zipper domain in addition to an N-terminal protein kinase domain. This C-terminal domain interacts with transcription factors such as homodimerization and kinase activation, and the activated transcription factor ATF4, a member of the cyclic AMP responsive factor binding protein (ATF / CREB) family of transcription factors. Mediates the interaction (Sanjo, H. et al. (1998) J. Biol. Chem, 273: 29066-29071). DRAK1 and DRAK2 are STKs that share homology with death-related protein kinases (DAP kinases) and are known to function in interferon gamma-induced apoptosis (Sanjo et al., Supra). Like ZIP kinase, DAP kinase contains an ankyrin repeat C-terminal protein-protein interaction domain in addition to the N-terminal kinase domain. ZIP, DAP, and DRAK kinases induce morphological changes associated with apoptosis when transformed into NIH3T3 cells (Sanjo et al., Supra). However, deletion of either the N-terminal kinase catalytic domain or the C-terminal domain of these proteins results in a loss of apoptotic activity. Thus, in addition to kinase activity, activity in the C-terminal domain is also required for apoptosis, and may be a domain that interacts with regulatory factors or specific substrates.
[0028]
RICK is another STK recently identified as mediating specific apoptotic pathways involving the death receptor CD95 (Inohara, N. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12296-12300). CD95 is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily and plays an important role in immune system regulation and homeostasis (Nagata, S. (1997) Cell 88: 355-365). The CD95 receptor signaling pathway involves recruitment of various intracellular molecules to the receptor complex following ligand binding. This process involves the supplementation of the cysteine protease caspase-8, which activates the caspase cascade and causes cell death. RICK consists of a C-terminal “caspase recruitment” domain that interacts with a caspase-like domain and an N-terminal kinase catalytic domain. This suggests that RICK plays a role in the mobilization of caspase-8. This interpretation is reinforced by the fact that RICK expression in human 293T cells promotes caspase-8 activation and enhances the induction of apoptosis by various proteins involved in the CD95 apoptotic pathway (Inohara et al., Supra). ).
[0029]
Mitochondrial protein kinase
Mitochondrial protein kinases (MPKs), a new class of eukaryotic kinases related by sequences to prokaryotic histidine protein kinases, do not appear to have sequence similarity to other eukaryotic protein kinases. These protein kinases exist only in the mitochondrial matrix space, and it appears that the genes present in the respiratory-dependent bacteria taken up by endocytosis by primitive eukaryotic cells have evolved. MPK is involved in phosphorylation and inactivation of branched chain α-keto acid dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase complexes (Harris, R. A. et al. (1995) Adv. Enzyme Regul. 34: 147-162). Five MPKs have been identified. The four members correspond to pyruvate dehydrogenase isoenzymes and regulate the activity of the pyruvate dehydrogenase complex, an important regulatory enzyme in the middle of glycolysis and the citrate cycle. The fifth member corresponds to the branched α-keto acid dehydrogenase kinase and is important in regulating the pathway for removal of branched chain amino acids (Harris, RA et al. (1997) Adv. Enzyme Regul. 37: 271). -293). It is known that pyruvate dehydrogenase kinase activity in rat liver, heart and muscle is significantly elevated in starvation and diabetic conditions. This increased activity contributes to the phosphorylation and inactivation of the pyruvate dehydrogenase complex in both pathologies and the preservation of pyruvate and lactic acid for gluconeogenesis (Harris et al., Supra).
[0030]
(Kinase with non-protein substrate)
Lipid kinase and inositol kinase
Lipid kinases phosphorylate the hydroxyl residues of the lipid head group. A family of kinases involved in phosphorylation of phosphatidylinositol (PI) has been described, each member phosphorylating a specific carbon of the inositol ring (Leevers, S. et al. (1999) Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 219-225). Phosphatidylinositol phosphorylation is involved in the activation of the protein kinase C signaling pathway. The inositol phospholipid (phosphoinositide) intracellular signaling pathway begins with the binding of signaling molecules to G protein-coupled receptors at the cell membrane. This results in phosphorylation of the phosphatidylinositol (PI) residue inside the cell membrane by inositol kinase, which causes the PI residue to diphosphate (PIP).₂). Then PIP₂Inositol triphosphate (IP₃) And diacylglycerol. These two products act as mediators to separate signal transduction pathways. Cellular responses mediated by these pathways include glycogenolysis in the liver in response to vasopressin, smooth muscle contraction in response to acetylcholine, and thrombin-induced platelet aggregation.
[0031]
PI3-kinase (PI3K), which phosphorylates the D3 position of PI and its derivatives, plays an important role in the growth factor signal cascade involved in cell proliferation, differentiation, and metabolism. PI3K is a heterodimer consisting of an adapter subunit and a catalytic subunit. This adapter subunit acts as a scaffold protein and interacts with certain tyrosine-phosphorylated proteins, lipid components, and other cytoplasmic factors. When the adapter subunit binds to a tyrosine phosphorylated target such as insulin responsive substrate (IRS) -1, the catalytic subunit is activated and PI (4, 5) diphosphate (PIP₂) PI (3, 4, 5) P_Three (PIP_Three). Then PIP₃Activates several other proteins including PKA, protein kinase B (PKB), protein kinase C (PKC), glycogen synthase kinase (GSK) -3, and P70 ribosomal s6 kinase. PI3K also interacts directly with the cytoskeleton-forming proteins Rac, rho, and cdc42 (Shepherd, P. R. et al. (1998) Biochem. J. 333: 471-490). Diabetic animal models such as obese and fat mice have altered levels of PI3k adapter subunits. It appears that PI3K plays a role in type 2 diabetes because certain mutations in the adapter subunit are found in the Danish population with insulin resistance (Shepherd, supra).
[0032]
An example of lipid kinase phosphorylation activity is phosphorylation of D-erythro-sphingosine to sphingosine-1-phosphate (SPP), a sphingolipid metabolite. SPP was found to be a novel lipid second messenger with both extracellular and intracellular effects (Kohama, T. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 23722-23728). Outside the cell, SPP is a ligand for the G protein-coupled receptor EDG-1 (endothelium-derived G protein-coupled receptor). Within the cell, SPP regulates cell growth, survival, motility, and changes in the cytoskeleton. The level of SPP is regulated by sphingosine kinase that specifically phosphorylates D-erythro-sphingosine to SPP. The importance of sphingosine kinase in cell signaling is that various stimuli, including activation of platelet-derived growth factor (PDGF), nerve growth factor, and protein kinase C, increase intracellular levels of SPP through activation of sphingosine kinase And the fact that competitive inhibitors of the enzyme selectively inhibit PDGF-induced cell growth (Kohama et al., Supra).
[0033]
PKC is also activated by diacylglycerol (DAG). Phorbol ester (PE) is an analog of DAG and a tumor promoter that produces a variety of physiological changes when administered to cells and tissues. Phorbol ester (PE) and diacylglycerol (DAG) bind to the N-terminal region of protein kinase C (PKC). This region is approximately 50 amino acid residues long and contains one or more copies of the cysteine-rich domain essential for DAG / PE binding. The enzyme diacylglycerol kinase (DGK) that converts DAG to phosphatidic acid contains two copies of the DAG / PE binding domain at its N-terminal part (Azzi, A. et al. (1992) Eur. J. Biochem. 208 : 547-557).
[0034]
An example of lipid kinase phosphorylation activity is phosphorylation of D-erythro-sphingosine to sphingosine-1-phosphate (SPP), a sphingolipid metabolite. SPP was found to be a novel lipid second messenger with both extracellular and intracellular effects (Kohama, T. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 23722-23728). Outside the cell, SPP is a ligand for the G protein-coupled receptor EDG-1 (endothelium-derived G protein-coupled receptor). Within the cell, SPP regulates cell growth, survival, motility, and changes in the cytoskeleton. The level of SPP is regulated by sphingosine kinase that specifically phosphorylates D-erythro-sphingosine to SPP. The importance of sphingosine kinase in cell signaling is that various stimuli, including activation of platelet-derived growth factor (PDGF), nerve growth factor, and protein kinase C, increase intracellular levels of SPP through activation of sphingosine kinase And the fact that competitive inhibitors of the enzyme selectively inhibit cell growth induced by PDGF (Kohama et al., Supra).
[0035]
Purine nucleotide kinase
The purine nucleotide kinases adenylate kinase (ATP: AMP phosphotransferase or AdK) and guanylate kinase (ATP: GMP phosphotransferase or GuK) play an important role in nucleotide metabolism and synthesize ATP and GTP. And is important in each of the regulation of intracellular levels. These two molecules are precursors of DNA and RNA synthesis in growing cells, are the main source of biochemical energy (ATP) in the cell, and signal transduction pathways (GTP) provide. Interfering with various steps in the synthesis of these two molecules is the principle of many antiproliferative agents for cancer and antiviral therapy (Pillwein, K. et al. (1990) Cancer Res. 50: 1576- 1579).
[0036]
AdK is found in most cell types and is particularly abundant in cells such as skeletal muscle that synthesize ATP at a high rate. In these cells, AdK physically associates with subcellular structures, mitochondria and myofibrils. Mitochondria produce energy, and myofibrils use that energy. Recent studies have demonstrated that AdK plays an important role in the transfer of high energy phosphoryl from metabolic processes that produce ATP to cellular components that consume ATP (Zeleznikar, RJ et al., (1995) J Biol. Chem. 270: 7311-7319). Therefore, AdK is thought to play a central role in maintaining energy production in cells, especially cancer cells, such as cells with high proliferation and metabolic rate, and is a target for suppressing its activity in the treatment of certain types of cancer. Can provide. Alternatively, a decrease in AdK activity may be the cause of various metabolic muscle energy diseases that cause heart failure and respiratory failure and could be treated by increasing AdK activity.
[0037]
In addition to providing an important step in the synthesis of GTP for RNA and DNA synthesis, GuK also plays an important role in cellular signaling pathways through regulation of GDP and GTP. Specifically, GTP binding to membrane-associated G protein mediates cell receptor activation, and adenyl cyclase is activated in the cell to produce cyclic AMP, which is a second messenger. GDP binding to G proteins inhibits these processes. P21 is also known to be involved in the regulation of cell proliferation and carcinogenesis by levels of GDP and GTP^rasThe activity of certain tumor proteins such as (Bos, J. L. (1989) Cancer Res. 49: 4682-4689). When the ratio of GTP to GDP caused by suppression of GuK is high, p21^rasIs activated and carcinogenesis is promoted. Increasing the activity of GuK to increase the level of GDP and decrease the level of GTP against GDP can be a treatment that suppresses carcinogenesis.
[0038]
GuK is an important enzyme in the phosphorylation and activation of certain antiviral agents useful for the treatment of herpes virus infections. These agents include the guanine homologues acyclovir and buciclovir (Miller, WH and Miller RL (1980) J. Biol. Chem. 255: 7204-7207; Stenberg, K. et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 2134-2139). Increasing the activity of GuK in infected cells could be a therapeutic method that promotes the effects of these drugs, thus reducing drug consumption.
[0039]
Pyrimidine kinase
Pyrimidine kinases include deoxythidine kinase and thymidine kinase 1 and 2. Deoxytidine kinase is present in the nucleus and thymidine kinases 1 and 2 are found in the cytoplasm (Johansson, M. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 11941-11945). Phosphorylation of deoxyribonucleosides by pyrimidine kinase leads to DNA precursorde novoAlternative routes for synthesis are provided. The role of pyrimidine kinase in phosphorylation is as important for the activation of several nucleoside analogues as are important for chemotherapy (Arner ES and Eriksson, S. (1995) Pharmacol. Ther. 67: 155 -186).
[0040]
Phosphatase
In general, protein phosphatases are characterized by either serine / threonine specificity or tyrosine specificity based on phosphoamino acid substrate selectivity. However, certain phosphatases (DSP: bispecific phosphatases) can act on phosphorylated tyrosine, serine, or threonine residues. Protein serine / threonine phosphatase (PSP) is an important regulator of many cAMP-mediated hormone responses in cells. Protein tyrosine phosphatase (PTP) plays an important role in the cell cycle and intracellular signaling processes. Another family of phosphatases is the acid phosphatase, or histidine acid phosphatase (HAP) family, whose members hydrolyze phosphate esters under acidic pH conditions.
[0041]
PSP is found in the cytosol, nucleus, and mitochondria and is associated with cytoskeleton and membrane structures in many tissues, particularly the brain. Some PSPs are active due to Ca²⁺Or Mn²⁺A divalent cation such as PSP plays an important role in glucose metabolism, muscle contraction, protein synthesis, T cell function, neural action, oocyte maturation, and liver metabolism (Cohen, P. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 453 (See the overview of -508). PSPs can be classified into two classes. The PPP classes include PP1, PP2A, PP2B / calcineurin, PP4, PP5, PP6, and PP7. Members of this class are composed of homologous catalytic subunits with highly conserved signature sequences combined with one or more regulatory subunits (PROSITE PDOC00115). Furthermore, the interaction with the scaffold and anchoring molecules determines the intracellular localization and substrate specificity of the PSP. The PPM class consists of several isoforms closely related to PP2C, and there is no evolutionary association with the PPP class.
[0042]
PP1 dephosphorylates many proteins phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA) and is an important regulator of many cAMP-mediated hormone responses in cells. Several isoforms have been identified, but the alpha and beta forms are generated by alternative splicing of the same gene. For PP1, ubiquitous and tissue-specific target proteins have been identified. In the brain, inhibition of PP1 activation by dopamine and 32 kDa adenosine 3 ′, 5′-monophosphate-regulated phosphoprotein (DARPP-32) is required for normal dopamine response in neostriatal neurons ( Price, NE and MC Mumby (1999) Curr. Op. Neurobiol. 9: 336-342. PP1 and PP2A have been shown to limit cell motility of microvascular endothelial cells and appear to play a role in PSP in inhibiting angiogenesis (Gabel, S. et al. (1999) Otolaryngol. Head Neck Surg 121: 463-468).
[0043]
PP2A is the main serine / threonine phosphatase. The core PP2A enzyme consists of one 36 kDa catalytic subunit (C) combined with a 65 kDa scaffolding subunit (A) that recruits additional regulatory subunits (B). Three gene families (PR55, PR61, and PR72) encoding the B subunit are known, each of which contains multiple isoforms, and there may be additional families (Millward, TA et al. (1999) Trends). Biosci. 24: 186-191). These “type B” subunits are cell type specific and tissue specific and determine substrate specificity, enzyme activity, and intracellular localization of the holoenzyme. The PR55 family is highly conserved and has a conserved motif (PROSITE PDOC00785). PR55 increases PP2A activity against mitogen-activated protein kinase (MAPK) and MAPK kinase (MEK). PP2A dephosphorylates the MAPK activation site and inhibits the transition of cells to mitosis. Several proteins can compete with PR55 for PP2A core enzyme binding, including the CKII kinase catalytic subunit, the polyomavirus medium and small T antigens, and the SV40 small t antigen. Viruses use this mechanism to stimulate PP2A activity and stimulate cell cycle progression (Pallas, D. C. et al. (1992) J. Virol. 66: 886-893). Altered expression of MAP kinases is also thought to be involved in a variety of conditions, including cancer, inflammatory diseases, immune system diseases, and diseases that affect growth and development. In fact, PP2Ain vitroAnd dephosphorylate more than 30 protein kinases to regulate their activity. Other research results also indicate that kinases such as PKB, PKC, calmodulin-dependent kinases, ERK family, MAP kinases, cyclin-dependent kinases, and IκB kinases.in vivoShowed similar results (Millward et al., Supra). PP2A itself is a substrate for CKI and CKII kinases and can be stimulated by polycationic macromolecules. PP2A-like phosphatases are required to maintain G1 phase disruption of mammalian cyclins A and B (Bastians, H. et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10: 3927-3941). PP2A acts primarily in the brain and is thought to be involved in the regulation of neurofilament stability and normal nerve function, particularly phosphorylation of the microtubule-associated protein tau. It has been proposed that excessive phosphorylation of tau causes the neurodegeneration seen in Alzheimer's disease (see previous review by Price and Mumby).
[0044]
PP2B or calcineurin is Ca²⁺An activated dimeric phosphatase, particularly present in large amounts in the brain. PP2B consists of a catalytic subunit and a regulatory subunit and is activated by the binding of the calcium / calmodulin complex. Calcineurin is the target of the immunosuppressive drugs cyclosporine and FK506. These agents along with other cellular factors interact with calcineurin and inhibit phosphatase activity. In T cells, this action inhibits calcium-dependent activation of the NF-AT family of transcription factors, resulting in immunosuppression. This family is widely distributed and calcineurin is likely to regulate gene expression in other tissues. In neurons, calcineurin regulates functions ranging from inhibition of neurotransmitter release to desensitization of post-synaptic NMDA receptor-bound calcium channels and long-term memory (Price and Mumby, supra).
[0045]
Other members of the PPP class have recently been identified (Cohen, P. T. (1997) Trends Biochem. Sci 22: 245-25). One of them, PP5, contains a regulatory domain with tetratricopeptide repeats. PP5 isin vitroIt appears to be involved in several signaling pathways, including those activated by anionic phospholipids and polyunsaturated fatty acids, including those regulated by atrial natriuretic peptide or steroid hormones (Andreeva, AV and See MA Kutuzov (1999) Cell Signal. 11: 555-562 review).
[0046]
PP2C is a monomer with a broad substrate specificity of up to 42 kDa, whose activity is divalent cation (mainly Mn²⁺Or Mg²⁺). PP2C proteins share a conserved N-terminal region with an invariant DGH motif containing aspartic acid residues involved in cation binding (PROSITE PDOC00792). The mechanism that regulates the action of the target protein and PP2C has not been identified. PP2C has been shown to inhibit stress-responsive p38 and Jun kinase (JNK) pathways (Takekawa, M. et al. (1998) EMBO J. 17: 4744-4752).
[0047]
In contrast to PSP, tyrosine-specific phosphatases (PTPs) are generally monomeric proteins of varying size and structure (20 kDa to 100 kDa and above), mainly signaling across the cell membrane Works in PTPs are classified as either soluble phosphatases or transmembrane receptor proteins that contain phosphatase domains. All PTPs share a conserved catalytic domain of about 300 amino acids including the active site. The consensus sequence of this active site contains cysteine residues that add nucleophilic attack to the phosphate moiety during catalysis (Neel, B.G. and N.K. Tonks (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9: 193-204). The receptor PTP consists of a variable-length N-terminal extracellular domain, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region that usually has two catalytic domains. While only the first catalytic domain appears to have enzymatic activity, the second catalytic domain appears to affect the substrate specificity of the first catalytic domain. The extracellular domains of some receptor PTPs include fibronectin-like repeats, immunoglobulin-like domains, MAM domains (extracellular motifs likely to have adhesion functions), or carbonic acid dehydrogenase-like domains (PROSITE PDOC 00323) Including. These various structural motifs have varied the size and specificity of PTP.
[0048]
PTP plays an important role in biological processes such as cell adhesion, lymphocyte activation, and cell proliferation. PTPμ and PTPκ are involved in cell-cell contacts and will regulate cadherin / catenin function. Several PTPs affect cell development, adhesion plaque, and cell motility, most of which are performed by the integrin / tyrosine kinase signaling pathway (reviews of Neel, BG and NK Tonks, supra) See). CD45 phosphatase regulates signal transduction and lymphocyte activation (Ledbetter, J. A. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8628-8632). A soluble PTP (SHP) with Src-homology-2 domain was identified. This suggests that these molecules interact with receptor tyrosine kinases. SHP-1 regulates cytokine receptor signaling by regulating Janus family PTKs in hematopoietic cells and by signaling by T cell receptors and c-Kit (see the review by Neel and Tonks above). M-phase-inducing phosphatase dephosphorylates and activates PTK CDC2, plays an important role in inducing mitosis, and leads to cell division (Sadhu, K. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5139-5143). In addition, at least eight PTP-encoding genes have been mapped to chromosomal regions that have been translocated or rearranged in various tumor conditions including lymphoma, small cell lung cancer, leukemia, adenocarcinoma, and neuroblastoma ( See Charbonneau, H. and NK Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8: 463-493). The activation site of the PTP enzyme contains a consensus sequence of the MTM1 gene family. The MTM1 gene is involved in recessive tubule myopathy linked to the X gene. This disease is a congenital myopathy associated with Xq28 (Kioschis, P. et al. (1998) Genomics 54: 256-266). It is well known that many PTKs are encoded by oncogenes and that carcinogenesis is often accompanied by increased tyrosine phosphorylation activity. Thus, PTP may regulate the level of tyrosine phosphorylation in cells to prevent or reverse cell transformation and the growth of various cancers. This notion is supported by research findings that overexpression of PTP can suppress cell transformation and specific inhibition of PTP can promote cell transformation (Charbonneau and Tonks, supra).
[0049]
Bispecific phosphatase (DSP) is more similar to PTP than PSP. The DSP has an extended PTP activation site motif with an additional 7 amino acid residues. DSP is primarily involved in cell proliferation and includes cell cycle regulators cdc25A, cdc25B, and cdc25C. Phosphatases DUSP1 and DUSP2 inactivate MAPK family members ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase), and p38 at both tyrosine and threonine residues (PROSITE PDOC 00323, The above). In the activated state, these kinases are involved in neuronal differentiation, proliferation, cancer transformation, platelet aggregation, and apoptosis. Thus, DSP is required for proper regulation of these processes (Muda, M. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 27205-27208). The tumor suppressor PTEN is a DSP that also exhibits lipid phosphatase activity. PTEN appears to negatively regulate its interaction with the extracellular matrix and maintain apoptotic sensitivity. PTEN is thought to be involved in the prevention of angiogenesis (Giri, D. and M. Ittmann (1999) Hum. Pathol. 30: 419-424). Abnormal expression of PTEN is associated with various cancers (Tamura, M. et al. (1999) J. Natl. Cancer Inst. 91: 1820-1828).
[0050]
Histidine acid phosphatase (HAP, EXPASY EC 3.1.3.2) is also known as acid phosphatase and contains a wide range of proteins, including alkyl, aryl, acyl orthophosphates, and phosphorylated proteins at low pH. Hydrolyze the substrate. HAP shares a conserved sequence in the two regions, both located around the histidine residues involved in catalysis. Members of the HAP family include lysosomal acid phosphatase (LAP) and prostate acid phosphatase (PAP), both of which are sensitive to suppression by L-tartrate (PROSITE PDOC00538).
[0051]
LAP, an orthophosphoric monoester within endosomes / lysosomes, is a controlled gene whose activity has been detected in all tissues tested (Geier, C. et al. (1989) Eur. J. Biochem. 183: 611616). LAP-deficient mice have progressive skeletal disease and are prone to generalized seizures (Saftig, P. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 1862818635). LAP-deficient patients are known to have the following clinical features: Intermittent vomiting, hypotonia, lethargy, posterior bowing tension, peripheral bleeding, stroke, death in childhood (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) * 200950).
[0052]
PAP, a differentiation antigen specific for prostate epithelium produced by the prostate, has been used to diagnose prostate cancer. Within prostate cancer, it has been found that the enzyme activity of PAP is reduced compared to normal or benign prostatic hypertrophy cells (Foti, A.G. et al. (1977) Cancer Res. 37: 41204124). Two types of PAP have been identified, one that is secreted and one that remains intracellular. Mature secreted PAP is detected in seminal fluid and is active as a glycosylated homodimer with a molecular weight of approximately 100 KDa. Intracellular PAP exhibits intrinsic tyrosine phosphorylated protein phosphatase activity and is known to be involved in the regulation of prostate cell growth (Meng, TC and MF Lin (1998) J. Biol. Chem. 34). : 2209622104).
[0053]
Synaptojanin, an inositol phosphate phosphatase, dephosphorylates inositol phosphates at positions 3, 4, and 5 of the inositol ring. Synaptojanin is a major presynaptic protein found in endosomal intermediates clathrin-covered at nerve terminals and binds to EPS15, a protein that binds to clathrin coat. This binding is mediated by the C-terminal region of synaptojanin-170 (Asp-Pro-Phe amino acid repeat three times). Furthermore, this 3-residue repeat has been found to be the binding site for the EH domain of EPS15 (Haffner, C. et al. (1997) FEBS Lett. 419: 175-180). In addition, synaptojanins regulate the interaction between endosomal proteins and the plasma membrane and may be involved in the recycling of synaptic vesicles (Brodin, L. et al. (2000) Curr. Opin. Neurobiol. 10 : 312-320). Studies of mice that have undergone targeted disruption of the synaptojanin 1 gene (Synj1) support the more efficient formation of endosomal vesicle coats seen in wild-type mice, with Synj1 being the membrane and coat protein. It suggests that it functions as a negative adjustment of the interaction. These findings provide genetic evidence that inositol phosphate metabolism plays an important role in synaptic vesicle recycling (Cremona, O. et al. (1999) Cell 99: 179-188).
[0054]
The discovery of new kinases and phosphatases, and polynucleotides encoding them, can meet the needs of the art by providing new compositions. This novel composition is useful in the diagnosis, treatment and prevention of cardiovascular diseases, immune system diseases, neurological diseases, developmental and developmental disorders, lipid diseases, cell proliferation abnormalities and cancers, and nucleic acids of kinases and phosphatases. It is also useful for evaluating the influence of foreign compounds on the expression of sequences and amino acid sequences.
[0055]
(Summary of the Invention)
The present invention is collectively referred to as “KAP”, and individually “KAP-1”, “KAP-2”, “KAP-3”, “KAP-4”, “KAP-5”, “ KAP-6, KAP-7, KAP-8, KAP-9, KAP-10, KAP-11, KAP-12, KAP-13, KAP-14 Featuring purified polypeptides that are kinases and phosphatases called "KAP-15", "KAP-16", "KAP-17", "KAP-18", "KAP-19", and "KAP-20" To do. In certain embodiments, the invention provides: (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20; (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 A polypeptide having a natural amino acid sequence that is at least 90% identical to (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, and (d ) Provided is an isolated polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20. In one embodiment, an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-20 is provided.
[0056]
The invention also relates to (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, and (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, and (d) SEQ ID NO An isolated polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group comprising: an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having: 1-20. In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group having SEQ ID NO: 1-20. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group having SEQ ID NO: 21-40.
[0057]
The invention further comprises (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, or (d) SEQ ID NO A recombinant polynucleotide having a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group having an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having 1-20 I will provide a. In one embodiment, the present invention provides a cell transformed with a recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant comprising a recombinant polynucleotide.
[0058]
Furthermore, the present invention relates to (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20; A polypeptide comprising a natural amino acid sequence having 90% or more identity, and (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-20, and a method for producing a polypeptide selected from the group consisting of: The production method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with the recombinant polynucleotide under conditions suitable for polypeptide expression, and (b) recovering the polypeptide so expressed. The recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide.
[0059]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 A polypeptide comprising a native amino acid sequence that is identical, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (d) SEQ ID NO: 1 An isolated antibody is provided that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of -20.
[0060]
The invention further comprises (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 and at least A polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having 90% identity, (c) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), and (e) ( Provided is an isolated polynucleotide selected from the group consisting of the RNA equivalents of a) to (d). In one embodiment, the polynucleotide has at least 60 contiguous nucleotides.
[0061]
The invention further provides a method of detecting a target polynucleotide in a sample. Wherein the target polynucleotide is (a) a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 A polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity with, (c) a polynucleotide complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), and (e) A polynucleotide sequence selected from the group consisting of RNA equivalents of (a) to (d).
The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe consisting of at least 20 consecutive nucleotide groups consisting of a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; and (b) The process includes detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. The probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide or fragment thereof. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0062]
The present invention also provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Wherein the target polynucleotide is (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, (b) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to the sequence, (c) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a), (d) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (b) It has the sequence of a polynucleotide selected from the group consisting of nucleotides and RNA equivalents of (e) (a)-(d). The detection method includes: (a) a process of amplifying a target polynucleotide or fragment thereof using polymerase chain reaction amplification; and (b) detecting the presence or absence of the target polynucleotide or fragment thereof, If a fragment is present, it optionally includes the process of detecting its amount.
[0063]
The invention further provides a composition comprising an effective amount of a polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. An effective amount of a polypeptide comprises (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 and at least A polypeptide comprising a natural amino acid sequence having 90% identity, (c) a biologically active fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (d) SEQ Selected from the group consisting of immunogenic fragments of amino acid sequences selected from the group consisting of ID NO: 1-20. In one example, the composition has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20. Furthermore, the present invention provides a method of administering the composition to a patient in need of treatment for a disease or condition associated with reduced expression of functional KAP.
[0064]
The invention also provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (d) SEQ ID NO A method is provided for screening a compound to confirm the effectiveness as an agonist of a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: 1-20. The screening method includes (a) exposing a sample containing the polypeptide to a compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the present invention provides a composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the present invention provides a method for treating diseases and symptoms associated with reduced expression of functional KAP comprising administering to the patient this composition.
[0065]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (d) ) Screening certain compounds for effectiveness as antagonists of a polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 Provide a method. The screening method consists of (a) exposing a sample containing the polypeptide to a certain compound and (b) detecting antagonistic activity in the sample. In one embodiment, the present invention provides a composition comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In yet another alternative, the present invention provides a method for treating diseases and symptoms associated with overexpression of functional KAP comprising administering the composition to a patient in need of such treatment.
[0066]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, or (D) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20, a method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of provide. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under appropriate conditions; (b) detecting binding of the test compound to the polypeptide, thereby And a process of identifying a compound that specifically binds.
[0067]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, and (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20, or (d) SEQ ID NO A method is provided for screening for compounds that modulate the activity of a polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having: 1-20. The screening method includes: (a) a step of mixing a polypeptide with at least one test compound under conditions where the activity of the polypeptide is allowed; and (b) a step of calculating the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, the change in the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. Means a compound that modulates the activity of a polypeptide.
[0068]
The present invention further provides a method of screening for a compound effective to alter the expression of a target polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, comprising: Exposing a sample containing the target polynucleotide to the compound; (b) detecting a change in expression of the target polynucleotide; and c) expressing the expression of different amounts of the target polynucleotide in the presence of the compound. The screening method comprises the step of comparing with expression in the absence.
[0069]
The present invention further provides a method for calculating the toxicity of a test compound. This method includes the following processes. (A) A process of treating a biological sample having a nucleic acid group with a test compound. (B) The process of hybridizing nucleic acid groups of treated biological samples. The following probe is used in this process. (I) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, (ii) at least a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence with a polynucleotide sequence having 90% identity, a polynucleotide having a sequence complementary to (iii) (i), and (iv) complementary to the polynucleotide of (ii) A probe consisting of at least 20 contiguous nucleotide groups of a polynucleotide selected from the group consisting of polynucleotides, RNA equivalents of (v) (i) to (iv). Hybridization occurs under conditions such that a specific hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in a biological sample, the target polynucleotide comprising: (i) SEQ ID NO: A polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of 21-40, (ii) a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity with a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 (Iii) a polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of (i), (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), and (v) (i) to (iv) ) Selected from the group consisting of RNA equivalents. Alternatively, the target polynucleotide comprises a fragment of a polynucleotide sequence selected from the group consisting of (i) to (v) above, (c) a process of quantifying the amount of the hybridization complex, and (d) a treated biology. Comparing the amount of hybridization complex in the experimental sample with the amount of hybridization complex in the untreated biological sample, and the difference in the amount of hybridization complex in the treated biological sample is tested Indicates the toxicity of the compound.
[0070]
(Description of the present invention)
Before describing the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention, it is to be understood that the present invention is not limited to the particular devices, materials and methods described, but can be modified. Also, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to limit the scope of the invention which is limited only by the claims. Please also understand.
[0071]
As used in the claims and in the specification, the singular forms “a” and “its” may refer to the plural unless the context clearly dictates otherwise. You have to be careful. Thus, for example, when “a certain host cell” is described, there may be a plurality of such host cells, and when “a certain antibody” is described, one or more antibodies, and References are also made to antibody equivalents known to those skilled in the art.
[0072]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art unless otherwise defined. Although any devices, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, suitable devices, materials, and methods are now described. All publications referred to in this invention are cited for purposes of describing and disclosing cell lines, protocols, reagents and vectors that have been reported in the publication and are likely to be relevant to the present invention. is there. No disclosure in this specification is an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0073]
(Definition)
The term “KAP” is a substantially purified amino acid of KAP obtained from all species, including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant (especially mammals including cattle, sheep, pigs, mice, horses and humans). Refers to an array.
[0074]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of KAP. This agonist interacts directly with KAP or interacts with components of biological pathways involving KAP to regulate KAP activity, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compound, A composition may be included.
[0075]
The term “allelic variant” refers to another form of the gene encoding KAP. Allelic variants can be made from at least one mutation in a nucleic acid sequence. Mutant mRNA or polypeptides can also be made. Its structure or function may or may not be mutated. A gene may have no natural allelic variants or one or several natural allelic variants. The usual mutational changes that generally give rise to allelic variants are ascribed to spontaneous deletions, additions or substitutions of nucleotides. Each of these changes can occur once or several times within a given sequence, alone or together with other changes.
[0076]
An “altered” nucleic acid sequence encoding KAP has a nucleic acid sequence that deletes, inserts, or substitutes various nucleotides and yields a polypeptide that is identical to KAP or has at least one functional characteristic of KAP. . This definition includes improper or unexpected hybridization of polynucleotide sequences encoding KAP with allelic variants at positions that are not normal chromosomal loci, as well as specific oligonucleotides of polynucleotides encoding KAP It includes polymorphisms that are easily detectable or difficult to detect using a probe. The encoded protein can also be “mutated” and can include deletions, insertions or substitutions of amino acid residues that produce a silent change resulting in a functionally equivalent KAP. Intentionally based on similarity of residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphiphilicity to the extent that KAP activity is retained biologically or immunologically Amino acid substitutions can be made. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids having uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, serine and threonine. Amino acids having uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine and valine, glycine and alanine, phenylalanine and tyrosine.
[0077]
The term “amino acid” or “amino acid sequence” refers to an oligopeptide, peptide, polypeptide or protein sequence or fragment thereof and refers to a natural or synthetic molecule. As used herein, “amino acid sequence” refers to the amino acid sequence of a natural protein molecule, and “amino acid sequence” and similar terms shall limit the amino acid sequence to the complete native amino acid sequence associated with the listed protein molecule. It is not something to do.
[0078]
“Amplification” refers to the additional replication of a nucleic acid sequence. Amplification is usually performed using polymerase chain reaction (PCR) techniques well known to those skilled in the art.
[0079]
The term “antagonist” is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of KAP. Antagonists can be antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compound or composition that interacts directly with KAP or interacts with components of biological pathways in which KAP is involved to modulate the activity of KAP. And so on.
[0080]
The term “antibody” refers to intact immunoglobulin molecules and fragments thereof, such as Fab, F (ab ′) 2 and Fv fragments, that are capable of binding antigenic determinants. Antibodies that bind to KAP polypeptides can be generated using intact molecules or fragments thereof that contain small peptides that immunize antibodies. Polypeptides or oligopeptides used to immunize animals (mouse, rat, rabbit, etc.) can be derived from polypeptides or oligopeptides obtained by RNA translation or chemical synthesis. It can also be conjugated to a protein. Commonly used carriers that chemically bond with peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and mussel hemocyanin (KLH). The binding peptide is used to immunize the animal.
[0081]
The term “antigenic determinant” refers to a region of a molecule (ie, an epitope) in contact with a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, multiple regions of the protein can induce the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region or three-dimensional structure of the protein). An antigenic determinant can compete with an intact antigen (ie, an immunogen used to elicit an immune response) in binding to the antibody.
[0082]
The term “aptamer” refers to a nucleic acid or oligonucleotide that binds to a specific molecular target. Aptamersin vitro(E.g., SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment), described in US Patent No. 5,270,163), which is a target-specific approach from a large combinatorial library. Select a specific aptamer sequence. Aptamer compositions may be double-stranded or single-stranded and may include deoxyribonucleotides, ribonucleotides, nucleotide derivatives, or other nucleotide-like molecules. The nucleotide component of the aptamer is a modified sugar group (e.g., the ribonucleotide 2'-OH group is 2'-F or 2'-NH₂These sugar groups improve desirable properties such as, for example, resistance to nucleases or longer life in blood. In order to slow down the rate at which aptamers are removed from the circulatory system, aptamers can be conjugated to molecules such as high molecular weight carriers. Aptamers can be specifically cross-linked with their homologous ligands, for example by photoactivation of certain cross-linking agents (see, for example, Brody, EN and L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74: 5-13). ).
[0083]
The term “intramer”in vivoFor example, RNA expression systems based on vaccinia virus have been used to express high levels of specific RNA aptamers in the cytoplasm of leukocytes (Blind, M. et al. (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 3606-3610).
[0084]
The term “spiegelmer” refers to aptamers containing L-DNA, L-RNA or other left-handed nucleotide derivatives or nucleotide-like molecules. Aptamers containing levorotatory nucleotides are resistant to degradation by natural enzymes that normally act on substrates containing dextrorotatory nucleotides.
[0085]
The term “antisense” refers to any composition capable of base pairing with the “sense” (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Examples of antisense compositions include DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA), oligonucleotides with modified backbone linkages such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, modified sugar groups such as Oligonucleotide having 2′-methoxyethyl sugar or 2′-methoxyethoxy sugar, or oligonucleotide having modified base such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2′-deoxyguanosine There can be. Antisense molecules can be produced by any method including chemical synthesis or transcription. Complementary antisense molecules, once introduced into a cell, base pair with the natural nucleic acid sequence formed by the cell, forming a duplex that prevents transcription or translation. The expression “negative” or “minus” may refer to the antisense strand of a reference DNA molecule, and the expression “positive” or “plus” may refer to the sense strand of a reference DNA molecule.
[0086]
The term “biologically active” refers to a protein having the structural, regulatory or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, the term “immunologically active” or “immunogenic” means that natural or recombinant KAP, synthetic KAP or any oligopeptide thereof is capable of producing a specific immune response in an appropriate animal or cell. Refers to the ability to induce and bind to a specific antibody.
[0087]
The term “complementary” or “complementarity” refers to the relationship between two single stranded nucleic acids that anneal by base pairing. For example, the sequence “5′A-G-T3 ′” binds to the complementary sequence “3′T-C-A5 ′”.
[0088]
“Composition comprising a predetermined polynucleotide sequence” and “composition comprising a predetermined amino acid sequence” refer to a wide range of optional components comprising a predetermined polynucleotide sequence or amino acid sequence. The composition can include a dry formulation or an aqueous solution. A composition comprising a polynucleotide sequence encoding KAP or a fragment of KAP can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, the probe is dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS) and other components (eg, Denhart's solution, skim milk powder, salmon sperm DNA, etc.) Can be made.
[0089]
The “consensus sequence” is obtained by repeatedly analyzing the DNA sequence in order to separate unnecessary bases, and extending in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (Applied Biosystems, Foster City CA) Resequenced nucleic acid sequences, or one or more duplicates using a GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or a fragment construction computer program such as Phrap (University of Washington, Seattle WA) Refers to a nucleic acid sequence constructed from cDNA, EST, or genomic DNA fragments. Some sequences perform both extension and construction to create a consensus sequence.
[0090]
A “conservative amino acid substitution” is a substitution that is predicted to cause little loss of the properties of the original protein when the substitution is made, that is, the structure and particularly the function of the protein are preserved, and a large change due to such substitution occurs. Refers to no replacement. The table below shows the amino acids that can be substituted for the original amino acids in the protein and are recognized as conservative amino acid substitutions.

[0091]
Conservative amino acid substitutions typically include (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, eg, a β sheet or α helix structure, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) the majority of the side chain. Is retained.
[0092]
A “deletion” refers to a change in amino acid or nucleotide sequence that results in the loss of one or several amino acid residues or nucleotides.
[0093]
The term “derivative” refers to a chemical modification of a polypeptide or polynucleotide. For example, replacement of hydrogen with an alkyl group, acyl group, hydroxyl group or amino group can be included in chemical modification of the polynucleotide sequence. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one biological or immunological function of the natural molecule. Polypeptide derivatives are modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function from the polypeptide of derived origin. Polypeptide.
[0094]
“Detectable label” refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal and is covalently or non-covalently bound to a polynucleotide or polypeptide.
[0095]
“Differential expression” refers to an increase (upregulation), or a decrease (downregulation), or a deficiency in defective gene or protein expression, as determined by comparing at least two different samples. Such a comparison can be performed, for example, between a post-treatment sample and an untreated sample or a diseased state sample and a normal sample.
[0096]
“Exon shuffling” refers to the recombination of different coding regions (exons). Since one exon can represent one structural or functional domain of the encoded protein, reclassifying stable substructures allows new proteins to be assembled and new protein function evolution Can be promoted.
[0097]
The term “fragment” refers to a unique portion of a polynucleotide encoding KAP or KAP that is identical to its parent sequence but shorter in length. A fragment may have a length that is less than the total length of the defined sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have 5 to 1000 consecutive nucleotide or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes are at least 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, It can be 250 or 500 contiguous nucleotides or amino acid residue lengths. Fragments can be preferentially selected from specific regions of a molecule. For example, a polypeptide fragment can have a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or the first 25% or 50% of the polypeptide) as shown in a given sequence. These lengths are clearly given by way of example, and in the examples of the present invention may be any length supported by the specification including the sequence listing, tables and drawings.
[0098]
The fragment of SEQ ID NO: 21-40 contains a region of unique polynucleotide sequence that unambiguously identifies SEQ ID NO: 21-40, for example, different from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NO: 21-40 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 21-40 from related polynucleotide sequences. The exact length of the fragment of SEQ ID NO: 21-40 and the region of SEQ ID NO: 21-40 corresponding to the fragment can be routinely determined by one skilled in the art based on the intended purpose for the fragment .
[0099]
The fragment of SEQ ID NO: 1-20 is encoded by the fragment of SEQ ID NO: 21-40. The fragment of SEQ ID NO: 1-20 contains a unique amino acid sequence region that specifically identifies SEQ ID NO: 1-20. For example, the fragment of SEQ ID NO: 1-20 is useful as an immunoantigenic peptide for producing an antibody that specifically recognizes SEQ ID NO: 1-20. The exact length of the fragment of SEQ ID NO: 1-20 and the region of SEQ ID NO: 1-20 corresponding to the fragment can be routinely determined by one skilled in the art based on the intended purpose for the fragment .
[0100]
A “full length” polynucleotide sequence is a sequence having at least one translation start codon (eg, methionine), an open reading frame, and a translation stop codon. A “full length” polynucleotide sequence encodes a “full length” polypeptide sequence.
[0101]
The term “homology” means sequence similarity or sequence identity between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0102]
The term “percent match” or “% match” as applied to a polynucleotide sequence refers to the percentage of residues that match between at least two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm inserts gaps in a standardized and reproducible way in the sequences being compared to optimize the alignment between the two sequences, so that the two sequences can be compared more significantly.
[0103]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using CLUSTAL V algorithm default parameters such as those incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package (a set of molecular biological analysis programs) (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is described in Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153, Higgins, D.G. et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. The default parameters when aligning polynucleotide sequences pairwise are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A “weighted” residue weight table was selected as the default. CLUSTAL V reports the percent identity as the “similarity” between aligned polynucleotide sequence pairs.
[0104]
Alternatively, the National Local Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is commonly used and provides a set of free sequence comparison algorithms (Altschul, SF et al. (1990) ) J. Mol. Biol. 215: 403-410). This algorithm is available from several sources and is also available from NCBI and the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) in Bethesda, Maryland. The BLAST software suite includes a variety of sequence analysis programs, one of which is “blastn” that aligns a known polynucleotide sequence with another polynucleotide sequence obtained from various databases. In addition, a tool called “BLAST 2 Sequences”, which is used to directly compare two nucleotide sequences in a pair-wise manner, can be used. “BLAST 2 Sequences” can be used interactively by accessing http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html. The “BLAST 2 Sequences” tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are typically used with gaps and other parameters set to default settings. For example, to compare two nucleotide sequences, blastn may be performed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set as default parameters. An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
The percent identity can be measured by the full length of a defined sequence (eg, a sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, compared to a shorter length, eg, the length of a fragment derived from a defined larger sequence (eg, a fragment of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100 or 200 consecutive nucleotides). The coincidence rate may be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and using the fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, the percent identity It should be understood that the length that can be measured can be accounted for.
[0105]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of homology may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It should be understood that this degeneracy can be used to cause changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences in which all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
[0106]
The term “percent match” or “% identity” as used for a polypeptide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. Some alignment methods take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions as detailed above usually preserve the acidity and hydrophobicity of the substitution site, thus preserving the structure of the polypeptide (and thus also the function).
[0107]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as those incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see above for explanation). The default parameters for aligning polypeptide sequences in pairwise using CLUSTAL V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, “diagonals saved” = 5. Select the PAM250 matrix as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignment, CLUSTAL V reports percent identity as “similarity” between aligned polypeptide sequence pairs.
[0108]
Alternatively, the NCBI BLAST software suite may be used. For example, when making pairwise comparisons of two polypeptide sequences, one would use blastp with the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. . An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
The percent identity can be measured relative to the length of a polypeptide sequence that is fully defined (eg, defined by a particular SEQ ID NO). The percent identity can be a sequence or a fragment of a shorter length, eg, a larger defined polypeptide sequence (eg, a fragment of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70 or 150 consecutive residues). The coincidence rate may be measured in comparison with the length of. The lengths listed here are merely exemplary and may be used with fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings. It should be understood that a length can be described for which a match rate can be measured.
[0109]
“Human Artificial Chromosome (HAC)” is a linear microchromosome containing all the elements necessary for chromosomal replication, segregation and maintenance, which may contain a DNA sequence of about 6 kb (kilobase) to 10 Mb in size. .
[0110]
The term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been altered to resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0111]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms base pairs with a complementary single strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization is an indication that two nucleic acid sequences share high complementarity. Specific hybridization complexes are formed under acceptable annealing conditions and remain hybridized after the “wash” step. The washing step is particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and even more stringent conditions reduce non-specific binding (ie, binding of pairs between nucleic acid strands that are not perfectly matched). The permissive conditions for nucleic acid sequence annealing are routinely determined by those skilled in the art. The permissive conditions may be constant during the hybridization experiment, but the wash conditions can be changed during the experiment to obtain the desired stringency and thus also the hybridization specificity. Conditions that allow annealing include, for example, a temperature of 68 ° C., about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS, and about 100 μg / ml shear-denatured salmon sperm DNA.
[0112]
In general, the stringency of hybridization can be expressed to some extent relative to the temperature at which the wash step is performed. Such washing temperatures are usually selected to be about 5-20 ° C. below the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under a given ionic strength and pH. The formula for calculating Tm and hybridization conditions for nucleic acids are well known, Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, see especially chapter 9 in volume 2.
[0113]
The high stringency conditions for polynucleotide-polynucleotide hybridization of the present invention include wash conditions for 1 hour at about 68 ° C. in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Or you may carry out at the temperature of 65 degreeC, 60 degreeC, 55 degreeC, or 42 degreeC. SSC concentrations can vary in the range of about 0.1-2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, a blocking agent is used to prevent nonspecific hybridization. Such blocking agents include, for example, about 100-200 μg / ml denatured salmon sperm DNA. For example, organic solvents such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v may be used for hybridization of RNA and DNA under specific conditions. Useful variations of the wash conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, particularly under high stringency conditions. Such similarity strongly suggests a similar role for nucleotides and nucleotide-encoded polypeptides.
[0114]
The term “hybridization complex” refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. Hybridization complexes can be formed in solution (C₀t or R₀t analysis etc.). Alternatively, one nucleic acid sequence is present in a dissolved state and the other nucleic acid sequence is a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin or glass slide, or other suitable substrate that is a cell or nucleic acid thereof. Can be formed between two nucleic acid sequences that are immobilized on a substrate to which is immobilized.
[0115]
The term “insertion” or “addition” refers to a change in amino acid sequence or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0116]
"Immune response" can refer to symptoms associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious diseases or genetic diseases. These symptoms can be characterized by the expression of various factors that can affect the cellular and systemic defense systems, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules.
[0117]
The term “immunogenic fragment” refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of KAP that, when introduced into a living animal such as a mammal, causes an immune response. The term “immunogenic fragment” also includes a polypeptide or oligopeptide fragment of KAP useful herein for any antibody production method disclosed herein or well known in the art.
[0118]
The term “microarray” refers to the organization of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0119]
The term “element” or “array element” refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound having a specific designated position on a microarray.
[0120]
The term “modulation” refers to a change in the activity of KAP. By modulating, for example, the protein activity, binding properties and other biological, functional or immunological properties of KAP can be increased or decreased.
[0121]
The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that can be single-stranded or double-stranded or can represent the sense or antisense strand. Peptide nucleic acid (PNA) or any DNA-like or RNA-like substance.
[0122]
“Functionally linked” refers to a state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. When it is necessary to connect two protein coding regions within the same reading frame, in general, functionally linked DNA sequences can be very close or contiguous.
[0123]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or anti-gene agent comprising an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length, attached to the peptide backbone of amino acid residues ending in lysine. Terminal lysine provides solubility to the composition. PNA binds preferentially to complementary single-stranded DNA or RNA to stop transcription elongation and can be polyethyleneglycolized to extend the life of PNA in cells.
[0124]
“Post-translational modifications” of KAP may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of KAP and can vary with cell type.
[0125]
The “probe” is a nucleic acid sequence encoding KAP, a complementary sequence thereof, or a fragment thereof, which is used for detection of the same sequence or an allelic nucleic acid sequence, a related nucleic acid sequence. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is bound to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioactive isotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, that can be annealed to a target polynucleotide by forming complementary base pairs. The primer can then be extended along the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs can be used, for example, for amplification (and identification) of nucleic acid sequences by polymerase chain reaction (PCR).
[0126]
Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of known sequence. Longer probes and primers to increase specificity, such as probes consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 consecutive nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences; Primers may be used. Some probes and primers are much longer than this. It should be understood that any length of nucleotide as supported herein, including tables, drawings and sequence listings, can be used.
[0127]
See Sambrook, J. et al. (1989) for the preparation and use of probes and primers.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.M., et al. (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications See Academic Press, San Diego CA, etc. PCR primer pairs can be obtained from known sequences using a computer program for that purpose, such as using Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
[0128]
The selection of oligonucleotides to be used as primers is performed using software well known in the art for such purposes. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs up to 100 nucleotides each, derived from oligonucleotides and up to 5,000 larger polynucleotides, up to 32 kilobases of input polynucleotide sequences. It is also useful for analyzing. Similar primer selection programs incorporate additional functionality for extended capabilities. For example, the PrimOU primer selection program (available to the public from the Genome Center of the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) can select specific primers from the megabase sequence, and thus the entire genome range. This is useful for designing primers. The Primer3 primer selection program (available from the Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge, Mass.) Allows the user to enter a “mispriming library” that allows the user to specify a sequence to be avoided as a primer binding site. Primer3 is particularly useful for the selection of oligonucleotides for microarrays (the source code for the latter two primer selection programs can be obtained from their respective sources and modified to meet user-specific needs). The PrimerGen program (publicly available from the UK Human Genome Mapping Project in Cambridge, UK-Resource Center) designs primers based on multiple sequence alignments, thereby maximally conserving or minimally conserving aligned nucleic acid sequences Allows selection of primers that hybridize to any of the regions. This program is therefore useful for the identification of unique and conserved oligonucleotide and polynucleotide fragments. Oligonucleotide and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, eg, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0129]
As used herein, “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence that is an artificial combination of separated segments of two or more sequences. This artificial combination is often accomplished by chemical synthesis, but more commonly by artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, eg, genetic engineering techniques such as those described in Sambrook et al. (Supra). Achieved by. The term recombinant nucleic acid also includes mutant nucleic acids that simply have added, substituted, or deleted part of the nucleic acid. Often recombinant nucleic acids include nucleic acid sequences operably linked to promoter sequences. Such recombinant nucleic acids can be part of a vector that is used, for example, to transform a cell.
[0130]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid can be part of a viral vector, for example based on vaccinia virus. Such vaccinia virus can be used to inoculate a mammal and the recombinant nucleic acid is expressed to induce a protective immune response in the absence of the mammal.
[0131]
“Regulators” are nucleic acid sequences that are usually derived from untranslated regions of a gene, and include enhancers, promoters, introns, and 5 ′ and 3 ′ untranslated regions (UTRs). Regulators interact with host or viral proteins that regulate transcription, translation or RNA stability.
[0132]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label a nucleic acid, amino acid or antibody. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, color formers, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and other components known in the art.
[0133]
In this specification, the “RNA equivalent” for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as that of the reference DNA sequence, but the thymine of the nitrogenous base is replaced with uracil, and the backbone of the sugar chain is It consists of ribose instead of deoxyribose.
[0134]
The term “sample” is used in its broadest sense. Samples presumed to contain KAP, KAP-encoding nucleic acids, or fragments thereof include body fluids, extracts from cells, chromosomes isolated from cells, organelles, membranes, cells, and solutions. Genomic DNA, RNA, cDNA, tissue, tissue print, etc. present in or immobilized on a substrate.
[0135]
The terms “specific binding” and “specifically bind” refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction means that it depends on whether there is a specific structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if the antibody is specific for epitope “A”, the presence of a polypeptide comprising epitope A (ie, free, unlabeled A) in a reaction involving free label A and the antibody is: Reduce the amount of labeled A bound to the antibody.
[0136]
The term “substantially purified” refers to a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from the natural environment or isolated or separated, at least about 60%, preferably at least about 75%, most preferred refers to those without at least about 90%.
[0137]
“Substitution” is the replacement of one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0138]
The term “substrate” refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate can have various surface forms such as walls, grooves, pins, channels, holes, and the like, and polynucleotides and polypeptides are bound to the substrate surface.
[0139]
A “transcription image” or “expression profile” refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0140]
“Transformation” is the process by which foreign DNA is introduced into a recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art and can be any known sequence that inserts an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. Can be based on method. The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. Non-limiting transformation methods include viral infection, electroporation (electroporation), heat shock, lipofection and methods using a particle gun. A “transformed cell” includes a stably transformed cell that can replicate as a plasmid in which the introduced DNA replicates autonomously or as part of a host chromosome. Furthermore, cells that transiently express introduced DNA or RNA in a limited time are also included.
[0141]
As used herein, a “genetic transformant” is any organism, including but not limited to animals and plants, and one or several cells of the organism may, for example, be used in the art by human involvement. Has heterologous nucleic acid introduced by well-known transformation techniques. Nucleic acids are introduced into cells directly or indirectly by introduction into cell precursors, by planned genetic manipulation, for example, by microinjection or by introduction of recombinant viruses. The term genetic manipulation does not refer to classical crossbreeding or in vitro fertilization but to the introduction of recombinant DNA molecules. Among the genetic transformants expected in accordance with the present invention are bacteria, cyanobacteria, fungi and animals and plants. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, such as infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are well known and are given in references such as Sambrook et al. (1989) supra.
[0142]
A “variant” of a particular nucleic acid sequence is defined as a nucleic acid sequence that has at least 40% homology with the particular nucleic acid sequence over the length of one nucleic acid sequence. At that time, “blastn” is executed by using “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as default parameters. Such nucleic acid pairs are, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% for a given length, It may show 96%, 97%, 98%, 99% or more homology. Certain variants may be described, for example, as “allelic” variants (described above), “splice” variants, “species” variants or “polymorphic” variants. A splice variant may have considerable homology with a reference molecule, but will usually have more or fewer polynucleotides due to alternative splicing of exons during mRNA processing. Corresponding polypeptides may have additional functional domains or lack domains present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that differ from one another. The resulting polypeptides usually have significant amino acid homology with each other. Polymorphic variants differ in the polynucleotide sequence of a particular gene between individuals of a given species. Polymorphic variant sequences can also include “single nucleotide polymorphisms” (SNPs) that differ in one nucleotide of the polynucleotide sequence. The presence of SNPs can indicate, for example, a particular population, condition or disease propensity.
[0143]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a polypeptide sequence that has at least 40% homology to the particular polypeptide sequence throughout the length of one of the polypeptide sequences. Here, blastp is executed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameters. Such polypeptide pairs are, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% for a given length. 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
[0144]
(invention)
The present invention is based on the discovery of novel human kinases and phosphatases (KAP) and polynucleotides encoding KAP, and cardiovascular diseases, immune system diseases, nervous system diseases, developmental or developmental disorders using these compositions. , Relating to the diagnosis, treatment and prevention of lipid disorders, cell proliferation disorders and cancer.
[0145]
Table 1 summarizes the nomenclature for the full-length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlates with one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was represented by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was represented by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
[0146]
Table 2 shows the sequences with homology to the polypeptides of the present invention as identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the GenBank identification number (GenBank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score representing the match between each polypeptide and its homologue. Column 5 indicates appropriate citations where applicable and one or more annotations of the GenBank homologue, all of which are included herein by reference.
[0147]
Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues of each polypeptide. Columns 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the GCG sequence analysis software package MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI). Column 6 shows the amino acid residues that include the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for the analysis of the structure / function of the protein, and the relevant part further shows a searchable database used for the analysis method.
[0148]
Tables 2 and 3 together summarize the properties of each polypeptide of the present invention, which establishes that the claimed polypeptides are kinases and phosphatases. For example, SEQ ID NO: 1 has been shown by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 79% identity with the rat protein tyrosine phosphatase TD14 (GenBank ID g3598974). (See Table 2) The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 1 also has a protein tyrosine phosphatase domain, which searches for a statistically significant match in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM). It has been determined. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further confirmatory evidence that SEQ ID NO: 1 is a protein tyrosine phosphatase.
[0149]
In yet another example, SEQ ID NO: 3 isFagus sylvatica Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) was shown to have 34% identity with the protein phosphatase 2C (PP2C, GenBank ID g7768151). (See Table 2) The BLAST probability score is 6.4e-17, indicating the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 3 also has 45% identity with the predicted nematode PP2C (GenBank ID g2804429) according to BLAST analysis, with a probability score of 2.4e-71. SEQ ID NO: 3 also has a protein phosphatase 2C domain, which searches for statistically significant matches in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM). It has been determined. (See Table 3) Data from BLIMPS analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 3 is protein phosphatase 2C.
[0150]
In another example, SEQ ID NO: 5 has 25% identity to human protein kinase PAK5 (GenBank ID g7649810) as identified by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). (See Table 2) The BLAST probability score is 7.2e-14, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 5 also has a eukaryotic protein kinase domain, which looks for a statistically significant match in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM) Was decided. (See Table 3) TMAP analysis data and BLIMPS and BLAST analysis of the PRODOM and DOMO databases provide further proof that SEQ ID NO: 5 is a membrane-bound kinase.
[0151]
In yet another example, SEQ ID NO: 6 has an amino acid residue of 1511 in length and has 97% identity with human MEK kinase I (GenBank ID g2815888) over 1494 residues, Determined by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (see Table 2). The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 6 also has a eukaryotic protein kinase domain, which searches for statistically significant matches in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM) Was decided. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 6 is a protein kinase.
In another example, SEQ ID NO: 9 was confirmed by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 87% identical to mouse protein kinase (GenBank ID g406058)). (See Table 2) The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 9 also has a eukaryotic protein kinase domain and a PDZ domain, which is statistically significant in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM). Determined by searching for matches. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 9 is a protein kinase.
[0152]
In another example, SEQ ID NO: 16 has 61% identity to human mitogen-activated kinase kinase kinase 5 (GenBank ID g1679668) as identified by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). (See Table 2) The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 16 also has a eukaryotic protein kinase domain, which searches for statistically significant matches in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM) Was decided. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 16 is a mitogen-activated protein kinase kinase kinase.
[0153]
In another example, SEQ ID NO: 18 was confirmed by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 83% identical to mouse protein kinase (GenBank ID g406058) from residues 4 to 372. (See Table 2) The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 18 also has a eukaryotic protein kinase domain and a PDZ domain, which is statistically significant in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM). Determined by searching for matches. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 18 is a serine / threonine protein kinase.
[0154]
For example, SEQ ID NO: 19 is 95 to 95 from residues M1 to V988 in rat myotonic dystrophy kinase-related Cdc42 binding kinase (GenBank ID g2736151) as determined by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). % Identical (see Table 2). The BLAST probability score is 0.0, which indicates the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 19 also has a protein kinase C-terminal domain and a eukaryotic protein kinase domain, which is a statistically significant PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM). Was determined by searching for significant matches. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and additional BLAST analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 19 is a protein kinase.
[0155]
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-15, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 20 were analyzed and annotated in the same way I put it on. Table 7 describes the algorithms and parameters for the analysis of SEQ ID NO: 1-20.
[0156]
As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequences of the present invention were assembled using cDNA sequences, or coding (exon) sequences derived from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Column 1 shows the polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte ID) for each polynucleotide of the invention, and the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Yes. Column 2 identifies the construction of the full-length polynucleotide sequence of the present invention, as well as the polynucleotide sequence associated with, for example, SEQ ID NO: 21-40 or SEQ ID NO: 21-40. The cDNA and / or genomic sequence starting nucleotide (5 ′) and ending nucleotide (3 ′) positions of fragments of polynucleotide sequences useful for hybridization or amplification techniques to distinguish them from 21-40 are indicated.
[0157]
The polynucleotide fragment listed in column 2 of Table 4 specifically refers to Incyte cDNA, eg, derived from a tissue specific cDNA library or from a pooled cDNA library. Alternatively, the polynucleotide fragment in column 2 may refer to a GenBank cDNA or EST that contributes to the assembly of the full-length polynucleotide sequence. In addition, the polynucleotide fragment in column 2 can identify sequences derived from the ENSEMBL (The Sanger Centre, Cambridge, UK) database (ie, sequences containing the “ENST” designation). Alternatively, the polynucleotide fragments in row 2 may be derived from the NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records database (i.e., sequences containing the designation `` NM '' or `` NT ''), and NCBI RefSeq Protein Sequence Records (i.e., `` NP ''). In some cases, it may be derived from a sequence including nomenclature. Alternatively, the polynucleotide fragments in row 2 may refer to a collection of both cDNA and Genscan predicted exons joined together by an “exon-stitching” algorithm. For example, FL_XXXXXX_N<sub>1</sub>_N<sub>2</sub>_YYYYY_N<sub>Three</sub>_N<sub>Four</sub> The polynucleotide sequence identified as is a “stitched” sequence, where XXXXXX is the identification number of the cluster of sequences to which the algorithm is applied, YYYYY is the number of predictions that the algorithm produces, N<sub>1,2,3 ...</sub>Represents a specific group of exons that were manually edited during the analysis (Example 5reference). Alternatively, the polynucleotide fragments in column 2 refer to a collection of exons joined together by an “exon-stretching” algorithm. For example, the polynucleotide sequence identified as FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N is a “stretch” sequence. Where XXXXXX is the Incyte project identification number, gAAAAA is the GenBank identification number of the human genome sequence to which the `` exon stretching '' algorithm is applied, gBBBBB is the GenBank or NCBI RefSeq identification number of the closest GenBank protein homolog, and N is a specific number Is an exon (Example 5See). When a RefSeq sequence is used as a protein homologue of the “exon stretching” algorithm, the RefSeq identifier (labeled “NM”, “NP” or “NT”) is replaced by the GenBank identifier (ie gBBBBB) Sometimes used.
[0158]
Alternatively, the prefix code identifies a constituent sequence that has been manually edited, predicted from a genomic DNA sequence, or derived from a combination of sequence analysis methods. The following table lists the constituent sequence prefix codes and examples of how to analyze the same sequences associated with the prefix codes (see Examples 4 and 5).

[0159]
In some cases, an Incyte cDNA coverage that overlapped with the sequence coverage shown in Table 4 was obtained to confirm the final consensus polynucleotide sequence, but the associated Incyte cDNA identification number was not shown.
[0160]
Table 5 shows a representative cDNA library for full-length polynucleotide sequences constructed using Incyte cDNA sequences. A representative cDNA library is the Incyte cDNA library that is most frequently represented by the Incyte cDNA sequences used to construct and confirm the polynucleotide sequences described above. The tissues and vectors used to construct the cDNA library are shown in Table 5 and described in Table 6.
[0161]
The present invention also includes variants of KAP. Preferred KAP variants have at least one functional or structural characteristic of KAP and have at least about 80% amino acid sequence identity or at least about 90% amino acid sequence identity to the KAP amino acid sequence. And at least about 95% amino acid sequence identity.
[0162]
The present invention also provides a polynucleotide encoding KAP. In certain embodiments, the present invention comprises a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 encoding KAP. The polynucleotide sequence of SEQ NO ID: 21-40 has an equivalent RNA sequence as shown in the sequence listing, but the appearance of the nitrogen base thymine is replaced by uracil, and the sugar backbone is not ribose but deoxyribose. It is configured.
[0163]
The present invention also includes variant sequences of polynucleotide sequences encoding KAP. In particular, such a variant sequence of the polynucleotide sequence is at least about 70% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide sequence encoding KAP, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, and even at least about Has as much as 95% polynucleotide sequence identity. Certain embodiments of the present invention have at least about 70% polynucleotide sequence identity with a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, Provides a mutated sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 with at least about 95% polynucleotide sequence identity. Any of the polynucleotide variants described above encodes an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of KAP.
[0164]
Additionally or alternatively, the polynucleotide variants of the invention are splice variants of the polynucleotide sequence encoding KAP. A splice variant may have a portion with high sequence homology to a polynucleotide sequence encoding KAP, but the number of nucleotides is increased due to the addition or deletion of sequence blocks resulting from alternative splicing of exons during mRNA processing. Become or be less. A splice variant may have a polynucleotide sequence homology of less than about 70%, alternatively about 60%, or less than about 50% with the polynucleotide sequence encoding KAP for its entire length, but some portion of the splice variant may be KAP The polynucleotide sequence homology with a portion of the polynucleotide sequence encoding is at least about 70%, alternatively at least about 85%, alternatively at least 95%, alternatively 100%. Each of the splice variants described above encodes an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of KAP.
[0165]
Those skilled in the art will recognize that various polynucleotide sequences encoding KAP that may be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequence of any known gene that occurs in nature. Will understand. Thus, the present invention can cover all possible polynucleotide sequence variants that can be produced by selection of combinations based on possible codon selection. These combinations are based on the standard triplet genetic code applied to the natural KAP polynucleotide sequence and all mutations are considered to be clearly disclosed.
[0166]
Nucleotide sequences encoding KAP and variants thereof are generally hybridizable to the nucleotide sequence of natural KAP under appropriately selected stringent conditions, but include, for example, non-natural codons. It may be advantageous to create a nucleotide sequence that encodes KAP or a derivative thereof having codons of different usage. Codons can be selected to increase the expression rate of peptides generated in a particular eukaryotic or prokaryotic host based on the frequency with which the host utilizes a particular codon. Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding KAP and its derivatives without changing the encoded amino acid sequence is that RNA transcription with favorable properties such as longer half-lives than transcripts made from the native sequence It is in making things.
[0167]
The present invention also includes the creation of DNA sequences encoding KAP and its derivatives or fragments thereof entirely by synthetic chemistry. After production, the synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations into sequences encoding KAP or any fragment thereof.
[0168]
The present invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under the various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NO: 21-40 and fragments thereof ( For example, see Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511, etc.). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in “Definitions”.
[0169]
Methods for DNA sequencing are known in the art, and any embodiment of the present invention can be performed using DNA sequencing methods. Enzymes can be used for the DNA sequencing method, such as Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ). ) Can be used. Alternatively, polymerases and proofreading exonucleases can be used in combination, as seen, for example, in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). Preferably, sequence preparation is automated using equipment such as the MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), the PTC200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA), and the ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems). The sequencing is then performed using the ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other methods well known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg Ausubel, F.M. (1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7 units, Meyers, R.A. (1995)Molecular Biology and BiotechnologyWiley VCH, New York NY, pages 856-853).
[0170]
Nucleic acid sequences encoding KAP are extended using partial nucleotide sequences in various ways based on PCR methods well known in the art to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. For example, restriction site PCR, one of the methods that can be used, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (see, for example, Sarkar, G. (1993 (See PCR Methods Applic. 2: 318322.) Another method is reverse PCR, which amplifies an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is obtained from a restriction enzyme fragment containing a known genomic locus and its surrounding sequences (for example, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). A third method is a capture PCR method. This involves a method for PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosome DNA. (See Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-119). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region using a plurality of restriction enzyme digestion and ligation reactions before PCR. Other methods that can be used to search for unknown sequences are known in the art (see Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060, etc.). In addition, genomic DNA can be walked using PCR, nested primers and PromoterFinder ™ library (Clontech, Palo Alto CA). This procedure is useful for finding intron / exon junctions without having to screen the library. For all PCR-based methods, using commercially available software such as OLIGO 4.06 primer analysis software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, about 22-30 nucleotides in length, containing GC Primers can be designed to anneal to the template at a rate of about 50% or greater and at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
[0171]
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that are size-selected to contain larger cDNAs. In addition, random primer libraries often contain sequences having the 5 ′ region of the gene and are suitable for situations in which an oligo d (T) library cannot produce a full-length cDNA. Genomic libraries may be useful for extending sequences into the 5 ′ non-transcribed regulatory region.
[0172]
Commercially available capillary electrophoresis systems can be used to analyze the size of the sequencing or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing is a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera to be used. The output / light intensity can be converted to an electrical signal using suitable software (Applied Biosystems GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR, etc.). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
[0173]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding KAP or a fragment thereof can be cloned into a recombinant DNA molecule to express KAP, a fragment or functional equivalent thereof in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, other DNA sequences are created that encode substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences, and these sequences can be used for expression of KAP.
[0174]
To alter the sequence encoding KAP for various purposes, the nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods generally known in the art. This purpose includes, but is not limited to, gene product cloning, processing and / or regulation of expression. It is possible to recombine nucleotide sequences using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, site-directed mutagenesis via oligonucleotides can be used to introduce mutations that create new restriction sites, change glycosylation patterns, change codon preference, generate splice variants, and the like.
[0175]
Nucleotides of the present invention are described in MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA. US Pat. No. 5,837,458, Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797, Christians, FC et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264, Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319) and the like, and the biological properties of KAP, such as biological activity, Enzymatic force or binding force with other molecules or compounds can be changed or improved. DNA shuffling is a process of creating a library of gene variants using PCR-mediated recombination of gene fragments. The library is then subjected to selection or screening to identify the gene variant with the desired properties. These suitable variants may then be pooled and further repeated for DNA shuffling and selection / screening. Therefore, various genes are created by artificial breeding and rapid molecular evolution. For example, single gene fragments with random point mutations can be recombined and screened and then shuffled until the desired properties are optimized. Alternatively, recombination of a given gene with a homologous gene from the same gene family, either from the same species or from a different species, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a directed and controllable manner be able to.
[0176]
According to another embodiment, the sequence encoding KAP can be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH et al. (1980) Nucl. Acids Res). Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Symp. Ser. 7: 225-232). Alternatively, chemical methods can be used to synthesize KAP itself or fragments thereof. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid phase or solid phase techniques (Creighton, T. (1984)Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60, Roberge, J.Y. et al. (1995) Science 269: 202204). Automated synthesis can be achieved using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems). In addition, the amino acid sequence of KAP or any part thereof may be mutated by direct synthesis modifications and / or in combination with other protein groups or sequences from any part thereof. Alternatively, it is possible to produce a polypeptide having a natural polypeptide sequence.
[0177]
This peptide can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (see, for example, Chiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see, for example, Creighton, pages 28-53 above).
[0178]
In order to express biologically active KAP, a nucleotide sequence encoding KAP or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the elements necessary for the control of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These factors include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and expression-inducible promoters, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions in polynucleotide sequences encoding vectors and KAP. Such elements vary in length and specificity. Depending on the specific initiation signal, it is possible to achieve a more effective translation of the sequence encoding KAP. Such signals include the ATG initiation codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding KAP and its initiation codon and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no further transcriptional or translational control signals will be required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal containing the in-frame ATG start codon should be included in the expression vector. Exogenous translation elements and initiation codons can originate from a variety of natural and synthetic products. Inclusion of enhancers suitable for the particular host cell system used can increase the efficiency of expression (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162. reference).
[0179]
Methods which are well known to those skilled in the art can be used to generate expression vectors containing sequences encoding KAP, suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods includein vitroRecombinant DNA technology, synthesis technology, andin vivoIncludes genetic engineering techniques (eg Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; and Ausubel, F.M. et al. (1995)Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, New York NY, ch. See chapters 9, 13 and 16.).
[0180]
A variety of expression vector / host systems may be utilized to retain and express the sequence encoding KAP. Such expression vector / host systems include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vectors, and yeast transformed with yeast expression vectors. Or transformed with an insect cell line infected with a viral expression vector (eg baculovirus), a viral expression vector (eg cauliflower mosaic virus, CaMV or tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (eg Ti plasmid or pBR322 plasmid) Plant cell lines and animal cell lines (see Sambrook, supra, Ausubel, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6: 307- 311;; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196, Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3655-3659, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355 etc.) Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression from various bacterial plasmids Vectors can be used to transport nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. 5 (6): 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, RM et al. (1985) Nature 317 (6040): 813-815; McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389: 239-242 etc.). The present invention is not limited by the host cell used.
[0181]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for polynucleotide sequences encoding KAP. For example, routine cloning, subcloning, propagation of polynucleotide sequences encoding KAP can be accomplished using multifunctional E. coli vectors such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or PSPORT1 plasmid (Life Technologies). Ligation of the KAP-encoding sequence at the many cloning sites of the vector destroys the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method for the identification of transformed bacteria containing recombinant molecules. Furthermore, these vectors are in the cloned sequencein vitroIt may also be useful for transcription, dideoxy sequencing, single-stranded rescue with helper phage, generation of nested deletions (eg, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264). : 55035509). For example, when a large amount of KAP is required for antibody production or the like, a vector that induces KAP expression at a high level can be used. For example, vectors containing a strong inducible SP6 bacteriophage promoter or an inducible T7 bacteriophage promoter can be used.
[0182]
YAP expression systems can be used to produce KAP. Numerous vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, and PGH promoter are budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) or Pichia yeast (Pichia pastoris )Can be used. In addition, such vectors induce either secretion of the expressed protein or retention into the cell and incorporate foreign sequences into the host genome for stable growth. (See, eg, Ausubel, 1995, supra, Bitter, G.A. et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544, and Scorer. C. A. et al. (1994) Bio / Technology 121-181-184.).
[0183]
It is also possible to express KAP using plant systems. Transcription of the KAP-encoding sequence can be accomplished by viral promoters such as CaMV-derived 35S and 19S as used alone or in combination with omega leader sequences from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). Promoted by a promoter. Alternatively, a plant promoter such as a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (for example, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224 : 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105) These constructs can be transformed into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. It can be introduced in. ("Maglow Hill Science and Technology Yearbook" (The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, see pages 191-196).
[0184]
In mammalian cells, a number of virus-based expression systems can be utilized. In cases where an adenovirus is used as an expression vector, sequences encoding KAP may be ligated into an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. It is possible to obtain infectious viruses that express KAP in host cells by insertion into the nonessential E1 or E3 region of the viral genome (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. Proteins can also be expressed at high levels using vectors based on SV40 or EBV.
[0185]
Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to transport larger fragments of DNA than those contained in and expressed from plasmids. For therapy, approximately 6 kb to 10 Mb of HAC has been made and delivered by conventional delivery methods (liposomes, polycation amino polymers, or vesicles) (eg, Harrington. JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355.)
[0186]
In order to produce recombinant proteins in mammalian systems over a long period of time, stable expression of KAP in cell lines is desirable. For example, it is possible to transform a group of sequences encoding KAP into a group of cell lines using an expression vector group. Such expression vectors may have the viral origin of replication factors and / or endogenous expression factors and certain selectable marker genes on the same vector or on different vectors. After the introduction of the vector, the cells can be grown for about 1-2 days in enhanced medium before being transferred to the selective medium. The purpose of the selectable marker is to provide resistance to the selection medium, and the presence of the selectable marker allows the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate to the cell type.
[0187]
Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. Such a selection system is not limited to tk⁻Herpes simplex virus thymidine kinase gene used for cells and apr⁻There are herpes simplex virus adenine phosphoribosyltransferase genes used for cells (eg, Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823. See). Moreover, tolerance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection. For example, dhfr provides resistance to methotrexate, neo provides resistance to aminoglycoside neomycin and G-418, als provides resistance to chlorsulfuron, and pat provides resistance to phosphinothricin acetyltransferase (Wigler, M. (See 1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 35673570; ColbereGarapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 114, etc.) Other selectable genes such as metabolism TrpB and hisD, which alter the cell requirements for, have been described in the literature (see, eg, Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 80478051). For example, anthocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. These markers can be used not only to identify transformants, but also to quantify transient or stable protein expression due to specific vector systems (Rhodes, CA (1995) Methods Mol. Biol 55: 121131 etc.).
[0188]
Even if the presence / absence of marker gene expression suggests the presence of the target gene, the presence and expression of the gene may need to be confirmed. For example, if a sequence encoding KAP is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding KAP can be identified by the lack of marker gene function. Alternatively, a marker gene can be placed in tandem with a sequence encoding KAP under the control of one promoter. Expression of a marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of a tandem gene.
[0189]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding KAP and that express KAP can be identified using a variety of methods well known to those of skill in the art. These methods include protein-biological, including DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR methods, membrane systems for the detection and / or quantification of nucleic acids or proteins, solution-based, or chip-based techniques. This includes but is not limited to test methods or immunological assays.
[0190]
Immunological methods for detecting and measuring the expression of KAP using specific polyclonal or specific monoclonal antibodies are known in the art. Examples of such techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence activated cell sorting (FACS), and the like. A two-site, monoclonal-based immunoassay using a monoclonal antibody that reacts with two non-interfering epitopes on KAP is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990)Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV, Coligan, J. E. et al. (1997)Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J.D. (1998)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ, etc.).
[0191]
A wide variety of labeling and conjugation methods are known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization probes or PCR probes to detect sequences related to PCR-encoding polynucleotides include oligo-labeled, nick-translated, end-labeled, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding KAP, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating mRNA probes. Such vectors are known in the art and are commercially available, with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides,in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. Such a method can be carried out using various kits commercially available from, for example, Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison WI), U.S. Biochemical and the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, color formers, and the like.
[0192]
Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding KAP are cultured under conditions suitable for expression and recovery of the protein in cell culture media. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence used, the vector, or both. One skilled in the art will appreciate that an expression vector comprising a polynucleotide encoding KAP can be designed to include a signal sequence that directs secretion of KAP across prokaryotic and eukaryotic membranes.
[0193]
Furthermore, selection of host cell lines may be made by their ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired form. Such polypeptide modifications include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation and acylation. Post-translational processing that cleaves the “prepro” or “pro” form of the protein can be used to identify induction, folding and / or activity of the protein to the target. Various host cells (eg CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) with unique cellular equipment and characteristic mechanisms for post-translational activity are obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) It is possible and can be chosen to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0194]
In another embodiment of the invention, the natural, altered, or recombinant nucleic acid sequence encoding KAP is linked to a heterologous sequence that results in translation of the fusion protein of any of the above host systems. . For example, a chimeric KAP protein containing a heterologous moiety recognized by a commercially available antibody facilitates the screening of peptide libraries for inhibitors of KAP activity. Also, heterologous protein portions and heterologous peptide portions can facilitate the purification of fusion proteins using commercially available affinity substrates. Such moieties include, but are not limited to, glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelate resins allow for purification of cognate fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, if the fusion protein contains a proteolytic cleavage site between the sequence encoding KAP and the heterologous protein sequence, KAP can be cleaved from the heterologous portion after purification. Fusion protein expression and purification methods are described in Ausubel (1995) chapter 10 above. Various commercially available kits can also be used to facilitate the expression and purification of the fusion protein.
[0195]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract system (Promega) is used.in vitroIt is possible to synthesize radiolabeled KAP. These systems couple the transcription and translation of protein coding sequences operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation is for example³⁵Occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0196]
A compound that specifically binds to KAP can be screened using the KAP of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to KAP. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg receptors) or small molecules.
[0197]
In one example, the compound thus identified is closely related to a natural ligand of KAP, such as a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, a compound may be closely related to the natural receptor to which KAP binds, or at least some fragment of the receptor, such as the ligand binding site. In either case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one example, screening for such compounds includes the production of suitable cells that express KAP as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila, or E. coli. Cells expressing KAP or cell membrane fragments containing KAP are contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either KAP or the compound.
[0198]
Some assays simply allow the test compound to be conjugated experimentally to the polypeptide and the binding detected by a fluorescent dye, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay may comprise mixing at least one test compound with KAP in solution or immobilized on a solid support and detecting binding of KAP to the compound. Alternatively, detection and measurement of test compound binding in the presence of labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed using cell-free reconstituted specimens, chemical libraries or natural product mixtures where the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0199]
The KAP of the present invention or a fragment thereof can be used to screen for a compound that modulates the activity of KAP. Such compounds include agonists, antagonists, partial agonists, inverse agonists, and the like. In one embodiment, the assay is performed under conditions that permit KAP activity, wherein the assay comprises mixing at least one test compound with KAP and determining the activity of KAP in the presence of the test compound in the absence of the test compound. Compare with KAP activity. A change in the activity of KAP in the presence of the test compound suggests the presence of a compound that modulates the activity of KAP. In another embodiment, the test compound comprises KAP under conditions suitable for KAP activity.in vitroAlternatively, the assay is performed by mixing with a cell-free reconstitution system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of KAP can bind indirectly and need not be in direct contact with the test compound. At least one or more test compounds can be screened.
[0200]
In another embodiment, homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells) is used to “knock out” a polynucleotide encoding KAP or a mammalian homolog thereof in an animal model system. Such techniques are well known in the art and are useful for the production of human disease animal models (see US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337, etc.). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from early mouse embryos and can be grown in media. This ES cell is transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. Alternatively, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system, and the target gene is knocked out in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002; Wagner, KU et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). Transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected from, for example, the C57BL / 6 mouse strain. A blastocyst is surgically introduced into a pseudopregnant female, the inherited traits of the resulting chimeric progeny are determined and crossed to create a heterozygous or homozygous system. The genetically modified animals thus prepared can be examined with potential therapeutic agents and toxic substances.
[0201]
Polynucleotide encoding KAPin vitroCan be manipulated in ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight separate cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate, for example, into neural cells, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, J.A. et al. (1998) Science 282: 1145-1 147).
[0202]
Polynucleotides encoding KAP can be used to create “knock-in” humanized animals (pigs) or transgenic animals (mouse or rat) modeled on human disease. Using knock-in technology, a region of the polynucleotide encoding KAP is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. Transformed cells are injected into blastula and transplanted as described above. Study genetically modified progeny or inbred lines and process with potential medicines to get information on the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress KAP, such as secreting KAP into milk, can also be a convenient source of protein (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4: 55-74).
[0203]
(Treatment)
There are chemical and structural similarities, for example in sequence and motif content, between certain regions of KAP and those of kinases and phosphatases. Furthermore, it shows in Table 6 as an example of the tissue which expresses KAP. Therefore, KAP is thought to be involved in cardiovascular diseases, immune system diseases, neurological diseases, diseases affecting development and development, lipid disorders, cell overgrowth and cancer. In the treatment of diseases associated with increased KAP expression or activity, it is desirable to reduce KAP expression or activity. Also, in the treatment of diseases associated with decreased KAP expression or activity, it is desirable to increase KAP expression or activity.
[0204]
Thus, in certain embodiments, it is possible to administer KAP or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of diseases associated with decreased KAP expression or activity. Examples of such diseases include, but are not limited to, cardiovascular diseases such as arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombus Phlebitis and vein thrombosis, vascular tumor, complication of thrombolysis, balloon angioplasty, vascular replacement, bypass surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina, myocardial infarction, hypertensive heart disease, degeneration Valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral valve prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infective endocarditis, nonbacterial thrombus Endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease, and heart transplant complications, congenital lung abnormalities Pulmonary dilatation, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism Pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, angiosclerosis, obstructive pulmonary disease, restrictive pulmonary disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral Pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilia obstructive bronchiolitis ―Pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary hemorrhage syndrome, Goodpasture syndrome, idiopathic pulmonary hematosis, pulmonary comorbid collagen disease, lung tumor, inflammation Include immune and non-inflammatory pleural effusions, pneumothorax, pleural tumors, drug-induced lung disease, lung disease due to radiation, and complications of lung transplantation. Immunological diseases include acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Addison disease , Adult breathing Distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune multiglandular endocrine candidal ectoderm dystrophy ( (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes mellitus, emphysema, lymphotoxin transient lymphopenia, fetal erythroblastosis, erythema nodosum, atrophy Gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis , Osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, all Systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitic infection, protozoal infection, helminth infection , Trauma, and nervous system diseases include epilepsy, ischemic cerebrovascular disorder, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, muscle Atrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, Brain abscess, subdural abscess, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system disease, prion disease (Kool, Kreuzfeld-Jakob disease, Gerstman syndrome, And And Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), fatal familial insomnia, neurotrophic and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebelloretinal hemangioblastomatosis, cerebral trigeminal nerve Central nervous system mental retardation and other developmental disorders, including vascular syndrome, Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord disorders, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, peripheral nerve diseases Dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine, and addictive myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, psychosis (moodness, anxiety disorder, schizophrenia), Seasonal disorder (SAD), inability to sit still, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, schizophrenic mental disorder, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease Includes epidemic supranuclear palsy, cerebral cortex basal ganglia degeneration, and familial frontotemporal amnesia, and among developmental and developmental disorders are actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis , Bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, tubular acidosis, anemia , Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonadal dysplasia, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary abnormalities, mental retardation), Smith-Magenis syndrome syndrome), spinal dysplasia syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoses, hereditary neuropathies such as Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, Syndenham choreography Included are seizure disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephalopathy, cranial spinal spondylosis, congenital glaucoma, cataract, sensory nerve loss, and lipid abnormalities include fatty liver, Cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, carnitine palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deminase deficiency, hypertriglyceridemia, Fabry lipid and other lipid storage diseases, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic White matter dystrophy, Adrenal white matter dystrophy, G_{M 2}Gangliosidosis, ceroid lipofuscinosis, β-lipoproteinemia, Tangier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous lipohistitis, disseminated adipose tissue necrosis , Painful steatosis, lipoid adrenal hyperplasia, lipoid nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid Dysfunction, nephropathy, liver disease, lecithin-cholesterol acyltransferase deficiency, cerebral tendon xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia , Lipid myopathy, obesity, and cell proliferation abnormalities include actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, Combined connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and Teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate , Salivary glands, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, leukemias such as multiple myeloma and lymphomas such as Hodgkins disease.
[0205]
In another embodiment, a vector capable of expressing KAP or a fragment or derivative thereof is administered to a patient to treat or prevent diseases associated with decreased KAP expression or activity, including but not limited to the diseases described above. It is also possible to do.
[0206]
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified KAP for the treatment or prevention of diseases associated with decreased KAP expression or activity, including but not limited to the diseases described above. It is also possible to administer to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0207]
In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of KAP may be administered to a patient to treat or prevent diseases associated with decreased expression or activity of KAP, including but not limited to those described above. Is possible.
[0208]
In a further embodiment, the patient can be administered an antagonist of KAP for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of KAP. Examples of such diseases include, but are not limited to, the cardiovascular diseases, immune system diseases, neurological diseases, developmental or developmental disorders, lipid disorders, abnormal cell proliferation and cancer described above. In one embodiment, an antibody that specifically binds to KAP can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism that delivers the drug to cells or tissues that express KAP.
[0209]
In another embodiment, a complementary sequence of a polynucleotide encoding KAP is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of KAP, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the vector to the patient.
[0210]
In another example, any protein, antagonist, antibody, agonist, complementary sequence, or vector of the invention can be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy can be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. When combined with a therapeutic agent, it can provide a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. By using this method, it is possible to increase the pharmaceutical effect with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
[0211]
Antagonists of KAP can be produced using methods generally known in the art. Specifically, it is possible to produce antibodies using purified KAP or screen a library of therapeutic agents to identify those that specifically bind to KAP. KAP antibodies can also be produced using methods generally known in the art. Such antibodies may include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are usually suitable for therapy.
[0212]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are immunized by injection of KAP or any fragment, or oligopeptides with immunogenic properties. Can be done. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, and surface activity such as lysolecithin, pluronic polyol, polyanion, peptide, oil emulsion, mussel hemocyanin, dinitrophenol, etc. There are drugs. Among adjuvants used in humans, BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0213]
The oligopeptide, peptide, or fragment used to elicit antibodies against KAP consists of at least about 5 amino acids, generally about 10 or more amino acids. These oligopeptides, peptides or fragments are preferably identical to part of the amino acid sequence of the natural protein. A short section of the amino acid group of KAP can be fused with the sequence of another protein such as KLH to produce an antibody against the chimeric molecule.
[0214]
Monoclonal antibodies against KAP can be made using any technique that produces antibody molecules by continuous cell lines in the culture medium. Such technologies include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497, Kozbor, D. et al. (1985) .J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62 : 109-120 etc.).
[0215]
Furthermore, techniques developed for the production of “chimeric antibodies” such as splicing mouse antibody genes into human antibody genes can be used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity. . (Eg Morrison, SL et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 68516855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452-454). Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies are applied using methods well known in the art to produce KAP-specific single chain antibodies. Antibodies with related specificity but different idiotype composition can also be generated by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries (Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10134). -10137 etc.).
[0216]
Antibody production in lymphocyte populationsin vivoIt can also be done by induction of production or by screening immunoglobulin libraries or panels of highly specific binding reagents as disclosed in the literature. (See Orlando, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0217]
Antibody fragments with specific binding sites for KAP can also be produced. For example, without limitation, such fragments include F (ab ′) produced by pepsin digestion of antibody molecules.₂ Fragment and F (ab ')₂ And Fab fragments made by reducing the disulfide bridges of the fragments. Alternatively, by producing a Fab expression library, it is possible to quickly and easily identify a monoclonal Fab fragment having a desired specificity (see Huse, WD et al. (1989) Science 246: 1275-1281). .
[0218]
A variety of immunoassays can be screened to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding assays, or immunoradiometric assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are well known in the art. Such immunoassays usually involve the measurement of complex formation between KAP and its specific antibody. Two-site monoclonal-based immunoassays that use monoclonal antibodies reactive against two non-interfering KAP epitopes are commonly used, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).
[0219]
Various methods such as Scatchard analysis in conjunction with radioimmunoassay techniques are used to assess the affinity of antibodies for KAP. The affinity is expressed by the binding constant Ka, which is a value obtained by dividing the molar concentration of the KAP antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The Ka of a polyclonal antibody drug that has a heterogeneous affinity for a number of KAP epitopes represents the average affinity or binding activity of the antibody to KAP. The Ka of a monoclonal antibody reagent that is monospecific for a particular KAP epitope represents a true measure of affinity. Ka value is 10⁹-10¹²A liter / mol high affinity antibody drug is preferably used in an immunoassay where the KAP antibody complex must withstand harsh manipulations. Ka value is 10⁶-10⁷A liter / mol low affinity antibody reagent is preferably used for immunopurification and similar processes where KAP must eventually dissociate from the antibody in an activated state (Catty, D. (1988).Antibodies, Volume I: A Practical ApproachIRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0220]
The antibody titer and binding activity of the polyclonal antibody reagent can be further evaluated to determine the quality and suitability of such a reagent for certain applications used later. For example, polyclonal antibody medicaments containing at least 1-2 mg / ml of a specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of a specific antibody are generally used in processes where the KAP antibody complex must be precipitated. Antibody specificity, antibody titer, binding activity, and guidelines for antibody quality and use in various applications are generally available (see, for example, Catty literature, Coligan et al. Above).
[0221]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding KAP, or any fragment or complementary sequence thereof, can be used for therapeutic purposes. In certain embodiments, gene expression can be altered by designing sequences and antisense molecules (DNA and RNA, PNA, modified nucleotides) complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding KAP. Such techniques are well known in the art, and sense oligonucleotides, antisense oligonucleotides, or larger fragments can be designed from the control region of the sequence encoding KAP or from various locations along the coding region. is there. (Agrawal, S., ed. (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ. )
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing an antisense sequence into a suitable target cell can be used. Antisense sequences can be delivered into cells in the form of expression plasmids that produce sequences complementary to at least a portion of the cellular sequence encoding the target protein during transcription (Slater, JE et al. (1998) J. Allergy Clin Immunol. 102 (3): 469-475 and Scanlon, KJ et al. (1995) 9 (13): 1288-1296.) Antisense sequences can also be used in viral vectors such as retroviruses and adeno-associated virus vectors. (Miller, AD (1990) Blood 76: 271, Ausubel, Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323- 347 etc.). Other genetic delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217-225; Boado, RJ et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736.
[0222]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding KAP may be used for somatic or germ cell gene therapy. By performing gene therapy, (i) a severe complex immune deficiency (SCID) characterized by gene deficiency (eg, X chromosome chain inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)) -X1), severe complex immune deficiency associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480, Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassamia, familial hypercholesterolemia, hemophilia caused by factor VIII or factor IX deficiency (Crystal, 35 RG (1995) Science 270: 404- 410, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389: 239-242) and (ii) express a conditional lethal gene product (eg, cancer caused by uncontrolled cell growth) And (iii) intracellular parasites (eg, human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11395-11399), hepatitis B or C virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites such asPlasmodium falciparumas well asTrypanosomacruziA protein having a protective function against protozoan parasites such as can be expressed. When a gene deficiency required for KAP expression or regulation causes a disease, KAP can be expressed from a suitable population of introduced cells to alleviate the symptoms caused by the gene deficiency.
[0223]
In a further embodiment of the present invention, diseases and abnormalities caused by KAP deficiency are treated by preparing mammalian expression vectors encoding KAP and introducing these vectors into KAP-deficient cells by mechanical means. .in vivoOrex vitroThe mechanical introduction techniques used in the cells include (i) direct microinjection of DNA into individual cells, (ii) gene guns, (iii) liposome-mediated transfection, (iv) receptors And (v) the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997) Cell 91: 501- 510; Boulay, JL. And H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0224]
Expression vectors that can affect the expression of KAP include but are not limited to PCDNA 3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX, PCR2-TOPOTA vectors (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTET-OFF, PTET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA) are included. To express KAP, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene), (ii) Inducible promoters (eg, tetracycline regulatable promoters (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89) contained in the commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). : 5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456)), an ecdysone inducible promoter (commercially available) Contained in plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), FK506 / rapamycin-inducible promoter, or RU486 / mifepristone-inducible promoter (Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) normal individuals Derived from KAP It is possible to use the natural promoter or a tissue-specific promoter of the endogenous gene over-de.
[0225]
Using commercially available liposome transformation kits (eg, PERFECT LIPID TRANSFECTION KIT from Invitrogen), one skilled in the art can introduce polynucleotides into target cells in culture without much reliance on experience. Alternatively, transformation using the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or electroporation (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845) I do. In order to introduce DNA into primary cells, modifications of standardized mammalian transfection protocols are required.
[0226]
In another embodiment of the present invention, a disease or disorder caused by a gene defect associated with KAP expression is expressed by (i) a polyvirus encoding ATRS under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. Nucleotides, (ii) a suitable RNA packaging signal, and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences necessary for efficient vector propagation. The retroviral vector can be made and treated. Retroviral vectors (eg PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and are based on published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 6733-6737). The above data is incorporated herein by reference. The vector is propagated in a suitable vector producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene with affinity for a receptor on the target cell or a pan-affinity envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650, Bender, MA et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull , T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). In US Pat. No. 5,910,434 granted to RIGG (“Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant”), a method for obtaining a retroviral packaging cell line is disclosed. It is a part of this specification. Retroviral vector propagation, cell population (eg CD4⁺ Transduction of T cells) and the return of transduced cells to patients is a method well known to those skilled in the art of gene therapy and has been described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997). J. Virol. 71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283-2290).
[0227]
Alternatively, an adenoviral gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding KAP to cells having one or more genetic abnormalities associated with KAP expression. Production and packaging of adenoviral vectors are known to those skilled in the art. Replication-deficient adenoviral vectors have proven to be flexible for introducing genes encoding immunoregulatory proteins into intact pancreatic islets (Csete, ME et al. (1995) Transplantation 27: 263-268 ). Adenoviral vectors that may be used are described in US Pat. No. 5,707,618 (“Adenovirus vectors for gene therapy”) to Armentano, which is incorporated herein by reference. See also Antinozzi, P.A. et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 511-544 and Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242 for adenoviral vectors. Both documents are hereby incorporated by reference.
[0228]
Alternatively, a herpes gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding KAP to a target cell having one or more genetic abnormalities associated with KAP expression. Herpes simplex virus (HSV) vectors are particularly important when introducing KAP into HSV-affected central neurons. The production and packaging of herpes vectors is known to those skilled in the art. Replication competent herpes simplex virus (HSV) type I vectors have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385- 395). The production of HSV-1 viral vectors is also disclosed in US Pat. No. 5,804,413 ("Herpes simplex virus swains for gene transfer") to DeLuca, which is incorporated herein by reference. . US Pat. No. 5,804,413 describes a recombinant HSV d92 comprising a genome with at least one exogenous gene introduced into a cell under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. The patent also discloses the generation and use of recombinant HSV lines that are removed for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see also Goins, W.F. et al. (1999) J. Virol. 73: 519-532 and Xu, H. et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are hereby incorporated by reference. Manipulation of cloned herpesvirus sequences, production of recombinant virus after transfection with a number of plasmids containing different parts of the giant herpesvirus genome, herpesvirus growth and proliferation, and infection of herpesvirus cells This is a technique known to those skilled in the art.
[0229]
Alternatively, an α virus (positive single stranded RNA virus) vector is used to deliver a polynucleotide encoding KAP to target cells. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been extensive, and it has been found that gene transfer vectors are based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During replication of alpha viral RNA, a subgenomic RNA that normally encodes the viral capsid protein is created. Since this subgenomic RNA is replicated to a higher level than the full-length genomic RNA, capsid proteins are overproduced compared to viral proteins with enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding KAP into the α virus genome instead of the region encoding capsid, RNA encoding a large number of KAP is produced in the vector-introduced cell, and KAP is synthesized at a high level. The ability to establish persistent infection of normal hamster kidney cells (BHK-21) with a Sindbis virus (SIN) variant, while α-virus infection is usually associated with cell lysis within a few days This suggests that lytic replication of α virus can be suitably modified so that it can be applied to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). Since α virus can be introduced into various hosts, KAP can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require cell sorting prior to transduction. Methods for treating alphavirus infectious cDNA clones, alphavirus cDNA and RNA transfection methods, and alphavirus infection methods are known to those skilled in the art.
[0230]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. The transcription start site is, for example, between about −10 and about +10 from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because triple helix base pairing inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent therapeutic advances using triple helix DNA are described in the literature (Gee, JE et al. (1994) in: Huber, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, (See pages 163-177 etc.). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of mRNA by preventing transcripts from binding to ribosomes.
[0231]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules, and ribozymes can also be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA and subsequent internal nucleotide strand breaks. For example, it is possible that a hammerhead ribozyme molecule produced by genetic engineering can specifically and effectively catalyze the cleavage of the nucleotide coding sequence in the sequence encoding KAP.
[0232]
Specific ribozyme cleavage sites within any RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites including GUA, GUU, GUC sequences. Once identified, assess whether a short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site has secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. Is possible. Assessment of the suitability of candidate targets can also be made by testing the accessibility of hybridization with complementary oligonucleotides using a ribonuclease protection assay.
[0233]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the present invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. Optional methods include methods of chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, the DNA sequence encoding KAPin vitroas well asin vivoTranscription can yield RNA molecules. Such DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells or tissues.
[0234]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include but are not limited to the addition of flanking sequences at the 5 'end, 3' end, or both of the molecule, or phosphorothioate or 2 rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. 'This includes using O-methyl. This concept is unique to PNA production and can be extended to all these molecules. This includes adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not easily recognized by endogenous endonucleases, with acetyl-, methyl-, thio- and similar modifications, as well as non-conventional bases such as inosine, queosin. (Queosine), wybutosine, etc. can be added.
[0235]
Further embodiments of the invention include methods of screening for compounds that are effective in altering the expression of a polynucleotide encoding KAP. Non-limiting compounds that are effective in causing altered expression of specific polynucleotides include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcriptional regulators, and specific polynucleotides There are non-polymeric chemical entities that can interact with sequences. Effective compounds may mutate polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Thus, in the treatment of diseases associated with increased KAP expression or activity, compounds that specifically inhibit expression of polynucleotides encoding KAP are therapeutically useful and are associated with decreased KAP expression or activity In the treatment of diseases, compounds that specifically promote expression of a polynucleotide encoding KAP may be therapeutically useful.
[0236]
At least one to a plurality of test compounds can be screened for efficacy in mutated expression of a specific polynucleotide. The test compound can be obtained by any method commonly known in the art. Such methods include mutating the expression of the polynucleotide, selecting from an existing, commercially available or proprietary, natural or non-natural compound library, and the chemical and / or structural properties of the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective when rationally designing properties-based compounds and when selecting from a library of combinatorially or randomly generated compounds. A sample containing a polynucleotide encoding KAP is exposed to at least one of the test compounds thus obtained. The sample can be, for example, an intact cell, a permeabilized cell, a cell-free reconstitution system or a reconstitution biochemistry system. Changes in the expression of a polynucleotide encoding KAP are assayed by any method commonly known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of a polynucleotide encoding KAP. The amount of hybridization can be quantified thereby forming the basis for comparison of expression of polynucleotides exposed and not exposed to one or more test compounds. Detection of a change in the expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in mutating the expression of the polynucleotide. For compounds effective for mutated expression of specific polynucleotides, for example, fission yeastSchizosaccharomyces pombe) Gene expression systems (Atkins, D. et al. (1999) US Pat. No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell systems such as HeLa cells (Clarke, ML et al. (2000) Screening is performed using Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention involve screening combinatorial libraries of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against specific polynucleotide sequences (Bruice, TW et al. (1997) US Pat. No. 5,686,242, Bruice, TW et al. (2000) US Pat. No. 6,022,691).
[0237]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in vivo,in vitroas well asex vivoIs equally suitable for use.ex vivoFor treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from the patient, cloned and expanded back to the same patient by autologous transplantation. Delivery by transfection, ribosome injection or polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-466. Etc. See).
[0238]
Any of the above treatment methods can be applied to all subjects requiring treatment, including mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0239]
Additional embodiments of the invention relate to the administration of compositions having active ingredients that are usually formulated with pharmaceutically acceptable excipients. Excipients include, for example, sugar, starch, cellulose, gum and protein. Various prescriptions are usually known, detailsRemington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such compositions consist of KAP, KAP antibodies, mimetics, agonists, antagonists, or inhibitors of KAP.
[0240]
The compositions used in the present invention can be administered by any number of routes including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal. Intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
[0241]
Compositions administered from the lungs can be prepared in liquid or dry powder form. Such compositions are usually aerosolized just before the patient inhales. In the case of small molecules (eg, conventional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast acting formulations is well known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), recent improvements in pulmonary delivery through the alveolar region of the lung in the art can substantially transport drugs such as insulin into the blood circulation. (See Patton, JS et al., US Pat. No. 5,997,848, etc.). Pulmonary delivery is superior in administration without needle injection and eliminates the need for penetration enhancers that may be toxic.
[0242]
Compositions suitable for use in the present invention include ingredients that contain as much active ingredient as is necessary to achieve the desired purpose. The determination of an effective dose is within the ability of those skilled in the art.
[0243]
In order to deliver a macromolecule containing KAP or a fragment thereof directly into a cell, the composition is preferably prepared in a special form. For example, a liposomal formulation comprising a cell impermeable polymer can facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, KAP or a fragment thereof can be linked from the HIV Tat-1 protein to the cation N-terminus. The fusion protein thus generated has been shown to transduce cells of all tissues including the brain of the mouse model system (Schwarze, S.R. et al. (1999) Science 285: 1569-1572).
[0244]
For any compound, in a cell culture assay, such as a neoplastic cell culture assay, or in an animal model such as a mouse, rabbit, dog, monkey, or pig, first estimate the effective dose of treatment. Can do. The animal model may also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine beneficial doses and routes for administration to humans.
[0245]
A therapeutically effective amount refers to the amount of an active formulation ingredient (eg, KAP or a fragment thereof, an antibody of KAP, an agonist or antagonist of KAP, an inhibitor, etc.) that ameliorates symptoms and conditions. Medicinal efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal experiments, e.g. ED₅₀(Therapeutically effective amount of 50% of the population) or LD₅₀It can be determined, for example, by measuring (lethal dose of 50% of the population). The ratio of dose to therapeutic effect of toxic effect is the therapeutic index, LD₅₀/ ED₅₀It can be expressed as a ratio. Compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. Data obtained from cell culture assays and animal studies is used to formulate a range of dosage for use in humans. Dosages containing such compositions contain little or no toxicity, and ED₅₀It is preferable to be in the range of the blood concentration that contains Depending on the mode of administration used, patient sensitivity and route of administration, the dosage will vary within this range.
[0246]
The exact dosage will be determined by the practitioner in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage amount and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors related to the subject include the severity of the disease, the patient's normal health, the patient's age, weight and sex, time and frequency of administration, drug formulation, response sensitivity and response to treatment. Long-acting compositions may be administered once every 3-4 days, once a week, or once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0247]
The usual dose depends on the route of administration, but is about 0.1 to 100,000 μg, up to a total of about 1 g. Guidance on specific doses and delivery methods is described in the literature and is usually available to practitioners. Those skilled in the art will utilize different formulations for nucleotides than for proteins or inhibitors. Similarly, delivery of polynucleotides or polypeptides will be specific to particular cells, conditions, locations, etc.
[0248]
(Diagnosis)
In another example, an antibody that specifically binds to KAP is an assay for diagnosing a disease characterized by expression of KAP, or for monitoring a patient being treated with an agonist or antagonist or inhibitor of KAP or KAP Used for. Antibodies useful for diagnostic purposes are formulated in the same manner as described above for the treatment site. KAP diagnostic assays include the use of antibodies and labels to detect KAP from human body fluids or from cells or tissues. The antibody can be modified or unmodified and can be labeled covalently or non-covalently with a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used, some of which have been described above.
[0249]
Various protocols, including ELISA, RIA, and FACS for measuring KAP are well known in the art and provide a basis for diagnosing unusual or abnormal levels of KAP expression. Normal or standard KAP expression values are determined by binding body fluids or cells collected from normal mammals, such as human subjects, to antibodies against KAP under conditions suitable for complex formation. To do. The amount of standard complex formation can be quantified by various methods such as photometry. The amount of KAP expression in each sample from the subject, control, and disease biopsy tissue is compared to a reference value. The deviation between the standard value and the subject is a parameter for diagnosing the disease.
[0250]
According to another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding KAP can also be used for diagnosis. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNAs. This polynucleotide is used to detect and quantify gene expression in biopsy tissues that express KAP that can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of KAP, further overexpression, and to monitor the regulation of KAP values during treatment.
[0251]
In one embodiment, a nucleic acid sequence encoding KAP can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising a gene sequence encoding KAP or a closely related molecule.
[0252]
Whether the probe is made from a highly specific region (eg, a 5 ′ regulatory region) or a slightly less specific region (eg, a conserved motif), The stringency of hybridization or amplification will depend on whether the probe identifies only the natural sequence encoding KAP or only the natural sequence encoding the allele or related sequence. .
[0253]
The probe is also utilized for the detection of related sequences and may have at least 50% sequence identity with any sequence encoding KAP. The hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 21-40, or a genomic sequence including the promoter, enhancer, and intron of the HPDE gene.
[0254]
As a method for preparing a hybridization probe specific for DNA encoding KAP, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding KAP and a KAP derivative into a vector for preparing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those skilled in the art and are commercially available, by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with various reporter populations. Examples of reporter groups include³²P or³⁵Examples thereof include a radionuclide such as S, or an enzyme label such as alkaline phosphatase bound to a probe via an avidin / biotin binding system.
[0255]
Polynucleotide sequences encoding KAP can be used to diagnose diseases associated with KAP expression. Examples of such diseases include, but are not limited to, cardiovascular diseases such as arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombus Phlebitis and vein thrombosis, vascular tumor, complication of thrombolysis, balloon angioplasty, vascular replacement, bypass surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina, myocardial infarction, hypertensive heart disease, degeneration Valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral valve prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infective endocarditis, nonbacterial thrombus Endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease, and heart transplant complications, congenital lung abnormalities Pulmonary dilatation, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism Pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, angiosclerosis, obstructive pulmonary disease, restrictive pulmonary disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral Pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilia obstructive bronchiolitis ―Pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary hemorrhage syndrome, Goodpasture syndrome, idiopathic pulmonary hematosis, pulmonary comorbid collagen disease, lung tumor, inflammation Include immune and non-inflammatory pleural effusions, pneumothorax, pleural tumors, drug-induced lung disease, lung disease due to radiation, and complications of lung transplantation. Immunological diseases include acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Addison disease , Adult breathing Distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune multiglandular endocrine candidal ectoderm dystrophy ( (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes mellitus, emphysema, lymphotoxin transient lymphopenia, fetal erythroblastosis, erythema nodosum, atrophy Gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis , Osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, all Systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitic infection, protozoal infection, helminth infection , Trauma, and nervous system diseases include epilepsy, ischemic cerebrovascular disorder, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, muscle Atrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, Brain abscess, subdural abscess, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system disease, prion disease (Kool, Kreuzfeld-Jakob disease, Gerstman syndrome, And And Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), fatal familial insomnia, neurotrophic and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebelloretinal hemangioblastomatosis, cerebral trigeminal nerve Central nervous system mental retardation and other developmental disorders, including vascular syndrome, Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord disorders, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, peripheral nerve diseases Dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine, and addictive myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, psychosis (moodness, anxiety disorder, schizophrenia), Seasonal disorder (SAD), inability to sit still, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, schizophrenic mental disorder, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease Includes epidemic supranuclear palsy, cerebral cortex basal ganglia degeneration, and familial frontotemporal amnesia, and among developmental and developmental disorders are actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis , Bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, tubular acidosis, anemia , Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonadal dysplasia, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary abnormalities, mental retardation), Smith-Magenis syndrome syndrome), spinal dysplasia syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoses, hereditary neuropathies such as Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, Syndenham choreography Symptom disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephalopathy, craniotomy, congenital glaucoma, cataract, sensory nerve hearing loss, lipid abnormalities include fatty liver, Cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, carnitine palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deminase deficiency, hypertriglyceridemia, Fabry lipid and other lipid storage diseases, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic White matter dystrophy, Adrenal white matter dystrophy, G_{M 2}Gangliosidosis, ceroid lipofuscinosis, β-lipoproteinemia, Tangier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous lipohistitis, disseminated adipose tissue necrosis , Painful steatosis, lipoid adrenal hyperplasia, lipoid nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid Dysfunction, nephropathy, liver disease, lecithin-cholesterol acyltransferase deficiency, cerebral tendon xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia , Lipid myopathy, obesity, and cell proliferation abnormalities include actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, Combined connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and Teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate , Salivary glands, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, leukemias such as multiple myeloma and lymphomas such as Hodgkins disease. Polynucleotide sequences encoding KAP include Southern, Northern, dot blot, or other membrane technologies, PCR methods, dipsticks, pins, ELISA assays, and expression of mutant ATRS It is possible to use for the microarray which utilizes the bodily fluid or tissue extract | collected from the patient in order to detect this. Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0256]
In certain embodiments, nucleotide sequences encoding KAP will be useful in assays to detect related diseases, particularly those mentioned above. The nucleotide sequence encoding KAP could be labeled by standard methods and added to a body fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for the formation of a hybridization complex. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient sample is significantly different compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding KAP in the sample reveals the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate specific therapeutic effects in animal experiments, clinical trials, or to monitor individual patient treatment.
[0257]
In order to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with the expression of KAP, a normal or standard profile of expression is established. This can be accomplished by combining bodily fluids or cells extracted from either normal animals or human subjects with sequences encoding KAP or fragments thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments conducted with known amounts of substantially purified polynucleotides to values obtained from normal subjects. The standard value thus obtained can be compared with the value obtained from a sample obtained from a patient showing signs of disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of the disease.
[0258]
Once the presence of the disease is established and the treatment protocol is initiated, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to determine whether the patient's expression level has begun to approach the level observed in normal subjects. The results obtained from continuous assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0259]
For cancer, the presence of an abnormal amount of transcripts (underexpressed or overexpressed) in living tissue from an individual indicates a predisposition to the disease or a method to detect the disease before clinical symptoms appear. Or provide. This type of clearer diagnosis allows medical professionals to take advantage of preventive or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0260]
Further diagnostic use of oligonucleotides designed from sequences encoding KAP may include the use of PCR. These oligomers can be synthesized chemically, produced enzymatically, orin vitroCan yield. Oligomers preferably comprise a fragment of a polynucleotide encoding KAP, or a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding KAP and are used to identify a particular gene or condition under optimal conditions. The In addition, oligomers can be used for the detection, quantification, or both of closely related DNA or RNA sequences under slightly stringent conditions.
[0261]
In certain embodiments, oligonucleotide primers derived from polynucleotide sequences encoding KAP can be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause human congenital or acquired genetic diseases. Although not limited, SNP detection methods include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, DNA is amplified by polymerase chain reaction (PCR) using an oligonucleotide primer derived from a polynucleotide sequence encoding KAP. DNA can be derived from, for example, diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in DNA make a difference in the secondary and tertiary structure of single-stranded PCR products. Differences can be detected using gel electrophoresis in non-denaturing gels. In fSCCP, the oligonucleotide primer is fluorescently labeled. As a result, the amplimer can be detected by a high-throughput device such as a DNA sequencing machine. In addition, a sequence database analysis method called in silico SNP (in silico SNP, isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as sequenced in a common consensus sequence. Can do. These computer-based methods filter out sequence variations due to sequencing errors using laboratory calibration of DNA and statistical models and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized, for example, by mass spectrometry using a high throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0262]
Methods that can be used to quantify the expression of KAP include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, coamplification of regulatory nucleic acids and interpolation of results obtained from standard curves (eg, Melby, PC et al. (1993) ) J. Immunol. Methods 159: 235244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229236.) The oligomer or polynucleotide of interest is present in various dilutions and is spectrophotometric or ratiometric. By performing a high-throughput assay that allows rapid quantification by color reaction, the rate of quantification of multiple samples can be accelerated.
[0263]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in the microarray. Microarrays can be used in transcriptional imaging techniques that simultaneously monitor the associated expression levels of multiple genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. Use this information to determine gene function, understand the genetic basis of the disease, diagnose the disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a pharmacogenomic profile of the patient to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective for the patient and has few side effects can be selected.
[0264]
In another example, KAP, a fragment of KAP, or an antibody specific for KAP can be used as an element on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0265]
Some embodiments relate to the use of the polynucleotides of the present invention to generate a transcript image of a tissue or cell type. A transcript image represents a global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Comprehensive gene expression patterns are analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under a given condition (see “Comparative Gene Transcript Analysis” of Seilhamer et al., US Pat. No. 5,840,484). Reference is hereby incorporated by reference). Thus, a transcript image can be generated by hybridizing a polynucleotide of the invention or its complement to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In certain embodiments, hybridization is generated in a high throughput format such that a polynucleotide of the invention or its complement comprises a plurality of subsets of elements on a microarray. The resulting transcript image can provide a profile of gene activity.
[0266]
Transcript images can be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies or biological samples thereof. Transcript images are therefore in the case of tissue or biopsy samplesin vivoOr in the case of cell linesin vitroReflects gene expression in
[0267]
Transcript images that produce the expression profiles of polynucleotides of the invention can also be used in connection with in vitro model systems and preclinical evaluation of drugs as well as industrial or natural environmental compound toxicity tests. All compounds elicit characteristic gene expression patterns, often referred to as molecular fingerprints or toxicity signatures, implying mechanisms of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog. 24: 15 3-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which is specifically incorporated herein by reference). If a test compound has a signature that is identical to the signature of a compound with known toxicity, it may share toxic properties. A fingerprint or signature is most useful and accurate when it contains expression information from multiple genes and gene families. Ideally, genome-wide measurement of expression provides the highest quality signature. Even if there are genes whose expression is not altered by any tested compound, those genes are important because their expression levels can be used to normalize the remaining expression data. Standardization procedures are useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of toxicity signatures helps to interpret toxicity mechanisms, but knowledge of gene function is not required to statistically match signatures that lead to toxicity prediction (eg, on February 29, 2000) See Press Release 00-02 issued by the National Institute of Environmental Health Sciences, http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip. available at htm). Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences in toxicological screening using toxicity signatures.
[0268]
In one embodiment, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acid with the test compound. Nucleic acid expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for the polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The transcription level in the treated biological sample is compared to the level in the untreated biological sample. The difference in transcription levels between the two samples indicates the toxic response caused by the test compound in the treated sample.
[0269]
Another example relates to the analysis of tissue or cell type proteomes using the polypeptide sequences of the invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be further analyzed individually. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by isolating and analyzing specific tissue or cell type polypeptides. In one embodiment, the separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis in which the protein is separated from the sample by one-dimensional isoelectric focusing and separated according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis ( Steiner and Anderson, supra). Proteins are visualized in the gel as dispersed, unique points by staining the gel with a substance such as Coomassie Blue, or silver stain or fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical density of protein spots obtained from different samples, eg, biological samples either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, are compared to identify changes in protein spot density associated with the treatment. Proteins within the spot are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 consecutive amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
[0270]
Proteomic profiles can also be generated by quantifying KAP expression levels using antibodies specific for KAP. In one embodiment, protein expression levels are quantified by using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to the sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999) Anal Biochern. 270: 103-111, Mendoze, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed in a variety of ways known in the art, for example, thiol or amino-reactive fluorescent compounds can be used to react proteins in a sample to detect the amount of fluorescent binding in each array element.
[0271]
Toxicity signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxicity signatures at the transcriptional level. For some proteins in certain tissues, the correlation between transcription and protein abundance may be poor (Anderson, NL and J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18: 533-537), so the transcript image is not much. Proteome toxicity signatures can be useful in the analysis of compounds that do not affect but alter the proteome profile. Furthermore, since analysis of transcription in body fluids is difficult due to rapid degradation of mRNA, proteome profiling is more reliable and informative in such cases.
[0272]
In another example, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins expressed in the treated biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in protein content of both samples indicates the response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing the amino acid residues of the individual proteins and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0273]
In another example, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins obtained from biological samples are incubated with antibodies specific for the polypeptides of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in protein content of both samples indicates the response to the test compound in the treated sample.
[0274]
Microarrays are prepared, used and analyzed using methods well known in the art (Brennan, TM et al. (1995), US Pat. No. 5,474,796, Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT application WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT application WO95 / 35505, Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, Heller, MJ et al. (1997) US Pat. No. 5,605,662 etc.). Various types of microarrays are known, for detailsDNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, edited. (1999) Oxford University Press, London. This document is incorporated herein by reference in particular.
[0275]
In another embodiment of the invention, the nucleic acid sequence encoding KAP can also be used to generate hybridization probes useful for mapping the native genomic sequence. Either a coding sequence or a non-coding sequence can be used, and in some cases a non-coding sequence is preferred over a coding sequence. For example, conservation of coding sequences within members of a multigene family can cause unwanted cross-hybridization during chromosomal mapping. Nucleic acid sequences can be specific chromosomes, specific regions of chromosomes or artificially formed chromosomes, such as human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC), bacterial P1 products, or single chromosome cDNA (E.g. Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127134; and Trask, BJ (1991) Trends Genet. (See 7: 149154.) Once mapped, use the nucleic acid sequence of the present invention to create a genetic linkage map that correlates, for example, the inheritance of a disease state with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) it can. (See, for example, Lander, E.S. and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357.)
fluorescencein situHybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, pages 965-968, etc.). Examples of genetic map data are: It can be found in various scientific journals or on the website of Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Because the correlation between the location of the gene encoding KAP on the physical chromosomal map and a particular disease or a predisposition to a particular disease can help determine the region of DNA associated with this disease Can facilitate the cloning task of determining the position.
[0276]
The genetic map can be extended using physical mapping techniques such as linkage analysis using established chromosomal markers and chromosomal specimen in situ hybridization. By placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, the associated markers can often be revealed even if the exact chromosomal locus is unknown. This information is valuable to researchers looking for genetic disorders using positional cloning and other gene discovery techniques. Once a gene involved in a disease or syndrome is roughly positioned by genetic binding to a particular gene region, such as the 11q22-23 region of vasodilatory ataxia, any sequence mapping to that region will be further investigated. (See Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580 etc.) for healthy individuals, holders, and infected individuals due to translocation, inversion, etc. The nucleotide sequences of the present invention may be used to find differences in chromosomal positions between individuals.
[0277]
In another embodiment of the invention, KAP, its catalytic fragment or immunogenic fragment or oligopeptide thereof can be used for screening a library of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for drug screening will be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located within the cell. Complex formation by binding of KAP to the agent being tested may be measured.
[0278]
Another drug screening method is used to screen compounds with suitable binding affinity for the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT application WO84 / 03564). In the method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is washed after reacting with KAP or a fragment thereof. The bound KAP is then detected by methods well known in the art. Purified KAP can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize the peptide on a solid support.
[0279]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of specifically binding to KAP compete with the test compound for binding to KAP. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with KAP.
[0280]
In another embodiment, molecular biology techniques to be developed in the future depend on the characteristics of currently known nucleotide sequences, including but not limited to triplet genetic code, specific base pair interactions, etc. If so, the new technology can be used for nucleotide sequences encoding KAP.
[0281]
Without further details, those skilled in the art will be able to make full use of the present invention with the above description. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and do not limit the invention in any way.
[0282]
All patents, patent applications and publications disclosed herein, particularly U.S. Patent Nos. 60 / 254.034, 60 / 255.756, 60 / 251.814, 60 / 256.172, 60 / 257.416, No. 60 / 260.912, 60 / 264.344 and 60 / 266.017 are hereby incorporated by reference.
[0283]
(Example)
1 cDNA Library creation
Incyte cDNA is derived from a cDNA library described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA). Some tissues are homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, and some tissues are homogenized and dissolved in a mixture of phenol or a suitable denaturing agent. Examples of the mixture of the modifier include TRIZOL (Life Technologies) which is a single phase solution of phenol and guanidinium isothiocyanate. The resulting lysate was centrifuged in cesium chloride or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using either isopropanol, sodium acetate and ethanol, or another method.
[0284]
In order to increase the purity of RNA, extraction and precipitation of RNA with phenol was repeated as many times as necessary. In some cases, RNA was treated with DNase. In most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Chatsworth CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit such as POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0285]
In some cases, RNA was provided to Stratagene and Stratagene produced the corresponding cDNA library. If not, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) using the recommended or similar methods known in the art to create a cDNA library (Ausubel, supra). , 1997, 5.1-6.6 units, etc.). Reverse transcription was initiated using oligo d (T) or random primers. A synthetic oligonucleotide adapter was ligated to a double stranded cDNA and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme. For most libraries, cDNA size selection (300-1000 bp) was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech) or preparative agarose gel electrophoresis. The cDNA was ligated into compatible restriction enzyme sites of a suitable plasmid polylinker. Suitable plasmids include, for example, PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene), PSPORT1 plasmid (Life Technologies), PCDNA2.1 plasmid (Invitrogen, Carlsbad CA), PBK-CMV plasmid (Stratagene), PCR2-TOPOTA (Invitrogen), PCMV-ICIS plasmid ( Stratagene), pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA), pRARE (Incyte Genomics) or pINCY (Incyte Genomics), or derivatives thereof. The recombinant plasmid was transformed into E. coli cells containing Stratagene XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR, or Life Technologies DH5α, DH10B or ELECTROMAX DH10B.
[0286]
2 cDNA Clone isolation
Using UNIZAP vector system (Stratagene)in vivoBy excision or by cell lysis,Example 1The plasmid obtained as described above was recovered from the host cells. Plasmid purification methods include Magic or WIZARD Minipreps DNA purification system (Promega), AGTC Miniprep purification kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAWELL QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid and QIAWELL 8 Ultra Plasmid Purification System, REAL At least one of the Prep 96 plasmid purification kits was used. The plasmid was precipitated and then resuspended in 0.1 ml distilled water and stored at 4 ° C. either lyophilized or not lyophilized.
[0287]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using direct binding PCR in a high throughput format (Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). Host cell lysis and thermal cycling processes were performed in a single reaction mixture. Samples are processed and stored in 384-well plates and the concentration of amplified plasmid DNA is determined fluorimetrically using PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and FLUOROSKANII fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) Quantified.
[0288]
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in 1 was sequenced as shown below. Sequencing of cDNA can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as the ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or PTC-200 thermal cycler (MJ Research) or the HYDRA microdispenser (Robbins Scientific) or MICROLAB 2200 (Hamilton) liquid transfer. Processed in conjunction with the system. A cDNA sequencing reaction was prepared using a reagent provided by Amersham Pharmacia Biotech, or an ABI sequencing kit such as ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics) or the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using standard ABI protocol and base pairing software ( Applied Biosystems) or other sequence analysis systems well known in the art. Reading frames within the cDNA sequences were determined using standard methods (reviewed in Ausubel, 1997, 7.7 units supra). Select some of the cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the method described in.
[0289]
Polynucleotide sequences derived from Incyte cDNA sequences were validated by removing vector, linker and poly (A) sequences and masking ambiguous base pairs. In doing so, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming and adjacent dinucleotide frequency analysis were used. Next, the Incyte cDNA sequences or their translation queries were made against one selected from the following database group. Public databases such as GenBank primate and rodent, mammal, vertebrate, eukaryotic databases, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM, PROTEOME, humans, rats, mice, nematodes (Caenorhabditis elegans), Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe)andCandida albicans(Incyte Genomics, Palo Alto CA) is a group of databases with sequences and protein family databases based on Hidden Markov Models (HMM) such as PFAM (HMM analyzes the primary structure of gene family consensus) (See, eg, Eddy, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365). Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365, etc.) was queried for the Incyte cDNA sequence or its translation. Inquiries were made using programs based on BLAST, FASTA, BLIMPS and HMMER. The Incyte cDNA sequence was constructed to yield the full length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNA, GenBank EST, stitched sequence, stretched sequence or Genscan predicted coding sequence (Examples 4 and 5Was used to extend the population of Incyte cDNA to full length. It was constructed using programs based on Phred, Phrap and Consed, and a population of cDNA was screened for open reading frames using programs based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full length polypeptide sequence. Alternatively, the polypeptides of the present invention can begin at any methionine residue of the full-length translated polypeptide. Subsequently, full-length poly is obtained by querying the protein family database based on the GenBank protein database (genpept), SwissProt, PROTEOME database, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, and other hidden Markov models (HMM) such as PFAM. The peptide sequence was analyzed. Full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Polynucleotide and polypeptide sequence alignments are generated using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm, such as those incorporated into the MEGALIGN multi-sequence alignment program (DNASTAR), which also calculates the percent identity between aligned sequences and sequences.
[0290]
Table 7 gives an overview of the tools, programs and algorithms used for analysis and assembly of Incyte cDNA and full-length sequences, as well as applicable descriptions, references and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 7 and a brief description thereof is shown in column 2. Column 3 is a preferred reference, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Where applicable, column 4 indicates the score, probability value, and other parameters used to evaluate the strength with which the two sequences match (the higher the score or the lower the probability value, the 2 High identity between sequences).
[0291]
The above programs used for the assembly and analysis of full-length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NO: 21-40. A fragment of about 20 to about 4000 nucleotides useful for hybridization and amplification techniques is shown in column 4 of Table 2.
[0292]
4 Genome DNA Identification and editing of coding sequences from
Putative kinases and phosphatases were first identified by running the Genscan gene identification program in public genomic sequence databases (eg gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94 and Burge, C. and S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). The program links predicted exons to form a constructed cDNA sequence that spans from methionine to the stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences that Genscan analyzes at one time was set to 30 kb. To determine which of these Genscan predicted cDNA sequences encode kinases and phosphatases, the encoded polypeptides were queried and analyzed for kinases and phosphatases in the PFAM model. Potential kinases and phosphatases were also identified based on their homology to the Incyte cDNA sequence annotated as kinases and phosphatases. The Genscan predicted sequences thus selected were then compared to the public databases genpept and gbpri by BLAST analysis. If necessary, edit the Genscan predicted sequence by comparing it with the top BLAST hits from genpept, and correct errors in the sequence predicted by Genscan, such as extra or removed exons. BLAST analysis also provides evidence of transcription because it can be used to find public cDNA coverage of any Incyte cDNA or Genscan predicted sequence. This information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence when the Incyte cDNA coverage was available. The full-length polynucleotide sequence isExample 3Obtained by constructing a Genscan predicted coding sequence with Incyte cDNA sequences and / or public cDNA sequences. Alternatively, the full-length polynucleotide sequence is completely derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0293]
Five cDNA Construction of genome sequence data using sequence data
Stitch arrangement ( Stiched Sequence )
The partial cDNA sequence isExample 4Extension using exons predicted by the Genscan gene identification program described in 1.Example 3The partial cDNAs constructed as described in 1 were mapped to genomic DNA and resolved into clusters containing the relevant cDNA and Genscan exons predicted from one or more genomic sequences. Analyze each cluster using graph theory and dynamic programming-based algorithms to integrate cDNA and genomic information, and subsequently generate potential splice variants that can be verified, edited, or extended to yield full-length sequences did. Sequences were identified in which the length of the entire interval was present in two or more sequences in the cluster, and the intervals so identified were considered equal by transition. For example, if there are intervals in one cDNA and two genomic sequences, all three intervals are considered equal. This process can link unrelated but contiguous genomic sequences together by cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequence. The linkage between the intervals generated along one type of parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) prevailed over the linkage changing the type of parent (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated and compared into public databases genpept and gbpri by BLAST analysis. The incorrect exon predicted by Genscan was corrected by comparing it to the top BLAST hit from genpept. If necessary, the sequences were further extended using additional cDNA sequences or by examination of genomic DNA.
[0294]
Stretch arrangement ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, using the BLAST program, GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes, such as public databases,Example 3We interrogated partial cDNAs constructed as described in. The closest GenBank protein homologue is then analyzed by BLAST analysis using the Incyte cDNA sequence orExample 4Compared to any of the GenScan exon predicted sequences described in. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to produce a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto the GenBank protein homologue. Insertions or deletions can occur within the chimeric protein in relation to the original GenBank protein homologue. Homologous genomic sequences were searched from public human genome databases using GenBank protein homologues, chimeric proteins or both as probes. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of homologous genomic sequences. The resulting stretch sequence was examined to determine whether it contained the complete gene.
[0295]
6 KAP Chromosome Mapping of Polynucleotides Encoding DNA
The sequences used to construct SEQ ID NO: 21-40 were compared to sequences in the Incyte LIFESEQ database and public domain database using BLAST and Smith-Waterman algorithms. The sequences of these databases that matched SEQ ID NO: 21-40 were incorporated into clusters of consecutive and overlapping sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 7). Clustered sequences have been previously mapped using radiation hybrids and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Research Institute (WIGR), and Genethon. I confirmed it was. When a mapped sequence was included in a cluster, the entire sequence of that cluster, including individual sequence numbers, was assigned to a map location.
[0296]
The location on the map is expressed as a range or interval of human chromosomes. The location on the map of the centimorgan interval is measured with respect to the end of the p-arm of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit of measure based on the frequency of recombination between chromosomal markers. On average, 1 cM is approximately equal to 1 megabase (Mb) of DNA in humans. It varies widely with alternate hot and cold spots.) CM distance is based on genetic markers mapped by Genethon that provide boundaries for radiation hybrid markers whose sequences are included within each cluster. The above sections have already been identified using human genetic maps and other information sources available to the general public, such as NCBI “GeneMap99” (http: //www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap) Whether it is located in or near the disease gene map can be determined.
[0297]
In this way, SEQ ID NO: 33 was mapped to chromosome 12 within a 97,10-113,30 centimorgan interval. SEQ ID NO: 35 maps to chromosome 3 at intervals within 16,50-30,40 centimorgans. SEQ ID NO: 29 maps to chromosome 13 with an interval within 11.60 to 22.80 centmorgan, to chromosome 15 with an interval within 72,30 to 77,30 centmorgan, and with an interval within 57.70 to 64.10 centmorgan Mapped to chromosome 20. One or more map positions are reported for SEQ ID NO: 29, indicating that sequences with different map positions have been constructed in one cluster. This situation occurs, for example, when sequences that are very similar but not completely identical are built into one cluster.
[0298]
7 Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information and involves the hybridization of labeled nucleotide sequences to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. ing. (See Sambrook, Chapter 7, Ausubel. F.M., et al., Chapters 4 and 16).
[0299]
Using similar computer techniques applied to BLAST, search for identical or related molecules in nucleotide databases such as GenBank and LifeSeq (Incyte Pharmaceuticals). Northern analysis is much faster than multi-membrane hybridization. Furthermore, the sensitivity of the computer search can be changed to determine whether a particular match is classified as an exact match or a similar match. The search criterion is a product score, which is defined by the following equation.
[0300]
[Expression 1]

[0301]
The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length with which the sequences match. The product score is a normalized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the nucleotide sequence identity and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. A BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each base that matches a high scoring segment pair (HSP) and assigning -4 to each unsuitable base pair. Two sequences can share two or more HSPs (separated by gaps). If there are two or more HSPs, the product score is calculated using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents the balance between the fractional overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is obtained only if there is a 100% match over the shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when either one end is 100% coincident and 70% overlap, or the other end is 88% coincident and 100% overlap. The product score 50 is obtained when either one end is 100% coincident and 50% overlap, or the other end is 79% coincident and 100% overlap.
[0302]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding KAP was analyzed in relation to the tissue source from which the polynucleotide sequence was derived. For example, one full-length sequence is an Incyte cDNA sequence (Example 3And at least partly overlap. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue consists of the following organism / tissue categories: cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryonic structure, endocrine system, exocrine gland, female genital organ, male genital organ, germ cell, blood and immune system, liver, musculoskeletal Classified as one of the system, nervous system, pancreas, respiratory system, sensory organ, skin, stomatognathic system, non-classified / mixed or urinary tract. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / pathology categories: cancer, cell line, development, inflammation, neurological, trauma, cardiovascular, pool, etc. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The resulting percentage reflects disease-specific expression of cDNA encoding KAP. cDNA sequences and cDNA library / tissue information can be obtained from the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0303]
8 KAP Of a polynucleotide encoding
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragments using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragments of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 ′ extension of a known fragment and the other primer was synthesized to initiate 3 ′ extension of a known fragment. The starting primer is about 22-30 nucleotides in length, has a GC content greater than about 50%, and is annealed to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. or OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or another suitable Was designed from cDNA using a simple program. All nucleotide extensions that resulted in hairpin structures and primer-primer dimers were avoided.
[0304]
A selected human cDNA library was used to extend the sequence. Additional primers or nested sets of primers were designed when more than one extension was necessary or desirable.
[0305]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture consists of template DNA and 200 nmol primers, Mg^{2 +}And (NH_Four)₂SO_FourAnd a buffer containing 2-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters._} Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 60 ° C, 1 minute, Step 4: 68 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ℃, 5 minutes, Step 7: Store at 4 ℃. Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters: Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 57 ° C, 1 minute, Step 4: 68 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C.
[0306]
100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25% (v / v) PICOGREEN, Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1X TE and 0.5 μl of undiluted PCR product were mixed with an opaque fluorometer plate (Coming Costar, Acton MA) was distributed to each hole, and the DNA concentration in each hole was measured by allowing the DNA to bind to the reagent. Plates were scanned with Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure sample fluorescence and quantify DNA concentration. An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction was successful in extending the sequence.
[0307]
The extended nucleotide is desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested with CviJI cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and religated into pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) Previously sonicated or sheared. For shotgun sequencing, digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, fragments were excised, and agar was digested with Agar ACE (Promega). Clones extended with T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA) were religated to pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) and treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) to fill the overhang part of the restriction site, E. coli cells were transfected. Transfected cells were selected and transferred to a medium containing antibiotics, and each colony was excised and cultured overnight at 37 ° C. in a 384 well plate of LB / 2X carbenicillin culture.
[0308]
Cells were lysed and DNA was PCR amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) as follows. Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 60 ° C, 1 minute, Step 4: 72 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 29 times . Step 6: Store at 72 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C. DNA was quantified with PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples are diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), and the DYENAMIC energy transfer sequencing primer and the DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing reaction kit (Terminator cycle sequencing ready) reaction kit) (Applied Biosystems).
[0309]
Similarly, full-length nucleotide sequences are verified using the above procedure, or 5 ′ regulatory sequences are obtained using oligonucleotides designed for such extensions and appropriate genomic libraries.
[0310]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
CDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using hybridization probes derived from SEQ ID NO: 21-40. Although specifically described for labeling oligonucleotides of about 20 base pairs, virtually the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences).³²Label by mixing 250 μCi of P] adenosine triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech) with T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is thoroughly purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba1 or Pvu II (DuPont NEN) endonuclease 10⁷An aliquot containing a count of labeled probes is used.
[0311]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blots are washed sequentially at room temperature, for example under conditions consistent with 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Visualize and compare hybridization patterns using autoradiography or alternative imaging means.
[0312]
10 Microarray
Bonding or synthesizing array elements on a microarray can be accomplished using photolithography, piezoelectric printing (see inkjet printing, Baldeschweiler, etc.), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. . In each of the above technologies, the substrate should be a uniform and non-porous solid (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, an array similar to dot blot or slot blot may be utilized to place and bind elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical bonding procedures. Conventional arrays can be made using available methods and machines well known to those skilled in the art and can have any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470, Shalon. D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0313]
Full-length cDNAs, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art such as Laser GENE software (DNASTAR). The array element is hybridized with the polynucleotide in the biological sample. The polynucleotide in the biological sample is conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization is detected at each array element using a fluorescent scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to elements on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
[0314]
Tissue or cell sample preparation
Isolate total RNA from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) using the oligo (dT) cellulose method⁺Purify RNA. Each poly (A)⁺RNA samples were MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21mer), 1X first strand buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, 500 μM Reverse transcription using 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). Reverse transcription reaction was performed using poly (A) using the GEMBRIGHT kit (Incyte).⁺Perform in 25 volume ml of RNA. Specific control poly (A)⁺RNA is derived from non-coding yeast genomic DNAin vitroSynthesize by transcription. After incubation at 37 ° C for 2 hours, each reaction sample (one Cy3 and the other Cy5 labeled) was treated with 2.5 ml of 0.5M sodium hydroxide and incubated at 85 ° C for 20 minutes to react. To break down RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After mixing, the two reaction samples are ethanol precipitated using 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. Samples are then dried and finished using SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl of 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0315]
Microarray preparation
An array element is generated using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from vector-containing bacterial cells with a cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence located on the side of the cDNA insert. Array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg in 30 cycles of PCR. Amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0316]
The purified array element is fixed on a polymer-coated slide glass. Microscope slides (Corning) are sonicated in 0.1% SDS and acetone, and washed well with distilled water during and after treatment. The slides were etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed extensively in distilled water, and 0.05% aminopropylsilane (Sigma) in 95% ethanol. ) To coat. The coated glass slide is cured with 110 ° C. of iron.
[0317]
Array elements are added to the coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. This patent is hereby incorporated by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed machine. The instrument now adds approximately 5 nl of array element samples per slide.
[0318]
The microarray is UV crosslinked using a STRATALINKER UV crosslinking agent (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. After incubating the microarray for 30 minutes at 60 ° C. in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA), 0.2% SDS and Nonspecific binding sites are blocked by washing with distilled water.
[0319]
Hybridization
The hybridization reaction solution contained 9 μl of a sample mixture containing 0.2 μg of each of a Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis product in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture is heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted on the microarray surface to 1.8 cm.² Cover with a cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. Keep the chamber interior at 100 humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated for about 6.5 hours at 60 ° C. Arrays were washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) for 10 minutes at 45 ° C. and in the second wash buffer (0.1 × SSC) for 10 minutes at 45 ° C. for 3 minutes each. Wash once and dry.
[0320]
detection
The reporter labeled hybridization complex is equipped with an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Santa Clara CA) capable of generating spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation. Detect with a microscope. The excitation laser light is focused on the array using a 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer-controlled X-Y stage of the microscope and passed through the objective lens for raster scanning. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example was scanned with a resolution of 20 μm.
[0321]
Of the two different scans, the mixed gas multiline laser sequentially excites two fluorescent dyes. The emitted light is separated based on the wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorescent dyes. The signal is filtered using a suitable filter placed between the array and the photomultiplier tube. The maximum emission wavelength of the fluorescent dye used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorochromes simultaneously, but scans once for each fluorochrome and usually scans each array twice using a suitable filter in the laser source.
[0322]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by the cDNA control species added to a known concentration of the sample mixture. A specific location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location is correlated with the hybridization species at a weight ratio of 1: 100,000. When two samples from different sources (such as cells to be tested and control cells) are each labeled with a different fluorescent dye and hybridized to a single array to identify genes that are differentially expressed Performs calibration by labeling a sample of cDNA to be calibrated with two fluorescent dyes and adding equal amounts of each to the hybridization mixture.
[0323]
The photomultiplier tube output is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) conversion board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensity is mapped using a linear 20-color conversion from a blue (low signal) to a red (high signal) pseudo color range. Data is also analyzed quantitatively. When two different fluorescent dyes are excited and measured simultaneously, using the emission spectra of each fluorescent dye, the data first corrects for optical crosstalk between the fluorescent dyes (due to overlapping emission spectra).
[0324]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescence signals within each element are integrated to give a numerical value depending on the average intensity of the signal. The software used for signal analysis is the GEMTOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0325]
11 Complementary polynucleotides
A sequence complementary to a sequence encoding KAP or any portion thereof is used to reduce or inhibit the expression of native KAP. Although the use of oligonucleotides comprising about 15-30 base pairs is described, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. Appropriate oligonucleotides are designed using Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of KAP. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to inhibit the promoter from binding to the coding sequence. In order to inhibit translation, a complementary oligonucleotide is designed to inhibit the ribosome from binding to the transcript encoding KAP.
[0326]
12 KAP Expression
Expression and purification of KAP can be performed using bacterial or viral based expression systems. For KAP expression in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that increases antibiotic resistance and the level of transcription of the cDNA. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter and trp-lac (tac) hybrid promoter associated with the lac operator regulator. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express KAP when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of KAP in eukaryotic cells is commonly known as baculovirusAutographica californicaIt is performed by infecting insect cell lines or mammalian cell lines with nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). A non-essential polyhedron gene of baculovirus is replaced with cDNA encoding KAP by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid mediation. The infectivity of the virus is maintained, and a high level of cDNA transcription is performed by a strong polyhedron promoter. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (See Engelhard. E. K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
[0327]
In most expression systems, KAP becomes a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S transferase (GST), or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, so recombinant fusion proteins from unpurified cell lysates Affinity-based purification of can be performed quickly in one step. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum that enables purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from KAP at specific engineered sites. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His, in which 6 histidine residues are continuously extended, allows purification on a metal chelate resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) chapters 10 and 16 above. Using KAP purified by these methods directly,Example16, 17, 18, and 19 assays can be performed.
[0328]
13 Functional assays
KAP function is assessed by expression of sequences encoding KAP at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses cDNA at high levels. Selection vectors include the pCMV SPORT plasmid (Life Technologies) and the pCR 3.1 plasmid (Invitrogen), both of which have a cytomegalovirus promoter. Using a liposomal formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is simultaneously transfected. The expression of the labeled protein provides a means to distinguish between transfected and non-transfected cells. Moreover, expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. The labeled protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells that express GFP or CD64-GFP using flow cytometry (FCM), an automated, laser-optical technology, and evaluate the apoptotic status and other cellular properties of the cells To do. FCM detects and measures the uptake of fluorescent molecules that diagnose phenomena that precede or occur simultaneously with cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and granularity as measured by forward light scattering and 90 ° side light scattering, Down-regulation of DNA synthesis measured by a decrease in bromodeoxyuridine incorporation, changes in protein expression on the cell surface and in cells measured by reactivity with specific antibodies, and cells of fluorescent complex annexin V protein There is a change in the plasma membrane composition measured by binding to the surface. For flow cytometry, see Ormerod, M. G. (1994).Flow CytometryDescribed in Oxford, New York, NY.
[0329]
The effect of KAP on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with either the sequence encoding KAP and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using a magnetic bead coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding KAP and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0330]
14 KAP Of specific antibodies
Standard methods using KAP substantially purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, for example, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 1816-3088-495) or other purification techniques. Immunize rabbits to produce antibodies.
[0331]
Alternatively, the KAP amino acid sequence is analyzed using laser GENE software (DNASTAR) to determine the highly immunogenic region. Then, a corresponding oligopeptide is synthesized, and an antibody is generated using this oligopeptide by a method well known to those skilled in the art. The selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or in the adjacent hydrophilic region, is known in the art (see Ausubel, 1995, chapter 11 above).
[0332]
Usually, an oligopeptide of about 15 residues in length is synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems) using Fmoc chemistry, and by a reaction using N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). Bind to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to increase immunogenicity (see Ausubel, 1995 et al., Supra). Rabbits are immunized with oligopeptide-KLH conjugate in complete Freund's adjuvant. For example, the peptide or KAP is bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and reacted with radioiodine-labeled goat anti-rabbit IgG. The serum is tested for anti-peptide activity and anti-KAP activity.
[0333]
15 Natural using specific antibodies KAP Purification
Native or recombinant KAP is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for KAP. The immunoaffinity column is formed by covalently binding an activation chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech) and an anti-KAP antibody. After bonding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
[0334]
The culture solution containing KAP is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of KAP (eg, with a high ionic strength buffer in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that break the binding between the antibody and KAP (eg, with a pH 2-3 buffer or chaotropic ions such as high concentrations of urea or thiocyanate ions) and KAP is recovered.
[0335]
16 KAP Of molecules that interact with
KAP or biologically active KAP fragment¹²⁵Label with I Bolton Hunter reagent. (See, for example, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539.) Candidate molecules previously sequenced in multiwell plates are incubated with labeled KAP, washed and labeled. Assay all wells with KAP complexes. Using the data obtained at various KAP concentrations, calculate the quantity, affinity, and association value of KAP bound to the candidate molecule.
[0336]
Alternatively, molecules interacting with KAP can be obtained by using the yeast two-hybrid system described in Fields, S. and O. Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech ) And other commercial kits based on 2-hybrid systems.
[0337]
KAP also uses the PATHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT), which uses the yeast two-hybrid system in a high-throughput manner, to determine all interactions between genes encoded in the two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) US Pat. No. 6,057,101). (2000) US Patent No. 6,057,101).
[0338]
17 KAP Demonstration of activity
Usually, protein kinase activity is [γ-³²Measured by quantifying protein substrate phosphorylation by KAP in the presence of P] ATP. KAP is a protein substrate,³²Incubate with P-ATP and appropriate kinase buffer. Incorporated into the substrate³²P is released by electrophoresis³²Separated and incorporated from P-ATP³²P is counted with a radioisotope counter. Incorporated³²The amount of P is proportional to the activity of KAP. Quantification of phosphorylated specific amino acid residues is made by phosphoamidic acid analysis of hydrolyzed proteins.
[0339]
In some embodiments, protein kinase activity is measured by quantifying the amount of gamma phosphate transferred from adenosine triphosphate (ATP) to a serine, threonine, or tyrosine residue in the protein substrate. The reaction consists of a protein kinase sample with a biotinylated peptide substrate and gamma³²Occurs with P-ATP. Following reaction, avidin in the solution was labeled with biotin³²It is added for the purpose of binding to the P peptide product. The bound sample then retains the product avidin complex and free gamma³²Centrifugal ultrafiltration process is performed using a P-ATP permeable membrane. As the rest³²The centrifuge unit reservoir containing the P-peptide product is then counted in a scintillation counter. This method allows for the assay of any type of protein kinase with a selected peptide substrate and kinase reaction buffer. This assay is provided in kit form (ASUA, Affinity Ultrafiltration Separation Assay, Transbio Corporation, Baltimore MD, US Pat. No. 5,869,275). Suggested substrates and their respective enzymes include, but are not limited to, histone H1 (Sigma) and p34^cdc2Kinase, Annexin I, Angiotensin (Sigma) and EGF receptor kinase, Annexin II and src kinase, ERK1 and ERK2 substrates and MEK, myelin basic protein and ERK (Pearson, JD et al., (1991) Methods Enzymol. 200 : 62-81).
[0340]
In another embodiment, the protein activity of KAP comprises KAP, 50 μl kinase buffer, 1 μg substrate (eg, myelin basic protein (MBP) or synthetic peptide substrate), 1 mM DTT, 10 μg ATP, and 0.5 μCi. [γ-³²In assays involving P] ATPin vitroIndicated by Incubate the reaction at 30 ° C. for 30 minutes and stop the reaction by pipetting to P81 paper. Not incorporated [γ-³²P] ATP is removed by washing and the incorporated radioactivity is measured using a scintillation counter. Alternatively, the reaction is stopped by heating to 100 ° C. in the presence of SDS loading buffer and separated on a 12% SDS polyacrylamide gel by autoradiography. Incorporated³²The amount of P is proportional to the activity of KAP.
[0341]
In yet another example, the adenylate kinase or guanylate kinase activity of KAP is determined using a gamma radioisotope counter [γ-³²P] ATP to ADP or GDP³²It can be measured by incorporation of P. KAP in the kinase buffer serves as an appropriate nucleotide monophosphate substrate (AMP or GMP) and phosphate donor³²Incubate with p-labeled ATP. The reaction is incubated at 37 ° C. and is terminated by the addition of trichloroacetic acid. The acid extract is neutralized and subjected to gel electrophoresis to separate the monophosphate, diphosphate and triphosphate nucleotide fractions. The diphosphate nucleotide fraction is removed and counted. The recovered radioactivity is proportional to the activity of KAP.
[0342]
In yet another example, other assays for KAP include scintillation proximity assay (SPA), scintillation plate technology, and filter binding assays. Useful substrates include recombinant proteins labeled with glutathione transferase, or synthetic peptide substrates labeled with biotin. Inhibitors of KAP activity, such as small organic molecules, proteins, and peptides, are identified in such assays.
[0343]
KAP activity is measured by hydrolysis of P-nitrophenyl phosphate (PNPP). KAP is incubated for 60 minutes at 37 ° C with PNPP in HEPES buffer pH 7.5 in the presence of 0.1% β-mercaptoethanol. The reaction is stopped by adding 6 ml of 10N sodium hydroxide (Diamond, R.H. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 375262). Alternatively, the acid phosphatase activity of KAP is demonstrated by incubation of an extract containing KAP in 0.1 M sodium citrate with a pH of 4.5 and 50 μl of 40 mM sodium chloride and 100 μl of 10 mM PNPP at 37 ° C. for 20 minutes. . The reaction is stopped by adding 0.5 ml of 0.4 M glycine / NaOH (pH 10.4) (Saftig, P. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 1862818635). The increase in light absorption at 410 nm caused by the hydrolysis of PNPP is measured with a spectrophotometer. In this assay, the increase in light absorption is proportional to the activity of KAP.
[0344]
Alternatively, KAP activity is determined by measuring the amount of phosphate removed from the phosphorylated protein substrate. Reactions include 2 nM or 4 nM KAP in a final volume of 30 μl containing 60 mM Tris (pH 7.6), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% β-mercaptoethanol and 10 μM substrate labeled with serine / threonine or tyrosine. Including. The reaction is started with substrate and incubated at 30 ° C. for 10-15 minutes. 0.6 M HC1, 90 mM Na_FourP₂O₇, And 2 mM NaH₂PO_FourStop with 450 μl of 4% (w / v) activated charcoal in, then centrifuge at 12,000 × g for 5 minutes. Acid soluble³²Pi is quantified with a liquid scintillation counter (Sinclair, C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 2366623672).
[0345]
18 Kinase binding assay
The binding of KAP to the FLAG-CD44cyt fusion protein was achieved by incubating KAP with anti-KAP-conjugated immunoaffinity beads,¹²⁵In the presence of I-labeled FLAG-CD44cyt fusion protein (5,000 cpm / ng protein), 0.5 ml binding buffer (20 mM Tris-HCL (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin and 0.05 % Triton X-100) and incubation at 4 ° C. for 5 hours. After binding, the beads were washed well in binding buffer and the bead-bound radioactivity was measured with a scintillation counter (Bourguignon, L.Y.W. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 7327-7336).³²The amount of P is proportional to the amount of bound KAP.
[0346]
19 KAP Inhibitor identification
Example 1 7As described in the assay, the compound to be tested is injected into the wells of a 384-well plate at various concentrations with a suitable buffer and substrate. KAP activity can be measured for each well to determine the ability and dose-response kinetics of each compound to inhibit KAP activity. This assay can also be used to identify molecules that promote KAP activity.
[0347]
20 KAP Substrate identification
The KAP “substrate-trapping” assay takes advantage of the increased substrate affinity that can be conferred by specific mutations in the PTP signature sequence of protein tyrosine phosphatases. KAPs with such mutations form stable complexes with their substrates and such complexes can be isolated biochemically. Mutation of a specific site of an invariant residue in the PTP signature sequence of a clone encoding the catalytic domain of KAP can be performed using methods well known in the art or a commercially available kit such as the MUTA-GENE kit sold by BIO-RAD. Can be done. To induce a KAP mutation in E. coli, the DNA fragment containing the mutation is exchanged with the corresponding wild type sequence of a glutathione S-transferase (GST) -KAP fusion protein or an expression vector having a sequence encoding KAP. A KAP mutant is expressed in E. coli and purified biochemically.
[0348]
Expression vectors are transformed into COS1 or 293 cells by calcium phosphate-mediated transfection using 20 μg CsCl-purified DNA per 10 cm dish and 8 μg CsCl-purified DNA per 6 cm dish. After 48 hours from transfection, when cells are stimulated with 100 ng / ml epidermal growth factor, tyrosine kinase EGFR is present in abundance in COS cells, increasing tyrosine phosphorylation in the cells. Cells were treated with 50 mM Tris HCl (pH 7.5) / 5 mM EDTA / 150 mM NaCl / 1% Triton X-100 / 5 mM iodoacetic acid / 10 mM sodium phosphate / 10 mM NaF / 5 μg / ml leupeptin / 5 μg / ml aprotinin / 1 mM benzamidine (1ml per 10cm petri dish, 0.5ml per 6cm petri dish). KAP is immunoprecipitated from the lysate with a suitable antibody. GST-KAP fusion protein is precipitated with glutathione-Sepharose, 4 μg mAb or 10 μl beads per mg of cell lysate, respectively. Complexes can be visualized by polyacrylamide electrophoresis (PAGE) but can be further purified to identify substrate molecules (Flint, AJ et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1680-1685).
[0349]
21 Enhancement / inhibition of protein kinase activity
Agonists or antagonists of KAP activation or inhibition are:Example 17You may test using the assay described in. Agonists cause an increase in KAP activity and antagonists cause a decrease in KAP activity.
[0350]
Those skilled in the art may make various modifications to the methods and systems described in this invention without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[0351]
(Short description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature for the full-length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0352]
Table 2 shows GenBank identification numbers and annotations of GenBank homologs closest to the polypeptides of the invention. The probability score for each polypeptide and its GenBank homologue is also shown.
[0353]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the present invention, including predicted motifs and domains, along with methods, algorithms and searchable databases for use in polypeptide analysis.
[0354]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to construct the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequences.
[0355]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotides of the present invention.
[0356]
Table 6 is an appendix explaining the tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0357]
Table 7 shows the tools, programs, algorithms used in the analysis of the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references and threshold parameters.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[Table 11]

[Table 12]

[Table 13]

[Table 14]

[Table 15]

[Table 16]

[Table 17]

[Table 18]

[Table 19]

[Table 20]

[Table 21]

[Table 22]

[Table 23]

[Table 24]

[Table 25]

[Table 26]

[Table 27]

[Table 28]

[Table 29]

[Table 30]

[Table 31]

[Table 32]

[Table 33]

[Table 34]

[Table 35]

[Table 36]

[Table 37]

[Table 38]

[Table 39]

[Table 40]

[Table 41]

[Table 42]

[Table 43]

[Sequence Listing]

Claims (95)

An isolated polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
(A) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 (b) at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 A polypeptide comprising a natural amino acid sequence (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 (d) from the group having SEQ ID NO: 1-20 Immunogenic fragments of polypeptides having selected amino acid sequences 2. The isolated polypeptide of claim 1, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. 5. The isolated polynucleotide of claim 4 having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40.  A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6. A genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide according to claim 6. A method for producing the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide having a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. When,
(B) a step of recovering the polypeptide so expressed, wherein the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 A method characterized by that. 10. The method of claim 9, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20. 2. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e):
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21-40 (b) at least 90% identical to a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 21-40 Polynucleotides (e) (a) to (d) complementary to the polynucleotides (d) (b) complementary to the polynucleotides (c) (a) having the natural polynucleotide sequence ) RNA equivalent 13. An isolated polynucleotide having at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12.
14. A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide of claim 12 in a sample comprising:
(A) a step of hybridizing the sample with a probe having at least 20 consecutive nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; the probe and the target polynucleotide or fragment thereof; A probe that specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions under which a hybridization complex is formed; and
(B) detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. 15. The method of claim 14, wherein the probe comprises at least 60 consecutive nucleotides. A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide of claim 12 in a sample comprising:
(A) amplifying the target polynucleotide or fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) including the step of detecting the presence / absence of the amplified target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof if present. Method. A composition comprising the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 18. The composition of claim 17, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20. A method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional KAP, comprising administering the composition of claim 17 to a patient in need of such treatment. A method of screening a compound to confirm its effectiveness as an agonist of the polypeptide of claim 1 comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting the agonist activity in the sample. 21. A composition comprising an agonist compound identified by the method of claim 20 and a pharmaceutically acceptable excipient. A method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional KAP, comprising administering the composition of claim 21 to a patient in need of such treatment. A method of screening a compound to confirm its effectiveness as an antagonist of the polypeptide of claim 1 comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting an antagonist activity in the sample. 24. A composition comprising an antagonist compound identified by the method of claim 23 and a pharmaceutically acceptable excipient. 25. A method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional KAP, comprising administering the composition of claim 24 to a patient in need of such treatment. A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under suitable conditions;
(B) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A method for screening for a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under conditions that permit the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound, A method wherein a change in the activity of the polypeptide of claim 1 is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1. A method of screening for compounds effective to alter the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of claim 5 comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting expression modification of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of the target polynucleotide in the presence of a variable amount of the compound and in the absence of the compound. A method for calculating the toxicity of a test compound comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acid with the test compound;
(B) hybridizing a nucleic acid of the treated biological sample with a probe having at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12, wherein the hybridization comprises the probe and the organism. Wherein the target polynucleotide has the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 12, or a fragment thereof, wherein the target polynucleotide has a polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 12 or a fragment thereof. A polynucleotide, said process;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of hybridization complex in the treated biological sample with the amount of hybridization complex in the untreated biological sample, Such that differences in the amount of hybridization complexes in the biological sample indicate the toxicity of the test compound. A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of TMP in a biological sample, comprising:
(A) mixing said biological sample with the antibody of claim 11 under conditions suitable for said antibody to bind said polypeptide and form a complex of antibody and polypeptide; ,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. The antibody is
An antibody that is any one of (a) a chimeric antibody, (b) a single chain antibody, (c) a Fab fragment, (d) an F (ab ′) ₂ fragment, and (e) a humanized antibody. 12. A composition comprising the antibody of claim 11 and an acceptable excipient. 33. A method for diagnosing a medical condition or disease associated with the expression of KAP in a subject, comprising the step of administering an effective amount of the composition according to claim 32 to the subject. 33. The composition of claim 32, wherein the antibody is labeled. 35. A method for diagnosing a medical condition or disease associated with the expression of KAP in a subject, comprising the step of administering to the subject an effective amount of the composition of claim 34. A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody of claim 11, comprising:
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 or an immunogenic fragment thereof under conditions that elicit an antibody response;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody with the polypeptide, thereby identifying a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-20; Including such methods. 37. A polyclonal antibody produced by the method of claim 36. 38. A composition comprising the polyclonal antibody of claim 37 and a suitable carrier. A method for producing a monoclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-20 or an immunogenic fragment thereof under conditions that elicit an antibody response;
(B) isolating antibody producing cells from the animal;
(C) fusing the antibody-producing cells and immortalized cells to form hybridoma cells that produce monoclonal antibodies;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the culture a monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-20. 40. A monoclonal antibody produced by the method of claim 39. 41. A composition comprising the monoclonal antibody of claim 40 and a suitable carrier. 12. The antibody of claim 11, wherein the antibody is produced by screening a Fab expression library. 12. The antibody according to claim 11, wherein the antibody is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. A method for detecting a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20,
(A) incubating the antibody and one sample under conditions allowing specific binding between the antibody of claim 11 and the polypeptide;
(B) detecting specific binding, wherein the specific binding indicates that a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 is present in the sample And how to. A method for purifying a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20 from a sample comprising:
(A) incubating the antibody and one sample under conditions allowing specific binding between the antibody of claim 11 and the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-20. 14. A microarray, wherein at least one element of the microarray is a polynucleotide according to claim 13. A method for generating an expression profile of a sample comprising a polynucleotide comprising:
(A) labeling the polynucleotide in the sample;
(B) contacting the microarray element of claim 46 with a labeled polynucleotide in a sample under conditions suitable for formation of a hybridization complex;
(C) quantifying the expression of the polynucleotide in the sample. An array comprising various nucleotide molecules attached at unique physical locations on a solid substrate, wherein at least one said nucleotide molecule is capable of specifically hybridizing with at least 30 consecutive nucleotides of a target polynucleotide 13. An array comprising oligonucleotides or polynucleotides, wherein the target polynucleotide is the polynucleotide of claim 12. 49. The array of claim 48, wherein the first oligonucleotide or polynucleotide sequence is completely complementary to at least 30 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the sequence of the first oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to at least 60 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the sequence of the first oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the array is a microarray. 49. The array of claim 48, comprising the target polynucleotide hybridized to a nucleotide molecule comprising a first sequence of the oligonucleotide or polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein a linker connects at least one of the nucleotide molecules and the solid substrate. 49. The array of claim 48, wherein each unique physical location on the substrate comprises a plurality of nucleotide molecules, wherein the plurality of nucleotide molecules at any single unique physical location have the same sequence. And each of the unique physical locations on the substrate comprises nucleotide molecules having a sequence different from the sequence of the nucleotide molecules at another unique physical location on the substrate. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 2. The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 21. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 22. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 23. The polynucleotide of claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 24. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 25. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 26. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 28. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 29. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 30. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 31. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 32. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 33. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 34. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 35. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 37. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 38. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 39. The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 40.