JP2004522409A - Human kinase - Google Patents

Abstract

The present invention provides polynucleotides that identify and encode human human kinase (PKIN) and PKIN. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with abnormal expression of PKIN.

Description

【００６５】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００６６】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００６７】
「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００６８】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【００６９】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子またはタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００７０】
用語「断片」は、ＰＫＩＮ またはＰＫＩＮ をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２ の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２ を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の断片の正確な長さ及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の断片によってコードされる。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ の断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ を特異的に認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ の断片及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６ の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００７３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００７４】
「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【００７５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００７６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【００７７】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「ｂｌａｓｔｎ」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するために用いる「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と称されるツールも利用可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ と ｂｌａｓｔｐ（後述）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ および Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さと比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７８】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００７９】
ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００８０】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【００８１】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ および Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００８２】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【００８３】
「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体により近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持しているような抗体分子を指す。
【００８４】
「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリングするプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【００８５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約０．１％のＳＤＳの存在下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。特定条件下、例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいて有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【００８７】
「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ解析等）。 或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【００８８】
「挿入」及び「付加」の語は、１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００８９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【００９０】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＰＫＩＮのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＰＫＩＮのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【００９１】
「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【００９２】
「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、マイクロアレイの環境において、基質の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００９３】
用語「調節」は、ＰＫＩＮの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＰＫＩＮのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【００９４】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【００９５】
「機能的に結合した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係があるように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。
【００９６】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端のリジンは、成分に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【００９７】
ＰＫＩＮの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＰＫＩＮの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【００９８】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＰＫＩＮやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される。
プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【００９９】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。 表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１００】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓら （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１０１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０２】
「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせなければ離隔しているような配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【０１０３】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであって例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応答を誘導する。
【０１０４】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の未翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１０５】
「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられる化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１０６】
ＤＮＡ配列に関する「ＲＮＡ等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースから構成されていることを除いて、参照ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチド線形配列から構成されている。
【０１０７】
「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。ＰＫＩＮ、ＰＫＩＮをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１０８】
「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチドの存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。
【０１０９】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメントの少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が遊離しているものを指す。
【０１１０】
「置換」は、１個若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【０１１１】
「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１１２】
「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１１３】
「形質転換」は、外来性のＤＮＡが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させるプロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１１４】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に与えられている。
【０１１５】
特定の核酸配列の「変異体」は、一定の長さの一本の核酸配列に対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。また、多形性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリヌクレオチド配列が変化する「１塩基多型」（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１１６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１１７】
発明
本発明は、新規のヒトキナーゼ（ＰＫＩＮ）及びＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した癌、免疫疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、心血管疾患、および脂質異常の診断、治療、及び予防に関する。
【０１１８】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１１９】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｗｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１２０】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１２１】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドがヒトキナーゼであることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はラットセリン／トレオニンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２０５２１８９）と９４％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳの確率スコアは０．０であり、観察されるポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はまた、プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ はマウスプロテインキナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４０６０５８） ）に８８％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳの確率スコアは０．０であり、観察されるポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ がプロテインキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ はウサギのミオシン軽鎖キナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６５５０６）に８５％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．５ｅ−２７２であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、真核生物プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ及びＭＯＴＩＦＳ 解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６がミオシン軽鎖キナーゼであることをさらに実証する証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ はマウスセリン／トレオニンキナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４０４６３４）に６４％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．５ｅ−６０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、プロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ がプロテインキナーゼ、特にセリン／トレオニンキナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ はヒトＧ−タンパク質結合受容体キナーゼのＧＲＫ４−ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ９９２６７２ ）に４９％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．３ｅ−１２９であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９はまた、Ｇ−タンパク質シグナル伝達レギュレータ（制御因子）ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ がＧタンパク質結合受容体キナーゼであることを裏づける証拠を更に提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０−２２ およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−２６ は同様にして解析し、注釈付けをされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６を解析するためのアルゴリズム及びパラメータは表７に記述する。
【０１２２】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブルするのに用いた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１２３】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリを意味する。例えば、６８２９３１５Ｈ１ はＩｎｃｙｔｅｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＳＩＮＴＮＯＲ０１はそれが由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリ（例えば、５５０５７２２６Ｈ１）に由来する。または、列５の識別番号は、完全長のポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇｇ２９５４２０８）の識別番号の場合もある。さらに、列５の識別番号はＥＮＳＥＭＢＬ （Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ） データベース（すなわち、「ＥＮＳＴ」と命名された配列）から由来した配列を示す。あるいは、列５の識別番号はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ヌクレオチド配列記録データベース（すなわち、「ＮＭ」または「ＮＴ」と命名された配列）またはＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ タンパク質配列記録（すなわち、「ＮＰ」と命名された配列）から由来している。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方の集合を指す。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ_１＿Ｎ_２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ_３＿Ｎ_４ は「スティッチ」配列を表しており、ＸＸＸＸＸＸはアルゴリズムが適用された配列のクラスターの識別番号であり、また、ＹＹＹＹＹ はアルゴリズムによって出された予測の番号である。Ｎ_{１，２，３．．．}， は存在する場合は、解析している時に手動で編集された可能性のある特定のエキソンを示す（実施例５を参照）。または列５の識別番号は、「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎ は「ストレッチ」配列の識別番号であり、ＸＸＸＸＸＸ はＩｎｃｙｔｅ プロジェクト識別番号で、ｇＡＡＡＡＡ は「エキソンストレチング」アルゴリズムが適用されたヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ 識別番号である。さらに、ｇＢＢＢＢＢ は最も近親のＧｅｎＢａｎｋ タンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ 識別番号か、またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 識別番号であり、Ｎは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。ＲｅｆＳｅｑ 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、ＲｅｆＳｅｑ 識別子（「ＮＭ 」、「ＮＰ」または「 ＮＴ」と表示された）はＧｅｎＢａｎｋ 識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使われる場合もある。
【０１２４】
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムＤＮＡ配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。

【０１２５】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するための列５に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１２６】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって最も頻繁に代表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１２７】
本発明はまた、ＰＫＩＮの変異体も含む。好適なＰＫＩＮの変異体は、ＰＫＩＮの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつＰＫＩＮアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２８】
本発明はまた、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＰＫＩＮをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１２９】
本発明はまた、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＰＫＩＮの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１３０】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＰＫＩＮをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、選択可能なコドンに基づく組合せを選ぶことによって産出されるようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅する。これらの組み合わせは、天然のＰＫＩＮのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１３１】
ＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＰＫＩＮのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＰＫＩＮ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＰＫＩＮ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１３２】
本発明はまた、ＰＫＩＮ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。
【０１３３】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。 或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の調製を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ 或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページ．等を参照）。
【０１３４】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＰＫＩＮをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、 Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８３２２を参照。）別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６等を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している。（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている。 （Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．ら （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１３５】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１３６】
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＰＫＩＮ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＰＫＩＮの発現に利用可能である。
【０１３７】
種々の目的でＰＫＩＮをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介特定部位突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。
【０１３８】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＰＫＩＮの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＰＫＩＮの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲ仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。このように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換えて、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１３９】
別の実施例によれば、ＰＫＩＮをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．７：２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＰＫＩＮ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成し得る。更にＰＫＩＮのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１４０】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．および Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページ等を参照）。
【０１４１】
生物学的に活性なＰＫＩＮを発現させるために、ＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＰＫＩＮをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＰＫＩＮをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２．等を参照）。
【０１４２】
当業者に周知の方法を用いて、ＰＫＩＮをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章，８章及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０１４３】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＰＫＩＮをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物がある。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． ら （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． ら （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． ら （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１４４】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＰＫＩＮをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＰＫＩＮが必要な場合は、ＰＫＩＮの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導Ｔ５バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１４５】
ＰＫＩＮの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）。
【０１４６】
植物系もＰＫＩＮの発現に使用可能である。ＰＫＩＮ をコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターによって促進される。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６頁等を参照。
【０１４７】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＰＫＩＮをコードする配列を結合し得る。可欠Ｅ１またはＥ３領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でＰＫＩＮを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１４８】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１４９】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＰＫＩＮの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＰＫＩＮをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。 このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１５０】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ⁻単純細胞のために用いられるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ⁻細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． ら （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７３５７０； ＣｏｌｂｅｒｅＧａｒａｐｉｎ， Ｆ． ら （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１１４ 等を参照。）この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７−８０５１等を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０１５１】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＰＫＩＮをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＰＫＩＮをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＰＫＩＮをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１５２】
一般に、ＰＫＩＮをコードする核酸配列を含み、ＰＫＩＮを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質配列の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＰＫＩＮの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＰＫＩＮ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベース イムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． ら （１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． ら （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１５４】
多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＰＫＩＮをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１５５】
ＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＰＫＩＮの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティング、折りたたみ及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１５６】
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＰＫＩＮタンパク質が、ＰＫＩＮの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＰＫＩＮをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＰＫＩＮが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１５７】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＰＫＩＮの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、例えば^３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１５８】
本発明のＰＫＩＮまたはその断片を用いて、ＰＫＩＮに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＰＫＩＮへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１５９】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＰＫＩＮの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＰＫＩＮが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＰＫＩＮを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、大腸菌からの細胞が含まれる。ＰＫＩＮを発現する細胞またはＰＫＩＮを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＰＫＩＮまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１６０】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＰＫＩＮと結合させるステップと、ＰＫＩＮとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１６１】
本発明のＰＫＩＮまたはその断片を用いて、ＰＫＩＮの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＰＫＩＮが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＰＫＩＮの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＰＫＩＮの活性が試験化合物不在下でのＰＫＩＮの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＰＫＩＮの活性の変化は、ＰＫＩＮの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＰＫＩＮの活性に適した条件下でＰＫＩＮを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＰＫＩＮの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１６２】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＰＫＩＮまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１６３】
ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０１６４】
ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＰＫＩＮを乳汁内に分泌するなどＰＫＩＮを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１６５】
治療
ＰＫＩＮのある領域とヒトキナーゼのある領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、ＰＫＩＮの発現は脂質障害、膵島細胞、肝疾患、白血球、臍帯内皮細胞、癌並びに、正常および罹患脳、腎性、生殖、膀胱腫瘍、後側海馬、腎臓、小腸、大腸および消化器系組織に密接に関連する。従って、ＰＫＩＮは、癌、免疫疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、心血管疾患、および脂質異常においてある役割を果たすと考えられる。ＰＫＩＮの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＰＫＩＮの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＰＫＩＮの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０１６６】
従って、一実施例において、ＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＰＫＩＮまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には癌、免疫疾患、成長及び発達に影響を及ぼす障害、アテローム性動脈硬化症及びその他の心血管疾患、及び脂質異常が含まれ、癌の中には腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発骨髄腫などの白血病、悪性リンパ腫などのリンパ腫が含まれ、免疫疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、成長および発達に影響を及ぼす疾患の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌や、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、バイパス手術、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪石灰化、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症と、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、Ｇ_{Ｍ ２}にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症が含まれる。
【０１６７】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＰＫＩＮまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＰＫＩＮを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０１６８】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＰＫＩＮの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１６９】
更なる実施例では、ＰＫＩＮの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＰＫＩＮのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した癌、免疫疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、心血管疾患、および脂質異常が含まれる。一実施態様では、ＰＫＩＮと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＰＫＩＮを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１７０】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＫＩＮの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１７１】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１７２】
ＰＫＩＮのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたＰＫＩＮを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＰＫＩＮと特異的に結合するものを同定が可能である。ＰＫＩＮの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。 但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１７３】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＰＫＩＮまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１７４】
ＰＫＩＮに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。ＰＫＩＮアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１７５】
ＰＫＩＮに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ら． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０１７６】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＰＫＩＮ特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． ら （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９等を参照）。
【０１７７】
ＰＫＩＮに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）_２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）_２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． ら （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１等を参照）。
【０１７８】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、ＰＫＩＮとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性ＰＫＩＮエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１７９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＰＫＩＮに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＰＫＩＮ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＰＫＩＮエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、ＰＫＩＮに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＰＫＩＮエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＰＫＩＮ抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＰＫＩＮが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 （Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． および Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１８０】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような医薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、ＰＫＩＮ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ らの文献等を参照）。
【０１８１】
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＰＫＩＮをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＰＫＩＮをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， ｅｄ． （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照。）
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５； およびＳｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５） ９（１３）：１２８８−１２９６を参照。）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． および Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．ら （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６． 等を参照）。
【０１８２】
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． ら （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． ら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ． ら （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． ら． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５ Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． ら （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、並びにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＰＫＩＮの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＰＫＩＮを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
本発明の更なる実施例では、ＰＫＩＮの欠損による疾患や異常症は、ＰＫＩＮをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＰＫＩＮ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． および Ｈ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）がある。
【０１８３】
ＰＫＩＮの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＰＫＩＮを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． および Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＰＫＩＮをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０１８４】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． ら （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． ら． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． ら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． ら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４^＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． ら （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０１８６】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＰＫＩＮの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． ら． （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． ら （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 及び Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１８７】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＰＫＩＮの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＰＫＩＮを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ 型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． ら （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（”Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． ら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ 及び Ｘｕ， Ｈ． ら （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０１８８】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＰＫＩＮをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＰＫＩＮをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＰＫＩＮが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． ら． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＰＫＩＮを導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０１８９】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． ら （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．および Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０１９０】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。例えば、ＰＫＩＮをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１９１】
任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定する。一度同定すると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【０１９２】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成の当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製することができる。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＰＫＩＮをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０１９３】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることができる。
【０１９４】
本発明の更なる実施例は、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＰＫＩＮの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＰＫＩＮの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。 通常、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． ら （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． ら （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． ら （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０１９５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０１９６】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０１９７】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＰＫＩＮ、ＰＫＩＮの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＰＫＩＮのインヒビターなどからなる。
【０１９８】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． ら， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０１９９】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２００】
ＰＫＩＮまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、ＰＫＩＮまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． ら （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２０１】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＰＫＩＮまたはその断片、ＰＫＩＮの抗体、ＰＫＩＮのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ_５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の薬用効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２０２】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２０３】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２０４】
（診断）
別の実施例では、ＰＫＩＮに特異的に結合する抗体が、ＰＫＩＮの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＰＫＩＮやＰＫＩＮのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＰＫＩＮの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＰＫＩＮを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２０５】
ＰＫＩＮを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＰＫＩＮの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＰＫＩＮの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＰＫＩＮに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのＰＫＩＮの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２０６】
本発明の別の実施例によれば、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＰＫＩＮを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＰＫＩＮの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＰＫＩＮ値の調節を監視する。
【０２０７】
一実施形態では、ＰＫＩＮまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＰＫＩＮをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＰＫＩＮをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２０８】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＰＫＩＮをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の配列、或いはＰＫＩＮ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２０９】
ＰＫＩＮをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＰＫＩＮ及びＰＫＩＮ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、^３２Ｐまたは^３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２１０】
ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＰＫＩＮの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には癌、免疫疾患、成長及び発達に影響を及ぼす障害、アテローム性動脈硬化症及びその他の心血管疾患、及び脂質異常が含まれ、癌の中には腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発骨髄腫などの白血病、悪性リンパ腫などのリンパ腫が含まれ、免疫疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、成長および発達に影響を及ぼす疾患の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌や、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、バイパス手術、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪石灰化、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症と、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、Ｇ_{Ｍ ２}にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症が含まれる。ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＰＫＩＮの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２１１】
ある実施態様では、ＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
ＰＫＩＮの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＰＫＩＮをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２１２】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返すことができる。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２１３】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２１４】
ＰＫＩＮをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２１５】
或る実施態様において、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法がある。ＳＳＣＰでは、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２１６】
ＰＫＩＮの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、 Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ． 他 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：２３５２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． 他 （１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９２３６を参照。）目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２１７】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２１８】
別の実施例では、ＰＫＩＮ、ＰＫＩＮの断片、ＰＫＩＮに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２１９】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ” を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２２０】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． ら． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。自己の発現が任意の試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２２１】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２２２】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
プロテオームのプロファイルは、ＰＫＩＮに特異的な抗体を用いてＰＫＩＮ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． ら． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２２３】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャ（特徴）も中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２２４】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２２５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２２６】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． ら （１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ら （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ らの （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．らの （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． ら （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． らの （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２２７】
本発明の別の実施例ではまた、ＰＫＩＮをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（例えば、 Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４； Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４を参照。）一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。（例えば、 Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． および Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照。）
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， ら （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ．等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＰＫＩＮをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０２２８】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．ら （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
本発明の別の実施例では、ＰＫＩＮ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＰＫＩＮと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ，らの （１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４等を参照）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、ＰＫＩＮ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＰＫＩＮが、当分野で周知の方法で検出される。 精製されたＰＫＩＮはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
別の実施例では、ＰＫＩＮと結合可能な中和抗体がＰＫＩＮと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＰＫＩＮと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＰＫＩＮをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０２２９】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第６０／２１２．０７３号、第６０／２１３．４６７号、第６０／２１５．６５１号、第６０／２１６．６０５号、第６０／２１８．３７２号および第６０／２２８．０５６は、言及することをもって本明細書の一部となす。
（実施例）
１ ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。
ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２３０】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ５．１−６．６等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ（３００〜１０００ｂｐ）選択は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 好適なプラスミド、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、或いはその誘導体等の、ポリリンカーの適合する制限酵素部位にｃＤＮＡをつないだ。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
２ ｃＤＮＡ クローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 １のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２３１】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。 ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に与えられた試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ７．７に概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２３２】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＩＭＰＳに基づくプログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＦＡＭ等のＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースの選択に対するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせたＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプローチである（Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５等を参照）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベース、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【０２３３】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。 列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
【０２３４】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０２３５】
４ ゲノム ＤＮＡ からのコード配列の同定及び編集
推定ヒトキナーゼは、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４ 及びＢｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列がヒトキナーゼをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいてヒトキナーゼについて問合せて分析した。潜在的なヒトキナーゼが、ヒトキナーゼとしてアノテーションが付けられたインサイトｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｂｐｒｉ及びｇｂｈｔｇと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２３６】
５ ゲノム配列データのｃＤＮＡ配列データへのアセンブリ
ステッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２３７】
６ ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２３８】
このようにして、７２．３０から７７．３０センチモルガン以内の間隔でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７ を染色体１９にマップし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５ を染色体１５にマップした。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８は、９３．８０〜９６．９０センチモルガン以内の間隔で染色体１０にマッピングする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９ は１１．６０ から ２２．８０センチモルガン以内の間隔で染色体１３に、また０．６０ から １４．８０センチモルガン以内の間隔で染色体１７にマップし、さらに、 ５７．７０ から ６４．１０センチモルガン以内の間隔で 染色体２０にマップした。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９については一つ以上のマップ位置が報告され、異なったマップ位置を持つ配列が、一つのクラスターに構築されたことを示す。この状態は、極めて類似しているが、完全に同一でない配列が一つのクラスターに構築される場合に発生する。
【０２３９】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． ら， ４章及び１６章等を参照。）
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬｉｆｅＳｅｑ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２４０】
【数１】

積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０２４１】
或いは、ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの生物／組織のカテゴリーの一つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＰＫＩＮをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。 ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２４２】
８ ＰＫＩＮをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２４３】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。 ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。 プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ６０℃， １ 分、ステップ ４： ６８℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２０回反復する。 ステップ６： ６８℃， ５ 分、ステップ７： ４℃で保存する。別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ５７℃， １ 分、ステップ ４： ６８℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２０回反復する。 ステップ６： ６８℃， ５ 分、ステップ７： ４℃で保存する。
【０２４４】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するべくプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２４５】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位の張出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ６０℃， １ 分、ステップ ４： ７２℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２９回反復する。 ステップ６： ７２℃， ５ 分、ステップ７： ４℃で保存する。上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２４６】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０２４７】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−^３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて十分に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０２４８】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
１０ マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に周知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． ら （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０２４９】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第１鎖バッファ、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて２００ ｎｇ ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 結合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて析出させたエタノール、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールである。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲで１〜２ｎｇの初期量から５μｇより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０２５０】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０２５１】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ^２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０２５２】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０２５３】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比１：１００，０００に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０２５４】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０２５５】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
１１ 相補的ポリヌクレオチド
ＰＫＩＮをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＰＫＩＮの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＫＩＮのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＰＫＩＮをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０２５６】
１２ ＰＫＩＮの発現
ＰＫＩＮの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＰＫＩＮが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＰＫＩＮを発現する。真核細胞でのＰＫＩＮの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＰＫＩＮをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．等を参照）。
殆どの発現系では、ＰＫＩＮが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＰＫＩＮからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＰＫＩＮを直接用いて以下の実施例１６、１７、及び１８のアッセイを行うことができる。
【０２５７】
１３ 機能的アッセイ
ＰＫＩＮの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＰＫＩＮをコードする配列の発現によって評価する。 ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り抜きのベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方光散乱と９０°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
遺伝子発現におけるＰＫＩＮの影響は、ＰＫＩＮをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。 ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。 ＰＫＩＮ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２５８】
１４ ＰＫＩＮに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＰＫＩＮを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
別法では、ＰＫＩＮアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。 Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０２５９】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫抗原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５ 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＭ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＰＫＩＮ活性を検査するには、ペプチドまたはＰＫＩＮを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２６０】
１５ 特異的抗体を用いる天然ＰＫＩＮの精製
天然ＰＫＩＮ或いは組換えＰＫＩＮを、ＰＫＩＮに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＰＫＩＮ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２６１】
ＰＫＩＮを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＰＫＩＮを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＰＫＩＮとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピック塩で）溶出させ、ＰＫＩＮを回収する。
【０２６２】
１６ ＰＫＩＮと相互作用する分子の同定
ＰＫＩＮまたは生物学的に活性であるＡＴＲＳ断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ． および Ｗ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照。）マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＰＫＩＮと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＰＫＩＮ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＰＫＩＮ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＰＫＩＮの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０２６３】
別法では、ＰＫＩＮと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０２６４】
ＰＫＩＮはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０２６５】
１７ ＰＫＩＮの活性の実証
通常、プロテインキナーゼ活性は、γ−標識された^３２Ｐ−ＡＴＰの存在で、ＰＫＩＮによりタンパク質基質のリン酸エステル化を定量化することで測定される。ＰＫＩＮはタンパク質基質、^３２Ｐ−ＡＴＰ、及び適切なキナーゼバッファと共にインキュベートされる。基質に組み込まれた^３２Ｐは、電気泳動法で遊離^３２Ｐ−ＡＴＰより分離され、組み込まれた^３２Ｐはラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた^３２Ｐの量は、ＰＫＩＮの活性に比例する。リン酸化された特異的アミノ酸残基の定量は、加水分解タンパク質のホスホアミド酸解析によってなされる。
【０２６６】
或る実施態様では、プロテインキナーゼ活性はガンマリン酸塩がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からタンパク質基質中のセリン、トレオニン、またはチロシン残基に転移する量を定量化することによって測定される。反応はビオチン標識されたペプチド基質を有するプロテインキナーゼサンプルとガンマ^３２Ｐ−ＡＴＰとの間で起こる。反応に続き、溶液中のアビジンがビオチン標識された^３２Ｐペプチド生成物に結合させる目的で添加される。結合試料は、次に生成物アビジン複合体を保持し、遊離のガンマ^３２Ｐ−ＡＴＰの透過させる膜を用いて、遠心限外濾過プロセスを行う。残余として^３２Ｐペプチド生成物を含む遠心分離ユニットのリザーバーは、次にシンチレーションカウンタでカウントされる。この方法は、選択されたペプチド基質及びキナーゼ反応バッファによってあらゆるタイプのプロテインキナーゼのアッセイを可能とする。このアッセイは、キット形態（ＡＳＵＡ， Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｔｒａｎｓｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ，米国特許番号 ５， ８６９， ２７５）で提供される。示唆された基質及びその各々の酵素は、次の、ヒストンＨ１（シグマ）及びｐ３４^ｃｄｃ２キナーゼ、アネキシンＩ、アンギオテンシン（シグマ）及びＥＧＦ受容体キナーゼ、アネキシンＩＩ 及びｓｒｃキナーゼ、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２基質及びＭＥＫ、ミエリン塩基性蛋白質及びＥＲＫである（Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｊ． Ｄ．ら、（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００ ： ６２−８１）。
別の実施態様では、ＰＫＩＮのタンパク質活性は、ＰＫＩＮ、５０μｌのキナーゼバッファー、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）若しくは合成ペプチド基質のような１μｇの基質、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇのＡＴＰ、及び０．５μＣｉの［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを含むアッセイに於いてｉｎ ｖｉｔｒｏで示される。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、ピペットでＰ８１ペーパーに移して反応を停止させる。組み込まれていない［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰは、洗浄によって取り除かれ、組み込まれた放射活性は放射能シンチレーションカウンタを用いて測定される。別法では、ＳＤＳローディングバッファーの存在下で１００℃に加熱して反応を停止し、オートラジオグラフにより１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で視覚化する。組み込まれた放射活性はＰＫＩＮの不在下、若しくは不活性キナーゼＫ３８Ａの存在下で実行される反応のために修正されても良い。
【０２６７】
さらに別の実施例では、アデニレートキナーゼ若しくはグアニル酸キナーゼが、γラジオアイソトープカウンターを用いて、γ標識された^３２ｐ−ＡＴＰのＡＤＰ若しくはＧＤＰへの取り込みを測定でき得る。キナーゼバッファー中の酵素は、適切なヌクレオチドモノリン酸塩基質（ＡＭＰ若しくはＧＭＰ）及びリン酸塩ドナーとしての^３２ｐ標識ＡＴＰと共にインキュベートされる。反応は摂氏３７度でインキュベートされ、トリクロロ酢酸の添加によって終了される。酸抽出物は、中和され、ゲル電気泳動にかけられて、一リン酸、二リン酸、三リン酸のヌクレオチド画分に分離する。二リン酸ヌクレオチド画分が取り除かれ、カウントされる。回復した放射性活性は酵素の活性に比例する。
【０２６８】
さらに別の実施例では、ＰＫＩＮのための別のアッセイは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、シンチレーションプレート技術、及びフィルタ結合アッセイを含む。有用な基質はグルタチオントランスフェラーゼで標識された組みかえタンパク質を含み、ビオチンで標識された合成ペプチド基質を含む。 小さな有機分子、タンパク質、及びペプチドのようなＰＫＩＮの活性の阻害剤は、そのようなアッセイで識別される。
【０２６９】
１８ プロテインキナーゼ活性の強化／抑制
ＰＫＩＮ活性化若しくは抑制のアゴニスト若しくはアンタゴニストは、実施例１７で記述したアッセイを用いてテストしても良い。アゴニストは、ＰＫＩＮ活性の増加を引き起こし、アンタゴニストはＰＫＩＮ活性の減少を引き起こす。
【０２７０】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２７１】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０２７２】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０２７３】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０２７４】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０２７５】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０２７６】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０２７７】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【表４０】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to the nucleic acid sequence and amino acid sequence of human kinase. The present invention also relates to the diagnosis, treatment and prevention of cancer, immune diseases, diseases affecting growth and development, cardiovascular diseases, and lipid abnormalities using these sequences. The present invention further relates to the evaluation of the effects of foreign compounds on the expression of human kinase nucleic acid and amino acid sequences.
[0002]
(Background of the Invention)
Kinases constitute the largest known enzyme superfamily, with a wide variety of target molecules. Kinases catalyze the transfer of high energy phosphate groups from phosphate donors to phosphate acceptors. Nucleotides usually act as phosphate donors in these reactions, and most kinases utilize adenosine triphosphate (ATP). A variety of molecules are possible for the phosphate receptor, including nucleosides, nucleotides, lipids, carbohydrates, and proteins. Proteins are phosphorylated on hydroxy amino acids. The addition of phosphate groups changes the local charge on the receptor molecule, which can change the internal structure and cause intermolecular contacts. Reversible protein phosphorylation is the primary method of regulating protein activity in eukaryotic cells. Generally, proteins are activated by phosphorylation in response to extracellular signals such as hormones, neurotransmitters, growth factors, and differentiation factors. The activated protein triggers the intracellular response of the cell via intracellular signaling pathways and second messenger molecules. This second messenger molecule includes cyclic nucleotides that regulate protein phosphorylation, calcium-calmodulin, inositol, and various mitogens.
[0003]
Kinases are involved in all cellular functions, from basic metabolic processes such as glycolysis to cell cycle regulation, differentiation, and the exchange of information with the extracellular environment via signaling cascades. Inappropriate phosphorylation of proteins in cells is associated with changes in cell cycle progression and cell differentiation. Changes in the cell cycle are associated with apoptosis and induction of cancer. Changes in cell differentiation are associated with diseases and disorders of the reproductive, immune, and skeletal muscles.
Protein kinases are divided into two classes (types). One class of protein tyrosine kinases (PTKs) phosphorylates tyrosine residues, while the other class, protein serine / threonine kinases (STKs), phosphorylates serine and threonine residues. Certain PTKs and STKs have structural features of both families and have specificity (bispecificity) for both tyrosine and serine / threonine residues. Almost all kinases contain a conserved 250-300 amino acid catalytic domain containing specific residues and sequence motifs unique to the kinase family. The protein kinase catalytic domain can be further divided into 11 subdomains. The N-terminal subdomains I-IV fold into a two lobed structure that binds and directs the ATP donor molecule, and subdomain V spans the two lobes. IV-XI of the C-terminal subdomain binds the protein substrate and transfers gamma phosphate from ATP to the hydroxyl group of a tyrosine, serine, or threonine residue. Each of the 11 subdomains contains an amino acid motif characteristic of the subdomain or specific catalytic residues. For example, subdomain I contains a high glycine ATP binding consensus motif of eight amino acids, subdomain II contains key lysine residues required for maximizing catalytic activity, and subdomains VI and IX are highly Contains a catalytic center stored in PTKs and STKs also contain sequence motifs unique to subdomains VI and VIII that can confer hydroxy amino acid specificity.
[0004]
In addition, kinases can be categorized by additional amino acid sequences, usually comprised in the range of 5 to 100, contained within or adjacent to the kinase domain. These additional amino acid sequences regulate kinase activity and determine substrate specificity. (Hardie, G. and S. Hanks (1995)The Protein Kinase Facts Book, Vol I, pp. 17-20 Academic Press, San Diego CA. In particular, two protein kinase signature sequences have been identified in the kinase domain. The first protein kinase signature sequence contains the active site of lysine residues involved in ATP binding, and the second protein kinase signature sequence contains aspartic acid residues that are important for catalytic activity. If the protein to be analyzed contains these two protein kinase signatures, the probability that the protein is a protein kinase is close to 100% (PROSITE: PDOC00100, November 1995).
[0005]
Protein tyrosine kinase
Protein tyrosine kinases (PTKs) can be classified as either transmembrane receptor PTK proteins or non-transmembrane non-receptor PTK proteins. Transmembrane tyrosine kinases function as receptors for most growth factors. Growth factors bind to receptor tyrosine kinases (RTKs), which cause the receptor to phosphorylate itself (autophosphorylation) and phosphorylate certain intracellular second messenger proteins. Growth factors (GF) that bind to the receptor PTK include epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, insulin and insulin-like growth factor, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor, and Macrophage colony stimulating factor.
[0006]
The non-transmembrane non-receptor PTK does not contain a transmembrane region but instead forms a signaling complex with the cytoplasmic domain of the cell membrane receptor. Receptors that function through non-receptor PTKs include cytokine and hormone receptors (growth hormone and prolactin) and antigen-specific receptors on T and B lymphocytes.
[0007]
Many PTKs were initially identified as oncogene products in cancer cells where PTK activity does not undergo normal cellular control. In fact, about one third of oncogenes encode PTKs. Furthermore, cell transformation (carcinogenesis) is often accompanied by an increase in tyrosine phosphorylation activity (Charbonneau, H. and Tonks, NK (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8: 463-93). Thus, modulation of PTK activity can be an important tool for controlling certain cancers.
[0008]
Protein serine / threonine kinase
Protein serine / threonine kinase (STK) is a non-transmembrane protein. The STK subclass is known as ERK (extracellular signal-regulated kinase) or MAP (mitogen-activated protein kinase) and is activated by cell stimulation by various hormones and growth factors. Cell stimulation induces a signaling cascade that leads to phosphorylation of MEK (MAP / ERK kinase), and after phosphorylation of MEK, phosphorylation of serine and threonine activates ERK. Because many proteins are downstream effectors to active ERK, they appear to be involved in regulating cell proliferation and differentiation, and in regulating the cytoskeleton. Activation of ERK is usually transient and cells have a bispecific phosphatase involved in its down-regulation, and studies have shown that elevated ERK activity is associated with certain cancers. Other STKs include second messenger-dependent proteins such as cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA), calcium-calmodulin (CaM) -dependent protein kinase, and mitogen-activated protein kinase (MAP). Kinases, cyclin-dependent protein kinases, checkpoint and cell cycle kinases, Numb-related kinases (Nak), human fusions (hFu), growth-related kinases, 5'-AMP-activated protein kinases, and kinases involved in apoptosis Murrell.
[0009]
Second messenger-dependent protein kinases include cyclic AMP (cAMP), cyclic GMP, inositol triphosphate, phosphatidylinositol, 3,4,5-triphosphate, cyclic ADP-ribose, arachidonic acid, diacylchrycerol and calcium It mainly mediates the effects of second messengers such as calmodulin; PKA is involved in mediating hormone-induced cellular responses and is activated by cAMP produced in cells in response to hormonal stimulation. cAMP is an intracellular mediator of hormonal action in all animal cells studied. Hormone-induced cellular responses include thyroid hormone secretion, cortisol secretion, progesterone secretion, glycogenolysis, bone resorption, regulation of heart rate, and regulation of myocardial contractility. PKA is found in all animal cells and appears to be involved in the effects of cAMP in most of these cells. Altered PKA expression is associated with cancer, thyroid disease, diabetes, atherosclerosis, and cardiovascular disease (Isselbacher, KJ et al., (1994)).Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, NY, pp. 416-431, 1887).
[0010]
The casein kinase I (CKI) gene family is another subfamily of serine / threonine protein kinases. This expanding family of kinases is involved in the regulation of various cellular and nuclear processes, including cellular metabolism, DNA replication, and DNA repair. The CKI enzyme is present on the membrane, nucleus, cytoplasm and cytoskeleton of eukaryotic cells and on the spindle of mammalian cells (Fish, KJ. Et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 14875). 14883.).
[0011]
All CKI family members include a short amino-terminal domain of 9-76 amino acids, a highly conserved kinase domain of 284 amino acids, and a variable carboxyl-terminal domain of more than 24-200 amino acids ( Cegielska, A. et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 1357-1364.). This CKI family consists of highly related proteins. This has been confirmed by the identification of casein kinase I isoforms from various samples. There are at least five mammalian isoforms of α, β, γ, δ, and ε. Fish et al. Identified CKIε from a human placenta cDNA library. This CKIε is a basic protein consisting of 416 amino acids and is similar to CKIδ. Recombinant expression was shown to cause CKIε to phosphorylate a known CKI substrate and be repressed by CKI-7, a CKI-specific inhibitor. The human gene for CKIε can help yeast with a slow-growth phenotype caused by the deletion of the yeast CKI locus, HRR250.
[0012]
Mammalian mutation circadian tau was found to be a semi-dominant chromosomal allele of CKIε that significantly shortens the cycle of the circadian rhythm in Syrian hamsters. The tau locus is encoded by casein kinase Iε and is also a homolog of the Drosophila circadian gene double-time. Studies of both wild-type and tau mutant CKIε enzymes showed that the mutant enzyme had a significantly reduced maximum rate and was in an autophosphorylated state. Furthermore,in in vitroHave the ability to interact with mammalian PERIOD protein, but the mutant enzyme lacks the ability to phosphorylate PERIOD. Lowley et al. Proposed that CKIε plays an important role in delaying negative feedback signals within the autoregulatory loop of the transcription-translation system, which is central to the circadian machinery. Thus, the CKIε enzyme is an ideal candidate for a pharmaceutical composition that affects circadian rhythms, jet lag and sleep, as well as other physiological and metabolic processes under circadian regulation (Lowrey, PL. (2000) Science 288: 483-491.).
[0013]
Homeodomain interacting protein kinase (HIPK) is a serine / threonine kinase, a new member of the DYRK kinase subfamily (Hofmann, TG et al., (2000) Biochimie 82: 1123-1127). HIPK contains a conserved protein kinase domain, separate from domains that interact with homeoproteins. HIPK is a nuclear kinase and HIPK2 is well expressed in neural tissue (Kim, YH, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 25875-25879; Wang, Y. et al., (2001). ) Biochim. Biophys. Acta 1518: 168-172). HIPK acts as a corepressor of the homeodomain transcription factor. This co-suppressor activity is found in post-translational modifications such as ubiquitin binding and phosphorylation that are important in the regulation of cellular protein function (Kim, YH, et al., (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 96: 12350-12355).
[0014]
Calcium-calmodulin-dependent protein kinase
Calcium-calmodulin (CaM) -dependent kinases are involved in the regulation of smooth muscle contraction, glycogenolysis (phosphorylase kinase), and neurotransmission (CaM kinase I and CaM kinase II). CaM-dependent protein kinase is activated by the intracellular calcium receptor calmodulin in response to the concentration of free intracellular calcium. Many CaM kinases are also activated by phosphorylation. Certain CaM kinases are also activated by autophosphorylation or other regulatory kinases. CaM kinase I phosphorylates various substances, including the neurotransmitter-related proteins synapsin I and II, the gene transcription regulator CREB, and the cystic fiber conductance regulator protein CFTR (Haribabu, B. et al.). , (1995) EMBO Journal 14: 3679-3686). CaM kinase II also phosphorylates synapsins at various sites and regulates catecholamine synthesis in the brain by phosphorylation and activation of tyrosine hydroxylase. CaM kinase II also regulates catecholamine and serotonin synthesis by phosphorylation / activation of tyrosine hydroxylase and tryptophan hydroxylase (Fujisawa, H. (1990) BioEssays 12: 27-29). MRNA encoding a protein kinase-like protein that binds to calmodulin has been found in large amounts in the mammalian forebrain. This protein binds to vesicles in both axons and dendrites and accumulates mainly after birth. The amino acid sequence of this protein is similar to a CaM-dependent STK, which binds to calmodulin in the presence of calcium (Godbout, M. et al., (1994) J. Neurosci. 14: 1-13).
[0015]
Mitogen-activated protein kinase
Mitogen-activated protein kinase (MAP) mediates signaling from the cell surface to the nucleus via a phosphorylation cascade. MAP is another STK family that regulates intracellular signaling pathways. Several subgroups have been identified, each with different substrate specificities and responding to unique extracellular stimuli (Egan, SE and Weinberg, RA (1993) Nature 365: 781-783). The MAP kinase signaling pathway exists in mammalian cells and yeast. Extracellular stimuli that activate the MAP kinase pathway include epidermal growth factor (EGF), ultraviolet light, hyperosmolar media, heat shock, lipopolysaccharide (LPS) and tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1 (IL Inflammatory cytokines such as -1) are included. Altered MAP kinase expression is thought to be involved in a variety of diseases, including cancer, inflammation, immune diseases, and diseases affecting growth and development.
[0016]
Cyclin-dependent protein kinase
Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are STKs that regulate cell progression through the cell cycle. Cells enter and exit mitosis by regulation by the synthesis and degradation of a family of activating proteins called cyclins. Cyclin, a small regulatory protein, binds to and activates the CDK. Activated CDKs phosphorylate selected proteins involved in the mitotic process. CDKs are unique in that multiple inputs are required to activate. In addition to cyclin binding, activation of the CDK requires phosphorylation of certain threonine residues and dephosphorylation of certain tyrosine residues in the CDK.
[0017]
NIMA (Never Enters Mitosis) Related Kinases (Neks) is another family of STKs involved in the cell cycle. Both CDK and Nek are involved in replication, maturation, and separation of centrosomes, the centers of microtubule formation, in animal cells (Fry, AM et al., (1998) EMBO J. 17: 470-481).
[0018]
Checkpoints and cell cycle kinases
In the process of cell differentiation, the order and timing of cell cycle entry is under the control of cell cycle checkpoints. This cell cycle checkpoint ensures that critical processes such as DNA replication and chromosome segregation are performed correctly. If DNA is damaged, for example by radiation, the checkpoint pathway is activated and the cell cycle is stopped to allow time for repair. If the damage is large, apoptosis is induced. If such a checkpoint does not exist, damaged DNA may be passed on to abnormal cells, causing abnormal growth such as cancer. Protein kinases play an important role in this process. For example, a specific kinase, checkpoint kinase 1 (Chk1), has been identified in yeast and mammals. This Chk1 is activated by DNA damage in yeast. Activation of Chk1 arrests cells at the G2 / M transition. (Sanchez, Y. et al., (1997) Science 277: 1497-1501.) Specifically, Chk1 phosphorylates the cell division cycle phosphatase CDC25, thereby dephosphorylating and activating the cyclin-dependent kinase Cdc2. Normal function of CDC25 is inhibited. Activation of Cdc2 regulates cells from entering mitosis (Peng, CY et al., (1997) Science 277: 1501-1505.). Thus, activation of Chk1 prevents damaged cells from entering mitosis. Similar deficiencies in checkpoint kinases, such as Chk1, can also cause cancer by failing to stop cells whose DNA has been damaged at other checkpoints, such as G2 / M.
[0019]
Cell proliferation-related kinase
Cell growth-related kinases are serum / cytokine-induced STKs involved in the regulation of cell cycle and cell proliferation in human megakaryocytes (Li, B. et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 19402-19408). ). Proliferation-related kinases are expressed in the plo () of STKs involved in cell division.Drosophila(derived from the polo gene). Growth-associated kinase is down-regulated in lung tumor tissue and appears to be a proto-oncogene. If the proto-oncogene is uncontrolledly expressed in normal tissues, normal tissues can become cancerous.
[0020]
5'-AMP- Activated protein kinase
One ligand-activated STK protein kinase is 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) (Gao, G. et al. (1996) J. Biol Chem. 271: 8675-8681). Mammalian AMPK is a regulator of fatty acid and sterol synthesis by phosphorylation of the enzymes acetyl-CoA carboxylase and hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, and is a regulator of intracellular stress such as heat shock and glucose and ATP depletion. Mediates the response of these pathways. AMPK is a heterotrimeric complex consisting of a catalytic α subunit and two non-catalytic β and γ subunits that are thought to regulate the activity of this α subunit. AMPK subunits are unexpectedly more widely distributed in non-fatty tissues such as brain, heart, spleen, and lung. This distribution is thought to play a role other than regulating lipid metabolism.
[0021]
Kinases in apoptosis
Apoptosis is a highly regulated signaling pathway that leads to cell death and plays a pivotal role in tissue development and homeostasis. Dysregulation of this process is associated with the pathogenesis of various diseases, including autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, and cancer. Various STKs play important roles in this process. ZIP kinase is an STK that contains a C-terminal leucine zipper domain in addition to an N-terminal protein kinase domain. This C-terminal domain is responsible for homodimerization and kinase activation, as well as with transcription factors such as the activating transcription factor ATF4, a member of the cyclic AMP responsive element binding protein (ATF / CREB) family of transcription factors. Mediates the interaction (Sanjo, H. et al., (1998) J. Biol. Chem, 273: 29066-29071). DRAK1 and DRAK2 are STKs that share homology with death-associated protein kinase (DAP kinase) and are known to function in interferon gamma-induced apoptosis (Sanjo et al., Supra). Like ZIP kinase, DAP kinase contains an ankyrin repeat type C-terminal protein-protein interaction domain in addition to the N-terminal kinase domain. ZIP, DAP, and DRAK kinases induce morphological changes associated with apoptosis when transformed into NIH3T3 cells (Sanjo et al., Supra). However, deletion of either the N-terminal kinase catalytic domain or the C-terminal domain of these proteins abolishes apoptotic activity. Thus, in addition to kinase activity, activity in the C-terminal domain is also required for apoptosis, and may be domains that interact with regulators or specific substrates.
[0022]
RICK is another STK that has recently been identified as mediating a specific apoptotic pathway involving the death receptor CD95 (Inohara, N. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12296-12300). CD95 is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily and plays an important role in the regulation and homeostasis of the immune system (Nagata, S. (1997) Cell 88: 355-365). The CD95 receptor signaling pathway involves the recruitment of various intracellular molecules to the receptor complex, followed by ligand binding. This process involves the recruitment of the cysteine protease caspase-8, which activates the caspase cascade and causes cell death. RICK consists of a C-terminal “caspase recruitment” domain that interacts with a caspase-like domain and an N-terminal kinase catalytic domain. This suggests that RICK plays a role in recruiting caspase-8. This interpretation is complemented by the fact that RICK expression in human 293T cells promotes caspase-8 activation and enhances the induction of apoptosis by various proteins involved in the CD95 apoptotic pathway (Inohara et al., Supra). ).
[0023]
Mitochondrial protein kinase
Mitochondrial protein kinase (MPK), a new class of eukaryotic kinases related to sequences for prokaryotic histidine protein kinase, does not appear to have sequence similarity to other eukaryotic protein kinases. These protein kinases are present only in the mitochondrial matrix space, and are likely to have evolved from genes originally present in respiratory-dependent bacteria taken up by primitive eukaryotic cells by endocytosis. MPK is involved in the phosphorylation and inactivation of the branched chain α-keto acid dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase complexes (Harris, RA et al., (1995) Adv. Enzyme Regul. 34: 147-162). Five MPKs have been identified. The four members correspond to pyruvate dehydrogenase isoenzymes and regulate the activity of the pyruvate dehydrogenase complex, a key regulatory enzyme between the glycolysis and citrate cycles. The fifth member corresponds to branched-chain α-keto acid dehydrogenase kinase and is important in regulating the pathway for removal of branched-chain amino acids (Harris, RA et al., (1997) Adv. Enzyme Regul. 37: 271-293). It is known that during starvation and diabetic conditions, pyruvate dehydrogenase kinase activity in rat liver, heart and muscle is significantly increased. This increase in activity contributes to the phosphorylation and inactivation of the pyruvate dehydrogenase complex in both disease states, and the conservation of pyruvate and lactate for gluconeogenesis (Harris et al., Supra).
[0024]
(Kinase for non-protein substrates)
Lipid kinase and inositol kinase
Lipid kinases phosphorylate the hydroxyl residues of the lipid headgroup. A family of kinases involved in the phosphorylation of phosphatidylinositol (PI) has been reported, with each member phosphorylating a particular carbon on the inositol ring (Leeves, S. et al., (1999) Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 219-225). Phosphorylation of phosphatidylinositol is involved in activation of the protein kinase C signaling pathway. The inositol phospholipid (phosphoinositide) intracellular signaling pathway is initiated by the binding of signaling molecules to G protein-coupled receptors at the cell membrane. This results in phosphorylation of phosphatidylinositol (PI) residues inside the cell membrane by inositol kinase, which causes the PI residues to become diphosphate (PIP₂). Next, PIP₂Is inositol triphosphate (IP₃) And diacylglycerol. These two products act as mediators to separate signaling pathways. Cellular responses mediated by these pathways include glycogenolysis in the liver in response to vasopressin, smooth muscle contraction in response to acetylcholine, and thrombin-induced platelet aggregation.
[0025]
PI 3-kinase (PI3K), which phosphorylates the D3 position of PI and its derivatives, plays an important role in growth factor signaling cascades involved in cell proliferation, differentiation, and metabolism. PI3K is a heterodimer consisting of an adapter subunit and a catalytic subunit. This adapter subunit acts as a scaffold protein and interacts with certain tyrosine-phosphorylated proteins, lipid components, and other cytoplasmic factors. When the adapter subunit binds to a tyrosine phosphorylation target such as insulin responsive substrate (IRS) -1, the catalytic subunit is activated and PI (4,5) diphosphate (PIP₂) To PI (3, 4, 5) P₃ (PIP₃). Next, PIP₃Activates PKA, protein kinase B (PKB), protein kinase C (PKC), glycogen synthase kinase (GSK) -3, and several other proteins, including P70 ribosomal s6 kinase. PI3K also interacts directly with cytoskeletal forming proteins Rac, rho, and cdc42 (Shepherd, PR et al., (1998) Biochem. J. 333: 471-490). Diabetic animal models, such as obese and fat mice, have altered levels of the PI3k adapter subunit. Certain mutations in the adapter subunit are found in an insulin resistant Danish population, suggesting that PI3K plays a role in type 2 diabetes (Shepherd, supra).
[0026]
An example of a lipid kinase phosphorylation activity is the phosphorylation of D-erythro-sphingosine, which produces the sphingolipid metabolite sphingosine-1-phosphate (SPP). SPP has been found to be a novel lipid second messenger with both extracellular and intracellular effects (Kohama, T. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 23722-23728). Extracellularly, SPP is a ligand for the G protein-coupled receptor EDG-1 (endothelium-derived G protein-coupled receptor). Within cells, SPP regulates changes in cell growth, survival, motility, and cytoskeleton. SPP levels are regulated by sphingosine kinase, which specifically phosphorylates D-erythro-sphingosine to SPP. The importance of sphingosine kinase in cell signaling is that various stimuli, including platelet-derived growth factor (PDGF), nerve growth factor, and activation of protein kinase C, increase intracellular levels of SPP by activating sphingosine kinase And the fact that competitive inhibitors of the enzyme selectively inhibit cell growth induced by PDGF (Kohama et al., Supra).
[0027]
Purine nucleotide kinase
Purine nucleotide kinases, adenylate kinase (ATP: AMP phosphotransferase or AdK) and guanylate kinase (ATP: GMP phosphotransferase or GuK) play important roles in nucleotide metabolism, and synthesize ATP and GTP. And regulation of intracellular levels, respectively. These two molecules are precursors to DNA and RNA synthesis in growing cells, are the major source of biochemical energy in cells (ATP), and regulate signaling pathways (GTP). provide. Preventing the various steps in the synthesis of these two molecules is the principle of many antiproliferative agents for cancer and antiviral therapy (Pillwein, K. et al., (1990) Cancer Res. 50: 1576-). 1579).
[0028]
AdK is found in most cell types and is particularly abundant in cells such as skeletal muscle that synthesize ATP at high rates. In these cells, AdK physically associates with the subcellular structures, mitochondria and myofibrils. Mitochondria produce energy, and myofibrils use that energy. Recent studies have demonstrated that AdK plays an important role in the transfer of high-energy phosphoryls from metabolic processes that produce ATP to cellular components that consume ATP (Zeleznikar, RJ et al., ( 1995) J. Biol. Chem. 270: 7311-7319). Thus, AdK is thought to play a central role in maintaining energy production in cells, particularly cells with high growth and metabolic rates, such as cancer cells, and is a candidate for inhibiting its activity in the treatment of certain cancers. Can be provided. Alternatively, reduced AdK activity could be the cause of various metabolic muscle energy disorders that cause heart failure and respiratory failure, and could be treated by increasing AdK activity.
[0029]
In addition to providing a key step in the synthesis of GTP for RNA and DNA synthesis, GuK also plays an important role in cellular signaling pathways by regulating GDP and GTP. Specifically, GTP that binds to a membrane-associated G protein mediates activation of a cell receptor, adenyl cyclase is activated in the cell, and cyclic AMP, which is a second messenger, is produced. GDP binding to G proteins inhibits these processes. Also, p21, known to be involved in the regulation of cell proliferation and carcinogenesis, by the levels of GDP and GTP^rasAnd the activity of certain oncoproteins is regulated (Bos, JL (1989) Cancer Res. 49: 4682-4689). 49: 46824689). A high ratio of GTP to GDP caused by GuK suppression results in p21^rasIs activated and carcinogenesis is promoted. Increasing the activity of GuK to increase the level of GDP and decrease the level of GTP to GDP can be a treatment to regress carcinogenesis.
[0030]
GuK is a key enzyme in the phosphorylation and activation of certain antiviral agents useful for treating herpesvirus infections. These agents include the guanine homologs acyclovir and bucillovir (Miller, WH and Miller RL (1980) J. Biol. Chem. 255: 7204-7207; Steenberg, K. et al., ( 1986) J. Biol. Chem. 261: 2134-2139). Increasing the activity of GuK in infected cells could be a therapeutic modality that would enhance the effects of these drugs, so it would be possible to reduce drug consumption.
[0031]
Pyrimidine kinase
Pyrimidine kinases include deoxytidine kinase, and thymidine kinases 1 and 2. Deoxytidine kinase is present in the nucleus and thymidine kinases 1 and 2 are found in the cytoplasm (Johansson, M. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1941-111945). Phosphorylation of deoxyribonucleosides by pyrimidine kinase leads to the production of DNA precursors.de novoAn alternative route for synthesis is provided. The role of pyrimidine kinase in phosphorylation, like purine kinase, is important in the activation of some nucleoside analogs that are important for chemotherapy (Arner ES and Eriksson, S. (1995) Pharmacol. Ther. 67: 155-186).
[0032]
The discovery of new human kinases, and polynucleotides encoding them, can meet the needs in the art by providing new compositions. This novel composition is useful in the diagnosis, treatment, and prevention of cancer, immune diseases, diseases affecting growth and development, cardiovascular diseases, and lipid disorders, and also has the nucleic acid sequence and amino acid sequence of human kinase. It is also useful for evaluating the effect of a foreign compound on expression.
[0033]
(Summary of the Invention)
The present invention is collectively referred to as "PKIN", and individually referred to as "PKIN-1", "PKIN-2", "PKIN-3", "PKIN-4", "PKIN-5", " "PKIN-6", "PKIN-7", "PKIN-8", "PKIN-9", "PKIN-10", "PKIN-11" "PKIN-12", "PKIN-13", "PKIN-14" "PKIN-15", "PKIN-16", "PKIN-17", "PKIN-18", "PKIN-19", "PKIN-20" "PKIN-21", "PKIN-22", "PKIN" -23 "characterized by a purified polypeptide which is a human kinase called" PKIN-24 "," PKIN-25 "and" PKIN-26 ". In certain embodiments, the present invention relates to (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26; (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26 A polypeptide having a natural amino acid sequence at least 90% identical to: (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, or (d) Provided is a substantially isolated polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. In one embodiment, there is provided a substantially isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-26.
[0034]
The present invention also provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26 at least 90% homology. A natural polypeptide consisting of an amino acid sequence having (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, or (d) a SEQ ID NO: 1-26 A substantially isolated polynucleotide is provided which encodes a polypeptide comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having: In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group having SEQ ID NOs: 27-52.
[0035]
The invention further provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, and (b) at least 90% homology with an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide having the natural amino acid sequence having, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, or (d) from a group having SEQ ID NOs: 1-26. Provided is a recombinant polynucleotide having a promoter sequence operably linked to a substantially isolated polynucleotide that encodes a polypeptide comprising an immunogenic fragment of the selected amino acid sequence. In one embodiment, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide.
[0036]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide consisting of a natural amino acid sequence that is 90% or more identical; (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26; A method for producing a polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26. The method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide. And (b) recovering the polypeptide thus expressed.
[0037]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26, and (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide having the same natural amino acid sequence, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26, and (d) SEQ ID NO: 1. A substantially isolated antibody that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of -26.
[0038]
The invention further relates to (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 27-52, and (b) at least 90% homology with a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 27-52. (C) a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (b), or (e) (a) to A substantially isolated polynucleotide comprising the RNA equivalent of (d) is provided. In one embodiment, the polynucleotide has at least 60 contiguous nucleotides.
[0039]
The present invention further provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 27-52, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 27-52 by at least 90%. (C) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), or (e) (a) to (d). A substantially isolated polynucleotide comprising the RNA equivalent of is provided. The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides containing a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; and (b) the presence of a hybridization complex. Detecting the absence and optionally detecting the amount of the complex, if any, under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide or fragment thereof. The probe hybridizes specifically to the target polynucleotide. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0040]
The invention also provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide containing a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 27-52, and (b) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7-52. A polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology to the sequence, a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (c) (a), a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (d) (b) (E) a polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of RNA equivalents of (a) to (d). The detection method includes (a) a process of amplifying a target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification, and (b) detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and Optionally, detecting the amount of fragments, if any, is included.
[0041]
The invention further provides a component comprising an effective amount of the polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. An effective amount of the polypeptide comprises at least (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide having a native amino acid sequence with 90% homology, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, or (d) a SEQ ID NO: Immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having ID NOs: 1-26. In one embodiment, there is provided a composition comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26. Further, the present invention provides a method for treating a disease or a symptom thereof associated with reduced expression of functional PKIN, comprising administering the composition to a patient.
[0042]
The invention also provides (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26, (b) at least 90% of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26 A polypeptide having a natural amino acid sequence having homology to: (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26; and (d) a SEQ ID NO: The present invention provides a method for screening a compound selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: 1-26 to confirm the effectiveness as an agonist of a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments. The screening method includes (a) exposing a sample having the polypeptide to the compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional PKIN, comprising administering the composition to a patient.
[0043]
The invention further provides (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, and (b) at least 90% of the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide consisting of a natural amino acid sequence having homology to: (c) a biologically active fragment of a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26; and (d) a SEQ ID NO: Provided is a method for screening a compound selected from the group comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having 1-26 to confirm the effectiveness as an antagonist of a polypeptide selected from the group. The screening method includes (a) exposing a sample containing the polypeptide to the compound, and (b) detecting antagonist activity in the sample. In one embodiment, the invention provides a component comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In a further alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with over-expression of functional PKIN, comprising administering the composition to a patient in need of such treatment.
[0044]
The invention further provides (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, and (b) at least 90% of the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide consisting of a natural amino acid sequence having homology to: (c) a biologically active fragment of a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26; and (d) a SEQ ID NO: Provided is a method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide selected from the group containing an immunogenic fragment of a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having 1-26. The screening method comprises: (a) binding the polypeptide to at least one test compound under appropriate conditions; and (b) detecting the binding of the polypeptide to the test compound, whereby the compound specifically binds to the polypeptide. And identifying.
[0045]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26, and (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26. A polypeptide having an amino acid sequence having the homology of: (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26, or (d) a SEQ ID NO: The present invention provides a method for screening for a compound that modulates the activity of a polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having: 1-26. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under conditions permitting the activity of the polypeptide; and (b) calculating the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, wherein the change in the activity of the polypeptide in the presence of the test compound Means that the compound modulates the activity of the polypeptide.
[0046]
The present invention further provides a method of screening a compound to confirm the effectiveness of target polynucleotide mutation expression. The target polynucleotide comprises a sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 27-52. The screening method includes (a) exposing a sample containing the target polynucleotide to the compound, and (b) detecting mutation expression of the target polynucleotide.
The invention further provides (a) treating a biological sample containing nucleic acids with a test compound, and (b) (i) a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27-52. (Ii) a polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology to a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-52, (iii) a sequence complementary to (i). At least 20 contiguous of a polynucleotide selected from the group consisting of: a polynucleotide having the formula: (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), and a (v) RNA equivalent of (i)-(iv). Using a nucleotide probe to hybridize the nucleic acid of the treated biological sample. It provides a method for calculating the toxicity of test compounds. Hybridization occurs under conditions such that a particular hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in a biological sample, wherein the target polynucleotide comprises (i) SEQ ID NO: A polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group having 27-52, (ii) a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology with a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 27-52 (Iii) a polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of (i), (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), (v) (i) to (iv) Selected from the group containing the RNA equivalents of Alternatively, the target polynucleotide may be a fragment of the polynucleotide sequence selected from the group consisting of (i) to (v), (c) a step of quantifying the amount of the hybridization complex, and (d) Comparing the amount of hybridization complex in the untreated biological sample with the amount of hybridization complex in the untreated biological sample. Shows the toxicity of the compound.
[0047]
(About the description of the present invention)
Before describing the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention, it is to be understood that the invention is not limited to the particular devices, materials and methods described, as such may be modified. It is also understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which is limited only by the claims. Please understand at the same time.
[0048]
As used in the claims and the specification, the singular forms “a” and “the” may refer to plural unless the context clearly dictates otherwise. You have to be careful. Thus, for example, when described as "a host cell", there may be more than one such host cell, and when described as "an antibody", one or more antibodies, and It also refers to equivalents of antibodies known to those skilled in the art.
[0049]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise defined. Although any apparatus, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, the preferred devices, materials, and methods are now described. All publications mentioned in the present invention are cited for the purpose of describing and disclosing the cells, protocols, reagents and vectors that are reported in the publications and that may be of interest to the present invention. . Nothing herein is an admission that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0050]
Definition
The term "PKIN" refers to substantially purified PKIN amino acids obtained from all species, particularly natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, including mammals, including cows, sheep, pigs, mice, horses and humans. Points to an array.
[0051]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of PKIN. The agonists may interact directly with PKIN or interact with components of the biological pathways involving PKIN to regulate the activity of PKIN, proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds, It may include a composition.
[0052]
The term "allelic variant" refers to another form of the gene encoding PKIN. Allelic variants can be made from at least one mutation in the nucleic acid sequence. It can also be made from mutant RNA or polypeptide. The structure or function of a polypeptide may or may not be mutated. A gene may have no natural allelic variants or one or several natural allelic variants. Common mutational changes that generally result in allelic variants are those that result from spontaneous deletion, addition or substitution of nucleotides. Each of these changes, alone or together with other changes, may occur once or several times within a given sequence.
[0053]
A “mutant” nucleic acid sequence that encodes PKIN refers to a polypeptide that retains the same polypeptide as PKIN or has at least one of the functional properties of PKIN, despite deletion, insertion, or substitution of various nucleotides. This definition includes improper or unexpected hybridization of a polynucleotide sequence encoding PKIN with an allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotides of the polynucleotide encoding PKIN. Includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using probes. The encoded protein can also be mutated and contain deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and are functionally equivalent to PKIN. Intentional amino acid substitutions may result in similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity of the residue, as long as PKIN activity is retained biologically or immunologically. It can be done based on For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids having uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, and serine and threonine. Amino acids with uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine and isoleucine and valine, glycine and alanine, and phenylalanine and tyrosine.
[0054]
The term “amino acid” or “amino acid sequence” refers to an oligopeptide, peptide, polypeptide or protein sequence or a fragment thereof, and refers to a natural or synthetic molecule. As used herein, "amino acid sequence" refers to the amino acid sequence of a naturally occurring protein molecule, and "amino acid sequence" and like terms limit the amino acid sequence to the complete original amino acid sequence associated with the listed protein molecule. Not to try.
[0055]
“Amplification” involves additional replication of a nucleic acid sequence. Amplification is typically performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art.
[0056]
The term "antagonist" is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of PKIN. Antagonists are antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds or compositions that interact with PKIN directly or with components of the biological pathway in which PKIN is involved to modulate the activity of PKIN. It can include proteins such as objects.
[0057]
The term "antibody" refers to intact immunoglobulins or fragments thereof, e.g., Fa, F (ab ').₂ And Fv fragments, which can bind to epitope determinants. Antibodies that bind to PKIN polypeptides can be made using intact polypeptides or fragments thereof, including small peptides that immunize the antigen. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (mouse, rat, rabbit, etc.) can be derived from translated or chemically synthesized RNA, and can be conjugated to a carrier protein if desired. is there. Commonly used carriers that chemically bond to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemocyanin (KLH). The binding peptide is used to immunize the animal.
[0058]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that is in contact with a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, a number of regions of the protein can induce the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a particular region or three-dimensional structure of the protein). Antigenic determinants can compete with the intact antigen for binding to the antibody (ie, the immunogen used to elicit the immune response).
[0059]
The term "antisense" refers to any component capable of base-pairing with the "sense" strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense components include DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), oligonucleotides having a modified backbone linkage such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, 2′-methoxyethyl sugar or 2 ′ Oligonucleotides having a modified saccharide such as -methoxyethoxy sugar or oligonucleotides having a modified base such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine. Antisense molecules can be produced by any method, including chemical synthesis or transcription. Once introduced into a cell, the complementary antisense molecule will base pair with the natural nucleic acid sequence formed by the cell, forming a duplex that prevents transcription or translation. The term “negative” or “minus (−)” may refer to the antisense strand, and “positive” or “plus (+)” may refer to the sense strand.
[0060]
The term "biologically active" refers to a protein that has a structural, regulatory or biochemical function of a natural molecule. Similarly, the term "immunologically active" or "immunogenic" refers to natural or recombinant PKIN, synthetic PKIN, or any oligopeptide thereof, that is capable of eliciting a specific immune response in a suitable animal or cell. Refers to the ability to trigger and bind to a particular antibody.
[0061]
The terms "complementary" or "complementarity" refer to the natural association of a polynucleotide with a polynucleotide by base pairing. For example, the sequence "5'A-G-T3 '" binds to the complementary sequence "3'TC-A5'".
[0062]
“Component consisting of a given polynucleotide sequence” and “component consisting of a given amino acid sequence” generally refer to any component consisting of a given polynucleotide or amino acid sequence. This component can include a dry formulation or an aqueous solution. Compositions comprising a polynucleotide sequence encoding PKIN or a fragment of PKIN can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, a probe is dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS) and other constituent elements (eg, denhardt solution, skim milk powder, DNA of salmon sperm, etc.). Can be done.
[0063]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to separate unnecessary bases, and is extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), One or more overlapping cDNAs using a resequenced nucleic acid sequence or a computer program for fragment construction such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). And ESTs, or nucleic acid sequences constructed from genomic DNA fragments. Some sequences both extend and assemble to determine a consensus sequence.
[0064]
"Conservative amino acid substitution" refers to a substitution that causes little change in the properties of the original protein when the substitution is made, that is, a substitution in which the structure and particularly the function of the protein are conserved and no major change is caused by such substitution. . The following table shows the amino acids that can be substituted for the original amino acid in the protein and those that are recognized as conservative amino acid substitutions.

[0065]
Conservative amino acid substitutions typically involve (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, eg, a β-sheet or α-helix structure, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) most of the side chain. Hold.
[0066]
A "deletion" refers to a change in the amino acid or nucleotide sequence that results in one or more amino acids or nucleotides being lost.
[0067]
The term "derivative" refers to a chemical modification of a polypeptide or polynucleotide sequence. For example, replacement of a hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group can be included in chemical modification of the polynucleotide sequence. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one of the biological or immunological functions of the natural molecule. The polypeptide derivative may be modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function from the polypeptide of inducible origin. Polypeptide.
[0068]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal and is covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0069]
"Differential expression" refers to increased or unregulated, or decreased, down-regulated, or defective gene or protein expression, determined by comparing at least two different samples. Such comparisons can be made, for example, between a post-treatment sample and an untreated sample or between a diseased sample and a normal sample.
[0070]
The term "fragment" refers to a unique portion of PKIN or a polynucleotide encoding PKIN that is identical to, but shorter in length than, its parent sequence. A fragment may have a length that is less than the total length of the defined sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes may be at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 or It can be as long as 500 contiguous nucleotides or amino acid residues. Fragments can be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment can have a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or first 25% or 50% of the polypeptide) as set forth in the given sequence. These lengths are clearly given by way of example, and in the embodiments of the present invention may be of any length supported by the description, including the sequence listings, tables and figures.
[0071]
A fragment of SEQ ID NO: 27-52 includes, for example, a region of a unique polynucleotide sequence that uniquely identifies SEQ ID NO: 27-52, which differs from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NO: 27-52 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 27-52 from related polynucleotide sequences. The exact lengths of the fragments of SEQ ID NO: 27-52 and the regions of SEQ ID NO: 27-52 that correspond to the fragments can be routinely determined by those skilled in the art based on the intended purpose for the fragments. .
[0072]
The fragment of SEQ ID NO: 1-26 is encoded by the fragment of SEQ ID NO: 27-52. The fragment of SEQ ID NO: 1-26 contains a unique amino acid sequence region that specifically identifies SEQ ID NO: 1-26. For example, a fragment of SEQ ID NO: 1-26 is useful as an immunogenic peptide for producing an antibody that specifically recognizes SEQ ID NO: 1-26. The exact length of the fragment of SEQ ID NO: 1-26 and the region of SEQ ID NO: 1-26 corresponding to the fragment can be routinely determined by those skilled in the art based on the intended purpose for the fragment. .
[0073]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine), an open reading frame, and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
[0074]
The term "homology" refers to sequence similarity, ie, interchangeable sequence identity between the sequences of two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0075]
The term “percent identity” or “percent identity” as applied to a polynucleotide sequence refers to the percentage of residues that match between at least two or more polynucleotide sequences aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm can more significantly compare two sequences because it inserts gaps in a standardized and reproducible manner in the sequences that are compared to optimize alignment between the two sequences.
[0076]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm as incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package (a set of molecular biological analysis programs) (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is available from Higgins, D.W. G. FIG. And P.A. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Higgins, D.W. G. FIG. Et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For alignment of pairs of polynucleotide sequences, the default parameters are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. CLUSTAL V reports percent identity as the "% similarity" between aligned polynucleotide sequence pairs.
[0077]
Alternatively, the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is commonly used and offers a complete set of freely available sequence comparison algorithms (Altschul, SF. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). This algorithm is available from several sources and is also available from NCBI in Bethesda, Md. And the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The BLAST software suite includes a variety of sequence analysis programs, including "blastn," which aligns known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences obtained from various databases. In addition, a tool called “BLAST 2 Sequences” that is used to directly compare two nucleotide sequences in pairs is available. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / bl2. It is possible to access html and use it interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are typically used with gaps and other parameters set to default settings. For example, blastn may be performed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as a default parameter to compare two nucleotide sequences. An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for Mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
The percent identity can be measured relative to a fully defined sequence length (eg, defined by a particular SEQ ID NO). Alternatively, the percent identity compared to shorter lengths, eg, fragments obtained from larger defined sequences (eg, fragments of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100 or 200 contiguous nucleotides) May be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and using any sequence length fragment backed by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It can be understood that the length over which the can be measured can be explained.
[0078]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of homology may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is to be understood that this degeneracy can be used to effect changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences such that all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
[0079]
The term “percent identity” or “percent identity” as applied to a polypeptide sequence refers to the percentage of residues that match between at least two or more polypeptide sequences aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. There are also alignment methods that take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as detailed above, generally preserve the acidity and hydrophobicity of the site of substitution, thus preserving the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0080]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as that incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see already described). The default parameters for aligning the polypeptide sequences in pairs using CLUSTAL V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. Select the PAM250 matrix as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, CLUSTAL V reports percent identity as “similarity” between aligned polypeptide sequence pairs.
[0081]
Alternatively, a set of NCBI BLAST software may be used. For example, when comparing two polypeptide sequences in pairs, one may use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. There will be. An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
The percent identity can be measured relative to the length of a fully defined (eg, defined by a particular SEQ ID NO) polypeptide sequence. The percent identity is determined by the sequence or fragments obtained from shorter lengths, eg, larger defined polypeptide sequences (eg, fragments of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70 or 150 contiguous residues). May be measured in comparison with the length of the match. The lengths listed here are merely exemplary, and using fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It should be understood that the length may explain the length over which the percent match can be measured.
[0082]
"Human artificial chromosome (HAC)" is a linear small chromosome that contains all the elements necessary for the isolation and maintenance of stable chromosomal replication, which can include DNA sequences of about 6 kb (kilobases) to 10 Mb in size. is there.
[0083]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence in the non-antibody binding region has been mutated to be closer to a human antibody, and retains its original binding ability.
[0084]
"Hybridization" refers to the process by which a single-stranded polynucleotide anneals to a complementary strand by forming base pairs under defined hybridization conditions. Specific hybridization indicates that two nucleic acid sequences share a high degree of homology. Specific hybridization complexes are formed under acceptable annealing conditions and remain hybridized after the "wash" step. Wash steps are particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, non-specific binding (ie, pair binding between nucleic acid strands that are not perfectly matched) is reduced. The permissive conditions for annealing a nucleic acid sequence are routinely determined by those skilled in the art. The permissive conditions may be constant during the hybridization experiment, but the washing conditions may be varied during the experiment to obtain the desired stringency and thus also the hybridization specificity. Conditions that permit annealing include, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS at about 68 ° C., and about 100 μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
[0085]
In general, the stringency of hybridization can be expressed, in part, in reference to the temperature at which the washing step is performed. Such a washing temperature is usually selected to be about 5 to 20 ° C. lower than the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under a given ionic strength and pH. The equation for calculating Tm and nucleic acid hybridization conditions are well known and are described in Sambrook et al. (1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, particularly see Volume 9, Chapter 9.
[0086]
High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a wash step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 0.1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. SSC concentrations can vary from about 0.1 to 2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking agents are used to block non-specific hybridization. Such blocking reagents include, for example, sheared and denatured salmon sperm DNA at about 100-200 μg / ml. Under certain conditions, for example, in the hybridization of RNA and DNA, an organic solvent such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can also be used. Useful variations of washing conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, especially under high stringency conditions. Such similarities strongly suggest a similar role for nucleotides and polypeptides encoded by nucleotides.
[0087]
The term "hybridization complex" refers to a complex formed between two nucleic acid sequences by the force of forming hydrogen bonds between complementary base pairs. Hybridization complexes can be formed in solution (C₀t or R₀t analysis). Alternatively, one nucleic acid sequence is in solution and the other nucleic acid sequence is a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin, or glass slide, or other suitable substrate, such as a cell or its nucleic acid). Can be formed between two nucleic acid sequences such that they are immobilized on a substrate to which they are immobilized.
[0088]
The terms "insertion" and "addition" refer to changes in an amino acid or nucleotide sequence that add one or more amino acid residues or nucleotide sequences, respectively.
[0089]
“Immune response” can refer to a condition associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious diseases or genetic diseases. These conditions can be characterized by the expression of various factors, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules, that can act on cells and the systemic defense system.
[0090]
The term “immunogenic fragment” refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of PKIN that elicits an immune response when introduced into a living animal, eg, a mammal. The term “immunogenic fragment” also includes polypeptide or oligopeptide fragments of PKIN useful in any of the antibody production methods disclosed herein or known in the art.
[0091]
The term "microarray" refers to the organization of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0092]
The term "element" or "array element" refers to a hybridizable polynucleotide located on the surface of a substrate in a microarray environment.
[0093]
The term "modulation" refers to a change in the activity of PKIN. For example, modulation results in a change in PKIN protein activity, or binding properties, or other biological, functional, or immunological properties.
[0094]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that may be single-stranded or double-stranded or represent a sense or antisense strand. , Peptide nucleic acid (PNA), or any DNA-like or RNA-like substance.
[0095]
"Operably linked" refers to a state in which a first nucleic acid sequence is placed in a functional relationship with a second nucleic acid sequence. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. Where it is necessary to join two protein coding regions in the same reading frame, generally the operably linked DNA sequences can be very close or contiguous.
[0096]
"Peptide nucleic acid" (PNA) refers to an antisense molecule or an antigenic material, consisting of an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length attached to the peptide backbone of lysine-terminated amino acid residues. . Terminal lysine confers solubility to the component. PNAs preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcription expansion, and can be polyethyleneglycolated to extend the lifespan of PNAs in cells.
[0097]
“Post-translational modifications” of PKIN include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation,
Racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art may be included. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of PKIN and may vary from cell type to cell type.
[0098]
"Probe" refers to a nucleic acid sequence that encodes PKIN, its complement, or a fragment thereof, for use in detecting the same or allelic nucleic acid sequence, or related nucleic acid sequences. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioisotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A "primer" is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, that can anneal to a target polynucleotide by forming complementary base pairs. The primer is then extended along the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme.
Primer pairs can be used for amplification (and identification) of nucleic acid sequences, for example, by the polymerase chain reaction (PCR).
[0099]
Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of a known sequence. Longer probes and primers to increase specificity, such as probes consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences; Primers may be used. Some probes and primers are considerably longer. It is understood that any length of nucleotide supported by the specification, including tables, figures and sequence listings, can be used.
[0100]
Methods for preparing and using probes and primers are described in Sambrook, J .; Et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.C. M. Et al., (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Green Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications See Academic Press, San Diego CA, and the like. A PCR primer pair can be obtained from a known sequence using a computer program for that purpose, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
[0101]
The selection of oligonucleotides to use as primers is made using software well known in the art for such purpose. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs of up to 100 nucleotides each, oligonucleotides and up to 5,000 larger polynucleotides derived from input polynucleotide sequences up to 32 kilobases. It is also useful for analyzing data. Similar primer selection programs incorporate additional features for expansion capabilities. For example, the PrimOU primer selection program (available publicly from the Genome Center at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) is capable of selecting specific primers from megabase sequences, and thus covers the entire genome. Useful for designing primers. The Primer3 primer selection program (available publicly from the Whitehead Institute / MIT Genome Research Center in Cambridge, Mass.) Allows users to input a "mispriming library", where the sequences that you want to avoid as primer binding sites are Is specified. Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays. (The source code of the latter two primer selection programs may be obtained from their own source and modified to meet the specific needs of the user.) PrimerGen program (Human Genome Mapping Project in Cambridge, UK-General Information from Resource Center Designed primers based on multiple sequence alignments, thereby allowing the selection of primers that hybridize to either the largest or the smallest conserved region of the aligned nucleic acid sequences . Thus, the program is useful for identifying unique and conserved fragments of oligonucleotides and polynucleotides. Oligonucleotides and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods can be used to identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, eg, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe to perform. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0102]
A “recombinant nucleic acid” is a sequence that is not a natural sequence or that has a sequence produced by artificially combining two or more segments of a sequence that would otherwise be separated if not artificially combined. This artificial combination is often achieved by chemical synthesis, but more generally by the artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, for example, by genetic engineering techniques such as those described in Sambrook et al., Supra. Achieved by. The term recombinant nucleic acid also includes a mutant nucleic acid in which a part of the nucleic acid is simply added, substituted or deleted. Frequently, recombinant nucleic acids include nucleic acid sequences operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can be an essential element of the vector, for example, as used to transform a cell.
[0103]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid may be an essential element of a viral vector, for example based on vaccinia virus. Vaccinia virus is used to vaccinate a mammal in which the recombinant nucleic acid is expressed and induces a protective immune response in the mammal.
[0104]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene and includes enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription, translation or RNA stability.
[0105]
"Reporter molecule" is a chemical or biochemical component used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and other components known in the art.
[0106]
An "RNA equivalent" for a DNA sequence is identical to the reference DNA sequence except that all generated nitrogenous bases thymine are replaced by uracil and that the sugar backbone is composed of ribose instead of deoxyribose. Consists of a nucleotide linear sequence.
[0107]
The term "sample" is used in its broadest sense. A sample presumed to contain PKIN, a nucleic acid encoding PKIN, or a fragment thereof is obtained by analyzing a body fluid, an extract from a cell, a chromosome or an organelle isolated from a cell, a membrane, a cell, Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, tissue, tissue prints and the like.
[0108]
The term “specific binding” or “specifically binds” refers to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, any natural or synthetic binding component. This interaction means that it depends on the presence or absence of a particular structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if the antibody is specific for epitope "A", the presence of a polynucleotide containing epitope A (ie, free and unlabeled A) in a reaction involving labeled free A and the antibody. Reduces the amount of labeled A bound to the antibody.
[0109]
The term "substantially purified" refers to a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from the natural environment or has been isolated or separated and that is at least about 60%, preferably at least about 60%, of other naturally associated components. 75%, most preferably at least about 90% free.
[0110]
"Substitution" refers to the replacement of one or several amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0111]
"Substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, fine particles. , Capillaries included. The substrate can have various surface morphologies, such as walls, grooves, pins, channels, pores, etc., to which polynucleotides or polypeptides bind.
[0112]
"Transcription image" refers to the collective pattern of gene expression by a unique cell type or tissue at a given time, condition.
[0113]
"Transformation" describes the process by which exogenous DNA enters a host cell and changes the host cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art, and include any known method for inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. Can be based. The method of transformation is selected depending on the type of host cell to be transformed. Transformation methods include, but are not limited to, viral infection, electroporation, heat shock, lipofection and microprojectile bombardment. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that express the introduced DNA or introduced RNA temporarily for a limited time are also included.
[0114]
As used herein, a “genetically transformant” is any organism, including but not limited to animals and plants, wherein one or several cells of the organism are involved, for example, in the art, by the involvement of humans. It has a heterologous nucleic acid introduced by well known transformation techniques. The nucleic acid is introduced into the cell either directly or indirectly, by introducing it into a precursor of the cell, by deliberate genetic manipulation, for example by microinjection or by introducing a recombinant virus. The term genetic manipulation refers to classical cross breeding orin in vitroIt does not refer to fertilization but to the introduction of a recombinant DNA molecule. Genetic transformants contemplated according to the present invention include bacteria, cyanobacteria, fungi and plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are well known and are provided in references such as Sambrook et al. (1989), supra.
[0115]
A “variant” of a particular nucleic acid sequence is defined as a nucleic acid sequence that has at least 40% homology with a particular nucleic acid sequence to a single nucleic acid sequence of a certain length. At this time, blastn is executed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameter. Such a nucleic acid pair can be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may show 96%, 97%, 98%, 99% or more homology. Certain variants may be described, for example, as "allelic" variants (described above), "splice" variants, "species" variants or "polymorphic" variants. Splice variants may have significant homology to a reference molecule, but will usually have a large or small number of polynucleotides due to alternate splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack domains present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that differ from one another by species. The resulting polypeptides usually have significant amino acid homology to one another. Polymorphic variants vary in the polynucleotide sequence of a particular gene between individuals of a given species. Polymorphic variants may also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which the polynucleotide sequence changes by one nucleotide base. The presence of a SNP may be indicative of, for example, a particular population, condition or propensity for a condition.
[0116]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a polypeptide sequence having at least 40% homology to the particular polypeptide sequence over one entire length of the polypeptide sequence. Here, blastp is executed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameter. Such a pair of polypeptides may be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, for a given length. , 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
[0117]
invention
The present invention is based on the discovery of novel human kinases (PKINs) and polynucleotides encoding PKINs, and uses these compositions to make cancer, immune diseases, diseases affecting growth and development, cardiovascular diseases, and lipids. It relates to the diagnosis, treatment, and prevention of abnormalities.
[0118]
Table 1 is a summary of the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlates with one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was designated by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was designated by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
[0119]
Table 2 shows sequences with homology to the polypeptides of the invention, as identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (Polypeptide SEQ ID NO :) for each polypeptide of the invention and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID). Column 3 shows the GenBank identification number (Genbank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score representing the match between each polypeptide and its GenBank homolog. Column 5 shows the annotation of the GwnBank homolog, with the appropriate citation in place. These are incorporated herein by reference.
[0120]
Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) of each polypeptide of the present invention and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID), respectively. Column 3 shows the number of amino acid residues in each polypeptide. Rows 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI) of the GCG sequence analysis software package. Column 6 shows the amino acid residues that include the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for analysis of the structure / function of the protein, and the relevant part shows a searchable database used for the analysis method.
[0121]
Tables 2 and 3 together summarize the properties of each polypeptide of the present invention, which properties establish that the claimed polypeptide is a human kinase. For example, SEQ ID NO: 4 was confirmed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 94% identity with rat serine / threonine kinase (GenBank ID g2052189). (See Table 2) The BLAS probability score is 0.0, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 4 also has a protein kinase domain, which is determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM) Was done. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 4 is a protein kinase. In another example, SEQ ID NO: 23 was confirmed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 88% identical to mouse protein kinase (GenBank ID g406060). (See Table 2) The BLAS probability score is 0.0, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 23 also has a eukaryotic protein kinase domain, which searches for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM) It was decided. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 23 is a protein kinase. In another example, SEQ ID NO: 6 was confirmed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 85% identical to rabbit myosin light chain kinase (GenBank ID g165506). (See Table 2) The BLAST probability score is 1.5e-272, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 6 also has a eukaryotic protein kinase domain, which searches for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM) It was decided. (See Table 3) Data from BLIMPS and MOTIFS analysis provide evidence further demonstrating that SEQ ID NO: 6 is a myosin light chain kinase. In another example, SEQ ID NO: 1 was confirmed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 64% identical to mouse serine / threonine kinase (GenBank ID g404634). (See Table 2) The BLAST probability score is 4.5e-60, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 1 also has a protein kinase domain, which is determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM). Was done. (See Table 3) Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 1 is a protein kinase, particularly a serine / threonine kinase. In another example, SEQ ID NO: 19 was confirmed by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 49% identical to the human G-protein coupled receptor kinase GRK4-beta (GenBank ID g992672). (See Table 2) The BLAST probability score is 4.3e-129, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 19 also has a G-protein signaling regulator (regulator) domain, which can be found statistically in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM). It was determined by searching for significant matches. (See Table 3) The data obtained from BLIMPS, MOTIFS and PROFILESCAN analysis provide further evidence that SEQ ID NO: 19 is a G protein-coupled receptor kinase. SEQ ID NO: 2-3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7-18, SEQ ID NO: 20-22 and SEQ ID NO: 24-26 were similarly analyzed and annotated. The algorithm and parameters for analyzing SEQ ID NOs: 1-26 are described in Table 7.
[0122]
As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequence of the present invention was constructed using a cDNA sequence or a coding (exon) sequence derived from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Columns 1 and 2 show the polynucleotide sequence identification number (Polynucleotide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte Polynucleotide ID) of each polynucleotide of the present invention, respectively. Column 3 shows the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Column 4 is a polynucleotide sequence useful for hybridization or amplification techniques, for example, to identify SEQ ID NO: 27-52, or to distinguish SEQ ID NO: 27-52 from related polynucleotide sequences. Is shown. Column 5 shows the identification number corresponding to the cDNA sequence, the coding sequence (exon) predicted from genomic DNA and / or the sequence set having both cDNA and genomic DNA. These sequences were used to assemble the full length polynucleotide sequences of the present invention. Columns 6 and 7 of Table 4 indicate the starting nucleotide (5 ') and ending nucleotide (3') positions of the cDNA and genomic sequences, respectively, corresponding to the sequence of column 5.
[0123]
The identification number in column 5 of Table 4 particularly means, for example, Incyte cDNA and the corresponding cDNA library. For example, 6829315H1 is the identification number of the Incyte cDNA sequence, and SINTNOR01 is the identification number of the cDNA library from which it is derived. Incyte cDNAs for which a cDNA library is not shown are derived from a pooled cDNA library (eg, 55557226H1). Alternatively, the identification number in row 5 may be the identification number of the GenBank cDNA or EST (eg, gg2954208) used to assemble the full length polynucleotide sequence. Further, the identification numbers in column 5 indicate sequences derived from the ENSEMBL (The Sanger Center, Cambridge, UK) database (ie, the sequence named "ENST"). Alternatively, the identification number in column 5 is derived from the NCBI RefSeq nucleotide sequence record database (ie, the sequence named “NM” or “NT”) or the NCBI RefSeq protein sequence record (ie, the sequence named “NP”). ing. Or, the identification number in column 5 refers to the set of both cDNA and Genscan predicted exons combined by the “exon-stitching” algorithm. For example, FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄ Represents the "stitch" sequence, XXXXXX is the identification number of the cluster of sequences to which the algorithm was applied, and YYYYY is the number of the prediction issued by the algorithm. N_{1,2,3. . .}, Indicates the specific exon that, if present, may have been manually edited during the analysis (see Example 5). Or, the identification number in column 5 refers to the set of exons connected by the “exon-stretching” algorithm. For example, FLXXXXXX_gAAAAAA_gBBBBBB_1_N is the identification number of the “stretch” sequence, XXXXXX is the Incyte project identification number, and gAAAAA is the GenBank identification number of the human genome sequence to which the “exon stretching” algorithm has been applied. In addition, gBBBBBB is the GenBank identification number of the closest GenBank protein homolog or the NCBI RefSeq identification number, where N refers to a particular exon (see Example 5). If the RefSeq sequence was used as a protein homolog of the “exon stretching” algorithm, the RefSeq identifier (denoted as “NM”, “NP” or “NT”) would replace the GenBank identifier (ie, gBBBBBB). Sometimes used.
[0124]
Alternatively, the prefix identifies constituent sequences that have been manually edited, predicted from genomic DNA sequences, or derived from a combination of sequence analysis methods. The following table lists examples of constituent sequence prefixes and methods of analyzing the same sequence associated with the prefixes (see Examples 4 and 5).

[0125]
In some cases, coverage of Incyte cDNA was obtained that overlapped with the coverage of the sequence as shown in column 5 to confirm the final consensus polynucleotide sequence, but did not give the relevant Incyte cDNA identification number.
[0126]
Table 5 shows a representative cDNA library for full-length polynucleotide sequences constructed using Incyte cDNA sequences. Representative cDNA libraries are those most frequently represented by the Incyte cDNA sequences used to construct and confirm the above polynucleotide sequences. The tissues and vectors used to prepare the cDNA library are shown in Table 5 and described in Table 6.
[0127]
The present invention also includes variants of PKIN. Preferred variants of PKIN have at least one of the functional and / or structural characteristics of PKIN and have at least about 80% amino acid sequence identity to the PKIN amino acid sequence, or at least about 90% amino acid sequence. Have identity, and even at least about 95% amino acid sequence identity.
[0128]
The present invention also provides a polynucleotide encoding PKIN. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27-52 that encodes PKIN. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27-52 shown in the sequence listing includes an equivalent RNA sequence in which thymine of a nitrogenous base is substituted with uracil and the backbone of the sugar chain is not ribose but ribose.
[0129]
The invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding PKIN. In particular, a variant of such a polynucleotide sequence will have at least 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding PKIN, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 95%. Has polynucleotide sequence identity. Certain embodiments of the present invention provide that at least 70% polynucleotide sequence identity, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 85% polynucleotide sequence identity to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27-52. A variant sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27-52 having as much as 95% polynucleotide sequence identity is provided. Each of the above-described polynucleotide variants encodes an amino acid sequence having at least one of the functional or structural characteristics of PKIN.
[0130]
Those skilled in the art will recognize that the various polynucleotide sequences encoding PKIN that can be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known naturally occurring genes. Will understand. Thus, the present invention covers all possible polynucleotide sequence variants as produced by choosing combinations based on selectable codons. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code as applied to the polynucleotide sequence of native PKIN, and all variations are considered to be expressly disclosed.
[0131]
Nucleotide sequences encoding PKIN and variants thereof are generally capable of hybridizing to nucleotide sequences of naturally occurring PKIN under suitably selected stringent conditions, but are substantially non-naturally occurring, including including non-naturally occurring codons. It may be advantageous to generate nucleotide sequences that encode PKIN or its derivatives with different usage codons. Based on the frequency with which a host utilizes a particular codon, it is possible to select codons to enhance the expression of a peptide that occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding PKIN and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA transcripts with favorable properties, such as longer half-lives, than transcripts made from the native sequence Is to make things.
[0132]
The invention also includes the generation of DNA sequences encoding PKIN and its derivatives or fragments thereof entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art.
[0133]
The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NO: 27-52 and fragments thereof ( See, for example, Wahl, GM, and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in Definitions.
Methods of DNA sequencing are well known in the art, and any of the embodiments of the present invention can be practiced using DNA sequencing methods. Enzymes can be used in the DNA sequencing method. For example, Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), and thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia, N. Biocia, Japan) ) Can be used. Alternatively, a polymerase and a calibrated exonuclease can be used in combination, for example, as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). Preferably, the system is automated using a MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), PTC200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA) and ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems). Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other methods well known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art. (Ausubel, FM (1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7, Meyers, R.A. A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853. Etc.).
[0134]
The partial nucleotide sequence is used to extend the PKIN-encoding nucleic acid sequence and various upstream sequences such as promoters and regulatory elements are detected by various methods based on PCR well known in the art. For example, one of the methods that can be used, the restriction site PCR method, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (for example, Sarkar, G. (1993)). ) PCR Methods Appl. 2: 318322.) Another method is inverse PCR, which amplifies an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is obtained from a restriction enzyme fragment consisting of a known genomic locus and surrounding sequences (see Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). A third method is the capture PCR method, which involves PCR amplifying a DNA fragment adjacent to a known sequence of human and yeast artificial chromosomal DNA. (See Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-119, etc.). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region using digestion and ligation of a plurality of restriction enzymes before performing PCR. Also, other methods that can be used to search for unknown sequences are known in the art. (See, Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). In addition, genomic DNA can be walked using PCR, nested primers and PromoterFinder ™ library (Clontech, Palo Alto CA). This procedure is useful for finding intron / exon junctions without having to screen the library. For all PCR-based methods, commercially available software, such as OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, may be about 22-30 nucleotides in length, Primers can be designed to anneal to the template at a GC content of about 50% or more and a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
[0135]
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include larger cDNAs. In addition, libraries of random primers often include sequences having the 5 'region of the gene and are suitable for situations where the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA. Genomic libraries will be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
A commercially available capillary electrophoresis system can be used to analyze the size of the sequencing or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing involves a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera used for The output / light intensity can be converted to an electrical signal using appropriate software (such as GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR from Applied Biosystems). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
[0136]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding PKIN, or a fragment thereof, can be cloned into a recombinant DNA molecule to express PKIN, a fragment thereof, or a functional equivalent in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, alternative DNA sequences encoding substantially the same or a functionally equivalent amino acid sequence can be made, and these sequences can be used for PKIN expression.
[0137]
The nucleotide sequences of the invention can be recombined using methods generally known in the art to alter the sequence encoding PKIN for various purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
[0138]
The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. C. et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. The biological properties of PKIN, such as its biological or enzymatic activity, or its ability to bind to other molecules or compounds, can be altered or improved. DNA shuffling is the process of generating a library of gene variants using PCR-mediated recombination of gene fragments. The library is then subjected to selection or screening to identify the gene variant with the desired properties. These suitable mutants may then be pooled and subjected to repeated DNA shuffling and selection / screening. Thus, genetic diversity is created through "artificial" breeding and rapid molecular evolution. For example, a single gene fragment having a random point mutation can be recombined, screened, and then shuffled until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene can be recombined with a homologous gene of the same gene family from either the same species or a different species, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a directed and controllable manner. Can be done.
[0139]
According to another embodiment, the sequence encoding PKIN can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH, et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Alternatively, PKIN itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid or solid phase techniques (Creightton, T. (1984)).Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60, Robert, J. et al. Y. (1995) Science 269: 202-204). Automated synthesis can be achieved using an ABI 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Further, the amino acid sequence of PKIN, or any portion thereof, may be altered by direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof, using chemical methods, to produce the native amino acid. It is possible to produce a polypeptide having a polypeptide sequence or a variant polypeptide.
[0140]
Peptides can be substantially purified using high performance liquid chromatography for separation (see, eg, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, supra, pages 28-53, etc.).
[0141]
To express a biologically active PKIN, the nucleotide sequence encoding PKIN or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and expression-inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding PKIN. Such elements vary in length and specificity. With certain initiation signals, it is possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding PKIN. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding PKIN, its initiation codon, and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be necessary. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG initiation codon should be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be of various natural and synthetic origin. The efficiency of expression can be increased by including an enhancer suitable for the particular host cell line used (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162.). .
[0142]
Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector containing a sequence encoding PKIN and suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoGenetic recombination techniques are included. (See, for example, Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4, 8, and 16-17; and Ausubel, F .; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. (See Chapters 9 and 13 1-4).
[0143]
Various expression vector / host systems can be used to retain and express the sequence encoding PKIN. Such expression vector / host systems include, but are not limited to, bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viruses. Insect cell lines infected with an expression vector (eg, baculovirus), plant cell lines transformed with a viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus CaMV or tobacco mosaic virus TMV) or a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid), There are microorganisms such as animal cell lines. (Sambrook, supra, Ausubel, supra, Van Heke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509; Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6: 307-311; Science and Technology Yearbook "(The McGraw Hill Year of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196, Logan, J. And T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. , A herpes virus or vaccinia virus, or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to deliver nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, M. et al. (1998). 5), 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, R. M. et al. McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389: 239-242). The present invention is not limited by the host cell used.
[0144]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors are available for selection depending on the intended use for the polynucleotide sequence encoding PKIN. For example, for routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide sequence encoding PKIN, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the PKIN-encoding sequence into multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, these vectors are used in the cloned sequence.in in vitroIt may also be useful for transcription, sequencing dideoxy, rescue of single strands by helper phage, generation of nested deletions (eg, Van Heake, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 55035509). For example, when a large amount of PKIN is required, for example, for production of an antibody, a vector that induces PKIN expression at a high level can be used. For example, vectors containing a strong inducible T5 or inducible T7 bacteriophage promoter can be used.
[0145]
A yeast expression system can be used for PKIN expression. Numerous vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, PGH promoter, etc.Pichia pastorisIt can be used for Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention in cells, incorporating foreign sequences into the host genome for stable growth. (See, for example, Ausubel, 1995, supra, Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544, and Scorer. CA, et al. (1994) Bio / Technology 121-181-184. reference).
[0146]
Plant systems can also be used for PKIN expression. Transcription of the PKIN-encoding sequence is induced by viral promoters, such as CaMV-derived 35S and 19S, alone or in combination with an omega leader sequence from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). Promoted by a promoter. Alternatively, a plant promoter such as a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (for example, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science). 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105) These constructs are used for direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection into plants. It can be introduced into cells. (Maglow Hill Science and Technology Yearbook (The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196.
[0147]
In mammalian cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding PKIN may be ligated to an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. It is possible to insert the viral genome into the indispensable E1 or E3 region and obtain an infectious virus that expresses PKIN in the host cell. (See, e.g., Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 36553659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. High levels of protein expression can also be achieved using vectors based on SV40 or EBV.
[0148]
Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to transport fragments of DNA larger than those contained in and expressed from the plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb of HACs are made for treatment and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (See, e.g., Harrington. JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355.).
[0149]
For long-term production of recombinant mammalian proteins, stable expression of PKIN in cell lines is desirable. For example, it is possible to transform a PKIN-encoding sequence into a cell line using an expression vector. Such expression vectors include replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells can be allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selection medium, and the presence of the selectable marker allows for the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0150]
The transformed cell line can be recovered using any number of selection systems. Such selection systems include, but are not limited to, tk⁻A herpesvirus thymidine kinase gene used for simple cells and apr⁻There are adenine phosphoribosyltransferase genes used for cells (see, for example, Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als confer resistance to chlorsulfuron, pat confer resistance to phosphinothricin acetyltransferase, respectively (Wigler, M., et al. Natl. Acad. Sci. USA 77: 35667570; Columbia Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 114.) Other selectable genes, such as metabolism TrpB and hisD, which alter the requirements of the cells for, have been described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. See 8047-8051, etc.):. Ci USA 85. Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. Using these markers, it is possible not only to identify transformants, but to quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (Rhodes, CA (1995) Methods). Mol. Biol. 55: 121131).
[0151]
Even if the presence / absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding PKIN is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding PKIN can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be aligned with the sequence encoding PKIN under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0152]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence that encodes PKIN and that express PKIN can be identified using a variety of methods known to those of skill in the art. These methods include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, and protein biology, including membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for the detection and / or quantification of nucleic acid or protein sequences. Test methods or immunological assays, but are not limited thereto.
[0153]
Immunological methods for detecting and measuring PKIN expression using either specific polyclonal or monoclonal antibodies are well known in the art. Such techniques include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays (RIAs), and fluorescence activated cell sorters (FACS). A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on PKIN is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990).Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV, Coligan, J.M. E. FIG. Et al. (1997)Current Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J .; D. (1998)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ, etc.).
[0154]
A wide variety of labels and conjugation methods are known by those skilled in the art and may be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization probes or PCR probes for detecting sequences associated with a polynucleotide encoding PKIN include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding PKIN, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are known in the art and commercially available, with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. Such methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison WI), U.S.A. S. It can be performed using various kits commercially available from Biochemical or the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0155]
Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding PKIN are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence, the vector, or both. Those of skill in the art will appreciate that expression vectors containing a polynucleotide encoding PKIN can be designed to include a signal sequence that directs secretion of PKIN across prokaryotic and eukaryotic cell membranes.
In addition, selection of a host cell strain may be made by its ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can also be used to identify protein targeting, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) with unique cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Va.). It is possible and can be chosen to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0156]
In another embodiment of the present invention, a natural or altered or recombinant nucleic acid sequence encoding PKIN is linked to a heterologous sequence which translates into a fusion protein in any of the host systems described above. For example, a chimeric PKIN protein containing a heterologous moiety that can be recognized by commercially available antibodies can facilitate screening of peptide libraries for inhibitors of PKIN activity. Heterologous protein moieties and heterologous peptide moieties can also facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such portions include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelating resin allow purification of homologous fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, genetic manipulation of the fusion protein to include a proteolytic cleavage site between the sequence encoding PKIN and the heterologous protein sequence may result in PKIN being cleaved from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel (1995), Chapter 10, supra. Various commercially available kits can also be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0157]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is used.in in vitroThe synthesis of PKIN radioactively labeled with is possible. These systems couple the transcription and translation of a protein coding sequence operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation, for example³⁵It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0158]
Using the PKIN of the present invention or a fragment thereof, a compound that specifically binds to PKIN can be screened. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to PKIN. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0159]
In one embodiment, the compound so identified is associated with a natural ligand of PKIN, eg, a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). (See Chapter 5 of Coligan, JE et al. (1991) Current Protocols in Immunology 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which PKIN binds, or at least some fragment of the receptor, eg, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves generating suitable cells that express PKIN as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila, E. coli. Cells expressing PKIN or cell membrane fragments containing PKIN are contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either PKIN or compound.
[0160]
Some assays simply allow the test compound to be conjugated experimentally to the polypeptide and the binding detected by a fluorescent dye, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include binding at least one test compound to PKIN, either in solution or immobilized on a solid support, and detecting the binding of PKIN to the compound. Alternatively, detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed with cell-free reconstituted specimens, chemical libraries or natural product mixtures, where the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0161]
Using the PKIN of the present invention or a fragment thereof, a compound that modulates the activity of PKIN can be screened. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions in which PKIN binds to at least one test compound, where the activity of PKIN is permissive, and the activity of PKIN in the presence of the test compound increases the activity of PKIN in the absence of the test compound. Compare with activity. A change in the activity of PKIN in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of PKIN. Alternatively, the test compound comprises PKIN under conditions suitable for the activity of PKIN.in in vitroAlternatively, the assay is performed in combination with a cell-free reconstitution system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of PKIN can bind indirectly and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one and a plurality of test compounds can be screened.
[0162]
In another example, a polynucleotide encoding PKIN or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from an early mouse embryo and can be grown in a medium. These ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected, for example, from the C57BL / 6 mouse line. The blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are determined, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested with potential therapeutic or toxic agents.
[0163]
A polynucleotide encoding PKINin in vitroIt is possible to operate on ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0164]
Using a polynucleotide encoding PKIN, it is possible to create a "knock-in" humanized animal (pig) or transgenic animal (mouse or rat) using human disease as a model. Using knock-in technology, a region of the polynucleotide encoding PKIN is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into a blastula and the blastula is implanted as described above. Study transgenic progeny or inbred lines and treat with potential medicines to obtain information on the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress PKIN, eg, secrete PKIN into milk, may be a convenient source of protein (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55). -74).
[0165]
Treatment
There are chemical and structural similarities, for example in sequence and motif content, between certain regions of PKIN and certain regions of human kinases. In addition, PKIN expression is associated with lipid disorders, islet cells, liver disease, leukocytes, umbilical cord endothelial cells, cancer and normal and diseased brain, renal, reproductive, bladder tumors, posterior hippocampus, kidney, small intestine, large intestine and digestive system. Closely related to the organization. Thus, PKIN is thought to play a role in cancer, immune disorders, disorders affecting growth and development, cardiovascular disorders, and dyslipidemia. In treating diseases associated with increased PKIN expression or activity, it is desirable to reduce PKIN expression or activity. In the treatment of a disease associated with a decrease in PKIN expression or activity, it is desirable to enhance PKIN expression or activity.
[0166]
Thus, in one embodiment, PKIN or a fragment or derivative thereof can be administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced PKIN expression or activity. Such disorders include, but are not limited to, cancer, immune disorders, disorders affecting growth and development, atherosclerosis and other cardiovascular disorders, and dyslipidemia. Is adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney Includes lymphoma such as liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, leukemia such as multiple myeloma, malignant lymphoma, Among the immune diseases are acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia , Autoimmune Thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocytic toxin Lymphocytopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple occurrence Sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, Systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial sensation Diseases that affect growth and development include fungal infections, fungal infections, parasite infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma, and include actinic keratosis and atherosclerosis, bursa Inflammation, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma , Myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas Cancer of the parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy , Gonad dysplasia, WAGR Syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, Charcot-Marie Hereditary neuropathies such as tooth disease and neurofibromatosis, seizure disorders such as hypothyroidism, hydrocephalus, chorea (Syndenham's chorea) and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spondylolysis, Includes congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss, and cardiovascular diseases include arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, vein malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombus and veins Flame and venous thrombosis, vascular tumor, thrombolysis complications, balloon angioplasty, vascular replacement, bypass surgery, congestive heart failure, ischemic heart Patients, angina, myocardial infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annulus calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatism Congenital heart disease, infectious endocarditis, nonbacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital Congenital heart disease and complications of heart transplantation and congenital lung abnormalities, lung dysfunction, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, Restricted lung disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis , Sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia Hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilia-obstructive bronchiolitis-pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary hemorrhage syndrome, Goodpasture's syndrome, idiopathic pulmonary hemangiopathy, Includes concurrent lung disease, alveolar proteinosis, lung tumor, inflammatory and non-inflammatory pleural effusion, pneumothorax, pleural tumor, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and complications of lung transplantation. Among them are fatty liver, cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, carnitine palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deminase deficiency, hypertriglyceridemia, lipid storage diseases such as Fabry disease, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic white Dystrophy, adrenal leukodystrophy, G_{M 2}Gangliosidosis, celoid lipofuscinosis, abeta-lipoproteinemia, tanzier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous steatitis, disseminated adipose tissue necrosis Lipoid adrenal hyperplasia, lipoid nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid gland Hypofunction, kidney disease, liver disease, lecithin-cholesterol acyltransferase deficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia , Lipid myopathy, and obesity.
[0167]
In another embodiment, a vector capable of expressing PKIN or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with reduced PKIN expression or activity, including, but not limited to, those listed above. It can also be administered to patients.
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified PKIN for the treatment or prevention of a disease associated with reduced PKIN expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. Can be administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0168]
In yet another embodiment, an agonist that modulates PKIN activity is administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced PKIN expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible.
[0169]
In a further example, a patient can be administered an antagonist of PKIN for the treatment or prevention of a disease associated with increased PKIN expression or activity. Examples of such diseases include, but are not limited to, the cancers described above, immune diseases, diseases affecting growth and development, cardiovascular diseases, and dyslipidemia. In one embodiment, an antibody that specifically binds PKIN can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver the drug to cells or tissues that express PKIN.
[0170]
In another example, the complement of a polynucleotide encoding PKIN is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased PKIN expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. The vector can be administered to the patient.
[0171]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, or vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy can be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. Combination with a therapeutic agent can have a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. By using this method, a medicinal effect can be obtained with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
[0172]
An antagonist of PKIN can be produced using methods common in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified PKIN, or a therapeutic drug library can be screened to identify those that specifically bind to PKIN. PKIN antibodies can also be produced using methods common in the art. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are generally suitable for therapeutic use.
[0173]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are immunized by injection of PKIN or any fragment, or its oligopeptides with immunogenic properties. Can be done. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol And the like. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred.
[0174]
Oligopeptides, peptides, or fragments used to elicit antibodies to PKIN consist of at least about 5 amino acids, and generally preferably consist of about 10 or more amino acids. Desirably, these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and include the entire amino acid sequence of the small native molecule. Short stretches of PKIN amino acids can be fused to sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0175]
Monoclonal antibodies to PKIN can be produced by continuous cell lines in culture using any technique that produces antibody molecules. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al.). (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP, et al. (1984). Mol. Cell Biol. 62: 109-120, etc.).
[0176]
In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene with a human antibody gene developed for the production of "chimeric antibodies" are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 68516855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature. 314: 452, 454). Alternatively, PKIN-specific single-chain antibodies are generated using the techniques described for the production of single-chain antibodies, using methods well known in the art. Antibodies with related specificities but differing idiotypic compositions can also be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (Bulton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 88: 10134-10137 etc.).
Antibody production in the lymphocyte populationin VivoIt can also be done by inducing production or by screening immunoglobulin libraries or a panel of highly specific binding reagents as disclosed in the literature (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0177]
Antibody fragments which contain specific binding sites for PKIN can also be obtained. For example, but not by way of limitation, such fragments may include F (ab ') 2 produced by pepsin digestion of the antibody molecule.₂ Fragment and F (ab ')₂ Some Fab fragments are made by reducing the disulfide bridges of the fragment. Alternatively, it is possible to identify a monoclonal Fab fragment quickly and easily with desired specificity by preparing an Fab expression library (Huse, WD, et al. (1989) Science 256: 1275-1281). reference).
[0178]
Screening can be performed using various immunoassays to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, using either polyclonal or monoclonal antibodies with sequestered specificity, or immunoradioactivity, are well known in the art. Usually such immunoassays involve the measurement of complex formation between PKIN and its specific antibody. Two-site, monoclonal-based immunoassays using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering PKIN epitopes are commonly used, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).
[0179]
Various methods, such as Scatchard analysis, are used in conjunction with radioimmunoassay techniques to assess the affinity of the antibody for PKIN. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the value obtained by dividing the molar concentration of the PKIN antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The Ka of a polyclonal antibody reagent with heterogeneous affinity for multiple PKIN epitopes indicates the average affinity or avidity of the antibody for PKIN. The Ka of a monoclonal antibody reagent monospecific for a particular PKIN epitope represents a true measure of affinity. Ka value is 10⁹-10¹²The liter / mol high affinity antibody reagent is preferably used in immunoassays where the PKIN antibody conjugate must withstand harsh treatments. Ka value is 10⁶-10⁷The liter / mol low-affinity antibody reagent is preferably used for immunopurification and similar treatments where PKIN must eventually dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; E. FIG. And Cryer, A .; (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0180]
The titer and avidity of the polyclonal antibody reagents can be further evaluated to determine the quality and suitability of such medicaments for certain subsequent applications. For example, polyclonal antibody reagents containing at least 1-2 mg / ml specific antibody, preferably 5-10 mg / ml specific antibody, are generally used in processes where the PKIN antibody complex must be precipitated. Information on antibody specificity, titer, avidity, and guidelines for antibody quality and use in various applications is generally available. (Refer to the above-mentioned Catty reference and the same reference by Coligan et al.).
[0181]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding PKIN, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In some embodiments, gene expression can be altered by designing sequences and antisense molecules (DNA and RNA, modified nucleotides) complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding PKIN. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the PKIN-encoding sequence, or from various locations along the coding region. (Agrawal, S., ed. (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc. , Totawa NJ. )
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing the antisense sequences into suitable target cells can be used. The antisense sequence can be transported intracellularly in the form of an expression plasmid that, upon transcription, expresses a sequence complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (Slater, JE et al. 1998) J. Allergy Cli. Immunol. 102 (3): 469-475; and Scanlon, KJ. Et al. (1995) 9 (13): 1288-1296.) Antisense sequences may also be, for example, retroviruses. Or a viral vector such as an adeno-associated virus vector (Miller, AD (1990) Blood 76: 271; Ausubel, Uckert, W. and W. Walther (1994), supra). Pharmacol. Ther. 63 (3 ): 323-347 etc.). Other gene delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217). -225; Bodo, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736. Etc.).
[0182]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding PKIN can be used for somatic or germ cell gene therapy. Gene therapy results in (i) severe combined immunodeficiency (SCID) characterized by a gene deficiency (eg, X chromosomal strand inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)). -X1), severe combined immunodeficiency associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480; Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to deficiency of factor VIII or factor IX (Crystal, 35 RG (1995)). ) Science 270: 404-410, Verma, IM and Somia N. (1997) Nature 389: 239-242), and (ii) expressing a conditional lethal gene product (e.g., (In the case of cancer caused by cell proliferation), (iii) parasites within cells (eg, human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996)). Proc. Natl. Aca ... Sci USA 93: 11395-11399), B-type or C hepatitis virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites, etc., andPlasmodium falciparumas well asTrypanosoma cruziAnd other proteins having a protective function against protozoan parasites. If a deficiency in the gene required for PKIN expression or regulation causes the disease, PKIN can be expressed from a suitable population of the introduced cells to mitigate the onset of symptoms caused by the gene deficiency.
In a further embodiment of the invention, diseases and disorders due to PKIN deficiency are treated by creating mammalian expression vectors encoding PKIN and introducing these vectors into PKIN deficient cells by mechanical means. .in VivoOrex in vitroThe mechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (ii) gene guns, (iii) transfection via liposomes, and (iv) receptors. Mediated gene transfer and (v) the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997) Cell. 91: 501-510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0183]
Expression vectors that can affect PKIN expression include, but are not limited to, PCDNA3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX vector (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTT-OFF, PET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express PKIN, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene); (Ii) Inducible promoters (eg, tetracycline-regulated promoters (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Inc.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechn. 9: 451-456)), an ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), an FK506 / rapamycin inducible promoter, or a RU486 / mifepristone inducible promoter ( Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) the natural or tissue-specific promoter of an endogenous gene encoding PKIN from a normal individual. It is.
[0184]
The use of commercially available liposome transformation kits (eg, PerFect Lipid Transfection Kit from Invitrogen) allows those skilled in the art to introduce polynucleotides into target cells in culture without much experience. Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845. ). The introduction of DNA into primary cultures requires modification of standardized mammalian transfection protocols.
[0185]
In another embodiment of the present invention, the disease or disorder caused by a gene deficiency associated with the expression of PKIN comprises: (i) a polynucleotide encoding PKIN under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. Nucleotides and (ii) a suitable RNA packaging signal, and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences required for efficient vector propagation. Retrovirus vectors can be produced and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6733-6737). Based on The above data is incorporated herein by reference. The vector is propagated in a suitable vector-producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene having tropism for a receptor on target cells or a promiscuous envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. 1987) J. Virol. 61: 1647-1650; Bender, MA et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA. And AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). U.S. Patent No. 5,910,434 to RIGG ("Method for observing retrovirus packaging cell lines producing high transducing effect"; a method for disseminating the virus in a retrospective system) Citation is incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, cell populations (eg, CD4⁺ The transduction of T cells) and the return of the transduced cells to the patient are methods known to those skilled in the art of gene therapy and are described in a large number of documents (Ranga, U. et al. (1997). 71) 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0186]
Alternatively, a polynucleotide encoding PKIN is delivered to cells that have one or more genetic abnormalities associated with PKIN expression using an adenovirus-based gene therapy delivery system. The production and packaging of adenovirus-based vectors are known to those skilled in the art. Replication-defective adenovirus vectors have been shown to be variable to introduce genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets of the pancreas (Csete, ME et al. (1995) Transplantation). 27: 263-268). Adenoviral vectors that may be used are described in US Patent No. 5,707,618 to Armentano ("Adenovirus vectors for gene therapy"), which is hereby incorporated by reference. And For adenovirus vectors, see Antinozzi, P. et al. A. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544 and Verma, I .; M. And N.I. See also Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242. Both documents are incorporated herein by reference.
[0187]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding PKIN to target cells having one or more genetic abnormalities associated with PKIN expression. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors are particularly important in introducing PKIN into central nervous cells with HSV affinity. The production and packaging of herpes-based vectors is known to those skilled in the art. Vectors of the replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385-385). 395). The construction of the HSV-1 viral vector is also disclosed in U.S. Patent No. 5,804,413 to DeLuca ("Herpes simplex viruses against genes transfer"), which is hereby incorporated by reference. Partial. US Patent No. 5,804,413 describes a recombinant HSV d92 comprising a genome having at least one exogenous gene introduced into a cell under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. There is a description. The patent also discloses the generation and use of recombinant HSV strains that are eliminated for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are incorporated herein by reference. Manipulation of the cloned herpesvirus sequence, production of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the genome of the herpesvirus giant, growth and propagation of the herpesvirus, and infection of cells with the herpesvirus This is a technique known to those skilled in the art.
[0188]
Alternatively, a polynucleotide encoding PKIN is delivered to target cells using an alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vector. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been extensively performed and gene transfer vectors have been found to be based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is created, usually encoding the viral capsid protein. This subgenomic RNA is replicated to a higher level than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins relative to viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding PKIN into a region encoding the capsid of the α virus genome, a large number of RNAs encoding PKIN are produced in the vector-transfected cells, and PKIN is synthesized at a high level. The ability to establish persistent infection of hamster normal kidney cells (BHK-21) harboring a mutant of Sindbis virus (SIN), while infection of the alpha virus is usually associated with cell lysis within a few days, (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). Because the α virus can be introduced into various hosts, PKIN can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of cells prior to transduction. Methods for treating infectious cDNA clones of the α virus, transfecting the cDNA and RNA of the α virus, and infecting the α virus are known to those skilled in the art.
[0189]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. The transcription start site is, for example, between about -10 and about +10 counted from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because triple helix base pairing inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent advances in therapy using triple-helical DNA are described in the literature (Gee, JE et al. (1994) in: Huber, BE and BI Carr,Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing Co., Ltd. , Mt. Kisco, NY, pp. 163-177). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to prevent translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
[0190]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules and can also be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA prior to nucleotide strand breaks. For example, it includes a recombinant hammerhead ribozyme molecule that specifically and effectively catalyzes nucleotide chain cleavage of a sequence encoding PKIN.
[0191]
Specific ribozyme cleavage sites within any RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, including GUA, GUU, GUC sequences. Once identified, it is possible to evaluate short RNA sequences of 15-20 ribonucleotides corresponding to regions of the target gene containing cleavage sites for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. . Evaluation of the suitability of a candidate target can also be performed by testing the feasibility of hybridization with a complementary oligonucleotide using a ribonuclease protection assay.
[0192]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made using any method well known in the art for synthesizing nucleic acid molecules. Optional methods include chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, the DNA sequence encoding PKINin in vitroas well asin VivoRNA molecules can be produced by transcription. Such a DNA sequence can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that constitutively or inducibly synthesize complementary RNA can be introduced into a cell line, cell or tissue.
[0193]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible, but not limiting, modifications include the addition of flanking sequences at the 5 ′ end, 3 ′ end, or both, of the molecule, and phosphorothioate or 2 ′ rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. 'Using O-methyl. This concept is unique to the production of PNA and can be extended to all these molecules. These include adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases, with acetyl-, methyl-, thio-, and similar modifications, as well as non-conventional bases such as inosine, queosine. (Queousine), wybutosine and the like.
[0194]
A further embodiment of the invention includes a method of screening for a compound that is effective in altering the expression of a polynucleotide encoding PKIN. Compounds useful for, but not limited to, mutagenesis of specific polynucleotides include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcriptional regulators, and interact with specific polynucleotide sequences. There are non-polymeric entities that can act. Effective compounds can mutate polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Accordingly, in the treatment of diseases associated with increased PKIN expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding PKIN are therapeutically useful, and are associated with reduced PKIN expression or activity. In treating disease, compounds that specifically enhance the expression of a polynucleotide encoding PKIN may be therapeutically useful.
At least one to a plurality of test compounds may be screened for efficacy in mutagenizing a specific polynucleotide. Test compounds are obtained by any method commonly known in the art. Such methods include mutating the expression of the polynucleotide, selecting from existing, commercially available or proprietary, natural or non-natural compound libraries, and chemically and / or structurally modifying the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective when rationally designing compounds based on properties and when selecting from libraries of combinatorially or randomly generated compounds. A sample containing a polynucleotide encoding PKIN is obtained by exposing it to at least one test compound. The sample can be, for example, an intact cell, a permeabilized cell, a cell-free reconstituted system or a reconstituted biochemical system. Changes in the expression of a polynucleotide encoding PKIN are assayed by any method known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding PKIN. The amount of hybridization can be quantified, thereby forming the basis for a comparison of the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. Detection of a change in expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in mutating expression of the polynucleotide. For a compound effective for mutation expression of a specific polynucleotide, for example,Schizosaccharomyces pombeGene expression system (Atkins, D. et al. (1999) US Patent No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell lines such as HeLa cells (Clarke). , ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention involve screening a combinatorial library of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against a specific polynucleotide sequence ( Bruice, TW, et al. (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW, et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0195]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitroas well asex VivoEqually suitable for the use ofex VivoFor treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient, cloned and propagated and returned to the same patient by autotransplantation. Transfection, ribosome injection or delivery by polycationic amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-). 466.).
[0196]
Any of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0197]
An additional embodiment of the present invention involves the administration of an ingredient having an active ingredient usually formulated in a pharmaceutically acceptable excipient. Excipients include, for example, sugars, starches, celluloses, gums and proteins. Various prescriptions are usually known,Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such compositions comprise PKIN, antibodies to PKIN, mimetics, agonists, antagonists or inhibitors of PKIN.
[0198]
The components used in the present invention can be administered by any number of routes, including but not limited to oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, Intraventricular, lung, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
Components for pulmonary administration can be prepared in liquid or dry powder form. Such components typically aerosolize shortly before inhalation by the patient. For small molecules (eg, traditional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast-acting formulations is known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), the recent improvement in the art of pulmonary delivery through the alveolar region of the lung results in the transport of drugs such as insulin substantially into the blood circulation. (See Patton, JS, et al., US Pat. No. 5,997,848, etc.). Pulmonary delivery is advantageous in that it is administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0199]
Ingredients suitable for use in the present invention include those that contain as much active ingredient as necessary to achieve the intended purpose. Determination of the effective dosage is within the ability of those skilled in the art.
[0200]
Preferably, the composition is prepared in a special form to deliver the macromolecule, including PKIN or a fragment thereof, directly into the cell. For example, a liposome formulation comprising a cell-impermeable polymer may facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, PKIN or a fragment thereof can be linked to the cationic N-terminus of the HIV Tat-1 protein. The fusion protein thus produced is known to transduce cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285: 1569-1572). .
[0201]
For any compound, an effective dosage of treatment can be initially estimated in cell culture assays, such as those for neoplastic cells, or in animal models such as mice, rabbits, dogs or pigs. . Animal models can also be used to determine suitable concentration ranges and routes of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans. A medically effective dose relates to the amount of active ingredient that ameliorates a symptom or condition, eg, PKIN or a fragment thereof, an antibody to PKIN, an agonist or antagonist of PKIN, an inhibitor, and the like. Therapeutic efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, for example by ED₅₀(Pharmaceutically effective amount of 50% of the population) or LD₅₀(A lethal dose of 50% of the population). The dose ratio of toxic to medicinal effects is the therapeutic index, LD₅₀/ ED₅₀It can be expressed as a ratio. Components that exhibit a high therapeutic index are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for use in humans. Dosages containing such compositions will contain little or no toxicity, ED₅₀It is preferable that the concentration be in the blood concentration range containing Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.
[0202]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject include the severity of the disease, the patient's general health, the patient's age, weight and gender, the time and frequency of administration, drug combination, response sensitivity and response to treatment. Components with a longer duration of action may be administered once every 3 to 4 days, once a week, or once every two weeks depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0203]
Normal dosage amounts range from about 0.1 to 100,000 μg, depending on the route of administration, up to a total of about 1 g. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to physicians in the field. One skilled in the art will utilize formulations for nucleotides that are different from those for proteins or inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
[0204]
(Diagnosis)
In another embodiment, an assay for the diagnosis of diseases characterized by expression of PKIN, or for monitoring patients being treated with PKIN, an agonist or antagonist of PKIN, or an inhibitor, wherein the antibody that specifically binds to PKIN is used. Used for Antibodies useful for diagnostic purposes are prepared in the same manner as described above for treatment. Diagnostic assays for PKIN include methods that use antibodies and labels to detect PKIN from human body fluids or from cells or tissues. The antibody can be modified or unmodified and can be labeled covalently or non-covalently with a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used, some of which are described above.
[0205]
Various protocols for measuring PKIN, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide a basis for diagnosing abnormal or abnormal levels of PKIN expression. Normal or standard PKIN expression values are determined by combining an antibody against PKIN with body fluids or cells collected from a subject, such as a normal mammal, eg, a human, under conditions suitable for complex formation. I do. The amount of the standard complex formed can be determined by various methods, for example, by photometry. The amount of PKIN expression in each sample from the subject, control, and disease biopsy tissue is compared to a reference value. The deviation between the standard value and the subject is a parameter for diagnosing the disease.
[0206]
According to another embodiment of the present invention, polynucleotides encoding PKIN may be used for diagnosis. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotide is used to detect and quantify the expression of the gene in biopsied tissues that express PKIN, which can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of PKIN, as well as overexpression, and to monitor PKIN levels during treatment.
[0207]
In one embodiment, a nucleic acid sequence encoding PKIN can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising the gene sequence encoding PKIN or a closely related molecule. The specificity of a probe, whether it is made from a highly specific region, for example, the 5 'regulatory region, or a region of relatively low specificity, such as a conserved motif, and the stringency of hybridization or amplification, Will only identify the native sequence that encodes the PKIN, or only the natural sequence that encodes the allele or related sequence.
[0208]
Probes can also be used for the detection of related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding PKIN. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 27-52 or a genomic sequence containing the promoter, enhancer, and intron of the PKIN gene.
[0209]
As a method for producing a hybridization probe specific to DNA encoding PKIN, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding PKIN and a PKIN derivative into a vector for producing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those of skill in the art and are commercially available, by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with a population of different reporters. Examples of reporter populations include:³²P or³⁵Radionuclides such as S; or enzyme labels such as alkaline phosphatase bound to the probe via an avidin / biotin binding system.
[0210]
The polynucleotide sequence encoding PKIN can be used to diagnose a disease associated with PKIN expression. Such disorders include, but are not limited to, cancer, immune disorders, disorders affecting growth and development, atherosclerosis and other cardiovascular disorders, and dyslipidemia. Is adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney Includes lymphoma such as liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, leukemia such as multiple myeloma, malignant lymphoma, Among the immune diseases are acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia , Autoimmune Thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocytic toxin Lymphocytopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple occurrence Sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, Systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial sensation Diseases that affect growth and development include fungal infections, fungal infections, parasite infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma, and include actinic keratosis and atherosclerosis, bursa Inflammation, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma , Myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas Cancer of the parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy , Gonad dysplasia, WAGR Syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, Charcot-Marie Hereditary neuropathies such as tooth disease and neurofibromatosis, seizure disorders such as hypothyroidism, hydrocephalus, chorea (Syndenham's chorea) and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spondylolysis, Includes congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss, and cardiovascular diseases include arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, vein malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombus and veins Flame and venous thrombosis, vascular tumor, thrombolysis complications, balloon angioplasty, vascular replacement, bypass surgery, congestive heart failure, ischemic heart Patients, angina, myocardial infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annulus calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatism Congenital heart disease, infectious endocarditis, nonbacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital Congenital heart disease and complications of heart transplantation and congenital lung abnormalities, lung dysfunction, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, Restricted lung disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis , Sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia Hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilia-obstructive bronchiolitis-pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary hemorrhage syndrome, Goodpasture's syndrome, idiopathic pulmonary hemangiopathy, Includes concurrent lung disease, alveolar proteinosis, lung tumor, inflammatory and non-inflammatory pleural effusion, pneumothorax, pleural tumor, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and complications of lung transplantation. Among them are fatty liver, cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, carnitine palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deminase deficiency, hypertriglyceridemia, lipid storage diseases such as Fabry disease, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic white Dystrophy, adrenal leukodystrophy, G_{M 2}Gangliosidosis, celoid lipofuscinosis, abeta-lipoproteinemia, tanzier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous steatitis, disseminated adipose tissue necrosis Lipoid adrenal hyperplasia, lipoid nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid gland Hypofunction, kidney disease, liver disease, lecithin-cholesterol acyltransferase deficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia , Lipid myopathy, and obesity. Polynucleotide sequences encoding PKIN can be obtained by Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin, ELISA, and expression of mutant PKIN. Can be used for microarrays utilizing body fluids or tissues collected from patients to detect Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0211]
In certain embodiments, the PKIN-encoding nucleotide sequence will be useful in assays that detect related disorders, particularly those described above. The nucleotide sequence encoding PKIN may be labeled by standard methods and added to a sample of body fluid or tissue taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient's sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding PKIN in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate the effect of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or to monitor the treatment of individual patients.
A normal or standard profile of PKIN expression is established to provide a basis for diagnosis of a disease associated with PKIN expression. This can be achieved by combining a PKIN-encoding sequence or a fragment thereof with a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments performed with known amounts of substantially purified polynucleotide to values obtained from normal subjects. The standard values thus obtained can be compared to values obtained from samples obtained from patients showing signs of the disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of disease.
[0212]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, hybridization assays can be repeated on a regular basis to determine if the patient's expression levels have begun to approach those observed in normal subjects. it can. The results from serial assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0213]
With respect to cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts (under- or over-expression) in living tissue from an individual indicates the predisposition of the disease or a method of detecting the disease before actual clinical symptoms appear. Or offer. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0214]
Further diagnostic uses of oligonucleotides designed from PKIN-encoding sequences may include the use of PCR. These oligomers can be chemically synthesized, produced enzymatically, orin in vitroCan be produced in Oligomers, including fragments of a polynucleotide that preferably encodes PKIN, or fragments of a polynucleotide that is complementary to a polynucleotide that encodes PKIN, are used under optimal conditions to identify a particular gene or condition. You. Oligomers can also be used under relatively mild stringent conditions for detection, quantification, or both, of closely related DNA or RNA sequences.
[0215]
In some embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding PKIN can be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause a congenital or acquired genetic disease in humans. Although not limited, SNP detection methods include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, DNA is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers derived from the polynucleotide sequence encoding PKIN. DNA can be derived, for example, from diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in DNA cause differences in the secondary and tertiary structure of single-stranded PCR products. Differences can be detected using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This allows the detection of amplimers on high throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as arranged in a common consensus sequence. obtain. These computer-based methods filter out sequence variations due to sequencing errors using laboratory preparation and statistical models of DNA and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry, for example, using a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0216]
Methods that can be used to quantify PKIN expression also include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of regulatory nucleic acids, and interpolation of results from standard curves (see, eg, Melby, PCC). (1993) J. Immunol. Methods 159: 235244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229236. The rate of quantitation of multiple samples can be accelerated by performing high-throughput formats of assays that allow rapid quantitation by color reaction.
[0217]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relevant expression levels of multiple genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. This information can be used to determine gene function, understand the genetic basis of disease, diagnose disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a patient's pharmacogenomic profile to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective and has few side effects for the patient can be selected.
[0218]
In another embodiment, PKIN, a fragment of PKIN, an antibody specific for PKIN can be used as an element on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0219]
Certain embodiments relate to the use of a polynucleotide of the invention to produce a transcribed image of a tissue or cell type. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns are analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at predetermined times under predetermined conditions (Seilliamer et al., US Patent No. 5,840,484, "Comparative Gene"). Transscript Analysis ", incorporated herein by reference to this patent). Thus, transcribed images can be generated by hybridizing the polynucleotide of the present invention or its complement to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In certain embodiments, hybridization occurs in a high-throughput format such that the polynucleotide of the invention or its complement comprises a plurality of subsets of the elements on the microarray. The resulting transcribed image can provide a profile of gene activity.
[0220]
Transcript images can be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies, or biological samples thereof. The transcribed image is therefore in the case of a tissue or biopsy samplein VivoOr in the case of cell linesin in vitroReflects gene expression at
Transcribed images that generate the expression profile of the polynucleotides of the present invention can also be used for toxicity testing of industrial or natural environmental compounds,in in vitroIt can be used in connection with preclinical evaluation of model systems and drugs. All compounds elicit a characteristic pattern of gene expression, often referred to as molecular fingerprints or toxic signatures, which implies a mechanism of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog. 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which is hereby incorporated by reference. Department). If the test compounds have the same signature as the signature of the compound with known toxicity, they may share toxic properties. A fingerprint or signature is most useful and accurate if it contains expression information from a large number of genes and gene families. Ideally, a genome-wide measurement of expression will provide the highest quality signature. Even if genes whose expression is not altered by any of the tested compounds are equally important, the expression levels of such genes are used to normalize the remaining expression data. The normalization procedure is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of a toxic signature helps to interpret the toxic mechanism, but knowledge of the gene function is not required to statistically match the signatures leading to toxicity prediction (eg, February 29, 2000). See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences, which is available at http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm. Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences using toxic signatures during toxicological screening.
[0221]
In certain embodiments, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound. Nucleic acids expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The transcript level in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. The difference in transcription level between the two samples indicates a toxic reaction caused by the test compound in the treated sample.
[0222]
Another example involves analyzing a tissue or cell type proteome using the polypeptide sequences of the invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be individually further analyzed. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis, such as separating proteins from a sample by one-dimensional isoelectric focusing and separating according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis ( Steiner and Anderson, supra). Proteins are visualized in the gel as dispersed, uniquely located points, usually by staining the gel with a substance such as Coomassie blue or silver or a fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical densities of protein spots obtained from different samples, eg, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, are compared to identify changes in protein spot density associated with the treatment. The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 consecutive amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
Proteome profiles can also be generated by quantifying PKIN expression levels using antibodies specific for PKIN. In one embodiment, protein expression levels are quantified by using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999)). Anal. Biochern. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed by various methods known in the art, for example, the proteins in the sample can be reacted with a thiol or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at the elements of each array.
[0223]
Toxicity signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxicology signatures at the transcript level. For some proteins in certain tissues, the correlation between transcription and protein abundance may be poor (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537). The proteome toxicity signature may be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect but alter the profile of the protein. In addition, protein profiling is more reliable and informative in such cases, since the analysis of transcription in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA.
[0224]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the processed biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing the amino acid residues of the individual proteins and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0225]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins obtained from a biological sample are incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample.
[0226]
Microarrays are prepared, used, and analyzed using methods well known in the art (Brennan, TM et al. (1995) US Patent No. 5,474,796; Schena, M.). (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 35505. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155; Heller, MJ. Et al. (1997) US Patent No. 5,605,662, etc.). . Various types of microarrays are known, and for details, seeDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, Editing. (1999) Oxford University Press, London. This reference is specifically incorporated by reference.
[0227]
In another embodiment of the invention, nucleic acid sequences encoding PKIN can be used to generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Either coding or non-coding sequences can be used; in certain instances, non-coding sequences are preferred throughout the coding sequence. For example, conservation of a coding sequence within a member of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. The nucleic acid sequence can be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificially formed chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product, or a single chromosomal cDNA. Mapped to libraries (eg, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127134; J. (1991) Trends Genet. 7: 149154.) Once mapped, the nucleic acid sequences of the invention can be used to correlate, for example, pathological inheritance with a particular chromosomal region inheritance or restriction fragment length polymorphism (RFLP). Gene linkage maps can be generated. (See, for example, Lander, ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357.)
Fluorescence in situ hybridization (FISH) can correlate with other physical and genetic map data (see Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, 1995, Meyers, 965-968, etc.). Examples can be found in various scientific journals or on the website of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Since the correlation between the location of the gene encoding PKIN on the physical chromosomal map and a predisposition to a particular disease, or a predisposition to a particular disease, can help determine the DNA region associated with such a disease, additional locations may be needed. Determining cloning is performed.
[0228]
The genetic map can be extended using physical mapping techniques such as binding analysis using established chromosomal markers and chromosome sample in situ hybridization. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, can reveal relevant markers even when the exact chromosomal locus is not known. This information is valuable to researchers searching for disease genes using positional cloning and other gene discovery techniques. Once the disease or syndrome has been loosely located by genetic linkage to a particular genetic region, such as the 11q22-23 region of ataxia telangiectasia, any mapping to that region will result in the relevant gene being identified for further investigation. Alternatively, it can represent a regulatory gene (see Gatti, RA, et al. (1988) Nature 336: 577-580, etc.) between a healthy person, a carrier, and an infected person due to translocation, inversion, and the like. The nucleotide sequence of the present invention may be used to discover differences in chromosomal location in.
In another embodiment of the present invention, PKIN, its catalytic or immunogenic fragments or its oligopeptides can be used to screen libraries of compounds in any of a variety of drug screening techniques. The fragments used for drug screening will be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. Complex formation due to binding of PKIN to the agent to be tested may be measured.
Another drug screening method is used to screen compounds having suitable binding affinity to the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. WO 84/03564). . In this method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is washed after reacting with PKIN, or a fragment thereof. Next, the bound PKIN is detected by methods well known in the art. Purified PKIN can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, the peptide can be captured using a non-neutralizing antibody and the peptide immobilized on a solid support.
In another embodiment, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding PKIN specifically compete with the test compound for binding PKIN. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with PKIN.
In another embodiment, the nucleotide sequence encoding PKIN is used in developing molecular biology techniques to characterize nucleotide sequences such as, but not limited to, the currently known triplet code and specific base pairing interactions. Can provide new technologies that depend on
[0229]
Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention in any way.
All patents, patent applications and publications disclosed herein, especially US Patent Nos. 60 / 212.073, 60 / 213.467, 60 / 215.651, 60 / 216.605. Nos. 60 / 218.372 and 60 / 228.056 are hereby incorporated by reference.
(Example)
1. Preparation of cDNA library
Incyte cDNA is derived from the cDNA library described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA) and listed in column 5 of Table 4.
Some tissues are homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while others are homogenized and dissolved in a mixture of phenol or a suitable denaturant. The mixture of the denaturing agent is, for example, TRIZOL (Life Technologies) which is a single-phase solution of phenol and guanidinium isothiocyanate. The resulting lysate was centrifuged on a cesium chloride cushion or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using isopropanol, sodium acetate and ethanol, or either, or another method.
[0230]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. In some cases, the RNA was treated with DNase. For most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Valencia CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit, such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
In some cases, RNA was provided to Stratagene, and a corresponding cDNA library was sometimes produced by Stratagene. Otherwise, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) according to the recommended method known in the art or a similar method, and a cDNA library was prepared (Ausubel, supra). , 1997, unit 5.1-6.6 etc.). Reverse transcription was started with oligo d (T) or random primer. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme. For most libraries, cDNA size (300-1000 bp) selection was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech) or preparative agarose gel electrophoresis. Suitable plasmids, such as the PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene), the pSPORT1 plasmid (Life Technologies), the PCDNA2.1 plasmid (Invitrogen, Carlsbad CA), the PBK-CMV plasmid (Stratagene) or plNCY, or a derivative of PlNCY, Incy, Glyme, Inc. The cDNA was ligated to a compatible restriction enzyme site of a polylinker. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli cells containing XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR from Stratagene, or DH5α, DH10B or ELECTROMAX DH10B from Life Technologies.
2 cDNA Clone isolation
UNIZAP vector system (Stratagene) was used.in VivoBy excision or by cell lysisExample 1The plasmid obtained as described above was recovered from the host cells. Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAWELL 8PlaimPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid E. FIG. A. L. Plasmids were purified using at least one of the Prep 96 plasmid kits. After settling, they were resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0231]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using direct binding PCR in a high-throughput format (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling process of the host cells was performed in a single reaction mixture. Samples were processed, stored in 384-well plates, and the concentration of amplified plasmid DNA was determined fluorometrically using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a Fluoroskan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Quantified.
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in, was sequenced as shown below. The cDNA sequencing reaction can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or a PTC-200 thermal cycler (MJ Research) with a HYDRA microdispenser (Robbins ScientificLMIBlOMIBOMICRiMbO2MCR) Treated in conjunction with the system. The sequencing reaction of cDNA was performed by using a reagent provided by Amersham Pharmacia Biotech or an ABI sequencing kit, for example, an ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied reagent prepared by using a reagent provided by Applied Biosystems). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics) or the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using standard ABI protocols and base pairing software ( Applied Biosystems) or other sequence analysis systems well known in the art. The reading frame within the cDNA sequence was determined using standard methods (reviewed in Ausubel, 1997, unit 7.7, supra). Select some of the cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the method described in (1).
[0232]
The polynucleotide sequence derived from the Incyte cDNA sequence was validated by removing the vector, linker and poly (A) sequences and masking ambiguous base pairs. At that time, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming and adjacent dinucleotide frequency analysis were used. Then, using programs based on BLAST, FASTA and BLIMPS, to obtain annotations in the program, public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes databases; For selection of Hidden Markov Model (HMM) -based protein family databases such as BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and PFAM, the HMM that queried the Incyte cDNA sequence or its translation for selection of a HMM-based protein family database is a stochastic approach to analyzing the consensus primary structure of a gene family (See, Eddy, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365). Queries were made using programs based on BLAST, FASTA, BLIMPS and HMMER. Incyte cDNA sequences were constructed to yield full-length polynucleotide sequences. Alternatively, GenBank cDNA, GenBank EST, stitched sequence, stretched sequence or Genscan predicted coding sequence (Examples 4 and 5) Was used to extend the population of Incyte cDNA to full length. A population of cDNAs was screened for open reading frames using a program based on Phred, Prap and Consed, and a program based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full length polypeptide sequence. Alternatively, the polypeptides of the invention may start at any methionine residue of the full length translated polypeptide. Subsequently, full-length polypeptide sequences were analyzed by queries against the GenBank protein database (genpept), databases such as SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, and Hidden Markov Model (HMM) based protein family databases such as PFAM. . Full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Polynucleotide and polypeptide sequence alignments are generated using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm, such as that incorporated into the MEGALIGN Multi-Sequence Alignment Program (DNASTAR), which also calculates the percent identity between aligned sequences.
[0233]
Table 7 outlines the tools, programs and algorithms used for analysis and assembly of Incyte cDNA and full-length sequences, along with applicable descriptions, references and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 7, and a brief description of them is shown in column 2. Column 3 is a preferred citation, all of which are incorporated by reference in their entirety. If applicable, column 4 shows the score, probability value and other parameters used to evaluate the strength of the match between the two sequences (the higher the score, the higher the homology between the two sequences) ).
[0234]
The programs described above for assembling and analyzing full-length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NOs: 27-52. Fragments of about 20 to about 4000 nucleotides that are useful for hybridization and amplification techniques are set forth in Table 4, column 4.
[0235]
4 Genome DNA Identification and editing of coding sequences from
Putative human kinases were first identified by running the Genscan gene identification program in public genomic sequence databases (eg, gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from a variety of organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94 and Burge, C. and S. Karl). Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). The program ligates the predicted exons to form a structured cDNA sequence ranging from methionine to stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences analyzed at one time by Genscan was set at 30 kb. To determine which of these Genscan deduced cDNA sequences encodes human kinase, the encoded polypeptide was queried and analyzed for human kinase in a PFAM model. Potential human kinases were identified based on homology to the in-site cDNA sequence annotated as human kinase. The Genscan predicted sequences thus selected were then compared by BLAST analysis to the public databases gbpri and gbhtg. If necessary, edit the Genscan predicted sequence by comparing to the top BLAST hit from genpept to correct errors in the Genscan predicted sequence, such as extra or removed exons. BLAST analysis also provides evidence of transcription as it is used to find the public cDNA coverage of any Incyte cDNA or Genscan predicted sequence. If Incyte cDNA coverage was available, this information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence. The full-length polynucleotide sequence isExample 3Obtained by constructing the Genscan predicted coding sequence with the Incyte cDNA sequence and / or the public cDNA sequence using the construction process described in US Pat. Alternatively, the full-length polynucleotide sequence is completely derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0236]
5 Assembly of genomic sequence data into cDNA sequence data
Stitch arrangement ( Stitched Sequence )
The partial cDNA sequence isExample 4Were extended using the exons predicted by the Genscan gene identification program described in (1).Example 3The partial cDNAs constructed as described in were mapped to genomic DNA and decomposed into clusters containing the related cDNA and Genscan exons predicted from one or more genomic sequences. Analyze each cluster using algorithms based on graph theory and dynamic programming to integrate cDNA and genomic information, and subsequently confirm, edit or extend to generate potential splice variants that yield full-length sequences did. Sequences were identified in which the length of the entire interval was present in more than one sequence in the cluster, and the intervals so identified were considered equal over time. For example, if there is an interval between one cDNA and two genomic sequences, all three intervals are considered equal. This process can link unrelated but contiguous genomic sequences together by cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequences. The linkage of intervals generated along one parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) took precedence over the linkage that changed parent type (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated into public databases genpept and gbpri by BLAST analysis and compared. Incorrect exons predicted by Genscan were corrected by comparing to the top BLAST hit from genpept. If necessary, the sequence was further extended using additional cDNA sequences or by inspection of genomic DNA.
Stretch array ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, the BLAST program was used to access public databases such as GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes databases.Example 3Were queried for the partial cDNAs constructed as described in. Next, the closest GenBank protein homolog was analyzed by BLAST analysis for the Incyte cDNA sequence orExample 4As described in any of the GenScan exon predicted sequences described above. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to generate a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto a GenBank protein homolog. Insertions or deletions can occur within the chimeric protein relative to the original GenBank protein homolog. GenBank protein homologs, chimeric proteins or both were used as probes to search homologous genomic sequences from public human genome databases. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of a homologous genomic sequence. The resulting stretch sequences were examined to determine if they contained the complete gene.
[0237]
6. Chromosome mapping of polynucleotides encoding PKIN
The sequences used to construct SEQ ID NOs: 27-52 were compared to those in the Incyte LIFESEQ database and the public domain database using the BLAST and Smith-Waterman algorithms. Sequences from these databases consistent with SEQ ID NOs: 27-52 were incorporated into clusters of contiguous and overlapping sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 7). Whether clustered sequences were previously mapped using radiation hybrid and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Institute (WIGR), and Genethon Was measured. As a result of the inclusion of the mapped sequence in a cluster, the entire sequence of that cluster, including the individual sequence numbers, was assigned to locations on the map.
Locations on the map are represented as ranges or intervals of human chromosomes. The location on the map of centiMorgan spacing is measured relative to the end of the p-arm of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit of measure based on the frequency of recombination between chromosomal markers. On average, 1 cM is approximately equal to one megabase (Mb) of DNA in humans. The cM distance is a genetic marker mapped by Genethon such that the sequence provides a boundary for radiation hybrid markers such that the sequence is contained within each cluster. based on. The above sections have already been identified using human genetic maps and other sources available to the general public, such as the NCBI "GeneMap99" (http: //www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap). Whether it is located in or near the disease gene map can be determined.
[0238]
Thus, SEQ ID NO: 27 was mapped to chromosome 19 and SEQ ID NO: 35 was mapped to chromosome 15 at an interval within 72.30 to 77.30 centiMorgan. SEQ ID NO: 48 maps to chromosome 10 at intervals within 93.80-96.90 centiMorgan. SEQ ID NO: 49 maps to chromosome 13 with an interval within 11.60 to 22.80 centiMorgan and to chromosome 17 with an interval within 0.60 to 14.80 centiMorgan, and furthermore, 57.70 to 64. Chromosome 20 was mapped at intervals within .10 centimorgan. One or more map positions are reported for SEQ ID NO: 49, indicating that sequences with different map positions were constructed in one cluster. This situation occurs when sequences that are very similar but not completely identical are assembled in one cluster.
[0239]
7. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information and involves the hybridization of a labeled nucleotide sequence to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. (See Sambrook, supra, Chapter 7, Ausubel. FM, et al., Chapters 4 and 16, etc.)
Similar computer techniques applied to BLAST are used to search the same or related molecules in nucleotide databases such as GenBank and LifeSeq (Incyte Pharmaceuticals). Northern analysis is much faster than multi-membrane based hybridization. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether to classify a particular identity as exact or homologous. The search criterion is the product score, which is defined by the following equation.
[0240]
(Equation 1)

The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length at which the sequences match. The product score is a standardized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent sequence identity of the nucleotides and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. The BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each base matching the high scoring segment pair (HSP) and -4 to each mismatched base pair. The two sequences may share more than one HSP (can be separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the entire shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when one end matches 100% and overlaps 70%, or the other end matches 88% and overlaps 100%. The product score 50 is obtained when either one end matches 100% and overlaps 50%, or the other end matches 79% and overlaps 100%.
[0241]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding PKIN is analyzed against the tissue of origin. For example, one full-length sequence is the Incyte cDNA sequence (Example 3) Are constructed so as to at least partially overlap with the above. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue has a cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryo structure, endocrine system, exocrine glands, female genitalia, male genitalia, germ cells, blood and immune system, lung, musculoskeletal system, nervous system, pancreas, respiration Classified into one of the organism / tissue categories, such as organs, sensory organs, skin, stomatognathic system, unclassified / mixed, or ureter. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / pathology categories: cancer, cell line, development, inflammation, nervous, trauma, cardiovascular, congestion, and others. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The percentage obtained reflects the disease-specific expression of the cDNA encoding PKIN. cDNA sequence and cDNA library / tissue information can be obtained from the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0242]
8. Elongation of polynucleotide encoding PKIN
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragment using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragment of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 'extension of the known fragment, and the other primer was synthesized to initiate 3' extension of the known fragment. The design of the starting primers is such that OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or about 22-30 nucleotides in length, with a GC content of 50% or more and annealing to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. Designed using another suitable program. All hairpin structures and nucleotide extensions resulting in primer-primer dimers were avoided.
To extend the sequence, a selected human cDNA library was used. If more than one step extension was needed or desired, additional primers or nested sets of primers were designed.
[0243]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture was composed of template DNA and 200 nmol of each primer, Mg^{2 +}And (NH₄)₂SO₄And a buffer containing β-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters. Step 1: 94 ° C., 3 minutes, Step 2: 94 ° C., 15 seconds, Step 3: 60 ° C., 1 minute, Step 4: 68 ° C., 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3 and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C. Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters. Step 1: 94 ° C., 3 minutes, Step 2: 94 ° C., 15 seconds, Step 3: 57 ° C., 1 minute, Step 4: 68 ° C., 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3 and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C.
[0244]
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25 (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence. The DNA is distributed to each well of a counting plate (Coming Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent, and the measurement is performed. The plate was scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure the fluorescence of the sample and quantify the DNA concentration. Aliquots of 5-10 μl of the reaction mixture were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reactions were successful in extending the sequence.
[0245]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested using CviJI cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and ligated into a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). Sonicated or sheared before. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, the fragments were excised, and the agar was digested with Agar ACE (Promega). The extended clone was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA), treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene), and treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene). And transfected into E. coli cells. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing an antibiotic, and each colony was cut out and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture at 37 ° C. overnight.
The cells were lysed, and the DNA was PCR-amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure. Step 1: 94 ° C., 3 minutes, Step 2: 94 ° C., 15 seconds, Step 3: 60 ° C., 1 minute, Step 4: 72 ° C., 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3 and 4 29 times . Step 6: Store at 72 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C. DNA was quantified using the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples were diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), DYENAMIC energy transfer sequencing primers, and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing kit (Timer cycle kit) reaction kit) (Applied Biosystems).
[0246]
Similarly, the above procedure is used to verify full-length nucleotide sequences, or to obtain 5 'regulatory sequences using oligonucleotides designed for such extension and appropriate genomic libraries.
[0247]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
A cDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using a hybridization probe derived from SEQ ID NO: 27-52. Although the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs is specifically described, the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences) and 50 pmol of each oligomer and [γ-³²P] Adenosine triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech) 250 μCi is mixed with T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is sufficiently purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of the endonucleases of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xbal or Pvu II (DuPont NEN), 10 per minute⁷An aliquot containing a count of labeled probes is used.
[0248]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blot is washed sequentially at room temperature, for example, under conditions consistent with 0.1 × sodium citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared using autoradiography or an alternative imaging means.
10 microarray
Chaining or synthesizing array elements on the surface of a microarray can be achieved using photolithography, piezoelectric printing (see inkjet printing, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. It is. In each of the above techniques, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, an array similar to dot blot or slot blot may be used to place and attach elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical binding procedures. Regular arrays can be made using available methods and machines known to those of skill in the art and may have any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470, Shalon. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0249]
Full-length cDNA, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art, such as Laser GENE software (DNASTAR). Array elements are hybridized with polynucleotides in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization is detected at each array element using a fluorescence scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
Preparation of tissue or cell samples
Total RNA was isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) was isolated using the oligo (dT) cellulose method.⁺Purify the RNA. Each poly (A)⁺RNA samples were MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, Reverse transcription is performed using 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). The reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGT kit (Incyte) using 200 ng poly (A).⁺Performed in 25 volume ml containing RNA. Specific control poly (A)⁺RNA is derived from non-coding yeast genomic DNAin in vitroSynthesized by transcription. Each reaction sample (one labeled Cy3 and the other labeled Cy5) is treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 85 ° C. for 20 minutes to stop the reaction and degrade RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After binding, the two reaction samples are ethanol precipitated with 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then dried and finished using SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl of 5 × SSC / 0.2% SDS.
Preparation of microarray
An array element is generated using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from vector-containing bacterial cells by a cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence flanking the cDNA insert. Amplify array elements from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg in 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0250]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope slides (Corning) are washed during and after treatment by sonication in 0.1% SDS and acetone, and very well washed with distilled water. Slides are etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed extensively in distilled water, and 0.05% aminopropylsilane (Sigma) in 95% ethanol. ). The coated glass slide is cured with an oven at 110 ° C. Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The specification is incorporated herein by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed mechanical device. The device now adds approximately 5 nl of array element sample per slide.
[0251]
The microarray is UV cross-linked using a STRATALLINKER UV cross-linking agent (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. After incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) for 30 minutes at 60 ° C., 0.2% SDS and Non-specific binding sites are blocked by washing with distilled water.
Hybridization
The hybridization reaction solution contained 9 μl of a sample mixture containing 0.2 μg each of Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis products in a 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted 1.8 cm on the microarray surface.² Cover with cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. The interior of the chamber is kept at 100% humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. The arrays were washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) at 45 ° C. for 10 minutes and in the second wash buffer (0.1 × SSC) at 45 ° C. for 10 minutes each. Wash and dry.
detection
The reporter-labeled hybridization complex uses an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) that can generate spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation. Detect with a microscope equipped. The excitation laser light is focused on the array using a 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of a microscope and raster scanned through an objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example was scanned at a resolution of 20 μm.
[0252]
Of the two different scans, the mixed gas multiline laser excites the two fluorescent dyes sequentially. The emitted light is separated based on the wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorescent dyes. The signal is filtered using a suitable filter placed between the array and the photomultiplier. The maximum emission wavelength of the fluorescent dye used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorochromes simultaneously, but scans once for each fluorochrome using a suitable filter in the laser source, and typically scans each array twice.
[0253]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by a cDNA control species added to a known concentration of the sample mixture. A specific location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location correlates to a 1: 100,000 weight ratio of hybridizing species. When two samples from different sources (eg, cells to be tested and control cells) are each labeled with a different fluorescent dye and hybridized to a single array to identify differentially expressed genes Is performed by labeling a sample of the cDNA to be calibrated with two fluorescent dyes and adding equal amounts of each to the hybridization mixture.
[0254]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) converter board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensities have been mapped using a linear 20-color conversion from a blue (low signal) to a pseudo-color range from red (high signal). The data is also analyzed quantitatively. If two different fluorochromes are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the fluorochromes (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each fluorochrome.
[0255]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescent signal in each element is integrated, and a value corresponding to the average intensity of the signal is obtained. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
11 Complementary polynucleotide
A sequence that encodes PKIN or a sequence that is complementary to any portion thereof is used to reduce or inhibit expression of native PKIN. Although the use of oligonucleotides containing about 15-30 base pairs is described, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. The appropriate oligonucleotides are designed using the Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of PKIN. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to inhibit the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent the ribosome from binding to the transcript encoding PKIN.
[0256]
12. Expression of PKIN
PKIN expression and purification can be performed using bacterial or viral based expression systems. For expression of PKIN in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that increases antibiotic resistance and the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express PKIN when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of PKIN in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect or mammalian cell lines.Autographica californicaIt is performed by infecting nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with the cDNA encoding PKIN by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid-mediated. The infectivity of the virus is maintained and a strong polyhedron promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (See Engelhard. EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
In most expression systems, PKIN is a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His; Can be performed quickly and in one go. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum, which allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from PKIN at a specific manipulation site. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which six histidine residues are continuously extended enables purification on a metal chelating resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) supra, Chapters 10 and 16. Using PKIN purified by these methods directly,Examples 16, 17, and 18Can be performed.
[0257]
13 Functional Assay
PKIN function is assessed by expression of PKIN-encoding sequences at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Selected vectors include the pCMV SPORT plasmid (Life Technologies) and the pCR 3.1 plasmid (Invitrogen), both with the cytomegalovirus promoter. Using a liposome formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein provides a means of distinguishing transfected from non-transfected cells. In addition, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. The labeling protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or a CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells expressing GFP or CD64-GFP and evaluate their apoptotic status and other cellular properties using an automated, laser optics-based technique, flow cytometry (FCM) I do. FCM detects and quantifies the uptake of fluorescent molecules that diagnose a phenomenon that precedes or coincides with cell death. Such phenomena include changes in nuclear DNA content measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and granularity measured by forward light scattering and 90 ° side light scattering, Downregulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, changes in cell surface and intracellular protein expression as measured by reactivity with specific antibodies, and cells with fluorescent complex annexin V protein There is a change in plasma membrane composition as measured by binding to the surface. For flow cytometry, see Ormerod, M .; G. FIG. (1994)Flow Cytometry Oxford, New York, NY. There is a description.
The effect of PKIN on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with the sequence encoding PKIN and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding PKIN and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0258]
14 Preparation of PKIN-specific antibody
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, e.g., Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495) or PKIN substantially purified by other purification techniques can be used to perform standard Immunize rabbits with a simple protocol to produce antibodies.
Alternatively, the PKIN amino acid sequence is analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine the region of high immunogenicity, and the corresponding oligopeptide is synthesized and used to generate antibodies using methods well known to those skilled in the art. Produce. The selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).
[0259]
Usually, oligopeptides of about 15 residues in length are synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer using Fmoc chemistry (Applied Biosystems) and reacted with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). It binds to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLM complex in complete Freund's adjuvant. In order to examine the anti-peptide activity and anti-PKIN activity of the obtained antiserum, the peptide or PKIN was bound to the substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further radioactively washed. React with iodine-labeled goat anti-rabbit IgG.
[0260]
15 Purification of native PKIN using specific antibodies
Native or recombinant PKIN is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for PKIN. An immunoaffinity column is formed by covalently linking an anti-PKIN antibody to an activation chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions.
[0261]
The culture solution containing PKIN is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow PKIN to be preferentially adsorbed (for example, with a buffer having a high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that break the binding of the antibody to PKIN (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of a chaotropic salt such as urea or thiocyanate ions) to recover PKIN.
[0262]
16 Identification of molecules that interact with PKIN
PKIN or a biologically active ATRS fragment is¹²⁵Label with I Bolton Hunter reagent. (See, e.g., Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539.) Pre-arranged candidate molecules in a multiwell plate are incubated with labeled PKIN. Wash and assay all wells with labeled PKIN complex. Using the data obtained at the various PKIN concentrations, values are calculated for the quantity and affinity of PKIN bound to the candidate molecule and for association.
[0263]
Alternatively, molecules that interact with PKIN are identified in Fields, S .; And O. The analysis is performed using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the yeast two-hybrid system described in Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech).
[0264]
PKIN is also used in a PATHHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0265]
17 Demonstration of PKIN activity
Usually, the protein kinase activity is γ-labeled³²It is measured by quantifying the phosphorylation of the protein substrate by PKIN in the presence of P-ATP. PKIN is a protein substrate,³²Incubate with P-ATP and an appropriate kinase buffer. Embedded in the substrate³²P is released by electrophoresis³²Separated and incorporated from P-ATP³²P is counted by a radioisotope counter. Incorporated³²The amount of P is proportional to the activity of PKIN. Quantification of phosphorylated specific amino acid residues is performed by phosphoamidic acid analysis of hydrolyzed proteins.
[0266]
In one embodiment, protein kinase activity is measured by quantifying the amount of gamma phosphate transferred from adenosine triphosphate (ATP) to serine, threonine, or tyrosine residues in a protein substrate. The reaction was performed with a protein kinase sample containing a biotin-labeled peptide substrate and gamma.³²Occurs between P-ATP. Following the reaction, avidin in the solution was labeled with biotin³²It is added for the purpose of binding to the P peptide product. The bound sample then retains the product avidin complex and free gamma³²A centrifugal ultrafiltration process is performed using a P-ATP permeable membrane. As a residue³²The reservoir of the centrifuge unit containing the P-peptide product is then counted in a scintillation counter. This method allows for the assay of any type of protein kinase with the chosen peptide substrate and kinase reaction buffer. The assay is provided in kit form (ASUA, Affinity Ultrafiltration Separation Assay, Transbio Corporation, Baltimore MD, US Pat. No. 5,869,275). The suggested substrates and their respective enzymes are the following, histone H1 (Sigma) and p34^cdc2Kinases, annexin I, angiotensin (sigma) and EGF receptor kinases, annexin II and src kinases, ERK1 and ERK2 substrates and MEK, myelin basic protein and ERK (Pearson, JD et al., (1991) Methods Enzymol). 200: 62-81).
In another embodiment, the protein activity of PKIN is PKIN, 50 μl of kinase buffer, 1 μg of substrate such as myelin basic protein (MBP) or synthetic peptide substrate, 1 mM DTT, 10 μg of ATP, and 0.5 μCi of [Γ-³²In assays containing [P] ATPin in vitroIndicated by The reaction is incubated at 30 ° C. for 30 minutes and stopped by pipetting on P81 paper. Not incorporated [γ-³²[P] ATP is removed by washing and incorporated radioactivity is measured using a radioactive scintillation counter. Alternatively, the reaction is stopped by heating to 100 ° C. in the presence of SDS loading buffer and visualized by autoradiography on a 12% SDS polyacrylamide gel. The incorporated radioactivity may be modified for reactions performed in the absence of PKIN, or in the presence of inactive kinase K38A.
[0267]
In yet another example, adenylate kinase or guanylate kinase was gamma labeled using a gamma radioisotope counter.³²Incorporation of p-ATP into ADP or GDP can be measured. The enzyme in the kinase buffer contains the appropriate nucleotide monophosphate matrix (AMP or GMP) and a phosphate donor.³²Incubate with p-labeled ATP. The reaction is incubated at 37 degrees Celsius and terminated by the addition of trichloroacetic acid. The acid extract is neutralized and subjected to gel electrophoresis to separate the monophosphate, diphosphate, and triphosphate nucleotide fractions. The diphosphate nucleotide fraction is removed and counted. The recovered radioactivity is proportional to the activity of the enzyme.
[0268]
In yet another example, other assays for PKIN include scintillation proximity assays (SPA), scintillation plate technology, and filter binding assays. Useful substrates include recombinant proteins labeled with glutathione transferase, and include synthetic peptide substrates labeled with biotin. Inhibitors of PKIN activity, such as small organic molecules, proteins, and peptides, are identified in such assays.
[0269]
18 Enhancement / suppression of protein kinase activity
An agonist or antagonist of PKIN activation or suppression isExample 17The assay may be tested using the assay described in. Agonists cause an increase in PKIN activity and antagonists cause a decrease in PKIN activity.
[0270]
Those skilled in the art may make various modifications to the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[0271]
(Brief description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0272]
Table 2 shows the GenBank identification numbers and annotations of the closest GenBank homolog to the polypeptide of the invention. The probability score that each polypeptide matches its GenBank homolog is also shown.
[0273]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the present invention, including predicted motifs and domains, along with methods, algorithms and searchable databases for use in analyzing polypeptides.
[0274]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to construct the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequence.
[0275]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotide of the present invention.
[0276]
Table 6 is a supplementary table explaining tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0277]
Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references, and threshold parameters.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[Table 11]

[Table 12]

[Table 13]

[Table 14]

[Table 15]

[Table 16]

[Table 17]

[Table 18]

[Table 19]

[Table 20]

[Table 21]

[Table 22]

[Table 23]

[Table 24]

[Table 25]

[Table 26]

[Table 27]

[Table 28]

[Table 29]

[Table 30]

[Table 31]

[Table 32]

[Table 33]

[Table 34]

[Table 35]

[Table 36]

[Table 37]

[Table 38]

[Table 39]

[Table 40]

Claims (96)

A substantially isolated polypeptide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26 (SEQ ID NOs: 1-26); and (b) at least 90 amino acid sequences selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26 (d) SEQ ID NO: Immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having 1-26 2. The isolated polypeptide of claim 1, selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. 5. The isolated polynucleotide of claim 4, selected from the group having SEQ ID NOs: 27-52. A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6. A genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide according to claim 6. A method for producing the polypeptide according to claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Process
(B) recovering the polypeptide thus expressed, wherein the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide according to claim 1. A method comprising: An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A substantially isolated polynucleotide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 27-52 (b) at least 90% identical to a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 27-52 Polynucleotides (e) (a) to (d) complementary to the polynucleotides (d) and (b) complementary to the polynucleotides of the polynucleotides (c) and (a) having such natural polynucleotide sequences. ) RNA equivalents An isolated polynucleotide comprising at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 11. A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) hybridizing the sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample;
(B) detecting the presence / absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex, if present, wherein the hybridization between the probe and the target polynucleotide or fragment is high. A method wherein the probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed. 14. The method of claim 13, wherein said probe comprises at least 60 contiguous nucleotides. A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) a method comprising detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof, if present. A component comprising an effective amount of the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 17. The component of claim 16, wherein said polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. 17. A method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional PKIN, comprising administering to a patient in need of such treatment the composition of claim 16. A method for screening a compound for confirming the efficacy of the polypeptide according to claim 1 as an agonist,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting agonist activity in the sample. A component comprising an agonist compound identified by the method of claim 19 and a pharmaceutically acceptable excipient. 21. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional PKIN, comprising administering to a patient in need of such treatment the composition of claim 20. A method for screening a compound for confirming its efficacy as an antagonist of the polypeptide according to claim 1, comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample. A component comprising an antagonist compound identified by the method of claim 22 and a pharmaceutically acceptable excipient. 24. A method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional PKIN, comprising administering to a patient in need of such treatment the composition of claim 23. A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under appropriate conditions;
(B) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under conditions permitting the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound. A method according to claim 1, wherein the change in the activity of the polypeptide according to claim 1 in the presence of is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1. A method for screening a compound to confirm the effectiveness of mutant expression of a target polynucleotide having the sequence according to claim 5,
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting the mutant expression of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of said target polynucleotide in the presence of said compound in a variable amount and in the absence of said compound. A method for calculating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) hybridizing the treated nucleic acid of the biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 11, wherein the hybridization comprises the hybridization of the probe and the biological sample. The method is carried out under conditions under which a specific hybridization complex is formed with the target polynucleotide, wherein the target polynucleotide is a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 11 or a fragment thereof. Said steps;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of the hybridization complex in the treated biological sample with the amount of the hybridization complex in an untreated biological sample. A method wherein the difference in the amount of the hybridization complex in the isolated biological sample is indicative of the toxicity of the test compound. A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of PKIN in a biological sample, comprising:
(A) binding the biological sample to the antibody of claim 10 under conditions suitable for the antibody to bind to the polypeptide and form a complex between the antibody and the polypeptide. When,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. The antibody,
The antibody according to claim 10, which is any one of (a) a chimeric antibody, (b) a single-chain antibody, (c) a Fab fragment, (d) an F (ab ') ₂ fragment, and (e) a humanized antibody. A compound comprising the antibody of claim 10 and an acceptable excipient. 32. A method for diagnosing a condition or disease associated with PKIN expression in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the compound of claim 31. 32. The compound of claim 31, wherein said antibody is labeled. A method for diagnosing a condition or disease associated with PKIN expression in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of the compound of claim 33. A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26 or an immunogenic fragment thereof under conditions for inducing an antibody response;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody for a polypeptide, thereby identifying a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26. A method comprising: An antibody produced by the method of claim 35. A compound comprising the antibody of claim 36 and a suitable carrier. A method for producing a monoclonal antibody using an antibody having the specificity of the antibody according to claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26 or an immunogenic fragment thereof under conditions for inducing an antibody response;
(B) isolating antibody-producing cells from the animal;
(C) forming a hybridoma cell producing a monoclonal antibody by fusing the antibody-producing cell with an immortalized cell;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the cultured monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26. A monoclonal antibody produced by the method of claim 38. A compound comprising the antibody of claim 39 and a suitable carrier. The antibody according to claim 10, wherein the antibody is produced by screening a Fab expression library. 11. The antibody according to claim 10, wherein said antibody is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. A method for detecting a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26, comprising:
(A) incubating the antibody according to claim 10 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) detecting specific binding, said specific binding indicating that a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26 is present in the sample. And how. A method for purifying a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-26,
(A) incubating the antibody according to claim 10 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-26. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. The polypeptide of claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. The polypeptide of claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. The polypeptide of claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 28. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 29. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 30. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 31. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 32. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 33. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 34. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 35. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 37. The polynucleotide of claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 38. The polynucleotide of claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 39. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 40. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 41. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 42. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 43. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 44. The polynucleotide of claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 45. The polynucleotide of claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 46. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 47. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 48. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 49. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 50. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 51. The polynucleotide according to claim 11, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 52.