JP2005511037A

JP2005511037A - 前立腺特異抗原のペプチドアゴニストおよびその使用

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Publication number: JP2005511037A
Application number: JP2003548767A
Authority: JP
Inventors: ジェフリー、スクロム; クォン‐ヨク、ツング
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2022-11-26
Also published as: CA2468258C; WO2003047506A2; US20050054575A1; ES2337454T3; JP4364643B2; ATE454447T1; AU2002352913A1; AU2002352913B2; US7247615B2; DK1461073T3; EP1461073B1; WO2003047506A3; DE60235041D1; EP1461073A4; EP1461073A2; CA2468258A1

Abstract

本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のアゴニストエピトープを含んでなる単離されたペプチドに関する。種々の態様では、本発明は、ＰＳＡ−３細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープのアゴニストエピトープを含んでなるペプチド、およびＰＳＡ−３アゴニストエピトープを含んでなるペプチドをコードする核酸に関する。また、これらの核酸を含んでなるプローブ、プライマー、およびベクター、ならびにこれらのベクターを含んでなる宿主細胞、およびＰＳＡ−３アゴニストペプチドと結合する抗体に関する。本発明はさらに、開示された核酸または抗体を用いる診断試薬および方法に関する。本発明はまた、本発明による核酸、宿主細胞およびペプチドを含んでなる医薬組成物、ならびにこのような組成物を用いる前立腺癌の治療方法または予防方法、例えば、ペプチドを介する、細胞を介する、およびベクターを介する免疫療法に関する。

Description

１．発明の分野
本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のアゴニストエピトープを含んでなる単離されたペプチドに関する。ある態様では、本発明は、ＰＳＡ−３ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）エピトープのアゴニストエピトープを含んでなるペプチドに関する。本発明はまた、ＰＳＡ−３アゴニストエピトープを含むペプチドをコードする核酸（例えば、組換えウイルスベクター）、ならびにこれらの核酸を含んでなる宿主細胞、およびこれらのペプチドと結合する抗体に関する。また、本発明による核酸およびペプチドを含んでなる医薬組成物、ならびにこのような組成物を用いる前立腺癌の治療方法、例えばペプチドを介する、およびベクターを介する免疫療法に関する。

２．背景の説明
現行の前立腺癌の治療には、外科術、放射線照射、化学療法、および／またはホルモン療法が含まれる。これらの治療法にもかかわらず、アメリカだけでも毎年４０，０００人を超える人が前立腺癌で亡くなっている(C.C. Boring et al., 1994, CA Cancer J. Clin. 44:7-26)。前立腺癌の治療のための有望な治療法の一つとして、ワクチン療法がある。前立腺癌において発現する抗原である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、ワクチン療法の重要な標的である(K.W. Watt et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3166-3170)。ＰＳＡは正常な前立腺上皮上で発現するが、その他の正常な成人組織では、感知できるレベルでは発現しない。しかし、ＰＳＡは免疫寛容を生じさせる「自己抗原」である。

ＰＳＡ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶ−ＰＳＡ）を免疫原として用いる２種類のワクチンの臨床試験が実施されている。これらの研究により、ワクチン接種した患者において抗ＰＳＡ抗体応答(M.G. Sanda et al., 1999, Urology 53:260-266)およびＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答(J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638)の双方が誘発され得ることが証明されている。一方の試験では、ｒＶ−ＰＳＡのワクチン接種後に、７名の前立腺癌患者のうちの５名において１０−ｍｅｒＰＳＡペプチドに対するＴ細胞応答が誘発された。これらの結果は、患者のＰＢＭＣを、ペプチドパルスしたＡＰＣ（抗原提示細胞）とともに一晩インキュベートするＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて得られたものである。Ｔ細胞のin vitroペプチド刺激サイクルが延びたことによる人為的影響を避けるため、短いインキュベート期間が用いられた(J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638)。特に、ｒＶ−ＰＳＡを接種する前にＰＢＭＣを用いた場合には、ＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答は認められなかった。

ｒＶ−ＰＳＡを接種した患者における免疫応答のモニタリングに用いたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２結合１０−ｍｅｒペプチドであり、ＰＳＡ−３と呼ばれる（ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ；配列番号１；P. Correale et al., 1997, J. Natl. Cancer Inst. 19:293-300; P. Correale et al., 1998, J. Immunol. 161:3186-3194）。このＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを用いてＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子について陽性の患者をモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子が北アメリカの人々の中で最も一般的なＨＬＡ対立遺伝子であり、白色人種集団の約５０％で発現することから、これを有する患者をモニタリング用に選択した(J. Lee, 1990, "The HLA system: a new approach" Proceedings Of The First Red Cross International Histocompatibility Workshop SpringerVerlag, New York, p. 154)。

また、これまでの研究により、ＰＳＡ−３エピトープが腫瘍細胞によって自然にプロセッシングされ、前立腺癌細胞表面にあるＭＨＣ−クラスＩＡ２分子と結合することも証明されている。この結合によって、前立腺の細胞はＭＨＣを制限した方法での特定のＴ細胞による溶解の影響を受けやすくなった(P. Correale et al., 1998, J. Immunol. 161:3186-3194)。さらに、先の研究では、コンピュータ・アルゴリズムおよびＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２Ａ２細胞系に対するペプチド結合実験の双方を用いて、ＰＳＡ分子のアミノ酸配列が分析されている(K.S. Anderson et al., 1993, J. Immunol. 151:3407-3419)。また、複数の研究により、種々のＰＳＡペプチドがin vitroでＣＴＬ系を生成し得ることも分析された。この分析により、ＰＳＡ−３ペプチドがこれらの特性に最適であることが証明された。

次に、ＰＳＡ−３ペプチドをＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いて、ワクチン接種患者における免疫応答がモニタリングされた(J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638; P. Arlen et al., 2000, Cancer Immuno. Immunother. 49:517-529)。これらの研究結果により、ｒＶ−ＰＳＡを接種した結果としてＥＬＩＳＰＯＴアッセイで観察された前駆体頻度の増加がそれほど大きくない（すなわち、２倍〜４倍）ことが示された（J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638)。よって、当技術分野ではＰＳＡの免疫原性を高めるための組成物および方法が必要とされている。

従って、本発明は、ＰＳＡ免疫原性を向上させるための組成物および方法、ならびにこれらの組成物および方法を用いる治療を開示するものである。本発明によれば、ＨＬＡ分子と相互作用するアミノ酸残基を修飾することにより、ＰＳＡペプチドの免疫原性が向上する。従来の研究では、ペプチドのアンカー残基内のアミノ酸修飾の結果としてＭＨＣとの結合の増強およびＴ細胞活性化の増強が起こり得ることが示されているが、一方で、その他のアミノ酸修飾はＴ細胞の活性化に効果を示さないか、または拮抗する働きをすると考えられる(H.M. Grey et al., 1995, Cancer Surv. 22:37-49; M.T. De Magistris et al., 1992, Cell 68:625-632; S.C. Jameson et al., 1995, Immunity 2:1-11; S. Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57:4570-4577)。ＨＬＡ−アンカー残基の修飾によるＴ細胞活性化の増強は、いくつかのヒト黒色腫関連抗原について実証されている(D. Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160:1750-1758, 1998; Y. Kawakami, Y., Eliyahu et al., 1995, J. Immunol. 154:3961-3968)が、大部分の固形腫瘍、白血病、またはリンパ腫に関連した抗原については実証されていない。

本明細書において後述する本発明にかかる実験では、ＰＳＡ−３Ａと呼ばれる、ＰＳＡ−３ＣＴＬエピトープのアゴニストのデザインおよび分析について説明する。これらの実験によれば、天然型ＰＳＡ−３エピトープと比較して、ＰＳＡ−３ＡエピトープがＭＨＣ−クラスＩＡ２対立遺伝子との結合の増強を示し、結果としてペプチドＭＨＣ複合体の安定性を向上させることが示されている。本明細書に示されるように、ＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３Ａペプチドのいずれかを用いて生成したＴ細胞系は、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスした標的よりもＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスした標的を高レベルで溶解する。これは、ペプチドおよびエフェクター双方の標的細胞に対する濃度比率を滴定したときに観察された。

さらに、本発明にかかる実験によれば、ＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスした樹状細胞（ＤＣ）で刺激したＴ細胞が、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスしたＤＣよりも高レベルのＩＦＮ−γを産生したことが示されている。しかし、ＰＳＡ−３で刺激したものと比較して、ＰＳＡ−３Ａアゴニストで刺激したＴ細胞におけるアポトーシスは１５のままで、その増加は認められなかった。特に、ＰＳＡ−３Ａアゴニストを用いて生成したヒトＴ細胞系は、ＭＨＣ−Ａ２を制限した様式で天然型ＰＳＡを発現するヒト前立腺癌細胞を溶解する能力を有していた。

本発明によれば、ＰＳＡ−３Ａエピトープを構成する単一のアミノ酸変化を有するか、またはこれを有さない完全ＰＳＡ導入遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスが構築されている。完全ＰＳＡ遺伝子内のアゴニストアミノ酸変化を含む組換えベクターに感染したＤＣ（ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａと呼ぶ）は、ｒＶ−ＰＳＡベクターよりも、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増強に有効であった。さらに、ＰＳＡ−３Ａアゴニストは、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウス(A. Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med. 173:1007-1015; V.H. Engelhard et al., 1991, J. Immunol. 6:1226-1232により報告された系統）を用いるin vivoモデルにおいて、ＰＳＡ−３ペプチドと比較して、高レベルのＴ細胞活性化を誘導することが示された。従って、本発明によるＰＳＡ−３Ａアゴニストエピトープは、ペプチドを介する前立腺癌の免疫療法プロトコール、およびベクターを介する前立腺癌の免疫療法プロトコールの双方において有用である。

発明の概要

本発明によれば、単離されたＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、ならびにこれらのペプチドの１以上を含んでなるポリペプチド（例えば、ＰＳＡポリペプチド）、およびその断片および変異体が提供される。また、これらのペプチドおよびポリペプチドの製造方法も提供される。

また、本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、ポリペプチド（例えば、ＰＳＡポリペプチド）、またはその断片もしくは変異体をコードする単離された核酸（例えば、配列番号２０〜配列番号２２）が提供される。また、本発明によれば、これらのヌクレオチド配列を含んでなるプローブ、プライマーおよびベクター、ならびにこれらのベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。また、これらの核酸の製造方法、ならびに本発明によるプローブ、プライマー、ベクターおよび宿主細胞の製造方法も提供される。

また、本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド（例えば、ＰＳＡポリペプチド）、またはその変異体もしくは断片と結合する抗体および抗体フラグメントが提供される。特に、本発明によれば、本明細書に開示されるＰＳＡ−３アゴニストペプチドおよびポリペプチドと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに抗体フラグメントが提供される。また、本発明によれば、これらの抗体および抗体フラグメントの製造方法も提供される。

また、本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドに対する免疫反応性をさらに増強する薬剤として使用可能な試験薬剤を同定する方法が提供される。このような薬剤は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドのミメティクスとして作用するものであっても、あるいはペプチド−ＨＬＡ複合体の形成または安定性を増強するものであってもよい。

また、本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体と結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる診断用試薬が提供される。さらに、ＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチドを含んでなる診断用試薬も提供される。また、これらの試薬を用いて、ベクターに基づく、細胞に基づく、および／またはペプチドに基づく本発明による免疫療法をモニタリングする方法も提供される。

また、本発明によれば、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド、ＰＳＡ−３アゴニスト改変ベクター、またはＰＳＡ−３アゴニスト改変宿主細胞を含んでなる医薬組成物が提供される。さらに、本発明によれば、前立腺癌の治療のためのこれらの医薬組成物の投与方法が提供される。このような治療としては、ベクターを介した、細胞を介した、およびペプチドを介した免疫療法、ならびにこれらの組合せが挙げられる。本発明による治療は、単独で用いても、また従来の癌治療、例えば、外科術、放射線療法、および／または化学療法と組み合わせてもよい。

本発明のさらなる目的および利点は、本明細書において後述する詳細な説明および実施例から明らかとなる。

好ましい実施形態の詳細な説明

「配列番号３〜配列番号５」などの用語の使用は、便宜上、各々個別の配列番号を個別に示すものであって、配列を集合体として示すものではない。本発明は、それぞれの配列を個々に包含し、さらには、そのいずれかの組合せをも包含する。

本明細書において「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのプリンおよびピリミジン含有ポリマーをいう。このようなものとしては、一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基とアミノ酸主鎖との結合によって形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が挙げられる。これにはまた、修飾された塩基を含む核酸も含まれる。ポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドとしては、天然に存在する種、または天然に存在するサブユニットもしくはその近縁ホモログから形成された合成種が挙げられる。この用語はまた、ポリヌクレオチドと同様に機能する部分も指すが、天然に存在しない部分も含む。よって、ポリヌクレオチドは、改変された糖部分または改変された糖間の結合を有するものであってもよい。これらの例としては、当技術分野で公知のホスホロチオエートおよびその他の硫黄含有種がある。

「コード配列」または「タンパク質コード配列」とは、ｍＲＮＡへ転写され得る、および／またはポリペプチドへ翻訳され得るポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、一般に、５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳停止コドンによって決まる。

本明細書において核酸配列の「相補物」または「相補配列」とは、オリジナル配列とのワトソン−クリック塩基対形成に関与するアンチセンス配列をいう。

「プローブ」または「プライマー」とは、そのプローブまたはプライマー中の少なくとも一つの配列と標的領域中のある配列との相補性により、標的領域中の配列とハイブリッド構造を形成する核酸またはオリゴヌクレオチドをいう。

本明細書において「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を複製することのできる核酸分子をいう。ベクターは、例えば、プラスミド、組換えウイルスまたはトランスポゾンであってよい。

「宿主」には、原核生物および真核生物が含まれる。この用語には、複製可能なベクターのレシピエントである生物体または細胞が含まれる。

本明細書において「単離された」とは、天然においてそれが会合している他の成分から少なくとも６０％遊離している、好ましくは７５％遊離している、そして最も好ましくは９０％遊離している核酸またはアミノ酸配列をいう。

本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは同義である。「ペプチド」とは、ポリペプチドの断片または部分と定義づけられ、好ましくは完全なポリペプチド配列としての少なくとも一つの機能活性（例えば、結合活性または抗原活性）を有する断片または部分をいう。「アミノ酸配列」は、ペプチドまたはポリペプチドに相当するものであってよい。

「抗原性」とは、検出し得る抗原−抗体複合体を形成する上で十分に高い親和性でその特異的抗体または抗体フラグメントに結合する分子（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）の能力をいう。

本明細書において「サンプル」とは、例えば個体から単離した組織または液体（限定されるものではないが、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙、唾液、乳汁、膿汁、ならびに組織滲出物および分泌物を含む）などの生物学的サンプル、またはin vitro細胞培養構成物から単離した組織または液体、ならびに、例えば、実験室での操作によって得られたサンプルをいう。

上述の用語その他の概要は当技術分野で公知である。例えば、Roitt et al., 1989, Immunology, 2^nd Edition, C.V. Mosby Company, New York; Male et al.,1991, Advanced Immunology, 2^nd Edition, Grower Medical Publishing, New Yorkを参照されたい。

核酸
本発明は、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号２０〜配列番号２２）を含んでなる単離された核酸に関する。このような核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、１５、１８、２１、２４、３０またはそれ以上の連続するヌクレオチド、またはその相補配列を含んでなるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡ）を含んでもよい。近縁の核酸変異体も本発明の一部に含まれ、さらには、後に詳述するように、１以上の置換、欠失、または付加を含むＰＳＡ−３アゴニストペプチドをコードする組換え核酸も本発明の一部に含まれる。変異型配列を含んでなる核酸は所望の機能（例えば、発現など）を維持していることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドをコードする核酸配列の少なくとも２４の連続ヌクレオチドに関するものとされる。

本発明によれば、ポリヌクレオチドのバリエーションは、少なくとも一つのヌクレオチドの欠失、転位（transition）および転換（transversion）などの置換、挿入、または改変（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ類似体による）からなる群から選択される。バリエーションは、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置に生じていてもよいし、あるいは、対照配列中のヌクレオチドの中に個々に点在するか、または対照配列内の１以上の連続する群として点在する、それら末端位置の間のいかなる位置に生じていてもよい。ＰＳＡ−３アゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のバリエーションは、コード配列中に、ナンセンス、ミスセンス、またはフレームシフト変異を作り出し、それによりコードされるペプチドを変更し得る。しかし、バリエーションはコード配列中にサイレント変異を作りだし、コードされるペプチドを変化させずにおくこともできる。

コード配列中のサイレント変異は遺伝コードの縮重（すなわち、重複性）に起因するものであり、これにより、１以上のコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る。特に、アゴニストペプチドＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）に関しては、バリンはＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、またはＧＴＧによってコード可能であり、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコード可能であり、セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコード可能であり、アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣによってコード可能であり、アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣによってコード可能であり、システインはＴＧＴまたはＴＧＣによってコード可能であり、アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコード可能であり、グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧによってコード可能であり、チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣによってコード可能であり、イソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡによってコード可能である。標準の遺伝コードを示した表は種々の情報源に見出すことができる（例えば、L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3^rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NY)。

ＤＮＡまたはＲＮＡなどの変異核酸は、例えば非相補配列を有する核酸がハイブリダイズしないように選択される高ストリンジェンシー条件下または中ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって検出および単離することができる。ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェンシー条件」とは、特定の核酸の別の核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする温度およびバッファー濃度の条件を指す技術用語であり、ここで、第一の核酸は第二の核酸と完全に相補的であってもよく、あるいは、第一および第二の核酸は、完全よりは劣るものの、ある程度の相補性を共有するものであってもよい。

例えば、特定の高ストリンジェンシー条件を用いて、完全に相補的な核酸と相補性の低いものとを区別することができる。核酸ハイブリダイゼーションの高、中、および低ストリンジェンシー条件は、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とするF.M. Ausubel et al. (eds), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Inc., New York, NYに説明されている。特に、２．１０．１〜２．１０．１６頁（特に２．１０．８〜２．１０．１１頁）および６．３．１〜６．３．６頁を参照されたい。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する厳密な条件は、イオン強度、温度およびホルムアミドなどの脱安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、および他の非同一配列内にあるその配列サブセットの出現頻度などの要因によって異なる。このように、高または中ストリンジェンシー条件は経験的に決定できる。

高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、一般的には、６５〜６８℃で０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにて実施される。高ストリンジェンシー条件は、約９５〜１００％の配列同一性を有する核酸分子のハイブリダイゼーションを可能にする。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、一般的には、５０〜６５℃で１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにて実施される。中ストリンジェンシー条件は、少なくとも８０〜９５％のヌクレオチド配列同一性を有する配列のハイブリダイゼーションを可能にする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、一般的には、４０〜５０℃で６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにて実施される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、少なくとも５０〜８０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションの検出を可能にする。高、中、および低ストリンジェンシー条件の例は、Sambrook et al., 1989に見出すことができる。条件の例は、M.H. Krause and S.A. Aaronson, 1991, Methods in Enzymology, 200:546556; Ausubel et al., 1995にも記載されている。低、中、および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当業者に周知であり、当業者が通常用いる種々の成分、バッファー、および温度を用いて変更し得ると考えられる。

本発明による核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、またはその組合せをはじめとする種々の起源に由来するものであってよい。配列は、いくつかの方法のうちのいずれによって取得してもよい。例えば、鋳型としてＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて本発明による核酸を作出することができる。ＰＣＲに用いられるプライマーは、本明細書に提供される配列情報を用いて合成することができ、さらに、所望により、組換え発現のための所定のベクターへの組み込みを容易にするために、適当な新たな制限部位を導入するようにデザインすることもできる。

本明細書に記載の核酸は、細胞、組織、または生物体への導入（例えば、形質転換、トランスフェクション、または組み込み）を通じてタンパク質またはペプチドを産生するための本発明による方法において使用することができる。ある実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドのコード配列の全てもしくは一部を含むＤＮＡまたはその断片が、好適な宿主細胞内でコードされたポリペプチドまたはペプチドを発現させるためのベクターへ組み込まれる。コードされたポリペプチドまたはペプチドは、抗原活性または結合活性などの正常な活性を有することが好ましい。

また、本発明による核酸については、例えば、ＰＳＡ−３Ａベクターを含む宿主細胞の分析、またはＰＳＡ−３ＡベクターもしくはＰＳＡ−３Ａで改変された宿主細胞で治療を受けている患者のモニタリングのためのプライマーおよびプローブとしての用途も見出される。例として、プローブは核酸ハイブリダイゼーション実験に用いることができ、一方で、プライマーはＰＣＲに基づく実験に用いることができる。本発明によるプローブはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明によるプローブおよびプライマーは、ＰＳＡ−３アゴニスト核酸（例えば、配列番号２０〜配列番号２２）のヌクレオチド配列の全てもしくは一部またはその相補配列を含むものとすることができ、プロモーター、エンハンサーエレメント、およびさらなるＰＳＡコード配列を含んでいてもよい。

ウイルスおよび非ウイルスベクター
種々の実施形態において、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによってコードされてよい。ポリオーマ、すなわちＳＶ４０(Madzak et al.,1992, J. Gen. Virol, 73:15331536)、アデノウイルス(Berkner, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berkner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256)、ワクシニアウイルス(Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499)、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; ON et al., 1990, Gene, 89:279-282)、ＨＳＶおよびＥＢＶなどのヘルペスウイルス(Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199)、シンドビスウイルス(H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167；米国特許第５，０９１，３０９号明細書および同第５，２２１７，８７９号明細書)、アルファウイルス(S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377)、ならびに鳥類レトロウイルス(Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplous et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397)、マウスレトロウイルス(Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24: Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al.,1985, J. Virol., 54:401-407)およびヒト起源のレトロウイルス(Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731-2739)をはじめとする多数のウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルカ核多角体病ウイルス，ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当技術分野で公知であり、販売業者（例えば、PharMingen, San Diego, CA; Protein Sciences Corp., Meriden, CT; Stratagene, La Jolla, CA)から入手できる。多くのヒト遺伝子治療プロトコールは、機能不全型マウスレトロウイルスに基づいたものである。

さらに、リン酸カルシウム共沈法(Grahamet al., 1973, Virology, 52:456-467; Pellicer et al., 1980, Science, 209:1414-1422)などの化学的技法、機械的技術、例えばマイクロインジェクション法(Anderson et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403; Gordon et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7380-7384; Brinster et al., 1981, Cell 27:223-231; Constantini et al., 1981, Nature, 294-92-94)、リポソームを介する膜融合媒介導入法(Leeらに対する米国特許第５，９０８，７７７号； Felgner et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417;Wang et al., 1989, Biochemistry, 28:9508-9514; Kaneda et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:12126-12129; Stewart et al., 1992, Hum. Gene Ther., 3:267-275; Nabel et al., 1990, Science, 249:1285-1288; Lim et al., 1992, Circulation, 83:2007-2011)、ならびにＤＮＡの直接取り込みおよび受容体を介するＤＮＡ導入(Wolff et al., 1990, Science, 247:14651468; Wu et al., 1991, BioTechniques, 11:474-485; Zenke et al., 1990,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:3655-3659; Wu et al., 1989,J. Biol. Chem., 264:16985-16987; Wolff et al., 1991, BioTechniques, 11:474-485; Wagner et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88:4255-4259; Cotten et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4033-4037; Curiel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850-8854; Curiel et al., 1991, Hum. Gene Ther. 3:147154)をはじめとする十分に確立された方法で非ウイルスベクターを宿主または宿主細胞へ導入することができる。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡウイルスの作製のための基本技術は当業者に公知である。このような技術としては、例えば、ドナープラスミド中の前記ＤＮＡ配列に隣接するウイルスＤＮＡ配列と親ウイルス中に存在する同種配列との間の相同組換え(Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419)が挙げられる。特に、ポックスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターが遺伝子送達に使用できる。このベクターは、例えば当技術分野で公知の工程、例えば、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とする、米国特許第５，０９３，２５８号明細書に記載の鶏痘ウイルスの合成組換えの作出方法と同様の工程によって構築することができる。その他の技術としては、天然に存在する、または人工的に親ウイルスベクターへ挿入した特有の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、異種ＤＮＡを挿入する方法が挙げられる。

本発明の実施に有用なポックスウイルスとしては、オルソポックス、スイポックス、アヴィポックス、およびカプリポックスウイルスが挙げられる。オルソポックスとしては、ワクシニア、エクトロメリア、およびアライグマポックスが挙げられる。好ましいオルソポックスはワクシニアである。アヴィポックスとしては、鶏痘、カナリア痘および鳩痘が挙げられる。好ましいアヴィポックスは鶏痘である。カプリポックスとしては、ヤギ痘およびヒツジ痘が挙げられる。好ましいスイポックスは豚痘である。ＰＳＡ発現のためのポックスウイルスベクターの例は、例えば、Schlom et al.に対する米国特許第６，１６５，４６０号に記載されている。使用可能なその他のウイルスベクターとしては、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどのその他のＤＮＡウイルス、ならびにレトロウイルスおよびポリオなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。場合によって、ワクシニアウイルスベクターが強い抗体応答を誘発する可能性がある。よって、ワクシニアベクターで何回も追加免疫することが可能であるが、その反復使用はある場合には好ましくない。しかし、この感受性の問題は、異なる属由来のポックスを追加免疫に用いることによって最小限にとどめることができる。第一または初回のポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスである場合、第二またはその後のポックスウイルスベクターは、免疫原性上ワクシニアとは異なるスイポックス、アヴィポックス、カプリポックスまたはオルソポックスなどの異なる属由来のポックスから選択されることが好ましい。

一般に、ＤＮＡドナーベクターは次の要素を含む：（ｉ）原核生物の複製起点（これにより、ベクターは原核生物宿主で増幅し得る）、（ii）ベクターを含む原核生物宿主細胞の選択を可能にするマーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）、（iii）配列の発現を指令することのできる転写プロモーターに隣接して位置する、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドをコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列、および（iv）要素（iii）の構築物に隣接する、外来遺伝子を挿入する親ウイルスゲノム領域に相同なＤＮＡ配列。複数の外来遺伝子をポックスウイルスへ導入するためのドナープラスミドを構築する方法は、引用することによりその技術を本明細書の一部とするＷＯ９１／１９８０３に記載されている。

一般に、転写プロモーターを含む断片および外来ＤＮＡ配列が挿入される親ウイルスゲノムの領域に相同な配列を含む断片をはじめとする、ドナーベクターの構築のためのＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡまたはクローンＤＮＡ断片から得ることができる。ドナープラスミドは、一価、二価、または多価であり得る（すなわち、１以上の挿入外来ＤＮＡ配列を含み得る）。ドナーベクターは、挿入された外来ＤＮＡを含む組換えウイルスの同定を可能にするマーカーをコードするさらなる遺伝子を含むことが好ましい。数種類のマーカー遺伝子を用いて組換えウイルスの同定および単離を可能にすることができる。これらは抗生物質耐性または化学薬品耐性をコードする遺伝子（例えば、Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62:1046; Falkner and Moss, 1988, J. Virol. 62:1849; Franke et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1918参照)、ならびに比色アッセイにより組換えウイルスのプラークの同定を可能にする大腸菌(E.coli) ｌａｃＺ遺伝子などの遺伝子(Panicali et al., 1986, Gene 47:193-199）を含む。

確立された方法によれば、ウイルスに挿入するＤＮＡ遺伝子配列を、ＤＮＡが挿入されるポックスウイルスの挿入部位のものなど、ＤＮＡのあるセクションに相同なＤＮＡが挿入されたドナープラスミド、例えば、大腸菌プラスミド構築物へ配置することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は個別にプロモーターと連結される。このプロモーターと遺伝子の連結は、所望の挿入領域であるポックスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡがその両端に隣接するように、プラスミド構築物中に配置する。親ポックスウイルスベクターとともに、ポックスプロモーターが用いられる。次いで、得られたプラスミド構築物を大腸菌内での増殖により増幅させて単離する。次に、挿入するＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドを、細胞培養物、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞へ、親ウイルス、例えば、ポックスウイルスとともにトランスフェクトする。プラスミド中の相同なポックスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の個々の組換えの結果、ウイルスの生存能に影響しない部位におけるそのゲノム内のプロモーター−遺伝子構築物の存在によって改変された組換えポックスウイルスが得られる。

上述のように、ＤＮＡ配列を、得られる組換えウイルスのウイルス生存能に影響しないウイルスの領域（挿入領域）へ挿入する。当業者であれば、例えば、組換え体のウイルス生存能に重大な影響を与えずに組換え体形成が可能な領域についてウイルスＤＮＡのセグメントをランダムに試験することによって、容易にウイルス中のこのような領域を同定することができる。容易に使用でき、多くのウイルスに存在する一つの領域として、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子がある。このＴＫ遺伝子は、レポリポックスウイルス(Upton et al., 1986, J. Virology 60:920)；ショープ線維腫ウイルス；カプリポックスウイルス (Gershon et al., 1989, J. Gen. Virol.70:525)Ｋｅｎｙａｓｈｅｅｐ−１；オルソポックスウイルス (Weir et al., 1983, J. Virol. 46:530)ワクシニア(Esposito et al., 1984, Virology 135:561);サル痘および天然痘ウイルス(Hruby et al., 1983, PNAS 80:3411)ワクシニア(Kilpatrick et al., 1985, Virology 143:399)；ヤバサル腫瘍ウイルス；アヴィポックスウイルス(Binns et al., 1988, J. Gen. Virol. 69:1275)；フォウイポックス(fowipox)；(Boyle et al., 1987, Virology 156:355)；ニワトリ痘(Schnitzlein et al., 1988, J.Virological Methods 20:341)；鶏痘、ウズラ痘；昆虫痘(Lytvyn et al., 1992, J. Gen.Virol. 73:3235-3240)をはじめとする、試験された全てのポックスウイルスゲノム中に見つかっている。

ワクシニアでは、ＴＫ領域に加え、他の挿入領域として、例えば、ＨｉｎｄIII Ｍ断片が挙げられる。鶏痘では、ＴＫ領域に加え、他の挿入領域として、例えば、ＢａｍＨＩＪ断片(Jenkins et al., 1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998)、欧州特許出願番号第０３０８２２０Ａ１号公報に記載のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII断片、ＢａｍＨＩ断片およびＨｉｎｄIII断片が挙げられる（Calvert et al., 1993, J. Virol. 67:3069-3076; Taylor et al., 1988, Vaccine 6:497-503; Spehner et al., 1990; Boursnell et al., 1990, J. Gen. Virol. 71:621-628も参照）。

豚痘では、好ましい挿入部位としては、チミジンキナーゼ遺伝子領域が挙げられる。遺伝子が挿入領域へ挿入される要件に加えて、改変されたポックスウイルスによる挿入遺伝子の発現を成功させるには、所望の遺伝子と作動可能なように連結された、すなわち、挿入遺伝子と適切な関係にあるプロモーターの存在が必要である。プロモーターは、発現させる遺伝子から上流に位置するように配置しなければならない。プロモーターは当技術分野で周知であり、宿主および標的にしようとする細胞種に応じて容易に選択できる。ポックスウイルスでは、ワクシニア７．５Ｋ、４０Ｋなどのポックスウイルスプロモーター、またはＦＰＶＣ１Ａなどの鶏痘プロモーターを用いることが好ましい。発現レベルを高めるためにエンハンサーエレメントを併用することもできる。さらに、これも当技術分野で周知である誘導プロモーターの使用も有利な場合がある。

感染細胞におけるドナープラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、所望のエレメントを組み込んだ組換えウイルスが形成される。in vivo組換えに適切な宿主細胞は、一般に、ウイルスに感染し、プラスミドベクターによってトランスフェクト可能な真核細胞である。ポックスウイルスとともに使用するのに好適なこのような細胞の例としては、ニワトリ胚繊維芽細胞、ＨｕＴＫ１４３（ヒト）細胞、ならびにＣＶ−１およびＢＳＣ−４０（双方ともサル腎臓）細胞がある。ポックスウイルスでの細胞の感染およびプラスミドベクターを用いるこれらの細胞のトランスフェクションは、当技術分野において標準的な手法によって達成される（PanicaliおよびPaoletti、米国特許第４，６０３，１１２号明細書、Ｗ０８９／０３４２９）。

in vivo組換えの後、組換えウイルスの子孫を、いくつかの技術のうちの一つによって同定することができる。例えば、ＤＮＡドナーベクターが外来遺伝子を親ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子へ挿入するようデザインされているならば、組み込まれたＤＮＡを含むウイルスはＴＫ−であり、これを基準に選択することができる(Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415)。あるいは、上記のように、マーカーまたは指標遺伝子を目的の外来遺伝子とともにコードする遺伝子の同時組み込みを用いて組換え子孫を同定することもできる。好ましい指標遺伝子の一つとして、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子がある。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスは、酵素に対する発色基質を用いて選択することができる(Panicali et al., 1986, Gene 47:193)。一旦組換えウイルスが同定されれば、種々の周知の方法を用いて挿入ＤＮＡ断片にコードされるＰＳＡ配列（例えば、ＰＳＡ−３Ａ）の発現をアッセイすることができる。これらの方法としては、ブラックプラークアッセイ（ウイルスプラーク上で実施されるin situ酵素免疫測定法）、ウエスタンブロット分析、放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）、および酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が挙げられる。

ペプチドおよびポリペプチド
本発明のさらなる態様は、単離されたＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、およびこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）に関するものである。本発明によるペプチドおよびポリペプチドは、単離物、合成物、または組換え体とすることができる。本発明は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドおよびこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、ならびにその断片および機能的同等物を包含する。「機能的同等物」とは、アミノ酸配列が本発明によるポリペプチドまたはペプチドとは異なるが、このような違いの結果として、ポリペプチドまたはペプチドの少なくとも一つの特徴的な機能（例えば、結合または抗原活性）を果たす修飾されたタンパク質を生じるタンパク質を含むものとする。例えば、ポリペプチドまたはペプチドの機能的同等物は、そのポリペプチドまたはペプチドの機能に直接関与しないアミノ酸残基の置換、付加、欠失、または修飾（例えば、リン酸化、標識など）などのバリエーションを有するものとすることができる。

可溶性の向上、分子の活性、抗原性、または安定性の増強（例えば、ex vivoでの保存期間およびin vivoでのタンパク質加水分解耐性）などの目的のためには、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドの構造を変化させることも可能である。このような変異体は、本明細書で定義したように、ポリペプチドおよびペプチドの機能的同等物とされる。ポリペプチドおよびペプチドは、活性を保持するように修飾されるのが好ましい。活性に必須であることが分かっている残基は、必須アミノ酸を別のもの、好ましくはその存在が機能を増強、低下させるが、これを除去しない、または機能に変化をもたらさないことが分かっている類似のアミノ酸残基で置換する（保存的置換）ことによって変更することができる。さらに、結合活性またはその他の活性に必須でないアミノ酸残基を、その組み込みによって反応性を増強、低下させるか、または変化をもたらさない別のアミノ酸で置換することによって変更することができる。

ポリペプチドおよびペプチド変異体としては、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって異なる突然変異体が挙げられる。１以上の残基が修飾された修飾ポリペプチドおよびペプチド、および１以上の修飾残基を含んでなる突然変異体も含まれる。有用な修飾としては、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化(Tarr, 1986, Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Silver, Ed., Humana Press, Clifton, NJ, pp. 155-194)；アシル化（Tarr,上記）；化学結合（Mishell and Shiigi (Eds), 1980, Selected Methods in Cellular Immunology, W H Freeman, San Francisco, CA；米国特許第４，９３９，２３９号明細書）；および弱いホルマリン処理（Marsh, 1971, Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41:199-215）が挙げられる。さらに、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、または非アミノ酸類似体を置換または付加して修飾ポリペプチドを作出することもできる。さらに、本明細書に開示されるポリペプチドを、公知の方法（S. I. Wie et al., 1981, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 64(1):8499）に従い、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて修飾して、ＰＥＧと共役したタンパク質を作出することもできる。さらに、ＰＥＧをタンパク質の化学合成中に付加することができる。修飾または配列のバリエーションは、対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置、あるいは対照配列中のアミノ酸の中に個々に散在し、または対照配列の中の１以上の連続した群に散在する、末端位置の間のいずれの位置において生じてもよい。

また、ポリペプチドまたはペプチドは、直接的または間接的に、限定されるものではないが、放射性同位元素標識、蛍光標識および酵素標識などの検出可能なシグナルを提供し得る標識で修飾してもよい。蛍光標識としては、例えば、ＣｙＴＭ３、ＣｙＴＭ５、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン（例えば、ＦｌｕｏｒＸ、ＤＴＡＦ、およびＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、ＴＲＩＴＣ）、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファーイエローが挙げられる。好ましい同位元素標識としては、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、および^１８６Ｒｅが挙げられる。好ましい酵素標識としては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼ（例えば、米国特許第３，６５４，０９０号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書および同第４，０１６，０４３号明細書参照）が挙げられる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によってコンジュゲートさせることができる。酵素標識は、視覚的に検出できるか、あるいは熱量測定、分光光度、蛍光分光光度、電流滴定、またはガス定量技術によって測定できる。アビジン／ビオチン、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡＴＭ）などのその他の標識系も当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ABC kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA;NEN（登録商標） Life Science Products, Inc., Boston, MA）。

本発明によれば、ポリペプチドまたはペプチド配列は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドと同一であってよく、また、特定の整数までのアミノ酸変異を含むことができる。アミノ酸変異は、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入からなる群から選択される。よって、ポリペプチドおよびペプチド変異体は、置換アミノ酸が類似の構造または化学特性を持つような、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換など、保存的変異を有してもよい。まれにではあるが、変異体が非保存的変異、例えば、グリシンのトリプトファンでの置換などを有してもよい場合がある。どのアミノ酸残基が生物活性または免疫学的活性を失わずに置換、挿入、または欠失させることができるかを判定する指針は、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて決定できる。非限定的な例として、ＰＳＡ−３アゴニストアミノ酸配列中の保存的置換は次の表に従って行うことができる。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）は、１番目にＶまたはＹ；２番目にＬまたはＭ：および１０番目にＶまたはＩを含むのが好ましい。好ましい実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドは、１番目にＤ、Ｅ、またはＰ；３番目にＤまたはＥ；４番目にＲ、Ｋ、ＨまたはＡ；５番目にＰ；７番目にＲ、ＫまたはＨ；８番目にＤ、Ｅ、Ｒ、ＫまたはＨ；９番目にＲ、ＫまたはＨ；または１０番目にＬを含まない。

機能または免疫原性における実質的変化は、上記の表に示したものよりも保存性の低い置換を選択することによって作出することができる。例えば、改変領域におけるポリペプチドの構造、例えば、α−へリックス構造またはβ−シート構造、標的部位における分子の電荷または疎水性、または側鎖のかさ、に有意に影響する非保存的置換を作出することができる。一般にポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすことが予想される置換は、１）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）の、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）による置換、またはその逆の置換、２）システインまたはプロリンの、他のいずれかの残基による置換、またはその逆の置換、３）正電荷側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジル）の、負電荷残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）による置換、またはその逆の置換、あるいは４）かさの高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）の、側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）による置換、またはその逆の置換である。

配列タグ（例えば、エピトープまたはタンパク質タグ）または１以上のリシンなどのアミノ酸を、本発明によるペプチド配列へ（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）付加することができる。エピトープタグの非限定的な例としては、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ポリヒスチジン（６Ｘ−ＨＩＳ）（配列番号１６）、ＧＬＵ−ＧＬＵ、およびＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７；ＦＬＡＧ（登録商標））タグが挙げられる。タンパク質タグの非限定的な例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用できる。リシンは、ペプチドの可溶性を高めるため、またはビオチニル化を可能にするために使用できる。

また、本発明によれば、本発明によるペプチドのアプタマーが提供される。本発明の好ましい実施形態によれば、配列番号３〜配列番号５などのＰＳＡ−３アゴニストペプチドのアプタマーが提供される。本アプタマーは、タンパク質またはその他の分子と結合可能なペプチドまたは核酸分子であるか、あるいは本発明によるペプチドの活性部分の三次元構造を模倣するものである。アプタマーは、合成法、組換え法、および精製法をはじめとするいずれの公知の方法によって作製してもよい（Nature 1996 Apr 11;380(6574):548-50）。

ペプチドおよびポリペプチドの生産
分子生物学、タンパク質生化学および免疫学における多くの従来技術を用いて、本発明について用いるためのＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）を生産および単離することができる。組換えポリペプチドおよびペプチドを得るためには、当技術分野で周知であり（Sambrook et al., 1989）、本明細書で記載する方法により、完全な宿主細胞または細胞フリー翻訳系における発現のために、コード配列を好適ないずれかのベクターへクローニングすればよい。あるいは、市販の自動化された方法により、ペプチドを化学的に合成してもよい。生産の後、本発明によるポリペプチドおよびペプチド（機能的同等物を含む）は、コード配列が導入および発現された野生型もしくは突然変異細胞（例えば、ヒト細胞または細胞系）から、または異種生物体もしくは細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳類細胞）から、または細胞フリー翻訳系（例えば、小麦胚芽、ミクロソーム膜、または細菌抽出物）から単離することができる。また、これらのポリペプチドおよびペプチドは、合成化学法の後に単離することもできる。

本発明の一つの態様では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５のうちの１以上）もしくはこのペプチドを含んでなるポリペプチドまたはその変異体に関するコード配列の全部または一部を含むＤＮＡが、コードされるアミノ酸配列の好適な宿主細胞における発現のためのベクターへ導入される。これらのコードされるポリペプチド、ペプチドまたはそれらの機能的同等物は、活性（例えば、結合活性または抗原活性）を持ち得ることが好ましい。細菌、酵母および哺乳類ベクターをはじめとする多数のベクターが、種々の宿主細胞または細胞フリー系での複製および／または発現用として文献に記載されており、ベクターに基づく療法ならびに単にクローニングまたはタンパク質発現のために使用できる。

一例として、ベクター（例えば、発現ベクター）は、少なくとも一つの調節配列と作動可能なように連結された、本明細書に記載のようなＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。調節配列は当技術分野で公知であり、適当な宿主細胞において目的のタンパク質の発現を指令するように選択される。よって、調節配列という用語には、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御エレメントが含まれる（例えば、 D.V. Goeddel, 1990, Methods Enzyniol. 185:3-7参照）。エンハンサーおよびその他の発現制御配列は、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, 1983, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。ベクターの設計は、トランスフェクトする宿主細胞の選択および／または発現させるポリペプチドもしくはペプチドの種類などの要因によって異なるものと理解すべきである。

いくつかの調節エレメント（例えば、プロモーター）が単離され、種々の宿主内で異種タンパク質の転写および翻訳に効果的であることが示されている。このような調節領域、単離方法、操作方法などは当技術分野で公知である。細菌プロモーターの例としては、限定されるものではないが、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ａｒａＢＡＤ（アラビノース）オペロンプロモーター、λ由来Ｐ_１プロモーターおよびＮ遺伝子リボゾーム結合部位、ならびにｔｒｐおよびｌａｃＵＶ５プロモーターの配列に由来するハイブリッドｔａｃプロモーターが挙げられる。酵母プロモーターの例としては、限定されるものではないが、３ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、ガラクトエピメラーゼプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーターが挙げられる。哺乳類細胞に関して好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などのウイルスプロモーターが挙げられる。好ましい複製および遺伝系としては、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、λ、アデノウイルス、ＣＥＮＡＩＲＳ、２μｍＡＩＲＳなどが挙げられる。ベクターは自立的に複製するものもあるが、当技術分野で周知の方法により宿主細胞のゲノムに挿入することにより複製することもできる。

ＤＮＡ配列は、所望により、所定の宿主生物または発現系でより効率的に発現されるように最適化することができる。例えば、十分に確立された技術を用いて所定の宿主細胞または細胞フリー翻訳系において好ましいコドン使用を付与するようにコドンを変更することができる。コドン使用データは、例えば、Codon Usage Database(hftp://www. kazusa.or.jp/codon/)などの一般に利用できる情報源から入手することができる。さらに、アミノ酸配列情報をコドン選択に従ってヌクレオチド配列情報へ翻訳するコンピュータープログラム（すなわち、バックトランスレーションプログラム）が広く利用可能である。例えば、Backtranslate program from Genetics Computer Group (GCG), Accelrys, Inc., Madison, WI;およびBacktranslation Applet from Entelechon GmbH, Regensburg, Germanyを参照されたい。このように、当業者ならば、本明細書に開示されるポリペプチドおよびペプチドを用い、選択した翻訳系または宿主細胞において最適な発現レベルが得られるように核酸をデザインすることができる。

真核細胞で発現を得るためには、遺伝子発現を調節するターミネーター配列、ポリアデニル化配列およびエンハンサー配列が必要となる。また、遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましいことがある。これらの配列は当技術分野で周知である。さらに、限定されるものではないが、細菌、酵母および動物細胞をはじめとする細胞から組換え産物の分泌を促進する分泌シグナル配列および／またはプレタンパク質もしくはプロタンパク質配列などの配列を含めてもよい。このような配列は当技術分野で十分に文献に記載されている。

発現ベクターおよびクローニングベクターは、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である選択マーカーを含んでもよい。この遺伝子が存在すると、挿入配列を発現する宿主細胞のみの増殖が確保される。典型的な選択遺伝子は、１）抗生物質またはその他の有毒物質（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートなど）に対する耐性を付与するタンパク質、２）栄養要求性欠損を補足するタンパク質、または３）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードするもの（例えば、バチルスではＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）である。マーカーは、誘導性遺伝子であっても非誘導性遺伝子であってもよく、また、一般には陽性選択を可能とするものとされる。マーカーの例としては、限定されるものではないが、アンピシリン耐性マーカー（すなわち、βラクタマーゼ）、テトラサイクリン耐性マーカー、ネオマイシン／カナマイシン耐性マーカー（すなわり、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンセターゼなどが挙げられる。適切な選択マーカーの選択は、当業者が理解しているように、宿主細胞および種々の宿主に適当なマーカーによって異なる。

本発明に関して用いるために好適なベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)、ｐＥＴ(Novagen, Inc., Madison,WI)およびｐＲＥＰ(Invitrogen)プラスミドが挙げられる。ベクターは、クローニングまたは発現のための１以上の複製および遺伝系、宿主における選択のための１以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性）、および１以上の発現カセットを含むことができる。挿入するコード配列は、標準的な方法により合成できるか、天然源から単離できるか、またはハイブリッドとして調製できる。コード配列の、転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび／またはインスレーター）への、および／または他のアミノ酸をコードする配列への連結は、確立された方法を用いて行うことができる。本発明に関して用いるために好適な細胞フリー発現系としては、限定されるものではないが、ウサギ網状赤血球溶解物、小麦胚芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌(E. coli)Ｓ３０抽出物、および転写／翻訳複合系(Promega Corp. , Madison, WI)が挙げられる。これらの系は、タンパク質コード領域と適当なプロモーターエレメントを含むクローニングベクター、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ配列を付加した際に、組換えポリペプチドおよびペプチドの発現を可能とする。

好適な宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、細菌、始原細菌、昆虫、真菌（例えば、酵母）、植物、および動物細胞（例えば、哺乳類、特にヒト）が挙げられる。特に注目されるものとしては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ならびに不死化した哺乳類骨髄細胞系およびリンパ細胞系がある。哺乳類細胞の培養系での増殖方法は周知である(Jakoby and Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, NY参照)。一般に用いられる哺乳類宿主細胞系の例としては、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞系があるが、当業者ならば、例えば目的のグリコシル化パターンまたはその他の特徴のより高い発現を得るために他の細胞系を用い得ることが分かるであろう。

宿主細胞は、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化リチウム、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランリポソームを介したＤＮＡ取り込み、スフェロプラスト化、注入、マイクロインジェクション、微粒子衝撃、ファージ感染、ウイルス感染、またはその他の確立された方法をはじめとするいずれの好適な方法によって適宜形質転換、トランスフェクトまたは感染させてもよい。あるいは、本発明による核酸を含むベクターは、in vitroで転写し、得られたＲＮＡを周知の方法により、例えば注入により宿主細胞へ導入することもできる(Kubo et al., 1988, FEBS Letts. 241:119参照)。上記の核酸を導入した細胞は、このような細胞の子孫をも含むものとする。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド、またはその変異体もしくは断片をコードする核酸は、好適な宿主細胞中で複製させることにより大量に生産することができる。目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１５の連続する塩基を含んでなる合成核酸断片を、原核細胞または真核細胞へ導入してそこで複製することのできる組換え核酸構築物、例えばＤＮＡ構築物に組み込んでもよい。最もよく用いられる原核宿主は大腸菌株であるが、枯草菌またはシュードモナスなどの他の原核生物を用いてもよい。哺乳類、または酵母、糸状真菌、植物、昆虫または両生類もしくは鳥類種などのその他の真核宿主細胞も有用であり、本発明による核酸の単離に有用であり得る。本発明による方法によって生産された核酸の精製は、例えば、Sambrook et al., 1989; F.M. Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York, NYに記載されている。

また、本発明によるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、化学合成法、例えば、Beaucage et al., 1981, Tetra. Letts. 22:1859-1862に記載されているホスホルアミダイト法、またはMatteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc., 103:3185に従うトリエステル法により生産することもでき、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて製造することもできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で両鎖をアニーリングすることによるか、あるいはＤＮＡポリメラーゼを適当なプライマー配列とともに用いて相補鎖を付加することにより、化学合成した一本鎖産物から得てもよい。

本発明の他の態様では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドは、限定されるものではないが、排他的固相合成、部分的固相法、断片の縮合、従来の液相合成をはじめとする市販の自動化された方法により化学的に合成することができる。さらに、ペプチド生産の組換え法および合成法を組み合わせて半合性ペプチドを生産することもできる。本発明によるペプチドは、好ましくはMerrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; 1997に記載されているような固相ペプチド合成により製造される。ある実施形態では、αアミノ末端が保護されたアミノ酸を用いて合成を行う。易変側鎖を有する三官能性アミノ酸も、ペプチド構築の際に起こる望ましくない化学反応を避けるために好適な基で保護する。このαアミノ保護基は、アミノ末端で次の反応を起こすように選択的に除去する。αアミノ保護基を除去するための条件は、側鎖保護基を除去しないものとする。

これらのαアミノ保護基は、段階的ペプチド合成の分野で有用であることが知られているものである。これらのものとして、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ））、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が挙げられる。好ましい保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒの側鎖保護基としては、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、４−Ｂｒ−Ｃｂｚおよび２，６−ジクロロベンジルが挙げられる。Ｔｙｒの好ましい側鎖保護基は２，６−ジクロロベンジルである。Ａｓｐの側鎖保護基としては、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。Ａｓｐの好ましい側鎖保護基はシクロヘキシルである。ＴｈｒおよびＳｅｒの側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、およびＣｂｚが挙げられる。ＴｈｒおよびＳｅｒの好ましい保護基はベンジルである。Ａｒｇの側鎖保護基としては、ニトロ、Ｔｏｓ、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニル、およびＢｏｃが挙げられる。Ａｒｇの好ましい保護基はＴｏｓである。Ｌｙｓの側鎖アミノ基はＣｂｚ、２−Ｃｌ−Ｃｂｚ、Ｔｏｓ、またはＢｏｃで保護することができる。２−Ｃ１−Ｃｂｚ基がＬｙｓの好ましい保護基である。選択した側鎖保護基は、カップリング中に完全に留まっていなければならず、アミノ末端保護基の脱保護中またはカップリング条件中に除去されてはならない。また、側鎖保護基は、最終的なペプチドを変化させない反応条件を用いて合成の終了時に除去できるものでなければならない。

固相合成は、通常、αアミノ保護した（側鎖保護した）アミノ酸を好適な固相支持体に結合することにより、カルボキシ末端から行う。クロロメチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させた場合にはエステル結合が形成され、得られるペプチドはＣ末端にフリーのカルボキシル末端を持つことになる。あるいは、ベンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いる場合には、アミド結合が形成され、得られるペプチドはＣ末端にカルボキシアミド基を持つことになる。これらの樹脂は市販されており、それらの製造方法は、Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載されている。

αアミノ基および必要に応じて側鎖を保護したＣ末端アミノ酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールをはじめとする種々の活性化剤を用いてベンズヒドリルアミン樹脂へ結合させる。樹脂支持体へ結合させた後、αアミノ保護基を、０℃〜２５℃の間の温度で、ジオキサン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＨＣｌを用いて除去する。メチオニン（Ｍｅｔ）を導入して可能性のあるＳ−アルキル化を抑制した後、このＴＦＡにジメチルスルフィドを加える。αアミノ保護基を除去した後、残りの保護されたアミノ酸を必要な順序で段階的にカップリングさせて目的の配列を得る。

カップリング反応には、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサ−フルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をはじめとする種々の活性化剤を用いることができる。各保護アミノ酸は過剰量（＞２．０当量）で用い、カップリングは通常、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中、またはＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２もしくはその混合物中で行う。カップリング反応の完了度は、各段階において、例えばKaiser et al., 1970, Anal. Biochem. 34:595に記載のニンヒドリン反応によってモニタリングする。完全なカップリングが見られたら、カップリング反応を繰り返す。このようなカップリング反応は、市販の装置を用いて自動で行うことができる。

目的のペプチドが完全に構築された後、そのペプチド樹脂を、液体ＨＦなどの試薬を用いて０℃で１〜２時間切断するが、これによりペプチドが樹脂から切断され、総ての側鎖保護基が除去される。通常、液体ＨＦとともにアニソールなどのスカベンジャーを用い、切断中に生じたカチオンがペプチド内に存在するアミノ酸残基をアルキル化しないようにする。所望により、切断前にこのペプチド−樹脂を５ＴＦＡ／ジチオエタンで脱保護することができる。

固相支持体上での側鎖と側鎖の環化には、酸性アミノ酸（例えばＡｓｐ）と塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓ）の側鎖官能基の選択的切断を可能とする直交保護スキームを使用する必要がある。この目的で、Ａｓｐの側鎖のためには９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）保護基を、そしてＬｙｓの側鎖のためには９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を用いることができる。これらの場合、Ｂｏｃ保護ペプチド−樹脂の側鎖保護基はＤＭＦ中のピペリジンで選択的に除去される。固相支持体上での環化は、ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、またはＢＯＰをはじめとする種々の活性化剤を用いて行う。上記のように、環化したペプチド−樹脂上でＨＦ反応を行う。

ポリペプチドおよびペプチドの精製のための方法は当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、分取用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、および向流分配が挙げられる。目的によっては、タンパク質が精製を助けるさらなる配列（例えばエピトープまたはタンパク質）タグを含むような組換え系でポリペプチドまたはペプチドを生産することが好ましい（上記参照）。

あるアプローチでは、ポリペプチドまたはペプチドのコード配列を、対象とする配列タグを有する融合物を作り出すベクターへクローニングすることができる。好適なベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＲＳＥＴ（Invitrogen Corp., San Diego, CA)、ｐＧＥＸ(Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)、ｐＥＧＦＰ(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)、およびｐＭＡＬＴＭ(New England BioLabs (NEB), Inc., Beverly, MA)プラスミドが挙げられる。発現後、エピトープまたはタンパク質タグの付いたポリペプチドまたはペプチドを、適当な固相マトリックスでのクロマトグラフィーにより、翻訳系または宿主細胞の粗溶解液から精製することができる。場合によっては、精製後にエピトープまたはタンパク質タグを除去（すなわち、プロテアーゼ切断による）することが好ましい。他のアプローチとしては、タンパク質またはペプチドに対して作製した抗体を精製試薬として用いることができる。また、その他の精製法も利用可能である。

抗体
本発明の他の態様は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、このペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に対する抗体に関する。本発明により、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。これらの抗体は、疾患に関連する免疫原性成分で免疫化することにより、動物宿主（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の非ヒト哺乳類）において誘導することができる。また、抗体は、免疫細胞のin vitroにおける免疫化（感作）によっても誘導することができる。抗体の生産を誘導するために用いられる免疫原性成分は、細胞から単離してもよいし、化学的に合成してもよい。また、抗体は、適当な抗体コードＤＮＡを用いてプログラムされた組換え系においても生産することができる。あるいは、精製した重鎖および軽鎖の生化学的再構成によって抗体を構築してもよい。抗体には、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、および一価抗体が含まれる。また、Ｆａｂ^１およびＦａｂ（ａｂ）^２フラグメントをはじめとする抗体のＦａｂフラグメントも含まれる。

単離されたＰＳＡ−３アゴニストペプチド、このペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を免疫原として使用し、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造の標準的な技術を用いて抗体を作製することができる。全長ＰＳＡポリペプチドが使用でき、あるいはまた、本発明により、免疫原として用いるためのこれらポリペプチドの抗原ペプチド部分が提供される。本発明による抗原ペプチドは、そのペプチドに対して生じた抗体がそのペプチドまたはポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようにＰＳＡポリペプチドのエピトープを包含するよう、十分な数の、アミノ酸配列またはその変異体の連続するアミノ酸残基を含む。典型的には、エピトープを規定するには少なくとも５個の連続するアミノ酸で十分である。ある実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストエピトープは、少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むことができる。

適当な免疫原性調製物としては、例えば、１）組換え生産されたＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、２）化学的に合成されたＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、または３）（１）〜（２）の断片もしくは変異体を含むことができる。この調製物は、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含むことができる。多くのアジュバントが知られており、当業者に用いられている。アジュバントの例としては、限定されるものではないが、フロイントの不完全アジュバント、ならびにリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニンおよびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。さらなるアジュバントの例としては、ステアリルチロシン(A. Nixon-George et al., 1990, J. Immunol. 144:4798-4802; Paoletti, et al., 1997, J. Infect. Diseases 175:1237-9; Moloney et al.に対する米国特許第４，２５８，０２９号; Jennings, et al.に対する米国特許第５，６８３，６９９号)、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７，ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’− ２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリル−オキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）が挙げられる。ある特定のアジュバントは、リン酸緩衝生理食塩水中に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクワレン、２．５％プルロニックＬ１２１ポリマーおよび０．２％ポリソルベートを含んでなる(Kwak et al., 1992, New Eng. J. Med. 327:1209-1215)。さらなるアジュバントの例は、本明細書において後述する。アジュバントの有効性は、免疫原性ペプチドに対する抗体の量を測定することにより求めることができる。

免疫原は、所望により、特に小さなペプチドを用いる場合には免疫原性を高めるために担体タンパク質と結合させることができる。ペプチドとの化学的結合に通常用いられる、一般に使用される担体としては、血清アルブミン、例えばウシ、ヒツジ、ヤギまたは魚血清アルブミン、チログロブリンおよびキーホールリンペット・ヘモシアニンが挙げられる。結合させた免疫原担体は、次に、レシピエント動物（例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギ）を免疫化するために使用する。免疫化動物の抗体力価は、固定化したＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によるものなど、標準的な技術によって経時的にモニタリングすることができる。所望により、抗体分子を哺乳類から（例えば血液から）単離し、さらにＩｇＧ画分を得るためのＡタンパク質クロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製することができる。

免疫化後の適当な時点、例えば抗体力価が最高になった時に、抗体産生細胞を動物被験体から得、ハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-46; Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al., 1976, PNAS 76:2927-31;およびYeh et al., 1982, Int. J. Cancer 29:269-75参照)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72)、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、またはトリオーマ技術などの標準的な技術により、モノクローナル抗体を作製するために用いることができる。ハイブリドーマを作出する技術は周知である(一般にR.H. Kenneth, 1980, Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, NY; E.A. Lerner, 1981, Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al., 1977, Somatic Cell Genet. 3:231-36参照)。一般に不死細胞系（典型的にはミエローマ）を、上記のようにＰＳＡ−３アゴニスト免疫原（例えばペプチドまたはポリペプチド）で免疫化した哺乳類由来のリンパ球（典型的には脾細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチドに対するモノクローナル抗体を作製する目的では、リンパ球と不死化細胞系を融合させるのに用いられる多くの公知の方法のうちのいずれを適用してもよい(例えば、G. Gafter et al., 1977, Nature 266:55052; Gefter et al., 1977; Lerner, 1981; Kenneth, 1980)。さらに、当業者ならば、このような方法の多くのバリエーションがあることが分かるであろう。典型的には、この不死細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明による免疫原性調製物で免疫化したマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞系と融合させることにより作製することができる。好ましい不死細胞系としては、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（ＨＡＴ培地）に感受性のあるマウスミエローマ細胞系がある。例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇｏ−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／０−Ａｇ１など、多くのミエローマ細胞系のうちのいずれを標準的な技術に従って融合相手として用いてもよい。これらのミエローマ系はＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, Manassas, VA)から入手できる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてマウス脾細胞と融合させる。次に、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、融合していない、または生産的に融合していないミエローマ細胞を死滅させる（融合していない脾細胞は形質転換されていないので、数日後に死滅する）ＨＡＴ培地を用いて選択する。本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドと結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、対応するＰＳＡ−３アゴニストペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をスクリーニングし、それによりこれらの分子と結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗体を同定および単離することもできる。ファージディスプレーライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 279400-01;およびthe Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。抗体ディスプレーライブラリーを作製およびスクリーニングする際に用いるのに特に適切な方法および試薬の例は、例えば、A. Blume 米国特許第6,010,861号、Ladner et al. 米国特許第5,223,409号; Kang et al. 国際公開番号WO92/18619; Dower et al. 国際公開番号WO91/17271; Winter et al. 国際公開番号WO92/20791; Markland et al. 国際公開番号WO92/15679; Breitling et al. 国際公開番号WO93/01288; McCafferty et al. 国際公開番号WO92/01047; Garrard et al. 国際公開番号WO92/09690; Ladner et al. 国際公開番号WO90/02809; Fuchs et al., 1991, BiolTechnology 9:1370-1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J 12:725-734; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al., 1991, Nature 352:624-628; Gram et al., 1992, PNAS 89:3576-3580; Garrad et al., 1991, Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., 1991, Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al., 1991, PNAS 88:7978-7982;およびMcCafferty et al., 1990, Nature 348:552-55に見出すことができる。

さらに、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドに対する組換え抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。例えば、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製することができる。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製する方法の例は、例えば、Robinson et al. 国際出願番号PCT/US86/02269; Akira, et al. 欧州特許出願184,187; Taniguchi, M., 欧州特許出願171,496; Morrison et al. 欧州特許出願173,494; Neuberger et al. PCT国際公開番号WO86/01533; Cabilly et al. 米国特許第4,816,567号; Cabilly et al. 欧州特許出願125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449;およびShaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; S.L. Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Winter 米国特許第5,225,539号; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534;およびBcidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチドに対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術により、対応する分子を単離するために使用できる。例えば、抗体は、組換え生産されたＰＳＡポリペプチドまたはＰＳＡ−３アゴニストペプチドの宿主細胞からの精製に役立つ。さらに、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドと結合する抗体は、タンパク質発現のパターンまたはレベルを評価するために、対応するペプチドまたはこのペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチドを（例えば、細胞溶解液または細胞上清において）検出するために使用できる。また、このような抗体は、例えば本明細書で詳細に記載されているような所定の治療計画の有効性を決定するための臨床試験法の一部として、組織内のＰＳＡポリペプチドまたはＰＳＡ−３アゴニストペプチドレベルをモニタリングするための診断薬として使用することもできる。

薬物のスクリーニングおよびデザイン
本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）、またはその断片もしくは変異体を用いて、当技術分野で周知の方法に従い、競合的結合アッセイにおいて薬物をスクリーニングする方法が提供される。例えば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドとＨＬＡ−Ａ２分子を含んでなる複合体を用い、ペプチド−ＨＬＡ複合体を妨害、増強、またはその他の様式で変更する試験薬剤をスクリーニングする競合的薬物スクリーニングアッセイを利用することができる。ペプチド−ＨＬＡ複合体を妨害する薬剤は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドの機能を模倣する類似体（すなわち、ミメティクス）として働き得る。ペプチド−ＨＬＡ複合体の形成または安定性を増強する薬剤は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドの免疫反応性を増強することができる。

試験薬剤は多くの化学種を包含し得るが、典型的には有機分子、例えば小分子である。好ましくは、試験薬剤の分子量は５０００ダルトン未満であり、より好ましくは、試験薬剤の分子量は５０ダルトンを超え、２，５００ダルトン未満である。このような試験薬剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含んでもよく、典型的には少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも二つの官能化学基を含む。有用な試験薬剤は、上記の官能基の１以上で置換されている環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多芳香族構造を含むことが多い。また、このような試験薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸類、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せをはじめとする生体分子をも含むことができる。

試験薬剤としては、例えば、１）Ｉｇテールを有する融合ペプチドをはじめとする可溶性ペプチド、ならびにランダムペプチドライブラリー（例えば、Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86参照）およびＤ−および／またはＬ−配置アミノ酸からなるコンビナトリアル化学からの分子５ライブラリーのメンバーなどのペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分的縮重、指定ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al, 1993, Cell 72:767-778参照）、３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体、ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびエピトープ結合フラグメント）、および４）有機および無機小分子が挙げられる。

試験薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーをはじめとする多様なソースから得ることができる。合成化合物ライブラリーは、例えば、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH)、およびMicrosource (New Milford, CT)から市販されている。希少な化学ライブラリーがAldrich Chemical Company, Inc.(Milwaukee, WI)から市販されている。細菌、真菌、植物または動物抽出物を含む天然化合物ライブラリーは、例えば、Pan Laboratories (Bothell, WA)から市販されている。さらに、ランダムオリゴヌクレオチドの発現をはじめ、多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指定合成のために、多くの手段が利用可能である。

あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは、容易に作製することができる。分子ライブラリーの合成方法も容易に利用可能である（例えば、DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallop et al., 1994, J. Med.Chem. 37:1233参照)。さらに、天然化合物または合成化合物ライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾することができ（例えば、Blondelle et al., 1996, Trends in Biotech. 14:60参照）、コンビナトリアルライブラリーを作製するために用いることができる。他のアプローチでは、従前に同定されている薬理作用剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指定またはランダム化学修飾を施すことができ、これらの類似体を、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドに対する免疫反応性のさらなる増強に関してスクリーニングすることができる。

コンビナトリアルライブラリーを作製するための多くの方法が当技術分野で知られており、例えば、生物学的ライブラリーを含むもの、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、デコンヴォルーションを要する合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法等が挙げられる。生物学的ライブラリーのアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である(K. S. Lam,1997, Anticancer Drug Des. 12:145)。

小分子、小分子ライブラリー、コンビナトリアルライブラリーの非限定的な例、およびスクリーニング方法は、B. Seligmann, 1995,"Synthesis, Screening, Identification of Positive Compounds and Optimization of Leads from Combinatorial Libraries: Validation of Success" p. 69-70. Symposium: Exploiting Molecular Diversity: Small Molecule Libraries for Drug Discovery, Jolla, CA, Jan. 23-25, 1995 (Wendy Warr & Associates, 6 Berwick Court, Cheshire, UK CW4 7HZから入手できる会議要旨); E. Martin et al., 1995, J. Med. Chem. 38:1431-1436; E. Martin et al., 1995, "Measuring diversity: Experimental design of combinatorial libraries for drug discovery" Abstract, ACS Meeting, Anaheim, CA, COMP 32;およびE. Martin, 1995,"Measuring Chemical Diversity: Random Screening or Rationale Library Design" p.27-30, Symposium: Exploiting Molecular Diversity: Small Molecule Libraries for Drug Discovery, La Jolla, Calif. Jan. 23-25, 1995(Wendy Warr & Associates, 6 Berwick Court, Cheshire, UK CW4 7HZから入手できる会議要旨)に記載されている。

ライブラリーのスクリーニングは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上(Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ上(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細菌もしくは胞子上(Ladner 米国特許第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)、もしくはファージ上(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner,上記)で行うことができる。

スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、このペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその変異体もしくは断片をラベルに連結してもよく、ここで、このラベルは直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供するものである。種々のラベルとして、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば、磁気粒子）などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対が挙げられる。特異的結合メンバーに関しては、通常、相補的メンバーを、公知の手順に従って、検出可能な分子で標識する。

他の種々の試薬をスクリーニングアッセイに含めてもよい。これらのものとしては、塩、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤など、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進する、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を軽減するために用いられる試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのような、アッセイの効率を向上させる試薬を用いてもよい。これらの成分は、必要な結合をもたらすいずれの順序で加えてもよい。インキュベーションは最適な活性を促進するいずれの温度で行ってもよく、典型的には４〜４０℃の間で行われる。インキュベーション時間は最適な活性化が得られるように選択されるが、ラピッド・ハイスループットスクリーニングを促進するために最適化してもよい。通常、０．１〜１時間の間で十分である。一般に、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で並行して実施し、これらの濃度に対する示差的応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの一つを陰性対照とし、すなわち、濃度０とするか、または検出レベル未満とする。

細胞フリーリガンドスクリーニングアッセイを行うためには、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、このペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を、これらの分子と結合する試験薬剤の同定を助けるとともにアッセイの自動化に適応させるために、表面に固定化するのが望ましい場合がある。例えば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドとアフィニティータグを含んでなる融合タンパク質を作製することができる。ある実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドとＦＬＡＧＳタグを含んでなる融合タンパク質を、抗ＦＬＡＧ（登録商標）タグを結合させたビーズまたはマイクロタイタープレートに吸着させる。標識（例えば放射性標識）した試験薬剤を、複合体を形成し得る条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件下）でコーティングビーズに加える。インキュベーション後、コーティングビーズを洗浄して結合していない試験薬剤を除去し、固定化された放射性標識の量を測定する。あるいは、この複合体を解離させて、上清中に存在する放射性標識を測定する。別のアプローチでは、ビーズをＳＩＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、結合した薬剤を同定する。

さらに、本発明によれば、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド、これらのペプチドと結合する抗体、またはその一部もしくは機能的同等物を用いた合理的な薬剤デザインの方法が提供される。合理的薬剤デザインの目的は、対象とする生物学的に活性なポリペプチドまたはそれが相互作用する小分子の構造類似体、例えばミメティクス、を作製することである。次に、これらの類似体を用いて、例えばＰＳＡ−３アゴニストペプチドのより活性な、またはより安定な形態である薬剤、あるいはin vivoでこのペプチドに対する免疫反応性を増強する薬剤を形作ることができる(例えば、Hodgson, 1991, Bio/Technology 9:19-21参照)。合理的薬剤デザインの例としては、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発がある(Erickson et al., 1990, Science, 249:527-533)。

一つのアプローチでは、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこのペプチドを含んでなるポリペプチドの三次元構造は、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリングまたはその組合せによって決定される。ペプチドまたはポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくコンピューターモデリングによって得ることもできる。さらに、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド、またはその断片は、アラニンスキャンによって分析することができる(Wells, 1991, Methods in Enzymol., 202:390-4.11)。この技術では、ポリペプチドまたはペプチドの各アミノ酸残基がアラニンで置換され、ポリペプチドの活性に対するその作用が決定される。

別のアプローチでは、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドに特異的な抗体を単離し、機能アッセイにより選択し、その後、その結晶構造を解明するために解析することができる。原則として、このアプローチによれば、次に行う薬物デザインの基礎とすることのできるファルマコアを得ることができる。あるいは、機能的、薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄ）を作製することにより、タンパク質結晶学を完全に迂回することもできる。鏡像の鏡像として、ａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は対応するＰＳＡ−３アゴニストペプチドの類似体であると推定される。次に、このａｎｔｉ−ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドは、次に、ファルマコアとして用いることができる。

限定されるものではないが、薬物デザインのための方法およびコンピューターツールの例は、R. Cramer et al., 1974, J. Med. Chem. 17:533; H.Kubinyi (ed) 1993, 3D QSAR in Drug Design, Theory, Methods, and Applications, ESCOM, Leiden, Holland; P. Dean (ed) 1995, Molecular Similarity in Drug Design, K. Kim "Comparative molecular field analysis (ComFA)" p. 291-324, Chapman & Hill, London, UK; Y. et al., 1993, J. Comp.-Aid. Mol. Des. 7:83102; G. Lauri and P.A. Bartlett, 1994, J. Comp.-Aid. Mol. Des. 8:51-66; P.J. Gane and P.M. Dean, 2000, Curr. Opin. Struct. Biol. 10(4):401-4; H.O. Kim and M. Kahn, 2000, Comb. Chem. High Throughput Screen. 3(3):167-83; G.K. Farber, 1999, Pharmacol Ther. 84(3):327-32;および H. van de Waterbeemd (Ed.) 1996, Structure-Property Correlations in Drug Research, Academic Press, San Diego, CA.に記載されている。

本発明の他の態様では、ＰＳＡ３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を有する細胞および動物を、治療化合物としての可能性を有する薬剤に関して研究および試験するためのモデル系として用いることができる。試験薬剤を動物に投与するか、細胞に適用した後に、動物／細胞の表現型を決定することができる。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を生み出すＰＳＡ−３アゴニストペプチドの能力を増強する化合物をスクリーニングするために使用できる。細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、マイクロタイタープレートで選択されたエピトープとともにインキュベートする。次に、試験する薬剤、例えば薬物をウェルに加え、Ｔ細胞の増殖を測定する。Ｔ細胞の増幅は、その試験薬剤がＴ細胞応答を増強することを示す。次に、Ｔ細胞応答を増強する試験薬剤についてさらなる評価を行う。

これらの方法によれば、例えば、ＰＳＡに対する免疫反応性の増強をもたらす薬物をデザインすることができる。ＰＳＡ−３アゴニストペプチドをコードするヌクレオチド配列を利用できることにより、Ｘ線結晶学などの解析研究を行うために十分な量のこれらペプチドまたはこれらのペプチドを含んでなるポリペプチドを作製することができる。さらに、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド配列の知見は、Ｘ線結晶学の代わりに、あるいはそれに加えて、コンピューターモデリング技術の使用が可能となる。

抗体に基づく診断
本発明のある実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、このペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）、またはその変異体もしくは断片と特異的に結合する抗体をアッセイに用いて、本明細書に記載のベクター、細胞またはペプチドに基づく治療薬で処置されている被験体をモニタリングすることができる。この診断目的に有用な抗体は、上述のものと同じように作製することができる。抗体は、全長ＰＳＡ−３アゴニストペプチドに対して作製しても、またはこのペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチドに対して作製してもよい。あるいは、抗体は、このペプチドまたはポリペプチドの一部または変異体に対して作製してもよい。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドに関する診断アッセイは、生物学的サンプル（例えばヒト体液、細胞、組織、または細胞もしくは組織の抽出物）においてペプチドまたはポリペプチドを検出するために、抗体および標識を利用する方法を含む。これらの抗体は、修飾しても、修飾しなくてもよく、リポーター分子と共有結合的または非共有結合的に結合させることにより標識してもよい。当技術分野で公知の多様なリポーター分子を使用することができ、そのいくつかを本明細書に記載している。

多くの免疫アッセイ形式が当技術分野で公知であり、用いる特定の形式はアッセイの目的によって決定される。免疫アッセイでは、例えば、単一の疾病関連エピトープに対するモノクローナル抗体、単一の疾病関連抗原成分の異なるエピトープに対するモノクローナル抗体、異なる疾病関連抗原のエピトープに対するモノクローナル抗体、同じ疾病関連抗原に対するポリクローナル抗体、または異なる疾病関連抗原に対するポリクローナル抗体を使用することができる。また、プロトコールは、例えば、固相支持体を使用できるか、あるいは免疫沈降を含み得る。典型的には、免疫アッセイでは、標識抗体と標識抗原成分（すなわち、抗体との結合に関してサンプル中の抗原と競合させるため）のいずれかを用いる。標識の例は上記の節に記載されている。

本発明によれば、「競合」（米国特許第３，６５４，０９０号明細書および同第３，８５０，７５２号明細書）、「サンドイッチ」（米国特許第４，０１６，０４３号明細書）、および「二重抗体」または「ＤＡＳＰ」アッセイを用い得る。当技術分野では、サンプル中のＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこのペプチドを含んでなるＳＰＡポリペプチドの量を測定するいくつかの方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＦＡＣＳ）が知られており、診断の基礎となる。ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の陰性対照値は、処置前被験体、好ましくはヒトから採取した生物学的サンプルを会合に好適な条件下でポリペプチドまたはペプチドに対する抗体とともにインキュベートすることによって確立する。抗体−抗原の会合量は種々の方法により定量できるが、光度測定手段が好ましい。処置後サンプル中、および処置前（陰性対照）サンプル中のポリペプチドまたはペプチドのレベルを比較する。処置前と処置後の値の差により、処置プロトコール中のレベルをモニタリングするためのパラメーターが確立される。

抗体に基づく診断用途に好適なキットは、典型的には次の成分の１以上を含む：
（１）抗体：抗体は予め標識されていてもよい。あるいは、抗体を標識せずに、標識用の成分を別の容器でキットに含めてもよく、または二次標識抗体が提供される。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、またはその変異体もしくは断片に対するものとすることができる；
（２）反応成分：キットはまた、他の適宜パッケージングされた試薬、および、適用可能であれば、固相マトリックスおよび標品をはじめとする、特定の免疫アッセイプロトコールに必要な材料を含んでもよい。

上述のキットは、試験を実施するための使用説明書を含んでもよい。さらにまた、好ましい実施形態では、診断キットは、ハイスループットおよび／または自動操作に適合可能なものとされる。

核酸に基づく診断薬
本発明の他の実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニスト核酸（例えば、配列番号２０〜配列番号２２）、またはその変異体もしくは断片は、本明細書に記載のベクターまたは細胞に基づく治療薬で処置される被験体をモニタリングするためのアッセイで用いることができる。よって、本発明によれば、生物学的サンプル（例えば、ヒト体液、細胞、組織、または細胞もしくは組織の抽出物）などのサンプル中のＰＳＡ−３アゴニスト核酸のレベルまたは配列を検出する方法が提供される。例えば、ＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチド配列の存在は、開示されたポリヌクレオチドまたはそれと相補的な配列の少なくとも一部を含んでなるプローブまたはプライマーを用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。

特定の態様では、ＰＳＡ−３アゴニストオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、すなわちプライマーは、ＰＳＡ−３アゴニストＤＮＡまたはＲＮＡを含む細胞またはその他の生物学的サンプルを検出するため、核酸増幅に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＲアッセイ）において用いることができる。あるいは、ＰＳＡオリゴマー（すなわち、プローブ）は、ＰＳＡ−３アゴニストＤＮＡまたはＲＮＡを含む細胞またはその他の生物学的サンプルを検出するため、核酸ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ（例えば、サザンブロット、ドットブロットまたはスロットブロット）において用いることができる。好ましくは、診断法におけるプローブまたはプライマーとして有用な核酸としては、ＰＳＡ−３アゴニスト核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも１５の連続するヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８、２１、２４、または３０の連続するヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが挙げられる。

ＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチドに対して特異的なプローブを作製するためには、いくつかの方法が使用できる。例えば、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅により、標識プローブを作製することができる。あるいは、ＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチド配列、またはその一部もしくは断片を、ｍＲＮＡプローブの生産のためのベクターへクローニングしてもよい。このようなベクターは当技術分野で公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ（６）などの適当なＲＮＡポリメラーゼと標識ヌクレオチドとを加えることにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。これらの手順は、種々の市販のキット（例えば、Amersham-Pharmacia; Promega Corp.;および U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH製）を用いて行うことができる。使用可能な好適なレポーター分子または標識としては、放射性ヌクレオチド（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、および３５Ｓ）、酵素、蛍光剤（例えば、ローダミン、フルオレセイン、およびＣｙＴＭ３、ＣｙＴＭ５）、化学発光剤、または発色剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などのようなその他の標識（例えば、ＤＮＰ、ジゴキシゲニンおよびビオチン）が挙げられる。

例えば組織サンプル（例えば、毛髪または頬内）または体液サンプル（例えば、血液、唾液または尿）などの分析サンプルは、核酸プローブと直接接触させればよい。あるいは、サンプルを処理してそこに含まれる核酸を抽出してもよい。ＤＮＡを抽出するのに用いる特定の方法は、生物学的サンプルの性質によって異なるとことが分かるであろう。サンプルから得られた核酸にゲル濾過またはその他のサイズ分画技術を適用してもよく、あるいは、核酸サンプルを、サイズ分画せずに、適当な固相マトリックスに固定化してもよい。

本発明によれば、診断アッセイは、治療処置または治療介入中のＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチドレベルをモニタリングするために用いることができる。例えば、ＰＳＡ−３アゴニストポリヌクレオチド配列、またはその断片もしくは相補配列は、例えばＰＳＡ−３アゴニスト発現レベルの状態を検出するために、患者生検由来の体液または組織を用いるサザンまたはノーザン解析、ドットブロットまたはその他の膜に基づく技術；ＰＣＲ技術；またはディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡまたはバイオチップアッセイにおいて使用できる。このような定性・定量法は当技術分野で周知である(G.H. Keller and M.M. Manak, 1993, DNA pROBES, 2nd Ed, Macmillan Publishers Ltd., England; D.W. Dieffenbach and G.S. Dveksler, 1995, PCR Primer. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY; B.D. Hames and S.J. Higgins, 1985, Gene Probes 1, 2, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England)。

ＰＳＡ−３アゴニスト核酸の発現を定量するのに好適な方法には、ヌクレオチドの放射性標識化またはビオチニル化、対照核酸の同時増幅、および実験結果を推定する標準曲線が含まれる(P.C. Melby et al., 1993, J. Immunol. Methods 159:235-244;およびC. Duplaa et al., 1993, Anal. Biochem. 212(1):229-36)。複数のサンプルを定量する速さは、ＥＬＩＳＡ形式（対象オリゴマーを種々の希釈率で提供し、分光光度測定または比色定量的応答により迅速な定量が得られる）でのアッセイを行うことにより加速化することができる。確立されている方法によれば、マイクロアレイ形式（すなわち、ＤＮＡチップまたはバイオチップ）を用いることができる（例えば、D.A. Rew DA, 2001, Eur. J. Surg. Oncol. 27(5):5048; P.J. Planet et al., 2001, Genome Res. 11(7):1149-55; J. Quackenbush, 2001, Nat. Rev. Genet. 2(6):418-27; O.P. Kallioniemi et al., 2001, Hum. Mol. Genet. 10(7):657-62;P. Lal et al.に対する米国特許第6,015,702号明細書; M. Schena (Ed.), 2000, Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing参照）。

核酸に基づく診断用途に好適なキットは、典型的には次の成分を含む：
（１）プローブＤＮＡ：プローブＤＮＡは予め標識されていてもよい。あるいは、プローブＤＮＡを標識せずに、標識用の成分を別の容器でキットに含めてもよい。プローブは、ＰＳＡ−３アゴニスト核酸、またはＰＳＡ−３アゴニスト核酸を含んでなるより長いＰＳＡ核酸とハイブリダイズし得るものである；
（２）ハイブリダイゼーション試薬：キットはまた、他の適宜パッケージングされた試薬、ならびに、適用可能であれば固相マトリックス、および標品をはじめとする、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要な材料を含んでもよい。

ベクターおよび細胞に基づく治療法
本発明のある実施形態では、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）、またはその断片もしくは変異体を、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を介して宿主に投与する。好ましい宿主はヒトである。ＰＳＡに対する特異的免疫応答は、上記のように構築された組換えポックスウイルス約１０５〜１０９ｐｆｕの間、より好ましくは１０^７ｐｆｕを宿主に投与することにより生起することができる。その後の少なくとも一期間で、好ましくは１〜３ヶ月後に、宿主に追加の抗原投与を行うことにより免疫応答をブーストする。より好ましくは、少なくとも２回目の「ブースト」を、好ましくは最初のブーストの１〜３ヶ月後に行う。

所望により１以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ）、増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）、または同時刺激分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはその他のＢ７関連分子）；またはＯＸ−４０Ｌもしくは４１ＢＢＬ；またはそれらの組合せを生物学的アジュバントとして使用してもよく（例えば、M.L. Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; M.T. Lotze et al., 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1): S61-6; L. Cao et al., 1998, Stem Cells 16(Suppl 1): 251-60; M. Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90参照)、宿主に全身投与してもよいし、あるいはベクター、例えば組換えポックスベクター中へこれらの分子をコードする遺伝子を挿入することにより同時に投与してもよい（例えば、Schlom et al.に対する米国特許第６，０４５，８０２号参照）。種々の実施形態では、これらの遺伝子はＰＳＡ−３アゴニストコード配列と同じベクターへクローニングしてもよく、あるいは同時投与用の１以上の個別のベクターへクローニングしてもよい。さらに、カルメット−ゲラン結核菌(BacillusCalmette-Guerin (BCG))およびレバミソールなどの非特異的免疫調節因子を同時投与することもできる。

場合によっては、被験体内で免疫応答をさらに増強するために、アジュバントを投与することが望ましいことがある。いくつかのアジュバントが公知であり、当業者に用いられている。ヒトへの使用に好適なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、珪酸アルミニウム、モンタニド（Montanide）（例えば、ＩＳＡ５０、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ８０、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、ＩＳＡ７４０）、およびリン酸カルシウム（例えば、ナノ粒子；BioSante Phannaceuticals, Inc., Lincolnshire, IL）が挙げられる。好ましいアジュバントは、ＲＩＢＩアジュバント（例えば、Ｄｅｔｏｘ（登録商標）, Corixa Corp., Seattle WA）である。Ｄｅｔｏｘ（登録商標）は、２％スクアラン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に、細菌から抽出された３種類の成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＴＤＭ＋ＣＷＳ＋ＭＰＬ（登録商標); Corixa Corp.）を含有する。他の好ましいアジュバントとしては、ＢＣＧ、ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）(CSL Limited, Parkville, Australia)および水酸化アルミニウムアジュバント(Superphos, Biosector)が挙げられる。

組換えベクターは、例えば乱刺法および注射、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内投与をはじめとするいずれかの許容される経路を用いて投与することができる。非経口投与のためには、組換えベクターを、典型的には、生理食塩水などの医薬上許容される担体とともに、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションにて注射する。

本発明の他の実施形態では、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドを宿主細胞（例えば、ＣＴＬ）を介して宿主に投与する。あるいは、本発明によるＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたは組成物を、樹状細胞またはＢ細胞などの抗原提示細胞とともに同時投与することができる。ＰＳＡ−３アゴニストペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、上述のように免疫化した宿主から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から確立することができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、培養してその数を増幅することができ、次に種々の手段によって宿主へ注射して戻すことができる。一般に、点滴５回当たり１×１０^５〜２×１０^１１個の間の細胞傷害性Ｔ細胞を、例えば３０〜６０分かけて各２００〜２５０ｍｌずつ３回点滴して投与する。点滴が完了した後、患者を用量７２０，０００ＩＵ／体重キログラムの組換えインターロイキン−２を８時間毎に静脈内投与して処置すればよく、一部用量は患者の薬物許容量に応じて省くことができる。さらに、点滴後、Ｔ細胞誘発エピトープを含むさらなる抗原または断片を患者に投与して、Ｔ細胞の数をさらに拡大してもよい。抗原またはエピトープは、アジュバントとともに調剤してもよく、かつ／またはリボソーム製剤としてもよい。また、細胞傷害性Ｔ細胞は、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるポリペプチド、および／またはＴＮＦ−αをコードするＤＮＡを含むウイルスベクターを導入することにより改変することができる。これらの改変細胞は、細胞の抗腫瘍活性を高めるために宿主に再導入することができる。本明細書に詳細に記載されるように、その他のサイトカインまたはモジュレーターを使用することもできる。

ペプチドに基づく治療法
本発明は、１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド（例えば、配列番号３〜配列番号５）、またはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド（例えば、配列番号２５〜配列番号３０）、またはその断片もしくは変異体と、生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる組成物に関する。さらに、本発明は、本発明による治療方法を実施する上で有用な医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤（担体）と、有効成分として本明細書に記載のような１以上のＰＳＡ−３アゴニストペプチド、これらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチド、または断片もしくは変異体とを混合して含む。

有効成分としてポリペプチドまたはペプチドを含む医薬組成物の製造方法は、当技術分野で十分に理解されている。典型的には、このような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射可能なものとして調製されるが、注射前に液体中の溶液または懸濁液とするのに好適な固形物を調製してもよい。また、この製剤は乳化させることもできる。有効治療成分は、多くの場合、医薬上許容され、かつ、有効成分に適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられ、さらにはそれらの組合せが挙げられる。さらに、所望により、有効成分の有効性を高める湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、微量の補助物質を含んでもよい。

ＰＳＡ−３アゴニストペプチドまたはこれらのペプチドを含んでなるＰＳＡポリペプチドは、中和された生理学上許容される塩の形態として医薬組成物に配合することができる。好適な塩としては酸付加塩（すなわち、ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基により形成される）があり、これらは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。また、遊離カルボキシル基から形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トルメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。

医薬組成物は、中性または塩の形態として製造され得る。塩は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸およびコハク酸をはじめとする多くの酸とともに形成し得る。組成物は、液剤、懸濁剤、坐剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性剤または散剤の形態をとり得る。このような製剤は、有効成分１０％〜９５％（ｗ／ｗ）、好ましくは２５％〜７０％（ｗ／ｗ）を含み得る。また、医薬製剤および組成物は、１以上の生理学上許容される担体、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、可塑剤、増量剤、着色剤、投与ビヒクル、吸収促進剤、安定剤、または殺菌剤を含み得る。このような組成物および製剤の製造および調剤は当技術分野で公知であり、実用化されている方法によって行う。

医薬組成物を調製した後は、それらを適当な容器に入れ、適応症の処置に関するラベルを付ければよい。このようなラベルは、量、頻度、および投与方法を含み得る。製剤は、経口または非経口経路により全身投与することができる。限定されるものではないが、非経口投与経路としては、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経皮、吸入、鼻腔内、動脈内、腸内、舌下または直腸が挙げられる。静脈内投与は、例えば、単位用量を注射することによって実施できる。「単位用量」とは、本発明による医薬組成物に関して用いる場合、ヒトへの単回投与として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療作用を得るために計算された所定量の有効物質を、必要とされる希釈剤、すなわち担体またはビヒクルとともに含有する。

医薬組成物は、その投与製剤に適合する様式および治療上有効な量で投与する。投与量は、処置する被験体、被験体の免疫系の有効成分利用能、および所望の免疫刺激度によって異なる。投与する必要がある有効成分の厳密な量は、医師の判断に委ねられ、各個体に対して特異的なものである。しかし、好適な用量は、投与経路にもよるが、１日あたり、個体の体重１ｋｇあたり、有効成分約０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ〜数ｍｇの範囲であり得る。初回投与に好適な用量計画と追加投与も異なるが、典型的には、初回投与の後、次の注射またはその他の投与まで１時間以上おいて反復投与する。あるいは、１０ｎＭ〜１０μＭの血中濃度を維持するのに十分な静脈内点滴も考えられる。

医薬製剤の例としては、ＰＳＡ−３アゴニストペプチド（５．０ｍｇ／ｍｌ）；重亜硫酸ナトリウムＵＳＰ（３．２ｍｇ／ｍｌ）；エデト酸二ナトリウムＵＳＰ（０．１ｍｇ／ｍｌ）；および注射用水q.s.a.d.（１．０ｍｌ）を含んでなる。医薬製剤を調製するさらなる指針は、例えば、Gilman et al. (eds), 1990, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press;およびRemingtoh's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis et al.(eds), 1993, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman et al. (eds), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New Yorkに見出すことができる。

場合によっては、被験体内で免疫応答をさらに増強するために、アジュバントを投与することが望ましいことがある。いくつかのアジュバントが公知であり、当業者に用いられている。ヒトへの使用に好適なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、珪酸アルミニウム、モンタニドＩＳＡ７２０、およびリン酸カルシウム（例えば、ナノ粒子；BioSante Phannaceuticals, Inc., Lincolnshire, IL）が挙げられる。好ましいアジュバントは、２％スクアラン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に、細菌から抽出された３種類の成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＴＤＭ＋ＣＷＳ＋ＭＰＬ（登録商標); Corixa Corp.）を含有するＲＩＢＩアジュバント（例えば、Ｄｅｔｏｘ（登録商標）, Corixa Corp., Seattle WA）である。他の好ましいアジュバントとしては、ＢＣＧ、ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）(CSL Limited, Parkville, Australia)および水酸化アルミニウムアジュバント(Superphos, Biosector)が挙げられる。

種々の実施形態では、１以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ）、増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）、または同時刺激分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、１３７２、またはその他のＢ７関連分子）；またはＯＸ−４０Ｌもしくは４１ＢＢＬ；またはそれらの組合せを生物学的アジュバントとして使用してもよく（例えば、M.L. Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; M.T. Lotze et al., 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1): S61-6; L. Cao et al., 1998, Stem Cells 16(Suppl 1): 251-60; M. Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90参照)、宿主に全身投与してもよいし、あるいはベクター、例えば組換えポックスベクター中へこれらの分子をコードする遺伝子を挿入することにより同時に投与してもよい（Schlom et al.に対する米国特許第６，０４５，８０２号参照）。

１以上のＰＳＡ−３ペプチドまたはこれらのペプチドを含んでなるポリペプチドを含有する医薬組成物の治療上有効量は、前立腺癌を軽減、緩和または除去するのに十分な量である。有効量は、治療する個体に１回の投与で導入することもできるし、あるいは繰り返し投与で導入することもできる。治療的投与に続き、疾病の治療後に予防的投与を行うこともできる。予防上有効な量は疾病の予防に有効な量であり、具体的な疾病および被験体によって異なる。治療上有効な用量は、まず、例えば細胞培養アッセイと動物モデル（通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタまたは非ヒト霊長類）のいずれかを用いて評価し得る。また、動物モデルを用いて最大許容用量および適当な投与経路を決定し得る。次に、このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定することができる。

特に、本発明によるペプチドに基づく、ベクターに基づく、および細胞に基づく治療法は、個々に使用することもできるし、いずれかの組合せで使用することもできる。さらに、これらの処置を、限定されるものではないが、ホルモン療法、化学療法、外科術（例えば、根治的前立腺切除）、凍結外科術、放射線療法（例えば、体外ビームまたはシードインプラント）、間質放射線治療、および免疫療法（例えば、抗ＨＥＲ２抗体；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））をはじめとする前立腺癌のその他の治療法と併用することができる。

本明細書に記載の実施例は、本発明をさらに説明するものであって、本発明を何ら制限するものではない。

実施例１
細胞培養物：ヒト前立腺癌細胞系統ＬＮＣａＰ（M.G. Sanda et al., 1995, J. Natl. Cancer Inst. 87:280-285) (ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＰＳＡ陽性）およびＳＫ−ＭＥＬ−２４（T.E. Carey et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3278-3282）、ヒト黒色腫細胞系統（ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＰＳＡ陰性）をAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA）より入手した。培養物はマイコプラズマを含まず、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies,Inc.）を補充した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０; Life Technologies, Inc., Grand Island, NY）で維持した。

Ｃ１Ｒ細胞系統は、内因性ＨＬＡ−ＡまたはＢ抗原を発現しないヒト血漿白血病細胞系統である（K.S. Anderson et al., 1993, J. Immunol. 151:3407-3419）。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞は、トランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ２．１のゲノムクローンを発現するＣ１Ｒ細胞である（W.J. Storkus et al., 1987, J. Immunol., 138:16571659）。これらの細胞はWilliam E. Biddison博士（National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NIH, Bethesda, MD）より入手した。１７４ＣＥＭ−Ｔ２細胞系統（Ｔ２）輸送欠失突然変異体（K.T. Hogan et al., 1988, J. Exp. Med. 168:725-736）はPeter Cresswell博士（Yale University School of Medicine, New Haven, CT）からの提供を受けた。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞およびＴ２細胞はマイコプラズマを含まず、それぞれＲＰＭＩ１６４０完全培地およびイスコフの改変ダルベッコ完全培地（Life Technologies）で維持した。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＣＡＰ−１エピトープに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）系統であるＶ８Ｔ細胞系統は、免疫原としてｒＶ−ＣＥＡを用いて、第１相試験に登録されている転移性結腸癌の患者から確立した（K.Y. Tsang et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3:2439-2449）。Ｖ８Ｔ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清およびＩＬ−２（National Cancer Institute, Surgery Branchが供給、２０単位／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地で培養した。

Ｖ８Ｔ細胞を、エフェクター：ＡＰＣの比１：３にて、先の再刺激から１６日後にＣＡＰ−１ペプチド（２５μｇ／ｍｌ）で再び刺激した。照射した（２３，０００ラッド）自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣとして用いた。

実施例２
ペプチド：ＰＳＡペプチドＰＳＡ−３のＰ１、Ｐ２およびＰ１０の位置に単一または二重アミノ酸置換を有する類似体パネル（P. Correale et al. , 1997, J.Nat. CancerLeast. 19: 293-300）（図１）、およびＣＥＡペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（S. Zaremba et al. , 1997, Cancer Res. 57: 45704577）は、９６％を超える純度であった。ペプチドはMultiple Peptide Systems（San Diego, CA）により作製された。

単色フローサイトメトリー分析：単色フローサイトメトリー分析法はこれまでに記載されている（F. Guadagni et al., 1990, Cancer Res. 50:6248-6255）。要するに、細胞をＣａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない冷ＤＰＢＳで３回洗浄した後、ｍＡｂを用いて１時間、１０^６細胞あたり１０μｇの１×実行希釈を用いてＨＬＡ−Ａ２（A2, 69, One Lambda, Inc., Canoga Park, CA）に対して染色した。鉱油形質細胞腫−１０４Ｅ（Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA）をイソ型対照として用いた。この細胞を３回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）の１：１００希釈液とともにインキュベートした。細胞を、直ちに、ブルーレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳｃａｎにて、４８８ｎｍ、励起１５ｎＷで分析した。１０，０００の生細胞からデータを採取し、保存し、これを用いて結果を得た。

実施例３
二色フローサイトメトリー分析：二色フローサイトメトリー分析の手順は、以下の点を除いて単色フローサイトメトリー分析の手順と同様であった。使用した抗体は、抗ＣＤ４ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８ＰＥ、抗ＣＤ４５Ｒ０−ＦＩＴＣ／抗−ＣＤ４９ｄＰＥ、抗ＣＤ２８ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５６ＰＥ、抗ＣＤ８６ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８０ＰＥ、抗ＣＤ５８ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５４ＰＥ、抗ＭＨＣクラスＩＦＩＴＣ／抗ＭＨＣクラスＩＩＰＥ、および抗ＩｇＧｌＦＩＴＣ／抗ＩｇＧ２ａＰＥ（イソ型対照）であった。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ５６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ５８に対する抗体はBecton Dickinsonより購入した。ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに対する抗体はSerotec, UKより購入した。ＣＤ１４およびＣＤ５４に対する抗体は、Becton Dickinsonより購入した。染色は同時に１時間行い、その後細胞を３回洗浄し、上記のように再懸濁し、直ちに、ブルーレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳｃａｎを用い、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラム（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて４８８ｎｍ、励起１５ｎＷで分析した。

実施例４
ＨＬＡ−Ａ２とのペプチド結合：ＰＳＡ−３類似体とＨＬＡ−Ａ２分子との結合を、フローサイトメトリーで示されるようなＴ２Ａ２細胞との結合で評価した（H.W. Nijman et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:1215-1219）。要するに、血清を含まないイスコフの改変ダルベッコ完全培地中の１×１０^６の細胞を、５％Ｃ０^２中３７℃、２４ウェル培養プレート中で、濃度５０μｇ／ｍｌのペプチドとともにインキュベートした。ペプチド結合のフローサイトメトリーを、Ｔ２細胞および単色分析を用いて実施した。細胞をＤＰＢＳ中で３回洗浄した後、上記のように、１０^６細胞あたり１０μｇの１×実行希釈を用いてＨＬＡ−Ａ２特異的ＭＡｂ（One Lambda,Inc.）とともに１時間インキュベートした。ＵＰＣ−１０（Cappel/Organon Teknika）をイソ型対照として用いた。この細胞を３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ（Becton Dickinson）の１：１００希釈液とともにインキュベートした。上記のように、ＦＡＣＳｃａｎで分析を実施した。細胞調製および染色中は総て、細胞は氷上で維持した。

実施例５
ＰＢＭＣ由来のＤＣの培養：ＨＬＡ−Ａ２正常ドナーＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をヘパリン添加血液から得た。ＰＢＭＣを、文献に記載のようにリンパ球分離培地勾配（Organon Teknika, Durham, NC）を用いて分離した（A. Boyum et al., 1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:51-76）。Sallustoらが記載した手順（F. Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1109-1118）の改変法を用いて樹状細胞（ＤＣ）を調製した。ＰＢＭＣ（１．５×１０^８）を、２ｍＭグルタミン、５０Ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technologies,Inc.）中に再懸濁し、Ｔ−１５０フラスコ（Corning Costar Corp., Cambridge, MA）に付着させておいた。３７℃で２時間後、付着しなかった細胞を穏やかにすすいで取り除いた。付着細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）および２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）および２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含むＡＩＭ−Ｖ培地で６〜７日間培養した。培地は３日毎に補充した。

実施例６
組換えウイルスおよびＰＳＡ（ｒＶ−ＰＳＡ）またはＰＳＡ−３Ａ（ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａ）を含むワクシニアウイルスでのＤＣの感染：ＰＳＡｃＤＮＡを、ワクシニア４０Ｋプロモーター（L. Gritz et al., 1990, J. Virol. 64:5948-5957）の制御下、ワクシニアウイルスのＷｙｅｔｈ株のＨｉｎｄIII Ｍゲノム領域へ挿入した。大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、鶏痘Ｃ１プロモーター（S. Jenkins et al., 1991, AIDS Res. Hum. Retroviruses 7:991-998）の制御下、組換えウイルスの比色マーカーとして含めた。文献に記載されているように（D. Panicali et al., 1986, Gene 47:193-199）、ｌａｃＺ遺伝子産物についての発色アッセイを用いて組換えウイルスを同定した。ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａの構築のため、in vitro突然変異誘発によってＰＳＡ配列中のコドン１５５をＡＴＴ（イソロイシン）からＣＴＧ（ロイシン）へ変更した（G. Mazzara et al., 1993, Methods Enzymol. 217:557-581, K. Smith et al., 1993, Vaccine 11:43-53）。

得られたＰＳＡ配列をＰＳＡ−３Ａと称し、文献に記載されているように（G. Mazzara et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:557-581; K. Smith et al., 1993, Vaccine 11:43-53,1993）、これをワクシニア４０Ｋプロモーターの制御下、宿主域選択系を用いてワクシニアウイルスのＷｙｅｔｈ株の誘導体のＨｉｎｄIII Ｍゲノム領域へ挿入した。ＤＣ（１×１０^６）を、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Life Technologies, Inc.）中、３７℃でｒＶ−ＰＳＡ、ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａまたは対照ワクシニアウイルスベクターとともにインキュベートした。滴定実験は、１時間での感染多重度（ＭＯＩ）１０と同等に相当する１×１０^７プラーク形成単位／ｍｌが一貫してＰＳＡの産生を誘導することができたことを示した。感染したＤＣを、２４時間培養した１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４、および２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含む１０ｍｌの新鮮な、温かいＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に懸濁し、その後、ＡＰＣとして用いた。

実施例７
Ｔ細胞系統の作製：Tsangらが記載しているプロトコール（K. Y. Tsang et al. , 1997, Clin.Cancer Res. 3: 2439-2449）の改変法を用いてＰＳＡ特異的ＣＴＬを作製した。ＤＣをＡＰＣとして用い、ＰＢＭＣから単離した非付着細胞をエフェクター細胞の供給源として用いた。ＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３Ａペプチドを最終濃度２５μｇ／ｍｌでＤＣに加えた。次いで、自己非付着細胞をＡＰＣ：エフェクター比１：１０でＡＰＣに加えた。培養物を、５％Ｃ０_２を含む加湿雰囲気下、３７℃で３日間インキュベートした。ペプチドを含む培地を取り出した後、次いで培養物に濃度２０単位／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を７日間添加した。ＩＬ−２を含む培地は３日ごとに補充した。３日間のペプチドによるインキュベーションおよび７日間のＩＬ−２補充を１サイクルのin vitro刺激（ＩＶＳ）とした。一次培養物を、１１日目にＰＳＡペプチド（２５μｇ／ｍｌ）で再び刺激して次のＩＶＳサイクルを開始した。照射した自己ＤＣを３サイクルのＩＶＳにＡＰＣとして用いた。照射した（２３，０００ラッド）自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を、３回目のＩＶＳサイクルの後にＡＰＣとして用いた。

実施例８
細胞傷害性アッセイ：標的細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ２または腫瘍細胞）を、室温で１５分間、５０μＣｉの^１１１インジウム標識したオキシキノリン（Medi-Physics Inc., Arlington, IL）で標識した。１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中の標的細胞（０．３×１０^４）を、平底のアッセイプレート（Corning Costar Corp.）中の９６ウェルの各々に加えた。標識したＣ１Ｒ−Ａ２標的細胞を、５％Ｃ０_２中で６０分間、３７℃で示した濃度のペプチドとともにインキュベートした後、エフェクター細胞を加えた。癌細胞系統を標的として用いる場合には、ペプチドは用いなかった。エフェクター細胞を、１０％ヒトＡＢプール血清を添加した１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中に懸濁し、標的細胞に加えた。次いで、細胞を、４または１６時間、５％Ｃ０_２中３７℃でインキュベートした。γ計数のため、回収フレーム（Skatron, Inc., Sterling, VA）を使用して上清を回収した。測定は３回行い、標準偏差を計算した。次式を用いて特異的溶解を算出した（全ての値はｃｐｍ）。

溶解（％）＝（観察された放出量−自発放出量）／（総放出量−自発放出量）×１００

自発放出量は、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を加えたウェルから測定した。標的を２．５％のＴｒｉｔｏｎｘ−１００で処理した後、総放出可能放射能を得た。

実施例９
アポトーシスアッセイ：Ｔ細胞を、上記ＩＶＳ手順に記載したようにペプチドを加えた自系Ｂ細胞の存在下で４８時間インキュベートし、９６ウェルプレートへ２４時間再びプレーティングした。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介するニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いてアポトーシスを分析した（Y. Gavrieli et al., 1992, J. Cell Biol. 119:493-501）。

実施例１０
トランスジェニックマウス：ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋ^ｂトランスジェニックマウスはL. Sherman博士（Scripps Laboratories, San Diego, CA）から提供された。トランスジェニックマウスは、重鎖のα−３ドメインがマウスＨ−２／Ｋ^ｂドメインによって置換されているが、ＨＬＡ−Ａ２．１ α−ｌおよびα−２ドメインは変更されていないＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子の産物を発現する（A. Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med. 173:1007-1015; V. H. Engelhard et al., 1991, J. Immunol. 46:1226-1232）。

実施例１１
in vivo免疫化およびマウスＴ細胞培養物：３群のＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋ^ｂトランスジェニックマウス（１群につきマウス３個体）を、ＰＳＡ−３ペプチドを加えたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋ^ｂＤＣ、ＰＳＡ−３Ａペプチドを加えたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋトランスジェニックマウス由来のＤＣ、またはＤＣのみを用いて、基本的に尾の皮下注射によって感作させた。ペプチドは濃度５０μｇ／ｍｌで用い、ＤＣは１×１０^６細胞／マウス／注入で用いた。合計３回の注射を、２週間離して各動物に行った。ＤＣのみを注射されたマウスを対照として用いた。最後の注射後７日にマウスを屠殺し、照射した同系の脾細胞を用いて２５μｇ／ｍｌのＰＳＡ−３またはＰＳＡ３Ａペプチドで脾臓細胞を６日間in vitroで再び刺激した。これらの大量の培養物のサイトカイン産生量を試験した。ペプチドでパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２（ＪＡ２Ｋ^ｂ）細胞を刺激細胞として用いた。Ｊｕｒｋａｔ０２０１Ｋ^ｂ細胞はヒトＴ細胞白血病系統Ｊｕｒｋａｔの安定したトランスフェクタントであり、ＨＬＡ−Ａ０２０１Ｋ^ｂキメラ遺伝子の産物を発現する（L.A. Sherman et al., 1992, Science 258:815-818）。

実施例１２
サイトカインの検出：ＩＬ−２フリー培地で種々の応答物：刺激剤比にて２４時間、ペプチドパルスした非感染ＤＣ、ｒＶ−ＰＳＡ感染ＤＣ、またはｒＶ−ＰＳＡ−３Ａ感染ＤＣに曝したＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキット(R & D Systems, Minneapolis, MN)を用いてＩＦＮ−γの分泌に関してスクリーニングした。結果はｐｇ／ｍｌとして算出した。また、ＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙ（ＣＢＡ）システム(BD PharMingen, San Diego, CA)も用い、特定のＴ細胞系統によって複数のサイトカインが分泌されることを判定した。ＣＢＡ系は粒子に基づく免疫アッセイで可溶性アナライトを測定するためにフローサイトメトリーによる蛍光検出を用いる。ＢＤヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡキットを用いて単一サンプル中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γタンパク質レベルを測定した。サイトカイン補足ビーズをＰＥ結合検出抗体と混合した後、組換えサイトカイン標品または試験サンプルとともにインキュベートしてサンドイッチ複合体を形成させた。サンプルの結果はＢＤＣＢＡ分析ソフトウエアを用いてグラフおよび表形式で示した。結果はｐｇ／ｍｌとして算出した。

統計分析：平均値間の差の統計分析は両側ｔ検定（two-tailed paired t test）を用いて行った(Stat View statistical software, Abacus Concepts, Berkeley, CA)。

結果
１０−ｍｅｒＰＳＡ−３ペプチドのアミノ酸１、２、および１０番の第一および第二のＬＡ−Ａ２アンカー残基の分析から、いくつかの修飾がＨＬＡ−Ａ２に対する結合を増強し得ることが明らかとなった。従って、ＰＳＡ−３の４つの異なる類似体を合成した（表１）。

表１：ＰＳＡ類似体。親ノナマーＰＳＡ−３ペプチド（ＰＳＡのアミノ酸１５４〜１６３番）および類似体ノナマー。アミノ酸は一文字コードで示している。置換アミノ酸はボールド体で示している。

対応するヌクレオチド配列を下の表に示す。置換コドンはボールド体で示している。

次にこれら４つの類似体を実施例の節に記載したように、ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２Ａ２細胞との結合に関して試験した。ＮＣＡペプチドはＨＬＡ−Ａ２とは結合しないことが従前に示されており、陰性５対照として用いた。ペプチドをＴ２Ａ２細胞に０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。図１Ａは４つのうち３つの類似体がＨＬＡ−Ａ２と結合したことを示している。２つの類似体（Ｌ−１５５とＹ１５４）は種々のペプチド濃度でＰＳＡ−３よりも高いレベルでＨＬＡ−Ａ２と結合した。ペプチド類似体１−１６３はＨＬＡ−Ａ２との結合は全く示さなかった（図１Ａ）。

さらに低いペプチド濃度でＨＬＡ−Ａ２と結合するペプチドを分析したところ、類似体１−１５５は明らかにＰＳＡ−３よりも高いレベルのＨＬＡ−Ａ２と結合したことが明らかになった（図１Ｂ）。このデータは、第一のアンカー位置２（ＰＳＡ分子の１５５番目）に修飾を有する１−１５５ペプチドがペプチドＰＳＡ−３の可能性のあるアゴニストであることを示し、これをＰＳＡ−３Ａと呼んだ。従って、このＰＳＡ−３Ａペプチドを天然ＰＳＡ−３ペプチドとのさらなる競合研究のために選択した。１５５番目に（ＰＳＡ３Ａで見られたものと）同一の変異ならびに二次アンカー残基（１５４番目）に付加的変異を含むペプチドは、実際に天然ＰＳＡ−３ペプチドよりも低いレベルでＨＬＡ−Ａ２と結合することに着目すべきである（図１Ａ〜１Ｂ）。

次に、ペプチドＰＳＡ−３およびＰＳＡ−３Ａに関するペプチドＭＨＣ複合体の安定性を検討するために研究を行った。ペプチドをＴ２Ａ２細胞とともに一晩インキュベートし、遊離の非結合ペプチドを洗い流し、細胞表面への新たなクラスＩ分子の送達を遮断するためにベレフェルジン−Ａとともにインキュベートした。種々の時点で、細胞をペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体の存在に関して分析した。図２はＰＳＡ−３Ａ−ＨＬＡ−Ａ２複合体が８時間の観察時間にわたってＰＳＡ−３複合体よりも安定であったことを示している。従って、ペプチドのＭＨＣとの結合能（図１Ａ〜１Ｂ）および安定性（図２）、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体の親和性は、天然ＰＳＡ−３ペプチドよりもＰＳＡ−３Ａペプチドのほうが高い。

次に、ＰＳＡ−３ペプチドおよびＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスしたＡＰＣを用いて、ヒトＴ細胞系統を確立し、これらを比較するために研究を行った。明らかに健康なドナーからのＤＣをＡＰＣとしていずれかのペプチドでパルスし、自己ＰＢＭＣをエフェクター細胞の供給源として用いた。実施例の節で記載したように、ＩＬ−２の存在下において各ペプチドでパルスすることにより培養細胞を確立した。ＩＶＳサイクル３（ＩＶＳ−３）において、ペプチドパルスされた標的を溶解するＴ細胞の能力を分析した。ペプチドＰＳＡ−３Ａを用いて確立された、Ｔ−ＰＳＡ−３Ａと呼ばれる系統は、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスされた細胞よりも高い程度で、ペプチドＰＳＡ−３ＡでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２細胞を溶解することが示された（図３Ａ）。しかし、ＰＳＡ−３ペプチドを用いて確立した細胞も、ＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスされたものよりも高い程度で、ＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスされた標的細胞を溶解した（図３Ｂ）。このことは２つの異なるエフェクター／標的細胞比において見られた。

この現象をさらに分析するため、次にＣ１Ｒ−Ａ２細胞を種々の濃度の天然およびアゴニストペプチドでパルスし、２つのＴ細胞系統の標的として用いた。ＰＳＡ−３Ａペプチドを用いて形成したＴ細胞は、各ペプチド濃度でＰＳＡ−３ペプチドでパルスされた細胞よりもＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスされた標的細胞の高い溶解％を示し、溶解にはＰＳＡ−３ペプチドより約８倍少ないＰＳＡ−３Ａペプチドしか必要としなかった（図４Ａ）。さらに、天然ＰＳＡ−３ペプチドで確立されたＴ細胞を用いた場合にもこの現象が見られた。このように、これらのＴ細胞は各ペプチド濃度で、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスされた標的細胞よりも高いレベルまで、ＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ２標的細胞を溶解し、同レベルの溶解を達成するのに約８倍少ないＰＳＡ−３Ａペプチドしか必要としなかった。これらの研究から、ＰＳＡ−３Ａペプチド由来の細胞系統が天然ＰＳＡ−３ペプチドＭＨＣ複合体を認識し、このような複合体を提示するこのような細胞を溶解し得るという第一の示唆が提供される。

ペプチドＰＳＡ−３を用いて確立されたＴ細胞系統（Ｔ−ＰＳＡ−３と呼ばれる）およびペプチドＰＳＡ−３Ａを用いて確立されたＴ細胞系統（Ｔ−ＰＳＡ−３Ａと呼ばれる）は双方とも、＞９５％がＣＤ４９ｄ陽性であり、＞６７％がＣＤ８^＋陽性であり、＜３．０％がＣＤ５６^＋陽性であり、＞８８％がＣＤ４５Ｒ０^＋陽性の細胞であることが示された。いずれかのペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞で刺激された細胞は、ＩＶＳ−５において、ＴＵＮＥＬアッセイによりＤＮＡフラグメンテーションについて分析した。図５は、ペプチドの不在下では２．９％のアポトーシスＣＤ８^＋細胞が見られ（図５Ａ）、ＰＳＡ−３ペプチドで刺激された細胞では４．９％のアポトーシスＣＤ８^＋細胞が見られ（図５Ｂ）、細胞がＰＳＡ−３ペプチドで刺激された場合には４．５％のアポトーシスＣＤ８^＋細胞が見られた（図５Ｃ）ことを示す。従って、アゴニストペプチドで刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と天然ペプチドで刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞とを比較すると、アポトーシスに差は見られなかった。

次に、ＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３ＡペプチドのいずれかでパルスされたＡＰＣで刺激されたＴ細胞のサイトカインプロフィールを分析した。これらの試験には、ＰＳＡ−３ペプチドを用いて誘導した細胞系統を使用し、用いたＡＰＣは自己Ｂ細胞であった。刺激後２４時間で得られた上清を用いる分析には、ＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙ（ＣＢＡ）アッセイを用いた（実施例の節参照）。図６Ａ〜６Ｃは、このアッセイで得られた結果の較正に用いた１０の内部標準のうちの４つを示す。図６Ｄ〜６Ｆは、それぞれペプチドでパルスされていないＡＰＣ、ＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスされたＡＰＣ、およびＰＳＡ−３ペプチドでパルスされたＡＰＣで刺激されたＴ細胞が産生した６種のサイトカインの各々のレベルを示している。これらの結果は、ＰＳＡ−３ペプチドよりもＰＳＡ−３Ａペプチドで刺激されたＴ細胞によるＩ型サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生がより大きいことを示している。いずれのペプチドを用いても、２型サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０のレベルは低いか、または検出できないレベルであった。２４時間の時点では、上清においてＴＮＦ−αは検出できなかった。ＩＬ−５に関して得られた結果は以下で考察する（結論の節）。

ＰＳＡ−３およびＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスしたＤＣで刺激した場合の、もともとＰＳＡ−３Ａペプチドを用いて形成されたＴ細胞によるＩＮＦ−γ産生のレベルを求めるための研究も行った。以下の表２は、ＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスされたＤＣで刺激されたＴ細胞が、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスされたＤＣで刺激されたものよりも多くのＩＦＮ−γを産生することを示している。ペプチド、ＤＣまたはＴ細胞を含まない培養物により、ＩＦＮ−γ産生の特異性（表２）と非特異的抗同種異系反応性が存在しないことが示された。

表２：ＰＳＡ−３またはアゴニストＰＳＡ−３Ａペプチドで刺激されたＴ細胞系統によるＩＦＮ−γの産生。ＰＳＡ特異的Ｔ細胞系統Ｔ−ＰＳＡ−３ＡをＩＶＳ−３にてエフェクター細胞として用いた。Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ細胞を、濃度２５μｇ／ｍｌおよびエフェクター／ＡＰＣ比１０：１でＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３Ａペプチドのいずれかでパルスした照射ＨＬＡ−Ａ２陽性同種異系ＤＣで刺激した。２４時間培養した後、上清を回収し、ＩＦＮ−γの分泌に関してスクリーニングした。ＡＰＣ＝抗原産生細胞。

ペプチドパルスしたＤＣによるＴ細胞の活性化はＤＣによるＩＬ−１２産生のレベルと関連していることが従前に示されている。よって、Ｔ細胞の存在下、ＰＳＡ−３およびＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスされたＤＣによるＩＬ−１２産生のレベルを求めるため試験を行った。下記の表３は、ペプチドの不在下のＤＣ、Ｔ細胞単独、およびＤＣの不在下のペプチドパルスしたＴ細胞の総てが、検出可能なレベルのＩＬ−１２を産生できなかったことを示している。ＰＳＡ−３ペプチドでパルスしたＤＣをＴ−ＰＳＡ−３かＴ−ＰＳＡ−３ＡＴ細胞系統のいずれかとともにインキュベートした場合、ＤＣはＩＬ−１２を産生することが示され、Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ系統とともに培養されたペプチドパルスＤＣにより、より多くのＩＬ−１２が産生された（表３）。ＰＳＡ３ＡペプチドでパルスしたＤＣを両Ｔ細胞系統とともにインキュベートした場合、Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ系統とともにインキュベートされたＤＣはここでも、Ｔ細胞系統Ｔ−ＰＳＡ−３とともにインキュベートされたペプチドパルスＤＣよりも高いレベルのＩＬ−１２を産生した（表３）。

表３：ペプチドＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３ＡアゴニストでパルスされたＤＣのＩＬ−１２産生能。ＰＳＡ特異的Ｔ細胞系統Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ（ＰＳＡ−３ＡペプチドでＰＢＭＣをパルスすることにより誘導）およびＴ−ＰＳＡ−３（ＰＳＡ−３ペプチドでＰＢＭＣをパルスすることにより誘導）をＩＶＳ−４にてエフェクター細胞として用いた。Ｔ細胞１５を濃度２５μｇ／ｍｌおよびエフェクター／ＡＰＣ比１０：１でＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３ＡペプチドのいずれかでパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性同種異系ＤＣで刺激した。２４時間培養した後、上清を回収し、ＩＬ−１２の分泌に関してスクリーニングした。ＩＬ−１２産生はｐｇ／ｍｌ／５×１０^５ＤＣとして表した。

次に、ＰＳＡ−３Ａペプチドを用いて形成したＴ細胞が天然ＰＳＡを内在発現する腫瘍細胞を溶解することができるかどうかを調べるために、試験を行った。下記の表４は、Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ系統が天然ＰＳＡを発現するＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞系統を溶解し得ること、およびＨＬＡ−Ａ２陽性であったことを示している。ＰＳＡを発現しないＨＬＡ−Ａ２陽性ＳＫ−ｍｅｌヒト黒色腫系統は溶解しないことが示された。Ｔ−ＰＳＡ−３系統（天然ＰＳＡ−３Ａペプチドを用いて形成）もＬＮＣａＰ系統を溶解したが、各エフェクター／標的細胞比においてＴ−ＰＳＡ−３Ａ系統で見られたものよりも低いレベルであった（表４）。この溶解がＭＨＣにより制限されるかどうかを調べるため、抗体遮断実験を行った。表４は、Ｔ−ＰＳＡ−３Ａ系統によるＬＮＣａＰ枝の溶解が抗ＨＬＡ−Ａ２抗体により遮断されたが、イソ型の一致する対照抗体ＵＰＣ−１０によっては遮断されなかったことを示す。

表４：アゴニストペプチド（ＰＳＡ−３Ａ）を用いて形成されたＴ細胞の、天然ＰＳＡを発現する前立腺癌細胞を溶解する能力。１８時間^１１１Ｉｎ放出アッセイを行った。ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌）細胞はＰＳＡ陽性かつＨＬＡ−Ａ２陽性である。ＳＫ−ｍｅｌ（黒色腫）細胞はＰＳＡ陰性でＨＬＡ−Ａ２陽性である。実験１および２をそれぞれＩＶＳ３および４で行った。実験２のＥ：Ｔ比は２５：１であった。括弧の中の数字は標準偏差である。実験２では、ＬＮＣａＰ細胞（１×１０^６）を^１１１Ｉｎで標識し、抗体、対照抗体ＵＰＣ−１０（１０μｇ／ｍｌ）、または抗ＨＬＡＡ２，２８抗体（１：１００希釈）を含有する培地の存在下で１時間インキュベートした。この細胞を１８時間細胞傷害アッセイで標的として用いた。^＊統計学的に有意（Ｐ＜０．０１，両側ｔ検定）。

ＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^ｂトランスジェニックマウスはこれまでに、ヒトに対するＨＬＡ−Ａ２ペプチドの免疫原性の決定の助けとなることが報告されている。よってこのin vitro系を用いてさらに分析を行い、ＰＳＡ−３Ａペプチドの免疫原性を天然ＰＳＡ−３ペプチドと比べた。ＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^ｂトランスジェニックマウス由来のＤＣをＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３Ａペプチドのいずれかでパルスし、これを用いてＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^ｂマウスにワクチン接種した。ＤＣ単独（ペプチドなし）も対照ワクチンとして用いた。２週間間隔で３回のワクチン接種後、最後のワクチン接種から２週間後に得られた脾細胞からＴ細胞を単離した。次にこのＴ細胞をＰＳＡ−３ペプチド、ＰＳＡ−３Ａペプチド、またはペプチドなしでパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２／Ｋ^ｂ細胞とともにインキュベートし、２４時間後の上清からＩＮＦ−γの産生を測定した。

下記の表５は、ペプチドを伴わないＤＣ単独を免疫原として用いてもＴ細胞によりＩＮＦ−γは産生されないことを示している。これに対し、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスしたＤＣをワクチン接種したマウスから得られたＴ細胞は、ＡＰＣをペプチドＰＳＡ−３またはＰＳＡ３Ａのいずれかでパルスした場合、ＩＮＦ−γを産生した（表５）。しかし、天然またはアゴニストＰＳＡペプチドのいずれかでパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２／Ｋ^ｂ細胞で刺激した場合、ＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスしたＤＣをワクチン接種したマウスのＴ細胞からはずっと高いレベルのＩＮＦ−γが得られた（表５）。これらの研究から、ＰＳＡ−３ＡエピトープがＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子に関してＰＳＡ−３エピトープよりも免疫原性が高いというさらなる証拠が得られる。

表５：ＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^ｂトランスジェニックマウスにおけるＰＳＡ−３対ＰＳＡ−３Ａペプチドの免疫原性。ＤＣ単独、ＰＳＡ−３でパルスしたＤＣまたはＰＳＡ−３ＡでパルスしたＤＣで免疫化したマウスからＴ細胞を得た。各群３個体のマウスを用いた。各動物に２週間間隔で３回注射（１×１０^６ＤＣ／マウス／注射）を行った。ペプチドは５０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ＩＮＦ−γ産生アッセイにおいては、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋ^ｂトランスジェニックマウスから得られた細胞をＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３Ａペプチド（２５μｇ／ｍｌ）でパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２／Ｋ^ｂ細胞で刺激した。２４時間目の培養上清を回収し、ＩＮＦ−γの分泌に関してスクリーニングした。

本発明の実験は、ペプチドに基づくワクチンまたはペプチドでパルスしたＤＣワクチンのいずれにおいてもＰＳＡ−３Ａエピトープの使用の利点を示す。また、ＰＳＡの全遺伝子を含むが、ＰＳＡ−３Ａエピトープの変異型アミノ酸配列を有するベクターを構築するための実験も行った。このように、１５５番目においてイソロイシンからロイシンへのアミノ酸変異を持たない、またはこれを持つ全ＰＳＡ導入遺伝子で組換えワクシニアウイルスを構築した。これらの組換えワクシニアウイルスは、それぞれｒＶ−ＰＳＡおよびｒＶ−ＰＳＡ−３Ａと称する。初期の研究により、両組換えワクシニアウイルスのヒトＤＣに対する至適感染多重度は１０ｐｆｕ／細胞であることが示された。いずれかの組換えベクターに感染したヒトＤＣは、上清の免疫アッセイによって求めた場合に約６３ｎｇ／ｍｌでＰＳＡタンパク質産生を示した。なお、ヒトＤＣのｒＶ−ＰＳＡ、ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａ、および野生型ワクシニアウイルスによる感染は、ＤＣの表面表現型マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ５８、クラスＩおよびクラスIIを変化させなかった。

Ｖ−ＰＳＡまたはｒＶ−ＰＳＡ−３Ａのいずれかに感染させたＤＣを用いて、もともとＡＰＣを天然ＰＳＡ−３ペプチドでパルスすることによって誘導したＴ細胞を刺激した。下記の表６は、ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａ組換え体に感染させたＤＣは、インターフェロン産生によって測定した場合、ｒＶ−ＰＳＡに感染させたＤＣを用いた場合よりもＰＳＡ特異的Ｔ細胞を活性化する上で効果が高かったことを示している。比較のため、２５μｇのＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスした非感染ＤＣも用いてＴ−ＰＳＡ−３Ｔ細胞を活性化した。特異性対照として、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞系統（Ｖ８Ｔ）の活性化はＰＳＡ組換えベクターによっては見られなかった。さらなる対照として、野生型ワクシニアベクターに感染させたＤＣを用いた。これらの研究から、変異型ＰＳＡエピトープもヒトＤＣによりプロセシング可能であり、特異的Ｔ細胞の活性化に対して提示され得ることが示される。

表６：ワクシニアＰＳＡ組換え体に感染させたＤＣの、ＰＳＡ−３ＡアゴニストエピトープをプロセシングしてＰＳＡ特異的Ｔ細胞を活性化させる能力。ＰＳＡ特異的Ｔ−ＰＳＡ−３細胞およびＣＥＡ特異的Ｖ８Ｔ細胞を、感染させていないか、またはｒＶ−ＰＳＡ、ｒＶ−ＰＳＡ（ＰＳＡ−３Ａ）、またはＶ−ＷＴ（野生型）に感染させた照射同種異系ＤＣで刺激した。比較のため、非感染ＤＣまたはＶ−ＷＴに感染させたＤＣをＰＳＡ−３ＡペプチドまたはＣＡＰ１−６Ｄペプチドでパルスした。ペプチドは２５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ワクシニアウイルスベクター感染は、１時間、ＭＯＩ１０とした。次に、感染細胞を３７℃、完全培地中で一晩インキュベートし、これをＡＰＣとして用いた。４８時間目の培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの分泌に関してスクリーニングした。ＣＡＰ１−６ＤペプチドはＣＥＡペプチドＣＡＰ−１のＴＣＲアゴニストである。

本明細書に示される結果は、アゴニストペプチドＰＳＡ−３Ａエピトープが、ＭＨＣとの結合親和性、ペプチドＭＨＣ複合体の親和性（アビディティー）、およびin vitroでＣＴＬを活性化する能力の点で、天然ＰＳＡ−３エピトープより優れていることを示す。このアゴニストエピトープはまた、in vivoＨＬＡ−Ａ２．１１Ｋ^ｂトランスジェニックマウスモデル(P. Correale et al., 1998, J. Immunol. 161:3186-3194)におけるＴ細胞の活性化において天然エピトープより有効であった。ＰＳＡ−３Ａペプチドにより活性化されたＴ細胞は、天然ペプチドでパルスしたＡＰＣと天然ＰＳＡを発現するヒト前立腺癌細胞の双方をＭＨＣに制限される様式で溶解する能力を示した。ワクシニア組換え体を用いたこれらの研究から、アゴニストエピトープが、ＰＳＡ分子全体に関して、Ｔ細胞の活性化に関してＡＰＣによりプロセシングされ提示され得ることも示した。なお、アゴニストペプチドによって刺激されたＴ細胞は、天然ペプチドと比較した場合、高レベルのＩ型サイトカインを産生するが、高いアポトーシスを受けないことが示された。

１０−ｍｅｒＨＬＡ−Ａ２．１リガンドの分析により、良好なＨＬＡ−Ａ２．１結合に強く関連する残基は、２番目の第一のアンカーについてはＬとＭであり、１０番目ではＶ、ＬおよびＩであることが示唆されている(J. Ruppert et al., 1993, Cell 74:929-93)。ＰＳＡ−３ペプチドの２番目（１５５番目のアミノ酸）においてＩがＬに置換されると、該ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１分子との結合効率が向上した。この現象は、２番目の残基ＩがＨＬＡ−Ａ２．１とのペプチド結合親和性ならびに残りのペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を低下させ得るということにより説明することができる(J. Ruppert et al., 1993, Cell 74:929-937; M. Bouvier and D.C. Wiley, 1994, Science 265:398-402)。ｇｐ１００１５４−１６２のＮ末端アンカー位置２においてＴをＬまたはＩに置換すると、ＨＬＡ−Ａ２分子との結合が著しく高まった。しかし、ＬまたはＩへの置換の間で、ペプチド結合親和性または抗原性に差はなかった(A.B.H. Bakker et al., 1997, Int. J. Cancer 70:302-309)。他方、ノナペプチドＭｅｌａｎ−Ａ２７−３５の２番目においてＡをＬに置換した場合には、ペプチドのＨＬＡ−Ａ２との結合は増強されたが、抗原活性に５０倍を超える低下があった(D. Valmori et al., 1998,J. Immunol. 160:1750-1758)。

１０番目のＶをＬで置換すると、ＰＳＡ−３ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１分子への結合が低下した。これは、一つには、９番目でのＶに代わるＬがペプチド−ＨＬＡ−Ａ２．１の親和性ならびにその複合体の安定性を低下させるということにより説明し得る(J. Ruppert et al., 1993, Cell 74:929-937; D.R. Madden, 1995, Ann. Rev. Immunol. 13:387-622)。ＦｌｕＡマトリックスＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチド５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号６）および５８−６８（ＧＩＬＧＦＶＴＬＶＬ；配列番号７）の場合、Ｌの代わりにＶという置換がＣ末端であった場合には、ＨＬＡ−Ａ２との結合に低下は検出されなかったことが示されている(H.W. Nijman et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:1215-1219)。このことは、Ｃ末端にＶを含む１０ｍｅｒペプチドのＮＹ−ＥＳＯ−１５７−１６６（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＶ；配列番号８）が、野生型ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦ；配列番号９）およびＣ末端にＬを含むＮＹ−ＥＳＯ−１５７−１６６ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＬ；配列番号１０）よりも効率的にＨＬＡ−Ａ２を認識したというChenらの報告(J.L. Chen et al., 2000, J. Immunol. 165:948-955)に一致している。他方、Ｃ末端においてＶｉｎＦｌｕＡカトリックスペプチド２−１１（ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶ；配列番号１１）および２−１２（ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬ；配列番号１２）においてＶの代わりにＬがある場合には、ＨＬＡ−Ａ２との結合の増強が見られた(H.W. Nijman et al., Eur. J. Immunol. 23:1215-1219)。

発明者らの研究では、１番目におけるＹへの置換は、ＰＳＡ−３ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合を増強した。このことは、１番の位置での芳香族残基の置換は１０−ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２．１への結合を好むという知見(J. Ruppert et al., 1993, Cell 74:929-937)と一致する。Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド２６−３５（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１３）に関して同じ結果がValmoriら(D. Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160:1750-1758)によって報告されており、そこでは１番におけるＥからＹへの置換（ＹＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１４）がペプチドの結合親和性を増強した。他方、１番にＹを含むｇｐ１００ペプチド２８０−２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ；配列番号１５）はＨＬＡ−Ａ２分子と十分結合しなかった(Y. Kawakami et al., 1995, J. Immunol.154:3961-3968)。第二のアンカー位置におけるＨＬＡ−Ａ２．１結合が弱いことと強い関連のある残基は、１番目ではＤ、Ｅ、Ｐ；３番目ではＤ，Ｅ；４番目ではＲ、Ｋ、Ｈ、Ａ；５番目ではＰ；７番目ではＲ、Ｋ、Ｈ；８番目ではＤ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ；また、９番目ではＲ、Ｋ、Ｈである(H.G. Rammensee et al., 1995, Immunogenetics 41:178-228)。ＰＳＡ−３ペプチドでは、第二のアンカー位置におけるＨＬＡ−Ａ２．１結合が弱いことと関連のある残基は存在しない。

興味深いことに、２番目（１５５番目のアミノ酸）におけるＬ、および１番目（１５４番目のアミノ酸）におけるＹへのアミノ酸置換によって作出された類似体ペプチドは、Ｔ２Ａ２細胞への結合によってアッセイした場合、ＨＬＡ−Ａ２．１分子への結合において天然ＰＳＡ−３ペプチドほど有効でなかった。これは、コンホメーション変異、立体障害、または反発性の静電気作用のような負の作用によるものであり得る。ｇａｐ１００ペプチド２８０−２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ；配列番号１５）は、１番における推定モチーフ残基Ｙ、２番におけるＬ、および９番におけるＡを含むことが示されている。これらの残基はＨＬＡ−Ａ２．１分子との良好な結合を助けるものと推定されるが、このペプチドの実際の結合親和性は高くなかった。ペプチドの親和性の低下は、３番における負に帯電したＥなど、ペプチドの他の位置における残基によるものであり得る(Y. Kawakami et al., 1995, J. Immunol. 154:3961-3968; A.L. Cox et al., 1994, Science 264:716-719)。

ワクチン療法におけるアゴニストペプチドの使用は、最近の２つの臨床試験で実証されている。一つの臨床試験では、変異型アンカー残基を有する黒色腫ｇｐ１００ペプチドをＩＬ−２と併用した場合、天然ｇｐ１００ペプチドをＩＬ−２と併用した場合よりも黒色腫患者でより高い臨床応答をもたらした(S.A. Rosenberg et al., 1999, J. Immunol. 163:1690-1695)。もう一つの臨床試験では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用するＣＥＡペプチドＣＡＰ１のアミノ酸の一つを改変してＣＡＰ１−６ＤＴＣＲエンハンサーアゴニストエピトープ(S. Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57:4570-4577)を作製した。このＣＡＰ１−６ＤアゴニストでパルスしたＤＣを進行型のＣＥＡ発現癌腫を有する患者においてワクチンとして用いた(L.H. Fong et al., Amer. Assoc. for Cancer Res. Ann. Mtg. April 1-5, 2000 Proceedings #1387, 41:217)。ワクチン接種した最初の６名の患者の同齢集団では、患者の部分集団で血清ＣＥＡの安定化が見られ、肺転移の退縮が見られた。アゴニストエピトープを用いた場合には、患者においてＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答も生じた(L.H. Fong et al., Amer. Assoc. for Cancer Res. Ann. Mtg. April 1-5, 2000 Proceedings #1387, 41:217)。

重要なことに、本明細書に記載されるアゴニストＰＳＡ−３Ａペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子陽性の前立腺癌患者のためのワクチン療法におけるアジュバント中の、またはペプチドパルスされたＤＣを介してのペプチドワクチンとして有用である。Ｆｌｔ−３Ｌ(E. Maraskovsky et al., 1996, J. Exp. Med. 184:1953-1962; S.D. Lyman, 1995, Int. J. Hematol. 62:63-73)またはＴＲＩＣＯＭベクター、すなわち３つの同時刺激分子を含むベクター(J.W. Hodge et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. 92:1228-1239)などの分子を用いた場合に高いペプチドパルスＣＤ活性を示すという最近の研究により、研究者はＤＣワクチンプロトコールを首尾よく行うことができる。

本明細書に示されている結果によれば、天然ＰＳＡ−３エピトープまたはＰＳＡ−３Ａアゴニストのいずれかを用いて形成されたＰＳＡ特異的Ｔ細胞が、ＰＳＡ−３ペプチドよりもＰＳＡ−３Ａに応答してより多くのＩＦＮ−γを産生することが実証されている。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの産生は、実施例の節に記載されたように、ＣＢＡアッセイによって測定した。これらのデータは、ＰＳＡ−３ペプチドと比較した場合におけるＰＳＡ−３Ａで刺激したＴ細胞由来のＩＬ−２、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−γの産生の増強を示したが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の増強は示さない。活性化されたＴ細胞によりＩＬ−５の産生が増強されると、次に好酸球、好塩基球、Ｂ細胞および胸腺細胞を活性化し得る。ＩＬ−５は好酸球の走化性および活性化因子である。ＩＬ−５はまた、刺激細胞およびＩＬ−２の存在下で落花生凝集素結合胸腺に対するキラー−ヘルパー因子活性を示すことが示されている。胸腺集団間からのＣＴＬの補充におけるこの結果は、標的胸腺細胞に対してＩＬ−２受容体をアップレギュレートするＩＬ−５の能力によるものである(K. Takatsu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4234-4238; S.C. Bischoff et al., 1990, J. Exp. Med., 172:1577-1582)。これは、ＰＳＡ−３Ａペプチドがまた、ＰＳＡワクチン臨床試験に関与する患者の免疫応答をモニタリングするためのより感受性の高い免疫アッセイにおいて用い得ることを示唆している。

ＰＳＡに基づくワクチンを用いたいくつかの臨床試験が完了しており、あるいはまた、前立腺癌患者において進行中である。進行型の前立腺癌を有する患者における最近の試験では、ｒＶＰＳＡワクチンがワクチン接種された７名のＨＬＡ−Ａ２．１患者のうちの５名において、ＰＳＡ−３ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答を誘導したことが示された(J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638)。ｒＶ−ＰＳＡワクチンは安全であることが示され、ある患者では、少なくとも２１ヶ月の間、臨床的進行の所見がないままであった(J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6:1632-1638)。進行中の臨床試験では、初回ワクチン接種としてｒＶ−ＰＳＡが用いられ、その後、組換え型鶏痘ＰＳＡワクチンで複数回追加ワクチン接種が行われる。この多角的な初回および追加ワクチン戦略は、組換えＣＥＡベクターワクチンを用いた動物モデルでも(J.W. Hodge et al., 1997, Vaccine 15:759-768, 1997)、臨床試験でも(J.L. Marshall et al., 2000, J. Clin. Oracol. 18:3964-3973)有利であることが示されている。

本明細書で報告された実験から、ＰＳＡ分子における単一のアミノ酸変異もまた、組換えＰＳＡワクシニアもしくは鶏痘ベクター、またはいずれかのＤＮＡベクター中における使用により、天然ＰＳＡ遺伝子を含む同ベクターの使用よりも有効にＴ細胞を活性化させることができることが実証される。このアゴニストエピトープはＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子を有する患者にのみ利益があり得るが、これはまだ白色人種のおよそ半分であり、同様にその他の集団でもさらに低い程度である。さらに、本発明における実験は、ＰＳＡのような比較的弱い免疫原性自己抗原のＣＴＬエピトープの組成における単一のアミノ酸変異を用いて、天然遺伝子産物を発現する腫瘍を溶解し得る特異的Ｔ細胞集団をより有効に活性化することができるというコンセプトを支持するものである。

実施例１３
細胞傷害性Ｔ細胞の作製：文献に記載されているように(Boyum et al., 1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:77-80)、Lymphocyte Separation Medium gradient (Organon Teknika, Durham, NC)を用いてＰＢＭＣを分離することができる。洗浄したＰＢＭＣを、１０％プールヒトＡＢ血清(Pel-Freeze Clinical System, Brown Dear, Wis.)、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(GIBCO)を添加した完全培地、例えばＲＰＭＩ１６４０(GIBCO)に再懸濁させる。完全培地中、約２×１０^５細胞の濃度のＰＢＭＣを、例えば１００μｌの容量で９６ウェル平底アッセイプレート(Costar, Cambridge, Mass., USA)の各ウェルに加える。これらの培養物中に抗原またはペプチドを最終濃度約５０μｇ／ｍｌで加え、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下、３７℃で５日間インキュベートする。５日後、ペプチドを含む培地を取り出した後に培養物に新鮮ヒトＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を供給し、３日毎にＩＬ−２を含む培地を補給する。１６日目に一次培養物を同ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）で再刺激する。この後、５×１０^５の照射（４，０００ｒａｄ）自己ＰＢＭＣを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、約５０μｌ完全培地の容量で加える。約５日後、文献に記載のように、培養物にヒトＩＬ−２含有培地を供給する。細胞を１６日間おいて５日間再刺激する。

本明細書に挙げた総ての特許出願、特許、テキスト、および参照文献は、本発明が属する技術分野をより十分に説明するため、引用することにより本明細書の開示の一部とする。

上述のような本発明の範囲および精神から逸脱することなく上記の方法および組成物において種々の変更ができることから、上記の記述に含まれ、付属の図面に示され、あるいは上記の実施形態に示される総ての主題は例示として示されるものであって、制限を意味するものではないと考えられる。

ＰＳＡペプチドとＨＬＡ−Ａ２との結合。実施例の節で記載したように、ペプチドをＴ２Ａ２細胞系との結合について分析した。ペプチドを、０〜５０μｇ／ｍｌ（図１Ａ）およびそれより低い濃度（図１Ｂ）で用いた。ＰＳＡ−３は親ＰＳＡペプチドである（白三角）。ＰＳＡ−３（Ｌ−１５５；ＰＳＡ−３Ａとも呼ばれる）（黒四角）、ＰＳＡ−３（Ｙ１５４）（黒丸）、ＰＳＡ−３（Ｙ１５４／Ｌ１５５）（黒三角）、およびＰＳＡ−３（Ｌ１６３）（白四角）は、ＰＳＡ−３アゴニストペプチドである。ＮＣＡペプチド（白丸）は陰性対照である。結果は相対蛍光値（ＭＦＩ）で表す。ＰＳＡ−３またはＰＳＡ−３ＡペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体の安定性の比較。Ｔ２Ａ２細胞をＰＳＡ−３（白四角）またはＰＳＡ−３Ａ（黒四角）ペプチドとともに５０μｇ／ｍｌの濃度で一晩インキュベートした後、結合しなかったペプチドを洗い流し、ブレフェルジンＡとともにインキュベートして新たなクラスＩ分子の細胞表面への送達を遮断した。示された時間に、表面ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体の存在に関して細胞を染色した。結果は、０時を１００％結合として比較した相対結合％で表す。ＰＢＭＣをＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスすることによって誘導したＴ−ＰＳＡ−３ＡＴ細胞系の細胞傷害性（図３Ａ）、およびＰＢＭＣをＰＳＡ−３ペプチドでパルスすることによって誘導したＴ−ＰＳＡ−３Ｔ細胞系の細胞傷害性（図３Ｂ）。標的細胞は、種々のＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比でのin vitro刺激（ＩＶＳ−３）のために、濃度２５μｇ／ｍｌでＰＳＡ−３Ａ（黒四角）またはＰＳＡ−３（黒丸）ペプチドのいずれかでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２細胞とした。ペプチドを含まないＣ１Ｒ−Ａ２細胞（白四角）も試験した。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性は、１８時間^１１１Ｉｎ放出アッセイで測定した。ＩＶＳ−３でＰＳＡ−３Ａ（黒四角）、またはＰＳＡ−３（白丸）ペプチドの濃度を増加させながらパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２細胞に対する、Ｔ−ＰＳＡ−３ＡＴ細胞系の細胞傷害性（図４Ａ）、およびＴ−ＰＳＡ−３Ｔ細胞系の細胞傷害性（図４Ｂ）。Ｅ：Ｔ比＝２５：１。ＣＴＬ活性は１８時間^１１１Ｉｎ放出アッセイで測定した。ＴＵＮＥＬアッセイを用いたペプチド刺激Ｔ細胞におけるＤＮＡ断片化。ＰＳＡペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞によって活性化したＣＤ８^＋細胞のアポトーシス。図５Ａ：ペプチドを含まないＢ細胞で刺激したＴ−ＰＳＡ−３細胞；図５Ｂ：ＰＳＡ−３ペプチドでパルスしたＢ細胞で刺激したＴ−ＰＳＡ−３細胞；図５Ｃ：ＰＳＡ−３ＡペプチドでパルスしたＢ細胞で刺激したＴ−ＰＳＡ−３細胞。実施例の節に記載のように、各ヒストグラムの中の数字はアポトーシス細胞（ラインより上の細胞）の百分率を示す。ペプチド刺激されたＴ細胞によるサイトカインの産生についてのサイトメトリックビーズアレイ(Cytometric Bead Array)アッセイ。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ（各図の上から下へ）の産生を分析した。０ｐｇ／ｍｌ（図６Ａ）、３１２ｐｇ／ｍｌ（図６Ｂ）、および５０００ｐｇ／ｍｌ（図６Ｃ）の各サイトカイン濃度の標品を用いて、サンプル中のこれら６種のサイトカインの濃度を測定した。ペプチドを含まないＴ−ＰＳＡ−３細胞＋ＡＰＣ（自己Ｂ細胞）から得た上清（図６Ｄ）。Ｔ−ＰＳＡ−３＋ＡＰＣ＋ＰＳＡ３Ａから得た上清（図６Ｅ）。Ｔ−ＰＳＡ−３＋ＡＰＣ＋ＰＳＡ−３から得た上清（図６Ｆ）。ＰＳＡポリペプチド。図７Ａ−７Ｂ：前駆体（配列番号２３）および成熟型（配列番号２４）のＰＳＡ配列。図７Ｃ−７Ｄ：ＰＳＡ−３（１−１５５）ペプチドを含んでなる前駆体（配列番号２５）および成熟型（配列番号２６）のＰＳＡ配列。図７Ｅ−７Ｆ：ＰＳＡ−３（Ｙ１５４）ペプチドを含んでなる前駆体（配列番号２７）および成熟型（配列番号２８）のＰＳＡ配列。図７Ｇ−７Ｈ：ＰＳＡ−３（Ｌ１５５／Ｙ１５４）ペプチドを含んでなる前駆体（配列番号２９）および成熟型（配列番号３０）のＰＳＡ配列。ＰＳＡ−３およびＰＳＡ−３アゴニストペプチド配列に下線が施してある。アミノ酸変化は斜体で示す。

【配列表】

Claims

ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
ベクターが、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
ベクターが、オルソポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アヴィポックスウイルス、鶏痘ポックスウイルス、カプリポックスウイルス、およびスイポックスウイルスからなる群から選択されるポックスウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
請求項５〜７のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
宿主細胞がヒト細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
宿主細胞が抗原提示細胞または腫瘍細胞である、請求項８または９に記載の宿主細胞。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、プライマー。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、プローブ。
ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含んでなる、単離されたアミノ酸配列。
配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０からなる群から選択される配列を含んでなる、単離されたアミノ酸配列。
請求項１３または１４に記載の単離されたアミノ酸配列に結合する抗体。
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
（ａ）請求項１２に記載のプローブ、および
（ｂ）前記プローブと核酸との結合を検出するための少なくとも１種の成分
を含んでなる、核酸を検出するためのキット。
（ａ）請求項１５または１６に記載の抗体、および
（ｂ）前記抗体とアミノ酸配列との結合を検出するための少なくとも１種の成分
を含んでなる、アミノ酸配列を検出するためのキット。
核酸を検出するための方法であって、
（ａ）請求項１２に記載のプローブを、核酸を含んでなる生物学的サンプルとともにインキュベートし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして
（ｂ）前記（ａ）で形成された複合体を検出する
ことを含んでなり、前記複合体の存在が核酸の検出を示す、方法。
アミノ酸配列を検出するための方法であって、
（ａ）請求項１５または１６に記載の抗体を、アミノ酸配列を含んでなる生物学的サンプルとともにインキュベートし、それにより複合体を形成し、そして
（ｂ）前記（ａ）で形成された複合体を検出する
ことを含んでなり、前記複合体の存在がアミノ酸配列の検出を示す、方法。
組換えアミノ酸配列を生産するための方法であって、
（ａ）請求項８〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を前記組換えアミノ酸配列の産生に好適な条件下で培養し、そして
（ｂ）前記宿主細胞または宿主細胞培養物から前記組換えアミノ酸配列を回収し、それにより前記組換えアミノ酸配列を生産する
ことを含んでなる、方法。
組換えアミノ酸配列を単離する方法であって、
（ａ）ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含んでなる組換えアミノ酸配列を発現する宿主細胞から得られた生物学的サンプルをインキュベートし、そして
（ｂ）複合体から前記組換えアミノ酸配列を回収し、それにより前記組換えアミノ酸配列を単離する
ことを含んでなる、方法。
前立腺特異抗原アゴニストペプチド活性を増強する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞傷害性Ｔ細胞を、請求項１２または１３に記載の単離されたアミノ酸配列および試験薬剤とともにインキュベートし、そして
（ｂ）前記細胞傷害性Ｔ細胞の増幅をスクリーニングする
ことを含んでなり、前記増幅が前立腺特異抗原アゴニストペプチド活性を増強する薬剤の同定を示す、方法。
前立腺特異抗原アゴニストペプチド活性を増強する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項８〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を試験薬剤とともにインキュベートし、そして
（ｂ）前記宿主細胞の増幅をスクリーニングする
ことを含んでなり、前記増幅が前立腺特異抗原アゴニストペプチド活性を増強する薬剤の同定を示す、方法。
請求項５〜７のいずれか一項に記載のベクターと、生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる、医薬組成物。
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞と、生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる、医薬組成物。
請求項１３または１４に記載の単離されたアミノ酸配列と、生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる、医薬組成物。
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前立腺癌を治療するのに十分な量で投与することを含んでなる、前立腺癌を治療または予防する方法。
前記医薬組成物が、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、珪酸アルミニウム、モンタニド、およびリン酸カルシウムからなる群から選択されるアジュバントとともに投与される、請求項２８に記載の方法。
前記医薬組成物が、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、および４１ＢＢＬからなる群から選択される生物学的アジュバントとともに投与される、請求項２８に記載の方法。
前記医薬組成物が抗原提示細胞とともに投与される、請求項２８に記載の方法。
前記医薬組成物が樹状細胞またはＢ細胞とともに投与される、請求項２８に記載の方法。
前記医薬組成物が、ホルモン療法、化学療法、外科術、凍結外科術、放射線療法、間質放射線治療、および抗ＨＥＲ２免疫療法からなる群から選択される治療法と併せて投与される、請求項２８に記載の方法。
前立腺癌を治療または予防する方法であって、
（ａ）ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードする単離された核酸を、単独で、または全ＰＳＡ遺伝子配列もしくはその生物学的に活性な部分の一部として含んでなるベクター、
（ｂ）前記（ａ）のベクターを含んでなる宿主細胞、ならびに
（ｃ）ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含んでなるアミノ酸配列
からなる群から選択される少なくとも一種の成分を含んでなる医薬組成物を、前立腺癌を治療するのに十分な量で投与することを含んでなる、方法。
前立腺癌の治療方法をモニタリングする方法であって、
（ａ）被験体由来の生物学的サンプルを、ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードする単離された核酸とともに、その単離された核酸と前記サンプル中の核酸とがハイブリダイズしてハイブリッドを形成し得る条件下でインキュベートし、そして
（ｂ）前記（ａ）で形成されたハイブリッドのレベルを測定し、それにより前記治療方法をモニタリングする
ことを含んでなる、方法。
前立腺癌の治療方法をモニタリングする方法であって、以下の工程を含んでなる方法。
（ａ）治療される被験体由来の生物学的サンプルを、ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択されるアミノ酸配列と結合する抗体とともに、その抗体が前記サンプル中のアミノ酸配列と結合して複合体を形成し得る条件下でインキュベートする工程。
（ｂ）前記（ａ）で形成された複合体のレベルを測定し、それにより前記治療方法をモニタリングする工程。
ＶＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号３）、ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号４）、およびＹＬＳＮＤＶＣＡＱＶ（配列番号５）からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含んでなる単離されたアミノ酸配列のアプタマー。