本発明は、並列逆相カラムを用いたタンパク質、ペプチドおよび核酸用MALDIターゲットの自動調製に関する。
ゲノム解析は生物学的なプロセスの遺伝学的な基礎を進歩させたが、生物学的なプロセスを完全に理解するという点では、ゲノム解析には大きな制限がある。したがって、現時点では、遺伝子配列またはmRNA転写物だけでは生物学的なプロセスを完全に定義または理解することはできないと一般に受け取られている。生物学的なプロセスを完全に理解するには、タンパク質の構造およびダイナミックスが必要になるはずである。ゲノムを補完するタンパク質の研究を一般にプロテオミクスと称する。
同定された遺伝子および特に部分的なcDNA配列によって符号化された生成物の機能は、それらの生成物の生化学的な特性に大きな影響を及ぼし得る(グリコシル化およびリン酸化などの)翻訳後修飾についての情報と同様に未知であることが多い。タンパク質の発現は翻訳後制御の影響下にあることが多く、そのため、細胞レベルのmRNAは、発現レベルのmRNA遺伝子産物と必ずしも相関しない。核酸のランダム配列決定の自動化技術は、科学的な重要性があるとすればどの核酸分子がそれを示すのかを決定する前に、多数の核酸分子の分析を伴う。これらの理由から、タンパク質およびタンパク質消化物の直接的な分析により、生物学的プロセスまたは疾患プロセスにおけるタンパク質発現および翻訳後修飾のパターンを研究することによってゲノムデータを補足することが必要である。
しかし、これまでは、技術的な制約により、生物サンプル中に存在するタンパク質その他の生体分子の、自動化され、コスト効果が高く、再現性がある系統的な分析を行うことが制限されていた。タンパク質などの生体分子の分析は、ほぼ自動化することが求められており、それによって、時間がかかり、労働集約的で高価な効率の低い検出、画像化、精製および分析が回避される。
生物サンプルを分析する最も堅固な方法の1つは、「MALDI−TOF/MS」(マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法)である。一般に、MALDIによるサンプル分析は、分析前にクロマトグラフィ分離を行う必要がなく、高感度の簡単な技術として知られている。現在、MALDIにより、分子量が約500〜5000ドルトンの範囲の値をとるタンパク質消化物ならびに最大100,000ドルトンまでの完全な形のタンパク質からペプチドの質量を精密に測定することができる。サンプルから1組のタンパク質を互いに混合するとき、MALDI−TOF/MSにより単一タンパク質の消化物を分析して、そのタンパク質を同定するペプチドマスフィンガープリンティング(PMF)を生成することができるが、PMFによってこのような1組のタンパク質を検出すると、PMFによって同定を行うというさらなる挑戦課題が与えられる。このようなタンパク質消化物は、個々のペプチドを断片化して、その後、そのペプチドの元となったタンパク質の配列決定および同定を行うことができるMALDI−MS/MS装置で分析することもできる。
質量分析法の中でも特にMALDIに伴う現在の検出限界は、小さなターゲット領域上にサンプルを濃縮させることに依存している。遺憾ながら、MALDIターゲット上にサンプルを濃縮する現在の方法は、ピペットチップなど、その先端に結合し約0.5μlの体積を占める樹脂を含む実験室用具、例えばZipTip(商標)(米国マサチューセッツ州Bedford所在のMillipore社)を使用することを含む。ZipTipを用いて移すこの方法は、レジンベッド表面に吸着するサンプル材料の差損失があり、そのため、この方法は、回収率が悪いことが問題であるタンパク質消化物用には実用的ではない。
現在、MALDIによる生物サンプルの分析は、マトリックス材料と混合したサンプルを手作業で、または自動的に調製する必要がある主にオフライン技術のプロセスである。このオフライン調製は、かなりの専門知識と、それに対応したかなりの時間とを必要とする。このプロセスは、液体ハンドリングロボットおよびZipTipを使用することによって、あるいは、ある種の脱塩カラムから溶離液を脱溶媒するシステムを使用することによって自動化することができる。後者の場合、このオフラインプロセスを自動化しようとしたこれまでの試みは、技術的な制約に直面した。
Karger他の米国特許第6,175,112号には、飛行時間型質量分析計に液体サンプルをオンラインで連続して直接導入する万能型インターフェースが記載されている。遺憾ながら、自動化を行って、スループットおよびMALDI−TOF質量分析法の有用性を向上させようとするこの試みには、いくつかの欠点がある。Kargerの装置の溶離液流量は、毎分約300ナノリットル未満に制限され、したがって、ポストカラム分離を行わずに、キャピラリ型液体クロマトグラフィなどの大規模なクロマトグラフィに対応することができない。さらに、石英ガラスチップの液体接合部は詰まり易く、この石英チップを頻繁に交換する必要がある。さらに、Kargerの構成は、液体接合部および真空チャンバにマトリックスを流すための別の補助ポンプを必要とする。
一般に、MALDIによるサンプルの分析は、分析前にクロマトグラフィ分離を行う必要がなく、高感度であり、不純物に対して比較的に不寛容である簡単な技術として知られている。対照的に、エレクトロスプレイなどの他の技術は、しばしば、分析前にクロマトグラフィ分離の利点を利用する必要がある。本発明のシステムおよび方法では、並列カラム脱塩法を用いて、逆相高圧液体クロマトグラフィ(「RP HPLC」)による溶離液をMALDIターゲット上に連続的に被着させることにより、この潜在的な利点をMALDIに利用する。本発明の方法により、分析物をあらかじめ濃縮し、分析物から妨げとなる汚染物質を分離することによってMALDIの感度を高くすることができる。サンプル材料を並列に処理することから得られる別の利点は、手作業の方法よりもスループットが高くなることである。サンプルの被着を自動化すると、MALDIターゲット上でクロマトグラフィ溶離液を適切なタイミングで凍結することができ、それを保管して後で他の技術によって分析することができる。
本発明の方法により、逆相HPLCによるペプチド分離からの溶離液を並列処理し、(αCHCAマトリックスをあらかじめ被覆した)MALDIサンプルプレート上に連続的に被着させることができる。これらのペプチドは、トリプシンでタンパク質混合物を消化させることによって得られる。このタンパク質混合物は、分離の長さおよびMALDI−TOF/MS法またはMALDI−MS/MS法のいずれを用いるかに応じて標準タンパク質から数百というタンパク質まで複雑さが変化する。
次いで、複数のRP HPLCカラムによる自動化並列処理によってすべての消化物を分離する。溶離液およびペプチドはこれらのRP HPLCカラムから回収され、加熱かつ同軸ネブライザガスの使用によって溶媒をほぼ取り除かれながら、MALDIターゲット上に被着される。次いで、MALDI−TOF MSおよびMALDI−MS/MSを用いて、これらのターゲットを分析する。本発明の範囲内で、当技術分野で知られている他の検出方法を利用できることが企図されている。
本発明の方法によって生成されたペプチドマスマップおよびペプチド配列決定情報を用いて、そのタンパク質が何であるかを決定する。RP HPLCによるペプチド分離によって生成されたサンプルを並列処理し、MALDIターゲットプレート上に連続的に被着させる本発明の自動化方法により、スループットをより高くすることができる。さらに、並列カラム内で分離を行うと、本発明の方法により、従来技術のスポッティング法に比べて、1つの混合物から同定することができるタンパク質の配列カバー率(coverage)およびダイナミックレンジの点で、ペプチドマスマッピングのカバー率が改善される。
本発明の上記のおよびその他の特徴および利点は、例示の実施形態の以下の詳細な説明を添付の図面と併せ読めばより詳細に理解されよう。
本発明は、MALDIターゲット上への生物サンプルの濃縮、脱塩および被着を並列に行う斬新な機器および方法を提供する。このように生物サンプルの被着を行うと、スループットおよび信頼性が既存の方法よりも高くなる。
図1に、MALDIターゲット上に生物サンプルを被着させる本発明のシステムおよび方法の全体概略図を示す。図1に移ると、このシステムは従来型のグラジエントシステムを含む。この実施形態の例のグラジエントシステムは、第1ポンプ103、第2ポンプ105および第3ポンプ107を備える。これらのポンプ103、105および107は、独立した往復型シリンジポンプである。この実施形態の例では、これらのポンプ103、105、107は、CapLC(商標)(米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社)の補助モードで構成される。本発明の範囲内で、Allianceシステム(米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社)などで使用される当技術分野で知られている他のポンプを使用できることが企図されている。第1ポンプ103および第2ポンプ105は、グラジエントポンプシステム101を含む。このグラジエントポンプシステム101は、本発明のシステム内で分離カラムまたはトラップカラム中に溶媒を送達する。これらのポンプ103および105は、共通混合ティー109に流体連通する。
グラジエントポンプ輸送システム101は、第1ポンプ103によって第1溶媒をポンプ輸送し、第2ポンプ105によって第2溶媒をポンプ輸送する。本発明の範囲内で企図されている溶媒は、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸などクロマトグラフィ分離用に当技術分野で知られているものである。共通混合ティー109は、10ポート切替バルブ111に流体連通する。この実施形態の例では、10ポート切替バルブ111は、(米国テキサス州ヒューストン所在の)Valco社から一般に入手可能なバルブである。本発明の範囲内で、米国カリフォルニア州Rohnert Park所在のRynodene,L.P.社から入手可能なRheodyneバルブなど他のマルチポート切替バルブを使用することができることも企図されている。本発明の範囲内で、当技術分野で知られているポート数が10個よりも多いか、あるいは10個よりも少ない他のマルチポートバルブを使用することもできるし、複数のマルチポート切替バルブを使用できることが企図されている。
マルチポート切替バルブ111により、サンプルを並列処理することができる。この10ポート切替バルブ111よりも数が多いマルチポートバルブを使用することによって、並列処理数を増やせることが当業者には理解されよう。複数のポート切替バルブを一列に並べて使用しポート数をより多くすると、カラム、溶媒送達システム、オートサンプラおよび検出器などのコンポーネントを追加することができる。10ポート切替バルブ111は、補助アイソクラティックポンプ122に流体連通する。補助ポンプ122は、第3ポンプ107を使用して、自動サンプル注入器113から10ポート切替バルブ111にサンプルをポンプ輸送する。グラジエントシステム内の第3ポンプ107は、単一シリンジ型ポンプであるCapLC(Waters社)である。本発明の範囲内で、対応する追加のポンプとともに2つ以上のオートサンプラを使用してサンプルを送達できることが企図されている。自動サンプル注入器113は、10ポート切替バルブ111に流体連通する。
10ポート切替バルブ111は、第1カラム115および第2カラム117に流体連通する。この実施形態の例では、カラム115、117は、米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社のSymmetry300(商標)C18 5um OPTI−PAK(商標)トラップカラムである。これらのトラップカラム115、117は、分析前にサンプルの濃縮および脱塩を行うことができる逆相カラムである。本発明の範囲内で、米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社のXterraまたはAtlantisカラムなど当技術分野で知られている他の逆相クロマトグラフィカラムを使用できることが企図されている。さらに、イオン交換またはサイズ排除など他のクロマトグラフィカラムを使用して、この多次元分離システムの能力を増すことができることも企図されている。
第1カラム115および第2カラム117を10ポート切替バルブ111に接続すると、本発明のシステム内で複数のサンプルの並列処理を行うことができる。
図1に示す第1実施形態の例では、サンプルの並列処理は、10ポート切替バルブ111が第1位置にある間に、第1サンプルを第1カラムから溶離し、米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社のLC−MALDIprep(商標)などの被着モジュール120に送達するのと同時に、オートサンプラ113から第2カラム117中に第2サンプルを注入することによって実現される。図2に移ると、10ポートバルブ111を第2位置にすることによって、サンプルを並列処理する様子がさらに示されている。10ポート切替バルブ111内のポート間の実線は、これらのポート間の流体接続部を示す。
図2に示す第2位置では、グラジエントシステム101から第2カラム117を介して50容量パーセント(容量/容量)の固定した割合のアセトニトリルで溶媒をポンプ輸送することによって、第2カラム117から第2サンプルが溶離される。第2サンプルは、第2カラム117から被着モジュール120に溶離される。第2位置では、10ポートバルブ111により、サンプルを水性溶媒中で平衡にした後で、それを第1カラム115に送達することができる。10ポート切替バルブ111のこの第1および第2位置により、サンプルの並列処理を行うことができる。この並列処理により、第2カラムが前に受け取ったサンプルの濃縮および脱塩を行う間に、第1カラムは、サンプルを受け取る前に適切な溶媒でカラムを洗い流すことによって準備を行うことができる。
それぞれのカラム115、117がサンプルを受け取ると、サンプルの濃縮および脱塩が行われる。次いで、このサンプルは溶離され、被着モジュール120に送達される。図3に示すように、本発明のシステムでは、被着モジュール120はネブライザ300である。このネブライザは、金属ブロック301で形成される。金属ブロック301は、入口ポート302および出口ポート303を有する。入口ポート302は、金属ブロック301中のキャビティ306内でコイル状に巻かれた長さ約30cm、内径(i.d.)100umのコイル状キャピラリチューブ304に接続される。このキャピラリチューブは、内径約10um〜500umの範囲の値を取り得る。長さは、約5cm〜60cmの範囲の値を取り得る。このチューブは、ステンレス鋼または石英ガラスで作製することができる。本発明の範囲内で、生体適合性があり、システムの溶媒に不活性である他の代替キャピラリチューブを使用できることが企図されている。この代替キャピラリチューブは、チタンなどの材料で製作することができる。
コイル状のキャピラリチューブ304は、第1端部306および第2端部308を有する。第1端部306は入口ポート302に接続される。第2端部308は出口ポート303に接続される。出口ポート303は、吹付けノズル312に接続される。金属ブロック301は、電気抵抗式加熱素子によって金属ブロック301を加熱するプログラム可能なブロックヒータ314を有する。本発明の範囲内で、ペルチェ加熱ポンプなど当技術分野で知られている他の方法を用いて、金属ブロック301を加熱できることが企図されている。
ネブライザ300は、金属ブロック301の温度を監視する温度コントローラ316を有する。ネブライザ300は、金属ブロック301内にガス入口ポート311を有する。ガス入口ポート311は、キャビティ306に接続される。このガス入口ポートは、シースガス余熱器317を備えたシースガス供給ライン312に接続される。本発明のネブライザ300は、上記で論じたように、カラムから溶離されるサンプル材料を受け取る。これらのサンプル材料は約20℃から150℃のある特定の温度に加熱され、それによってサンプル材料が気化する。この気化した材料は、窒素などの非反応性ガスのシースで覆われる。本発明の範囲内で、ヘリウム、アルゴンなど当技術分野で知られている他の非反応性ガスを使用できることが企図されている。この非反応性ガスが、気化したサンプル材料を閉じこめ、それを浮遊させて運び(entrain)、サンプル中に残った溶媒を気化させる助けとなり、それによってかなりの量の溶媒が気化した後で、この気化したサンプルがMALDIターゲット表面322上に被着される。
本発明では、微量の溶媒がサンプル材料中に残り、それによって、MALDIマトリックスを被覆することができるMALDIターゲット表面322内で、サンプル材料が溶解し得ることが望ましい。本発明のネブライザ300は、プログラム可能なヒータ314を使用してサンプルを気化させ、それを、導電箔上のMALDIマトリックスとすることができるMALDIターゲット表面322上で連続ストリップ状に被着させる。本発明のネブライザ300は、Prevost他の特許である米国特許第5,772,964号にさらに記載されている。この教示全体を参照により本明細書に組み込む。
この気化したサンプル材料を、この第1実施形態の例ではWaters社のLC−MALDIprep(商標)TargetsであるMALDIターゲット表面322上に被着させる。本発明の範囲内で、スピンコートしたMALDIマトリックス、加工されていないステンレス鋼、DIOS表面、乾燥液滴法、薄層法など当技術分野で知られている他のMALDIターゲットおよび調製方法を利用できることが企図されている。
MALDIターゲット322は、プレートホルダを使用することによって、プログラム可能な移動プラテン324の縁部に重ねられる。このコンピュータによりプログラム可能な移動プラテン324は、MALDIターゲット322上のサンプル材料の効率的に検索可能な(retrievable)配置をたどるように制御され、それによって分析が行われる。このサンプル材料は、ネブライザ300によってMALDIターゲット322上で連続したストリップ状に吹き付けられて、その後、MALDI質量分析計による検索可能な分析にかけられる。
例示の実施形態では、データプロセッサは、インテルのPentium(登録商標)を搭載し、かつマイクロソフトのWindows(登録商標)XPまたはWindows(登録商標) NTが動作するパーソナルコンピュータなどの汎用コンピュータである。本発明の範囲内で、当技術分野で知られている他のプロセッサを使用できることが企図されている。
処理および制御アプリケーションソフトウエアは、米国マサチューセッツ州Milford所在のWaters社が生産するMassLynx(登録商標)またはスタンドアローンのLC−MALDIprepソフトウエアである。図4に示すように、MassLynx(登録商標)は、3つの主要なコンポーネントを含む。主制御部410は、ユーザインターフェース412およびMassLynxクロマトグラフィ主制御部414と通信する。ユーザインターフェース412は、確実に正確なサンプル被着を行うなどの診断目的で主制御部410を使用する。主制御部410は、制御モジュールに方法データを送る。本発明では、制御モジュールは、移動制御部416および温度制御部418を含む。ネブライザおよび移動可能なプラテン内の移動および温度コントローラは、制御モジュールとの間に別個の通信ラインを有する。この制御ソフトウエアにより、クロマトグラフィ作業者は装置を制御し、サンプル材料を取得し、それをMALDIターゲット上に被着させることができる。この制御ソフトウエアにより、クロマトグラフィ作業者は、これらのMALDIターゲットサンプルを処理し、サンプル材料の位置の記憶、検索および表示を行うこともできる。
もう1つのコンポーネントは、これらのデータからの情報を処理し抽出し、それを報告書に提示するアプリケーションソフトウエアである。報告書生成機能により、ユーザは、報告書を生成し、管理し、印刷することができる。グラフィカルユーザインターフェース(GUI)により、ユーザは、モニタからこれらすべてのサブシステムおよびコンポーネントと対話することができる。本発明の実施形態の例は、MassLynx(登録商標)のデータ処理コンポーネント内で実施されている。
MALDIターゲット上に被着させたいくつかのタンパク質消化物を用いて、本発明の方法の性能を試験した。2つのサンプルを用いて、特に本発明のオフライン並列処理方法によって、MALDIスペクトルの再現性を示した。使用した2つのサンプルは、ミオグロビンおよびグリセルアルデヒド−3−PO4−デヒドロゲナーゼのトリプシンによる消化物とした。本発明の方法に従ってこれらのサンプルを並列処理し、これら2つのサンプルの逆相HPLCによるペプチド溶離からの溶離液を、(αCHCAマトリックスをあらかじめ被覆した)MALDIサンプルプレート上で連続的に被着させた。この結果を図5に示す。ミオグロビン501を含むサンプルおよびグリセルアルデヒド−3−PO4−デヒドロゲナーゼ502を含むサンプルを並列処理して、MALDI質量スペクトル応答の良好な再現性が示された。
図6Aおよび図6Bに移ると、これら2つのサンプルの質量分析計による分析が示されている。図6Bに、ミオグロビン消化物のスペクトル分析を示し、図6Aに、G3PDH消化物のスペクトル分析を示す。
本発明の実施形態の例では、並列に操作される2つのクロマトグラフィカラムを用いているが、切替バルブ内にポートを追加すると、追加の複数のクロマトグラフィカラムを使用できることが当業者には理解されよう。同様に、追加のクロマトグラフィカラムを用いることにより、追加の複数のクロマトグラフィカラムとともに追加の複数の溶媒送達システムおよびオートサンプラを用いて、実施形態の例よりもさらにスループットが高い並列処理を実現することができることも理解されたい。
本発明の実施形態の例では、あらかじめ被覆したMALDIマトリックスターゲットを使用しているが、当技術分野で知られている他のターゲット基板を使用できることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例では、MALDIイオン化法を用いているが、MALDIイオントラップ、MALDI Q−TOF、MALDI TOF TOFなど当技術分野で知られている他の検出方法を利用できることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例では、MALDIターゲットおよび検出方法を使用しているが、シリコーン上脱離イオン化(DIOS)など他のターゲットおよび検出方法を利用できることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例では、2つのクロマトグラフィカラムを並列に使用しているが、並列カラムのスループットを高くするには、各並列構成内で直列に配列された複数のカラムを使用して、さらにスループットを高くできることが当業者には理解されよう。
実施形態の例では、MALDIマトリックス上にサンプルを被着させるが、噴霧化される(nebulized)サンプルがMALDIマトリックス材料を含む場合、MALDIマトリックス材料と、噴霧化する前の、カラムの下流側からの検出物を混合できることが当業者には理解されよう。
実施形態の例の各要素は、互いに流体連通するように説明されるが、このような連通は、このような要素間の直接的または間接的な接続部により得られることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例に関連して本発明を示し説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらの実施形態の中で本発明の形態および細部に他の様々な変更、割愛および追加を加えることができる。
本発明の10ポートバルブ構成を、(第1位置で)消化物の脱塩処理を並列に行うことができる2つのトラップカラムとともに示す概略図である。
本発明の10ポートバルブ構成を、(第2位置で)消化物の脱塩処理を並列に行うことができる2つのトラップカラムとともに示す概略図である。
MALDIターゲット上にサンプルを被着させるための、本発明のシステムで用いるネブライザを示す図である。
本発明のプログラム可能な制御システムを示す概略図である。
第1および第2カラムからの検出器応答の再現性を示すグラフである。
第1カラムおよび第2カラムからのサンプルの質量分析計を示すグラフである。
第1カラムおよび第2カラムからのサンプルの質量分析計を示すグラフである。