JP2005507008A - Use of a tissue factor agonist or tissue factor antagonist for the treatment of symptoms associated with apoptosis - Google Patents

Abstract

The present invention relates to FVII and / or FVIIa and / or another TF agonist, and / or FVIIai and / or another for therapeutic treatment of pathological conditions in which increased or decreased cellular apoptosis is required. Of TF antagonists.

Description

本明細書に使用されるものとして、「TFアンタゴニスト」の用語は、実施例3に記載されているアポトーシスアッセイ法で決定されるものとして、細胞群のアポトーシスを減少または阻害することなくTFに対して直接結合する任意の化合物（たとえばFVIIai）を意味することが企図される。本発明の1つの態様において、TFアンタゴニストは、ヒトTFに対する抗体である。1つの態様において、抗体は、ヒト抗体である。さらなる態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる態様において、抗体は、Fab断片、F（ab）₂断片、F（ab'）₂断片、または単鎖Fv断片である。
【００１７】
この文脈において、「治療」の用語は、有害な症状を防止すること、および症状を阻害する、または最小にする目的ですでに生じている症状を調節することの両方を含むことを意味する。したがって、FVIIaもしくは別のTFアゴニスト、またはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストの予防的投与は、「治療」の用語に含まれる。この文脈において、「患者」の用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類としても定義される。「被検体」の用語は、「患者」と交換可能に使用される。
【００１８】
治療されるであろう症状は、たとえば、種々の癌、種々の退行性の神経疾患や、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症を含む神経病理などの病的状態含む病状を含む。皮膚および小腸などの組織では、生物の生涯の間に絶えず代謝回転しており、これらの組織を形成する細胞は、生物の生涯を通じてプログラム細胞死を受ける。通常、このプロセスは、厳密に調節されており、細胞分裂のために産生される細胞数は、プログラム細胞死を受ける細胞数と釣り合う。しかし、プログラム細胞死の調節は、多くの経路を含む複雑なプロセスであり、時には、プログラム細胞死の調節に欠陥が生じる。組織における細胞数を不変に維持する際の、または生物の発生の間に適切な細胞を維持する際の、このプロセスの重要な役割を考えると、プログラム細胞死の欠陥は、病的な症状を伴うことが多い。生物におけるプログラム細胞死の異常な調節によって、種々の疾病状態が生じる。たとえば、組織におけるアポトーシスのレベルの減少を生じる欠陥は、組織において不変に維持するために必要とされる正常なレベルと比較して、組織において細胞数の増大を生じ得る。細胞数を増大するこのような機構は、種々の癌において同定されており、腫瘍の形成は、癌細胞がこれらの正常な対応物よりも必然的に急速に分裂するためだけでなく、該細胞が、これらの通常の速度で死なないために生じる。癌と比較して、細胞がアポトーシスを受ける可能性が減少している場合、種々の病態が通常量よりも多くのアポトーシを受けている細胞を含む組織と関連している。たとえば、アポトーシスのレベルの増大は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症を含む種々の神経病理を伴う。神経細胞は、一般に成体では分離しないので、したがって、死んだ細胞の変わりに新たな細胞を利用できず、このような疾患において生じる神経細胞死は、該疾患を患っている患者の症状を次第に悪化させる。正常よりも高いアポトーシスレベルに関与するその他の症状は、TFアゴニストで治療されてもよく、筋障害および筋ジストロフィー、糸球体硬化症、メンケベルク中動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性肝炎、血色素症およびウィルソン病、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、種々の病因による急性肝不全、胆管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、並びに化学療法剤の使用に関連するアポトーシスを含む。
【００１９】
第1の側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを減少または阻害するための方法であって、組織因子アゴニストと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。1つの態様において、細胞は、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞、造血性の細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および内皮細胞を含む組織因子を発現するヒト細胞である。
【００２０】
第2の側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを誘導または増強するための方法であって、組織因子アンタゴニストと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。1つの態様において、細胞は、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞、造血性の細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および内皮細胞を含む組織因子を発現するヒト細胞である。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの阻害または減少により、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、VIIa因子もしくはVII因子または別の組織因子アゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を個体に投与することを含む方法に関する。本発明の1つの態様において、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる症状は、神経変性疾患である。本発明のさらなる態様において、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる疾患または症状は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症、筋障害および筋ジストロフィー、糸球体硬化症、メンケベルク中動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性肝炎、血色素症およびウィルソン病、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、種々の病因による急性肝不全、胆管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アポトーシスで誘導される毛の減少、並びに化学療法剤の使用に関連するアポトーシスからなる群より選択される。1つの態様において、化学療法剤の使用に関連するアポトーシスにより、毛の減少を生じる。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの誘導または増強により、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、組織因子アンタゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を個体に投与することを含む方法に関する。本発明の1つの態様において、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる疾患または症状は、原発腫瘍増殖、腫瘍の浸潤、転移、乾癬、自己免疫疾患、および再狭窄からなる群より選択される。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、細胞群における望まれないアポトーシスに関連した疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アゴニストの使用に関する
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの誘導または増強が望まれる疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アンタゴニストの使用に関する。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを調節する方法であって、前記細胞を組織因子アゴニストと接触させること、または前記細胞を組織因子アンタゴニストと接触させることのいずれかの工程を含む方法に関する。
【００２５】
本発明の1つの態様において、組織因子アゴニストは、FVIIまたはFVIIaである。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、組織因子アンタゴニストは、修飾されたFVIIである。1つの態様において、修飾されたVII因子は、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-PhePro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびダンシル-D-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンによって修飾されたVII因子から選択される。
【００２７】
もう一つの側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスを調節する薬物候補を検出する方法であって、該方法は：
a）TF発現細胞を培養すること;
b）細胞群のアポトーシスを測定すること;
c）候補薬と細胞をインキュベートすること、および
d）インキュベートした細胞のアポトーシスを測定し、工程bにおいて測定したアポトーシスのレベルと比較して、アポトーシスのレベルのあらゆる変化を決定すること、
を含み、このような変化は、前記細胞において生物学的に活性な候補薬の指標である方法に関する。
【００２８】
「TF発現細胞」の用語は、TFを発現する任意の哺乳類細胞を意味する。
【００２９】
「候補薬」の用語は、細胞系において、生物学的な機能を有するか、または生物学的な効果を及ぼす任意の試料を示すことが企図される。試料は、微生物または植物の抽出物などの生物物質の試料であってもよく、または有機合成または遺伝学的技術によって調製された化合物もしくは化合物の混合物を含む試料であってもよい。
【００３０】
さらなる側面において、本発明は、アポトーシスから細胞を保護のための組織因子の使用に関する。本発明の発明者によって開示された実験から分かるように、TF発現細胞のみが、アポトーシスから保護されている。したがって、さらなる側面において、本発明は、組換えタンパク質を産生する方法であって、該方法は：
a）TFをコードするポリヌクレオチド構築物を細胞にトランスフェクションすること;
b）産生される組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を同じ細胞にトランスフェクションすること;
c）ポリヌクレオチド構築物を発現することができる条件下において、適切な増殖培地液中で細胞を培養し、生じるポリペプチドを培地から回収することを含む方法に関する。
【００３１】
本発明の1つの態様において、産生される組換えタンパク質は、ヒトFVIIである。さらなる態様において、適切な細胞増殖培地は、FVIIaを含む。
【００３２】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスを減少のまたは抑制するための方法であって、活性化された凝固因子と前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの減少のまたは抑制のための方法であって、トロンビンまたは凝固因子Xaと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３４】
さらなる側面において、本発明は、細胞群においてアポトーシスを誘導または増強するための方法であって、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤と前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３５】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの阻害または減少により、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、トロンビンまたは凝固因子Xaを含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法に関する。
【００３６】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの誘導または増強により、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤を含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法に関する。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、細胞群における望まれないアポトーシスに関連した疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、トロンビンまたは凝固因子Xaの使用に関する。
【００３８】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの誘導もしくは増強が望まれる疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤の使用に関する。
【００３９】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを調節する方法であって、前記細胞をトロンビンもしくは凝固因子Xaと接触させること、または前記細胞をトロンビン阻害剤もしくは凝固因子Xa阻害剤と接触させることのいずれかの工程を含む方法に関する。
【００４０】
本発明の1つの態様において、トロンビン阻害剤は、ヒルジンである。本発明のもう１つの態様において、凝固因子Xa阻害剤は、ダニ抗凝固タンパク質（Tick Anticoagulant Protein：TAP）である。特定の態様において、ダニ抗凝固タンパク質は、組換えヒトタンパク質である。
【００４１】
略語：
TF 組織因子
FVII VII因子の単鎖、不活性化形態
FVIIa VII因子の活性化形態
rFVIIa 組換えVII因子の活性化形態
FVIIa 修飾された（不活性型）VII因子
FFR-FVIIai D-Phe-L-Phe-L-Argクロロメチルケトンによって不活性化された因子FVII
組織因子（TF）は、因子FVIIa（FVIIa）の細胞受容体であり、該複合体は、血液凝固の主要な発動因子である。我々は、多量のTFを発現する細胞における細胞アポトーシスに対する、FVIIaのTFへの結合の効果を研究した。FVIIaとインキュベートしたTF発現細胞は、アポトーシスにより感受性でなくなることが示される。
【００４２】
以下において、我々は、FVIIaのTFへの結合と、細胞のアポトーシスとの間の明白な関係を初めて示す。我々は、TF発現細胞のFVIIa刺激が、細胞群におけるアポトーシスの減少または阻害を引き起こすというデータを示す。さらに、活性部位が阻害されたFVIIa（FFR-FVIIa）は、細胞群においてアポトーシスを誘導または増強することを示する。TFは、血管の周膜の、並びに肝臓、脾臓、および腎臓の線維性莢膜の間質性線維芽細胞などの多くの血管外細胞に恒常的に発現されている。したがって、TFの発現は、循環している血液から物理的に離れた部位において見いだされ、止血性エンベロープを提供する。傷害の際には、この障壁が出血から生物を保護すると考えられる。しかし、TFは、サイトカインおよび成長因子を含む種々の薬剤によって、単球/マクロファージ、血管平滑筋細胞、内皮細胞において、および多くの腫瘍細胞において誘導することができる。刺激後に、転写レベルでの誘導が迅速に生じ、TFは、増殖関連の前初期遺伝子として同定される。
【００４３】
活性部位が阻害されたFVIIaは、アポトーシスからの保護を誘発しなかったので、TFに対して結合することだけでなく、TF/FVIIaの触媒活性も、必須のようである。TAPおよびヒルジンは、アポトーシス・アッセイ法においてFVIIaの効果を消失させなかったので、我々はFXaまたはトロンビンにより、FVIIaによるアポトーシスからの保護が生じることを除外した。FVIIaの抗アポトーシスの効果の用量反応を、TFをトランスフェクトしたBHK細胞において判断した。
【００４４】
本明細書において言及したFVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストで治療するどの患者のための療法も、当業者によって決定されるべきである。治療において投与される１日量は、医師が決定することができ、使用される特定の化合物に、投与の経路に、および患者の重量および症状に依存する。有効な量は、最適には、約5μg/kg/日〜約500μg/kg/日、好ましくは約10μg/kg/日〜約300μg/kg/日、より好ましくは、約15μg/kg/日〜約200μg/kg/日、もっとも好ましくは、約20μg/kg/日〜約100μg/kg/日の1日用量である。
【００４５】
FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、1回の単一用量で投与されるべきであるが、与えられる用量および患者の症状に依存して、好ましくは4〜6〜12時間の間隔で多回投与で与えることもできる。
【００４６】
特定の態様において、有効な量は、約5μg/kg/日〜約500μg/kg/日のFVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストの1日用量である。
【００４７】
FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、静脈内に投与されてもよく、または持続性もしくは拍動性の注射によって投与されてもよく、またはたとえば直接腫瘍に注入するなど、関連した部位に直接投与されてもよい。FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、好ましくは静脈内注射によって、かつ約100〜100,000単位／kg体重の量で、および好ましくは約5〜500μg/kgに対応する約250〜25,000単位／kg体重の量で、24時間あた2〜4回繰り返さなければならない用量によって投与される。
【００４８】
本発明に従って使用することができる薬学的組成物を調製するための従来技術は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences, 1985に記載されている。
【００４９】
本発明に従って使用される組成物は、当業者に既知の方法によって調製される。
【００５０】
手短に言えば、本発明に従って使用するために適した薬学的標品は、FVII、FVIIaもしくは別のTFアゴニスト、またはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストを、好ましくは精製した形態で、適切なアジュバントおよび適切なキャリアまたは希釈液と混合することによって作成される。適切な生理学的に許容されるキャリアまたは希釈液は、滅菌水および塩類溶液を含む。この点に関しては、適切なアジュバントは、精製したVIIa因子を安定化するためのカルシウム、タンパク質（たとえばアルブミン）、またはその他の非活性のペプチド（たとえばグリシルグリシン）もしくはアミノ酸（たとえばグリシンまたはヒスチジン）を含む。その他の生理学的に許容されるアジュバントは、非還元糖、多価アルコール（たとえばソルビトール、マンニトール、またはグリセリン）、低分子量のデキストリンなどの多糖体、界面活性剤（たとえばポリソルベート）、および抗酸化物（たとえば亜硫酸水素塩およびアスコルビン酸塩）である。アジュバントは、一般に、0.001〜4%w/vの濃度で存在する。また、本製剤は、プロテアーゼ阻害剤、たとえばアプロチニン、および保存剤を含んでいてもよい。
【００５１】
本標品は、たとえば細菌保持フィルターを通して濾過することによって、組成物に殺菌剤を組み込むことによって、組成物に照射することによって、または組成物を加熱することによって殺菌されていてもよい。また、これらは、無菌の固体組成物の形態で製造することもでき、使用の前または直前に、これを滅菌水またはその他の注射に適した無菌培地に溶解することができる。
【００５２】
本発明は、実施例によってさらに例証されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。前述の記述において、および以下の実施例において開示された特徴は、両方とも別々に、およびそのいかなる組み合わせにもおいても、本発明のその多様な形態を理解するための材料である。
【実施例】
【００５３】
実施例1
FVII の調製
本発明に使用するために適したヒト精製VIIa因子は、たとえばHagenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986に記載されているように、または欧州特許番号第200.421号（ZymoGenetics）に記載されているように、好ましくはDNA組換技術によって作成される。組換技術によって産生されるVIIa因子は、真のVIIa因子またはこのようなVIIa因子が実質的に真のVIIa因子と同じ血液凝固の生物活性を有することを条件として、多少修飾されたVIIa因子であってもよい。このような修飾されたVIIa因子は、周知の手段、たとえば部位特異的突然変異により天然のFVIIをコードする核酸において、アミノ酸コドンを変えることによって、またはのいくつかのアミノ酸コドンを除去することによってVII因子をコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。
【００５４】
また、VII因子は、Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 （4）: 1242-1247,1980並びにHedner and Kisiel, J. Clin. lnvest. 71: 1836-1841, 1983に記載されている方法によって産生されてもよい。これらの方法では、検出可能な量のその他の血液凝固因子を伴わずにVII因子を産生する。さらに精製VII因子標品は、最終的な精製工程としてさらなるゲル濾過を含むことによって得てもよい。次いで、既知の手段によって、たとえばBjoernら（Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564- 565）によって記載されているように、因子XIIa、IXa、またはXaなどのいくつかの異なる血漿タンパク質によって、VII因子を活性化されたFVIIaに変換し、VII因子をMono Q（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより、活性化してもよい。
【００５５】
実施例2
FVIIai の調製
本発明における使用に適した修飾VII因子は、たとえば国際公開番号第92/15686号、94/27631号,96/12800号、および97/47651号（ZymoGenet-ics/NovoNordisk）に記載されたとおりに作成される。
【００５６】
実施例3
BHK（+TF）およびBHK wt細胞の生存に対するFVIIaの効果を調査するために、24時間および48時間の血清枯渇によって細胞にアポトーシスを誘導した。アポトーシスは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端ラベリング（TUNEL）後に、フローサイトメトリーによって検出した。アポトーシスの後期段階のうちの1つは、アポトーシスのプログラムの間にエンドヌクレアーゼの活性化によって生じるプロセスであるDNA断片化である。ヌクレアーゼが高次染色質構造を約300kbの断片に分解し、その後に約50塩基対の長さのより小さなDNA部分に分解する。TUNELアッセイ法（PharmingenからのAPO-BRDU）では、TdTが、パラホルムアルデヒドおよびエタノールで固定した細胞において、2本鎖および1本鎖DNAの3'ヒドロキシル末端に対する臭素化されたデオキシウリジントリホスフェート（Br-dUTP）の鋳型非依存的な付加を触媒する。取り込み後、FITCラベルした抗BrdU mAbで細胞を染色することによって、フローサイトメトリー法によりこれらの部位を同定する。細胞周期の進行については、最終工程で細胞をヨウ化プロピジウム（PI）でラベルする。
【００５７】
Thim, L.ら、Biochem 27: 7785-7793,1988に記載されているように、タンパク質−ヒト組換えFVIIおよびFVIIaを発現させて精製した。
【００５８】
FVIIaiは、Sorensen B. B.ら、J. Biol. Chem. 272: 11863-11868,1997によって前述されているように、D-Phe-L-Phe-L-Argクロロメチルケトン（FFR-FVIIa）でFVIIaの活性部位をブロッキングすることによって得た。
【００５９】
トロンビンは、酵素調査研究室（Enzyme Research Lab）からのものである。特異的なトロンビン阻害剤ヒルジンは、Sigma-Aldrichから購入してもよく、特異的なFXa阻害剤の組換えTAP（Tick抗凝固タンパク質）は、G.P.Vlasuk博士、Corvas（SanDiego,CA）によって親切に提供された。細胞培養−ベビー・ハムスター腎臓細胞株BHK-21tk-ts13（ATCC CRL 1632）は、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾さイーグル培地において培養した。全ての細胞株は、T80またはT175フラスコ中で培養し、単一の10cmの培養皿（78cm²）において二次培養した。
【００６０】
TFでのBHK細胞のトランスフェクション−完全ヒトTF cDNAを哺乳類Zem219b発現ベクターにクローン化した。BHK細胞には、リン酸カルシウム共沈の標準的な技術を使用して、TF発現プラスミドをトランスフェクトした。安定に構築物が組み込まれた細胞を1μMメトトレキセートによって選択した。
【００６１】
実験：
細胞を10%のFCS、100 IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（DMEM+/+）を補ったDMEMにまいた（800.000細胞/ディッシュ）。2日後に、細胞は約80%コンフルエントであり、血清枯渇の準備ができていた。細胞をDMEM-/-培地（正しいpH安定化および温度にするために、使用前にDMEM-/-を一晩インキュベータに入れたままにしておいた）で2回洗浄し、最終的な洗浄後に、細胞を6mlのDMEM-/-および示された化合物と共に、24時間および／または48時放置した。インキュベーション期間終了後、付着細胞をトリプシン処理して培地中のゆるんだ細胞をプールして、5分間300×gで遠心した。細胞をPBSで洗浄後、1%パラホルムアルデヒドのPBS溶液において氷中で15分間固定した。その後、PBS中で洗浄して500μlのPBSに再懸濁した後に、5mlの70%エタノールを添加した。細胞懸濁液を-20℃において少なくとも18時間放置した後、製造者の手順に従ってTUNELアッセイ法によって解析した（PharmingenからのApo-BRDU）。
【００６２】
結果：
BHK（+TF）およびBHK wt細胞におけるFVIIaの抗アポトーシスの効果の用量反応。BHK（+TF）細胞において、24時間または48時間の血清枯渇によってアポトーシスが誘導され、アポトーシス細胞が、TUNEL染色およびフローサイトメトリーによって検出された。結果は、対数x-スケールに対してFITCラベルしたDNA破壊（FITC-dUTP）（x軸の値が右へ移動するほど、細胞におけるDNA破壊が多い）として表し、y軸にリニアスケールで細胞数を示す。濃度を増大してFVIIaが存在すると（12.5nM〜100nM）、BHK（+TF）細胞では血清が枯渇した。BHK（+TF）細胞を血清除去した培地中に24時間放置すると、アポトーシス細胞の明らかな増加が見られ、10%の血清の存在下において増殖する健康な細胞（10%の血清）を表すピークが減少する（図1A）。図1Aの残りの4つの曲線は、FVIIaの濃度増大を表し、結果は、12.5nM程度の低濃度のFVIIaでは、アポトーシスから細胞群を救うことが可能であったことを示す。図1Bでは、BHK（+TF）細胞を、FVIIaの濃度を増大して血清を除去した培地に48時間維持した。この実験において、10%の血清処理した細胞と無処置の細胞を比較することによって観察されるアポトーシス細胞に明らかな増加があった。48時間後において、無処置の細胞は、血清除去の24時間後よりもアポトーシスが多かった。血清枯渇の48時間後において、FVIIaによるアポトーシスの阻害に非常に明らかな濃度依存性が見られた。100nMのFVIIaでは、ほぼ全てのアポトーシスの抑制が見られた。
【００６３】
FVIIaで誘導されるアポトーシスの阻害に対するTAPおよびヒルジンの効果。
このアッセイ法では、FVIIaの有意な効果が見られたので、このアポトーシス抑制の効果がFVIIaに特異的かどうか、または下流の凝固産物によりこれらの知見を説明することができるかどうか決定することが重要である。したがって、BHK（+TF）細胞を、特異的なトロンビン阻害剤ヒルジン（25U/ml）および特異的なFXa阻害剤TAP（100nM）の有り無しにおいて、FVIIa（100nM）の存在下で24時間または48時間血清除去した。対照として、ヒルジン+TAPの有り無しにおいてトロンビン（10nM）でも試験した。図3Aは、無処置の細胞では、血清除去の24時間においてアポトーシス細胞を生じ、FITC-dUTP「健康なピーク」の減少および黒線によって表された健康な血清処理細胞と比較して、ピークのわずかな右への移動を生じた。ここで、FVIIaは、完全にアポトーシスの阻害を示し、この効果のは、ヒルジンおよびTAPの添加によって影響されないことから、FXaおよびFIIaは、FVIIaで誘導されるアポトーシスからの保護に関与していないことを示される。対照実験として、10nM FIIaの存在下において細胞を血清除去した。FIIaでは、FVIIaと同程度にアポトーシスの阻害が可能であった。FIIaおよびヒルジン+TAPを同時に添加することにより、このアポトーシスの阻害は消失し、該細胞では、FITC-dUTPの右へ移動によってアポトーシス細胞の明らかな増大が示され、余分のピークを生じる。48時間の血清枯渇では、無処置の細胞は、24時間の血清枯渇と比較してよりアポトーシスが多い（図3B）。この実験では、FVIIaは、ヒルジンおよびTAPから独立して、部分的にアポトーシスを阻害した。同程度のアポトーシス阻害が、FIIaで見られた。10nMのFVIIa濃度では、48時間の血清枯渇の間にアポトーシスを阻害するには十分でなかった（図3B）。結論として、24時間および48時間の血清枯渇の両者において、FVIIaの抗アポトーシスの効果は、下流の凝固産物のFXaおよびFIIaから独立している。
【００６４】
また、FVIIaの抗アポトーシスの効果に対する下流の凝固産物の特異的な阻害剤の効果を探査する同じ実験で、BHK wt細胞を調査した。BHK wt細胞を24時間血清枯渇した場合、10%処理した細胞と比較して、アポトーシス細胞の増加はなく（図4A）、図2Aに示した実験とよく相関する。BHK wt細胞における48時間の血清枯渇では（図4B）、健康な細胞と比較して、明らかにアポトーシス細胞の増大を生じた（図4B）。この実験において、ヒルジンおよびTAPの有り無しにおける100nMのFVIIa、並びに10nMのFVIIaでは、抗アポトーシスの効果を有さなかった（図4B）。FIIaは、BHK wt細胞（図4B）に対して、BHK（+TF）細胞（図3B）に対する効果と同じ抗アポトーシスの効果を示すことが非常に明白であった。
【００６５】
FVIIaのタンパク分解活性は、抗アポトーシスの効果に必須である。
TFに対するFVIIaの結合が、この抗アポトーシス効果を誘導するために十分であったかどうかを調査するために、枯渇期間の間に、FVIIa（FFR-FVIIa）の活性部位を不活性化した変異体を細胞に添加した。FFR-FVIIaは、TFに対して2倍より高い親和性で結合するが、該複合体は、タンパク分解性が不活性のままである。図5は、BHK（+TF）を使用する実験を表し、ここでは、24時間（図5A）および48時間（図5B）の血清枯渇が、明らかにアポトーシス抑制性の効果を有した。面白いことに、FFR-FVIIa（図5C）は、いかなる細胞を救出することもできず、細胞群は、24時間および48時間の血清除去の両者において無処置の細胞と同じであった。
【００６６】
BHK（+TF）細胞における血清枯渇で誘導されるアポトーシスの時間依存性。
アポトーシス細胞のTUNEL染色では、DNA破壊が形成されなければならないので、後期段階のアポトーシスを検出するのみである。FVIIaおよびFFR-FVIIaの有り無しにおいて、BHK（+TF）細胞で17、22、および44時間血清除去した。実験において、健康な細胞の対照として10%の血清を使用し、アポトーシス陽性の対照として非処理の細胞を使用した。図6から、22時間の血清枯渇（パネルB）が、TUNELアッセイ法での標識化DNA破壊によって測定できるアポトーシスを誘導するための最短時間であったことが分かった。血清を除去した培地において、細胞を17時間培養したときに（パネルA）、有意な量のアポトーシスは見られなかった。対照的に、44時間の血清枯渇では、このアッセイ法で非常に明らかにアポトーシスが誘導された。図6から、FFR-FVIIaでは、44時間の血清除去後において抗アポトーシス効果を示すが、FVIIaでは示さないことが明らかである。
【００６７】
実施例4
組換えヒトFVIIaおよびFFR-FVIIaは、実施例1および2に記載したとおりに調製した。因子X、FXa、トロンビン、およびヒルジンは、Enzyme Research Laboratories（South Bend, IN）から得た。特異的なFXa阻害剤（組換えダニ抗凝固タンパク質（TAP））は、Vlasuk博士（Corvas, La Jolla, C）から寛大に譲り受けた。カスパーゼ3、リン酸化p44/42MAPK、およびリン酸化Aktに対する抗体は、Cell Signaling Technology（Boston, MA）からのものであった。β−アクチン抗体は、Abcam（Cambridge, UK）からのものであった。LY294002およびU0126は、Promega （Madison, WI）からのものであった。
【００６８】
細胞株−ベビーハムスター腎臓細胞株BHK-21 tk-（ATCC CRL 1632）は、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。完全ヒトTF cDNAを哺乳類Zem219b発現ベクターにクローン化し、リン酸カルシウム共沈手順を使用してBHK細胞にトランスフェクトし、安定に組み込まれた構築物を1μMのメトトレキセートを使用して選択した（Sorensen, B. B. , Freskgard, P.-O., Nielsen, L. S. , Rao, L. V. M. , Ezban, M. , and Petersen, L. C. （1999） J. Biol. Chem. 274, 21349-21354）。チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1、ATCCCCL-61）細胞を、10% FCSおよび1%の非必須アミノ酸を補ったHam-F12培地中で培養した。CHO細胞には、FuGene（商標）（Roche Diagnostics, Indi- anapolis, IN）を使用して、pcDNA3（Invitrogen, Carlsbad, CA）内の完全ヒトTFをトランスフェクトした。安定細胞株は、ジェネティシン（0.7mg/ml）に対する耐性によって選択した。クローン細胞株を、無処理の単層の細胞を使用するFXa生成アッセイ法でTFの発現について試験した。FXa生成アッセイ法によって判断されるように、2種のトランスフェクトされた細胞系BHK（+TF）およびCHO（+TF）の機能的TFの発現は同等であった。
【００６９】
TUNEL/フローサイトメトリー−細胞を、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを補ったDMEM中で、9cmのディッシュ（800,000細胞/ディッシュ）にまいた。細胞が約80%コンフルエントなときに、これらを実験の試験化合物の存在下および非存在化において、血清除去に供した。簡単には、単層をDMEM（pHを安定させるために、使用前にDMEMを一晩インキュベータに放置した）で２回洗浄し、最終的な洗浄後、細胞を実験の試験化合物を含む6mlのDMEMで24時間または48時間おおった。インキュベーション期間終了後、付着細胞をトリプシン処理して培地中のゆるんだ細胞をプールして、5分間300×gで遠心した。細胞をPBSで洗浄後、1%パラホルムアルデヒドのPBS溶液において氷中で15分間固定した。その後、PBS中で洗浄して500μlのPBSに再懸濁した後に、5mlの70%エタノールを添加した。細胞懸濁液を-20℃において少なくとも18時間放置した後、製造者の手順に従ってTUNELアッセイ法によって解析した（Pharmingen, SanDiego,CAからのApo-BRDU）。染色された細胞をFACScan（商標）フローサイトメーター（Becton Dickinson）によって解析した。
【００７０】
カスパーゼ3活性化の検出-TUNELの下で記述したとおりに、細胞を9cmのディッシュにおいて、実験の試験化合物の存在下および非存在化で血清を除去した。特定の時間間隔の終了後、結果に示したとおり、培養したディッシュを氷上に置き、ゆるい細胞を含む上の培地を回収した。付着した細胞をディッシュの底からこすり落として、条件培地によってプールして、4℃において300×gで5分間遠心して細胞ペレットを得た。上清を捨て、チューブから慎重に排出（チューブを逆にすることによって）して細胞ペレットを得た。細胞を50μlの氷冷Chaps Cell Extract Buffer（使用直前に20μg/mlのロイペプチン、10ug/mlのアプロチニン、5mMのDTT、0.1mMのAEBSF（4-（2-アミノエチル）-（ベンゼンスルホニルフルオライド：4-（2-Aminoethyl）-bezenesulfonylfluoride）を補った50mMのPipes/KOH、pH6.5、2mMのEDTA、0.1%のChaps）に添加することによって溶解した。可溶化液を3回凍結融解し、4℃において5分間15,000×gで遠心した。上清を回収し、総タンパク質量濃度をバイオラド・タンパク質アッセイキットによって決定した。約10μgのタンパク質を還元条件下で4〜12%勾配ゲルのSDS-PAGEに供した。酵素前駆体（zymogen）（33kDa）および切断された抗原（18kDa）を認識するカスパーゼ3に対する抗体を使用するウエスタンブロット解析によって、カスパーゼ3活性化を評価した。
【００７１】
Aktおよびp44/42MAPキナーゼ活性化の決定−細胞を6穴プレートの完全培地中にまいた。細胞が80〜90%のコンフルエンシーに達したときに、細胞を無血清培地中で２回洗浄し、細胞を静止状態にするために無血清培地に2時間入れたままにしておいた。細胞を37℃において10分間FVIIaで刺激した。阻害剤を含めた場合には、これらをFVIIaの添加の30分前に細胞に添加した。FVIIaで10分間処理した後、細胞を溶解緩衝液に溶解（20mMのトリス、0.1%（v/w）トリトンX-100、1mMのEDTA、1mMのEGTA、50mMのフッ化ナトリウム、10mMのβ−グリセロリン酸ナトリウム、5mMのピロリン酸ナトリウム、0.1mMのAEBSF（4-（2-アミノエチル）-ベンゼンスルホニルフルオライド：4-（2-Aminoethyl）-bezenesulfonylfluoride）、1mMのベンズアミジン、150mMのNaCl、pH7.5。使用直前に：1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、5μg/mlのロイペプチン、10μg/mlのアプロチニンを添加した）。10μgのタンパク質をSDS-PAGE（4〜12%勾配ゲル、還元条件）に充填し、リン酸化p44/42MAPKおよびcAktに対する特異抗体を使用するウエスタンブロット解析に供した。
【００７２】
ウエスタンブロット解析−電気ブロッティング後、膜をブロッキング緩衝液（0.1%のTween-20および5%の脱脂粉乳を含むTBS）中で1時間ブロックし、0.1%のTween-20を含むTBS（TBS/T）で3回洗浄した後、ブロッキング緩衝液に一次抗体（1：1,000、およびベータ−アクチンについては1：1000,000）を添加した。4℃において一次抗体と一晩インキュベーションした後に、膜をTBS/Tで3回を洗浄した後、ブロッキング緩衝液にHRP結合二次抗体（1：2000）を添加した。膜を室温において1時間インキュベートした後、TBS/Tで３回洗浄した。化学発光基質（Supersignal, Pierce）を5分間添加して、冷却したCCDカメラ（LAS1000、Fujifilm）によって化学発光を検出した。Image Gaugev.4.0（Fujifilm）を使用してバンドの強度を定量するために、これらのデジタル画像を使用した。
【００７３】
免疫細胞化学−BHK（+TF）細胞を8チャンバーのガラススライド（Nalge Nunc International, Rochester, NY）にまき、30%コンフルエンスに増殖させた。細胞を洗浄し、なし、20nM FVIIa、20nM FFR-FVIIa、または10%のFCSを補った無血清培地中で6時間インキュベートした。実験の終わりに細胞を洗浄し、4%（v/v）パラホルムアルデヒドのリン酸塩緩衝食塩水（PBS）溶液中で4℃において15分間固定し、PBSで簡単にすすぎ、70%（v/v）エタノール中で15分間RTにおいて後固定（post-fixed）し、空気乾燥した。3×5分間、60℃に予熱した10mMのクエン酸緩衝液pH6.0中において、80%の効果で電子レンジ（Polar Patent, Umea, Sweden）で前処理することによって、抗原回収（antigen retrieval）を達成した。細胞をクエン酸緩衝液中で室温において10分間冷却し、トリス緩衝化塩類溶液（TBS）中ですすいで、5%のロバ血清のTBS溶液中で15分間プレインキュベートし、続いてヤギ抗ヒトTF IgG（American Diagnostica Incorporation, Greenwich, Ct）と4℃において一晩インキュベーションした。次いで、細胞を、ビオチン化したロバ抗ヤギ（Jackson ImmunoReseach Laboratory, West Growe, PE）と1時間、HRPストレプトアビジン（NEN Life Science Products, Boston, MA）と30分、およびTSA-FITC（チラミドシグナル増幅蛍光系：Tyramide Signal Amplification Fluorescein system）（NEN Life Science Products, Boston, MA）とインキュベートした。TBS中で簡単にリンスした後、アポトーシス細胞の形態学的な解析のために、細胞をヘキスト（Hoechst：Molecular Probes, Leiden, The Netherlands）で対比染色し、H₂Oですすいで着色してMounting Medium Fluorescence（DAKO, Glostrup, Denmark）でマウントした。選択的AMCAおよびFITCHフィルタを備えているオリンパスBX51反射蛍光系顕微鏡、並びにDP50デジタルカメラを使用して細胞を撮影した。
【００７４】
結果：
FVIIaは、無血清条件下において核染色質の凝集を妨げる。本発明の発明者は、血清除去により、細胞が寄せ集まり、ゆるく培養ディッシュに付着して（容易にディッシュから分離する）、微妙な形態学的な変化を受ける傾向があることを見いだした。これらの変化は、FVIIaを無血清培地に含めたときに減弱された。本発明は、アポトーシスの形態学的変化について細胞を検査した場合の、細胞生存性およびアポトーシスに対する、検査したFVIIaおよびるFFR-FVIIaの効果に基づいている。血清枯渇条件下では（図7、パネルAおよびB）、蛍光顕微鏡観察により、かなり数のBHK（+TF）細胞がアポトーシス小疱および濃縮された染色質体の核によって特徴づけられることが示されたが、血清枯渇の間にFVIIaが存在すると著しくアポトーシス形態を有する細胞数が減少され（図7、パネルCおよびD）、その結果、FVIIaにさらされた細胞培養は、血清を含有する培地中で維持したものと同様の見かけを有した（図7、パネルGおよびH）。FVIIaとは対照的に、FFR-FVIIaは、血清除去によって誘導される核凝縮を妨げることができなかったことから（図7、パネルEおよびF）、FVIIaのタンパク分解活性がこの効果に必須であったことを示唆する。
【００７５】
血清除去条件下におけるFVIIaの抗アポトーシス効果−図7における細胞形態観察では、血清枯渇したBHK（+TF）細胞に対するFVIIaの暴露によって抗アポトーシス効果を生じることを示唆する。この効果の定量的特徴付けを得るために、我々は、TUNEL/フローサイトメトリーによって、DNA分解を測定してアポトーシスの変化について細胞を検査した。血清の対照と比較して、無血清条件において24時間のBHK（+TF）細胞の培養では、DNA分解が促進されてアポトーシス細胞の画分が著しく増大し（図8A）、48時間（図8B）までの長期の血清枯渇によって、この画分はわずかに増大した。しかし、特に、血清を除去した培地に1pM〜100nMのFVIIaを添加することにより、用量依存的に細胞がアポトーシスから救出された。FVIIaの抗アポトーシス効果は、1nMで明らかであり、10nM FVIIaでは、細胞の生存がかなり増大された;これは、FVII血漿レベルと同等の濃度である。100nM FVIIaにさらに増大すると、細胞生存がわずかに改善された。FVIIaに48時間さらされた細胞において、FVIIaの抗アポトーシス効果の同様のプロフィールが観察された（図8B）。
【００７６】
野生型の非トランスフェクトBHK細胞は、検出可能なレベルのTFを発現しない。TFトランスフェクト細胞のように、48時間の無血清条件下におけるこれらの細胞の培養では、TUNELアッセイ法によって示されるとおり、広範なアポトーシスを生じた。しかし、図8Cは、BHK（+TF）細胞とは対照的に、野生型BHK細胞では、FVIIaによってアポトーシスから細胞を救出することができなかったことを示し、TFに対する結合がその抗アポトーシス効果に必須であることを示唆する。
【００７７】
活性部位がブロックされたFVIIaであるFFR-FVIIaではなく、FVIIaでは、血清枯渇によって誘導される形態学的な変化からBHK（+TF）細胞を保護することが可能であったという観察は、TUNELアッセイ法によってこれをさらに探査することを我々に促す。次に、FVIIaのタンパク分解活性がその抗アポトーシスの効果に必要であることを確立した。図9Aに示した結果は、FFR-FVIIaではなく、FVIIaがBHK（+TF）細胞をアポトーシスから保護したので、該活性が必須であることを明らかに示した。
【００７８】
FVIIaのように、TF凝固経路の下流プロテアーゼであるFXaおよびトロンビンは、種々の細胞の反応を生じる細胞内シグナリングを誘導することが知られている。したがって、FVIIaが、少量の下流凝固因子を生成することを介してその効果を及ぼすことを除外することが重要であった。我々は、これらの研究において組換えFVIIaを使用し、かつ我々の実験系においてFXaまたはトロンビンの生成の証拠は見出されていないが、我々は、FXaおよびトロンビンの特異的な阻害剤、すなわち、それぞれTAPおよびヒルジンの存在下において、FVIIaの抗アポトーシスの効果を評価した。図9Bに示すように、TAPおよびヒルジンは、FVIIaの抗アポトーシスの効果を妨げることができなかったが、これらは、FXaおよびトロンビンの抗アポトーシスの効果を完全に消失させた。これらのデータにより、FVIIa/TFの特異的なプロテアーゼ活性が、FVIIaにさらされたTF発現細胞において観察されるアポトーシスの減少の原因であることを証明される。
【００７９】
FVIIaはカスパーゼ3活性化を抑制する−システインプロテアーゼファミリーのカスパーゼは、アポトーシスの中心的調節因子である。カスパーゼは、カスケード系において組織化された、潜在性の酵素前駆体として合成され、アポトーシスの活性化を刺激する。アポトーシスの阻害は、カスパーゼの活性を阻害することによって、またはこれらの活性化を妨げることによって達成される。FVIIaがアポトーシスを阻害する機構の手掛かりを得るために、我々は、中心的アポトーシスのエフェクターであるカスパーゼ3の活性化を、酵素前駆体並びに活性化された酵素系形態を認識する抗体を使用するウエスタンブロット解析によって調査した。血清除去により、BHK（+TF）細胞において18〜20kDaのカスパーゼ3のバンドの時間依存的な出現を誘導した（図10）。カスパーゼ3の活性化は、血清除去の2時間後に明らかであり、3時間において最大に達した。活性化は、少なくとも5時間（実験の期間）維持された。しかし、無血清培地における100nM FVIIaの存在下では、3、4、および5時間において明らかにカスパーゼ3の活性化を70〜80%に減少した。さらなる実験において（データ示さず）、FVIIaは、カスパーゼ3活性化の用量依存的な阻害を誘導し、TUNELアッセイ法で測定されるアポトーシスの用量依存的阻害と相関があった。BHK（+TF）細胞とは対照的に、FVIIaは、TFを発現しない野生型BHK細胞のカスパーゼ3活性化を阻害することができなかった（図11B）。血清により、BHK（+TF）および野生型BHK細胞の両者におけるカスパーゼ3の活性化は消失した。同様のデータは、野生型CHO-K1およびTFをトランスフェクしたCHO細胞でも得られた（図12）。
【００８０】
FVIIa/TFは、静止状態のBHK（+TF）細胞において、p44/42MAPK（図13A）並びにAkt（図13B）を活性化することが示され、両者とも、生存シグナリングの重要なプレーヤであると考えられる。しかし、どのキナーゼが、FVIIaの抗アポトーシスの効果の原因となるかは現在明らかではない。特異的なMEK阻害剤U0126および特異的なP13-キナーゼ阻害剤LY294003による実験では、両方のキナーゼがFVIIaの抗アポトーシス効果に関与するかもしれないことを示す（データ示さず）。
【００８１】
FVIIaの抗アポトーシス効果がTFを媒介することを確認するために、無血清培地中にFVIIaを添加する前にFVIIa-TF相互作用のアンタゴニスト（FFR-FVIIaおよびmAb1F44A1）を細胞とプレインキュベートした。アポトーシスは、カスパーゼ-3活性化によって検出した。FFR-FVIIaおよびモノクローナル抗ヒトTF抗体1F44A1は、FVIIaの抗アポトーシス効果を減弱することができた（図14）。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FVIIaの用量反応。
【図２】BHK wt.のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FVIIaの用量反応。
【図３】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図４】BHK wtのFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図５】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。血清枯渇で誘導されるアポトーシスに対するFVIIaおよびFFRFVIIaの効果。
【図６】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。血清枯渇で誘導されるアポトーシスの時間依存性。
【図７】細胞をBHK（+TF）の凝縮した核（矢印でマークした）のヘキスト染色によって例証されるアポトーシス。
【図８】FlTC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。TF発現細胞におけるFVIIaの用量依存的な抗アポトーシスの効果。フローサイトメトリによるTUNEL解析。
【図９】TUNELおよびフローサイトメトリによって解析したBHK（+TF）のFIT-DUT染色によって例証されるアポトーシス。FFR-FVIIaの関与。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図１０】BHK（+TF）細胞における血清欠乏によるカスパーゼ3活性化の時間依存性。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。FVIIaは、試験下時間の全てにおいて抗アポトーシスの効果を示す。
【図１１】カスパーゼ3の活性化によって例証されるアポトーシス。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。TF発現細胞のみにおけるFVIIaの抗アポトーシスの効果。
【図１２】CHO細胞のカスパーゼ3活性化によって例証されるアポトーシス。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。TF発現細胞のみにおけるFVIIaの効果。
【図１３】FVIIaの抗アポトーシスの効果は、用量依存的であり、BHK（+TF）細胞においてFVIIaがp44/42MAPKおよびAktを活性化する能力に関連がある。ウエスタンブロット解析。
【図１４】BHK（+TF）細胞における活性化されたカスパーゼ3のWb解析によって例証されるアポトーシス。TFへのFVIIaの結合を妨げることにより、FVIIaの抗アポトーシス効果を中和する。【Technical field】
[0001]
Field of Invention
Novel modulating the activity of tissue factor (TF) agonists such as coagulation factor VII (FVII) or tissue factor antagonists such as inactivated coagulation factor VIIa (FVIIai) in cells expressing tissue factor (TF) Cells have been described. The present invention relates to a method for modulating cellular apoptosis by contacting a cell with a TF agonist, such as FVIIa, or a TF antagonist, such as FVIIai. The invention also relates to the use of FVIIa or another TF agonist, or FVIIai or another TF antagonist, for the preparation of a medicament for the modulation of symptoms associated with apoptosis in a patient. Furthermore, the present invention relates to a method for treating a condition in a patient in need of reduced or increased apoptosis.
[Background]
[0002]
Background of the Invention
When FVIIa circulating in plasma binds to the essential membrane protein tissue factor (TF), the extrinsic pathway of blood clotting is triggered. It is believed that FVIIa is involved as a proteolytic enzyme in the blood coagulation cascade only in the extracellular leaflet of TF expressing cells. In the study of the putative intracellular signaling ability of FVIIa, it was pretreated by human bladder cancer cell line and constitutively expressing TF and expressed TF, but any cytokine-like intracellular tyrosine kinase In the cells of umbelical vein endothelial cells that did not show any activation, free calcium (Ca²⁺) Was shown to induce mobilization. Recent reports indicate that TF may affect important biological functions other than coagulation such as angiogenesis, fetal angiogenesis, and tumor metastasis. However, it is currently unclear how TF is involved in these biological processes.
[0003]
Studies that have shown that the prometastatic function of TF is highly dependent on the cytoplasmic domain of TF show a potential role in signaling of the cytoplasmic domain of TF. In addition, the cytoplasmic domain of TF interacts with actin-binding protein 280 (ABP-280) and is shown to assist cell adhesion and migration through the recruitment of ABP-280 for TF-mediated adhesive contact. Has been.
[0004]
However, TF has also been shown to be involved in certain types of cellular signaling by functioning as a cofactor for its physiological ligand FVIIa in extracellular signaling through a putative proteolytic mechanism . For example, FVIIa binding to cell surface TF is associated with intracellular Ca in many TF expressing cells.²⁺It has been shown to induce periodic fluctuations, transient phosphorylation of tyrosine in monocytes, activation of MAP kinase, altered gene expression in fibroblasts, and enhanced urokinase receptor expression in tumor cells . Catalytically inactive FVIIa (FVIIai) is Ca²⁺From periodic fluctuations to MAP kinase activation and gene depletion, many of the above signaling responses cannot be induced and FVIIa catalytic activity is required for at least some TF-FVIIa-mediated signaling. I will. Currently, many of the signaling pathway (s) induced by proteolytically active FVIIa are unknown.
[0005]
The body's normal tissue is formed by cells that have reached a terminally differentiated state and no longer divide or by cells that have died and relocated from the pool of dividing cells. For example, neural tissue is formed early in development and cells of the nervous system reach a terminally differentiated state immediately after birth. In general, when nerve tissue is damaged, nerve cells cannot divide, and thus loss of function by damaged nerve cells is not treated.
[0006]
Compared to the nervous system, the skin consists of layers stratified in epithelial cells, the upper (outer) layer of the cell always falls off and the lower layer of the cell divides to replace the lost cells To do. Thus, skin is an example of a tissue where the number of cells lost is maintained in a steady state equal to the number of new cells produced.
[0007]
In some tissues, such as skin, the steady state is maintained in part by a process of programmed cell death that is genetically “programmed” such that the cells die after a period of time. Cells undergoing programmed cell death undergo morphological changes characteristic of apoptosis, including, for example, fragmentation of the DNA and disruption of the cell nucleus.
[0008]
Apoptosis is particularly prominent during the development of an organism, and cells that perform transient functions are programmed to die after these functions are no longer needed. In addition, apoptosis can occur in cells that have undergone major genetic changes, thus providing a means for organisms to escape defective and potentially cancer-forming cells. Apoptosis can also be induced by exposing organisms to various external stimuli including, for example, bacterial toxins, ethanol, and ultraviolet light. Chemotherapeutic drugs for treating cancer are also powerful inducers of apoptosis.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0009]
Description of the invention
The present invention relates to the use of FVII and / or FVIIa and / or another TF agonist and / or FVIIai and / or TF antagonist in the therapeutic treatment of pathological conditions that may be associated with apoptosis.
[0010]
In general, the blood component that participates in what is called the coagulation “cascade” is an enzymatically inactive protein, a proenzyme or a zymogen, which is itself activated. It is converted into a proteolytic enzyme by the action of an activator which is a coagulation factor. Coagulation factors that have undergone such conversion are commonly referred to as “active factors” and are indicated by adding the letter “a” to the name of the coagulation factor (eg, factor VIIa).
[0011]
The term “FVII” or “Factor VII” means “single chain” (enzyme source) coagulation factor VII. The term “Factor VIIa” or “FVIIa” means a “double-stranded” coagulation factor VII cleaved by specific cleavage of the peptide bond of Arg152-Ile153. FVII and FVIIa may be produced from blood or produced by recombinant means. It is clear that the performance of the method described herein is independent of how much purified factor VIIa is derived, and therefore the present invention is not intended for use herein. It is envisaged to encompass the use of any suitable factor FVII or FVIIa preparation. Human FVIIa is preferred.
[0012]
The terms “modified factor VII”, “inactivated FVII”, or “FVIIai” are intended to mean FVIIa with at least one modification, and such modifications are referred to as modified FVIIa Substantially inhibits the ability to activate FX and / or FIX. This modification will be present in the catalytic center of FVIIa. The term may be used interchangeably. Such modifications include substitution (or exchange) of one or more amino acids of the catalytic triads Ser344, Asp142, and His193, and also include organophosphorus compounds, sulfanyl fluoride, peptide halomethyl Also includes catalytic triad modification by serine protease inhibitors such as ketones or azapeptides. Modifications also include amino acid deletions and insertions. FFR-FVIIa is one example of an FVIIai derivative obtained by blocking the active center of FVIIa with an irreversible inhibitor, D-phenylalanine-L-phenylalanine-L-arginine chloromethyl ketone (FFRcmk). Other suitable FVIIai derivatives are L-phenylalanine-L-phenylalanine-L-arginine chloromethyl ketone, dansyl-L-phenylalanine-L-phenylalanine-L-arginine chloromethyl ketone, or dansyl-D-phenylalanine-L-phenylalanine Inactivated FVIIa obtained or obtained by blocking the active center with -L-arginine chloromethyl ketone, preferably FFR-FVIIa (FVIIa inactivated by FFRcmk).
[0013]
As used herein, the term “TF agonist” refers to direct binding to TF (eg, FVIIa) or other TF dependence, as determined by the apoptosis assay described in Example 3. By the general mechanism is intended to mean any compound that reduces or inhibits apoptosis of a population of cells.
[0014]
In one embodiment of the invention, the TF agonist is recombinant factor VIIa. In a further embodiment, the TF agonist is recombinant human factor VIIa. In a further embodiment, the TF agonist is a Factor VIIa equivalent. In one embodiment, the Factor VII equivalent is an amino acid sequence variant in which no more than 20 amino acids have been substituted, deleted, or inserted as compared to wild type Factor VII (ie, US Pat. No. 4,784,950). A polypeptide having the amino acid sequence disclosed in 1). In another embodiment, compared to wild-type factor VII, the factor VIIa variant has no more than 15 amino acids replaced, deleted, or inserted; in another embodiment, the factor VII variant is No more than 10 amino acids are substituted, deleted or inserted; in another embodiment, the Factor VII variant has no more than 8 amino acids substituted, deleted or inserted; another embodiment Wherein a factor VII variant has 6 or fewer amino acids substituted, deleted or inserted; in another embodiment, a factor VII variant has 5 or fewer amino acids substituted and deleted, In another embodiment, the Factor VIIa variant has 3 or fewer amino acids replaced, deleted, or inserted. In one embodiment, the Factor VIIa variant is L305V-FVIIa, L305V / M306D / D309S-FVIIa, L3051-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T / M298Q-FVIIa, V158D / E296V / M298Q-FVIIa, K337A -FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D / M298Q-FVIIa, L305V / K337A-FVIIa, V158D / E296V / M298Q / L305V-FVIIa, V158D / E296WM298Q / K337A-FVIIa, V158D / E296WM298Q / L305V / K337A-AVIIF , E296V-FVIIa, E296V / M298Q-FVIIa, V158D / E296V-FVIIa, V158D / M298K-FVIIa, and S336G-FVIIa.
[0015]
Used in the conventional sense, the three-letter or single-letter designations for amino acids were used in their conventional meaning as shown in Table 1. Unless explicitly indicated, the amino acids referred to herein are L amino acids. The terminology for a Factor VIIa variant with an amino acid substitution is as follows: The first letter represented by the one letter code represents the naturally occurring amino acid at the position of human wild type factor VIIa. The following number represents the position of human wild type factor VIIa. The second letter is represented by a one letter code that codes for a different amino acid replacing a natural amino acid. An example is L305V / K337A-FVII, where the leucine at position 305 of wild-type factor VIIa is replaced by valine and the lysine at position 337 of human wild-type factor VIIa is replaced by alanine, both in the same factor VII variant Mutate.
[0016]
table 1:
Abbreviations for amino acids:

As used herein, the term “TF antagonist” refers to TF without reducing or inhibiting apoptosis of a population of cells as determined by the apoptosis assay described in Example 3. Is intended to mean any compound that binds directly (eg FVIIai). In one embodiment of the invention, the TF antagonist is an antibody against human TF. In one embodiment, the antibody is a human antibody. In a further embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. In a further embodiment, the antibody is a Fab fragment, F (ab)₂Fragment, F (ab ')₂Fragment, or single chain Fv fragment.
[0017]
In this context, the term “treatment” is meant to include both preventing adverse symptoms and modulating symptoms that have already occurred in order to inhibit or minimize symptoms. Thus, prophylactic administration of FVIIa or another TF agonist, or FVIIai or another TF antagonist is included in the term “treatment”. In this context, the term “patient” is also defined as any animal, especially a mammal such as a human. The term “subject” is used interchangeably with “patient”.
[0018]
Symptoms that may be treated include, for example, various cancers, various degenerative neurological disorders, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), denervation decline, otosclerosis, stroke , Including pathologies including neuropathology including encephalopathy associated with dementia, multiple sclerosis, Huntington's disease, and acquired immune deficiency (AIDS). Tissues such as skin and small intestine are constantly turning over the life of the organism, and the cells that form these tissues undergo programmed cell death throughout the life of the organism. Normally, this process is tightly regulated and the number of cells produced for cell division is commensurate with the number of cells undergoing programmed cell death. However, the regulation of programmed cell death is a complex process involving many pathways, sometimes resulting in defects in the regulation of programmed cell death. Given the important role of this process in maintaining a constant number of cells in a tissue or in maintaining appropriate cells during the development of an organism, a defect in programmed cell death is a pathological condition. Often accompanied. Abnormal regulation of programmed cell death in an organism results in various disease states. For example, a defect that results in a decrease in the level of apoptosis in a tissue can result in an increase in the number of cells in the tissue as compared to the normal level required to remain unchanged in the tissue. Such a mechanism to increase cell number has been identified in various cancers, and tumor formation is not only because cancer cells inevitably divide more rapidly than their normal counterparts, but the cells Occurs because they do not die at these normal speeds. When the likelihood of a cell undergoing apoptosis is reduced compared to cancer, a variety of pathologies are associated with tissues containing cells that have received more apoptosis than normal. For example, increased levels of apoptosis include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), denervation, otosclerosis, stroke, dementia, multiple sclerosis, Huntington's disease, and acquired immunity Accompanies various neuropathologies including encephalopathy associated with insufficiency (AIDS). Nerve cells generally do not separate in adults, so new cells cannot be used in place of dead cells, and neuronal cell death that occurs in such diseases progressively worsens the symptoms of patients suffering from the disease Let Other symptoms involving higher than normal apoptotic levels may be treated with TF agonists, including myopathy and muscular dystrophy, glomerulosclerosis, Mönkenberg middle arteriosclerosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, autoimmunity Hepatitis, hemochromatosis and Wilson's disease, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, acute liver failure due to various etiologies, bile duct disease, atherosclerosis, hypertension, and apoptosis associated with the use of chemotherapeutic agents.
[0019]
In a first aspect, the present invention relates to a method for reducing or inhibiting apoptosis in a group of cells comprising the step of contacting said cells with a tissue factor agonist. In one embodiment, the cells are human cells that express tissue factors including fibroblasts, smooth muscle cells, tumor cells, hematopoietic cells, monocytes, macrophages, epithelial cells, keratinocytes, nerve cells, and endothelial cells. is there.
[0020]
In a second aspect, the present invention relates to a method for inducing or enhancing apoptosis in a group of cells, comprising the step of contacting said cells with a tissue factor antagonist. In one embodiment, the cells are human cells that express tissue factors including fibroblasts, smooth muscle cells, tumor cells, hematopoietic cells, monocytes, macrophages, epithelial cells, keratinocytes, nerve cells, and endothelial cells. is there.
[0021]
In a further aspect, the present invention is a method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by an increase in the level of apoptosis by inhibiting or decreasing the level of apoptosis in the population of cells, said method comprising the factor VIIa Or relates to a method comprising administering to an individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising Factor VII or another tissue factor agonist. In one embodiment of the invention, the condition characterized by an increased level of apoptosis is a neurodegenerative disease. In a further embodiment of the invention, the disease or condition characterized by increased levels of apoptosis is Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), denervation, otosclerosis, stroke, dementia, Encephalopathy associated with multiple sclerosis, Huntington's disease, and acquired immune deficiency (AIDS), myopathy and muscular dystrophy, glomerulosclerosis, Menkeberg's middle arteriosclerosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, autoimmune hepatitis, Related to hemochromatosis and Wilson's disease, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, acute liver failure due to various etiologies, bile duct disease, atherosclerosis, hypertension, apoptosis-induced hair loss, and use of chemotherapeutic agents Selected from the group consisting of apoptosis. In one embodiment, apoptosis associated with the use of chemotherapeutic agents results in hair loss.
[0022]
In a further aspect, the present invention is a method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by a decrease in the level of apoptosis by inducing or enhancing the level of apoptosis in a population of cells, the method comprising tissue factor It relates to a method comprising administering to an individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an antagonist. In one embodiment of the invention, the disease or condition characterized by a reduced level of apoptosis is selected from the group consisting of primary tumor growth, tumor invasion, metastasis, psoriasis, autoimmune disease, and restenosis.
[0023]
In a further aspect, the present invention relates to the use of a tissue factor agonist for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition associated with unwanted apoptosis in a population of cells.
In a further aspect, the invention relates to the use of a tissue factor antagonist for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition for which apoptosis induction or enhancement in a cell population is desired.
[0024]
In a further aspect, the present invention provides a method of modulating apoptosis in a group of cells comprising the step of either contacting said cell with a tissue factor agonist or contacting said cell with a tissue factor antagonist. About.
[0025]
In one embodiment of the invention, the tissue factor agonist is FVII or FVIIa.
[0026]
In a further embodiment of the invention, the tissue factor antagonist is modified FVII. In one embodiment, the modified Factor VII is Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Phe-Arg chloromethyl Ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-PhePro-Arg chloromethyl ketone, L-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone , And D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl- D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D- Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-L-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone, and dans It is selected from factor VII modified with Le -D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone.
[0027]
In another aspect, the present invention is a method for detecting drug candidates that modulate apoptosis of a population of cells, the method comprising:
a) culturing TF expressing cells;
b) measuring apoptosis of a population of cells;
c) incubating the cells with the candidate drug, and
d) measuring the apoptosis of the incubated cells and determining any change in the level of apoptosis compared to the level of apoptosis measured in step b;
And such changes relate to methods that are indicative of a biologically active candidate drug in said cell.
[0028]
The term “TF expressing cell” means any mammalian cell that expresses TF.
[0029]
The term “candidate drug” is intended to indicate any sample that has a biological function or exerts a biological effect in a cell line. The sample may be a sample of biological material such as a microorganism or plant extract, or it may be a sample containing a compound or mixture of compounds prepared by organic synthesis or genetic techniques.
[0030]
In a further aspect, the present invention relates to the use of tissue factor for protecting cells from apoptosis. As can be seen from the experiments disclosed by the inventors of the present invention, only TF expressing cells are protected from apoptosis. Thus, in a further aspect, the present invention is a method of producing a recombinant protein comprising:
a) transfecting a cell with a polynucleotide construct encoding TF;
b) transfecting the same cell with a polynucleotide construct encoding the recombinant protein produced;
c) relates to a method comprising culturing cells in a suitable growth medium under conditions capable of expressing the polynucleotide construct and recovering the resulting polypeptide from the medium.
[0031]
In one embodiment of the invention, the recombinant protein produced is human FVII. In a further embodiment, a suitable cell growth medium comprises FVIIa.
[0032]
In a further aspect, the present invention relates to a method for reducing or inhibiting apoptosis of a group of cells, comprising contacting the cell with an activated clotting factor.
[0033]
In a further aspect, the present invention relates to a method for reducing or suppressing apoptosis in a group of cells comprising contacting said cell with thrombin or coagulation factor Xa.
[0034]
In a further aspect, the present invention relates to a method for inducing or enhancing apoptosis in a population of cells comprising contacting said cell with a thrombin inhibitor or a coagulation factor Xa inhibitor.
[0035]
In a further aspect, the present invention is a method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by an increase in the level of apoptosis by inhibiting or decreasing the level of apoptosis in the population of cells, the method comprising thrombin or It relates to a method comprising administering to said individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising coagulation factor Xa.
[0036]
In a further aspect, the present invention is a method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by a decrease in the level of apoptosis by inducing or enhancing the level of apoptosis in a population of cells, said method comprising thrombin inhibition Or a method comprising administering to said individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an agent or a coagulation factor Xa inhibitor.
[0037]
In a further aspect, the present invention relates to the use of thrombin or coagulation factor Xa for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases or conditions associated with unwanted apoptosis in a population of cells.
[0038]
In a further aspect, the present invention relates to the use of a thrombin inhibitor or a coagulation factor Xa inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition where induction or enhancement of apoptosis in a population of cells is desired.
[0039]
In a further aspect, the present invention is a method of modulating apoptosis in a population of cells, wherein the cells are contacted with thrombin or clotting factor Xa, or the cells are contacted with thrombin inhibitor or clotting factor Xa inhibitor. The present invention relates to a method including any one of the following steps.
[0040]
In one embodiment of the invention, the thrombin inhibitor is hirudin. In another embodiment of the present invention, the coagulation factor Xa inhibitor is Tick Anticoagulant Protein (TAP). In certain embodiments, the tick anticoagulant protein is a recombinant human protein.
[0041]
Abbreviations:
TF tissue factor
Single chain, inactivated form of FVII factor VII
Activated form of FVIIa factor VII
rFVIIa Activated form of recombinant factor VII
FVIIa modified (inactive) factor VII
FFR-FVIIai Factor FVII inactivated by D-Phe-L-Phe-L-Arg chloromethyl ketone
Tissue factor (TF) is the cellular receptor for factor FVIIa (FVIIa) and the complex is the main trigger for blood clotting. We studied the effect of FVIIa binding to TF on cell apoptosis in cells expressing large amounts of TF. TF expressing cells incubated with FVIIa are shown to become insensitive due to apoptosis.
[0042]
In the following, we show for the first time a clear relationship between FVIIa binding to TF and cellular apoptosis. We present data that FVIIa stimulation of TF expressing cells causes a decrease or inhibition of apoptosis in the cell population. Furthermore, FVIIa whose active site is inhibited (FFR-FVIIa) is shown to induce or enhance apoptosis in cell populations. TF is constitutively expressed in many extravascular cells such as stromal fibroblasts in the perivascular membrane and in the fibrotic capsule of the liver, spleen, and kidney. Thus, TF expression is found at sites physically remote from the circulating blood, providing a hemostatic envelope. In the event of injury, this barrier is thought to protect the organism from bleeding. However, TF can be induced in monocytes / macrophages, vascular smooth muscle cells, endothelial cells and in many tumor cells by various agents including cytokines and growth factors. Following stimulation, induction at the transcriptional level occurs rapidly and TF is identified as a proliferation-related immediate early gene.
[0043]
Since FVIIa, whose active site was inhibited, did not induce protection from apoptosis, it appears that not only binding to TF but also the catalytic activity of TF / FVIIa is essential. Since TAP and hirudin did not abolish the effect of FVIIa in the apoptosis assay, we excluded that FXa or thrombin produced protection from apoptosis by FVIIa. The dose response of the anti-apoptotic effect of FVIIa was determined in TF transfected BHK cells.
[0044]
The therapy for any patient to be treated with FVIIa or another TF agonist or FVIIai or another TF antagonist referred to herein should be determined by one skilled in the art. The daily dose administered in treatment can be determined by the physician and depends on the particular compound used, the route of administration, and the weight and symptoms of the patient. Effective amounts are optimally from about 5 μg / kg / day to about 500 μg / kg / day, preferably from about 10 μg / kg / day to about 300 μg / kg / day, more preferably from about 15 μg / kg / day. A daily dose of about 200 μg / kg / day, most preferably about 20 μg / kg / day to about 100 μg / kg / day.
[0045]
FVIIa or another TF agonist or FVIIai or another TF antagonist should be administered in one single dose, but preferably 4-6-12 hours depending on the dose given and the patient's symptoms It can also be given in multiple doses at intervals.
[0046]
In certain embodiments, the effective amount is a daily dose of about 5 μg / kg / day to about 500 μg / kg / day of FVIIa or another TF agonist or FVIIai or another TF antagonist.
[0047]
FVIIa or another TF agonist or FVIIai or another TF antagonist may be administered intravenously, or may be administered by continuous or pulsatile injection, or related, for example, directly injected into a tumor May be administered directly to the site. FVIIa or another TF agonist or FVIIai or another TF antagonist is preferably administered by intravenous injection and in an amount of about 100-100,000 units / kg body weight, and preferably about 250--corresponding to about 5-500 μg / kg. It is administered in doses of 25,000 units / kg body weight, which must be repeated 2-4 times over 24 hours.
[0048]
Conventional techniques for preparing pharmaceutical compositions that can be used in accordance with the present invention are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985.
[0049]
The compositions used according to the present invention are prepared by methods known to those skilled in the art.
[0050]
Briefly, pharmaceutical preparations suitable for use in accordance with the present invention are FVII, FVIIa or another TF agonist, or FVIIai or another TF antagonist, preferably in purified form, suitable adjuvants and suitable Made by mixing with a suitable carrier or diluent. Suitable physiologically acceptable carriers or diluents include sterile water and saline. In this regard, suitable adjuvants include calcium, protein (eg albumin), or other inactive peptides (eg glycylglycine) or amino acids (eg glycine or histidine) to stabilize purified factor VIIa. Including. Other physiologically acceptable adjuvants include non-reducing sugars, polyhydric alcohols (eg, sorbitol, mannitol, or glycerin), polysaccharides such as low molecular weight dextrins, surfactants (eg, polysorbate), and antioxidants ( For example, bisulfite and ascorbate). Adjuvant is generally present at a concentration of 0.001-4% w / v. The formulation may also contain a protease inhibitor, such as aprotinin, and a preservative.
[0051]
The preparation may be sterilized, for example, by filtration through a bacteria-retaining filter, by incorporating a bactericide into the composition, by irradiating the composition, or by heating the composition. They can also be manufactured in the form of sterile solid compositions, which can be dissolved in sterile water or other sterile medium suitable for injection prior to or just before use.
[0052]
The invention is further illustrated by the examples, but is not to be construed as limiting the scope of protection. The features disclosed in the foregoing description and in the following examples are both materials for understanding the various aspects of the present invention, both separately and in any combination.
【Example】
[0053]
Example 1
FVII Preparation of
Human purified Factor VIIa suitable for use in the present invention is described, for example, in Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, or European Patent No. 200.421. (ZymoGenetics), preferably made by DNA recombination techniques. Factor VIIa produced by the recombination technique is either a true factor VIIa or a somewhat modified factor VIIa, provided that such factor VIIa has substantially the same blood clotting biological activity as true VIIa. There may be. Such modified factor VIIa can be obtained by well-known means, for example by changing amino acid codons in a nucleic acid encoding native FVII by site-directed mutagenesis or by removing some amino acid codons. It may be produced by modifying the nucleic acid sequence encoding the factor.
[0054]
In addition, factor VII is a method described in Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 and Hedner and Kisiel, J. Clin. Lnvest. 71: 1836-1841, 1983. May be produced. These methods produce Factor VII without a detectable amount of other blood clotting factors. In addition, a purified factor VII preparation may be obtained by including further gel filtration as a final purification step. Then, by known means, for example by several different plasma proteins such as factor XIIa, IXa, or Xa, as described by Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565) VII The factor may be activated by converting it to activated FVIIa and passing the factor VII through ion exchange chromatography, such as Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals).
[0055]
Example 2
FVIIai Preparation of
Modified factor VII suitable for use in the present invention is, for example, as described in International Publication Nos. 92/15686, 94/27631, 96/12800, and 97/47651 (ZymoGenet-ics / NovoNordisk) Created.
[0056]
Example 3
To investigate the effect of FVIIa on BHK (+ TF) and BHK wt cell survival, apoptosis was induced in cells by serum deprivation for 24 and 48 hours. Apoptosis was detected by flow cytometry after terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). One of the late stages of apoptosis is DNA fragmentation, a process caused by the activation of endonucleases during the apoptotic program. Nucleases break down higher chromatin structures into fragments of about 300 kb, followed by a smaller portion of DNA about 50 base pairs in length. In the TUNEL assay (APO-BRDU from Pharmingen), TdT is a brominated deoxyuridine triphosphate (Br) against the 3 'hydroxyl end of double- and single-stranded DNA in cells fixed with paraformaldehyde and ethanol. -dUTP) to catalyze the template-independent addition. After uptake, these sites are identified by flow cytometry by staining the cells with FITC-labeled anti-BrdU mAb. For cell cycle progression, cells are labeled with propidium iodide (PI) in the final step.
[0057]
Protein-human recombinant FVII and FVIIa were expressed and purified as described in Thim, L. et al., Biochem 27: 7785-7793,1988.
[0058]
FVIIai is a D-Phe-L-Phe-L-Arg chloromethyl ketone (FFR-FVIIa) as described previously by Sorensen BB et al., J. Biol. Chem. 272: 11863-11868, 1997. Obtained by blocking the active site.
[0059]
Thrombin is from the Enzyme Research Lab. The specific thrombin inhibitor hirudin may be purchased from Sigma-Aldrich and the specific FXa inhibitor recombinant TAP (Tick anticoagulant protein) is kindly provided by Dr. GPVlasuk, Corvas (SanDiego, CA) sponsored. Cell culture-Baby hamster kidney cell line BHK-21tk-ts13 (ATCC CRL 1632) was cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. All cell lines are cultured in T80 or T175 flasks and a single 10 cm culture dish (78 cm²) Was subcultured.
[0060]
Transfection of BHK cells with TF—Complete human TF cDNA was cloned into a mammalian Zem219b expression vector. BHK cells were transfected with a TF expression plasmid using standard techniques of calcium phosphate coprecipitation. Cells stably incorporating the construct were selected with 1 μM methotrexate.
[0061]
Experiment:
Cells were seeded in DMEM supplemented with 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (DMEM + / +) (800.000 cells / dish). Two days later, the cells were approximately 80% confluent and were ready for serum starvation. Cells are washed twice with DMEM-/-medium (DMEM-/-was left in the incubator overnight before use for correct pH stabilization and temperature) and after the final wash The cells were left with 6 ml DMEM − / − and the indicated compound for 24 hours and / or 48 hours. At the end of the incubation period, adherent cells were trypsinized to pool loose cells in the medium and centrifuged at 300 xg for 5 minutes. The cells were washed with PBS and then fixed in 1% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes on ice. Then, after washing in PBS and resuspending in 500 μl of PBS, 5 ml of 70% ethanol was added. The cell suspension was left at -20 ° C. for at least 18 hours before being analyzed by TUNEL assay according to the manufacturer's procedure (Apo-BRDU from Pharmingen).
[0062]
result:
Dose response of the anti-apoptotic effect of FVIIa in BHK (+ TF) and BHK wt cells. In BHK (+ TF) cells, apoptosis was induced by serum deprivation for 24 or 48 hours, and apoptotic cells were detected by TUNEL staining and flow cytometry. Results are expressed as FITC-labeled DNA breaks (FITC-dUTP) against logarithmic x-scale (the more the x-axis value moves to the right, the more DNA breaks in the cells), and the number of cells on a linear scale on the y-axis Indicates. When FVIIa was present at increasing concentrations (12.5 nM-100 nM), serum was depleted in BHK (+ TF) cells. When BHK (+ TF) cells are left in serum-free medium for 24 hours, there is a clear increase in apoptotic cells, a peak representing healthy cells that grow in the presence of 10% serum (10% serum) Decrease (Figure 1A). The remaining four curves in FIG. 1A represent an increase in the concentration of FVIIa, and the results indicate that FVIIa as low as 12.5 nM was able to rescue the cell population from apoptosis. In FIG. 1B, BHK (+ TF) cells were maintained for 48 hours in medium from which serum was removed by increasing the concentration of FVIIa. In this experiment, there was a clear increase in apoptotic cells observed by comparing 10% serum treated and untreated cells. At 48 hours, untreated cells were more apoptotic than 24 hours after serum removal. A very clear concentration dependence was observed in the inhibition of apoptosis by FVIIa 48 hours after serum starvation. With 100 nM FVIIa, almost all inhibition of apoptosis was observed.
[0063]
Effect of TAP and hirudin on inhibition of FVIIa-induced apoptosis.
Since this assay showed significant effects of FVIIa, it was possible to determine whether this anti-apoptotic effect was specific for FVIIa or whether downstream clotting products could explain these findings. is important. Thus, BHK (+ TF) cells were allowed to remain in the presence of FVIIa (100 nM) for 24 hours or 48 with or without the specific thrombin inhibitor hirudin (25 U / ml) and the specific FXa inhibitor TAP (100 nM). Serum was removed for a period of time. As a control, thrombin (10 nM) was also tested with and without hirudin + TAP. FIG. 3A shows that untreated cells give rise to apoptotic cells at 24 hours of serum removal, with a decrease in FITC-dUTP “healthy peak” and peak peaks compared to healthy serum treated cells represented by the black line. A slight right shift occurred. Here, FVIIa shows complete inhibition of apoptosis, and this effect is not affected by the addition of hirudin and TAP, so FXa and FIIa are not involved in protection from apoptosis induced by FVIIa Shown. As a control experiment, cells were serum deprived in the presence of 10 nM FIIa. FIIa was able to inhibit apoptosis to the same extent as FVIIa. By simultaneously adding FIIa and hirudin + TAP, this inhibition of apoptosis disappears, in which the migration of FITC-dUTP to the right shows a clear increase in apoptotic cells, resulting in an extra peak. At 48 hours of serum deprivation, untreated cells are more apoptotic compared to 24 hours of serum deprivation (Figure 3B). In this experiment, FVIIa partially inhibited apoptosis, independent of hirudin and TAP. Similar inhibition of apoptosis was seen with FIIa. A concentration of 10 nM FVIIa was not sufficient to inhibit apoptosis during 48 hours of serum starvation (FIG. 3B). In conclusion, in both 24-hour and 48-hour serum starvation, the anti-apoptotic effect of FVIIa is independent of the downstream coagulation products FXa and FIIa.
[0064]
We also investigated BHK wt cells in the same experiment exploring the effects of specific inhibitors of downstream coagulation products on the anti-apoptotic effects of FVIIa. When BHK wt cells were serum starved for 24 hours, there was no increase in apoptotic cells compared to 10% treated cells (FIG. 4A), which correlates well with the experiment shown in FIG. 2A. Serum starvation in BHK wt cells for 48 hours (FIG. 4B) clearly resulted in an increase in apoptotic cells compared to healthy cells (FIG. 4B). In this experiment, 100 nM FVIIa with or without hirudin and TAP and 10 nM FVIIa had no anti-apoptotic effect (FIG. 4B). It was very clear that FIIa showed the same anti-apoptotic effect on BHK wt cells (FIG. 4B) as it did on BHK (+ TF) cells (FIG. 3B).
[0065]
The proteolytic activity of FVIIa is essential for the anti-apoptotic effect.
In order to investigate whether the binding of FVIIa to TF was sufficient to induce this anti-apoptotic effect, during the depletion period, the mutant cells that inactivated the active site of FVIIa (FFR-FVIIa) were Added to. FFR-FVIIa binds to TF with more than twice the affinity, but the complex remains proteolytically inactive. FIG. 5 represents an experiment using BHK (+ TF), where serum deprivation at 24 hours (FIG. 5A) and 48 hours (FIG. 5B) clearly had an inhibitory effect on apoptosis. Interestingly, FFR-FVIIa (FIG. 5C) was unable to rescue any cells and the cell population was the same as untreated cells at both 24-hour and 48-hour serum removal.
[0066]
Time dependence of apoptosis induced by serum deprivation in BHK (+ TF) cells.
TUNEL staining of apoptotic cells only detects late-stage apoptosis because DNA disruption must be formed. Serum was removed with BHK (+ TF) cells for 17, 22, and 44 hours with or without FVIIa and FFR-FVIIa. In the experiment, 10% serum was used as a healthy cell control and untreated cells were used as a positive apoptosis control. From FIG. 6, it was found that 22 hours of serum depletion (panel B) was the shortest time to induce apoptosis that could be measured by labeled DNA breakage in the TUNEL assay. No significant amount of apoptosis was seen when cells were cultured for 17 hours in serum-free medium (panel A). In contrast, 44 hours of serum depletion induced apoptosis very clearly in this assay. From FIG. 6, it is clear that FFR-FVIIa shows an anti-apoptotic effect after 44 hours of serum removal but not FVIIa.
[0067]
Example 4
Recombinant human FVIIa and FFR-FVIIa were prepared as described in Examples 1 and 2. Factor X, FXa, thrombin, and hirudin were obtained from Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). A specific FXa inhibitor (recombinant tick anticoagulant protein (TAP)) was generously obtained from Dr. Vlasuk (Corvas, La Jolla, C). Antibodies against caspase 3, phosphorylated p44 / 42MAPK, and phosphorylated Akt were from Cell Signaling Technology (Boston, Mass.). β-actin antibody was from Abcam (Cambridge, UK). LY294002 and U0126 were from Promega (Madison, WI).
[0068]
Cell Line—Baby Hamster Kidney Cell Line BHK-21 tk- (ATCC CRL 1632) was cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. Completely human TF cDNA was cloned into a mammalian Zem219b expression vector, transfected into BHK cells using the calcium phosphate coprecipitation procedure, and the stably integrated construct was selected using 1 μM methotrexate (Sorensen, BB, Freskgard , P.-O., Nielsen, LS, Rao, LVM, Ezban, M., and Petersen, LC (1999) J. Biol. Chem. 274, 21349-21354). Chinese hamster ovary (CHO-K1, ATCCCCL-61) cells were cultured in Ham-F12 medium supplemented with 10% FCS and 1% non-essential amino acids. CHO cells were transfected with fully human TF in pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Using FuGene ™ (Roche Diagnostics, Indianapolis, Ind.). Stable cell lines were selected by resistance to geneticin (0.7 mg / ml). Clonal cell lines were tested for TF expression in an FXa production assay using untreated monolayer cells. The functional TF expression of the two transfected cell lines BHK (+ TF) and CHO (+ TF) was comparable as judged by the FXa production assay.
[0069]
TUNEL / flow cytometry—Cells were seeded in 9 cm dishes (800,000 cells / dish) in DMEM supplemented with 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. When cells were approximately 80% confluent, they were subjected to serum removal in the presence and absence of experimental test compounds. Briefly, the monolayer was washed twice with DMEM (DMEM was left in the incubator overnight before use to stabilize the pH), and after the final wash, the cells were washed with 6 ml of experimental test compound. Covered with DMEM for 24 or 48 hours. At the end of the incubation period, adherent cells were trypsinized to pool loose cells in the medium and centrifuged at 300 xg for 5 minutes. The cells were washed with PBS and then fixed in 1% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes on ice. Then, after washing in PBS and resuspending in 500 μl of PBS, 5 ml of 70% ethanol was added. Cell suspensions were left at -20 ° C. for at least 18 hours before being analyzed by TUNEL assay according to the manufacturer's procedure (Apo-BRDU from Pharmingen, San Diego, Calif.). Stained cells were analyzed with a FACScan ™ flow cytometer (Becton Dickinson).
[0070]
Detection of caspase 3 activation-Serum was removed from cells in 9 cm dishes in the presence and absence of experimental test compounds as described under TUNEL. After the specified time interval, as shown in the results, the cultured dishes were placed on ice and the above medium containing loose cells was collected. Adherent cells were scraped from the bottom of the dish, pooled with conditioned medium, and centrifuged at 300 × g for 5 minutes at 4 ° C. to obtain a cell pellet. The supernatant was discarded and carefully drained (by inverting the tube) from the tube to obtain a cell pellet. Cells were washed with 50 μl ice-cold Chaps Cell Extract Buffer (20 μg / ml leupeptin, 10 ug / ml aprotinin, 5 mM DTT, 0.1 mM AEBSF (4- (2-aminoethyl)-(benzenesulfonyl fluoride: 4- (2-Aminoethyl) -bezenesulfonylfluoride) supplemented with 50 mM Pipes / KOH, pH 6.5, 2 mM EDTA, 0.1% Chaps). Centrifugation at 15,000 × g for 5 minutes at 4 ° C. Supernatant was collected and total protein concentration was determined by BioRad protein assay kit, approximately 10 μg of protein was reduced to 4-12% gradient gel SDS- Caspase 3 activation was assessed by Western blot analysis using an antibody against caspase 3 that recognizes the zymogen (33 kDa) and the cleaved antigen (18 kDa).
[0071]
Determination of Akt and p44 / 42 MAP kinase activation-Cells were seeded in complete medium in 6-well plates. When the cells reached 80-90% confluency, the cells were washed twice in serum free medium and left in serum free medium for 2 hours to bring the cells to rest. Cells were stimulated with FVIIa for 10 minutes at 37 ° C. If inhibitors were included, they were added to the cells 30 minutes prior to the addition of FVIIa. After 10 minutes treatment with FVIIa, cells were lysed in lysis buffer (20 mM Tris, 0.1% (v / w) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM sodium fluoride, 10 mM β- Sodium glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.1 mM AEBSF (4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride: 4- (2-Aminoethyl) -bezenesulfonylfluoride), 1 mM benzamidine, 150 mM NaCl, pH 7. 5. Immediately before use: 1 mM sodium orthovanadate, 5 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml aprotinin was added). 10 μg of protein was loaded on SDS-PAGE (4-12% gradient gel, reducing conditions) and subjected to Western blot analysis using specific antibodies against phosphorylated p44 / 42MAPK and cAkt.
[0072]
Western blot analysis—After electroblotting, membranes were blocked in blocking buffer (TBS containing 0.1% Tween-20 and 5% nonfat dry milk) for 1 hour and TBS containing 0.1% Tween-20 (TBS / T ), And the primary antibody (1: 1,000, and 1: 1000,000 for beta-actin) was added to the blocking buffer. After overnight incubation with the primary antibody at 4 ° C., the membrane was washed 3 times with TBS / T and then HRP-conjugated secondary antibody (1: 2000) was added to the blocking buffer. The membrane was incubated for 1 hour at room temperature and then washed 3 times with TBS / T. Chemiluminescence substrate (Supersignal, Pierce) was added for 5 minutes, and chemiluminescence was detected by a cooled CCD camera (LAS1000, Fujifilm). These digital images were used to quantify the intensity of the bands using Image Gaugev.4.0 (Fujifilm).
[0073]
Immunocytochemistry-BHK (+ TF) cells were plated on 8-chamber glass slides (Nalge Nunc International, Rochester, NY) and grown to 30% confluence. Cells were washed and incubated for 6 hours in serum-free medium supplemented with None, 20 nM FVIIa, 20 nM FFR-FVIIa, or 10% FCS. At the end of the experiment, the cells were washed and fixed in 4% (v / v) paraformaldehyde in phosphate buffered saline (PBS) for 15 minutes at 4 ° C, rinsed briefly with PBS, and 70% (v / v). v) Post-fixed in ethanol for 15 minutes at RT and air dried. Antigen retrieval by pretreatment in a microwave oven (Polar Patent, Umea, Sweden) with 80% effect in 10 mM citrate buffer pH 6.0 preheated to 60 ° C. for 3 × 5 minutes Achieved. Cells are cooled in citrate buffer at room temperature for 10 minutes, rinsed in Tris-buffered saline (TBS), pre-incubated in 5% donkey serum TBS solution, followed by goat anti-human TF Incubated with IgG (American Diagnostica Incorporation, Greenwich, Ct) at 4 ° C overnight. Cells were then incubated with biotinylated donkey anti-goat (Jackson ImmunoReseach Laboratory, West Growe, PE) for 1 hour, HRP streptavidin (NEN Life Science Products, Boston, MA) for 30 minutes, and TSA-FITC (tyramide signal). Amplification fluorescence system (Tyramide Signal Amplification Fluorescein system) (NEN Life Science Products, Boston, MA). After a simple rinse in TBS, the cells were counterstained with Hoechst (Hoechst: Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) for morphological analysis of apoptotic cells, and H₂Rinsed with O and colored and mounted with Mounting Medium Fluorescence (DAKO, Glostrup, Denmark). Cells were photographed using an Olympus BX51 reflective fluorescence microscope equipped with selective AMCA and FITCH filters and a DP50 digital camera.
[0074]
result:
FVIIa prevents nuclear chromatin aggregation under serum-free conditions. The inventors of the present invention have found that with serum removal, cells tend to gather, loosely adhere to the culture dish (separate from the dish easily) and undergo subtle morphological changes. These changes were attenuated when FVIIa was included in the serum-free medium. The present invention is based on the effect of tested FVIIa and FFR-FVIIa on cell viability and apoptosis when cells are examined for morphological changes in apoptosis. Under serum-depleted conditions (Figure 7, Panels A and B), fluorescence microscopy shows that a significant number of BHK (+ TF) cells are characterized by apoptotic vesicles and enriched chromatin nuclei. However, the presence of FVIIa during serum depletion significantly reduces the number of cells with apoptotic morphology (Figure 7, Panels C and D), so that cell cultures exposed to FVIIa can be found in serum-containing media. Had the same appearance as that maintained in (FIG. 7, panels G and H). In contrast to FVIIa, FFR-FVIIa failed to prevent nuclear condensation induced by serum removal (Figure 7, Panels E and F), so FVIIa proteolytic activity is essential for this effect. Suggest that there was.
[0075]
Anti-apoptotic effect of FVIIa under serum removal conditions—Cell morphology observation in FIG. 7 suggests that exposure of FVIIa to serum-depleted BHK (+ TF) cells produces an anti-apoptotic effect. To obtain a quantitative characterization of this effect, we examined the cells for changes in apoptosis by measuring DNA degradation by TUNEL / flow cytometry. Compared to serum controls, cultures of BHK (+ TF) cells for 24 hours in serum-free conditions promoted DNA degradation and markedly increased the fraction of apoptotic cells (FIG. 8A) and 48 hours (FIG. 8B). This fraction increased slightly with long-term serum depletion until). In particular, however, cells were rescued from apoptosis in a dose-dependent manner by adding 1 pM to 100 nM FVIIa to the serum-free medium. The anti-apoptotic effect of FVIIa was evident at 1 nM, and 10 nM FVIIa significantly increased cell survival; this is a concentration comparable to FVII plasma levels. Further increase to 100 nM FVIIa slightly improved cell survival. A similar profile of the anti-apoptotic effect of FVIIa was observed in cells exposed to FVIIa for 48 hours (FIG. 8B).
[0076]
Wild type untransfected BHK cells do not express detectable levels of TF. Like TF-transfected cells, culturing these cells under serum-free conditions for 48 hours resulted in extensive apoptosis, as shown by the TUNEL assay. However, FIG. 8C shows that in contrast to BHK (+ TF) cells, wild type BHK cells were unable to rescue cells from apoptosis by FVIIa, and binding to TF contributed to its anti-apoptotic effect. Suggests essential.
[0077]
The observation that FVIIa, rather than FFR-FVIIa, the active site blocked FVIIa, was able to protect BHK (+ TF) cells from morphological changes induced by serum depletion was Encourage us to explore this further with assay methods. Next, we established that the proteolytic activity of FVIIa is necessary for its anti-apoptotic effect. The results shown in FIG. 9A clearly showed that the activity is essential because FVIIa, but not FFR-FVIIa, protected BHK (+ TF) cells from apoptosis.
[0078]
Like FVIIa, FXa and thrombin, which are downstream proteases of the TF coagulation pathway, are known to induce intracellular signaling that results in various cellular responses. Therefore, it was important to exclude that FVIIa exerted its effect through producing a small amount of downstream clotting factor. Although we use recombinant FVIIa in these studies and no evidence of FXa or thrombin production has been found in our experimental system, we have identified specific inhibitors of FXa and thrombin, i.e. The anti-apoptotic effect of FVIIa was evaluated in the presence of TAP and hirudin, respectively. As shown in FIG. 9B, TAP and hirudin were unable to prevent the anti-apoptotic effect of FVIIa, but they completely abolished the anti-apoptotic effect of FXa and thrombin. These data demonstrate that the specific protease activity of FVIIa / TF is responsible for the decrease in apoptosis observed in TF expressing cells exposed to FVIIa.
[0079]
FVIIa inhibits caspase 3 activation-The caspases of the cysteine protease family are central regulators of apoptosis. Caspases are synthesized as latent enzyme precursors organized in a cascade system and stimulate activation of apoptosis. Inhibition of apoptosis is achieved by inhibiting the activity of caspases or by preventing their activation. In order to gain a clue to the mechanism by which FVIIa inhibits apoptosis, we use caspase-3, a central apoptotic effector, to activate the progenitors as well as antibodies that recognize activated enzyme-based forms. Investigated by blot analysis. Serum removal induced a time-dependent appearance of the 18-20 kDa caspase 3 band in BHK (+ TF) cells (FIG. 10). Caspase 3 activation was evident 2 hours after serum removal and reached a maximum at 3 hours. Activation was maintained for at least 5 hours (experimental period). However, the presence of 100 nM FVIIa in serum-free medium clearly reduced caspase 3 activation to 70-80% at 3, 4, and 5 hours. In further experiments (data not shown), FVIIa induced a dose-dependent inhibition of caspase 3 activation and correlated with a dose-dependent inhibition of apoptosis as measured by the TUNEL assay. In contrast to BHK (+ TF) cells, FVIIa was unable to inhibit caspase 3 activation of wild-type BHK cells that do not express TF (FIG. 11B). Serum abolished caspase 3 activation in both BHK (+ TF) and wild type BHK cells. Similar data was obtained for CHO cells transfected with wild-type CHO-K1 and TF (FIG. 12).
[0080]
FVIIa / TF has been shown to activate p44 / 42MAPK (Figure 13A) and Akt (Figure 13B) in quiescent BHK (+ TF) cells, both of which are important players in survival signaling Conceivable. However, it is not currently clear which kinase is responsible for the anti-apoptotic effect of FVIIa. Experiments with the specific MEK inhibitor U0126 and the specific P13-kinase inhibitor LY294003 show that both kinases may be involved in the anti-apoptotic effect of FVIIa (data not shown).
[0081]
To confirm that the anti-apoptotic effect of FVIIa mediates TF, antagonists of FVIIa-TF interaction (FFR-FVIIa and mAb1F44A1) were preincubated with the cells before adding FVIIa in serum-free medium. Apoptosis was detected by caspase-3 activation. FFR-FVIIa and monoclonal anti-human TF antibody 1F44A1 were able to attenuate the anti-apoptotic effect of FVIIa (FIG. 14).
[Brief description of the drawings]
[0082]
FIG. 1. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK (+ TF). Dose response of FVIIa.
FIG. 2. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK wt. Dose response of FVIIa.
FIG. 3. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK (+ TF). Involvement of FXa and thrombin inhibitors.
FIG. 4. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK wt. Involvement of FXa and thrombin inhibitors.
FIG. 5. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK (+ TF). Effect of FVIIa and FFRFVIIa on apoptosis induced by serum deprivation.
FIG. 6. Apoptosis illustrated by FITC-dUTP staining of BHK (+ TF). Time dependence of apoptosis induced by serum deprivation.
FIG. 7. Apoptosis exemplified by Hoechst staining of BHK (+ TF) condensed nuclei (marked with arrows).
FIG. 8. Apoptosis illustrated by FlTC-dUTP staining. DVII-dependent anti-apoptotic effect of FVIIa in TF expressing cells. TUNEL analysis by flow cytometry.
FIG. 9. Apoptosis illustrated by FIT-DUT staining of BHK (+ TF) analyzed by TUNEL and flow cytometry. Involvement of FFR-FVIIa. Involvement of FXa and thrombin inhibitors.
FIG. 10: Time dependence of caspase 3 activation due to serum deprivation in BHK (+ TF) cells. Western blot analysis using anti-caspase 3 ab's. FVIIa shows an anti-apoptotic effect at all times under test.
FIG. 11. Apoptosis illustrated by caspase 3 activation. Western blot analysis using anti-caspase 3 ab's. Anti-apoptotic effect of FVIIa only in TF expressing cells.
FIG. 12. Apoptosis illustrated by caspase 3 activation in CHO cells. Western blot analysis using anti-caspase 3 ab's. Effect of FVIIa on TF expressing cells only.
FIG. 13. The anti-apoptotic effect of FVIIa is dose-dependent and is related to the ability of FVIIa to activate p44 / 42MAPK and Akt in BHK (+ TF) cells. Western blot analysis.
FIG. 14. Apoptosis illustrated by Wb analysis of activated caspase 3 in BHK (+ TF) cells. By neutralizing the binding of FVIIa to TF, it neutralizes the anti-apoptotic effect of FVIIa.

Claims (19)

A method for reducing or inhibiting apoptosis in a group of cells, comprising the step of contacting said cells with a tissue factor agonist. 2. The method of claim 1, wherein the tissue factor agonist is FVII or FVIIa. A method for inducing or enhancing apoptosis in a population of cells comprising contacting said cells with a tissue factor antagonist. 4. The method of claim 3, wherein the tissue factor antagonist is modified FVII. 2. The cells are human cells that express tissue factor, including fibroblasts, smooth muscle cells, tumor cells, hematopoietic cells, monocytes, macrophages, epithelial cells, keratinocytes, nerve cells, and endothelial cells. The method of any one of -4. 5. The method of claim 4, wherein the modified factor VII is Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D- Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, L -Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone, and D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe- Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro- Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-L-Glu-Gly-Arg chloromethyl keto And a factor VII modified with dansyl-D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone. A method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by an increase in the level of apoptosis by inhibiting or reducing the level of apoptosis in a population of cells comprising:
The method comprises administering to said individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising Factor VIIa or Factor VII or another tissue factor agonist. A method of reducing the severity of symptoms in an individual characterized by a decrease in the level of apoptosis by inducing or enhancing the level of apoptosis in a population of cells comprising:
The method comprises administering to said individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist. 8. The method of claim 7, wherein the symptoms are Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), denervation, otosclerosis, stroke, dementia, multiple sclerosis, Huntington Disease, and encephalopathy associated with acquired immune deficiency (AIDS), myopathy and muscular dystrophy, glomerulosclerosis, Menkeberg arteriosclerosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, autoimmune hepatitis, hemochromatosis and Wilson disease, From the group consisting of viral hepatitis, alcoholic hepatitis, acute liver failure due to various etiologies, biliary tract disease, atherosclerosis, hypertension, apoptosis-induced hair loss, and apoptosis associated with the use of chemotherapeutic agents The method chosen. 9. The method of claim 8, wherein the disease or condition is selected from the group consisting of primary tumor growth, tumor invasion, metastasis, psoriasis, autoimmune disease, and restenosis. 11. A method according to any one of claims 8 to 10, wherein the tissue factor antagonist is a modified factor VII. Use of a tissue factor agonist for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition associated with unwanted apoptosis in a cell population. 13. Use according to claim 12, wherein the tissue factor agonist is FVII or FVIIa or a combination thereof. Use of a tissue factor antagonist for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition for which induction or enhancement of apoptosis in a cell population is desired. 15. Use according to claim 14, wherein the tissue factor antagonist is a modified factor VII. 16. Use according to claim 15, wherein the modified factor VII comprises Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, D- Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, D-PhePro-Arg chloromethyl ketone, L-Glu -Gly-Arg chloromethyl ketone, and D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Phe- Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Phe-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-Phe-Pro-Arg chloro Methyl ketone, dansyl-D-Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone, dansyl-L-Glu-Gly-Arg chloromethyl keto And selected from factor VII modified by dansyl-D-Glu-Gly-Arg chloromethyl ketone. A method of modulating apoptosis in a population of cells comprising the step of either contacting said cells with a tissue factor agonist or contacting said cells with a tissue factor antagonist. 18. The method of claim 17, wherein the tissue factor agonist is FVII or FVIIa. 19. The method of claim 18, wherein the tissue factor antagonist is modified FVII.

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