JP2005506057A - Whole mitochondrial genome sequence as a diagnostic tool for health science - Google Patents

Abstract

Testing for mutations throughout the mitochondrial genome is used as a diagnostic system for diseases such as prostate cancer and non-melanoma skin cancer. Characteristic mutations and rearrangements, including point mutations (transitions, transversions), deletions, inversions, duplications, recombination, insertions or combinations thereof in the mitochondrial genome, have been found in prostate cancer and non-melanoma skin It is used as an initial indicator. In addition, “common deletion” along with 4977 bp, or other related mutations and / or deletions, has been used as a measure of aging.

Description

【００３０】
酸素フリーラジカルは、ＡＴＰ生産の標準的な副産物であるが、この欠失の確実な原因であり、年齢とともに頻度が増加する。現存する文献は、筋肉および脳のような細胞分裂しない組織においてｍｔＤＮＡ突然変異と、生活年齢と、全体の老化のプロセスとの間に強力な関係があることを実証している。しかしながら、年齢に関連した腫瘍の事象と年齢に関係しない腫瘍とを区別するためには、比較母系研究が必要とされている。
【００３１】
最近、種々の慢性変性疾患が、ｍｔＤＮＡの突然変異から起因していることが示された（Gattermanら(1995)）。変性ＯＸＰＨＯＳに関連した病気がｍｔＤＮＡ突然変異に密接に関連していると考えられている（Byrne(1992)）。さらに、これらの筋障害がミトコンドリアゲノムの4977-bpの共通欠失にしばしば関連していることが示された（Liuら(1977)）。この大きな欠失はまた、正常に年老いた人の種々の組織において、ヘテロプラスミーレベルで発見されており、老化のミトコンドリア理論（Mitochondrial Theory of Aging）と一致している（Harman(1981)）。これは、欠失頻度の増加（Cortopassi & Wang(1995)）、およびこれに続いて起こる、結果として老齢期の細胞死につながることになる呼吸機能の衰退（Miquelら(1992)）を通じて、明らかである。早期の遺伝子診断は患者の予後を向上させるので、病気素質または機能障害素質の早期発見は、医学の介入のための最良の機会を与える。
【００３２】
代表的な面だけの構造を採用した過去の研究は、ｍｔＤＮＡの突然変異、欠失、および（または）その組合せと老化との関連つまり因果関係を確立した。正確なデータを得るためには、年齢に特異性のある欠失および（または）突然変異の比率が簡潔に決定されなければならない。集団レベルでの特定の病気とは対照的に、突然変異を老化のプロセスに起因すると考えることは重要なことである。この情報は、いかにしてｍｔＤＮＡの損傷が時間をかけて生じるのかについての理解には不可欠である。さらに、予知を行うとともに最終的に分子レベルで老化を遅らせるためには、これらの特定の突然変異の結果、頻度、および老化の時間的側面における関係が知られなければならない。研究者らは、母系を通じて集団のデータの評価を必要とする、この比率を未だ決定していない。したがって、老化のプロセスを追跡するバイオメーカーの必要性が存在する。
【００３３】
したがって、早期の段階の癌、老化、またはＤＮＡ要素を備えた、その他のヒトの病気を示す突然変異のための膨大な核ゲノムを監視する単純かつ簡単なシステムの必要性が存在する。ミトコンドリアゲノムの欠失に関連する非黒色腫皮膚がん、前立腺がん、肺がんおよび老化のための簡単な診断システムの必要性についても存在する。病気を引き起こすｍｔＤＮＡの突然変異と、単に集団内および集団間の変異を示す突然変異とを識別する診断システムの必要性が存在する。
【００３４】
本発明の目的は、癌、老化、ＤＮＡ要素を有するその他のヒトの病気と関連した早期トランジションのために巨大な核ゲノムを監視するための単純で簡単なシステムを提供することにある。
【発明の開示】
【００３５】
本発明の一実施例においては、尿、前立腺液、皮膚細胞、唾液のような組織または体液試料を含む小さな生物学的試料が、個人から採取される。病気の形態を示す細胞を識別するために、これらの試料は、組織学的検査を含む任意の適切な方法を用いて検査される。レーザー捕捉を含む（これには限定されないが）任意の適切な方法を用いて、病気の形態を示す識別細胞が試料から採取され、そこからのｍｔＤＮＡの配列が決定され、続いて、健康および病気の双方に関連する既知のミトコンドリア配列のデータベースと比較される。
【００３６】
好ましい実施例では、病気と関連するｍｔＤＮＡ配列の変異を決定するために、すべてのミトコンドリアゲノムの配列が集団レベルで決定される。
【００３７】
他の実施例では、突然変異の進行の存在が、病気の始まりおよび進行を表している。突然変異（遺伝）荷重はまた、病気の進行状態つまり病状を示している。
【００３８】
好ましい実施例では、前立腺液からのｍｔＤＮＡ配列が、前立腺がんと明らかに関係する、正常で一時的な転移ｍｔＤＮＡ配列のデータベースと比較されている。この比較データの組は、母系の研究に基づいており、さらに、一般の集団に存在するミトコンドリア族に現れる変異とは対称的に、病気と明らかに関連したｍｔＤＮＡ変異の明らかな例を供給する母系データベースに蓄積されている集団に存在するその他の正常な母系変異の研究に基づいている。
【００３９】
病気素質を示す特異母系があるかもしれない。
【００４０】
他の実施例においては、疑わしいと考えられている非黒色腫皮膚がんからのｍｔＤＮＡ配列が、非黒色腫皮膚がんと明らかに関係する正常なｍｔＤＮＡ配列のｍｔＤＮＡ配列データベースと比較される。
【００４１】
本発明の一つの特徴部分によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気の発生または進行を検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出することとを有している。突然変異の存在を検出する工程が、ｍｔＤＮＡの配列を決定することと、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅することと、サウスウェスタンブロッティングすることと、変性ＨＰＬＣを行うことと、マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）することと、分子マーカー分析と、これらの組合せとからなるグループから選択されている。さらに、生物学的試料のｍｔＤＮＡがデータベースと比較されており、このデータベースが、病気のないｍｔＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【００４２】
本発明の一つの特徴部分によれば、ヒト検体において病気の存在を検出する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。このデータベースは、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。特異病に関連したミトコンドリアＤＮＡの突然変異率は、病気の進行および予後の重要なインジケータである。このことは、病気のステージの特定ができるようにして、優れた病気干渉や特定の療法に帰着することになる病気の特定を向上させる。
【００４３】
さらに他の実施例においては、ヘテロプラスミー検出の感度を増加させることが、試験の早期識別能力を向上させる。
【００４４】
また、本発明は、転移によってターゲットされた重要な部位を観察することによって病気の進行を監視するのに用いられてもよい。
【００４５】
ミトコンドリアＤＮＡ配列の突然変異によって示される病気素質または機能障害素質を決定する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの中の突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。このデータベースは、病気または機能障害にかかりやすい個人と病気または機能障害にかかりにくい個人とのミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータを含んでいる。
【００４６】
好ましい実施例においては、ミトコンドリアＤＮＡの配列を決定するのに、ＤＮＡマイクロアレイが使用されている。その他の技術を用いることも可能である。たとえば、検体または完全ヒトゲノムの直接配列決定法、SNaP shot^TM、ＳＮＰ検出、リアルタイムＰＣＲ、または当該分野で標準的なその他の方法である。
【００４７】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、ヒト検体の老化の進行状態を査定する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの中の突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。データベースは、老化に関連したＴＤＮＡの突然変異のデータを含んでいる。
【００４８】
ｍｔＤＮＡ突然変異の存在を検出する工程が、ｍｔＤＮＡの配列を決定することと、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅することと、サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションすることと、変性ＨＰＬＣを行うことと、マイクロアレイ、バイオチップまたは遺伝子チップにハイブリダイゼーションすることと、分子マーカー分析と、これらのいずれかの組合せとから選択されている。
【００４９】
本発明のさらに他の実施例によれば、複数のヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を有するデータベースが提供されている。ミトコンドリアＤＮＡ配列は、病気のない状態と関連する正常な制御配列と、病気の存在と関連する配列または病気素質を示す配列とからなるグループから選択されている。
【００５０】
病気の診断のためのキットが提供されている。このキットは、使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスする手段とを備えている。
【００５１】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、患者の病気を診断する方法が提供されている。この方法は、ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションすることを備えている。各核酸要素は病気の存在を示しており、各核酸要素は特有の位置を有するとともに、固形基質に安定して結合している。アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、前立腺がんの存在を示している。
【００５２】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、病気素質を決定するためのキットが提供されている。このキットは、使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスする手段とを備えている。
【００５３】
本発明の他の実施例によれば、ミトコンドリアＤＮＡ配列の突然変異により示される病気または機能障害の素質を決定しまたは徴候を示すための方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からミトコンドリアＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの配列を決定することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。データベースは、病気のないｍｔＤＮＡ配列に関連した突然変異の集団レベルのデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【００５４】
本発明のさらに他の実施例によれば、患者の非黒色腫皮膚がんを診断する方法が提供されている。この方法は、ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションすることを備えている。各核酸要素は非黒色腫皮膚がんを示しており、各核酸要素は特有の位置を有するとともに、固形基質に安定して結合している。アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、非黒色腫皮膚がんの存在を示している。あるいは、非特異的突然変異が、癌の進展する閾効果（threshold effect）を超えた閾効果に到達するかもしれない。同様にして、前立腺がんについても診断可能である。
【００５５】
本発明の他の実施例によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体においてヘテロプラスミーを検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、試料上で変性ＨＰＬＣを実行することとを備えている。
【００５６】
本発明の他の特徴部分によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気と関連する突然変異を検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出することと、生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較することとを備えている。データベースは、病気のない共通集団のバリアントのデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明の方法は、ｍｔＤＮＡに関連した病気を診断するのに用いることができる。本発明による方法は、生物学的試料から個人のミトコンドリアゲノムを増幅し、ミトコンドリアゲノムの一部、好ましくは個人のすべてのミトコンドリアゲノムの配列をすでに知られた任意の手段を用いて決定する。多くの試料を迅速にスクリーンするのに、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いるようにしてもよい。ＤＨＰＬＣは、突然変異のホットスポットに集中させることができる。通常のシークエンスにおける２０〜２５％と比べて、ＤＨＰＬＣは、突然変異の検出に関しては、２％のヘテロプラスミーを自動シークエンスするよりも感度がよい。低レベルのヘテロプラスミー（＜２％）を検出する方法を開発してもよい。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、ｍｔＤＮＡにおける突然変異の「存在」は、ヘテロプラスミー突然変異を含んでおり、したがって、突然変異したＤＮＡが存在する試料の中には、いくつかの正常なｍｔＤＮＡが付加的に存在していると考えられる。
【００５９】
本明細書中で使用される「紫外線角膜炎（actinic kerotoses）」は、扁平上皮がんの前駆物質表皮損傷を意味している。
【００６０】
本明細書中で使用される「老化（aging）」は、分子レベルおよび細胞レベルの双方において、時間の経過につれての変化の蓄積を意味している。
【００６１】
本明細書中で使用される「対立遺伝子（alleles）」とは、染色体の特異部位を占める一定のＤＮＡ配列におけるいくつかの変形形態のうちの一つを意味している。
【００６２】
本明細書中で使用される「付着（attaching）」または「接着（spotting）」は、核酸が共有結合、水素結合またはイオン作用（イオン結合）を介して基質に不可逆に結合されるように、核酸を固形基質の上に配置して核酸アレイを形成する工程を意味している。
【００６３】
本明細書中で使用される「基底細胞がん（basal cell carcinoma）」は、皮膚細胞の癌の一類型である
【００６４】
本明細書中で使用される「ボーエン病（Bowen’s disease）」は、in situ 表皮がんを意味している。
【００６５】
本明細書中で使用される「診断上の（diagnostic）」または「診断する（diagnosing）」とは、病気の診断または処置の要素として突然変異またはその組合せの存在または非存在を用いることを意味している。突然変異の検出は、病気の症状の診断の一ステップとなり得る。
【００６６】
本明細書中で使用される「病気（disease）」は、機能障害またはその他の異常な肉体状態を含んでいる。
【００６７】
本明細書中で使用される「病気が関連したミトコンドリアゲノム（disease associated mitochondrial genomes）」とは、特定の病気を示すまたは特定の病気に関連した突然変異を含むゲノムを意味している。
【００６８】
本明細書中で使用される「データベース（database）」とは、電子記憶システム（標準的な産業ソフトウエアを用いたコンピュータベースの）を意味しており、このシステムは、研究者らがヌクレオチドの配列構造を素早く決定するのを可能にする回収可能な情報を蓄積し提供する能力を有している。このデータベースはまた、生物学的試料を提供する個人の記述情報についても蓄積している。この記述情報は、生物学的試料に相関関係がある健康状態およびその他の関連項目を含む。
【００６９】
本明細書中で使用される「欠失（deletions）」とは、核酸の連続的な配列からＤＮＡの一部位を取り除くことを意味している。一旦欠失が発生すると、その隙間は端部を再結合することによって修復される。欠失は、一つの塩基から何千またはそれ以上の大きさの塩基までその大きさが変化し得る。
【００７０】
本明細書中で使用される「重複（duplications）」とは、ＤＮＡの特異配列が複製されて、元の複製の後方または前方にまたはゲノムのいずれかの部位に、一つまたはそれ以上挿入されることを意味している。
【００７１】
本明細書中で使用される「ヘテロプラスミー（heteroplasmy）」は、突然変異の比率によって定義される。野生型ｍｔＤＮＡ分子については、１００％突然変異ｍｔＤＮＡが「ホモプラスミーの（homoplasmic）」と称される。ヘテロプラスミーの（heteroplasmic）突然変異は、ミトコンドリアゲノムのすべての複製においてではないが、いくつかの複製において発生する突然変異である。
【００７２】
本明細書中で使用される「ホモプラスミー（homoplasmy）」とは、すべてのミトコンドリア配列が同一であることを意味している。
【００７３】
本明細書中で使用される「逆位（inversions）」は、一連のＤＮＡの長さが切除されて、逆向きに再挿入されることを指している。
【００７４】
本明細書中で使用される「母性遺伝（maternal inheritance）」とは、卵の細胞質を介して受け継がれるミトコンドリアを意味している。
【００７５】
本明細書中で使用される「母系（maternal line）」は、母親から次の世代に代々引き継がれるミトコンドリアＤＮＡのクローン配列を指している。
【００７６】
本明細書中で使用される「ミトコンドリア（mitochondria）」とは、細胞プロセスのためのＡＴＰを生成する真核細胞質細胞小器官を意味している。
【００７７】
本明細書中で使用される「突然変異（mutation）」は、野生型配列からのＤＮＡ配列内の任意の変化を包含しており、これには、点突然変異、トランジション、挿入、トランスバージョン、転位、欠失、逆位、重複、組換え、またはこれらの組合せが含まれる。
【００７８】
本明細書中で使用される「突然変異荷重（mutation load）」は、関与遺伝子またはすべての遺伝子の機能低下につながることになるｍｔＤＮＡにおける突然変異の増加を指している。
【００７９】
本明細書中で使用される「核酸アレイ（nucleic acid array）」は、異なる核酸が１平方センチ当たり２０を超える密度で固形支持部の一方の面に付着された複数の特定の核酸を指している。各核酸は、予め選択された、同一でない領域において、固形支持部の面に付着されている。一実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ＤＮＡである。好ましい実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ｃＤＮＡである。他の好ましい実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されたｃＤＮＡである。好ましくは、本発明による核酸アレイは、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さの核酸を有している。好ましくは、核酸アレイは、６，０００ヌクレオチド以下の長さの核酸を有している。より好ましくは、核酸アレイは、５００ヌクレオチド以下の長さの核酸を有している。他の実施例では、アレイは、固形支持部の一方の面に付着された少なくとも１０の異なる拡散を有している。さらに他の実施例では、アレイは、固形支持部の一方の面に付着された少なくとも１０，０００の異なる拡散を有している。本明細書中で使用される「核酸（nucleic acid）」という語は、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と互換性がある。
【００８０】
本明細書中で使用される「核酸ターゲット（nucleic acid target）」または「ターゲット核酸（target nucleic acid）」は、一つまたはそれ以上の種類の化学的結合を介して、通常は相補的な塩基対合を介して、相補的配列の核酸要素に結合できる核酸と定義される。本明細書中で使用されるように、核酸ターゲットは、天然塩基（例：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）と、修飾塩基（7-ジアゾグアノシン、イノシンなど）を含む。また、核酸プローブの塩基は、ハイブリダイゼーションと干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合されていてもよい。これにより、核酸ターゲットは、構成塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって結合されたペプチド核酸であってもよい。好ましくは、核酸ターゲットは、ヒトの組織または体液の抽出物から取り出されている。より好ましくは、核酸ターゲットは、ヒトの組織または体液の抽出物から合成された一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
【００８１】
本明細書中で使用される「核（nucleus）」は、真核細胞の中のもっとも有名な細胞小器官を意味しており、すべての染色体ＤＮＡを有している。
【００８２】
本明細書中で使用される「ＰＳＡ試験（PSA Test）」は、前立腺に特異性のある抗原試験を意味しており、この抗原は、前立腺がんを示す血液中の抗原である。
【００８３】
本明細書中で使用される「点突然変異（point mutation）」は、ＤＮＡ中の単一のヌクレオチドの変化を意味している。
【００８４】
本明細書中で使用される「多型性（polymorphism）」とは、対立遺伝子またはｍｔＤＮＡゲノムの集団内における配列の変化を意味している。
【００８５】
本明細書中で使用される「前駆体障害（precursor lesions）」とは、潜在的な病気との関連を示すＤＮＡ変異またはその組合せを意味している。
【００８６】
本明細書中で使用される「病気素質（predisposed to a disease or a predisposition to a disease）」は、病気または機能障害と関連性がある突然変異の存在または欠如のために、人が病気または機能障害を持つようになる危険性が非常に高い、あるいは、平均的な人よりも病気または機能障害を早期に発症する危険性が非常に高いということを意味している。
【００８７】
本明細書中で使用される「予め選択された領域（preselected region）」、「予め限定された領域（predefined region）」または「独特の位置（unique position）」は、核酸の堆積のために用いられている、または用いられた、あるいは用いられようと意図されている基質上の局所領域を指している。別の言い方をすれば、ここでは、「選択領域（selected region）」または単に「領域（region）」のことを指している。予め選択された領域は、任意の適切な形状（例：円形、矩形、楕円形、楔状など）を有している。いくつかの実施例においては、予め選択された領域は、約１cm²より小さく、より好ましくは１mm²より小さく、さらに一層好ましくは０．５mm²よりも小さい。また、いくつかの実施例では、領域は約０．１２５〜０．５mm²である。
【００８８】
本明細書中で使用される「体細胞突然変異（somatic mutation）」は、受精後のＤＮＡ配列の変化を意味している。
【００８９】
本明細書中で使用される「固形基質（solid substrate）」または「固形支持部（solid support）」は、堅いまたは部分的に堅い面を有する要素のことを指している。「基質（substrate）」または「支持部（support）」という語は、ここでは、「固形基質（solid substrate）」または「固形支持部（solid support）」という語と互換性がある。固形支持部は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的、非生物学的、生体的または非生体的なもの、あるいはこれらのうちの任意の組合せでよい。基質は、シリコン面またはガラス面、あるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、または６６ナイロンやニトロセルロース、これらの組合せのような帯電膜であることが多い。好ましい実施例では、固形の支持部はガラスである。好ましくは、基質の少なくとも一つの面が実質的に平坦になっている。好ましくは、固形支持部の面は、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基などを含む（これらには限定されないが）官能基を有している。一実施例では、面は透光性を有している。
【００９０】
本明細書中で使用される「扁平上皮がん（squamous cell carcinoma）」は、皮膚細胞の癌の一類型である。
【００９１】
本明細書中で使用される「安定して結合（stably associated）」とは、共有結合、水素結合またはイオン作用（イオン結合）を介してアレイを形成するために、固形基質に不可逆に結合している核酸を指している。これにより、核酸が、アレイと安定して結合している他のすべての核酸に対して、あるいは、アレイが分析（すなわち、ハイブリダイゼーションまたはスキャン）される条件下で固形基質上で予め選択された他のすべての領域に対して、予め選択された特有の位置を維持している。
【００９２】
ミトコンドリアＤＮＡ配列の「有意性のある（statistically significant）」数は、標準的なカイ二乗設計的アルゴリズムを用いて、つまり観測値対期待値を決定することによって、決定される。
【００９３】
本明細書中で使用される「トランジション」とは、窒素を含む同じ塩基、つまりピリミジンからピリミジン、またはプリンからプリンへの置換を意味している。一方のピリミジンが他のピリミジンによって置き換えられる、あるいは一方のプリンが他方のプリンによって置換される突然変異。
【００９４】
本明細書中で使用される「トランスバージョン」は、窒素を含む異なる塩基の置換、つまりプリンからピリミジン、またはピリミジンからプリンへの置換を意味している。一方のプリンがピリミジン置き換えられる（置換される）またはその逆に置換される突然変異。
【００９５】
特異病のｍｔＤＮＡおよび診断
本発明の一実施例においては、ｍｔＤＮＡ配列を比較することにより、前立腺がんや非黒色腫皮膚がんのような特異な病気を診断するとともに老化を観察するための方法が提供されている。核ＤＮＡではなくｍｔＤＮＡを用いて、前立腺がんのような病気を診断することは、いくつかの利点を有している。第１に、ｍｔＤＮＡは、複雑なゲノムではなく、個人レベルおよび集団レベルにおいて容易に理解される。このため、正常なゲノムおよび病気が関連したゲノムを有する大きなｍｔＤＮＡデータベースが、個人の診断を非常に正確なものにする。したがって、病気に関連した変種（variation）が理解される。第２に、ｍｔＤＮＡは、核ＤＮＡよりも１０倍突然変異率が高い（Wallace(1992)）。病気の前段階を示唆する核再配列が、素早くミトコンドリアと結合して、体細胞突然変異として現れる。第３に、ｍｔＤＮＡが母性遺伝パターン（maternal inheritance pattern）を有しており、すべてのミトコンドリアが同じｍｔＤＮＡから始まるので、ｍｔＤＮＡは本質的にクローンである。このため、このクローン状態からの変種は、簡単に検出される。また、ｍｔＤＮＡが組換えの説得力ある証拠を示さないので、配列における何らかの変種は体細胞の事象である。突然変異がある任意のミトコンドリアは、一つのミトコンドリアにつき多くの（コピー数2〜10の）ミトコンドリアゲノムが、また一つの細胞につき多くの（500〜2,000の）ミトコンドリアが存在していることの結果として、ある意味では「劣性（recessive）」である。さらに、ミトコンドリアゲノムは、損傷を受けたゲノムを有するミトコンドリアの非常に高いレベル（９０％まで）を許容できる。このことは、残存する野生型ｍｔＤＮＡによる相補性を通じて起こる（Chomynら(1992)）。しかしながら、突然変異したゲノムは、通常小さいため、野生型ゲノムに対して複製の利点を有しており（Hayashiら(1991)）、したがって、突然変異したｍｔＤＮＡはクローン拡大する。このことは、核遺伝子と異なり、ｍｔＤＮＡ突然変異がいる細胞に対する選択がほとんどないかまたは全くないということを示唆している。このような高い突然変異率のために、ｍｔＤＮＡに現れる突然変異および（または）欠失は、細胞の寿命の間維持され、種々の変異原にさらされたことの記録として役立つ。ｍｔＤＮＡの全体性（integrity）は、核修復機構によって維持される。これらの遺伝子座における欠陥は、多数のミトコンドリア欠失と関連する常染色体優性異常（autosomal dominant disorder）に帰着することになることが示唆されている（Zevianiら(1990)）。したがって、ｍｔＤＮＡは、種々の癌またはその他の病気と関連した初期の核事象の初期の見張り役として機能する。最後に、ミトコンドリアゲノムは、その配列を決定することができ、個人ベースで突然変異を監視することができる。
【００９６】
非黒色腫皮膚がんの診断
本発明の好ましい実施例では、非黒色腫皮膚がん（ＮＭＳＣ）におけるｍｔＤＮＡの変化や固形腫瘍の発達を示す前駆体損傷の初期診断のためのシステムが提供されている。共通欠失（common deletion）、関連する突然変異、ｍｔＤＮＡにおいて未だ特徴付けられていない欠失の発生のような特定の変化が、潜在的な皮膚がんの信頼できるバイオマーカーとして役立つ。ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるすべてのｍｔＤＮＡゲノムの突然変異指紋（フィンガープリント）が決定される。このようにして、ｍｔＤＮＡの変化が、ヒトの皮膚がんおよびその前駆体損傷の早期バイオマーカーとして確立される。次に、変性ＨＰＬＣが、注目されている配列において低レベルのヘテロプラスミーを評価するのに用いられる。このようなアプローチはまた、その他のヒトの腫瘍における早期変化の発達の見通しを提供することができる。
【００９７】
前立腺がんの診断
本発明の他の実施例においては、前立腺がんの診断のためのシステムが提供されている。年齢に関連した、ｍｔＤＮＡ欠陥の蓄積は、中年および老年に流行っている前立腺がんのようなある種の臨床疾患の発現に人をかかりやすくする。好ましい実施例においては、前立腺がんのルーチン・スクリーニングが、前立腺液からのミトコンドリアゲノム配列決定を通じて行われる。がん細胞に変異した上皮細胞の存在が、前立腺液からのｍｔＤＮＡの増幅を通じて決定される。このことは、デジタル直腸内診およびＰＳＡのような現行の診断技術の影を薄くしている。最近、Flissら（2000）は、膀胱がんの患者の尿のサンプルの中に突然変異のｍｔＤＮＡを認定した。前立腺液における同様の発見が、前立腺がんのための、侵襲でない（non-invensive）早期検出方法を提供する。全体として前立腺がんと対照的に、若い患者において攻撃的で成長の速い細胞の分化と同様にして、異なるタイプの前立腺がんを診断することが可能である。
【００９８】
老化と関連する突然変異の評価
本発明によるシステムおよび方法は、4977bpの「共通欠失」やミトコンドリアゲノムの他の突然変異（Liuら(1977))のような突然変異の増加頻度に基づいて、老化を評価するのに用いられてもよい。この情報は、健康調査データと協働して、同じ突然変異/欠失に帰着する別個の原因の統計上重要な区別を可能にする。幸いなことに、ｍｔＤＮＡは、卵を通じてのみ遺伝し、本来、本質的にクローンである（Van De Graaff & Fox(1955)）。このことは、年齢が関連した欠失の信頼できる頻度を決定するために、幾世代かにわたって母系の突然変異／欠失の注意深く管理された研究を可能にする。この情報は、老化のプロセスを遅らせる処置方法を開発するのに用いられてもよい。
【００９９】
試料の収集
生物学的試料は、ｍｔＤＮＡ配列のデータベースを構築する目的でまたは個人に診断検査を行う目的で、任意の既知の手段によって集めることができる。データベースの作成のために前もって用意される試料は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、腫瘍バンク、皮膚がんおよび前立腺がん（これらには限定されない）のような特異病を高い頻度で発症するグループまたは集団からの母系研究および健康状態や老化の評価とともに、同じ母系から影響を受けた人および影響を受けていない人の母系研究。たとえば、生物学的試料を収集して記録するのに、FTA^ョ Gene Cards^ョ が用いられてもよい。適切な試料は、中皮（体腔上皮）、上皮または内皮から得られた任意の組織または体液を含んでいる。このような組織および体液は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、血液、唾、頬細胞、唾液、前立腺液、汗、骨、髪、リンパ組織、子宮頸管塗抹、乳吸引物、おりもの、精液、月経出血および生検組織。好ましくは、約１００μlの血液、１００μg〜２５mgの固形組織が試料とされた。皮膚がんが疑われる場合には、（正常な、ＮＭＳＣの、および前駆体損傷からの）皮膚細胞または皮膚組織が皮膚生検またはルーチン・サクション・ブリスタリング法により採取される。病気が疑われる場合には、初期治療の医師、癌研究者またはその他の専門家は、患者から正常な組織と病気が疑われる組織の双方を抽出する。
【０１００】
たとえば、前立腺または皮膚の腫瘍の試料の場合、微小分割されてパラフィンが埋め込まれた組織の同型体の横断面（５ミクロン）は、一つのスライドがヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色される前に、パラフィンが取り除かれる。同型体は、当該分野で標準的なことではあるが、メチルグリーン（ＭＧ）を用いて染色されている。ＨＥ染色は、正常、前駆体について、および腫瘍の進行の適用可能な格付けについて、病理学者により格付けされる。同型体ＭＧスライドは、格付け細胞の製造者推薦（Arcturus）によると、レーザー捕捉に用いられる。
【０１０１】
ｍｔＤＮＡの抽出
分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）に記載されているように、ＤＮＡの抽出は、当該分野で知られている任意の方法を用いて行われ、これに続いて、ミトコンドリアゲノムの配列が決定される。
【０１０２】
ｍｔＤＮＡの配列決定
＜ＰＣＲ＞
本発明によるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。ＰＣＲ法は、当該分野の当業者にはよく知られている。ＰＣＲには、増幅される核酸の存在、増幅される配列の両側に位置する二本鎖のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝剤および塩が必要である。ＰＣＲの手法は、当該分野ではよく知られている。ＰＣＲは、MullisおよびFaloona(1987)の Methods Enzymolの155:335（引用によって本明細書中に含まれる）に記載されているように実行される。
【０１０３】
一般に、ＰＣＲは、鋳型（template）ＤＮＡ（少なくとも１fg；より有効的には１〜1000 ng）および少なくとも２５pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実行される。典型的な反応混合物は、２μlのＤＮＡ、２５pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μlの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝剤１（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、０．４μlの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μl（または２．５ユニット）の Taq ＤＮＡ ポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、および総量２５μlの脱イオン水を含んでいる。流動パラフィン（mineral oil）で覆われて、ＰＣＲは、プログラム可能な熱循環器を用いて実行される。
【０１０４】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度は、サイクルの数とともに、実際上、過酷な必要条件によって調整されている。アニール温度およびタイミングは、プライマーが鋳型にアニールすると期待される効率と、許容されるミスマッチの程度との双方によって決定される。プライマーのアニールする条件の厳しさを最適化することができる能力は、当該分野における通常の技術者の一人の知識の範囲内である。３０〜７２℃の範囲のアニール温度が用いられている。一般に、鋳型分子の初期の変性が通常９２〜９９℃の範囲の温度で４分間発生し、変性からなる２０〜４０サイクル（９４〜９９℃で１５秒〜１分間）がこれに続いて、アニーリング（上述のように決定された温度で１〜２分間）および伸長（７２℃で１分間）が生じる。最終の伸長工程は、一般に７２℃で４分間実行され、次に４℃で（０〜２４時間）不定の工程がこれに続く。
【０１０５】
＜ＤＮＡ配列決定＞
ミトコンドリアゲノムの配列を決定するための任意の既知の手段が用いられてよい。好ましくは、ｍｔＤＮＡは、配列の決定に先立って、ＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ生成物は、直接その配列が決定されるか、あるいはバクテリア宿主に配置されるベクターにクローン化される。ＤＮＡシークエンス法の例は、Brumley, R.L. Jr.および Smith, L.M.（1991）による「横型超薄ゲル電気泳動による高速ＤＮＡシークエンス（Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis）」(Nucleic Acids Res. 19:4121-4126)と、Luckey, J.A.ら(1993)による「毛細管ゲル電気泳動による高速ＤＮＡシークエンス（High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis）」(Methods Enzymol. 218: 154-172)とに見出される。ｍｔＤＮＡの配列決定およびＰＣＲを組み合わせて使用することは、Hopgood, R.ら(1992)による「ＰＣＲ生成物から直接ヒトのｍｔＤＮＡの配列を自動的に決定するための方法（Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products）」(Biotechniques 13:82-92)および Tanaka, M ら(1996)による「ｍｔＤＮＡの自動配列決定（Automated sequencing of mtDNA）」(Methods Enzymol 264:407-421)に記述されている。
【０１０６】
＜欠失分析および検出＞
好ましいアプローチは、伸長鋳型（Expand Long Template）ＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim）を用いた伸長（long extension）ＰＣＲ（ＬＸ−ＰＣＲ）技術である。ＬＸ−ＰＣＲ技術は、Birch-Machin 研究所において確立され実証されたものであるが、これを用いることにより、単一の欠失の事象と対比して、ｍｔＤＮＡのすべてのスペクトルのために迅速にスクリーンする機会が提供される。
【０１０７】
全ｍｔＤＮＡの中のｍｔＤＮＡ⁴⁹⁷⁷欠失の比率を評価するのに、半定量化ＰＣＲ法（Corral-Debrinskiら(1991)）を用いることができる。
【０１０８】
また、サザンブロットや同位元素で標識化されたプローブ技術、および当該分野で標準的な他の任意の技術を欠失検出にも用いるようにしてもよい。
【０１０９】
＜ＰＣＲ生成物の配列決定＞
ＰＣＲ生成物の配列を決定するのに、任意の既知の手段が用いられてよい。好ましくは、すべてのＤＮＡ配列は、ABI Big Dye Terminator^TM技術と、各々重鎖および軽鎖のための一連の７２オーバラッププライマーとを用いたジデオキシ配列決定法によって特徴付けられている。配列決定は、一つについて、または幾つかについて、あるいは310，3100または3700のＡＢＩプラットフォームの組合せについて、生じる。配列決定反応は、製造者の推薦に応じて実行される。
【０１１０】
変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ： Denaturing High Performance Liquid Chromatography ）を用いたミトコンドリアゲノムの突然変異分析
ミトコンドリアゲノムの配列決定および突然変異のホットスポットの識別に先立って、多くの試料の中の突然変異を迅速にスクリーンするのに、ＤＨＰＬＣを用いることができる。この技術は、低レベルのヘテロプラスミー（heteroplasmy）の識別に高感度を提供する。これは、ホモプラスミーな（homoplasmic）変化を検出することはできないが、伝統的な配列決定技術を補完するものである。最近腫瘍内で識別されたホモプラスミーの突然変異は別にして、報告された大多数のｍｔＤＮＡの突然変異はヘテロプラスミーである（Chinneryら(1999)）。これらのヘテロプラスミーな（heteroplasmic）ｍｔＤＮＡ変化は、ｍｔＤＮＡのＰＣＲ増幅の後にヘテロ二本鎖（heteroduplexes）に帰着する。ヘテロプラスミーなｍｔＤＮＡ突然変異のための迅速なスクリーニングは、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ：Denaturing High Performance Liquid Chromatography）という比較的新しい技術を用いて決定される。この技術は、ヘテロプラスミーな点突然変異に関して５％よりも低いレベルまで、すべてのｍｔＤＮＡゲノムを迅速にスクリーンして識別するのに最近用いられてきた（Van den Boschら(2000)）。
【０１１１】
このＤＨＰＬＣは、完全自動化スクリーニングを提供する Wave^TM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha. USA) に基づいて実行されてもよい。ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーな突然変異をスクリーンするのに、同じ技術を用いることが可能である。好ましくは、すべてのｍｔＤＮＡゲノムは、van den Boschら(2000)により記述された二つの異なるＰＣＲ条件を用いることによって、１３のオーバラップ断片においてＰＣＲにより増幅されている。１〜２kbのＰＣＲ生成物が、９０〜６００bpの断片に分解され、その最適な溶融温度で分割される。突然変異は、二つのピークで表され、２％ヘテロプラスミーよりも低いような低比率の突然変異は、ピークの肩部（shoulder）として表される。
【０１１２】
ＤＮＡ配列の決定は、当該分野で知られているマイクロアレイを用いて行うことも可能である。
【０１１３】
データの分析
一旦配列が決定されると、正常なｍｔＤＮＡ配列および病気が関連したｍｔＤＮＡ配列が、データベースでの比較のために記録される。再配列決定装置（resequensing devices）、マイクロアレイ技術（micro-array technology）、一体型微少流体増幅・分析システム（integrated microfluidic amplification and analysis system）、高速・高処理突然変異検出法（high-speed, high-throughput, mutation detection method）およびその他の方法がすべて本発明の方法とともに用いられてよい。
【０１１４】
個人のミトコンドリアゲノムの配列決定から得られたデータは、集団レベルのデータと比較される。データは、上述したように、試料の入手およびｍｔＤＮＡの配列決定を通じて、獲得される。好ましくは、データベースは、母系研究からの情報を含んでいる。集団レベルデータは、データベースに保有されている。任意の適切なデータベースを使用可能である。
【０１１５】
臨床および生物学的データの多次元評価研究データベース（multidimensional evaluation research database）が用いられている。これは、この事業に携わる研究所によって集められた情報の収集、加工および流布のために必要なバイオ情報科学の基盤を提供する。このデータベースは、動的かつ強力な資源となるネットワークとリンクする中央電子システムである。
【０１１６】
データベースは、任意の既知の手段、好ましくは安全なインターネットを介して、アクセスされるようにしてもよい。好ましくは、データベースは、サーバーに構築されるとともに最適な性能および測定可能な特徴部分を通じて多数のユーザーをサポートするアプリケーションサーバーの使用を採用するｅ-コマース・アルゴリズムを用いて開発されている。別個の「ウエブ」サーバーは、すべての内容、アプリケーションおよび処理がユーザーに到達する前にそこを通じて流れなければならない中央ポイントとして機能し得るので、ウエブサイトのアーキテクチャーの基礎を提供することができる。
【０１１７】
当該分野で知られているデータ発掘アルゴリズムは、データからパターン、集団およびモデルを発見するのに利用されている（SAS 2000）。さらに、知能アルゴリズムおよび方法は、突然変異の発生、突然変異率、病気検出のための突然変異のパターン、情報回収、およびその他の複雑な配列分析ソフトウエアのために、開発されるだろう。
【０１１８】
核酸要素およびプローブ
本発明は、ターゲット核酸配列に特異的に結合する核酸要素およびプローブを提供する。ターゲット核酸配列は、前立腺がん、非黒色腫皮膚がんなどの病気を示すものとして、検出されるべき核酸または核酸の一領域である。本発明のマイクロアレイを用いて分析されるべきターゲット核酸配列は、好ましくは、ヒトの組織または体液の試料から採取されている。本発明は、ＲＮＡ、ＲＮＡに対応する核酸（つまりｃＤＮＡ）、またはＤＮＡからなるターゲット核酸配列を提供する。核酸要素は、本発明によるアレイを構成するための固形支持部と安定して結合している。核酸要素は、一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片でもよい。
【０１１９】
本発明はまた、プローブを構成するポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書中で用いられているように、「プローブ」という語は、ターゲット領域に配列を有するプローブにおいて少なくとも一つの配列の相補性のために、ターゲット核酸に配列を有する二重構造を形成するオリゴヌクレオチドを指している。プローブは、当該分野で知られる方法により、標識化されていてもよい。本発明によるプローブは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１２０】
診断装置
本発明は、特異病を診断しまたは特異突然変異を識別するのに用いられるバイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイのような診断装置を含んでいる。配列が決定されたすべてのミトコンドリアゲノムは、塩基対配列の一致構造を生成するように評価されるとともに、特定の病気または機能疾患に関連した突然変異および塩基対欠失の比率の抑制指数を付与される。診断装置は、次に、バイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイを生成するのに使用される。
【０１２１】
特定の病気、病状または機能障害に関連した配列が一旦識別されると、オリゴヌクレオチドのアレイへのｍｔＤＮＡのハイブリダイゼーションが特定の突然変異を識別するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションの任意の既知の手法が用いられてよい。好ましくは、野生型または突然変異領域とマッチするオリゴヌクレオチドプローブおよび制御プローブを有しているアレイが用いられる。マイクロアレイまたは遺伝子チップのような市販可能なアレイが適している。これらのアレイは、適合した何千もの制御プローブ対をスライドまたはマイクロチップの上に有している。ゲノムおよびＤＮＡ配列分析におけるマイクロアレイの使用について記述する雑誌の記事は、www.gene-chips.com で入手可能である。
【０１２２】
＜マイクロアレイ＞
ポリヌクレオチドアレイは、一つまたはそれ以上のターゲット核酸配列を有する試料内で多数のポリヌクレオチドの分析を可能にする高速処理技術を提供する。本発明のアレイは、遺伝子発現分析、病気の診断および予後（例：治療、ドラッグスクリーニングなどに対する患者の反応の監視）に有用である。
【０１２３】
病気、老化またはその他健康が関連した突然変異を示すｍｔＤＮＡのポリヌクレオチド配列の任意の組合せが、マイクロアレイの構築のために用いられる。
【０１２４】
マイクロアレイを用いて分析されるべきターゲット核酸試料は、上述したように、十分な量のｍｔＤＮＡを含む任意のヒトの組織または体液、好ましくは前立腺液、固形腫瘍、血液または尿から採取される。ターゲット核酸試料は、相補核酸要素/ターゲット複合体のハイブリダイゼーションのパターンを生じさせるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、ポリヌクレオチド要素と接触させられる。
【０１２５】
＜マイクロアレイの構築＞
マイクロアレイは、固形支持部の一方の面に付着した複数の特定（unique）のポリヌクレオチドを有している。ポリヌクレオチドの各々は、予め選択された同一でない領域において固形支持部の面に付着している。アレイ上の各関連試料は、以下により詳細に記述されるように、既知のアイデンティティー（identity）、通常は既知の配列のポリヌクレオチド成分を有している。本発明においては、考えられる任意の基質を採用するようにしてもよい。
【０１２６】
アレイは、既知の任意の手段を用いて構成される。核酸要素は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や逆転写（ＲＴ）のような，確立された技術を用いて生成されてもよい。これらの手法は、当該分野で現在知られている技術と類似している（例えば PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al.(1995) および PCR: Introduction to Biotechniques Series, C.R. Newton, A. Graham (1997) 参照）。増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野でよく知られた方法（例：カラム精製）によって精製される。ポリヌクレオチドは、所望のポリヌクレオチドの合成の間に生成された不完全な生産物およびポリマーが実質的にないときには、純粋であると考えられている。好ましくは、精製されたポリヌクレオチドもまた、分子の結合作用を妨げたり邪魔をしたりする汚染物が実質的にないだろう。
【０１２７】
本発明のアレイにおいては、ポリヌクレオチドの構成成分が、固形支持部の表面に安定して結合している。支持部は、可撓性のあるまたは堅い固形支持部である。
【０１２８】
本発明においては、核酸要素が付着する任意の固形支持部を用いてよい。適切な固形支持部の材料の例は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、ガラスおよびシリカゲルのようなケイ酸塩、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ラテックス、ラバー、およびテフロン^TMのようなフッ化炭素樹脂。
【０１２９】
堅い支持要素は、スライドやビード（これらには限定されない）を含む幅広い種類の形状で用いられてよい。スライドは、いくつかの機能上の利点を提供しており、固形支持部の好ましい形態である。その平坦な面のために、ガラススライドを用いることにより、プローブやハイブリダイゼーション試薬が最小にされる。スライドはまた、試薬のターゲット応用を可能にし、一定の温度に保持するのを容易にし、洗浄を容易にするとともに、固形支持部に固定化されたＲＮＡおよび（または）ＤＮＡの直接的な視覚化を容易にする。固形支持部に固定化されたＲＮＡおよび（または）ＤＮＡの除去についても、スライドを用いることにより容易になる。
【０１３０】
固形支持部として選択される特定の材料は、記述された機能を提供する限りにおいて、本発明に本質的なものではない。通常、本発明を生産しまたは使用する者は、コスト面、入手可能性、最終生成物において期待される応用条件、および全製造工程の需要に基づいて、最良の市販可能な材料を選択するだろう。
【０１３１】
本発明の核酸要素を基質に付着させる（スポッティングと称される工程）ための多くの手法が用いられている。たとえば、ポリヌクレオチドは、米国特許第5,807,522号の技術を用いて付着されている。なお、当該米国特許は、ポリマー付着の方法を教示するために、引用することによって本明細書の中に含まれている。あるいは、スポッティングは、密着印刷技術（contact printing technology）を用いて実行される。
【０１３２】
各構成成分に存在するポリヌクレオチドの量は、アレイが採用される分析の間にターゲットポリヌクレオチド配列の検出および十分なハイブリダイゼーションを提供するのに十分であろう。一般に、アレイの固形支持部と安定して結合する各核酸要素の量は、少なくとも約０．１ngであり、好ましくは少なくとも約０．５ngであり、より好ましくは少なくとも約１ngである。各核酸の量は、せいぜい１０００ngまたはそれ以上であり、通常は約２０ngを超えない。拡散要素が、全体として円の大きさを有するスポット内において固形支持部の上にスポットされる場合、スポットの直径は、一般に約10〜5,000μmの範囲であり、大抵約20〜2,000μmであり、普通は約50〜１,000μmである。
【０１３３】
プローブが標識化されるターゲット以外の試料においてポリヌクレオチドに対する非特異性結合またはクロス・ハイブリダイゼーションを監視するために、制御ポリヌクレオチドは、アレイ上にスポットされて、ターゲット発現制御ポリヌクレオチドおよびミスマッチ制御ヌクレオチドとして用いられてもよい。このため、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的かそうでないかを示す。たとえば、もしターゲットが存在していれば、完全にマッチしたプローブがミスマッチプローブよりも常に明るいはずである。また、もしすべて中央のミスマッチが存在していれば、ミスマッチプローブが突然変異を検出するのに使用される。
【０１３４】
＜ターゲットの準備＞
マイクロアレイのためのターゲットは、ヒトの体液または組織の試料から採取される。ハイブリダイゼーションに先立って、ターゲット核酸試料を増幅するのが望ましいであろう。当該分野の当業者は、どんな増幅方法が用いられようとも、もし定量的結果が望ましいのであれば、増幅されたポリヌクレオチドの相対的頻度を制御しまたは維持する方法を使用するように注意しなければならないということを理解するだろう。「定量」増幅の方法は、当該分野の当業者には周知である。たとえば、定量ＰＣＲは、同じプライマーを用いて既知の量の制御配列を同時に増幅することを含んでいる。このことは、ＰＣＲ反応を較正するのに用いられる内部基準を提供する。高密度のアレイは、増幅されたポリヌクレオチドの定量化のための内部基準に特異性を有するプローブを含んでいてよい。定量ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis らによる Academic Press, Inc. N.Y.(1990)に提供されている。その他の適切な増幅方法は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Innis, et al., PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990)）, リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）(Wu and Wallace, Genomics, 4: 560(1989), Landegren, et al., Science, 241: 1077(1988) and Barringer, et al., Gene, 89: 117(1990), transcription amplication（Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173(1989)) および自動継続配列複製（self-sustained sequences replication）(Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990))。
【０１３５】
本発明は、標識ターゲットまたは標識プローブを提供する。本発明においては、分子内に付着されまたは組み込まれた、分析的に検出可能な任意のマーカーを用いてよい。分析的に検出可能なマーカーは、分析的に検出されて定量化される任意の分子、原子団または原子を指している。本発明への使用に適した検出可能な標識は、分光、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学または化学的手段によって検出可能な任意の構成成分を含んでいる。本発明に有用な標識は、標識化ストレプタビジン抱合体で染色されるビオチン、磁気ビード（例：Dynabeads^TM）、蛍光染料（例：フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質など）、放射能標識（例：^３Ｈ，^１２５Ｉ，^３５Ｓ，^１４Ｃまたは^３２Ｐ）、酵素（例：西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡ（エンザイムイムノアッセイ）において一般に使用されているその他のもの）、および金コロイド、着色ガラス、プラスチックビード（例：ポリスチレン、ポリプロプレン、ラテックスなど）のような比色標識を含んでいる。このような標識の使用について教示する特許は、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、第4,366,241号を含んでいる。
【０１３６】
このような標識を検出する手段は、当該分野の当業者にはよく知られている。したがって、たとえば、放射能標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンター用いて検出され、蛍光マーカーは、放出した光を検出する光検出器を用いて検出される。酵素標識は、典型的には、基質に酵素を与え、基質上の酵素反応により生成される反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色標識を単に視覚化することによって検出される。
【０１３７】
標識は、当該分野の当業者によく知られた多くの手段のうちのいずれかによって組み込まれる。なお、好ましい実施例においては、標識は、試料のポリヌクレオチドの準備における増幅工程の間に同時に組み込まれている。このため、たとえば、標識化プライマーまたは標識化ヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、標識化された増幅生成物を提供するだろう。好ましい実施例においては、上述したように、標識化ヌクレオチド（フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いた転写増幅は、標識を転写ポリヌクレオチドに導入している。あるいは、標識は、元のポリヌクレオチド試料（例：ｍＲＮＡ，ポリＡ ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡなど）に、または増幅完了後の増幅生成物に直接加えてられてもよい。ポリヌクレオチドに標識を付ける手段は、当該分野の当業者にはよく知られており、たとえば、試料のポリヌクレオチドを標識（例：fluorophore）に結合するポリヌクレオチドリンカーの次の付着（連鎖反応）およびポリヌクレオチドをキナーゼ化することによるニックトランスレーションや端部標識化（end-labeling）（例えば標識化ＲＮＡとの）を含んでいる。
【０１３８】
好ましい実施例では、ターゲットは、マイクロアレイから発生した信号を平均化するために、マイクロアレイ上のプローブを制御するように雑種核酸を作る一つまたはそれ以上の制御分子を含んでいる。標識化された平均化ターゲットは、上述したようにマイクロアレイ上にスポットされるオリゴヌクレオチドを制御するように完全に相補的なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション後に平均化制御から得られた信号は、ハイブリダイゼーション条件の変化、標識強度の変化、効率の「読み（reading）」の変化、完全なハイブリダイゼーション信号をアレイ間で変化させる他の要因の変化のための制御を提供する。
【０１３９】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションは、プローブまたはターゲット核酸要素およびその相補的ターゲットが相補的な塩基対合を通じて安定したハイブリッド二重構造を形成することができる条件下で、変性プローブまたはターゲット核酸要素およびターゲットポリヌクレオチドを提供することを含んでいる。ハイブリッド二重構造を形成しないポリヌクレオチドは、付着された検出可能な標識の検出を通じて検出されるべきハイブリッド形成のポリヌクレオチドを残したまま、洗い流される。ポリヌクレオチドは、温度を上げたり、ポリヌクレオチドを含む緩衝液の塩濃度を下げたりすることによって変性することが、一般に認識されている。低緊縮条件（low stringency conditions）下(例：低温および/または高濃度塩分)では、アニーリングされた配列が完全に相補的でない場合においても、ハイブリッド二重構造体（例：ＤＮＡ：ＤＮＡ，ＲＮＡ：ＲＮＡ，ＲＮＡ：ＤＮＡ，ｃＤＮＡ：ＲＮＡ，ｃＤＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。このため、ハイブリダイゼーションの特異性は、低緊縮時には減少する。これとは逆に、高緊縮（higher stringency）時(例：高温または低濃度塩分)においては、成功したハイブリダイゼーションがほとんどミスマッチを要求しない。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当該分野の当業者にはよく知られている（例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Polynucleotide Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.(1993)）。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリッド形成されずに標識化されたまたは標識化されていないポリヌクレオチドが、好都合なことに洗浄によって支持面から取り除かれる。これにより、ハイブリッド形成されたターゲットポリヌクレオチドのパターンが支持面上に生成される。種々の洗浄液が当該分野の当業者に知られており、これらが用いられてよい。結果として生じるところの、標識化されてハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドおよび（または）ポリヌクレオチドのハイブリッド形成のパターンは、種々の方法で視覚化されて検出されてよい。特定の検出方法が試験ポリヌクレオチドの特定の標識に基づいて選択されており、代表的な検出手段は、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定などを含んでいる。
【０１４１】
＜イメージ獲得およびデータ分析＞
上述したように、ハイブリダイゼーション、任意の洗浄工程および（または）その後の処理に続き、その結果として生じるハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出しまたは視覚化する際には、標識の強度または信号値が検出されるだけでなく、定量化される。このことは、ハイブリダイゼーションの各スポットからの信号が測定されて、既知の数の端部標識化ターゲットポリヌクレオチドにより発せられる信号に対応する単位値と比較され、これにより、ハイブリダイゼーションパターンにおいてアレイ上の特定のスポットにハイブリッド形成される各端部標識化ターゲットのコピー数の数または絶対値が得られるということを意味している。
【０１４２】
アレイへのハイブリッド形成から集められたデータを分析する手法は、当該分野ではよく知られている。たとえば、ハイブリッド形成の検出が蛍光標識を含んでいる場合には、データ分析は、集められたデータから基質位置の関数として蛍光強度を決定し、異常値つまり所定の統計分布から外れているデータを除去し、残りのデータから試験ポリヌクレオチドの相対的な結合親和性を計算する工程を含み得る。残りのデータは、関連するオリゴヌクレオチドと（または）ポリヌクレオチドと試験ポリヌクレオチドとの間の結合の親和性に応じて変化する各領域の強度を備えたイメージとして示されている。
【０１４３】
検出または視覚化に続いて、ハイブリッド形成のパターンが、ハイブリッド形成パターンを生成するようにアレイと接触した標識化ターゲットポリヌクレオチド試料の遺伝子の特徴のみならず、標識化ターゲットポリヌクレオチド試料が取り出された生理学的出所についての定量的情報を決定するのに用いられている。遺伝子の特徴は、試料内に存在するポリヌクレオチドの型に関する、すなわち相補性を有する遺伝子の型のみならず試料内の特定のポリヌクレオチドのコピー数に関する情報を意味している。
【０１４４】
＜診断検査または予後検査＞
本発明は、病気を検出するための診断検査を提供する。本発明はまた、治療に対する患者の反応を観察するための予後検査をも提供する。本発明の方法によれば、病気の存在または治療に対する患者の反応が、患者から体液または組織試料を採取することによって検出される。体液または組織の試料から、核酸を含む試料が用意される。試料から抽出された核酸は、固形基質および複数の核酸要素を含むアレイに対してハイブリッド形成される。各要素は、病気あるいは病気素質または機能障害素質の存在を示している。この診断検査によれば、アレイ上の一つまたはそれ以上の核酸要素に対する、核酸を含む試料のハイブリッド形成が、病気、病気素質または機能障害素質を示しており、さらに予後検査の場合には、治療に対する患者の反応を示している。
【０１４５】
本発明のその他の有用性は、上述したように、また以下の例に示すように、当該分野の当業者にはすぐに明らかとなるだろう。
【０１４６】
本発明は、以下の実例においてさらに詳細に記述されている。多数の変更例や変形例が当該分野の当業者には明らかであるので、これらの実例は単なる例示にすぎない。
【０１４７】
実例１：前立腺腫瘍
前立腺液の採取または前立腺腫瘍を切除する外科手術に続いて、変異細胞または癌細胞を特定するために、生検スライドが準備される。正常、良性または悪性の細胞を組織部分から分離するのに、レーザー捕捉微小切断（ＬＣＭ：Laser Capture Microdissection）顕微鏡検査が用いられる。前癌性細胞や癌細胞浸潤グループのような、対象となっている罹病細胞の入手は、周囲の外性細胞の中から可能である。
【０１４８】
これらの各細胞からのすべてのＤＮＡ抽出物は、Arcturus Engineering Inc. によって概略示されたプロトコルの変形例に応じて精製される。ＤＮＡは、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０内において、１mg/mlのプロテイナーゼＫ（ＰＫ）の５０μlの容積をもって、４２℃で一晩かけて細胞から抽出された。４２℃で一晩培養した後、培養炉から管が取り出された。試料は、6400rpm（2000 x g）で５min遠心分離された。CapSure^TMが管から取り外されて廃棄された。管は、９５℃で１０分間培養されて（ＰＫは不活性）、室温まで冷却された。５〜５０μlの試料がＰＣＲ増幅のために用いられた。
【０１４９】
精製に続いて、超可変領域１（ＨＶ１）、超可変領域２（ＨＶ２）およびすべての１２Ｓ領域のための適切なプライマーを用いてＬＸ−ＰＣＲにより、個々の試料が増幅される。次に、これらのＰＣＲ生成物は、当該分野でよく知られた高速処理法を用いて配列決定される。
【０１５０】
実例２：太陽にさらされた皮膚からのｍｔＤＮＡの非コード領域の複製
Qiagen により供給された DNeasy^TM キットを使用して、実例１に記述されたように、組織試料からＤＮＡが抽出された。太陽にさらされたことに関連した非コード領域（ＮＣＲ）のタンデム重複の発生を調査するのに、「背中合わせ（back to back）」のプライマー法が用いられた。３２歳に匹敵する、太陽にさらされた体の部位（n=24）および太陽から保護された体の部位（n=10）からのヒトの皮膚の分割試料が調査された。
【０１５１】
Brockingtonら(1993) およびLeeら(1994)からの以下の重複プライマーが用いられた。
C L336 AAC ACA TCT CTG CCA AAC CC 20 mer
D H335 TAA GTG CTG TGG CCA GAA GC 20 mer
E L467 CCC ATA CTA CTA ATC TCA TC 20 mer
F H466 AGT GGG AGG GGA AAA TAA TG 20 mer
【０１５２】
プライマー対であるＣ/ＤおよびＥ/Ｆは、非コード領域の直列反復における二つの隔てられた組の部位において、「背中合わせ（back to back）」である。このため、もしこれらの部位に重複が存在していれば、直列反復は単に生成物を生成するだけである。生成される生成物は、２６０bpおよび（または）これより少ない２００bpの共通バリアントである。変更されたＰＣＲ条件は、以下のとおりである。総量100ngの細胞ＤＮＡ、200μMの ｄＮＴＰ、２．５Ｕ HotStar Taq ポリメラーゼおよびＰＣＲ緩衝液（Qiagen, UK）、９４℃４分間を１サイクル、９４℃ x１分間、５５℃ x １分間および７２℃ x １分間を３６サイクル、ならびに７２℃７分間を１サイクルである。
【０１５３】
太陽への露出の増加とともに、重複の発生の増加が観察された。太陽にさらされた皮膚からの試料と太陽から保護された皮膚からの試料とについてそれぞれ１０/２４で重複が確認され、０/１０で重複が確認されなかった（Fisher’s exact test, p=0.015）（Birch-Machin and Krishnan 2001）。もっとも頻度の高い重複のサイズは、２００および２６０塩基対であった。興味深いことに、これらの同じ試料はまた、実例６に記述されている、確立された定量化３プライマーＰＣＲ分析によって決定されたような高レベル（＞1%）の4977bpの共通ｍｔＤＮＡ欠失を含んでいた。
【０１５４】
実例３：ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるｍｔＤＮＡの突然変異フィンガープリント
Qiagen によるDNeasy^TM を用いて、実例１に記述されたヒトの皮膚組織試料からＤＮＡが抽出された。特定のプライマーを用いて、ｍｔＤＮＡは、ＰＣＲおよびこれに続くＤＮＡ試料の準備（Qiagen）によって増幅された。突然変異は、BigDye^TM Terminator Cycle 配列決定を用いた自動配列決定（PE Applied Biosystems）によって認識された。このようなやり方は、Healyら(2000)および Heardingら(2000)に記述されている。偽遺伝子やその他の核遺伝子座を増幅しないことで知られている、確立されたＰＣＲプライマー対を用いて、すべての16,569bpのヒトのミトコンドリアゲノムの配列が決定される。推定される任意のＤＮＡ変化は、改訂された「ケンブリッジ」ヒトｍｔＤＮＡ文献（Andrewsら(1999)）と比較することによって確認される。腫瘍のｍｔＤＮＡから得られた配列は、まず、既知の多型性（Andrewsら(1999); MITOMAP）のために比較され、次に、純粋な体細胞突然変異を認識するために、正常な皮膚からのｍｔＤＮＡ配列と比較される。
【０１５５】
完全自動化スクリーン処理を提供するＤＨＰＬＣが、WAVE^TM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, USA) において実行される。同じ技術は、皮膚腫瘍ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーのためにスクリーンするのに用いられる。
【０１５６】
実例２に記述されたような背中合わせ（back to back）プライマー法を用いて、非コード領域（ＮＣＲ）の非常に変化しやすい部分においてＤＮＡ長さの突然変異（つまりタンデム重複）のパターンが迅速にスクリーニングされる。
【０１５７】
実例４：ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるすべてのミトコンドリアゲノムの欠失スペクトル
扁平上皮細胞がん（ＳＣＣＳ）、基底細胞がん（ＢＣＣＳ），およびボーエン病や化学線角化症のような推定される前駆体損傷におけるｍｔＤＮＡ損傷が、太陽にさらされた体の異なる部位から採取された隣の皮膚と比較された。すべてのミトコンドリアゲノムを増幅してｍｔＤＮＡのすべての欠失スペクトルを決定するために、長ＰＣＲ技術（ＬＸ−ＰＣＲ）（Rayら(1998)）が用いられた。無数の特異欠失が、すべてのミトコンドリアゲノムにおいて発生するのが観察された。しかしながら、すべての欠失が非黒色腫皮膚がんと相関関係を有するとは限らないが、正確な診断方法のためには、病気と関連する欠失が知られなければならない。
【０１５８】
ＤＮＡは、生産者の推薦に応じて、市販のキット（Qiangen）を用いて抽出される。すべてのミトコンドリアゲノムは、Expand TM Long Template PCR Systems^TM (Boehringer Manheim, スイス)を用いて、別個の二つの反応で増幅される。使用されるＰＣＲプライマーは、ケンブリッジ配列（Andrewsら(1999)）の以下の領域をカバーする、Kleinleら(1997)により記述されたものである。すなわち、ＤＩＡ(ヌクレオチド(nt)336-363)，ＤＩＢ(nt 282-255)，ＯＬＡ(nt 5756-5781)，およびＯＬＢ(nt 5745-5781)である。これらの大きな生成物は、核偽遺伝子の増幅を排除する。プライマーの配列は以下のとおりである。
DIAF:(336-363) 5' AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3'
OLBR:(5745-5721) 5' CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3'
OLAF:(5756-5781) 5' GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3'
DIBR:(282-255) 5' ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3'
【０１５９】
増幅は、１６pmolの各プライマー、５００μmolのｄＮＴＰ、２２．５MmのＭｇＣｌ_２および界面活性剤（キット）を含む１０ x ＰＣＲの緩衝剤、０．７５μlの酵素（３．５ x １０^３単位/ml）および５０〜２００ngの全ＤＮＡを含む５０マイクロリッターの反応液内で実行される。一つの反応がゲノムの11,095bpの部分を生成し、他の反応が5,409bpの長さに帰着する（例えばKleinleら(1997)）。ＰＣＲ増幅条件は、９３℃で１分３０秒の変性段階と、これに続く、９３℃３０秒、６０℃３０秒および６８℃１２分の１０サイクルと、さらにこれに続く、同じ温度変化の２０サイクルであって各サイクルに５秒の延長時間が加えられたものとから構成されている。そして、９３℃３０秒、６０℃３０秒および６８℃２６分の最終サイクルがある。再生産性を確保するために、１％アガロースゲル上で既知の量のＤＮＡが分離されており、少なくとも同じ量のＤＮＡを有している試料のみが分析に含まれている。
【０１６０】
表２に示すように、腫瘍試料においてＵＶにさらされる時間が増えるほど、平均的に多数の欠失が発見されている。
【表２】

【０１６１】
実例５：老化およびｍｔＤＮＡ
ヌクレオチドの塩基対の配列をその特異分子および可能な時間変化のために最終的に明確にするために、与えられた組織から抽出されたｍｔＤＮＡのすべての配列が、時間的な母系比較（つまり曾孫から祖父母までの）を用いて、迅速かつ正確に決定される。これらの特徴付けは、大きな集団の中の特異な母系間で、健康状態および老化のインジケータと比較される。この組み合わされた情報は、同じ突然変異/欠失に帰着することになる別個の原因の間の重要な統計的区別を与えるとともに、バイオマーカーとして用いられるｍｔＤＮＡ配列が、その有効性を確立するために、要求された特異性指数と感度を有しているということを証明している。また、塩基対の欠失および突然変異の比率が、一貫性のために、母方の４世代にわたって種々の組織で比較される。最近の方法論の発達は、血液試料において老化に影響を与える塩基対欠失の検出を可能にするとともに（Bassamら(1991)）、ｍｔＤＮＡを研究するのに、骨格筋の代わりに血液試料が用いられてもよいという可能性を高めた（Von Wurmbら(1998)）。ｍｔＤＮＡの欠失および/または突然変異の代表例として、筋肉組織の代わりに白血球を採用する有効性を確立した後で、次の工程は、白血球中のｍｔＤＮＡのみを評価するだけである。次に、ｍｔＤＮＡの欠失/突然変異が、既述したようにして決定される。
【０１６２】
骨格筋または白血球は、患者から採取された。ＤＮＡは、実例１で実行されたようにして抽出された。以下のプライマーが用いられた。
12ST1:(1257-1279) 5' TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3'
12ST2:(1433-1411) 5' TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3'
D1F: 5' CCTTACACTATTCCTCATCACC 3'
D1R: 5' TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3'
【０１６３】
増幅は、２．０μmolの各プライマー、２５０μmolのdNTP、１０ x PCR緩衝剤（Thermopol Reaction Buffer）、ウシ血清アルブミン、０．５単位のDeep vent ポリメラーゼ、および５０−２００ng の全ＤＮＡを含む５０マイクロリッターの反応液中で実行された。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性段階（ホットスタート）と、これに続く、９４℃３０秒間、６０℃６０秒間、７２℃１０分間の最終延長がある７２℃３０秒間の３０サイクルとから構成されている。２％アガロースゲルにおいて、１２５ボルトで６０分間、ゲル電気泳動が実行された。そして、臭化エチジウムで染色され、ＵＶ光の下で視覚化された。再生産性を確保するために、２％アガロースゲル上で既知の量のＤＮＡが分離されており、同じ量のＤＮＡを有している試料のみが分析に含まれている。
【０１６４】
実例６：３-プライマーＰＣＲによる４９７７bp共通ｍｔＤＮＡ欠失の定量化検出
適切な個所において、１-５％よりも高いレベルを検出する３-プライマーＰＣＲ法による、または１％よりも低く１０^−４％までのレベルを検出する希釈ＰＣＲ法による、定量的方法で共通欠失の発生が決定される（実例７参照）。試料は採取され、ＤＮＡは、実例１に既述したようにして抽出された。ＤＮＡ試料中において欠失ｍｔＤＮＡおよび野生型（ｗｔ）ｍｔＤＮＡの双方の比率を同時に検出して定量化するために、３-プライマーＰＣＲ法が用いられる（Birch-Machinら(1998)に既述されたように）。プライマーＡおよびＣは、重鎖位置13720-13705および9028-9008にそれぞれ対応しており（Andersonら(1981)）、プライマーＢは、軽鎖位置8273-8289位置に対応している。プライマーＣは、共通欠失内のｍｔＤＮＡ領域に位置しており、プライマーＡおよびＢは、欠失領域の側面に位置している。したがって、プライマーＢおよびＣは、ｗｔ-ｍｔＤＮＡを増幅するだけであり、プライマーＡおよびＢは、欠失ｍｔＤＮＡを増幅するだけである（欠失のない二つのプライマー間の距離である約５．５kbは、以下に述べるように、我々のＰＣＲ条件の下で増幅するには長すぎる）。
【０１６５】
三つのプライマーの使用は、ｗｔ-ｍｔＤＮＡに対応する長いバンド（755bp）と「共通欠失」にいる欠失ｍｔＤＮＡに対応する短いバンド（470bp）という二つのバンドの同時検出を可能にした。ＰＣＲ反応混合物（総量２５μl）は、総量１００ngの細胞ＤＮＡと、２００μＭのｄＮＴＰと、１０ｍＭのトリス‐ＨＣＬ（pH 8.8）と、５０ｍＭのＫＣｌと、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２と、０．１％のトリトンＸ-１００と、２．５ＵのTaq DNA ポリメラーゼ（BioTaq, BiolineUK Limited, London）、２５pmolのプライマーＡ，Ｂ、６．２５pmolのプライマーＣ、および３μCi of [α-^３２P]-dATP。ＰＣＲ条件は、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１５分間の最終延長を含む７２℃２分間の２５サイクルであった。次に、これらのＰＣＲ生成物は、６％の非変性ポリアクリアミドゲルを用いて電気泳動された。そして、放射性ＰＣＲ断片が、ImageQuant^TMソフトウエア（Molecule Dynamics, Chesham UK）を用いた分析によって定量化された。
【０１６６】
実例７：低レベル（＜１％）の共通ｍｔＤＮＡ欠失を定量的に検出するための連続希釈ＰＣＲ法
組織/細胞試料から抽出されたすべてのｍｔＤＮＡ中の共通欠失の比率を評価するために、半定量化ＰＣＲ法（Corral-Debrinskiら(1991)）が用いられる。生物学的試料が採取され、実例１に示すようにして、ＤＮＡが抽出された。ＤＮＡ試料は、まず、制限酵素 Bam HI（１μlの酵素および工業用に供給された１μlの緩衝剤）を用いて３７℃で９０分間かけて線状にされた。（最初１０倍の希釈液があった完全ｍｔＤＮＡのために）２倍の工程で連続希釈が実行された。そして、以下のプライマーを用いて、各希釈液（１μl）についてＰＣＲが実行された。
完全mtDNAのためのプライマー
L3108(nt3108-3127)
H3717(nt3717-3701)
共通欠失のためのプライマー
L8282(nt8282-8305)
H13851(ntl3851-13832)
【０１６７】
反応条件は以下のとおりである。
９４℃２分間を１サイクル、９４℃４５秒間、５１℃３０秒間（完全ｍｔＤＮＡ）、５６℃３０秒間（共通欠失）および７２℃１分間を３４サイクル、最後に７２℃８分間を１サイクル。すべてのＰＣＲ反応は、以下の混合物（５０μl）内で実行された。１μlの試料ＤＮＡ、０．６μＭの前進（forward）プライマー、０．６μＭの復帰（reverse）プライマー、０．２ｍＭの dNTP、５μlの GeneAmp^R 10x PCR 緩衝剤（Perkin Elmer）、０．２μlの Amplitaq^RのＤＮＡのポリメラーゼ（Perkin Elmer）、オートクレーブされた３５．７５μlの２倍無菌蒸留水。
【０１６８】
電気泳動に続いて、ＰＣＲ生成物がＵＶ照通装置（TMW-20, Flowgen Ltd., Lichfield, UK）で視覚化されるとともに、イメージ捕捉措置（Flowgen LTD., Lichfield, UK により供給された Alpha Imager 2000, Alpha Innotech Corporation, ）を用いて、ゲルのデジタル像が得られた。関連するイメージ解析ソフトウエア（Alpha Ease v3.3, Alpha Innotech Corp.）は、直接希釈において各ＰＣＲ生成物についての統一吸光度（ＩＯＤ：Integrated Optical Density）の算出を可能にした。ＩＯＤ値が零の帯域は、完全ｍｔＤＮＡおよび欠失ｍｔＤＮＡの双方について得られた。対応する希釈値が、以下のように、試料内の共通欠失の比率を計算するのに用いられている。
共通欠失（％）＝［全ｍｔＤＮＡ希釈因子^{（ IOD Zero ）}ｘ 100］/［共通欠失希釈因子^{（ IOD Zero ）}］
【０１６９】
実例８：変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）
試料が採取され、実例１と同様にして、ＤＮＡが抽出された。Van den Boschら(2000)により記述された二つの異なるＰＣＲ条件を用いることにより、１３の重複断片についてＰＣＲが実行された。以下は、ＰＣＲのための三つのｍｔＤＮＡ特異プライマー対である。
ｉ．オリゴ配列
Mt3118F CCCTGTACGAAAGGACAAGAG
Mt3334R TGAGGAGTAGGAGGTTGG
Mt8207F CCCATCGTCCTAGAATTAATTCC
Mt8400R ATGGTGGGCCATACGGTAG
Mt14427F CCCATGCCTCAGGATACTCCTC
Mt14997R GCGTGAAGGTAGCGGATG
【０１７０】
1-2 kb のＰＣＲ生成物は、90‐600 bp の断片に温浸され、最適な融解温度で分解された。突然変異は、二つのピークで表され、２％ヘテロプラスミーよりも低いような低い比率の突然変異は、ピークの「肩部」で表される。
【０１７１】
ＤＨＰＬＣは、二つの溶離液（pH 7.0）からなる流動相を用いて実行される。緩衝液Ａは、トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）を含んでおり、これは、ＤＮＡ上で負に帯電したリン酸基およびカラム表面の双方と相互作用する。緩衝液Ｂは、２５％変性剤アセトニトリルを有するＴＥＡＡを含んでいる。断片は、一定の流速においてアセトニトリルの１次勾配をもって溶離した。アセトニトリルの濃度を上げると、断片が変性する。以下の表３は、製造者の指示にしたがってWAVEMAKER ソフトウエア（Transgenomics）を用いることにより、生成したＰＣＲ反応のＤＨＰＬＣのための標準的な方法の一例を示している。
【表３】

【０１７２】
種々の heteroduplexes において成功した分解の温度は、以下に詳細に示されており、表２の関連位置に置き換えることができる。
断片 融解温度（℃） 緩衝液Ｂの濃度勾配（％）
Mt3118F 59 51-59
Mt8207F 58 50-58
Mt14427F 56 60-68
【０１７３】
参考文献
Anderson S, et al., Nature 290:457-464, 1981.
【０１７４】
Andrews RM, et al., Nature Genetics 23(2):147, 1999.
【０１７５】
Barringer, et al., Gene 89:117, 1990.
【０１７６】
Bassam BJ, Caetano-Anolles PM, Gresshoff PM., Anal. Biochem. 196:80-83, 1991.
【０１７７】
Berneburg M, et al., J. Biol. Chem. 274(22):1 5345-15349, 1999.
【０１７８】
Berthon P, Valeri A, Cohen-Akeninc A, Drelon E, Paiss T, Wohr G, Latil A et al., Am. J. Hum. Genet., 62:1416-1424, 1998.
【０１７９】
Birch-Machin MA, et al., Methods in Toxicology, Volume 2, 51-69, 1993.
【０１８０】
Birch-Machin MA, et al., J. Invest. Dermatol., 110:149-152, 1998.
【０１８１】
Birch-Machin MA, オンライン会議報告書（Sunburnt DNA），生化学・分子生物学国際学会。New Scientist, 2000(a).
【０１８２】
Birch-Machin MA, Taylor RW, Cochran B, Ackrell BAC, Tumbull DM. Ann Neurol 48:330-335, 2000(b).
【０１８３】
Birch-Machin MA, Clin. Exp. Dermatol,. 25(2), 141-146, 2000(c).
【０１８４】
Birch-Machin MA and Krishnan K. Mitochondrion, 1, p45 (2001).
【０１８５】
Birch-Machin MA, Lindsey J. Lusher M and Krishnan K. Mitochondrion, 1 Suppl. 1, S30 (2001).
【０１８６】
Bogliolo M, et al., Mutagenesis, 14:77-82, 1999.
【０１８７】
Brierley EJ, Johnson MA, Lightowlers RN, James O, Turnbull DM., Ann Neurol 43(2):217-223, 1998.
【０１８８】
Brockington, et al., Nature Genet 4:67-71, 1993.
【０１８９】
Brown M.D., et al., Am J. Humn Genet, 60:381-387, 1997.
【０１９０】
Brumley R.L. Jr. and Smith L.M., 1991, 水平極薄ゲル電気泳動による高速DNA配列決定。Nucleic Acids Res. 19:4121-4126.
【０１９１】
Buttyan R, Sawczuk IS, Benson MC, Siegal JD, Olsson CA., Prostate 11:327-337, 1987.
【０１９２】
Byrne E., Curr Opin Reumatol 4(6):784-793, 1992.
【０１９３】
Cairns P, Okami K, Halachmi S, Halachmi N, Esteller M, Herman JG, Jen J et al., Cancer Res 57:4997-5000, 1997.
【０１９４】
Chee M, et al., Science 274:610-614, 1996.
【０１９５】
Chinnery PF, Howel N, Turnbull DM., J. Med. Genet. 36:425-436, 1999.
【０１９６】
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1):17-21, 1999.
【０１９７】
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1):17-21, 2000.
【０１９８】
Chollat-Traquet C, Tobacco or health: a WHO programme., Eur J Cancer, 28(2-3):311-315, 1992.
【０１９９】
Chomyn A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(10):4221-4225, 1992.
【０２００】
Cohen D, Barton G, The cost to society of smoking cessation., Thorax. 53(2):S38-42, 1998.
【０２０１】
Corral-Debrinski et al., Mutat Res, 275:169-180, 1991.
【０２０２】
Cortopassi G.A. and Arnheim H., 高齢のヒトの組織における特異ミドコンドリアDNA欠失の検出。Nucleic Acids Tes. 18, 6927-6933, 1990.
【０２０３】
Cortopassi G, Wang E., Biochim Biophys Acta 1271(1):171-176, 1995.
【０２０４】
Croteau DL, Stierum RH, Bohr VA, Mutat Res 434(3):137-148, 1999.
【０２０５】
分子生物学の現行プロトコル。
【０２０６】
Davis RM, Boyd GM, Schoenborn CA,「一般的礼儀」と受動喫煙の排除。Results of the 1987 National Health Interview Survey. JAMA 263(16):2208-10, 1990.
【０２０７】
Dong JT, Isaacs WB, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaaca JT, Barrett JC., Science 268:884-886, 1995.
【０２０８】
Driezen P, Brown KS., Searchable database of questionnaire items from populations surveys of tobacco use in Canada: A summary report to the Ontario Tobacco Research Unit (Toronto, Ontario), 1999.
【０２０９】
Easton RD, Merriwether AD, Crews DE, and Ferrell RE., Am. J. Hum. Genet. 59:202-212, 1996.
【０２１０】
Fahn H, Wang L, Hseith R, Chang S, Kao S, Huang M, and Wei Y. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine, 154:1141-1145, 1996.
【０２１１】
Fahn HJ, Wang LS, Kao SH, Chang SC, Huang MH, Wei YH., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 19(6):901-9, 1998.
【０２１２】
Finegold D., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 12, 1997.
【０２１３】
Flanagan N, Birch-Machin MA, Rees JL., Hum Mol Genet 9(17):2531-2537, 2000.
【０２１４】
Flanagan N, Ray AJ, Todd C, Birch-Machin MA and Rees JL., J Invest. Dermatol (2001) 117 (5) 1314-1317.
【０２１５】
Fliss MS, et al. Science 287:2017-2019, 2000.
【０２１６】
Gattermann N, Berneburg M, Heinisch J, Aul C, Schneider W., Leukemia 9(10):1704-10, 1995.
【０２１７】
Green R, Reed JC., Science 281(5381):1309-1312, 1998.
【０２１８】
Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874, 1990.
【０２１９】
Gulavita, Sunil Dr. Northwestern Ontario Cancer Centre - Personal Communication.
【０２２０】
Habano S, Nakamura, Sugai T., Oncogene 17(15):1931-1937, 1998.
【０２２１】
Harding RM, et al., Am. J. Hum. Genet. 66, 1351-1361, 2000.
【０２２２】
Harman D., Proc Nati Acad Sci USA 78(11):7124-8, 1981.
【０２２３】
Hattori et al., ヒトの心臓における、欠失ミドコンドリアDNAの年齢依存性増加：possible contributory factor to presbycardia, AM. Heart J., 121, 1735-1742, 1991.
【０２２４】
Hayashi J, Ohta S, Kikuchi A, Takemitsu M, Goto Y, Nonaka I., Proc Natl Acad Sci USA 88(23):10614-10618, 1991.
【０２２５】
Hayward SW, Grossfeld GD, Tlsty TD, Cunha GR., Int J Oncol 13:35-47, 1998.
【０２２６】
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL. Chapter 1 1. ヒトメラノコルチン１レセプター遺伝子。In the Melanocortin Receptors (Cone RD(ed)). Humana Press Inc. New Jersey, USA, 1999.
【０２２７】
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL., Lancet 355, 1072-1073, 2000.
【０２２８】
Hearst N, Hulley SB. Using secondary data, In Designing clinical research: an epidemiological approach. Ed. Hulley S. and Cummings S., Baltimore: Williams & Wilkins, pages 53-62, 1988.
【０２２９】
Hopgood R., et al., 1992, PCR試料からの直接の、ヒトmtDNAの自動配列決定方法。Biotechniques 13:82-92.
【０２３０】
Hsieh RH and Wei YH,ヒト筋ミトコンドリアDNAにおける年齢依存性多発性欠失。in preparation 1992.
【０２３１】
Huang GM, Ng WL, Farkas J, He L, Liang HA, Gordon D, Hood R., Genomics 59(2):178-86, 1999.
【０２３２】
http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html
【０２３３】
Ikebe et al., パーキンソン病および老化におけるストリアートゥムでの欠失ミトコンドリアDNAの増加。Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 1044-1048, 1990.
【０２３４】
Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press Inc. San Diego, 1990.
【０２３５】
Kaiserman MJ, Chronic Dis Can 18(1):13-9, 1997.
【０２３６】
Kalra J, Chaudhary AK, Prasad K., Int. J. Exp. Pathol. 72(1):1-7, 1991.
【０２３７】
Katayama et al., 老齢のヒトの骨格筋における欠失ミトコンドリアDNA。Biochem. Int., 25, 47-56, 1991.
【０２３８】
Kleinle S, et al., Human Genet. 290:457-465, 1997.
【０２３９】
Konishi N, Cho M, Yamamoto K, Hiasa Y. Pathol. Int. 47:735-747, 1997.
【０２４０】
Krishnan K and Birch-Machin MA. British Journal of Dermatology (2002), 146,723.
【０２４１】
Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173, 1989.
【０２４２】
Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer J. Clin. 49:8-31.
【０２４３】
Landis, SH, et al., CA Cancer J. Clin. 49:8-31, 1999.
【０２４４】
Landegren et al., Science, 241:1077, 1988.
【０２４５】
LeDoux SP, et al., Mutat Res 434(3):149-159, 1999.
【０２４６】
Lee HC, et al., FEBS Letters 354:79-83, 1994.
【０２４７】
Lee HC, Lu CY, Fahn HJ, Wei YH. Federation of European Biochemical Societies, 441:292-296, 1998.
【０２４８】
Lee HC, et al., Arch. Biochem. Biophys. 362(2):309-16, 1999.
【０２４９】
Leonard & Shapira 1997.
【０２５０】
Lindsey J, Lusher M, Krishnan KJ and Birch-Machin MA., British Journal of Dermatology (2001), 144,655.
【０２５１】
Li Y, et al., In: Oxygen Radicals and the Disease Process, Amsterdam, The Netherlands: Harwood Academic Publishers, 237-277, 1997.
【０２５２】
Linnane et al., 1990.
【０２５３】
Liu CS, Kao SH, Wei YH. Environ. Mol. Mutagen 30(1):47-55, 1997.
【０２５４】
Lowes S, Krishnan K, Lindsey J, Lusher M and Brich-Machin MA. British Journal of Dermatology (2002), 146,736.
【０２５５】
Luckey J. A., et al., 1993, 毛細管ゲル電気泳動による高速DNA配列決定。Methods Enzymol. 218:154-172.
【０２５６】
McCormack, Douglas. Website: http://cormactech.com/dna, 2001.
【０２５７】
Meibner C, von Wurmb N, Oehmichen M., Int. J. Legal Med. 110:288-291, 1997.
【０２５８】
Michikawa Y, Mazzucchelli F, Bresolin N, Scarlato G, Attardi G., Science, 286:774-779, 1999.
【０２５９】
Miquel J, de Juan E, Sevila I. EXS 62:47-57, 1992.
【０２６０】
MITOMAP: A human mt genome database (www.gen.emory.edu/mitomap.html).
【０２６１】
Mullis and Faloona Methods Enzymol 155, 335, 1987.
【０２６２】
Nachman MW, Brown WM, Stoneking M, Aquardo CF., Genetics 142:53-963, 1996.
【０２６３】
National Cancer Institute of Canada, Canadian cancer statistics 2000., National Cancer Institute of Canada., Toronto, Ont. 2000.
【０２６４】
Naviaux RK., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 3-10, 1997.
【０２６５】
Newton CR and Graham A., Introduction to Biotecniques Series 1997.
【０２６６】
Oefner PJ, Underhill PA., Current protocols in human genetics 19, 7.10.1-12, 1998.
【０２６７】
Ozen M, et al., Prostate 36:264-271, 1998.
【０２６８】
Pang et al., Arch. Biochem. Biophys. 312:534-538, 1994.
【０２６９】
Parsons TJ, et al., Nature Genet. 15(4):363-368, 1997.
【０２７０】
Pascucci B, et al., J. Mol. Biol. 273(2):417-427, 1997.
【０２７１】
Penta JS, Johnson FM, Wachsman JT, Copeland WC., Mut. Res. 488, 119-133, 2001.
【０２７２】
Polyak Y, et al., Nature Genet. 20(3):291-293, 1998.
【０２７３】
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol. 110:692, 1998.
【０２７４】
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., Brit. J. Dermatol. 140:788, 1999.
【０２７５】
Ray AJ, Pickersgill L, Turner R, Nikaido O, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol 115(4):674-679, 2000.
【０２７６】
Rees JL, Skin cancer. In: The Genetic Basis of Human Cancer, eds Vogelstein B, Kinzler K. New York: McGraw-Hill, pp527-536, 1998.
【０２７７】
Rehman I, Quinn AJ, Healy E, Rees JL. Lancet 344:788-789, 1994.
【０２７８】
Rehman I, Takata M, Wu YY, Rees JL. Oncogene 12:2483-2490, 1996.
【０２７９】
SAS Enterprise Mining Users Guide, SAS Inc., 2000.
【０２８０】
Sawyer E, Van Houten B., Mutation Res. 434(3):161-176, 1999.
【０２８１】
Schurr TG, Ballinger SW, Gan Y, Hodge JA, Merriwether DA, Lawrence DN, Knowler WC, Weiss KM, and Wallace DC., Am. J. Hum. Genet. 46:613-623, 1990.
【０２８２】
Seidman M.D. et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 123:1039-1045, 1997.
【０２８３】
Shankey TV, Jin JK, Dougherty S, Flanigan RC, Graham S, Pyle JM., Cytometry 21:30-39, 1995.
【０２８４】
Shay JW, Werbin H., Mutat. Res: 186:149, 1987.
【０２８５】
Sherrat EJ, Thomas AW, Alcolado JC., Clin. Sci. 92:225-235, 1997.
【０２８６】
Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang C, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Reckford CL, and Wallace DC., Genomics 17:171-184, 1993.
【０２８７】
Smith DG, Malhi RS, Eshleman J, Lorenz JG and Kaestle FA., Am. J. Hum. Genet. 110:271-284, 1999.
【０２８８】
Smith R, Birch-Machin MA, Rees JL. J. Invest. Dermatol. 111:101-104, 1998.
【０２８９】
SpringNet - CE Connection: Screening, Diagnosis: Improving Primary Care Outcomes. Website: http://www.springnet.com/ce/j803a.htm.
【０２９０】
Stone AC and Stoneking M. Amer. J., Phys. Anthro. 92(4):463-471, 1993.
【０２９１】
Tamura S, et al., Eur. J. Cancer [A] 35(2):316-319, 1999.
【０２９２】
Tanaka M. et al., 1996, mtDNAの自動配列決定。Methods Enzymol. 264:407-421.
【０２９３】
Taniike M. et al., BioChem BioPhys Res Comun, 186:47-53, 1992.
【０２９４】
Taylor RW, Birch-Machin MA, Bartlett K, Turnbull DM., J Biol Chem, 269, 3523-3528, 1994.
【０２９５】
Tijssen, P. (ed) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Polynucleotide Probes, Elsevier, N.Y., 1993.
【０２９６】
Tori et al., 加齢に関連した、ヒト横隔膜ミトコンドリアDNAの欠失。AM. J. Respir. Cel. l Mol. Biol. in press, 1992.
【０２９７】
Van De Graff KM, Fox SI., Concepts of Human Anatomy and Physiology., Dubuque: WM. C. Brown Publishers, 1995.
【０２９８】
Van den Bosch BJC, et al., Nucleic Acids Res. 28:89, 2000.
【０２９９】
von Wurmb N, Oehmichen, M, Meissner, C., Mutat Res. 422:247-254, 1998.
【０３００】
Wallace DC., Annu Rev Biochem, 61:1175-1212, 1992.
【０３０１】
Wallace DC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8739-8746, 1994.
【０３０２】
Wald and Wallace, D.C., ヒトおよびマウスのミトコンドリア病。Science, 5 (283):1482-1497, 1999.
【０３０３】
Wald NJ, Hackshaw, AK, タバコの喫煙：疫学的概観。Br Med Bull. 52(1):3-11, 1996.
【０３０４】
Wallace et al., レーバー遺伝性視神経症に関連したミトコンドリアDNAの突然変異。Science, 1427-1429.
【０３０５】
Walsh PC, Partin AW. Cancer 80:1871-1874, 1997.
【０３０６】
Ward RH, Frazier BL, Dew-Jager K, Paabo S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8720-8724, 1991.
【０３０７】
Ward 1993.
【０３０８】
Wei YH, Pang C, You B, Lee H. Ann. NY Acad. Sci. 786:82-101, 1996.
【０３０９】
Wei YH. Proceedings of the Nat. Sci. Council of the Republic of China April 22 (2):5567, 1998.
【０３１０】
Weinstock MA: In: JJ Stern RS, MacKie RM and Weinstock MA, Grob (eds) Epidemiology, Blackwell (UK). pp121-128, 1998.
【０３１１】
Woodwell DA. National Ambulatory Medical Care Survey: 1997 Summary. Advance data from vital and health statistics; no. 305. Hyattsville, Maryland: National Center for Health Statistics. 1999.
【０３１２】
Wu & Wallace Genomics, 4:560, 1989.
【０３１３】
Xu J, et al., Nature Genet 20:175-179, 1998.
【０３１４】
Yamaguchi KT, et al., Free Radical Res. Commun. 16(3):167-74, 1992.
【０３１５】
Yeh J.J., et al., Oncogene Journal, 19:2060-2066, 2000.
【０３１６】
Yen et al., 加齢に関連した、ヒト肝ミトコンドリアDNAの5kb欠失。Biochem., Biophys., Res. Commun., 178, 124-131, 1991.
【０３１７】
Yen et al., 加齢に関連した、ヒト肝ミトコンドリアDNAの6kb欠失。Biochem. Int. 26, 457-468, 1992.
【０３１８】
Zeviani M, et al., Am. J. Hum. Genet. 47:904-914, 1990.
【０３１９】
Zhang et al., 老齢のヒトにおける多発性ミトコンドリアDNA欠失。FEBS Lett, 297, 34-38, 1992.
【０３２０】
Zhang C., et al., BioChem. BioPhys. Res. Comun., 195:1104-1110, 1993.【Technical field】
[0001]
The present invention relates to the field of mitochondrial genomes. In particular, the invention relates to mutations in the mitochondrial genome and its use as an indicator in the very early stages of the disease.
[Background]
[0002]
A recent major trend in biological sciences is the human genome project, the commercial use of that data. However, there are exceptional restrictions on the use and provision of this information because the data is not specific at the individual level. Incredibly, the data is from a small number of individuals and represents very little change that exists in the human population, making the data useful only for general applications. The amazing complexity of the human genome makes it impossible to apply to an individual base. The US Department of Energy and the National Institutes of Health have invested $ 2.5 billion since 1988 to fully determine the sequence of one human nuclear genome (http://www.ornl.gov/hgmis /project/budget.html).
[0003]
Mitochondrial genome
The mitochondrial genome is a compact but important nucleic acid sequence. The mitochondrial genome encodes a subunit of the enzyme necessary for cell respiration. Mitochondrial DNA, or mtDNA, is a very small genome of nucleic acids at 16,569 base pairs compared to the large nuclear genome of 3.3 billion base pairs (bp Anderson et al. (1981); Andrews et al. (1999)). Its genetic complement is astronomically smaller (0.0005%) than its nuclear counterpart. However, communication, or chemical signals, occur on a daily basis (Sherratt et al. (1997)). In addition, certain nuclear components are responsible for maintaining and maintaining mitochondrial sequences. Mutations begin to appear in the mtDNA sequence when these nuclear regions become nonfunctional due to nuclear rearrangements that indicate potential disease. Certain mitochondria may also be certified for intracellular destruction due to deletions induced by somatic mutations in the mitochondrial genome. Such a theoretical mechanism may serve as a sign of the disease that is about to develop. Approximately 3,000 genes are required to create mitochondria, but only 37 of these are encoded by the mitochondrial genome, indicating a significant mitochondrial dependence on the locus (Naviaux (1997)).
[0004]
The essential role of mtDNA is the production of adenosine triphosphate (ATP), a cellular fuel that burns cellular metabolism. Importantly, the mitochondrial genome, in addition to the 13 polypeptides supplied by the mitochondrial genome (Leonard and Shapira (1997)), achieves the oxidation and reduction reactions necessary for its important functions. Depends on 70 proteins Different tissues and organs depend on oxidative phosphorylation to different extents. Furthermore, mutations in the mitochondrial genome have been implicated in various chronic degenerative diseases (Gattermann et al. (1995)). Diseases associated with defective oxidative phosphorylation (OXPHOS) are thought to be associated with mutations in mtDNA (Byrne (1992)). Therefore, as OXPHOS decreases due to the increased intensity of mtDNA mutations, the organ-specific energy thresholds that cause various clinical phenotypes will be exceeded.
[0005]
Recently, Fliss et al. (2000) showed that the high frequency of mtDNA mutations, which were inherently homoplasmic in stage 1 tumors from lung and bladder cancers, were dominant in cancer cells. I discovered that it was there. Point mutations and deletions are thought to be unprogrammed but unavoidable side effects of oxygen free radical damage to the mitochondrial genome and membrane (Miquel et al. (1992)). Such a theory is reasonable because not only does the mitochondrial genome have protective histones, but it is also susceptible to oxidative damage near the mitochondrial oxygen-generating inner membrane. Furthermore, because mtDNA has a compact genome and no introns, toxic events are likely to affect coding sequences that can result in biochemical dysfunction. This dysfunction further increases the cellular oxidative action leading to nuclear damage as well as mtDNA damage, thereby increasing the likelihood that the cell will enter a cancer progression state (Penta et al. (2001)). In this regard, studies have shown that mtDNA damage increases with age (Cortopassi & Wang 1955), followed by a decrease in respiratory function that will eventually lead to cell death (Miquel et al. (1992)). It shows that.
[0006]
MtDNA as a diagnostic tool
The growth process of mtDNA sequences is an important diagnostic tool. Mutations in mtDNA are often associated with nuclear mutations, but are often used as preliminary indicators of disease symptoms, including but not limited to the following diseases: Acts as a related biomarker. That is, cancer based on tissue damage, (direct) smoking and secondhand smoke (Lee et al. (1998); Wei (1998)), life expectancy based on accumulation of mitochondrial genomic mutations beginning around 20 years and increasing thereafter (von Wurmb (1998)), carcinogens, mutagens, or metastatic diseases caused by exposure to or caused by UV radiation (Birch-Machin (2000)), osteoarthritis, cardiovascular disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease (Shoffner et al. (1993); Sherratt et al. (1997); Zang et al. (1998)), age-related hearing loss (Seidman et al. (1997)), optic nerve degeneration and heart rate irregularities (Brown et al. (1997); Wallce et al. (1988)), Chronic progressive exophthalmia (Taniike et al. (1992)), atherosclerosis (Bogliolo et al. (1999)), papillary thyroid cancer and thyroid tumor (Yeh et al. (2000)), and other diseases (eg, Naviaux (1997); Chinnery and Turnbull (1997)).
[0007]
In particular, these modifications include point mutations (transitions, transversions), deletions (from one base to thousands of bases), inversions, duplications (from one base to thousands of bases), pairs It contains an insertion (from one base to thousands of bases). In addition, certain base pair degenerations, deletions or bonds are exposed not only to early onset of prostate cancer, skin cancer and lung cancer, but also to aging (eg Polyak et al. (1998)), premature aging, carcinogens. (Lee et al. (1998)).
[0008]
It is important to understand mitochondrial sequences through this genetic means because mtDNA is transmitted to offspring only through eggs. The sequence of mtDNA varies widely between maternal families (Ward et al. (1991)). Thus, disease-related mutations must be clearly understood compared to this change. For example, in connection with a particular cancer, the particular T-to-C transition found in some individual sequences is actually a maternal lineage that has spread to a particular geographic region, ie, associated with ethnicity. It will be a natural change in the clan. For example, indigenous North Americans have an unusually high rate of adult adult diabetes. All North American indigenous peoples are also generally characterized by five basic maternal blood families represented by A, B, C, D and X (Schurr et al. (1990); Stone and Stoneking (1993); Smith et al. (1999)). Bloodline A is identified by a simple point mutation that results in site HaeIII at 663 bp (base pairs) in the mitochondrial genome. However, there was no causal relationship between this mutation and adult diabetes development. There are also sequence alterations, even within clan populations.
[0009]
Outside certain markers associated with certain blood families, there is more degeneration in the human population than in the human population (Easton et al. (1996); Ward et al. (1991, 1993)). Such differences must be understood for optimal identification of disease-related mutations. Thus, a maternal research approach (Parsons et al. (1997)) that mimics the force of the longitudinal structure (ie, the subject follows for a substantial amount of time) is in contrast to mutations that are not associated with disease. Must be used to identify mutations directly related to the disease. In addition, certain substances such as tobacco secondhand smoke, low levels of asbestos, lead, and all known and low levels of all mutagens in many environments may cause specific point mutations. Although not, it is not necessarily a marker specific to the disease. Thus, a substantial mtDNA sequence database is a clear prerequisite for accurately predicting potential illnesses as a natural progression or by exposure to agents. Furthermore, the sequence of the entire molecule must be determined for all its information content. Point mutation (transition, transversion), deletion (from one base to thousands of bases), inversion, duplication (from one base to thousands of bases), recombination and insertion (one base) To thousands of bases) must be characterized as a whole across the entire mitochondrial genome. This ensures that all information available in the mitochondrial genome is captured. The cytoplasmic mitochondrial genome (16,569 bp) has been sequenced at the individual level, as in the nucleus, but the mitochondrial genome has been sequenced at the population level for use as a diagnostic tool. Absent.
[0010]
Recently, mitochondria have been closely linked in the process of carcinogenicity due to their role in apoptosis and other aspects of tumor biology (Green & Reed (1998); Penta et al. (2001)). In particular, somatic mutations in mtDNA have been observed in many human tumors (Habano et al. (1998); Polyak et al. (1998); Tamura et al. (1999); Fliss et al. (2000)). Of these, the latter finding was made more interesting by the assertion that certain mtDNA mutations appear to be homoplasmy (Habano et al. (1998); Polyak et al. (1998); Fliss et al. (2000). ). Researchers also found that ultraviolet radiation (UV) is important for the pathogenesis and progression of non-melanoma skin cancer (NMSC) (Weinstock (1998); Rees (1998)), and UV It was found to induce damage (Birch-Machin (2000a)).
[0011]
Furthermore, over time, mitochondrial sequences lose their integrity. For example, the 4977 bp deletion increases with age (Fahn et al. (1996)). Beginning at the age of 20, this deletion begins to occur in a small number of mitochondria. By the age of 80, a substantial number of molecules had been deleted. This deletion characterizes the standard aging process and as such serves as a biomarker for this process. Such quantification of the aging process may allow medical or other treatments to slow down the process.
[0012]
Since mtDNA has been used primarily as a population genetics tool and more recently as a forensic tool, its application to drugs in the mitochondrial genome has been overlooked. However, it has become increasingly clear that the information content of mtDNA has been substantially applied in the field of medical diagnosis. Moreover, until recently, the emergence of large-volume, high-throughput robotic DNA sequencer systems, determining the sequence of all complements of mtDNA has been a daunting task. In addition, population genetics was able to collect important data from two regions that changed greatly in the control region, but these small regions represented a small part of less than 10% of the whole genome, This means that 90% of the data with analytical power is not used. Importantly, many degenerations associated with the disease are outside the control region. Genome-wide characteristics should be considered to include all sequence information for accurate and highly analytical diagnosis.
[0013]
Nonmelanoma skin cancer
Human non-melanoma skin cancer (NMSC) is the most common cancer in many Caucasians (Weinstock (1998); Rees (1998)). Most of these tumors are basal cell carcinoma (BCC) and squamous cell carcinoma (SCC). BCC is locally invasive and causes significant depression, but rarely metastasizes. SCC shows significant metastatic potential, and the occurrence of multiple NMSCs in immunosuppressed patients poses significant treatment problems (Rees (1998)). Although no malignant damage has been clinically recognized in advance for BCC, some SCCs include precursor damage, ie actinic keratosis (AK) or Bowen's disease (in situ cancer) (Rees (1998) Some are thought to arise from the domain of
[0014]
SCC exhibits loss of heterozygote affecting several chromosomes suggesting the developmental involvement of several tumor suppressors. Interestingly, in AK, comparable or greater genetic loss is observed in precursors compared to SCC (Rehman et al. (1994); Rehman et al. (1996)). This is important in the proposed invention. This is because, in addition to the inactivation of tumor suppressors, it suggests that other mechanisms are likely involved in the development of SCC.
[0015]
The role of mitochondria in tumorigenesis was initially hypothesized when tumor cells were discovered to have respiratory injury and high glycolysis (Shay & Werbin (1987)). Colon cancer (Habano et al. (1998); Polyak et al. (1998) reviewed by Penta (2001) et al.), First stage tumors of the bladder, neck, and lung (Fliss et al. (2000)), and gastric tumors ( Recent discoveries that reveal the role of mitochondria in Green & Reed (1998), along with the high incidence of homoplasmy mtDNA mutations in Tamura et al. (1999), further support this assumption. Furthermore, it was pointed out that these mitochondrial mutations may affect the levels of reactive oxygen species (ROS) that have been shown to be highly mitogenic.
[0016]
Previous studies by the present inventors and others have shown that mtDNA mutations and related mitochondrial dysfunction contribute to human degenerative disease (Birch-Machin et al. (1993) Chinnery et al. (1999); Birch-Machin et al. (2000b)). This is due to the large amount of ROS generated in organelles in relation to the lack of protective histones, and a low rate of mtDNA repair relative to the nucleus (Pascucci et al. (1997); Sawyer & van Houten; LeDoux et al. (1999). ) Because the mitochondrial genome is particularly susceptible to mutations. Indeed, the mutation rate of mtDNA is about 10 times higher than that of nuclear DNA (Wallace (1994)). Many of the mtDNA mutations recognized in recent human tumor studies have shown the potential for exposure to ROS mutagens. This is important for the investigation of mtDNA mutations in NMSC. This is because there is recent evidence that UV-induced ROS is directly involved in the occurrence of mtDNA deletions in human skin cells. Also, the greatest determinant of NMSC in individuals without protective pigmentation or genetic predisposition is UV (Weinstock (1998)). Presumed precursor damage in SCC has also been found prominently in sites that have been exposed to the sun all the time. This is important. This is because the results from the Birch-Machin laboratory show a marked difference in the occurrence of mitochondrial DNA damage in skin taken from different parts of the body exposed to the sun. Most of the damage is found at sites that are constantly exposed to the sun (Krishanan et al. (2002)).
[0017]
One of the inventors was the first to quantitatively show that exposure to UV induces mtDNA damage (Birch-Machin et al. (1998)). MtDNA as a molecular marker was used to study the relationship between age aging and photoaging in human skin. To study the change in the ratio of the 4977 bp deletion to wild-type mtDNA to the sun exposure of human skin and its age of life, a three primer quantification PCR method was used. Compared to sun-protected sites (1.1% [1/90]), higher levels (ie> 1%) of the 4977bp deletion mtDNA in sun-exposed sites (27% [27/100]) Incidence increased significantly (Fishers exact test, P <0.0001). Thus, mtDNA deletions or mutations are useful as markers of cumulative ultraviolet radiation.
[0018]
Furthermore, studies using a Southwestern blot approach involving monoclonal antibodies to thymine dimers provided direct evidence of the presence of UV-induced damage to purified mtDNA (Ray et al. (1998)). .
[0019]
However, quantification of a single deletion alone does not provide a reliable UV biomarker because it represents only one of many possible deletions or combinations and other related mutations. (Birch-Machin (2000)). A recent study by our research group has shown that the length of the entire mitochondrial genome is amplified in order to determine the total deletion spectrum of mtDNA resulting from exposure to UV (Ray et al. (2000)). PCR (LX-PCR) technology was used. A long PCR analysis of 71 split skin samples with the epidermis separated from the underlying dermis was performed in connection with sun exposure. Longer exposure to UV significantly increased the number of deletions in the epidermis (Kruskal-Wallis test, p = 0.0015). Findings in the epidermis are not confused with the increase in mtDNA deletion with age, also detected by long PCR techniques. The large spectrum of recognized deletions highlights the mutated load and ubiquitous nature of mtDNA associated with exposure to UV. Compared to single-deletion detection using low-cost PCR, long PCR provides a more comprehensive index of all mtDNA damage in the skin, although it is a highly accurate technique and not quantitative It indicates that it may be. A study by one of the above inventors has shown that mtDNA is an important target of UV, which has recently been reviewed (Birch-Machin (2000)) along with the role of mitochondria in skin diseases. It shows clearly.
[0020]
Human hair and skin color, which has a major covariant relationship with UV sensitivity and human skin cancer, was investigated. These studies focused on the association of individual or population sensitivity to the sun with mutants of the melanocortin 1-receptor gene associated with skin cancer susceptibility (Smith et al. (1998); Healy (1999); Flanagan et al. (2000); Healy et al. (2000); Harding et al. (2000); Flanagan et al. (2002)). However, these studies did not address population level changes in mtDNA sequences in relation to specific skin types and / or hair color.
[0021]
One problem that has not been generally answered by recent studies of mtDNA mutations in human tumors is the occurrence of mitochondrial genome deletions associated with these tumors. This is an important question to answer. This is because a preliminary study on the skin of a single patient showed the occurrence of a common mtDNA deletion between several tumors and normal skin (AK and SCC) (Pang et al. (1994) ). Similarly, the inventor's own preliminary data indicate that the number of mtDNA deletions in the tumor is increased compared to normal skin. Finally, Birch-Machin and others have shown that the occurrence of mtDNA deletions, like replication, increases with prolonged UV exposure (Berneburg et al. (1999); Birch-Machin et al. (1998). Ray et al. (1999); Ray et al. (2000); Lindsey et al. (2001); Birch-Machin et al. (2001); Lowes et al. (2002); Krishnan et al. (2002)).
[0022]
Apart from problems related to tumor development, other important problems have not been generally answered by recent studies of mtDNA in human tumors (Habano et al. (1998); Fliss et al. (2000)). First, it is not clear due to technical limitations whether the mtDNA mutation is really homoplasmy, since the mutation level of heteroplasmy may also indicate important disease mutations (Habano et al. (1998); Polyak et al. (1998); Fliss et al. (2000)). Secondly, apart from one study (Tamura et al. (1999)), the occurrence of mtDNA deletion and its potential role as a biomaker for NMSC was not investigated. Researchers looked at common deletions and ignored the remaining 100 or so deletions. Similarly, investigators focused on identifying mutations rather than mutation quantification. Because of the threshold effect of mtDNA damage on ATP production and thus on cellular function, it is important to accurately assess the occurrence of deletions in a quantitative manner. Deletions are also difficult to characterize. Long PCR is generally used that produces a ladder of deletions that must be characterized.
[0023]
The current NMSC diagnosis is a pathological appraisal of the excised tissue. Thus, there is a need for early markers for UV-induced DNA damage that make humans susceptible to NMSCs. There is also a need for gene-based diagnostic tools that enable early detection and accurate diagnosis.
[0024]
Prostate cancer
Prostate cancer is a solid tumor that is often diagnosed and often occurs in the prostate epithelium (Huang et al. (1999)). In 1997, nearly 10 million American men were tested for prostate specific antigen (PSA) whose presence suggests prostate cancer (Woodwell (1999)). Shows that he received an initial digital prostate palpation (DRE). In the same year, 31 million men received DRE (Woodwell (1999)). In addition, it is estimated that there are 179,000 new cases of prostate cancer diagnosed annually in the United States (Landis et al. (1999)). This is the second most common cancer diagnosed in Canadian men and the second most common cause of cancer mortality. In 1997, prostate cancer accounted for 19,800 of the first diagnosed cancers in Canadian men (28%) (National Cancer Institute of Canada). 30-40% of all men over 49 years old have some cancerous prostate cells, but only 20-25% of these men have clinically important forms of prostate cancer (SpringNet-CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm). Prostate cancer manifests a variety of histological properties, including both sexual and exogenous factors: socioeconomic status, food, geography, hormonal instability, family history, and genetic constitution (Konishi et al. (1997); Hayward et al. (1998)).
[0025]
From a risk perspective, familial prostate cancer and hereditary prostate cancer are not considered synonymous terms. Familial cancer refers to an outbreak within the family but is not inherited. This form accounts for up to 25% of prostate cancer (Walsh & Partin (1997)). Hereditary refers to a subtype of prostate cancer that carries the Mendelian inheritance of the susceptibility gene, accounting for approximately 9% of reported cases. The family's positive history of prostate cancer suggests that these susceptibility genes play an important role in prostate cancer development and progression. Recently, susceptibility genes on chromosomes 1 and X have been identified as making men more susceptible to prostate cancer, which provides great insight into the pathogenesis of hereditary cancer (Berthon et al. (1998). Xu et al. (1998)).
[0026]
Prognosis of prostate cancer depends primarily on the stage and progression of the tumor at the time of diagnosis. Only localized prostate cancer can be treated with radical therapy. Standard detection still relies on digital prostate palpation, PSA testing, and histopathology of prostate tissue with biopsy. Biopsy is used to identify malignant tumors, but this is not an early detection technique. Unfortunately, some early tumors cannot be identified during palpation. The PSA test has a specificity of 60-70% and a sensitivity of 70-80% (personal communication, Dr. Sunil Gulavita, Northwestern Ontario Cancer Center). A new technique to improve diagnosis for tumors with a common histological stage is ploidy DNA analysis that employs flow cytometry (Shankey et al. (1995)). However, this technique measures chromosomal changes that become apparent in the later stages of cancer progression, and can be used to detect minor changes in DNA structure or chromosomal inversions, or reciprocal translocations in early cancers. It does not have sufficient sensitivity. Since the prognosis greatly depends on the stage of the disease at the time of diagnosis, the present invention concentrates on the initial detection.
[0027]
Our understanding of prostate cancer genetic abnormalities is poor. Research on prostate cancer focused on developing knowledge in the following areas: 1) Oncogene (Buttyan et al. (1987)). 2) Tumor suppressor genes (p53, p73, KAII and MMACI / PTEN; Dong et al. (1995); Cairns et al. (1997)). 3) Telomere / telomerase activity in metastasis. Upregulation of telomerase and amplification of telomeric DNA in prostate cells may provide an effective marker for diagnosis. In addition, telomeres may serve as therapeutic sites (Ozen et al. (1998)). Many groups provided evidence for a “prostate cancer gene” in the short arm of chromosome 1. Many studies require the identification of specific loci within this region. It has been suggested that this marker is only one of several possible genes that make men more susceptible to familial prostate cancer. Other studies have shown possible marker sites on the X chromosome (Xu et al. (1998)). If some prostate cancers are multifactorial, mtDNA is an important diagnostic tool because it is difficult to recognize and understand the interactions between all relevant nuclear genes in such cases It becomes.
[0028]
Indeed, a major problem in prostate cancer research is identifying molecular markers that can effectively determine and identify tumor stages. Molecular markers may be able to distinguish between neoplastic prostate tumors that progress rapidly to metastatic disease and those that rarely develop into tumors. To date, research has focused primarily on secrets hidden within the nuclear genome. On the other hand, a much smaller mtDNA genome appears to act as a barometer of internal nuclear events, and as such provides a means for early detection of human prostate cancer (Zeviani (1990)). Importantly, in this regard, mitochondria have been implicated in the carcinogenic process because of its role in apoptosis and other aspects of tumor biology (Green & Reed (1998)). In particular, somatic mutations in mtDNA have been observed in many human tumors (Polyak et al. (1998); Tamura et al. (1999); Fliss et al. (2000)). However, past studies did not take into account the clonal nature of maternal mtDNA, so they only looked at representative aspects. Limited studies that look only at such representative aspects only show mutations at some point. This may or may not give an exact association between the mutation and the corresponding medical condition. Research that employs a maternal system while looking at representative aspects has the advantage of tracking mtDNA mutations over time, which mimics the power of longitudinal structures.
Mutations that are common population variants can be distinguished in contrast to mutations associated with disease.
[0029]
Aging
Aging consists of an accumulation of changes over time at both the molecular and cellular levels. However, the specific molecular structure that causes the aging process remains unresolved. In an attempt to explain the aging process, the mitochondrial genome in an older specimen was compared with the genome of a young specimen from the same maternal line. One deletion associated with aging is known as a common deletion or 4977-bp deletion. Aging studies have been limited to this common deletion and polymorphism in the control region. In order to clearly understand this mutation, the entire genome must be analyzed. Other deletions can be seen in Table 1, adapted from 1992 Wei.
[Table 1]

[0030]
Oxygen free radicals are a standard byproduct of ATP production, but are a sure cause of this deletion and increase in frequency with age. Existing literature demonstrates that there is a strong relationship between mtDNA mutations, age of life, and the entire aging process in non-cell dividing tissues such as muscle and brain. However, comparative maternal studies are needed to distinguish between age-related tumor events and non-age related tumors.
[0031]
Recently, various chronic degenerative diseases have been shown to result from mutations in mtDNA (Gatterman et al. (1995)). Diseases associated with denatured OXPHOS are thought to be closely related to mtDNA mutations (Byrne (1992)). Furthermore, it has been shown that these myopathies are often associated with a 4977-bp common deletion in the mitochondrial genome (Liu et al. (1977)). This large deletion has also been found at heteroplasmy levels in various tissues of normally aged persons, consistent with the Mitochondrial Theory of Aging (Harman (1981)). This is evident through an increase in deletion frequency (Cortopassi & Wang (1995)) and the subsequent decline in respiratory function (Miquel et al. (1992)), which eventually leads to cell death in old age. is there. Because early genetic diagnosis improves the prognosis of patients, early detection of disease predisposition or dysfunction predisposition provides the best opportunity for medical intervention.
[0032]
Past studies employing structures of representative aspects only have established an association or causality between mtDNA mutations, deletions, and / or combinations thereof and aging. In order to obtain accurate data, age-specific deletion and / or mutation ratios must be concisely determined. In contrast to certain diseases at the population level, it is important to consider mutations due to the aging process. This information is essential for understanding how mtDNA damage occurs over time. Furthermore, in order to make a prediction and ultimately delay aging at the molecular level, the consequences of these specific mutations, the frequency, and the relationship in time aspects of aging must be known. Researchers have not yet determined this ratio, which requires evaluation of population data throughout the maternal line. Thus, there is a need for biomakers to track the aging process.
[0033]
Thus, there is a need for a simple and easy system to monitor a vast nuclear genome for mutations indicative of early stage cancer, aging, or other human disease with DNA elements. There is also a need for a simple diagnostic system for non-melanoma skin cancer, prostate cancer, lung cancer and aging associated with deletions in the mitochondrial genome. There is a need for a diagnostic system that discriminates between mtDNA mutations that cause disease and mutations that simply indicate mutations within and between populations.
[0034]
It is an object of the present invention to provide a simple and simple system for monitoring large nuclear genomes for early transitions associated with cancer, aging, and other human diseases with DNA elements.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0035]
In one embodiment of the invention, a small biological sample is collected from an individual, including tissue or body fluid samples such as urine, prostate fluid, skin cells, saliva. These samples are examined using any suitable method, including histological examination, in order to identify cells that exhibit disease morphology. Using any suitable method, including but not limited to laser capture, discriminating cells exhibiting the form of the disease are taken from the sample and the mtDNA sequenced therefrom, followed by health and disease. Compared to a database of known mitochondrial sequences related to both.
[0036]
In a preferred embodiment, all mitochondrial genome sequences are determined at the population level to determine mtDNA sequence mutations associated with disease.
[0037]
In other examples, the presence of mutation progression is indicative of disease onset and progression. Mutation (inheritance) weights are also indicative of disease progression or pathology.
[0038]
In a preferred embodiment, mtDNA sequences from prostate fluid are compared to a database of normal and transient metastatic mtDNA sequences that are clearly associated with prostate cancer. This set of comparative data is based on maternal studies, and further provides a clear example of mtDNA mutations clearly associated with the disease, as opposed to mutations that appear in the mitochondrial family in the general population. Based on studies of other normal maternal mutations present in populations accumulated in the database.
[0039]
There may be a peculiar maternal system that shows disease predisposition.
[0040]
In another example, mtDNA sequences from suspected non-melanoma skin cancer are compared to an mtDNA sequence database of normal mtDNA sequences clearly associated with non-melanoma skin cancer.
[0041]
According to one characteristic part of the present invention, a method for detecting the occurrence or progression of disease in a subject containing mtDNA is provided. This method includes obtaining a biological sample from a subject, removing DNA from the biological sample, and detecting the presence of a mutation in the mtDNA. The step of detecting the presence of the mutation includes determining the sequence of mtDNA, amplifying mtDNA by PCR, performing southwestern blotting, performing denaturing HPLC, microarray, gene chip or biochip. It is selected from the group consisting of hybridization (hybridization), molecular marker analysis, and combinations thereof. In addition, the mtDNA of the biological sample has been compared to a database, which contains mutation data associated with disease-free mtDNA sequences and disease-related mitochondrial genome data.
[0042]
According to one feature of the invention, a method is provided for detecting the presence of a disease in a human specimen. The method includes obtaining a biological sample from a human specimen, removing DNA from the biological sample, detecting a mutation in mitochondrial DNA of the biological sample, and mitochondria of the biological sample. Comparing the DNA sequence to a database. This database contains mutation data associated with disease-free mitochondrial DNA sequences and disease-associated mitochondrial genome data. Mitochondrial DNA mutation rates associated with specific diseases are important indicators of disease progression and prognosis. This allows the identification of the stage of the disease and improves the identification of the disease that will result in good disease interference and specific therapies.
[0043]
In yet another embodiment, increasing the sensitivity of heteroplasmy detection improves the early discrimination ability of the test.
[0044]
The present invention may also be used to monitor disease progression by observing critical sites targeted by metastasis.
[0045]
Methods are provided for determining the predisposition to illness or dysfunction indicated by mutations in mitochondrial DNA sequences. The method includes obtaining a biological sample from a human specimen, removing DNA from the biological sample, detecting a mutation in the mitochondrial DNA of the biological sample, Comparing the mitochondrial DNA sequence to a database. This database contains data on mutations related to mitochondrial DNA sequences between individuals susceptible to illness or dysfunction and individuals susceptible to illness or dysfunction.
[0046]
In the preferred embodiment, a DNA microarray is used to determine the sequence of mitochondrial DNA. Other techniques can also be used. For example, direct sequencing of specimens or the complete human genome, SNaP shot^TMSNP detection, real-time PCR, or other methods standard in the art.
[0047]
According to yet another feature of the invention, a method for assessing the progress of aging in a human specimen is provided. The method includes obtaining a biological sample from a human specimen, removing DNA from the biological sample, detecting a mutation in the mitochondrial DNA of the biological sample, Comparing the mitochondrial DNA sequence to a database. The database contains data on TDNA mutations associated with aging.
[0048]
Detecting the presence of mtDNA mutations includes determining the sequence of mtDNA, amplifying mtDNA by PCR, Southern, Northern, Western and Southwestern blot hybridization, and performing denaturing HPLC. And hybridization to a microarray, biochip or gene chip, molecular marker analysis, and any combination thereof.
[0049]
In accordance with yet another embodiment of the present invention, a database having a plurality of human mitochondrial DNA sequences is provided. The mitochondrial DNA sequence is selected from the group consisting of normal regulatory sequences associated with disease free conditions, and sequences associated with disease presence or predisposition to disease predisposition.
[0050]
Kits for diagnosing disease are provided. The kit includes a disposable chip, a microarray, means for holding the disposable chip, means for extracting mitochondrial DNA, and means for accessing a database of mitochondrial DNA sequences.
[0051]
According to yet another feature of the invention, a method for diagnosing a patient's disease is provided. The method comprises hybridizing a nucleic acid sample obtained from mitochondrial DNA to an array having a solid substrate and a plurality of nucleic acid elements. Each nucleic acid element indicates the presence of a disease, and each nucleic acid element has a unique position and is stably bound to a solid substrate. Hybridization of a nucleic acid sample to one or more nucleic acid elements having an array indicates the presence of prostate cancer.
[0052]
According to yet another feature of the invention, a kit for determining disease predisposition is provided. The kit includes a disposable chip, a microarray, means for holding the disposable chip, means for taking out DNA, and means for accessing a database of mitochondrial DNA sequences.
[0053]
According to another embodiment of the invention, a method is provided for determining the predisposition or symptom of a disease or dysfunction indicated by a mutation in a mitochondrial DNA sequence. The method includes obtaining a biological sample from a human specimen, removing mitochondrial DNA from the biological sample, determining the sequence of mitochondrial DNA in the biological sample, and mitochondria of the biological sample. Comparing the DNA sequence to a database. The database includes population level data for mutations associated with disease-free mtDNA sequences and data for mitochondrial genomes associated with disease.
[0054]
According to yet another embodiment of the present invention, a method for diagnosing non-melanoma skin cancer in a patient is provided. The method comprises hybridizing a nucleic acid sample obtained from mitochondrial DNA to an array having a solid substrate and a plurality of nucleic acid elements. Each nucleic acid element represents non-melanoma skin cancer, and each nucleic acid element has a unique position and is stably bound to a solid substrate. Hybridization of the nucleic acid sample to one or more nucleic acid elements having an array indicates the presence of non-melanoma skin cancer. Alternatively, non-specific mutations may reach a threshold effect that exceeds the threshold effect of cancer progression. Similarly, prostate cancer can be diagnosed.
[0055]
According to another embodiment of the present invention, a method for detecting heteroplasmy in a subject containing mtDNA is provided. The method comprises obtaining a biological sample from a subject, removing DNA from the biological sample, and performing denaturing HPLC on the sample.
[0056]
According to another feature of the invention, a method is provided for detecting a disease-related mutation in a subject comprising mtDNA. The method includes obtaining a biological sample from a subject, removing DNA from the biological sample, detecting the presence of a mutation in mtDNA, and storing the mtDNA of the biological sample in a database. Comparing with. The database contains variant data for a common population without disease and data for the mitochondrial genome associated with the disease.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0057]
The methods of the invention can be used to diagnose diseases associated with mtDNA. The method according to the invention amplifies an individual's mitochondrial genome from a biological sample and determines the sequence of a portion of the mitochondrial genome, preferably all of the individual's mitochondrial genome, using any means already known. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) may be used to screen many samples quickly. DHPLC can be focused on mutation hot spots. Compared to 20-25% in a normal sequence, DHPLC is more sensitive for mutation detection than autosequencing 2% heteroplasmy. Methods may be developed to detect low levels of heteroplasmy (<2%).
[0058]
As used herein, the “presence” of a mutation in mtDNA includes a heteroplasmy mutation, and therefore some normal samples include some normal MtDNA is thought to be additionally present.
[0059]
“Ultraviolet kerotoses” as used herein refers to precursor epidermal damage of squamous cell carcinoma.
[0060]
“Aging” as used herein means the accumulation of changes over time, both at the molecular and cellular level.
[0061]
As used herein, “alleles” refers to one of several variations in a given DNA sequence that occupies a specific site on a chromosome.
[0062]
As used herein, “attaching” or “spotting” refers to irreversibly binding a nucleic acid to a substrate via covalent bonding, hydrogen bonding or ionic action (ionic bonding). It means the step of arranging nucleic acids on a solid substrate to form a nucleic acid array.
[0063]
As used herein, “basal cell carcinoma” is a type of skin cell cancer.
[0064]
As used herein, “Bowen's disease” means in situ epidermoid cancer.
[0065]
As used herein, “diagnostic” or “diagnosing” means using the presence or absence of a mutation or combination thereof as an element in diagnosing or treating a disease. doing. Mutation detection can be a step in the diagnosis of disease symptoms.
[0066]
As used herein, “disease” includes dysfunction or other abnormal physical condition.
[0067]
As used herein, “disease associated mitochondrial genomes” refers to genomes that indicate a specific disease or contain mutations associated with a specific disease.
[0068]
As used herein, a “database” refers to an electronic storage system (computer-based using standard industrial software), which is used by researchers as nucleotides. It has the ability to accumulate and provide recoverable information that allows the sequence structure to be determined quickly. The database also stores descriptive information about individuals who provide biological samples. This descriptive information includes health status and other related items that are correlated with the biological sample.
[0069]
As used herein, “deletions” means the removal of a portion of DNA from a contiguous sequence of nucleic acids. Once the deletion occurs, the gap is repaired by rejoining the ends. Deletions can vary in size from one base to thousands or more in size.
[0070]
As used herein, “duplications” means that a specific sequence of DNA is replicated and inserted one or more of the original replication behind or in front of or at any site in the genome. It means that.
[0071]
As used herein, “heteroplasmy” is defined by the mutation rate. For wild-type mtDNA molecules, 100% mutated mtDNA is referred to as “homoplasmic”. Heteroplasmic mutations are mutations that occur in some replicas but not in all replicas of the mitochondrial genome.
[0072]
As used herein, “homoplasmy” means that all mitochondrial sequences are identical.
[0073]
As used herein, “inversions” refers to a series of DNA lengths being excised and reinserted in the opposite direction.
[0074]
As used herein, “maternal inheritance” refers to mitochondria that are inherited through the cytoplasm of the egg.
[0075]
As used herein, a “maternal line” refers to a clonal sequence of mitochondrial DNA that is passed down from mother to generation.
[0076]
As used herein, “mitochondria” means a eukaryotic cytoplasmic organelle that produces ATP for cellular processes.
[0077]
As used herein, “mutation” encompasses any change in the DNA sequence from the wild-type sequence, including point mutations, transitions, insertions, transversions, Transposition, deletion, inversion, duplication, recombination, or combinations thereof are included.
[0078]
“Mutation load” as used herein refers to an increase in mutations in mtDNA that will lead to a loss of function of the gene or all genes involved.
[0079]
As used herein, “nucleic acid array” refers to a plurality of specific nucleic acids in which different nucleic acids are attached to one side of a solid support at a density of greater than 20 per square centimeter. Yes. Each nucleic acid is attached to the surface of the solid support in a preselected, non-identical region. In one embodiment, the nucleic acid attached to the surface of the solid support is DNA. In a preferred embodiment, the nucleic acid attached to the surface of the solid support is cDNA. In another preferred embodiment, the nucleic acid attached to the surface of the solid support is cDNA synthesized by polymerase chain reaction (PCR). Preferably, the nucleic acid array according to the invention has nucleic acids with a length of at least 150 nucleotides. Preferably, the nucleic acid array has nucleic acids with a length of 6,000 nucleotides or less. More preferably, the nucleic acid array has nucleic acids having a length of 500 nucleotides or less. In other embodiments, the array has at least 10 different diffusions attached to one side of the solid support. In yet another embodiment, the array has at least 10,000 different diffusions attached to one side of the solid support. As used herein, the term “nucleic acid” is interchangeable with “polynucleotide”.
[0080]
As used herein, a “nucleic acid target” or “target nucleic acid” is usually a complementary base through one or more types of chemical bonds. Defined as a nucleic acid capable of binding to a complementary sequence nucleic acid element through pairing. As used herein, a nucleic acid target includes a natural base (eg, A, G, C, or T) and a modified base (7-diazoguanosine, inosine, etc.). Further, the base of the nucleic acid probe may be bound by a bond other than a phosphodiester bond as long as it does not interfere with hybridization. Thereby, the nucleic acid target may be a peptide nucleic acid in which the constituent bases are bound by peptide bonds rather than phosphodiester bonds. Preferably, the nucleic acid target has been removed from an extract of human tissue or body fluid. More preferably, the nucleic acid target is a single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or DNA-RNA hybrid synthesized from an extract of human tissue or body fluid.
[0081]
As used herein, “nucleus” means the most famous organelle of eukaryotic cells and has all chromosomal DNA.
[0082]
As used herein, “PSA Test” means an antigen test that is specific to the prostate, which is an antigen in the blood that is indicative of prostate cancer.
[0083]
As used herein, “point mutation” refers to a single nucleotide change in DNA.
[0084]
As used herein, “polymorphism” refers to sequence changes within a population of alleles or mtDNA genomes.
[0085]
As used herein, “precursor lesions” refers to DNA mutations or combinations thereof that indicate an association with a potential disease.
[0086]
As used herein, “predisposed to a disease or a predisposition to a disease” refers to a person's disease or function due to the presence or absence of a mutation associated with the disease or dysfunction. It means that the risk of becoming disabled is very high, or that the risk of developing a disease or dysfunction earlier than the average person is very high.
[0087]
As used herein, “preselected region”, “predefined region” or “unique position” is used for nucleic acid deposition. Refers to a local area on a substrate that has been used, used, or intended to be used. To put it another way, here it refers to a “selected region” or simply a “region”. The preselected region has any suitable shape (eg, circular, rectangular, elliptical, wedge shape, etc.). In some embodiments, the preselected area is about 1 cm.²Smaller, more preferably 1mm²Smaller, even more preferably 0.5 mm²Smaller than. Also, in some embodiments, the area is about 0.125 to 0.5 mm.²It is.
[0088]
As used herein, “somatic mutation” means a change in DNA sequence after fertilization.
[0089]
As used herein, “solid substrate” or “solid support” refers to an element having a rigid or partially rigid surface. The term “substrate” or “support” is here interchangeable with the terms “solid substrate” or “solid support”. Solid supports can be biological, non-biological, biological or present as particles, chains, precipitates, gels, sheets, tubes, spheres, containers, capillaries, pads, slices, films, plates, slides, etc. It may be non-biological or any combination of these. The substrate is often a silicon or glass surface, or a charged membrane such as (poly) tetrafluoroethylene, (poly) vinylidene fluoride, polystyrene, polycarbonate, or 66 nylon or nitrocellulose, or combinations thereof. In a preferred embodiment, the solid support is glass. Preferably, at least one surface of the substrate is substantially flat. Preferably, the surface of the solid support has functional groups including (but not limited to) carboxyl groups, amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, and the like. In one embodiment, the surface is translucent.
[0090]
As used herein, “squamous cell carcinoma” is a type of skin cell cancer.
[0091]
As used herein, “stably associated” refers to binding irreversibly to a solid substrate to form an array via covalent bonds, hydrogen bonds or ionic effects (ionic bonds). Refers to the nucleic acid. This allows the nucleic acid to be preselected on a solid substrate against all other nucleic acids that are stably bound to the array or under conditions in which the array is analyzed (ie, hybridized or scanned). A pre-selected unique position is maintained for all other regions.
[0092]
The “statistically significant” number of mitochondrial DNA sequences is determined using a standard chi-square design algorithm, that is, by determining observed versus expected values.
[0093]
As used herein, “transition” refers to substitution of the same base containing nitrogen, ie, pyrimidine to pyrimidine, or purine to purine. A mutation in which one pyrimidine is replaced by another pyrimidine, or one purine is replaced by the other.
[0094]
As used herein, “transversion” means substitution of different bases containing nitrogen, ie, purine to pyrimidine, or pyrimidine to purine. A mutation in which one purine is replaced (substituted) or vice versa.
[0095]
MtDNA and diagnosis of specific diseases
In one embodiment of the present invention, a method is provided for diagnosing specific diseases such as prostate cancer and non-melanoma skin cancer and observing aging by comparing mtDNA sequences. Diagnosing diseases such as prostate cancer using mtDNA rather than nuclear DNA has several advantages. First, mtDNA is easily understood at the individual and population level, not a complex genome. For this reason, large mtDNA databases with normal and disease-related genomes make individual diagnoses very accurate. Thus, variations associated with the disease are understood. Second, mtDNA has a 10-fold higher mutation rate than nuclear DNA (Wallace (1992)). A nuclear rearrangement that suggests a pre-stage of disease quickly binds to the mitochondria and appears as a somatic mutation. Third, mtDNA is essentially a clone because mtDNA has a maternal inheritance pattern and all mitochondria begin with the same mtDNA. For this reason, variants from this clonal state are easily detected. Also, any variation in sequence is a somatic event since mtDNA does not provide compelling evidence of recombination. Any mitochondria with mutations will result from the presence of many (2-10 copy number) mitochondrial genomes per mitochondria and many (500-2,000) mitochondria per cell. In a sense, it is “recessive”. Furthermore, the mitochondrial genome can tolerate very high levels (up to 90%) of mitochondria with damaged genomes. This occurs through complementation with the remaining wild type mtDNA (Chomyn et al. (1992)). However, the mutated genome is usually small and therefore has a replication advantage over the wild-type genome (Hayashi et al. (1991)), and thus the mutated mtDNA is clonal expansion. This suggests that unlike nuclear genes, there is little or no selection for cells with mtDNA mutations. Because of this high mutation rate, mutations and / or deletions that appear in mtDNA are maintained throughout the life of the cell and serve as a record of exposure to various mutagens. The integrity of mtDNA is maintained by a nuclear repair mechanism. It has been suggested that defects at these loci result in autosomal dominant disorder associated with numerous mitochondrial deletions (Zeviani et al. (1990)). Thus, mtDNA serves as an early lookout for early nuclear events associated with various cancers or other diseases. Finally, the mitochondrial genome can determine its sequence and monitor mutations on an individual basis.
[0096]
Diagnosis of nonmelanoma skin cancer
In a preferred embodiment of the present invention, a system is provided for early diagnosis of precursor damage indicative of mtDNA changes and solid tumor development in non-melanoma skin cancer (NMSC). Certain changes, such as the occurrence of common deletions, related mutations, and uncharacterized deletions in mtDNA, serve as reliable biomarkers for potential skin cancer. Mutant fingerprints of all mtDNA genomes in human NMSC and its precursor lesions are determined. In this way, mtDNA changes are established as early biomarkers of human skin cancer and its precursor damage. Denaturing HPLC is then used to assess low levels of heteroplasmy in the sequence of interest. Such an approach can also provide prospects for the development of early changes in other human tumors.
[0097]
Diagnosis of prostate cancer
In another embodiment of the present invention, a system for diagnosing prostate cancer is provided. Age-related accumulation of mtDNA defects makes people more susceptible to the development of certain clinical diseases such as prostate cancer that are prevalent in middle and old age. In preferred embodiments, routine prostate cancer screening is performed through mitochondrial genomic sequencing from prostate fluid. The presence of epithelial cells mutated to cancer cells is determined through amplification of mtDNA from prostate fluid. This diminishes current diagnostic techniques such as digital rectal examination and PSA. Recently, Fliss et al. (2000) identified mutated mtDNA in urine samples of patients with bladder cancer. Similar findings in prostatic fluid provide a non-invensive early detection method for prostate cancer. In contrast to prostate cancer as a whole, it is possible to diagnose different types of prostate cancer, as well as aggressive and fast-growing cell differentiation in young patients.
[0098]
Evaluation of mutations associated with aging
The system and method according to the present invention can be used to assess senescence based on the increasing frequency of mutations such as the 4977 bp “common deletion” and other mutations in the mitochondrial genome (Liu et al. (1977)). May be. This information, in conjunction with health survey data, allows statistically significant distinction of distinct causes that result in the same mutation / deletion. Fortunately, mtDNA is inherited only through eggs and is essentially a clone (Van De Graaff & Fox (1955)). This allows for carefully controlled studies of maternal mutations / deletions over several generations to determine a reliable frequency of age-related deletions. This information may be used to develop treatment methods that slow the aging process.
[0099]
Sample collection
Biological samples can be collected by any known means for the purpose of building a database of mtDNA sequences or for conducting diagnostic tests on individuals. Samples prepared in advance for database creation include, but are not limited to: In other words, maternal studies from groups or populations that frequently develop specific diseases such as, but not limited to, tumor banks, skin cancers and prostate cancer, and assessments of health and aging, as well as effects from the same maternal Maternal study of affected and unaffected people. For example, to collect and record biological samples, FTA^® Gene Cards^® May be used. Suitable samples include any tissue or fluid obtained from the mesothelium (body cavity epithelium), epithelium or endothelium. Such tissues and body fluids include, but are not limited to: Blood, saliva, cheek cells, saliva, prostate fluid, sweat, bone, hair, lymphoid tissue, cervical smear, breast aspirate, semen, semen, menstrual bleeding and biopsy tissue. Preferably, about 100 μl of blood, 100 μg to 25 mg of solid tissue was sampled. When skin cancer is suspected, skin cells or tissue (from normal, NMSC, and precursor lesions) are collected by skin biopsy or routine suction blistering. If a disease is suspected, the initial treatment physician, cancer researcher or other specialist will extract both normal and suspected tissue from the patient.
[0100]
For example, in the case of a prostate or skin tumor sample, a cross-section (5 micron) of a microdivided, paraffin-embedded tissue is shown before one slide is stained with hematoxylin and eosin (HE). The paraffin is removed. Isomorphs are stained with methyl green (MG), which is standard in the art. HE staining is rated by pathologists for normal, precursor, and applicable ratings of tumor progression. Isomorphic MG slides are used for laser capture, according to the rating cell manufacturer's recommendation (Arcturus).
[0101]
Extraction of mtDNA
As described in Current Protocols in Molecular Biology, DNA extraction is performed using any method known in the art, followed by the mitochondrial genome. The sequence is determined.
[0102]
Sequencing of mtDNA
<PCR>
The polynucleotide according to the present invention can be amplified by polymerase chain reaction (PCR). PCR methods are well known to those skilled in the art. PCR requires the presence of the nucleic acid to be amplified, double stranded oligonucleotide primers located on either side of the amplified sequence, DNA polymerase, deoxyribonucleoside triphosphates, buffers and salts. PCR techniques are well known in the art. PCR is performed as described in Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol 155: 335, which is incorporated herein by reference.
[0103]
In general, PCR is performed using template DNA (at least 1 fg; more effectively 1-1000 ng) and at least 25 pmol of oligonucleotide primers. A typical reaction mixture consists of 2 μl DNA, 25 pmol oligonucleotide primer, 2.5 μl 10 × PCR buffer 1 (Perkin-Elmer, Foster City, Calif.), 0.4 μl 1.25 μM dNTP, 0.15 μl ( Or 2.5 units) Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, Calif.) And a total volume of 25 μl deionized water. Covered with liquid mineral oil, PCR is performed using a programmable thermal circulator.
[0104]
The length and temperature of each step of the PCR cycle, as well as the number of cycles, are practically adjusted by strict requirements. The annealing temperature and timing are determined by both the efficiency with which the primer is expected to anneal to the template and the degree of mismatch allowed. The ability to optimize the severity of primer annealing conditions is within the knowledge of one of ordinary skill in the art. An annealing temperature in the range of 30-72 ° C. is used. In general, initial denaturation of the template molecule usually occurs for 4 minutes at a temperature in the range of 92-99 ° C, followed by 20-40 cycles of denaturation (94-99 ° C for 15 seconds to 1 minute) followed by annealing. (1-2 minutes at the temperature determined as above) and elongation (1 minute at 72 ° C.) occurs. The final extension step is generally performed at 72 ° C for 4 minutes, followed by an indefinite step at 4 ° C (0-24 hours).
[0105]
<DNA sequencing>
Any known means for determining the sequence of the mitochondrial genome may be used. Preferably, mtDNA is amplified by PCR prior to sequencing. The PCR product is cloned directly into a vector whose sequence is determined or placed in a bacterial host. An example of a DNA sequencing method is described in “Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis” (Nucleic Acids Res. 19: 4121) by Brumley, RL Jr. and Smith, LM (1991). -4126) and “High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis” (Methods Enzymol. 218: 154-172) by Luckey, JA et al. (1993). The combined use of mtDNA sequencing and PCR has been described by Hopgood, R. et al. (1992), “Strategies for automated sequencing of humans directly from PCR products. mtDNA directly from PCR products ”(Biotechniques 13: 82-92) and Tanaka, M et al. (1996)“ Automated sequencing of mtDNA ”(Methods Enzymol 264: 407-421). Yes.
[0106]
<Deletion analysis and detection>
A preferred approach is the long extension PCR (LX-PCR) technique using the Expand Long Template PCR system (Boehringer Mannheim). The LX-PCR technique, which was established and demonstrated at the Birch-Machin laboratory, can be used quickly for all spectra of mtDNA, as opposed to a single deletion event. An opportunity to screen is provided.
[0107]
MtDNA of all mtDNA⁴⁹⁷⁷A semi-quantitative PCR method (Corral-Debrinski et al. (1991)) can be used to assess the rate of deletion.
[0108]
Also, Southern blots, probe techniques labeled with isotopes, and any other technique standard in the art may be used for deletion detection.
[0109]
<Sequencing of PCR product>
Any known means may be used to determine the sequence of the PCR product. Preferably, all DNA sequences are ABI Big Dye Terminator^TMCharacterized by dideoxy sequencing using the technique and a series of 72 overlapping primers for heavy and light chains, respectively. Sequencing occurs for one or several or for combinations of 310, 3100 or 3700 ABI platforms. The sequencing reaction is performed according to the manufacturer's recommendation.
[0110]
Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography ) Mutation analysis of the mitochondrial genome
DHPLC can be used to quickly screen mutations in many samples prior to sequencing the mitochondrial genome and identifying mutation hot spots. This technique provides high sensitivity for the identification of low levels of heteroplasmy. This does not detect homoplasmic changes, but complements traditional sequencing techniques. Apart from homoplasmy mutations recently identified in tumors, the majority of mtDNA mutations reported are heteroplasmy (Chinnery et al. (1999)). These heteroplasmic mtDNA changes result in heteroduplexes after PCR amplification of mtDNA. Rapid screening for heteroplasmic mtDNA mutations is determined using a relatively new technique called Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC). This technique has recently been used to rapidly screen and identify all mtDNA genomes to levels below 5% for heteroplasmic point mutations (Van den Bosch et al. (2000)).
[0111]
This DHPLC provides fully automated screening Wave^TM It may be performed based on the DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha. USA). The same technique can be used to screen for heteroplasmic mutations in mtDNA. Preferably, all mtDNA genomes have been PCR amplified in 13 overlapping fragments by using two different PCR conditions described by van den Bosch et al. (2000). A 1-2 kb PCR product is broken into 90-600 bp fragments and split at its optimal melting temperature. Mutations are represented by two peaks, and a low proportion of mutations, such as lower than 2% heteroplasmy, is represented as a peak shoulder.
[0112]
The DNA sequence can also be determined using a microarray known in the art.
[0113]
Analyzing data
Once the sequence is determined, the normal mtDNA sequence and the disease-related mtDNA sequence are recorded for comparison in the database. Resequensing devices, micro-array technology, integrated microfluidic amplification and analysis system, high-speed, high-throughput mutation detection method throughput, mutation detection method) and other methods may all be used with the method of the present invention.
[0114]
Data obtained from sequencing the individual's mitochondrial genome is compared to population level data. Data is acquired through sample acquisition and mtDNA sequencing as described above. Preferably, the database contains information from maternal studies. Population level data is held in a database. Any suitable database can be used.
[0115]
A multidimensional evaluation research database of clinical and biological data is used. This provides the necessary bioinformatics foundation for the collection, processing and dissemination of information collected by the laboratories involved in this business. This database is a central electronic system linked to a network that is a dynamic and powerful resource.
[0116]
The database may be accessed via any known means, preferably the secure internet. Preferably, the database is developed using an e-commerce algorithm that is built on the server and employs the use of an application server that supports multiple users through optimal performance and measurable features. A separate “web” server can serve as a central point where all content, applications and processes must flow through before reaching the user, thus providing the basis for the architecture of the website.
[0117]
Data mining algorithms known in the art are used to find patterns, populations and models from data (SAS 2000). In addition, intelligent algorithms and methods will be developed for the occurrence of mutations, mutation rates, mutation patterns for disease detection, information retrieval, and other complex sequence analysis software.
[0118]
Nucleic acid elements and probes
The present invention provides nucleic acid elements and probes that specifically bind to a target nucleic acid sequence. The target nucleic acid sequence is a nucleic acid or a region of nucleic acid that is to be detected as indicative of a disease such as prostate cancer, non-melanoma skin cancer. The target nucleic acid sequence to be analyzed using the microarray of the present invention is preferably taken from a sample of human tissue or body fluid. The present invention provides target nucleic acid sequences consisting of RNA, nucleic acid corresponding to RNA (ie, cDNA), or DNA. The nucleic acid elements are stably bound to the solid support for constituting the array according to the present invention. The nucleic acid element may be single-stranded or double-stranded, and may be a PCR fragment amplified from cDNA.
[0119]
The present invention also provides a polynucleotide sequence constituting the probe. As used herein, the term “probe” forms a duplex structure having a sequence in a target nucleic acid due to complementarity of at least one sequence in a probe having a sequence in a target region. Refers to an oligonucleotide. The probe may be labeled by a method known in the art. The probe according to the present invention may be single-stranded or double-stranded.
[0120]
Diagnostic equipment
The present invention includes diagnostic devices such as biochips, gene chips or microarrays used to diagnose specific diseases or identify specific mutations. All sequenced mitochondrial genomes are evaluated to generate base-paired conformational structures and are conferred with a suppression index of mutation and base-pair deletion ratios associated with a particular disease or functional disorder Is done. The diagnostic device is then used to generate a biochip, gene chip or microarray.
[0121]
Once the sequence associated with a particular disease, condition or dysfunction is identified, hybridization of mtDNA to an array of oligonucleotides can be used to identify the particular mutation. Any known technique of hybridization may be used. Preferably, an array having oligonucleotide probes and control probes that match the wild type or mutated region is used. Commercially available arrays such as microarrays or gene chips are suitable. These arrays have thousands of matched control probe pairs on a slide or microchip. Magazine articles describing the use of microarrays in genomic and DNA sequence analysis are available at www.gene-chips.com.
[0122]
<Microarray>
Polynucleotide arrays provide a high-speed processing technique that allows analysis of multiple polynucleotides within a sample having one or more target nucleic acid sequences. The arrays of the present invention are useful for gene expression analysis, disease diagnosis and prognosis (eg, monitoring patient response to therapy, drug screening, etc.).
[0123]
Any combination of mtDNA polynucleotide sequences exhibiting disease, aging, or other health related mutations can be used to construct a microarray.
[0124]
The target nucleic acid sample to be analyzed using the microarray is taken from any human tissue or body fluid containing a sufficient amount of mtDNA, preferably prostate fluid, solid tumor, blood or urine, as described above. The target nucleic acid sample is contacted with the polynucleotide element under hybridization conditions sufficient to produce a pattern of hybridization of the complementary nucleic acid element / target complex.
[0125]
<Construction of microarray>
The microarray has a plurality of unique polynucleotides attached to one side of the solid support. Each of the polynucleotides is attached to the surface of the solid support in a preselected non-identical region. Each related sample on the array has a known identity, usually a polynucleotide component of a known sequence, as described in more detail below. In the present invention, any conceivable substrate may be employed.
[0126]
The array is constructed using any known means. Nucleic acid elements may be generated using established techniques such as polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription (RT). These techniques are similar to techniques currently known in the art (eg PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al. (1995) and PCR: Introduction to Biotechniques Series, CR Newton, A See Graham (1997). The amplified polynucleotide is purified by methods well known in the art (eg, column purification). A polynucleotide is considered pure when it is substantially free of incomplete products and polymers produced during the synthesis of the desired polynucleotide. Preferably, the purified polynucleotide will also be substantially free of contaminants that interfere with or interfere with the binding action of the molecule.
[0127]
In the array of the present invention, the components of the polynucleotide are stably bound to the surface of the solid support. The support is a flexible or rigid solid support.
[0128]
In the present invention, any solid support to which the nucleic acid element is attached may be used. Examples of suitable solid support materials include, but are not limited to: Silicates such as glass and silica gel, cellulose paper, nitrocellulose paper, nylon, polystyrene, polymethacrylate, latex, rubber, and Teflon^TMFluorocarbon resin.
[0129]
The rigid support element may be used in a wide variety of shapes, including but not limited to slides and beads. Slides offer several functional advantages and are the preferred form of solid support. Because of its flat surface, the use of glass slides minimizes probes and hybridization reagents. The slide also allows for targeted application of reagents, facilitates holding at a constant temperature, facilitates washing, and direct visualization of RNA and / or DNA immobilized on a solid support. To make it easier. Removal of RNA and / or DNA immobilized on the solid support is also facilitated by using a slide.
[0130]
The particular material selected as the solid support is not essential to the present invention so long as it provides the described function. Typically, the person who produces or uses the present invention will select the best commercially available material based on cost, availability, expected application conditions in the final product, and demand for the entire manufacturing process. Let ’s go.
[0131]
Many techniques for attaching the nucleic acid element of the present invention to a substrate (a step called spotting) have been used. For example, the polynucleotide is attached using the technique of US Pat. No. 5,807,522. The US patent is incorporated herein by reference to teach the method of polymer deposition. Alternatively, spotting is performed using contact printing technology.
[0132]
The amount of polynucleotide present in each component will be sufficient to provide for detection of the target polynucleotide sequence and sufficient hybridization during the analysis in which the array is employed. In general, the amount of each nucleic acid element that stably binds to the solid support of the array is at least about 0.1 ng, preferably at least about 0.5 ng, more preferably at least about 1 ng. The amount of each nucleic acid is at most 1000 ng or more and usually does not exceed about 20 ng. When the diffusing element is spotted on a solid support within a spot having a generally circular size, the diameter of the spot is generally in the range of about 10 to 5,000 μm, usually about 20 to 2,000 μm. Usually, it is about 50 to 1,000 μm.
[0133]
In order to monitor non-specific binding or cross-hybridization to the polynucleotide in a sample other than the target to which the probe is labeled, the control polynucleotide is spotted on the array, and the target expression control polynucleotide and the mismatch control nucleotide May be used as Thus, the mismatch probe indicates whether the hybridization is specific or not. For example, if a target is present, a perfectly matched probe should always be brighter than a mismatched probe. Also, if all central mismatches are present, a mismatch probe is used to detect the mutation.
[0134]
<Preparation of target>
Targets for microarrays are taken from human body fluids or tissue samples. It may be desirable to amplify the target nucleic acid sample prior to hybridization. No matter what amplification method is used, those skilled in the art should be careful to use methods that control or maintain the relative frequency of the amplified polynucleotide, if quantitative results are desired. You will understand that you have to. Methods of “quantitative” amplification are well known to those skilled in the art. For example, quantitative PCR involves simultaneously amplifying a known amount of control sequences using the same primers. This provides an internal reference used to calibrate the PCR reaction. A high density array may include probes that have specificity for an internal standard for quantification of amplified polynucleotides. Detailed protocols for quantitative PCR are provided in Academic Press, Inc. N.Y. (1990) by PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. Other suitable amplification methods include, but are not limited to: That is, polymerase chain reaction (PCR) (Innis, et al., PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990)), ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics, 4: 560 (1989), Landegren, et al., Science, 241: 1077 (1988) and Barringer, et al., Gene, 89: 117 (1990), transcription amplication (Kwoh, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989)) and self-sustained sequences replication (Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)).
[0135]
The present invention provides a labeled target or labeled probe. In the present invention, any analytically detectable marker attached or incorporated within the molecule may be used. An analytically detectable marker refers to any molecule, atomic group or atom that is analytically detected and quantified. Detectable labels suitable for use in the present invention include any component detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means. Labels useful in the present invention include biotin, magnetic beads (eg, Dynabeads) that are stained with a labeled streptavidin conjugate.^TM), Fluorescent dyes (eg fluorescein, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein), radiolabels (eg:³H,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C or³²P), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and others commonly used in ELISA (enzyme immunoassay)), and colloidal gold, colored glass, plastic beads (eg, polystyrene, polypropylene, latex, etc.) ). Patents that teach the use of such labels include US Pat. Nos. 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149, 4,366,241.
[0136]
Means for detecting such labels are well known to those of skill in the art. Thus, for example, radioactive labels are detected using a photographic film or scintillation counter, and fluorescent markers are detected using a photodetector that detects the emitted light. Enzymatic labels are typically detected by providing an enzyme to the substrate and detecting the reaction product produced by the enzymatic reaction on the substrate, and the colorimetric label is detected by simply visualizing the colored label Is done.
[0137]
The label is incorporated by any of a number of means well known to those skilled in the art. In a preferred embodiment, the label is incorporated simultaneously during the amplification step in the preparation of the sample polynucleotide. Thus, for example, polymerase chain reaction (PCR) with labeled primers or labeled nucleotides will provide a labeled amplification product. In a preferred embodiment, as described above, transcription amplification using labeled nucleotides (fluorescein labeled UTP and / or CTP) introduces a label into the transcribed polynucleotide. Alternatively, the label may be added directly to the original polynucleotide sample (eg, mRNA, poly A mRNA, cDNA, etc.) or to the amplification product after amplification is complete. Means for labeling polynucleotides are well known to those of skill in the art, eg, subsequent attachment of a polynucleotide linker (chain reaction) that binds the sample polynucleotide to the label (eg, fluorophore) and It includes nick translation and end-labeling (eg with labeled RNA) by kinaseing the polynucleotide.
[0138]
In a preferred embodiment, the target includes one or more control molecules that create hybrid nucleic acids to control the probes on the microarray in order to average the signal generated from the microarray. The labeled averaging target is a fully complementary polynucleotide sequence to control the oligonucleotides spotted on the microarray as described above. The signal obtained from the Averaging Control after hybridization can be used to account for changes in hybridization conditions, changes in label intensity, changes in efficiency “reading”, and other factors that change the complete hybridization signal between arrays. Provides control for change.
[0139]
<Hybridization conditions>
Polynucleotide hybridization involves denatured probe or target nucleic acid element and target poly- mer under conditions that allow the probe or target nucleic acid element and its complementary target to form a stable hybrid duplex through complementary base pairing. Providing nucleotides. Polynucleotides that do not form a hybrid duplex are washed away leaving the hybridizing polynucleotide to be detected through detection of the attached detectable label. It is generally recognized that polynucleotides are denatured by increasing the temperature or decreasing the salt concentration of the buffer containing the polynucleotide. Under low stringency conditions (eg, low temperature and / or high salinity), hybrid duplexes (eg, DNA: DNA, RNA: RNA, RNA: DNA, cDNA: RNA, cDNA: DNA) are formed. For this reason, the specificity of hybridization decreases at low stringency. In contrast, at higher stringency (eg, high temperature or low salinity), successful hybridization requires little mismatch. Methods for optimizing hybridization conditions are well known to those skilled in the art (eg, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Polynucleotide Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, NY (1993)).
[0140]
Following hybridization, unhybridized labeled or unlabeled polynucleotides are conveniently removed from the support surface by washing. Thereby, a pattern of the hybridized target polynucleotide is generated on the support surface. Various cleaning solutions are known to those skilled in the art and may be used. The resulting pattern of hybridization of labeled and hybridized oligonucleotides and / or polynucleotides may be visualized and detected in various ways. Specific detection methods have been selected based on the specific label of the test polynucleotide, and representative detection means include scintillation counting, autoradiography, fluorescence measurements, colorimetric measurements, luminescence measurements, and the like.
[0141]
<Image acquisition and data analysis>
As described above, following hybridization, optional washing steps, and / or subsequent processing, the resulting hybridization pattern is detected. In detecting or visualizing the hybridization pattern, not only the intensity or signal value of the label is detected, but also quantified. This is because the signal from each hybridization spot is measured and compared to a unit value corresponding to the signal emitted by a known number of end-labeled target polynucleotides, so that on the array in the hybridization pattern. This means that the number or absolute value of the copy number of each end-labeled target that is hybridized to a particular spot is obtained.
[0142]
Techniques for analyzing data collected from hybridization to arrays are well known in the art. For example, if the detection of hybridization includes a fluorescent label, data analysis determines fluorescence intensity as a function of substrate position from the collected data, and outliers, ie, data that deviates from a predetermined statistical distribution. Removing and calculating the relative binding affinity of the test polynucleotide from the remaining data. The remaining data is presented as an image with the intensity of each region varying depending on the binding affinity between the relevant oligonucleotide and / or polynucleotide and the test polynucleotide.
[0143]
Following detection or visualization, the labeled target polynucleotide sample was removed as well as the genetic characteristics of the labeled target polynucleotide sample contacted with the array to produce a hybridization pattern. Used to determine quantitative information about physiological sources. Genetic characteristics refer to information regarding the type of polynucleotide present in the sample, ie, regarding the number of copies of a particular polynucleotide within the sample as well as the type of gene having complementarity.
[0144]
<Diagnostic test or prognostic test>
The present invention provides a diagnostic test for detecting disease. The present invention also provides a prognostic test to observe the patient's response to treatment. According to the method of the present invention, the presence of a disease or the patient's response to treatment is detected by taking a body fluid or tissue sample from the patient. A sample containing nucleic acid is prepared from a sample of body fluid or tissue. Nucleic acid extracted from the sample is hybridized to an array comprising a solid substrate and a plurality of nucleic acid elements. Each element indicates the presence of a disease or predisposition to illness or disability. According to this diagnostic test, hybridization of a sample containing nucleic acid to one or more nucleic acid elements on the array is indicative of disease, disease predisposition or dysfunction predisposition, and in the case of prognosis, Shows patient response to treatment.
[0145]
Other utilities of the present invention will be readily apparent to those skilled in the art, as described above and as shown in the following examples.
[0146]
The invention is described in more detail in the following examples. These examples are merely illustrative, as numerous modifications and variations will be apparent to those skilled in the art.
[0147]
Example 1: Prostate tumor
Following collection of prostate fluid or surgery to remove the prostate tumor, biopsy slides are prepared to identify mutant or cancer cells. Laser capture microdissection (LCM) microscopy is used to separate normal, benign or malignant cells from a tissue section. Obtaining diseased cells of interest, such as precancerous cells or cancer cell infiltrating groups, is possible from the surrounding exogenous cells.
[0148]
All DNA extracts from each of these cells are purified according to a variation of the protocol outlined by Arcturus Engineering Inc. DNA was prepared at 42 ° C. in a 50 μl volume of 1 mg / ml proteinase K (PK) in 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA (pH 8.0) and 0.1% Tween 20. Extracted from cells overnight. After overnight culture at 42 ° C., the tube was removed from the culture furnace. The sample was centrifuged at 6400 rpm (2000 x g) for 5 min. CapSure^TMWas removed from the tube and discarded. The tube was incubated at 95 ° C. for 10 minutes (PK is inactive) and cooled to room temperature. 5-50 μl of sample was used for PCR amplification.
[0149]
Following purification, individual samples are amplified by LX-PCR using appropriate primers for hypervariable region 1 (HV1), hypervariable region 2 (HV2) and all 12S regions. These PCR products are then sequenced using high speed processing methods well known in the art.
[0150]
Example 2: Replication of non-coding regions of mtDNA from sun-exposed skin
DNeasy supplied by Qiagen^TM Using the kit, DNA was extracted from the tissue samples as described in Example 1. A “back to back” primer method was used to investigate the occurrence of non-coding region (NCR) tandem duplications associated with sun exposure. Divided samples of human skin from sun-exposed body parts (n = 24) and sun-protected body parts (n = 10) comparable to 32 years old were investigated.
[0151]
The following overlapping primers from Brockington et al. (1993) and Lee et al. (1994) were used.
C L336 AAC ACA TCT CTG CCA AAC CC 20 mer
D H335 TAA GTG CTG TGG CCA GAA GC 20 mer
E L467 CCC ATA CTA CTA ATC TCA TC 20 mer
F H466 AGT GGG AGG GGA AAA TAA TG 20 mer
[0152]
The primer pairs C / D and E / F are “back to back” at two separate sets of sites in a tandem repeat of the non-coding region. For this reason, if there is an overlap at these sites, a tandem repeat will simply produce a product. The product produced is a common variant of 260 bp and / or less 200 bp. The changed PCR conditions are as follows. Total amount of 100 ng cellular DNA, 200 μM dNTP, 2.5 U HotStar Taq polymerase and PCR buffer (Qiagen, UK), 1 cycle at 94 ° C. for 4 minutes, 94 ° C. × 1 minute, 55 ° C. × 1 minute and 72 ° C. × 1 minute 36 cycles, and 72 ° C. for 7 minutes is one cycle.
[0153]
With increasing sun exposure, an increased occurrence of duplication was observed. Overlap was confirmed at 10/24 for samples from skin exposed to the sun and samples from sun-protected skin, and no overlap was observed at 0/10 (Fisher's exact test, p = 0.015) (Birch-Machin and Krishnan 2001). The most frequent duplicate sizes were 200 and 260 base pairs. Interestingly, these same samples also contain a high level (> 1%) of a 4977 bp common mtDNA deletion as determined by the established quantitative three-primer PCR analysis described in Example 6. It was out.
[0154]
Example 3: Mutation fingerprint of mtDNA in human NMSC and its precursor lesions
DNeasy by Qiagen^TM Was used to extract DNA from the human skin tissue sample described in Example 1. Using specific primers, mtDNA was amplified by PCR followed by DNA sample preparation (Qiagen). Mutation is BigDye^TM Recognized by automated sequencing (PE Applied Biosystems) using Terminator Cycle sequencing. Such an approach is described in Healy et al. (2000) and Hearding et al. (2000). Using an established PCR primer pair known not to amplify pseudogenes or other nuclear loci, the sequence of all 16,569 bp human mitochondrial genome is determined. Any putative DNA changes are confirmed by comparison with the revised “Cambridge” human mtDNA literature (Andrews et al. (1999)). Sequences derived from tumor mtDNA are first compared for known polymorphisms (Andrews et al. (1999); MITOMAP), and then normal skin to recognize pure somatic mutations. To the mtDNA sequence from
[0155]
DHPLC offers fully automated screen processing, WAVE^TM Performed in the DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, USA). The same technique is used to screen for heteroplasmy of skin tumor mtDNA.
[0156]
Using the back-to-back primer method as described in Example 2, the pattern of DNA length mutations (ie tandem duplication) in the highly variable portion of the non-coding region (NCR) is rapidly To be screened.
[0157]
Example 4: Deletion spectrum of all mitochondrial genomes in human NMSC and its precursor lesions
MtDNA damage in squamous cell carcinoma (SCCS), basal cell carcinoma (BCCS), and presumed precursor damage such as Bowen's disease and actinic keratosis from different parts of the body exposed to the sun It was compared with the next skin collected. The long PCR technique (LX-PCR) (Ray et al. (1998)) was used to amplify all mitochondrial genomes and determine all deletion spectra of mtDNA. Innumerable specific deletions were observed to occur in all mitochondrial genomes. However, not all deletions correlate with non-melanoma skin cancer, but for accurate diagnostic methods, deletions associated with disease must be known.
[0158]
DNA is extracted using a commercially available kit (Qiangen) according to the recommendations of the producer. All mitochondrial genomes are expanded TM Long Template PCR Systems^TM (Boehringer Manheim, Switzerland) and amplified in two separate reactions. The PCR primers used are those described by Kleinle et al. (1997) covering the following regions of the Cambridge sequence (Andrews et al. (1999)). That is, DIA (nucleotide (nt) 336-363), DIB (nt 282-255), OLA (nt 5756-5781), and OLB (nt 5745-5781). These large products eliminate the amplification of nuclear pseudogenes. Primer sequences are as follows.
DIAF: (336-363) 5 'AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3'
OLBR: (5745-5721) 5 'CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3'
OLAF: (5756-5781) 5 'GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3'
DIBR: (282-255) 5 'ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3'
[0159]
Amplification consists of 16 pmol of each primer, 500 μmol dNTP, 22.5 Mm MgCl.₂And 10 × PCR buffer containing detergent (kit), 0.75 μl enzyme (3.5 × 10³Unit / ml) and 50 microliters of reaction containing 50-200 ng of total DNA. One reaction produces a 11,095 bp portion of the genome and the other results in a length of 5,409 bp (eg Kleinle et al. (1997)). PCR amplification conditions consisted of a denaturation step at 93 ° C. for 1 minute 30 seconds followed by 10 cycles of 93 ° C. 30 seconds, 60 ° C. 30 seconds and 68 ° C. 12 minutes, followed by 20 of the same temperature change. Cycle, each cycle plus an extension time of 5 seconds. And there is a final cycle of 93 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds and 68 ° C 26 minutes. To ensure reproducibility, a known amount of DNA has been separated on a 1% agarose gel and only samples with at least the same amount of DNA are included in the analysis.
[0160]
As shown in Table 2, on average, a larger number of deletions are found with increasing time of UV exposure in tumor samples.
[Table 2]

[0161]
Example 5: Aging and mtDNA
In order to finally clarify the nucleotide base pair sequence for its specific molecule and possible temporal changes, all sequences of mtDNA extracted from a given tissue are compared with temporal maternal comparisons (ie, great-grandchildren). From the grandparents) to be determined quickly and accurately. These characterizations are compared with health status and aging indicators among unique maternals in a large population. This combined information provides an important statistical distinction between distinct causes that will result in the same mutation / deletion, and the mtDNA sequence used as a biomarker establishes its effectiveness. It proves that it has the required specificity index and sensitivity. Also, base pair deletion and mutation ratios are compared in various tissues over the four maternal generations for consistency. Recent developments in methodology have enabled the detection of base pair deletions that affect aging in blood samples (Bassam et al. (1991)), and blood samples have been used instead of skeletal muscle to study mtDNA. Increased the possibility that it may be done (Von Wurmb et al. (1998)). After establishing the effectiveness of employing leukocytes instead of muscle tissue as a representative example of mtDNA deletion and / or mutation, the next step is only to evaluate mtDNA in leukocytes. The mtDNA deletion / mutation is then determined as previously described.
[0162]
Skeletal muscle or leukocytes were collected from patients. DNA was extracted as performed in Example 1. The following primers were used.
12ST1: (1257-1279) 5 'TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3'
12ST2: (1433-1411) 5 'TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3'
D1F: 5 'CCTTACACTATTCCTCATCACC 3'
D1R: 5 'TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3'
[0163]
Amplification is 50 microliters containing 2.0 μmol of each primer, 250 μmol of dNTP, 10 × PCR buffer (Thermopol Reaction Buffer), bovine serum albumin, 0.5 units of Deep vent polymerase, and 50-200 ng of total DNA. Was carried out in the reaction solution. PCR amplification conditions consisted of a denaturation step (hot start) at 95 ° C for 5 minutes followed by 30 cycles of 72 ° C for 30 seconds with a final extension of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 60 seconds, 72 ° C for 10 minutes. It is composed of Gel electrophoresis was performed on a 2% agarose gel at 125 volts for 60 minutes. They were then stained with ethidium bromide and visualized under UV light. In order to ensure reproductivity, a known amount of DNA has been separated on a 2% agarose gel and only samples with the same amount of DNA are included in the analysis.
[0164]
Example 6: Quantitative detection of 4977 bp common mtDNA deletion by 3-primer PCR
Where appropriate, by 3-primer PCR to detect levels higher than 1-5% or lower than 1% 10^-4The occurrence of common deletions is determined quantitatively by dilution PCR, which detects levels up to% (see Example 7). Samples were taken and DNA was extracted as previously described in Example 1. A 3-primer PCR method is used to simultaneously detect and quantify the ratio of both deleted mtDNA and wild type (wt) mtDNA in a DNA sample (as previously described in Birch-Machin et al. (1998)). like). Primers A and C correspond to heavy chain positions 13720-13705 and 9028-9008, respectively (Anderson et al. (1981)), and primer B corresponds to light chain positions 8273-8289. Primer C is located in the mtDNA region within the common deletion and primers A and B are located on the sides of the deletion region. Thus, primers B and C only amplify wt-mtDNA, and primers A and B only amplify the deleted mtDNA (about 5.5 kb, the distance between the two primers without deletion). Is too long to amplify under our PCR conditions, as described below).
[0165]
The use of three primers allowed simultaneous detection of two bands, a long band corresponding to wt-mtDNA (755 bp) and a short band corresponding to the deleted mtDNA in the “common deletion” (470 bp). The PCR reaction mixture (total volume 25 μl) was prepared with a total volume of 100 ng cellular DNA, 200 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCL (pH 8.8), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl.₂0.1% Triton X-100, 2.5 U Taq DNA polymerase (BioTaq, BiolineUK Limited, London), 25 pmol primer A, B, 6.25 pmol primer C, and 3 μCi of [α-³²P] -dATP. The PCR conditions were 25 cycles of 72 ° C. for 2 minutes with a final extension of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 15 minutes. These PCR products were then electrophoresed using 6% non-denaturing polyacrylamide gels. And the radioactive PCR fragment is imageQuant^TMQuantified by analysis using software (Molecule Dynamics, Chesham UK).
[0166]
Example 7: Serial dilution PCR method for quantitative detection of low level (<1%) common mtDNA deletion
A semi-quantitative PCR method (Corral-Debrinski et al. (1991)) is used to assess the proportion of common deletions in all mtDNA extracted from tissue / cell samples. A biological sample was taken and DNA was extracted as shown in Example 1. The DNA sample was first linearized over 90 minutes at 37 ° C. using the restriction enzyme Bam HI (1 μl enzyme and 1 μl buffer supplied for industry). Serial dilutions were performed in 2x steps (for complete mtDNA with 10x dilution at first). And PCR was performed about each dilution liquid (1 microliter) using the following primers.
Primer for complete mtDNA
L3108 (nt3108-3127)
H3717 (nt3717-3701)
Primer for common deletion
L8282 (nt8282-8305)
H13851 (ntl3851-13832)
[0167]
The reaction conditions are as follows.
94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 45 seconds, 51 ° C for 30 seconds (complete mtDNA), 56 ° C for 30 seconds (common deletion) and 72 ° C for 1 minute for 34 cycles, and finally 72 ° C for 8 minutes for 1 cycle. All PCR reactions were performed in the following mixture (50 μl). 1 μl sample DNA, 0.6 μM forward primer, 0.6 μM reverse primer, 0.2 mM dNTP, 5 μl GeneAmp^R 10x PCR buffer (Perkin Elmer), 0.2 μl Amplitaq^RDNA polymerase (Perkin Elmer), 35.75 μl of 2 × sterile distilled water autoclaved.
[0168]
Following electrophoresis, the PCR product is visualized with a UV illuminator (TMW-20, Flowgen Ltd., Lichfield, UK) and the image capture measure (Flowgen LTD., Lichfield, UK supplied Alpha A digital image of the gel was obtained using Imager 2000, Alpha Innotech Corporation,). The related image analysis software (Alpha Ease v3.3, Alpha Innotech Corp.) allowed the calculation of unified optical density (IOD) for each PCR product in direct dilution. Bands with zero IOD values were obtained for both complete and deleted mtDNA. The corresponding dilution value is used to calculate the proportion of common deletions in the sample as follows.
Common deletion (%) = [total mtDNA dilution factor^{( IOD Zero )}x 100] / [Common deletion dilution factor^{( IOD Zero )}]
[0169]
Example 8: Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)
A sample was taken and DNA was extracted as in Example 1. PCR was performed on 13 overlapping fragments by using two different PCR conditions described by Van den Bosch et al. (2000). The following are three mtDNA specific primer pairs for PCR.
i. Oligo sequence
Mt3118F CCCTGTACGAAAGGACAAGAG
Mt3334R TGAGGAGTAGGAGGTTGG
Mt8207F CCCATCGTCCTAGAATTAATTCC
Mt8400R ATGGTGGGCCATACGGTAG
Mt14427F CCCATGCCTCAGGATACTCCTC
Mt14997R GCGTGAAGGTAGCGGATG
[0170]
The 1-2 kb PCR product was digested into 90-600 bp fragments and digested at the optimal melting temperature. Mutations are represented by two peaks, and a low ratio of mutations, such as lower than 2% heteroplasmy, is represented by the “shoulder” of the peak.
[0171]
DHPLC is performed with a fluid phase consisting of two eluents (pH 7.0). Buffer A contains triethylammonium acetate (TEAA), which interacts with both negatively charged phosphate groups on the DNA and the column surface. Buffer B contains TEAA with 25% denaturant acetonitrile. Fragments eluted with a first order gradient of acetonitrile at a constant flow rate. Increasing the concentration of acetonitrile denatures the fragments. Table 3 below shows an example of a standard method for DHPLC of PCR reactions generated using WAVEMAKER software (Transgenomics) according to the manufacturer's instructions.
[Table 3]

[0172]
The temperature of successful decomposition in various heteroduplexes is detailed below and can be replaced by the relevant positions in Table 2.
Fragment melting temperature (° C) Concentration gradient of buffer B (%)
Mt3118F 59 51-59
Mt8207F 58 50-58
Mt14427F 56 60-68
[0173]
References
Anderson S, et al., Nature 290: 457-464, 1981.
[0174]
Andrews RM, et al., Nature Genetics 23 (2): 147, 1999.
[0175]
Barringer, et al., Gene 89: 117, 1990.
[0176]
Bassam BJ, Caetano-Anolles PM, Gresshoff PM., Anal. Biochem. 196: 80-83, 1991.
[0177]
Berneburg M, et al., J. Biol. Chem. 274 (22): 1 5345-15349, 1999.
[0178]
Berthon P, Valeri A, Cohen-Akeninc A, Drelon E, Paiss T, Wohr G, Latil A et al., Am. J. Hum. Genet., 62: 1416-1424, 1998.
[0179]
Birch-Machin MA, et al., Methods in Toxicology, Volume 2, 51-69, 1993.
[0180]
Birch-Machin MA, et al., J. Invest. Dermatol., 110: 149-152, 1998.
[0181]
Birch-Machin MA, Online Conference Report (Sunburnt DNA), International Society of Biochemistry and Molecular Biology. New Scientist, 2000 (a).
[0182]
Birch-Machin MA, Taylor RW, Cochran B, Ackrell BAC, Tumbull DM. Ann Neurol 48: 330-335, 2000 (b).
[0183]
Birch-Machin MA, Clin. Exp. Dermatol ,. 25 (2), 141-146, 2000 (c).
[0184]
Birch-Machin MA and Krishnan K. Mitochondrion, 1, p45 (2001).
[0185]
Birch-Machin MA, Lindsey J. Lusher M and Krishnan K. Mitochondrion, 1 Suppl. 1, S30 (2001).
[0186]
Bogliolo M, et al., Mutagenesis, 14: 77-82, 1999.
[0187]
Brierley EJ, Johnson MA, Lightowlers RN, James O, Turnbull DM., Ann Neurol 43 (2): 217-223, 1998.
[0188]
Brockington, et al., Nature Genet 4: 67-71, 1993.
[0189]
Brown M.D., et al., Am J. Humn Genet, 60: 381-387, 1997.
[0190]
Brumley R.L. Jr. and Smith L.M., 1991, fast DNA sequencing by horizontal ultra-thin gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 19: 4121-4126.
[0191]
Buttyan R, Sawczuk IS, Benson MC, Siegal JD, Olsson CA., Prostate 11: 327-337, 1987.
[0192]
Byrne E., Curr Opin Reumatol 4 (6): 784-793, 1992.
[0193]
Cairns P, Okami K, Halachmi S, Halachmi N, Esteller M, Herman JG, Jen J et al., Cancer Res 57: 4997-5000, 1997.
[0194]
Chee M, et al., Science 274: 610-614, 1996.
[0195]
Chinnery PF, Howel N, Turnbull DM., J. Med. Genet. 36: 425-436, 1999.
[0196]
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1): 17-21, 1999.
[0197]
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1): 17-21, 2000.
[0198]
Chollat-Traquet C, Tobacco or health: a WHO program., Eur J Cancer, 28 (2-3): 311-315, 1992.
[0199]
Chomyn A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (10): 4221-4225, 1992.
[0200]
Cohen D, Barton G, The cost to society of smoking cessation., Thorax. 53 (2): S38-42, 1998.
[0201]
Corral-Debrinski et al., Mutat Res, 275: 169-180, 1991.
[0202]
Cortopassi G.A. and Arnheim H., Detection of specific midchondria DNA deletion in aged human tissues. Nucleic Acids Tes. 18, 6927-6933, 1990.
[0203]
Cortopassi G, Wang E., Biochim Biophys Acta 1271 (1): 171-176, 1995.
[0204]
Croteau DL, Stierum RH, Bohr VA, Mutat Res 434 (3): 137-148, 1999.
[0205]
Current protocol of molecular biology.
[0206]
Davis RM, Boyd GM, Schoenborn CA, “general courtesy” and elimination of passive smoking. Results of the 1987 National Health Interview Survey. JAMA 263 (16): 2208-10, 1990.
[0207]
Dong JT, Isaacs WB, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaaca JT, Barrett JC., Science 268: 884-886, 1995.
[0208]
Driezen P, Brown KS., Searchable database of questionnaire items from populations surveys of tobacco use in Canada: A summary report to the Ontario Tobacco Research Unit (Toronto, Ontario), 1999.
[0209]
Easton RD, Merriwether AD, Crews DE, and Ferrell RE., Am. J. Hum. Genet. 59: 202-212, 1996.
[0210]
Fahn H, Wang L, Hseith R, Chang S, Kao S, Huang M, and Wei Y. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine, 154: 1141-1145, 1996.
[0211]
Fahn HJ, Wang LS, Kao SH, Chang SC, Huang MH, Wei YH., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 19 (6): 901-9, 1998.
[0212]
Finegold D., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide.Psy-Ed. Corp D / B / A Exceptional Parents Guide: 12, 1997.
[0213]
Flanagan N, Birch-Machin MA, Rees JL., Hum Mol Genet 9 (17): 2531-2537, 2000.
[0214]
Flanagan N, Ray AJ, Todd C, Birch-Machin MA and Rees JL., J Invest. Dermatol (2001) 117 (5) 1314-1317.
[0215]
Fliss MS, et al. Science 287: 2017-2019, 2000.
[0216]
Gattermann N, Berneburg M, Heinisch J, Aul C, Schneider W., Leukemia 9 (10): 1704-10, 1995.
[0217]
Green R, Reed JC., Science 281 (5381): 1309-1312, 1998.
[0218]
Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1874, 1990.
[0219]
Gulavita, Sunil Dr. Northwestern Ontario Cancer Center-Personal Communication.
[0220]
Habano S, Nakamura, Sugai T., Oncogene 17 (15): 1931-1937, 1998.
[0221]
Harding RM, et al., Am. J. Hum. Genet. 66, 1351-1361, 2000.
[0222]
Harman D., Proc Nati Acad Sci USA 78 (11): 7124-8, 1981.
[0223]
Hattori et al., Age-dependent increase in deleted midchondria DNA in the human heart: possible contributory factor to presbycardia, AM. Heart J., 121, 1735-1742, 1991.
[0224]
Hayashi J, Ohta S, Kikuchi A, Takemitsu M, Goto Y, Nonaka I., Proc Natl Acad Sci USA 88 (23): 10614-10618, 1991.
[0225]
Hayward SW, Grossfeld GD, Tlsty TD, Cunha GR., Int J Oncol 13: 35-47, 1998.
[0226]
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL. Chapter 1 1. Human melanocortin 1 receptor gene. In the Melanocortin Receptors (Cone RD (ed)). Humana Press Inc. New Jersey, USA, 1999.
[0227]
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL., Lancet 355, 1072-1073, 2000.
[0228]
Hearst N, Hulley SB.Using secondary data, In Designing clinical research: an epidemiological approach.Ed. Hulley S. and Cummings S., Baltimore: Williams & Wilkins, pages 53-62, 1988.
[0229]
Hopgood R., et al., 1992, Automated human mtDNA sequencing method directly from PCR samples. Biotechniques 13: 82-92.
[0230]
Hsieh RH and Wei YH, age-dependent multiple deletions in human muscle mitochondrial DNA. in preparation 1992.
[0231]
Huang GM, Ng WL, Farkas J, He L, Liang HA, Gordon D, Hood R., Genomics 59 (2): 178-86, 1999.
[0232]
http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html
[0233]
Ikebe et al., Increased deletion of mitochondrial DNA at striatum in Parkinson's disease and aging. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 1044-1048, 1990.
[0234]
Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press Inc. San Diego, 1990.
[0235]
Kaiserman MJ, Chronic Dis Can 18 (1): 13-9, 1997.
[0236]
Kalra J, Chaudhary AK, Prasad K., Int. J. Exp. Pathol. 72 (1): 1-7, 1991.
[0237]
Katayama et al., Deletion mitochondrial DNA in skeletal muscle of aged humans. Biochem. Int., 25, 47-56, 1991.
[0238]
Kleinle S, et al., Human Genet. 290: 457-465, 1997.
[0239]
Konishi N, Cho M, Yamamoto K, Hiasa Y. Pathol. Int. 47: 735-747, 1997.
[0240]
Krishnan K and Birch-Machin MA.British Journal of Dermatology (2002), 146,723.
[0241]
Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 1173, 1989.
[0242]
Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer J. Clin. 49: 8-31.
[0243]
Landis, SH, et al., CA Cancer J. Clin. 49: 8-31, 1999.
[0244]
Landegren et al., Science, 241: 1077, 1988.
[0245]
LeDoux SP, et al., Mutat Res 434 (3): 149-159, 1999.
[0246]
Lee HC, et al., FEBS Letters 354: 79-83, 1994.
[0247]
Lee HC, Lu CY, Fahn HJ, Wei YH. Federation of European Biochemical Societies, 441: 292-296, 1998.
[0248]
Lee HC, et al., Arch. Biochem. Biophys. 362 (2): 309-16, 1999.
[0249]
Leonard & Shapira 1997.
[0250]
Lindsey J, Lusher M, Krishnan KJ and Birch-Machin MA., British Journal of Dermatology (2001), 144,655.
[0251]
Li Y, et al., In: Oxygen Radicals and the Disease Process, Amsterdam, The Netherlands: Harwood Academic Publishers, 237-277, 1997.
[0252]
Linnane et al., 1990.
[0253]
Liu CS, Kao SH, Wei YH. Environ. Mol. Mutagen 30 (1): 47-55, 1997.
[0254]
Lowes S, Krishnan K, Lindsey J, Lusher M and Brich-Machin MA.British Journal of Dermatology (2002), 146,736.
[0255]
Luckey J. A., et al., 1993, High-speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis. Methods Enzymol. 218: 154-172.
[0256]
McCormack, Douglas. Website: http://cormactech.com/dna, 2001.
[0257]
Meibner C, von Wurmb N, Oehmichen M., Int. J. Legal Med. 110: 288-291, 1997.
[0258]
Michikawa Y, Mazzucchelli F, Bresolin N, Scarlato G, Attardi G., Science, 286: 774-779, 1999.
[0259]
Miquel J, de Juan E, Sevila I. EXS 62: 47-57, 1992.
[0260]
MITOMAP: A human mt genome database (www.gen.emory.edu/mitomap.html).
[0261]
Mullis and Faloona Methods Enzymol 155, 335, 1987.
[0262]
Nachman MW, Brown WM, Stoneking M, Aquardo CF., Genetics 142: 53-963, 1996.
[0263]
National Cancer Institute of Canada, Canadian cancer statistics 2000., National Cancer Institute of Canada., Toronto, Ont. 2000.
[0264]
Naviaux RK., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide.Psy-Ed. Corp D / B / A Exceptional Parents Guide: 3-10, 1997.
[0265]
Newton CR and Graham A., Introduction to Biotecniques Series 1997.
[0266]
Oefner PJ, Underhill PA., Current protocols in human genetics 19, 7.10.1-12, 1998.
[0267]
Ozen M, et al., Prostate 36: 264-271, 1998.
[0268]
Pang et al., Arch. Biochem. Biophys. 312: 534-538, 1994.
[0269]
Parsons TJ, et al., Nature Genet. 15 (4): 363-368, 1997.
[0270]
Pascucci B, et al., J. Mol. Biol. 273 (2): 417-427, 1997.
[0271]
Penta JS, Johnson FM, Wachsman JT, Copeland WC., Mut. Res. 488, 119-133, 2001.
[0272]
Polyak Y, et al., Nature Genet. 20 (3): 291-293, 1998.
[0273]
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol. 110: 692, 1998.
[0274]
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., Brit. J. Dermatol. 140: 788, 1999.
[0275]
Ray AJ, Pickersgill L, Turner R, Nikaido O, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol 115 (4): 674-679, 2000.
[0276]
Rees JL, Skin cancer.In: The Genetic Basis of Human Cancer, eds Vogelstein B, Kinzler K. New York: McGraw-Hill, pp527-536, 1998.
[0277]
Rehman I, Quinn AJ, Healy E, Rees JL. Lancet 344: 788-789, 1994.
[0278]
Rehman I, Takata M, Wu YY, Rees JL. Oncogene 12: 2483-2490, 1996.
[0279]
SAS Enterprise Mining Users Guide, SAS Inc., 2000.
[0280]
Sawyer E, Van Houten B., Mutation Res. 434 (3): 161-176, 1999.
[0281]
Schurr TG, Ballinger SW, Gan Y, Hodge JA, Merriwether DA, Lawrence DN, Knowler WC, Weiss KM, and Wallace DC., Am. J. Hum. Genet. 46: 613-623, 1990.
[0282]
Seidman M.D. et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 123: 1039-1045, 1997.
[0283]
Shankey TV, Jin JK, Dougherty S, Flanigan RC, Graham S, Pyle JM., Cytometry 21: 30-39, 1995.
[0284]
Shay JW, Werbin H., Mutat.Res: 186: 149, 1987.
[0285]
Sherrat EJ, Thomas AW, Alcolado JC., Clin. Sci. 92: 225-235, 1997.
[0286]
Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang C, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Reckford CL, and Wallace DC., Genomics 17: 171-184, 1993.
[0287]
Smith DG, Malhi RS, Eshleman J, Lorenz JG and Kaestle FA., Am. J. Hum. Genet. 110: 271-284, 1999.
[0288]
Smith R, Birch-Machin MA, Rees JL. J. Invest. Dermatol. 111: 101-104, 1998.
[0289]
SpringNet-CE Connection: Screening, Diagnosis: Improving Primary Care Outcomes. Website: http://www.springnet.com/ce/j803a.htm.
[0290]
Stone AC and Stoneking M. Amer. J., Phys. Anthro. 92 (4): 463-471, 1993.
[0291]
Tamura S, et al., Eur. J. Cancer [A] 35 (2): 316-319, 1999.
[0292]
Tanaka M. et al., 1996, Automated sequencing of mtDNA. Methods Enzymol. 264: 407-421.
[0293]
Taniike M. et al., BioChem BioPhys Res Comun, 186: 47-53, 1992.
[0294]
Taylor RW, Birch-Machin MA, Bartlett K, Turnbull DM., J Biol Chem, 269, 3523-3528, 1994.
[0295]
Tijssen, P. (ed) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Polynucleotide Probes, Elsevier, N.Y., 1993.
[0296]
Tori et al., Aging-related deletion of human diaphragm mitochondrial DNA. AM. J. Respir. Cel. L Mol. Biol. In press, 1992.
[0297]
Van De Graff KM, Fox SI., Concepts of Human Anatomy and Physiology., Dubuque: WM.C. Brown Publishers, 1995.
[0298]
Van den Bosch BJC, et al., Nucleic Acids Res. 28:89, 2000.
[0299]
von Wurmb N, Oehmichen, M, Meissner, C., Mutat Res. 422: 247-254, 1998.
[0300]
Wallace DC., Annu Rev Biochem, 61: 1175-1212, 1992.
[0301]
Wallace DC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8739-8746, 1994.
[0302]
Wald and Wallace, D.C., human and mouse mitochondrial disease. Science, 5 (283): 1482-1497, 1999.
[0303]
Wald NJ, Hackshaw, AK, Cigarette Smoking: An Epidemiological Overview. Br Med Bull. 52 (1): 3-11, 1996.
[0304]
Wallace et al., Mutation in mitochondrial DNA associated with Leber hereditary optic neuropathy. Science, 1427-1429.
[0305]
Walsh PC, Partin AW. Cancer 80: 1871-1874, 1997.
[0306]
Ward RH, Frazier BL, Dew-Jager K, Paabo S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8720-8724, 1991.
[0307]
Ward 1993.
[0308]
Wei YH, Pang C, You B, Lee H. Ann. NY Acad. Sci. 786: 82-101, 1996.
[0309]
Wei YH. Proceedings of the Nat. Sci. Council of the Republic of China April 22 (2): 5567, 1998.
[0310]
Weinstock MA: In: JJ Stern RS, MacKie RM and Weinstock MA, Grob (eds) Epidemiology, Blackwell (UK) .pp121-128, 1998.
[0311]
Woodwell DA. National Ambulatory Medical Care Survey: 1997 Summary. Advance data from vital and health statistics; no. 305. Hyattsville, Maryland: National Center for Health Statistics. 1999.
[0312]
Wu & Wallace Genomics, 4: 560, 1989.
[0313]
Xu J, et al., Nature Genet 20: 175-179, 1998.
[0314]
Yamaguchi KT, et al., Free Radical Res. Commun. 16 (3): 167-74, 1992.
[0315]
Yeh J.J., et al., Oncogene Journal, 19: 2060-2066, 2000.
[0316]
Yen et al., A 5 kb deletion of human liver mitochondrial DNA associated with aging. Biochem., Biophys., Res. Commun., 178, 124-131, 1991.
[0317]
Yen et al., 6kb deletion of human liver mitochondrial DNA associated with aging. Biochem. Int. 26, 457-468, 1992.
[0318]
Zeviani M, et al., Am. J. Hum. Genet. 47: 904-914, 1990.
[0319]
Zhang et al., Multiple mitochondrial DNA deletions in aged humans. FEBS Lett, 297, 34-38, 1992.
[0320]
Zhang C., et al., BioChem. BioPhys. Res. Comun., 195: 1104-1110, 1993.

Claims (72)

A method for detecting the occurrence or progression of a disease in a subject containing mtDNA,
a) obtaining a biological sample from a subject;
b) removing DNA from the biological sample;
c) detecting the presence of the mutation in the mtDNA;
d) comparing the mtDNA of the biological sample with a database;
The database contains mutation data associated with disease-free mitochondrial DNA sequences and disease-associated mitochondrial genome data;
A method characterized by that. The method of claim 1, comprising:
Detecting the presence of the mutation comprises
a) determining the sequence of mtDNA;
b) amplifying mtDNA by PCR;
c) Southern, Northern, Western and Southwestern blot hybridization steps;
d) denaturing the HPLC;
e) hybridizing to a microarray, gene chip or biochip;
f) molecular marker analysis;
g) any combination of a) to f);
Selected from the group consisting of
A method characterized by that. The method of claim 2, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has a specific region of the mitochondrial genome in which known biomarkers associated with disease are located,
A method characterized by that. The method of claim 2, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has the entire mitochondrial genome,
A method characterized by that. The method of claim 1, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of being a potential site of disease,
A method characterized by that. The method of claim 1, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of having metastasized,
A method characterized by that. In claim 1,
The disease is selected from the group of prostate cancer and non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 7,
The disease is prostate cancer,
A method characterized by that. In claim 7,
The disease is non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 1,
The mutation is selected from the group of single base pair mutations, deletions, insertions and transversions,
A method characterized by that. In claim 1,
The mutation is homoplasmy,
A method characterized by that. In claim 1,
The mutation is at any level of heteroplasmy,
A method characterized by that. In claim 1,
Biological samples are blood, saliva, cheek cells, prostate fluid, saliva, sweat, PAP cervical tissue, urine, skin cells, bones, hair, lymphatic tissue, cervical smear, milk aspirate, vaginal discharge, semen Selected from the group consisting of menstrual fluid or biopsy tissue,
A method characterized by that. In any of claims 1 to 13,
The database has at least a significant number of mitochondrial DNA sequences, and the mitochondrial DNA sequences are obtained from both maternal and non-maternal samples;
A method characterized by that. A method for detecting the presence of a disease in a subject containing mtDNA,
a) obtaining a biological sample from a subject;
b) removing DNA from the biological sample;
c) detecting the presence of the mutation in the mtDNA;
d) comparing the mtDNA of the biological sample with a database;
The database contains mutation data associated with disease-free mitochondrial DNA sequences and disease-associated mitochondrial genome data;
A method characterized by that. The method of claim 15, comprising:
Detecting the presence of the mutation comprises
a) determining the sequence of mtDNA;
b) amplifying mtDNA by PCR;
c) Southern, Northern, Western and Southwestern blot hybridization steps;
d) denaturing the HPLC;
e) hybridizing to a microarray, gene chip or biochip;
f) molecular marker analysis;
g) any combination of a) to f);
Selected from the group consisting of
A method characterized by that. The method of claim 16, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has a specific region of the mitochondrial genome in which known biomarkers associated with disease are located,
A method characterized by that. The method of claim 16, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has the entire mitochondrial genome,
A method characterized by that. The method of claim 15, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of being a potential site of disease,
A method characterized by that. The method of claim 15, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of having metastasized,
A method characterized by that. In claim 15,
The disease is selected from the group of prostate cancer and non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 21,
The disease is prostate cancer,
A method characterized by that. In claim 21,
The disease is non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 15,
The mutation is selected from the group of single base pair mutations, deletions, insertions and transversions,
A method characterized by that. In claim 15,
The mutation is homoplasmy,
A method characterized by that. In claim 15,
The mutation is at any level of heteroplasmy,
A method characterized by that. In claim 15,
Biological samples are blood, saliva, cheek cells, prostate fluid, saliva, sweat, PAP cervical tissue, urine, skin cells, bones, hair, lymphatic tissue, cervical smear, milk aspirate, vaginal discharge, semen Selected from the group consisting of menstrual fluid or biopsy tissue,
A method characterized by that. In any of claims 15 to 27,
The database has at least a significant number of mitochondrial DNA sequences, and the mitochondrial DNA sequences are obtained from both maternal and non-maternal samples;
A method characterized by that. A method for determining a predisposition to illness or dysfunction indicated by a mutation in a mitochondrial DNA sequence comprising:
a) obtaining a biological sample from a subject;
b) removing DNA from the biological sample;
c) detecting the presence of the mutation in the mtDNA;
d) comparing the mtDNA of the biological sample with a database;
The database contains mutation data associated with disease-free mitochondrial DNA sequences and disease-associated mitochondrial genome data;
A method characterized by that. 30. The method of claim 29, comprising:
Detecting the presence of the mutation comprises
a) determining the sequence of mtDNA;
b) amplifying mtDNA by PCR;
c) Southern, Northern, Western and Southwestern blot hybridization steps;
d) denaturing the HPLC;
e) hybridizing to a microarray, gene chip or biochip;
f) molecular marker analysis;
g) any combination of a) to f);
Selected from the group consisting of
A method characterized by that. 32. The method of claim 30, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has a specific region of the mitochondrial genome in which known biomarkers associated with disease are located,
A method characterized by that. 32. The method of claim 30, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has the entire mitochondrial genome,
A method characterized by that. 30. The method of claim 29, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of being a potential site of disease,
A method characterized by that. 30. The method of claim 29, comprising:
The biological sample is from a tissue suspected of having metastasized,
A method characterized by that. In claim 29,
The disease is selected from the group of prostate cancer and non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 35,
The disease is prostate cancer,
A method characterized by that. In claim 35,
The disease is non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 29,
The mutation is selected from the group of single base pair mutations, deletions, insertions and transversions,
A method characterized by that. In claim 29,
The mutation is homoplasmy,
A method characterized by that. In claim 29,
The mutation is at any level of heteroplasmy,
A method characterized by that. In claim 29,
Biological samples are blood, saliva, cheek cells, saliva, prostate fluid, sweat, milk aspirate, cage, semen, PAP cervical tissue, urine, skin cells, bone, hair, lymphoid tissue, cage, Selected from the group consisting of cervical smear or biopsy tissue,
A method characterized by that. In any of claims 29 to 41,
The database has at least a significant number of mitochondrial DNA sequences, and the mitochondrial DNA sequences are obtained from both maternal and non-maternal samples;
A method characterized by that. A method for assessing the progress of aging in a human specimen,
a) obtaining a biological sample from a human specimen;
b) removing DNA from the biological sample;
c) detecting the presence of the mutation in the mtDNA;
d) comparing the mtDNA of the biological sample with a database;
The database contains mutation data associated with disease-free mitochondrial DNA sequences and disease-associated mitochondrial genome data;
A method characterized by that. 44. The method of claim 43, comprising:
Detecting the presence of the mutation comprises
a) determining the sequence of mtDNA;
b) amplifying mtDNA by PCR;
c) Southern, Northern, Western and Southwestern blot hybridization steps;
d) denaturing the HPLC;
e) hybridizing to a microarray, gene chip or biochip;
f) molecular marker analysis;
g) any combination of a) to f);
Selected from the group consisting of
A method characterized by that. 44. The method of claim 43, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has a specific region of the mitochondrial genome in which known biomarkers associated with disease are located,
A method characterized by that. 44. The method of claim 43, comprising:
The mitochondrial DNA to be sequenced has the entire mitochondrial genome,
A method characterized by that. In claim 43,
The mutation is selected from the group of single base pair mutations, deletions, insertions and transversions,
A method characterized by that. In claim 43,
The mutation is homoplasmy,
A method characterized by that. In claim 43,
The mutation is at any level of heteroplasmy,
A method characterized by that. In claim 43,
Biological samples are blood, saliva, cheek cells, saliva, prostate fluid, sweat, PAP cervical tissue, urine, skin cells, bone, hair, lymphatic tissue, cervical smear, cage, milk aspirate, semen Selected from the group consisting of menstrual fluid or biopsy tissue,
A method characterized by that. In any of claims 43-50,
The database has at least a significant number of mitochondrial DNA sequences, and the mitochondrial DNA sequences are obtained from both maternal and non-maternal samples;
A method characterized by that. A database having a plurality of human mitochondrial DNA sequences,
The mitochondrial DNA sequence is selected from the group consisting of a normal regulatory sequence associated with a disease free state and a sequence associated with the presence of a disease or a sequence indicative of a disease predisposition;
A database characterized by that. In claim 52,
The disease is selected from the group of prostate cancer and non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 52,
Mitochondrial DNA sequences are associated with the aging process of human specimens,
A method characterized by that. In claim 53 or 54,
The database has a significant number of mitochondrial DNA sequences, and the mitochondrial DNA sequences are obtained from both maternal and non-maternal samples;
A method characterized by that. A kit for diagnosing a disease,
A disposable chip, a microarray, means for holding the disposable chip, means for extracting mitochondrial DNA, and means for accessing a database of mitochondrial DNA sequences;
Kit for diagnosing disease. A kit for determining the predisposition of a disease,
A disposable chip, a microarray, means for holding the disposable chip, means for extracting mitochondrial DNA, and means for accessing a database of mitochondrial DNA sequences;
A kit for determining disease predisposition. An array having a plurality of nucleic acid elements and a solid substrate,
Each nucleic acid element indicates the presence of a disease and is selected from the group consisting of mitochondrial DNA and RNA transcribed from mitochondrial DNA, each nucleic acid element has a unique position on the array, Stably bonded,
An array characterized by that. In claim 58,
Each nucleic acid element indicates prostate cancer,
An array characterized by that. In claim 58,
Each nucleic acid element represents non-melanoma skin cancer,
An array characterized by that. An array having a plurality of nucleic acid elements and a solid substrate,
Each nucleic acid element indicates a disease predisposition and is selected from the group consisting of mitochondrial DNA, RNA transcribed from mitochondrial DNA, and cDNA, each nucleic acid element has a unique position on the array, and is a solid substrate Meeting stably
An array characterized by that. In claim 58,
Each nucleic acid element indicates a predisposition to the disease,
An array characterized by that. In claim 58,
Each nucleic acid element is associated with the aging process,
An array characterized by that. A method of diagnosing a patient's disease,
A step of hybridizing a nucleic acid sample obtained from mitochondrial DNA to an array having a solid substrate and a plurality of nucleic acid elements, each nucleic acid element indicating the presence of a disease, and each nucleic acid element having a unique position Hybridization of a nucleic acid sample to one or more nucleic acid elements that are stably bound to a solid substrate and having an array indicates the presence of a disease;
A method characterized by that. In claim 64,
The disease is prostate cancer,
A method characterized by that. In claim 65,
Further comprising separating the prostate fluid sample from the patient;
A method characterized by that. In claim 65,
Further comprising preparing a nucleic acid sample from the prostatic fluid sample,
A method characterized by that. A method of diagnosing non-melanoma skin cancer in a patient,
A step of hybridizing a nucleic acid sample obtained from mitochondrial DNA to an array having a solid substrate and a plurality of nucleic acid elements, each nucleic acid element indicating non-melanoma skin cancer, each nucleic acid element having a unique position And hybridization of the nucleic acid sample to one or more nucleic acid elements having an array, indicating the presence of non-melanoma skin cancer,
A method characterized by that. In claim 68,
Further comprising separating the skin sample from the patient,
A method characterized by that. In claim 69,
Further comprising preparing a nucleic acid sample from the skin sample,
A method characterized by that. A method for detecting heteroplasmy in a subject containing mtDNA,
a) obtaining a biological sample from a subject;
b) removing DNA from the biological sample;
c) denaturing the HPLC on the sample;
With a method. A method for detecting a mutation associated with a disease in a subject comprising mtDNA comprising:
a) obtaining a biological sample from a subject;
b) removing DNA from the biological sample;
c) detecting the presence of the mutation in the mtDNA;
d) comparing the mtDNA of the biological sample with a database;
The database contains variant data for a common population without disease and mitochondrial genome data associated with the disease,
A method characterized by that.