JP2005502335A - 細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質 - Google Patents

細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明の種々の実施例は、細胞増殖、分化および細胞死関連ヒトタンパク質(CGDD)および、CGDDを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の実施例はCGDDの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸、これらの核酸によってコードされる細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質群に関し、また、癌などの細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、および胎盤障害の診断、治療並びに予防におけるこれらの核酸およびタンパク質の利用に関する。本発明はまた、核酸および細胞増殖、分化および死に関連するタンパク質の発現に対する外因性化合物の作用の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの成長と発達とには、細胞分化、細胞増殖、およびアポトーシスの、空間的および時間的な調節を要する。これらのプロセスが、生殖、老化、胚形成、形態形成、器官形成、並びに組織の修復および維持を、協調的に制御する。細胞レベルでは、成長と発達との支配は、細胞が細胞分裂周期から出たり入ったりする決定に、また、細胞の、最終分化状態へのコミットメントによって成される。これらの決定は、細胞によって、細胞外シグナルと他の細胞が受け取る環境からの合図に応じて成される。以下の考察の焦点は、細胞分裂、胚形成、細胞分化および細胞増殖、並びにアポトーシスの分子機序に置かれ、また、これら機序の破壊に起因しうる癌などの病態に置かれている。
【０００３】
細胞周期
細胞分裂は、全ての生物がこれによって成長し生殖する、基本的プロセスである。酵母菌や細菌などの単細胞生物では、各細胞分裂で生物の数が2倍となる。多細胞の種では、消耗あるいはプログラム細胞死により消失した細胞を置換するために、また新たな組織や器官を作製する細胞分化のために、多数回の細胞分裂が必要とされる。 細胞周期の進行は、タンパク質複合体群の複雑な相互作用によって支配される。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接／間接的に調節する分子は、サイクリン、サイクリン依存性プロテインキナーゼ、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャー、シグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質等の複数のカテゴリーに分類される。
【０００４】
細胞分裂周期の詳細は異なりうるが、基本的なプロセスは3つの主要な現象からなる。最初の現象である間期には、細胞分裂の準備、DNAの複製、必須タンパク質の作製が含まれる。2番目の現象である有糸分裂では、核物質が分裂して細胞の両側に分離する。最終の現象である細胞質分裂は、細胞質の分配と分裂である。細胞周期移行の順序およびタイミングは、種々のチェックポイント(検問点)で正または負の調節回路によりプロセスを制御する細胞周期調節システムの制御下にある。
【０００５】
有糸分裂は間期の終了を特徴付け、また細胞質分裂の開始で終了する。有糸分裂には4つの段階があり、次の順序で発生する。すなわち、前期、中期、後期、および終期である。前期には二極性紡錘体の形成が含まれ、これは微小管と、ダイニンなどの関連タンパク質から構成されており、形成は極性分裂中心から始まる。中期の間、核物質は凝縮する。また、核物質の、紡錘体への物理的な付着を助ける動原体線維を発達させる。続いて核物質は紡錘体に沿って反対の極へ移動するが、それは後期に起こる。終期には、核物質からの紡錘体と動原体線維の消滅が含まれる。有糸分裂は、多数のタンパク質の相互作用に依存する。例えば、CENP-A、B、C等のセントロメア結合タンパク質は、動原体の形成およびアセンブリにおいて構造的役割を果たしている(Saffery, R. 他(2000) Human Mol. Gen. 9: 175-185)。
【０００６】
真核細胞周期のM期に構造的再編成が起こり、娘細胞間の細胞成分の適切な分配を確保する。間期構造の、より小さなサブユニットへの分解は一般的である。核エンベロープは小胞へ分解し、核ラミンは解離する。次にこれらラミンのリン酸化が起こり、リン酸化は終期まで維持される。終期には、核ラミナ構造が再構成される。M期リン酸化(MPP)をコードするcDNA群はU3核小体低分子リボ核タンパク質(snoRNP)の成分であり、これらcDNAは、有糸分裂が完了すると、核小体に再局在する(Westendorf, J.M. 他(1998) J. Biol. Chem. 9:437-449)。U3 snoRNP類は、RNAプロセシング諸イベントの必須メディエータである。
【０００７】
細胞プロセス（例えば有糸分裂）の調節に関わるタンパク質としては、Ser/Thrプロテインホスファターゼ1型(PP-1)を含む。PP-1類の作用は、中期-後期移行に関わる、鍵となるタンパク質群の脱リン酸化によって成される。遺伝子PP1R7は調節ポリペプチドsds22をコードし、PP1R7は少なくとも6種のスプライス変異体を持つ(Ceulemans, H. 他(1999) Eur. J. Biochem. 262:36-42)。sds22はPP-1類の触媒サブユニットの活性を調節し、有糸分裂基質類の、PP-1依存性脱リン酸化を増進する。
【０００８】
細胞周期調節タンパク質類は、細胞増殖と癌とに重要な役割を果たす。例えば、細胞周期イベントの妥当な実行とタイミングとが不全であると、染色体分配欠損をもたらすことがあり、この結果、異数性または倍数性が生じる。このゲノム不安定性は、形質転換した細胞の特徴である(Luca, F.C.及びM. Winey(1998) Mol. Biol. Cell. 9:29-46)。最近同定されたタンパク質であるmMOB1は酵母MOB1の哺乳類相同体であり、MOB1は、有糸分裂の完遂と倍数関係の維持とに必要な必須の酵母遺伝子である。哺乳類mMOB1はプロテインホスファターゼ2A (PP2A)を含むタンパク質複合体類のメンバーであり、mMOB1のリン酸化は、PP2Aによって調節されるようである(Moreno, C.S. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:24253-24260)。PP2Aは、ヒト癌の発症に関わるとされ、これには肺癌、結腸癌、および白血病を含む。
【０００９】
ＥＲＭタンパク質はアクチンフィラメントの原形質膜への架橋結合を担う。ＥＲＭタンパク質のＮ末端領域に存在するＦＥＲＭドメインは、膜内在性タンパク質の細胞質ドメインと膜自体との相互作用を調節する。4.1タンパク質ファミリの分子はアクチン細胞骨格の細胞表面糖タンパク質への連結を担う。たとえば、神経線維腫症２（ＮＦ２）腫瘍抑制因子は4.1タンパク質ファミリのメンバーである。NF2タンパク質は細胞成長の抑制に関与し、細胞の伸展、接着および移動性などの他の細胞骨格依存性機能を遅延させる (Gutmann, D.H. 他(2001) Neurobiol. Dis. 8:266-278)最近、新規な推定癌抑制遺伝子およびNF2/ERM/4.1スーパファミリのメンバーが、非小細胞肺癌細胞の成長を遅らせることが観察されている(Tran, Y.K. 他(1999) Cancer Res. 59:35-43)。
【００１０】
細胞周期の調節には、順次に相互作用する、多数のタンパク質が関わる。真核生物の細胞周期は幾つかの、高度に制御されたイベントからなり、それらイベントの正確な秩序が、DNA複製と細胞分裂との成功を保証する。細胞は、これらイベントの秩序の維持を、後期イベントを早期イベントの成功裏の完了に依存させることによって行う。この依存性は、チェックポイントと呼ばれる細胞機序によって補強される。更なる細胞周期調節タンパク質の例には、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)類を含む。HDAC類は細胞周期の調節に関与する。また、クロマチン構造を調整する。ヒトHDAC1はin vitroでヒトHus1遺伝子産物と相互作用することが知られている。この産物の分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）相同体は、G2/Mチェックポイント制御に関わると示唆されている(Cai, R.L. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:27909-27916)。 DNA損傷(G2)とDNA複製(S期)とのチェックポイントは、真核細胞をG2/M移行期に停止させる。この停止は、有糸分裂に入る前に、DNA修復またはDNA複製が起こるための時間を提供する。したがって、G2/Mチェックポイントは、DNA複製が完了し、染色体損傷が無いときにのみ、有糸分裂が起こることを保証する。分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のHus1遺伝子は細胞周期チェックポイント遺伝子であり、radファミリーの遺伝子(例えばrad1およびrad9)も同様である(Volkmer, E. および Karnitz, L.M. (1999) J. Biol. Chem. 274:567-570; Kostrub C.F. 他 (1998) EMBO J. 17:2055-2066)。これら遺伝子は有糸分裂チェックポイントに関わる。また、DNA損傷または複製の遮断のいずれかによってこれらの遺伝子が誘導される。DNA損傷または複製遮断の誘発は、Hus1遺伝子の機能の喪失と、続いての細胞死とをもたらす。大多数のrad遺伝子のヒト相同体群が同定されており、これにはATMとATRとを含み、これらはrad3pのヒト相同体である。ATM遺伝子での突然変異群は、重度の先天性疾患である血管拡張性失調症と相関する(Savitsky, K. 他 (1995) Science 268:1749-1753)。ヒトHus1タンパク質はrad9と相互作用するrad1タンパク質との複合体の形で作用することが示されており、このことは、これらを、ヒト細胞の、或るDNA損傷応答性タンパク質複合体の中心成分にしている(Volkmerおよび Karnitz、前出)。
【００１１】
細胞は、サイクリンと呼ばれる活性化タンパク質ファミリーの合成および分解による調節により、有糸分裂に入ったり有糸分裂から出たりする。サイクリンは一群のサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)へ結合し活性化させて作用する。Cdkは次に、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化し活性化する。サイクリンは長さが約180アミノ酸であり、また「サイクリンボックス」と呼ばれる共有相同性の広い領域により特徴付けられる(Chapman, D.L及びD.J. Wolgemuth (1993) Development 118:229-240)。さらにサイクリンは、「destruction box」と呼ばれる分子のN末端領域で保存された９アミノ酸配列を含む。この配列は、ユビキチンが仲介するサイクリンB分解を誘発する認識コードと思われる(Hunt, T. (1991) Nature 349:100-101)。数タイプのサイクリンが存在する(Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21)。G1期とS期との過程は、G1サイクリン類とその触媒サブユニット群(例えばCdk2-サイクリンA、Cdk2-サイクリンE、Cdk4-サイクリンDおよびCdk6-サイクリンDを含む)によって進行される。G2/Mの移行は、Cdc2サイクリンA、Cdc2サイクリンB1、およびCdc2サイクリンB2複合体等の有糸分裂CDKサイクリン複合体の活性化によって進行される(Yang, J及びKornbluth, S. (1999) Trends in Cell Biology 9:207-210に概説)。
【００１２】
サイクリンは、真核細胞と数種の細菌では、細胞タンパク質の分解の主な経路である、ユビキチン抱合系（ubiquitin conjugation system:UCS）によって分解される。UCSは異常なタンパク質の除去を仲介する。また遺伝子の転写と細胞周期の進行等の細胞過程を制御する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。UCSは、有糸分裂サイクリンキナーゼ、オンコプロテイン(腫瘍性タンパク)、癌抑制遺伝子（p53等）、ウイルス蛋白、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写調節因子、および変異タンパク質または損傷タンパク質の分解に関与する（Ciechanover, 前出）。
【００１３】
ユビキチン抱合とタンパク質分解のプロセスは５つの主要なステップの形で起こる(Jentsch, S. (1992) Annu. Rev. Genet. 26:179-207)。第１番目にATP依存性反応で、小さな耐熱性タンパク質であるユビキチン(Ub)がユビキチン活性化酵素（E1）により活性化する。この反応はUbのC末端をE1内部システイン残基のチオール基に結合する。２番目に、活性化したUbがUb抱合酵素（E2）のうちの１つに移る。異なるユビキチン依存性タンパク分解経路は構造的に類似するが異なるユビキチン抱合酵素を利用し、これら酵素は特定の分解シグナルを運ぶタンパク質に酵素を誘導する認識サブユニット群と会合する。３番目にE2は、C末端グリシンによりユビキチン-タンパク質リガーゼファミリー、E3のメンバーにUb分子を移す。４番目に、E3はUb分子を標的タンパク質に移す。付加的Ub分子が標的タンパク質に追加され多重Ub鎖構造を形成することがある。５番目に、ユビキチン結合したタンパク質が次に、大きな多サブユニットタンパク質分解酵素複合体であるプロテアソームによって認識され分解される。そして再利用のためにUbが放出される。
【００１４】
活性化の前に、Ubは通常、融合タンパク質（N末端のユビキチンと、C末端延長タンパク質(CEP)で構成）として発現されるか、または、ポリユビキチンタンパク質（Ub単量体群が同じ方向を向いて一列（head to tail）に結合）として発現される。CEP類は種々の調節タンパク質の特徴を持つ。即ち大抵は高度に塩基性であり、最大30%のリジン残基とアルギニン残基とを含み、また、核酸結合ドメインを持つ(Monia, B.P. 他(1989) J. Biol. Chem. 264:4093-4103)。この融合タンパク質は重要な中間体であり、細胞の翻訳活性とタンパク質分解活性との同時制御と、非活性酵素の、特異的細胞部位への局在とを仲介するようである。この融合タンパク質はいったん送達されると、C末端加水分解酵素によって切断されて機能的Ubを放出する(Monia他、前出)。
【００１５】
Ub抱合酵素（E2）は、種々のUCS経路における基質特異性のために重要である。全てのE2は、UBCドメインと呼ばれるおよそ16kDaの保存されたドメインを有する。UBCドメインは全てのE2において少なくとも35%の同一性があり、ユビキチン-酵素チオールエステル形成に必要な、中心に位置するシステイン残基を含む(Jentsch、前出)。良く保存されたプロリンリッチエレメントが、N末端から活性システイン残基に位置する。この保存されたドメイン以外の構造的変異を用いて、E2酵素を分類する。クラスIのE2は、ほぼ例外なく、保存UBCドメインから成る。クラスIIのE2には、基質特異性および細胞局在に寄与する、多様な関連のないC末端延長がある。クラスIIIのE2には、酵素調節または基質特異性に関与すると思われる特有のN末端延長がある。
【００１６】
Ｅ２はいくつかのＵＣＳ経路において基質特異性のために重要である。すべてのＥ２はほぼ16kDの保存されたユビキチン抱合（UBC）ドメインを有し、互いに少なくとも35%の同一性を有し、またユビキチン−酵素チオールエステル形成に必要であるシステイン残基が中央に存在する（Jentsch、前出）。高度に保存されたプロリンリッチエレメントが、N末端から活性システイン残基に位置する。この保存されたドメインの構造的差異を用いてE2酵素をクラス群に分ける。クラス１（E2-1）のE2は保存されたUBCドメインから構成されており、酵母E2-1およびUBC４、５および７を含む。これらのE2が活性化されるためにE3が必要であると考えられる（Jentsch、前出）。UBC７はユビキチンを基質として認識し、in vitroにおいてポリユビキチン鎖を形成することがわかっている。(van Nocker, S. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:12150-58)。クラス２のE2(E2-2)には、基質特異性および細胞局在に寄与する、多様な関連のないC末端延長がある。酵母E2-2酵素、UBC2およびUBC3は、ヒストンのような塩基性基質との相互作用を促進する、酸性度の高いC末端延長を有する。酵母UBC6はタンパク質を小胞体に局在化させる疎水性のシグナルアンカー配列を有する。
【００１７】
有糸分裂サイクリン特異的E2 (E2-C)は、保存されたUBCドメイン、他のE2では見出されない30アミノ酸のN末端延長、この延長に隣接する7アミノ酸特異配列により特徴付けられる。サイクリンへのE2-Cの高親和性と共にこれらの特性はE2-Cを、E2の新しいクラスとして同定する(Aristarkhov, A.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:4294-99)。
【００１８】
ユビキチン-タンパク質リガーゼ(E3)は、ユビキチン抱合プロセスの最終ステップである基質とのユビキチンの共有結合を触媒する。E3は該プロセスの特異性の決定に重要な役割を果たす。現在のところ同定されているE3はわずかである。E3リガーゼの１つのタイプは、HECT(E6-APのC末端に相同的)ドメインタンパク質ファミリーである。HECTファミリーの１つのメンバーであるE6-AP (E6関連タンパク質)は、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV) E6腫瘍性タンパク質と同様に、p53のユビキチン結合と分解のために必要である(Scheffner他(1993) Cell 75:495-505)。HECTタンパク質のC末端ドメインは、高度に保存されたユビキチン結合システイン残基を含む。様々なHECTタンパク質のN末端領域は多様であり、特異的な基質認識に関与すると思われる(Huibregtse, J.M他(1997) Proc.Natl Acad. Sci. USA 94:3656-3661)。SCF (Skp1-Cdc53/Cullin-Fボックス受容体)ファミリーのタンパク質は、別のグループのユビキチンリガーゼを構成する(Deshaies, R. (1999) Annu. Rev. Dev. Biol. 15:435-467)。複数のタンパク質がSCF複合体内へ動員される。このタンパク質としては、Skp1、cullin(カリン)、および、或るFボックスドメイン含有タンパク質を含む。このFボックス蛋白質はユビキチン結合反応のために基質に結合する。また、基質特異性を決定し、基質を反応のためにその方向を位置付ける役割を果たす可能性がある。Skp1はFボックス蛋白質とカリンとの双方と相互作用する。また、E2酵素からタンパク質基質へのユビキチンの転移のために、Fボックス蛋白質とカリンとを複合体内で位置づける過程に関わる可能性がある。SCFリガーゼ類の基質としては、CDK活性の調節、転写の活性化、シグナル伝達、動原体のアセンブリ、およびDNA複製に関わるタンパク質類を含む。
【００１９】
Sgt1は、酵母での、Skp1における突然変異に起因する、動原体機能の欠損を抑制する遺伝子のスクリーニングにおいて同定された(Kitagawa, K. 他(1999) Mol.Cell 4:21-33)。Sgt1は、Skp1と相互作用する。また、SCFユビキチンリガーゼと会合する。Sgt1における欠損は、細胞周期のG1期またはG2期の何れかで細胞の停止を引き起こす。或る酵母Sgt1ヌル変異体は、ヒトSgt1によってレスキューされ得る。これは、多くの種にわたってSgt1機能が保存されていることを示す。Sgt1は、酵母での動原体複合体のアセンブリに必要である。
【００２０】
UCSの異常な活性は、多数の疾患と障害とに関連付けられている。これらには例えば悪液質(Llovera, M. 他 (1995) Int. J. Cancer 61: 138-141)、腫瘍抑制タンパク質p53の分解(Ciechanover, 前出)、および、アルツハイマー病に見られるような神経変性(Gregori, L. 他 (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1731-1738)を含む。ユビキチン抱合は抗原提示の律速段階なので、ユビキチン分解経路はまた、免疫応答において決定的な役割を持つ可能性がある(Grant E.P. 他(1995) J. Immunol. 155: 3750-3758)。
【００２１】
数種の細胞増殖障害は、細胞周期中の進行を通常は制御するタンパク質複合体の変化により同定され得る。或る初期治療ストラテジーには、細胞周期調節に関与するタンパク質群の操作により、細胞周期進行への制御を再確立することが関係している(Nigg, E.A. (1995) BioEssays 17:471-480)。
【００２２】
細胞周期の調節された進行は、成長制御経路群と、基礎的な細胞周期機構との統合に依存する。細胞周期調節因子群は、ヒトcDNAと酵母cDNAから、過剰発現時に酵母接合フェロモン経路の細胞周期停止シグナル群をブロックまたは活性化するcDNAを選択して同定されている。既知の調節因子としては、ヒトCPR（細胞周期進行回復）遺伝子群(例えばCPR8およびCPR2)、並びに酵母CDC(細胞分裂制御)遺伝子群(CDC91を含み、停止シグナル群をブロック)を含む。CPR遺伝子群は、種々のタンパク質(例えばサイクリン、腫瘍サプレッサー結合タンパク質、シャペロン、転写因子、翻訳因子、およびRNA結合タンパク質を含む)を発現する(Edwards, M.C. 他(1997) Genetics 147:1063-1076)。
【００２３】
幾つかの細胞周期移行(細胞が有糸分裂に入ったり出たりすることを含む)は、サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）類の活性化および阻害に依存する。Cdk類の構成は、キナーゼサブユニットであるCdkと、活性化サブユニットであるサイクリンとから成り、これらの複合体は、多くのレベルの調節を受ける。単一のCdkが出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）と分裂酵母（Saccharomyces pombe）に在るようである。一方、哺乳類は、種々の特化したCdkを持つ。サイクリンはサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)類へ結合し活性化して作用する。Cdkは次に、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化し活性化する。Cdk-サイクリン複合体は、リン酸化によって、また、CDC4およびCDC53等の分子の関わる、標的を定めた分解によって、正負両方に調節される。また、Cdk類は更に、阻害剤その他のタンパク質(例えばSuc1、これはCdkの、調節因子群への特異性またはアクセス可能性を修正)への結合によって調節される(Patra, D. および W.G. Dunphy (1996) Genes Dev.10:1503-1515; 並びにMathias, N. 他(1996) Mol.Cell Biol. 16:6634-6643)。
【００２４】
生殖
男女の生殖系は複雑であり、また、成長と発達との多くの側面に関わる。男女生殖系の解剖学と生理学との概説は（Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA, 899-928ページ）にある。
【００２５】
男性生殖系としては精子形成のプロセスを含み、ここで精子が形成される。また男性生殖機能の調節は、種々のホルモンと、それらの、付属性器、細胞代謝、成長、および他の身体機能への効果によって成される。
【００２６】
精子形成は思春期に、下垂体前葉から放出される性腺刺激ホルモンによる刺激の結果として始まる。未熟な精子(精原細胞)は数回の有糸細胞分裂を経た後、減数分裂と完全な成熟を経験する。精巣は数種の男性ホルモンを分泌する。最も豊富なものはテストステロンであり、これは、未熟な精子の成長と分裂とに、また、男性の身体の男性的特徴に必須である。3種の他の男性ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、黄体形成ホルモン(LH)、および卵胞刺激ホルモン(FSH)が、性機能を制御する。
【００２７】
子宮、卵巣、卵管、膣、および乳房が、女性生殖系を構成する。卵巣と子宮とは各々、卵子の源泉であり、胎児発達の部位である。卵管と膣とは付属器官であり、それぞれ子宮の上と下に付いている。子宮と卵巣との両方が、女性の生涯における生殖能力の発生と喪失で、更なる役割を有する。乳房の主要な役割は泌乳である。卵巣、子宮、下垂体、視床下部、副腎、その他の組織からの多数の内分泌シグナルが、生殖と泌乳とを協調させる。これらシグナルは毎月の月経周期の期間中および女性の生涯の期間中に変動する。同様に、これら内分泌シグナルへの、生殖器の感度は、女性の生涯の期間中に変動する。
【００２８】
卵巣、下垂体、および視床下部への、正負のフィードバックの組合せが、月ごとの排卵および子宮内膜周期での生理変化を制御する。下垂体前葉は、２種の主要な性腺刺激ホルモンである、卵胞刺激ホルモン(FSH)と黄体形成ホルモン(LH)とを分泌する。これは、ステロイド類の負のフィードバックによって(最も著しくは卵巣エストラジオールによって)調節される。受精が起きない場合、エストロゲンとプロゲステロンとのレベルが低下する。この、卵巣ホルモンの急激な減少は、月経(内膜の剥離)を生じる。
【００２９】
ホルモンは更に、妊娠、分娩、泌乳、および閉経の、全ステップを支配する。妊娠時には、多量のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、エストロゲン、プロゲステロン、およびヒト絨毛性ソマトマンモトロピン(hCS)が、胎盤によって形成される。hCGは黄体形成ホルモンに似た糖タンパク質であり、黄体が、更なるプロゲステロンとエストロゲンとを産生し続け、卵子が受精しないときに起きるように萎縮することの無い様に刺激する。hCSは成長ホルモンに似ており、胎児の栄養摂取に死活的である。
【００３０】
女性乳房はまた、妊娠時に成熟する。多量のエストロゲンが胎盤から分泌され、乳管系の成長と分枝形成との引き金となる。一方、泌乳の開始は、下垂体によるプロラクチンの分泌によって成される。
【００３１】
分娩には、幾つかのホルモンの変化を伴う。これらの変化が、子宮の収縮性を、妊娠の終了に向けて次のように増大させる。エストロゲンのレベルが、プロゲステロンのレベル以上に増加する。オキシトシンが、神経下垂体によって分泌される。同時に、オキシトシンへの子宮の感度が増加する。胎児自身がオキシトシン、コルチゾル(副腎から)、およびプロスタグランジンを分泌する。
【００３２】
閉経は、大半の卵胞が変性したときに起きる。卵巣はその後、より少ないエストラジオールを産生し、下垂体と視床下部での負のフィードバックを低下させる。循環するFSHとLHとの平均レベルが増加する(排卵周期が続くにも関わらず)。したがって、卵巣は性腺刺激ホルモンへの応答性がより低く、また、月経周期の間の時間が増加する。結果的に、月経出血が止まり、生殖能力が終了する。
【００３３】
胚形成
哺乳類の胚形成プロセスには、受胎後の最初の数週間の発達を含む。この期間に、胚形成は、単一の受精卵から、3種の胚組織の形成へ、次に胚へと進む。この胚は、その殆どの内部器官と、その全ての外的特徴とを持つ。
【００３４】
正常なコースの哺乳類胚形成は、多数の遺伝子と組織との、妥当な時間的および空間的な調節に依存する。これらの調節プロセスは、マウスで集中的に研究されている。依然として理解の乏しい或る必須プロセスは、受精後の胚ゲノムの活性化である。マウス卵母細胞が成長するにつれ、卵母細胞は転写物を蓄積する。転写物は、直接にタンパク質へ翻訳されるか、または調節されたポリアデニル化による後の活性化のために貯蔵されるかの何れかである。その後の減数分裂型成熟と排卵との間、母性ゲノムは転写的に不活性であり、殆どの母性転写物は、2細胞期における接合体遺伝子群の活性化に先立ち、またはそれらの活性化と同時に、脱アデニル化および／または分解される(Stutz, A. 他(1998) Genes Dev. 12:2535-2548)。 母性から胚性への移行には、卵母細胞転写物の分解を伴うが接合体転写物の分解は伴わず、また、胚ゲノムの活性化と、早期発達に順応するための細胞周期進行の誘導とを伴う。
【００３５】
MATER (Maternal Antigen That Embryos Require：胚が必要とする母性抗原)は初め、卵巣免疫を持つマウスに由来する抗体群の標的として同定された(Tong, Z-B.、および Nelson, L.M. (1999) Endocrinology 140:3720-3726)。MATERをコードする遺伝子の発現は卵母細胞に限られ、この遺伝子を、限られた数の、哺乳類での既知の母性効果遺伝子の1つにしている(Tong, Z-B., 他(2000) Mamm.Genome 11:281-287)。MATERタンパク質は2細胞から先の胚の発達に必要である。これは、この遺伝子が非活性化されたマウスでの予備結果に基づく。1111アミノ酸のMATERタンパク質内には、或る親水性リピート領域(アミノ末端内)と、或る、14ロイシンリッチリピート群を持つ領域(カルボキシル末端内)とを含む。これらリピートは、タンパク質間相互作用に決定的である、ブタのリボヌクレアーゼ阻害剤に見られる配列に似ている。
【００３６】
減数分裂型成熟と排卵との際の母性転写物の分解は、排卵直前のリボヌクレアーゼの活性化に関わる可能性がある。したがって、MATERの機能は、母性リボヌクレアーゼに結合し、接合体転写物の分解を防ぐことである可能性がある(Tong 他、前出)。卵母細胞発達と胚形成とにおける役割に加え、MATERはまた、卵巣免疫の発生機序に関わる可能性がある。理由は、MATERが、自己免疫性卵巣炎を持つマウスにおいて自己抗体の標的であるからである(Tong およびNelson、 前出)。
【００３７】
母性mRNA D7は、アフリカツメガエルでは中程度に豊富な転写物である。その発現は、卵形成と早期胚形成において最高であり、おそらくこれらの時期に限られる。D7タンパク質は卵母細胞には存在せず、卵母細胞成熟時に初めて蓄積し始める。D7タンパク質レベルは胚の発生の初日に最高であり、その後は減少する。D7タンパク質の喪失は、成熟プロセス自体に影響し、胚小胞分解の時間経過を大きく遅らせる。このように、D7は卵母細胞成熟に関わる、新規に記載されたタンパク質である(Smith R.C., 他(1988) Genes Dev. 2(10):1296306)。
【００３８】
多くの他の遺伝子が、以後の胚形成の諸ステージに関わる。受精後、卵母細胞の誘導が各卵管の遠位端の卵管采によって成され、卵母細胞は卵管に入り、通過し、そして子宮へ誘導される。子宮内膜で諸変化が起こり、受精卵の着床と胚の発達とを支持する準備ができる。幾つかの段階での分割が起きた後、今や約100細胞を持つ胚盤胞となった分割卵が、子宮に入る。子宮に到達すると、発達中の胚盤胞は通常、子宮腔に更に2〜4日とどまった後、子宮内膜(子宮の内層)内に着床する。着床は、栄養膜細胞の作用による。栄養膜細胞は、胚盤胞の表面を覆って発達する。栄養膜細胞は、タンパク分解酵素群を分泌し、これら酵素が、内膜の細胞を消化し液化する。侵入プロセスの概説は、Fisher, S.J. およびC.H. Damsky (1993; Semin Cell Biol 4:183-188)並びにGraham, C.H. およびP.K. Lala (1992; Biochem Cell Biol 70:867-874)にある。着床が起きると、栄養膜細胞および他の下層細胞は迅速に増殖し、胎盤および、妊娠の種々の膜を形成する(Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, 第８版 W.B. Saunders Company, Philadelphia 915-919ページを参照)。
【００３９】
胎盤は、発達する胎児を保護し養う、必須の役割を持つ。大抵の種では、合胞体栄養細胞層が、胎盤の外側の、胎児-母体インターフェースに在る。これは連続構造で、1細胞の深さを持ち、構成物である栄養膜細胞の融合によって形成される。合胞体栄養細胞は、母体-胎児間交換に、胎児発生時の組織リモデリングに、また、発生時の胎児の、母性免疫応答からの保護において重要な役割を果たす(Stoye, J.P. および Coffin, J.M. (2000) Nature 403:715-717)。
【００４０】
syncytin(シンシチン)と言う遺伝子は、ヒトの内因性の欠損性プロウイルスのエンベロープ遺伝子である。syncytinは、高レベルで胎盤に発現し、精巣ではより弱く発現するが、いかなる他の組織にも検出されない(Mi, S. 他 (2000) Nature 403:785-789}。胎盤内のsyncytin発現は、合胞体栄養細胞に限定される。レトロウイルスenvタンパク質類はしばしば細胞融合イベント群の促進に関わるので、syncytinは栄養膜細胞の、合胞体栄養細胞層への融合の調節に関わりうると考えられた。諸実験が示したところでは、syncytinは、細胞融合をin vitroで仲介しうる。また、抗syncytin抗体類は、胎盤の細胞性栄養細胞の融合を阻害しうる(Mi 、他、前出)。また、或る保存された免疫抑制ドメインが、レトロウイルスのエンベロープタンパク質群に存在し、syncytinのアミノ酸残基373-397に見られるが、このドメインは、発達する胚に対する母性免疫応答の防止に関わる可能性がある。 syncytinはまた、栄養膜侵入性の調節に、栄養膜の融合と最終分化とを誘発することによって関わる可能性がある(Mi、他、 前出)。子宮壁の不充分な栄養膜浸潤は、胎盤障害（例えば子癇前症）または妊娠誘発高血圧を伴う。一方、無制御な栄養膜侵入は、絨毛癌およびその他の妊娠性の栄養膜疾患で観察される。このように、syncytin機能は、これら疾患に関わる可能性がある。
【００４１】
細胞分化
多細胞生物は、各細胞は互いに、その遺伝的資性において類似しているにもかかわらず、構造及び機能が著しく異なる多様な細胞型から構成される。細胞分化のプロセスによって、細胞群は、その構造と生理機能とが異なるようになる。多細胞生物の細胞は全て、単細胞接合体の有糸分裂に起因する。接合体は全能性である。即ち、成体の如何なるタイプの細胞をも生じる能力を持つ。発生中に、接合体の細胞子孫はその全能性を失い、決定されて行く。細胞の予定運命が樹立すると、細胞は分化したと言われる。この細胞の全ての子孫は、同じタイプとなる。
ヒトの成長と発達とには、細胞増殖、および調節された細胞死と共に、細胞分化の空間的および時間的な調節を要する。これらのプロセスは協調し、生殖、老化、胚形成、形態形成、器官形成、ならびに組織の修復および維持を制御する。細胞分化に関わる諸プロセスはまた、病態（癌など）にも関与する。この場合、正常な細胞分化を調節する因子類が変容しており、癌細胞を未分化または低分化状態で増殖させる。
【００４２】
分化の機序には転写と翻訳との細胞特異的な調節を伴うので、異なる遺伝子群が、異なる時期に異なる細胞で選択的に発現する。ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)を用いた遺伝実験によって、発生および分化時のパターン形成を制御する転写因子の調節されたカスケードが同定されている。これらカスケードには、ホメオティック遺伝子群を含む。これら遺伝子は、ホメオボックスモチーフを持つ転写因子群をコードする。ホメオティック遺伝子の産物は、如何にしてこの昆虫の成虫原基が未分化細胞の塊から複雑な器官を持つ特異的な体節へ発達するかを決定する。これらのタンパク質は発達段階において前後体軸の特定化に重要である。ショウジョウバエの細胞分化と発達とに関わることが見出された多くの遺伝子は、相同体を哺乳類に有する。数種のヒト遺伝子は、そのショウジョウバエ相同体と等価の発達的役割を持つ。ショウジョウバエeyes absent遺伝子(eya)のヒト相同体はbranchio-oto-renal(鰓弓耳腎)症候群の根底にある。この発達障害は、耳と腎臓とを冒す(Abdelhak, S. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-164)。ショウジョウバエにおいて、Iroquois ホメオボックス遺伝子は前神経および脈管形成遺伝子の制御、知覚神経の位置的同定、alula（小翼羽）および背板の形成、並びに卵胞、頭および眼の発達に必要な背腹側パターンの形成中心の確立において役割を果たしている。哺乳類のIroquoisホメオボックス遺伝子は神経系および心臓の発達に関与している(Christoffels, V.M. 他 (2000) Dev. Biol. 224:263-274)。
【００４３】
tesmin(テスミン)は精母細胞に特異的に発現される精巣特異的メタロチオネイン様タンパク質であり、精子形成においてある役割を果たし得る(Sugihara, T. 他(1999) Genomics 57:130-136)。メタロチオネインタンパク質は重金属イオンに結合する低分子量のシステインリッチタンパク質である。メタロチオネインタンパク質は毒性の重金属に結合して、それを隔離し、金属貯蔵分子として作用する。さらに、必須重金属、特に亜鉛の濃度を調節する。メタロチオネインは、特定の酵素や転写因子に必要な亜鉛のような金属イオンの利用能を調節することによって、細胞増殖や分化における役割を果たし得る。
【００４４】
細胞レベルでは、成長と発達との支配は、細胞が細胞周期に入ったり出たりする決定に、また、細胞の、最終分化状態へのコミットメントによって成される。細胞内の分化遺伝子発現は、細胞外シグナルとその他の環境合図へ応答して誘発される。このようなシグナルとしては、成長因子および他の分裂促進因子(例えばレチノイン酸)、細胞間接触および細胞-マトリクス接触、並びに、環境因子(例えば栄養シグナル、毒性物質、および熱ショック)を含む。分化の役割を果たしうる候補遺伝子群の同定は、in vitroでの細胞分化の誘発時の、変容した発現パターンによって成されうる。
【００４５】
細胞分化の最終ステップの結果、特化が生じる。特化の特徴は、特定タンパク質の産生(例えば筋細胞での収縮タンパク、肝細胞での血清タンパク、および、赤血球前駆体でのグロビン)である。これら特化タンパクの発現は、少なくとも部分的に、細胞特異的転写因子群に依存する。例えばホメオボックス含有転写因子PAX-6は、脊椎動物の早期の眼の決定、眼組織の特異化、および、正常な眼の発達に必須である。
【００４６】
表皮分化の場合、分化特異的遺伝子群の誘発は、成長停止と共にまたはその後の何れかに起こる。また、不可逆的な成長停止を制御する分子イベント群に連関すると思われる。不可逆的な成長停止という早期イベントは、細胞が、皮膚の基底層から、最深部のsuprabasal layer(基底上層)へ移行し、扁平上皮特異的遺伝子群を発現し始めるときに起きる。これら遺伝子としては、架橋したエンベロープの形成に関わる遺伝子(例えばトランスグルタミナーゼIおよびIII、involucrin(インボルクリン)、loricin(ロリクリン)、および、スモールプロリンリッチリピート（SPRR）タンパク等)を含む。SPRRタンパク類は8〜10 kDaの分子量を持ち、プロリン、グルタミン、およびシステインが豊富である。また、類似した反復配列エレメントを持つ。SPRRタンパクは、強い二次構造を持つ構造タンパクであるか、または、金属結合タンパク(メタロチオネインなど)でありうる(Jetten, A. M. および Harvat, B. L. (1997) J. Dermatol. 24:711-725; PRINTS Entry PR00021 PRORICH Small proline-rich protein signature)。
【００４７】
Wnt遺伝子ファミリーの分泌シグナル分子は、真核細胞全体で高度に保存されている。Wntファミリーのメンバーは、軟骨テンプレート(cartilage template)内の軟骨細胞分化の調節に関わる。Wnt-5a、Wnt-5b、およびWnt-4遺伝子の発現は、ニワトリ四肢の軟骨形成領域で成される。Wnt-5aの発現は、軟骨膜(早期軟骨テンプレートのすぐ周辺の間葉細胞)で成される。Wnt-5a誤発現は、ニワトリ四肢で、軟骨細胞の成熟と、bone collar形成の開始を遅らせる(Hartmann, C. および Tabin, C.J. (2000) Development 127:3141-3159)。
【００４８】
グリピカン(glypicans)は細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンの１ファミリーであり、これらは、細胞成長制御と分化とで重要な役割を果たす。cerebroglycanはヘパラン硫酸プロテオグリカンであって神経系に発現される。これは、発達するニューロンの運動性の挙動に関わる(Stipp, C.S. 他(1994) J. Cｅｌl. Biol. 124:149-160)。
【００４９】
Notchは膠細胞の分化で活性な役割を果たす。また、神経突起の長さと構成とに影響する(概説は、Frisen, J. および Lendahl, U. (2001) Bioessays 23:3-7を参照)。Notch受容体シグナル経路は、多細胞種での多くの器官および組織の、形態形成と発達とに重要である。ショウジョウバエfringeタンパク質は、翅の成虫原基の背腹境界でのNotchシグナル伝達経路の活性化を調整する。哺乳類fringe関連ファミリーメンバーは、分節時の境界決定に関与する(Johnston, S.H. 他(1997) Development 124:2245-2254)。
【００５０】
最近、数種のタンパク質に、或る保存されたシステインリッチドメインがあることがわかり、これは約60アミノ酸残基からなり、LIMドメインと呼ばれる(Lin-11、Isl-1、Mec-3に由来) (Freyd G. 他(1990) Nature 344:876-879; Baltz R. 他(1992) Plant Cell 4:1465-1466)。LIMドメインには、７つの保存されたシステイン残基と、１つのヒスチジンとがある。LIMドメインは、2個の亜鉛イオンと結合する(Michelsen J.W. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4404-4408)。LIMはDNAとは結合せず、むしろ、タンパク間相互作用のインターフェースとして作用するようである。
【００５１】
アポトーシス
アポトーシスは遺伝的に制御されたプロセスであり、これにより、不要なまたは欠陥のある細胞が、プログラム細胞死を迎える。細胞の選択的除去は、形態形成と組織リモデリングにとって、細胞増殖および分化と同じく重要である。アポトーシス不足の結果、過形成その他の、増加した細胞増殖に伴う障害を生じうる。アポトーシスはまた、免疫応答の決定的要素である。免疫細胞(例えば細胞障害性T細胞およびナチュラルキラー細胞)は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞にアポトーシスを誘発して、疾患が広がるのを防ぐ。また、自己分子と外来分子とを区別しない免疫細胞は、アポトーシスで除去され自己免疫応答を避ける必要がある。
【００５２】
アポトーシス細胞は、明確な形態変化を経る。アポトーシスの特質としては、細胞収縮、核と細胞質との凝縮、および、形質膜トポロジーの変容を含む。生化学的には、アポトーシス細胞の特徴は、増加した細胞内カルシウム濃度、染色体DNAの断片化、および、新規な細胞表面成分の発現である。
【００５３】
アポトーシスの分子機序は高度に保存されており、アポトーシスの鍵となる多くのタンパク調節因子およびエフェクターが同定されている。アポトーシスは一般に、細胞内伝達され結果として変容したパターンの遺伝子発現とタンパク活性とを生じるシグナルに応じて進行する。シグナル分子(例えばホルモンやサイトカイン)は、アポトーシスの刺激と阻害との双方を、細胞表面受容体との相互作用を介して行うことが知られる。転写因子もまた、アポトーシスの開始において重要な役割を果たす。多数の下流エフェクター分子(特にプロテアーゼ)が、細胞成分の分解と、他のアポトーシスエフェクター群のタンパク分解活性化とに関連付けられている。
【００５４】
Bcl-2ファミリーのタンパク質は、他の細胞質タンパクと同様、アポトーシスの鍵となる調節因子である。少なくとも15種のBcl-2ファミリーメンバーが、3種のサブファミリーに存在する。Bcl-2タンパクは、哺乳類細胞とウイルスとで同定されている。また、各々が、4種のBcl-2相同性ドメイン(BH1〜BH4)の少なくとも1つを持つ。これらドメインは高度に保存される。Bcl-2ファミリー蛋白にはBH1およびBH2ドメインが含まれ、これらはプロサバイバル(生存促進)サブファミリーのメンバーに見られるが、Bcl-2に最も似たタンパク類は4種すべての保存ドメインを持ち、種々の細胞障害性の挑戦に遭遇した際のアポトーシスの阻害を可能にしている。プロ生存（pro-survival）サブファミリのメンバーの例として、哺乳類ではBcl-2、Bcl-xL、 Bcl-w、 Mcl-1および A1 、NF-13(ニワトリ) 、CED-9 (線虫)、またウイルスタンパク質のBHRF1、 LMW5-HL、 ORF16、 KS-Bcl-2およびE1B-19Kがある。BH3ドメインは、プロアポトーシスサブファミリー蛋白の機能に必須である。2つのプロアポトーシスサブファミリのBax とBH3のうち、Baxには、Bax、 Bakおよび Bok (Mtdとも呼ばれる)が含まれ、BH3にはBik、 Blk、 Hrk、 BNIP3、 BimL、 Bad、 Bid、 および Egl-1 (線虫)が含まれる。BaxサブファミリーのメンバーはBH1、BH2、およびBH3ドメインを持ち、Bcl-2にかなり良く似ている。一方、BH3サブファミリーのメンバーは9〜16残基のBH3ドメインのみを持つ以外は如何なる既知タンパクとも無関係であり、BikとBlkとのみが配列類似性を共有する。2種のプロアポトーシスサブファミリーのタンパク質は、プロサバイバルサブファミリー蛋白のアンタゴニストの可能性がある。これは線虫で例証され、アポトーシスに必要なEgl-1がCED-9 に結合し、またCED-9 を介して作用する(総説はAdams, J.M. 及びS. Cory (1998) Science 281:1322-1326を参照のこと)。
【００５５】
プロアポトーシスサブファミリー蛋白および抗アポトーシスサブファミリー蛋白の間のヘテロ二量体化は、これらタンパク質サブファミリーの機能へタイトレーション的効果を持つようであり、これが示唆するところでは、各サブファミリーのメンバーの相対濃度が作用してアポトーシスを調節する。ヘテロ二量体化はプロサバイバル蛋白には不要だが、BH3サブファミリーには必須であり、Baxサブファミリーにはさほどでない。
【００５６】
Bcl-2タンパクは2種のアイソフォーム、αとβとを持ち、これらは選択的スプライシングによって形成される。Bcl-2はホモ二量体を形成し、また、BaxおよびBakタンパク、並びにBcl-XアイソフォームであるBcl-xとのヘテロ二量体を形成する。Baxとのヘテロ二量体化には無傷のBH1およびBH2ドメインを要する。またこれは、プロサバイバル活性に必要である。BH4ドメインも、プロサバイバル活性に関わるようである。Bcl-2はミトコンドリアの内膜と外膜に局在し、また核エンベロープと小胞体内にも局在し、発現は種々の組織で成される。Bcl-2のろ胞性リンパ腫(タイプII慢性リンパ性白血病)での関与が、染色体転座T(14;18) (q32;q21)に見られ、Bcl-2の関与は免疫グロブリン遺伝子領域に関わる。
【００５７】
Bcl-xタンパク質は、アポトーシス細胞死の主要な調節因子である。選択的スプライシングの結果、3種のアイソフォームである、Bcl-xB、長いアイソフォーム、および短いアイソフォームを生じる。長いアイソフォームは細胞死抑制作用を示し、短いアイソフォームはアポトーシスを促進する。Bcl-xLはBaxおよびBakとのヘテロ二量体を形成するが、Baxとのヘテロ二量体化は、プロサバイバル(抗アポトーシス)活性に必要ではないらしい。Bcl-xSはBcl-2とのヘテロ二量体を形成する。Bcl-xは、ミトコンドリア膜と、核周囲エンベロープとに見られる。Bcl-xSの高レベルでの発現は、発生中のリンパ球その他の、高速の代謝回転を受けている細胞に見られる。Bcl-xLは、成人の脳に、また、他の組織の、寿命の長い有糸分裂後細胞に見られる。Bcl-2と同様、BH1、BH2およびBH4ドメインは、プロサバイバル活性に関わる。
【００５８】
Bcl-wタンパクは、殆ど全ての骨髄性細胞系の細胞質に、また多数の組織に見られる。最高の発現レベルは、脳、結腸、および唾液腺に見られる。Bcl-wタンパクは、低レベルでは精巣、肝臓、心臓、胃、骨格筋、および胎盤、並びに少数のリンパ性細胞系において発現される。Bcl-wは、BH1、BH2、およびBH4ドメインを持ち、この全ては、その細胞生存促進活性に必要である。Bcl-w遺伝子機能が相同組換えで破壊されたマウスは生存可能で、健康で、外見が正常であり、成体雌は正常な生殖機能を有したが、成体雄は不妊性であった。これら雄では、精子形成の最初の前思春期段階の大部分は無影響で、精巣は正常に発達した。しかし精細管が無秩序で、多数のアポトーシス細胞を有し、成熟精子を作れなかった。このマウスモデルは、数種のヒト男性不妊に適用できる可能性があり、この示唆するところでは、精巣のプログラム細胞死の改変は、生殖力の調整に有用であり得る(Print, C.G. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431)。
【００５９】
ラット虚血脳の研究では、Bcl-wが、非虚血脳で正常なレベル（恒常的に低い）で発現されているのに比して、虚血脳で過剰発現されていた。さらに、Bcl-w の作用機序を調べるin vitro 研究によって、単離されたラット脳ミトコンドリアは、Bcl-w が存在する時に、組換えBax の添加に、あるいは高濃度のカルシウムに応答できないことがわかった。正常な応答であれば、チトクロムcがミトコンドリアから放出されたであろう。また、組換えBcl-wタンパクは、カルシウム誘発によるミトコンドリア膜電位の喪失を阻害することが見られた。これは、透過性の変化を示す。これらの所見が共に示唆するところでは、Bcl-wは、虚血性神経細胞死に対する神経保護作用を示し、この保護を、ミトコンドリア死亡調節経路を介して達成する(Yan, C. 他(2000) J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:620-630)。
【００６０】
bfl-1遺伝子は、Bcl-2ファミリーの更なるメンバーであり、これもアポトーシスの抑制因子である。Bfl-1タンパクは175アミノ酸を持ち、また、BH1、BH2、およびBH3保存ドメインを持つ。これらドメインはBcl-2ファミリーメンバーに見られる。Bfl-1はまた、GlnリッチなNH2末端領域を持ち、NHドメイン1を欠く。これは他のBcl-2ファミリーメンバーと異なる。マウスA1タンパクは、Bfl-1と高い配列相同性を共有し、Bfl-1に見られる3種の保存ドメインを持つ。p53腫瘍抑制タンパクに誘発されるアポトーシスは、Bfl-1によって抑制される。これは、Bcl-2、Bcl-xL、およびEBV-BHRF1の作用に似る(D'Sa-Eipper, C. 他(1996) Cancer Res.56:3879-3882）。 Bfl-1は細胞内に見られる。最高発現は、造血区画(即ち血液、脾臓、および骨髄)に見られ、中等度の発現は肺、小腸、および精巣で、また最少発現は他の組織に見られる。Bfl-1はまた、血管平滑筋細胞および造血器悪性腫瘍(hematopoietic malignancies)に見られる。bfl-1の発現レベルと、胃癌の発症との間の相関が記述されており、その示唆するところでは、Bfl-1タンパクは、癌細胞生存の促進、または癌で胃癌の発症に関わる。(Choi, S.S. 他(1995) Oncogene 11: 1693-1698)。
【００６１】
癌の特徴は、継続的で無制御な細胞増殖である。数種の癌には、正常なアポトーシス細胞死の抑制を伴う。治療のストラテジーには、細胞周期進行への制御を再確立することや、癌細胞のアポトーシスを選択的に刺激することを含みうる(Nigg, E.A. (1995) BioEssays 17:471-480)。癌の免疫防御としては、突然変異細胞での、腫瘍抑制因子によるアポトーシスの誘発と、腫瘍抗原の、Tリンパ球による認識とを含む。分裂促進ストレスへの応答は、しばしば転写のレベルで制御される。また、種々の転写因子によって調整される。例えばRel/NF-κBファミリーの脊椎動物転写因子は、放射線への炎症応答および免疫応答で中心的な役割を果たす。NF-κBファミリーとしては、p50、p52、RelA、RelB、cRel他のDNA結合タンパクを含む。p52タンパクはアポトーシスを誘発し、転写因子c-Junを上方制御し、c-Jun N末端キナーゼ１(JNK1)を活性化する(Sun, L. 他(1998) Gene 208:157-166)。大抵のNF-κBタンパクは、DNA結合ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。多くの転写因子の二量体化はbZIP ドメインとして知られている保存された配列によって媒介される。このbZIP ドメインは塩基領域とその後のロイシンジッパーによって特徴付けられる。
【００６２】
Fas/Apo-1 受容体(FAS)は腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリのメンバーである。そのリガンド(Fasリガンド)と結合すると、膜貫通型のFASは、アポトーシスの誘発を、数種の細胞質タンパクを動員して行う。これらタンパクが死のシグナルを伝達する。FAS関連タンパク因子1 (FAF1)と呼ばれる、このようなタンパク質の1つが、マウスから単離された。また、L細胞でのFAF1の発現が、FAS誘発アポトーシスを増強することが示された(Chu, K. 他(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11894-11898)。続いて、FAS関連因子群の単離が、多数の他の種(例えばショウジョウバエやウズラ)で成されている(Frohlich, T. 他(1998) J. Cell Sci.111:2353-2363）。Fasからの死のシグナルの伝達で機能する別の細胞質タンパクがFas会合デスドメイン蛋白、略称FADDである。FADDは、死のシグナルを、FAS媒介およびTNFレセプター媒介アポトーシス経路の双方で、カスパーゼ8を活性化して伝達する(Bang, S. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:36217-36222)。
【００６３】
染色体DNAの断片化は、アポトーシスの特質の１つである。DNA断片化因子(DFF)タンパクは、2種のサブユニットからなる。40-kDaのカスパーゼ活性化ヌクレアーゼであるDFF40/CADと、その45-kDaの阻害因子であるDFF45/ICADである。DFF45/ICADの2種のマウス相同体であるCIDE-AおよびCIDE-Bが最近、報告されている(Inohara, N. 他(1998) EMBO J. 17:2526-2533)。哺乳類細胞でのCIDE-AとCIDE-Bとの発現はアポトーシスを活性化し、CIDE-A単独の発現は、DNA断片化を誘発した。また、FAS媒介アポトーシスは、CIDE-AとCIDE-Bとによって増進された。これは、これらタンパク質を、アポトーシスを媒介するエフェクターとして更に関連付ける。
【００６４】
転写因子は、アポトーシスの開始において重要な役割を果たす。多数の下流エフェクター分子、特にプロテアーゼ（例えばカスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼ）が、アポトーシスの開始段階と実行段階に関与している。カスパーゼの活性化は、プロサバイバルおよびプロアポトーシス型Bcl-2関連タンパクの競合作用による(Print, C.G. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431)。プロアポトーシス性シグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的なアポトーシス細胞死に導く。2つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機序に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの1つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。
【００６５】
カスパーゼは不活性酵素前駆体として合成され、この前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される1つの大きな（p20）サブユニットと1つの小さな（p10）サブユニット、および、可変N末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスに正または負に影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルが、特異的アスパラギン酸残基（カスパーゼ1の番号付け規則ではD297）の自己タンパク質分解切断およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、p10/p20ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーの2つが、その小サブユニットを介して相互作用し、触媒的に活性な四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。幾つかのカスパーゼはそのプロドメインに「デスエフェクタードメイン」を含み、それによって、他のカスパーゼおよび、FADDタンパク質会合細胞死受容体（death receptor）との自己活性化複合体に、あるいはTNF受容体複合体に、カスパーゼが補充されうる。さらに、カスパーゼファミリーの異なるメンバーからの2つの二量体が会合して、結果として得る四量体の基質特異性を変えることができる。
【００６６】
腫瘍壊死因子（TNF）と関連サイトカイン類とは、リンパ系細胞においてアポトーシスを誘発する(概説はNagata, S. (1997) Cell 88:355-365)。TNFの、その受容体への結合は、或るシグナル伝達経路の引き金となり、その結果、タンパク質分解的カスパーゼカスケードの活性化が生じる。このようなカスパーゼの1種であるICE(インターロイキン1β変換酵素)はシステインプロテアーゼであり、ICEは、ICE自己切断によって産生される、2種の大サブユニットと2種の小サブユニットとからなる(Dinarello, C. A. (1994) FASEB J. 8:1314-1325)。ICEは、主に単球に発現する。ICEはサイトカイン前駆体であるインターロイキン-1βをその活性形態にプロセシングし、この活性型は急性・慢性炎症、骨再吸収、骨髄性白血病および他の病理的過程において中心的な役割を果たす。ICEと関連カスパーゼ類とは、形質移入した細胞株内で過剰発現すると、アポトーシスを起こす。
【００６７】
カスパーゼ補充ドメイン(CARD)は、数種のアピカルカスパーゼ（apical caspases）のプロドメインに見られる。また、数種のアポトーシス調節分子、例えばApaf-2、RAIDD、および、アポトーシス蛋白の細胞性阻害物質(IAP)で保存される(Hofmann, K. 他(1997) Trends Biochem. Sci. 22:155-157)。アポトーシスでのCARDの調節的役割は、Apaf-1等のタンパク質をカスパーゼ9と会合させることでありうる(Li, P. 他(1997) Cell 91:479-489)。骨格筋と心筋との双方で発現する、CARD含有アポトーシス抑制因子（ARC）をコードする或るヒトcDNAが、同定され特徴付けられている。ARCはアポトーシスの阻害因子として機能し、また、カスパーゼと選択的に相互作用する(Koseki, T. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5156-5160)。これら全ての相互作用は、アポトーシスの調整に明らかに影響する（Chan S.L.およびM.P. Mattson (1999) J. Neurosci. Res. 58:167-190; Salveson, G.S. および V.M. Dixit (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10964-10967に概説）。
【００６８】
ES18は、アポトーシスの潜在的調節因子として、マウスT細胞で同定された(Park, E.J. 他(1999) Nuc. Acid. Res. 27:1524-1530)。ES18は428アミノ酸の長さであり、N末端プロリンリッチ領域、1つの酸性グルタミン酸リッチドメイン、および、1つの推定LXXLL核レセプター結合モチーフを持つ。ES18タンパクは、リンパ節と胸腺とで優先的に発現する。ES18発現のレベルは、T細胞胸腺腫S49.1では、デキサメタゾン、スタウロスポリン、またはC2セラミド（これらは、アポトーシスを誘発する）での治療に応じて増加する。ES18は、T細胞でのアポトーシス細胞死の刺激で役割を果たす可能性がある。
【００６９】
ラット腹葉前立腺(RVP)は、ホルモン調節型アポトーシスの研究の或るモデル系である。RVP上皮細胞は、アンドロゲン剥奪に応答してアポトーシスを受ける。アポトーシスRVP内で上方制御されるメッセンジャーRNA(mRNA)転写物群が同定されている(Briehl, M. M. および Miesfeld, R. L. (1991) Mol. Endocrinol. 5:1381-1388)。このような転写物の１つはRVP.1をコードする。アポトーシスでのこれの正確な役割は決定されていない。RVP.1のヒト相同体であるhRVP1は、このラットタンパク質に89％同一である(Katahira, J. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:26652-26658)。hRVP1は220アミノ酸の長さであり、4つの膜貫通ドメインを持つ。hRVP1は、肺、腸、および肝臓で高発現される。興味深いことに、hRVP1は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のエンテロトキシン(ヒト等の動物での下痢の原因物質)の低親和性レセプターとして機能する。
【００７０】
サイトカイン媒介アポトーシスは、造血と免疫応答とにおいて重要な役割を果たす。骨髄性細胞は、マクロファージ、好中球、赤血球など血球の幹細胞前駆体であり、これは、特異的サイトカイン、例えば顆粒球／マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)およびインターロイキン3(IL-3)などに応答して増殖する。GM-CSFまたはIL-3を剥奪すると、骨髄性細胞はアポトーシスを受ける。ネズミrequiem (req)遺伝子は、骨髄性細胞株FDCP-1での、このアポトーシス応答に必要な推定転写因子をコードする(Gabig, T. G. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:29515-29519)。Reqタンパクは371アミノ酸の長さであり、1つの核局在シグナル、単一のKruppelタイプZnフィンガー、1つの酸性ドメイン、および、一群の、4種の独特なZnフィンガーモチーフ(金属結合に関わるシステインおよびヒスチジン残基が豊富)を持つ。reqの発現は骨髄性特異的でもアポトーシス特異的でもなく、これが示唆するところでは、付加的因子群が、骨髄性細胞アポトーシスでのReq活性を調節する。
【００７１】
アポトーシスの調節不全は最近、多くのヒト疾患の発生機序における有意な因子として認識されている。例えば、アポトーシス低下によって生じた過剰な細胞生存は、細胞増殖と免疫応答とに関する諸障害に寄与しうる。これらの障害としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、および炎症を含む。一方、アポトーシス増加によって生じた過剰な細胞死は、変性障害および免疫不全症(例えばAIDS、神経変性疾患、および骨髄異形成症候群)をもたらしうる(Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462)。
【００７２】
アポトーシスの欠陥的調節はまた、アルツハイマー病でのニューロンの喪失に関わる。アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、アミロイドβペプチドを含有する、老人斑と神経原線維変化との形成である。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。Bアミロイドペプチドは、アポトーシスを誘発しニューロンの死をもたらすシグナル経路に関わる(Kajkowski, C. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:18748-18756)。アルツハイマーの病理の早期には、生理変化が帯状皮質で見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。
【００７３】
細胞分化および増殖
組織成長には、複雑で秩序あるパターンの、細胞増殖、細胞分化、およびアポトーシスが関わる。細胞増殖は、細胞の数と、細胞の空間的構成との双方を維持するために調節される必要がある。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接または間接的に調節する分子は、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャーとシグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質、および有糸分裂促進因子などの、複数のカテゴリーに分類される。
【００７４】
成長因子は初め、細胞増殖の促進に必要な血清因子として記載された。殆どの成長因子は大きな分泌ポリペプチドであり、その局所環境にある細胞に作用する。成長因子は、特異的な細胞表面受容体に結合して活性化させ、細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。多くの成長因子受容体は、リガンド結合時に自己リン酸化を受ける受容体チロシンキナーゼとして分類される。自己リン酸化は、受容体が、SH2ドメインまたはSH3ドメイン(Src相同性領域2又は3)の存在で特徴付けられるシグナル伝達タンパク質と相互作用することを可能にする。これらタンパク質は次に、小さなGタンパク質(例えばRas、Rab、およびRho)の活性状態の調整を、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)、グアニンヌクレオチド放出タンパク質(GNRP)、および他のグアニンヌクレオチド交換因子と共に行う。小さなGタンパク質は、他の下流イベント(例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）のカスケード)を活性化する分子スイッチとして作用する。MAPキナーゼは最終的に、有糸分裂促進遺伝子の転写を活性化する。
【００７５】
成長因子に加え、小さなシグナル伝達ペプチドとホルモンも、細胞増殖に影響する。これら分子は主に他のクラスの受容体、即ち三量体のGタンパク質共役受容体(GPCR)に結合する。GPCRは、免疫細胞、神経細胞、および神経内分泌細胞の表面に主に見られる。リガンド結合時に、GPCRは三量体Gタンパク質を活性化し、Gタンパク質は次に、細胞内セカンドメッセンジャー（例えばホスホリパーゼC、Ca2+、およびサイクリックAMP）のレベル増加の引き金となる。大抵のGPCR仲介シグナル伝達経路では、直接の分裂促進効果を持つ他のシグナリング分子の分泌または分解を生じることによって間接的に細胞増殖を促進する。これらのシグナル伝達カスケードはしばしば、キナーゼとホスファターゼとの活性化を伴う。数種の成長因子(例えばトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）ファミリーの幾つかのメンバー)は、数種の細胞上では細胞増殖を刺激するよう作用し、他の細胞では増殖を阻害するよう作用する。成長因子はまた、或る細胞を或る濃度では刺激し、同じ細胞を他の濃度では阻害することがある。大抵の成長因子はまた、細胞成長と細胞分裂との調節以外に、多数の他の作用を持つ。それら因子は、状況に応じ、細胞の増殖、生存、分化、遊走、または機能を制御できる。例えば腫瘍壊死因子／神経成長因子（TNF/NGF）ファミリーは、細胞死を活性化または阻害でき、また、増殖と分化とを調節できる。細胞応答は、細胞のタイプ、細胞の分化のステージ、形質転換状態、どの表面受容体が刺激されるか、および、細胞に作用する刺激のタイプに依存する(Smith, A. 他(1994) Cell 76:959-962; およびNocentini, G. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221)。
【００７６】
組織内で隣接する細胞群は、成長因子について競合する。また、灌流した系内で「無限」量を提供されると、細胞分裂の密度依存性阻害に到達するまでに、一層高い細胞密度まで成長することとなる。細胞はしばしば、細胞分裂の足場依存性をも示す。この足場依存性は、細胞骨格を細胞外マトリクス(ECM)と連結する接着点（focal contacts）の形成に関連する可能性がある。ECM成分の発現は、成長因子によって刺激されうる。例えばTGF-βは、線維芽細胞を刺激し、種々のECMタンパク質(フィブロネクチン、コラーゲン、およびテネイシン等)を産生させる(Pearson, C.A. 他(1988) EMBO J. 7:2677-2981)。事実、数種の細胞タイプに特異的なECM分子(例えばラミニンまたはフィブロネクチン)は、成長因子として作用しうる。テネイシンCとテネイシンRとは発生期と罹患時との神経組織に発現され、刺激性／抗接着特性または阻害特性を各々、軸索成長に提供する(Faissner, A. (1997) Cell Tissue Res. 290:331-341)。
【００７７】
発癌遺伝子
癌は、正常な細胞遺伝子に由来する発癌遺伝子類の活性化を伴う。これら発癌遺伝子は腫瘍性タンパク質をコードし、このタンパク質が正常な細胞を悪性細胞に転換する。数種の腫瘍性タンパク質は正常タンパク質の突然変異アイソフォームであり、他の腫瘍性タンパク質は、発現の部位または量に関して異常に発現する。後者のカテゴリーの腫瘍性タンパク質は、細胞増殖の転写調節を変更することにより癌の原因となる。5クラスの腫瘍性タンパク質が、細胞周期制御に影響することが既知である。これらクラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質を含む。 ウイルス発癌遺伝子は、ヒト細胞が数種のウイルスに感染するとヒトゲノムに組込まれる。ウイルス発癌遺伝子の例としては、v-src、v-abl、およびv-fpsを含む。腫瘍と転移とに関わるタンパク質の過剰発現に関連する多くの症例が報告されている。Mta1遺伝子は、マウスでは、転移性腫瘍を示す細胞株と組織との双方においてクローン化されている(Simpson, A. 他(2001) Gene 273:29-39)。メラノーマ抗原コード遺伝子(MAGE)ファミリーのタンパク質の発現も、多くの腫瘍で検出されている。GAC1はロイシンリッチリピートスーパーファミリーの新規メンバーであり、悪性グリオーマでは増幅され過剰発現する(Almeida, A. 他(1998) Oncogene 16: 2997-3002)。
【００７８】
多くの発癌遺伝子が同定され特徴付けられている。発癌遺伝子としてはerbA、erbB、her-2、突然変異Gs、src、abl、ras、crk、jun、fos、myc、および突然変異した腫瘍抑制遺伝子(例えばRB、p53、mdm2、Cip1、p16、およびサイクリンD)を含む。正常遺伝子から発癌遺伝子への転換は、染色体転座によっても起こりうる。フィラデルフィア染色体は、慢性骨髄性白血病と、或るサブセットの急性リンパ芽球性白血病との特徴であり、これは、9番染色体と22番染色体との間の相互転座の結果である。この転座は、プロトオンコジーンc-ablの或る切り詰められた部分を、22番染色体のブレークポイント(切断点)クラスター領域(bcr)へ移動させる。
【００７９】
腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖の調節に関係する。腫瘍抑制遺伝子の機能を低減または喪失させる突然変異の結果、無制御な細胞増殖が起こる。例えば網膜芽腫遺伝子産物(RB)は、非リン酸化状態では、数種の早期応答遺伝子と結合し、それらの転写を抑制して、細胞分裂をブロックする。RBのリン酸化は、RBをこれら遺伝子から解離させ、抑制を解除し、細胞分裂を進行させる。
【００８０】
血管新生
血管新生は既存の血管から新しい毛細血管が形成されることによる過程である。これは胚形成時の正常組織の成長にとって、また腫瘍の病態的成長にとっても重要な機能である。ガン細胞の病態的増殖は血液循環へのアクセスなしには塊としての比例した増加が起こらなくなる。腫瘍は、血管新生刺激因子を上方制御することによって、また血管新生抑制因子を下方制御することによって、それ自体の循環系を形成する。転移が血管新生応答を誘発できない場合は休眠表現型となる。アンギオスタチン（angiostatin）は血管新生の循環抑制因子である。in vitroにおいてこれは内皮細胞遊走、増殖および管形成を抑制し、細胞型特異的な様式でアポトーシスを誘発する。angiomotin(アンギオモチン)は内皮細胞の遊走および管形成のアンギオスタチン阻害を媒介するアンギオスタチン結合ペプチドである。angiomotinは毛細血管およびヒト胎盤の大血管の内皮細胞に発現される。アンギオスタチンは内皮細胞におけるangiomotinの活性を妨げることによって細胞遊走を阻害する（Troyanovsky, B. 他(2001) J. Cｅｌl. Biol. 152:12471254）。
【００８１】
核小体タンパク質p120はG1期初期の細胞によって発現される増殖関連抗原であり、モノクローナル抗体FBによって同定される。これは極めて癌特異的である。実際、p120タンパク質の定量的免疫組織化学的分析は、口腔癌における臨床結果と危険グループの決定の評価に容易で信頼できる方法である(Ventura, L. 他(1999) Anticancer Res.19:1423-1426）。 P120は１つの塩基性ドメイン、１つの酸性ドメイン、１つの疎水性でメチオニンリッチなドメインを含み、１つのシステインおよびプロリン残基の多いドメインを含む(Fonagy, A. 他(1989) Cancer Commun. 1:243-251）。このタンパク質はG1期の初期に発現され、良性腫瘍および大部分の正常の休止組織には検出されない。Satoらは、腫瘍組織のP120の発現レベルを、摘出した肺腺癌の独立した、強力な予後徴候マーカーとして用いることができることを示している(Sato, G. 他 (1999) J. Clin. Oncol. 17:27212727)。
【００８２】
ヒトLGI1遺伝子は、T98Gグリア芽細胞腫株化細胞のt(10:19)ブレークポイントからクローンされたロイシンリッチで、リピート含有遺伝子である。LGI1遺伝子は悪性神経膠腫のピークLOH（ヘテロ接合性消失）のある領域の10q24にマップされ、脳腫瘍の低度から高度への移行時に不活性化される。マウスのlgil遺伝子は、ヒト遺伝子に対してアミノ酸レベルで97％の相同性があり、ヌクレオチドレベルで91%の相同性がある。LGI1は8個のエクソンを含んでおり、その４個のロイシンリッチリピートの各々が個別の72-bpエクソンに含まれている。そのロイシンリッチリピート（LRR）に隣接するシステインリッチ領域と一回膜貫通ドメインは個別のエクソンを占めない（Somerville, R.P. 他(2000) Mamm.Genome 11:622-627）。
【００８３】
ウイルス発癌遺伝子は、ヒト細胞が数種のウイルスに感染するとヒトゲノムに組込まれる。ウイルス発癌遺伝子の例としては、v-src、v-abl、およびv-fpsを含む。正常遺伝子の、発癌遺伝子への転換はまた、染色体転座によっても起こりうる。フィラデルフィア染色体は、慢性骨髄性白血病と、或るサブセットの急性リンパ芽球性白血病との特徴であり、これは、9番染色体と22番染色体との間の相互転座の結果である。この転座は、プロトオンコジーンc-ablの或る切り詰められた部分を、22番染色体のブレークポイント（切断点）クラスター領域(bcr)へ移動させる。ハイブリッドc-abl-bcr遺伝子がコードするキメラタンパク質は、チロシンキナーゼ活性を持つ。慢性骨髄性白血病では、このキメラ蛋白が持つ分子量は210 kdであり、急性白血病では、より活性な180 kdのチロシンキナーゼが形成される(Robbins, S.L. 他(1994) Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA)。
【００８４】
Rasスーパーファミリーの低分子量GTPアーゼは、広範な細胞シグナル経路の調節に関わる。Rasファミリー蛋白は膜結合タンパクであり、分子スイッチとして作用し、GTPとGDPとに結合し、GTPをGDPへ加水分解する。活性なGTP結合状態では、Rasファミリー蛋白は種々の細胞標的と相互作用し、下流シグナル経路を活性化する。例えばRasサブファミリーのメンバーは、受容体チロシンキナーゼ(RTK)から、一連のセリン/トレオニンキナーゼへのシグナル伝達に必須である。セリン/トレオニンキナーゼは細胞成長および分化を制御する。活性化したRas遺伝子は初めにヒトの癌で見出され、続いての研究は、細胞が成長を続けるか、最終分化に至るかの決定にRas機能が重要であることを確認した（Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827、Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-98）。突然変異Rasタンパク（GTPに結合するが加水分解しないRas）は恒久的に活性化されており、継続的細胞増殖または癌を起こす。
【００８５】
Rasファミリータンパクの活性化の触媒はグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)が行い、GEFは、結合したGDPの解離と、その後のGTPの結合とを触媒する。最近発見されたRalGEF様タンパクであるRGL3は、Rasと近縁タンパクRitの双方と相互作用する。構成的に活性なRitは、Ras同様、癌原性転換を誘発しうるが、Ritは大抵の既知Rasエフェクター蛋白と相互作用しないので、新規な細胞標的が、Rit転換活性に関わる可能性がある。RGL3はRasとRitの双方と相互作用するので、これらタンパク質の下流エフェクターとして作用する可能性がある(Shao, H.およびD.A. Andres(2000) J. Biol. Chem. 275:26914-26924)。
【００８６】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は細胞表面分子であり、腫瘍細胞では非腫瘍組織と異なる発現をする。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を免疫的に正常細胞と異なるものとし、ヒトの癌での潜在的診断材料である。数種のモノクローナル抗体が、癌細胞と特異的に反応することが同定された(例えばT細胞急性リンパ芽球白血病および神経芽腫)(Minegishi, M. 他(1989) Leukemia Res.13:43-51; Takagi 他(1995) Int. J. Cancer 61:706-715)。また、HER2遺伝子の、乳腺腫瘍での高レベル発現の発見は、治療処置の開発につながった(Liu , E. 他(1992) Oncogene 7:1027-1032、Kern, J.A. (1993) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:448-454)。腫瘍抗原は細胞表面に見られ、特徴は、膜タンパクまたは糖タンパクであることである。例えばMAGE遺伝子は、自家細胞溶解性Tリンパ球によってメラノーマ細胞表面で認識される、腫瘍抗原ファミリーをコードする。単離された１2種のヒトMAGE遺伝子の内、半分は、種々の組織学タイプの腫瘍で差次的に発現される(De Plaen , E. 他(1994) Immunogenetics 40:360-369)。しかし、12種のMAGE遺伝子のいずれもが、健常組織では精巣と胎盤と以外では発現されない。
【００８７】
腫瘍抑制因子
腫瘍抑制遺伝子の一般的定義は、遺伝エレメントであってその喪失または不活化が、細胞増殖の調節解除と、癌の発生機序と進行とに寄与する要素である。腫瘍抑制遺伝子の正常な機能は、ストレスに応じて細胞成長を制御または阻害し、細胞の増殖寿命を限定することである。数種の腫瘍抑制遺伝子が同定されており、これには網膜芽腫(Rb)タンパク、p53、並びに乳癌1および2タンパク(BRCA1およびBRCA2)をコードする遺伝子を含む。これら遺伝子の突然変異は、数種の癌の発症への、後天性および先天性の遺伝素因と関連する。
【００８８】
p53の、癌の発生機序における役割は、広範に研究されている(概説はAggarwal, M. L. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:1-4、Levine, A. (1997) Cell 88:323-331)。全てのヒト癌の約50％は、p53遺伝子の突然変異を含む。これら突然変異の結果、機能的p53の不在や、より多くは、過剰発現される欠損型のp53を生じる。p53は転写因子であり、DNA結合に必要な中心コアドメインを持つ。p53での大抵の癌関連突然変異は、このドメインに局在する。正常な増殖細胞では、p53は発現が低レベルであり、迅速に分解される。p53の発現と活性との誘発は、DNA損傷、失敗に終わる有糸分裂、その他のストレス性の刺激に応じて起こる。これらの場合、p53はアポトーシスを誘発させ又は、ストレスが除去されるまで細胞成長を停止させる。p53活性の下流エフェクターは、アポトーシス特異的タンパクおよび細胞周期調節タンパク質（例えばRb）、発癌遺伝子産物、サイクリン、および細胞周期依存キナーゼなどを含む。
【００８９】
新規の候補癌抑制遺伝子、LGI1 (leucine-rich gene-glioma inactivated)は、ポジショナルクローニング法を用いてグリア芽細胞腫多形腫瘍で同定された(Chernova, O.B. 他(1998) 17:2873-2881)。グリア芽細胞腫多形は、豊富な血管新生活性と１０番染色体における癌抑制遺伝子の喪失を特徴とする。ヒトLGI1 遺伝子は、T98G グリア芽細胞腫細胞系のt(10;19) ブレークポイントからクローン化されたロイシンリッチのリピート含有遺伝子である(Somerville, R.P.T., 他 (2000) Mammalian Genome 11:622-627)。もっと厳密には、LGI1 は10q24 領域に局在しており、そのグリア腫瘍との関連はt(10;19) (q24;q13) 転座の結果であると思われる。LGI1 遺伝子は60kD の分子量のタンパク質をコードし、3.5ロイシンリッチリピート(LRR)を含む。
【００９０】
転移抑制遺伝子であるKAI1（CD82）は、腫瘍抑制遺伝子p53に近縁であるとの報告がある。KAI1は、その発現の低下時に、ヒト前立腺癌の進行、また、おそらく肺癌と乳癌との進行に関わる。KAI1は、構造的に特有な、白血球表面糖タンパク質のファミリーのメンバーをコードする。このファミリーは、膜４回貫通型タンパク質ファミリーまたは膜貫通4スーパーファミリー(TM4SF)として知られる。理由は、このファミリーのメンバーが、形質膜を4回貫通するからである。このファミリーは、膜内在性タンパクからなる。これらはN末端膜アンカードメインを持ち、この機能は、膜アンカーとして、また、タンパク生合成時の移行シグナルとしてのものである。N末端膜アンカードメインは、生合成時に切断されない。TM4SFタンパクは、3つの更なる膜貫通領域群、7個以上の保存システイン残基を持ち、同様のサイズであり(218〜284残基)、全てが、大きな細胞外親水性ドメイン（3つの潜在的Nグリコシル化部位を持つ）を有する。プロモーター領域には種々の転写因子の、多くの推定結合モチーフを持ち、5つのAP2部位と、９つのSpI部位を含む。KAI1と7種の他のTM4SFメンバーとの遺伝子構造比較が示すところでは、予測されたタンパクの種々の構造ドメインに関連したスプライス部位が保存されている。これが示唆するところでは、これら遺伝子は進化的に近縁で、遺伝子重複および分岐進化で生じた(Levy, S. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:14597-14602、Dong, J.T. 他(1995) Science 268:884-886、Dong, J.T. 他 (1997) Genomics 41:25-32)。
【００９１】
ロイシンリッチ遺伝子グリオーマ不活化(LGI1)タンパクは、受容体および接着タンパクとして機能する多数の膜貫通および細胞外タンパクとの相同性を共有する。LGI1は或るLRR(ロイシンリッチリピート含有)遺伝子によってコードされ、10q24にマップする。LGI1は4つのLRR(システインリッチ領域に隣接)と、1つの膜貫通ドメインとを持つ(Somerville, R.P.、 他(2000) Mamm.Genome 11:622-627)。LGI1発現は、主に神経組織、特に脳で見られる。腫瘍抑制作用の喪失は、LGI1タンパクの不活化で見られ、これは、悪性グリオーマの、低から高グレードの腫瘍の移行時に起こる。LGI1発現の、低グレード脳腫瘍での低下と、悪性グリオーマでの発現の顕著な低下または不在とが示唆するところでは、LGI1は、グリア腫瘍進行の診断に用い得る(Chernova, O.B., 他(1998) Oncogene 17: 2873-2881)。
【００９２】
ST13腫瘍抑制因子の同定は、正常な粘膜組織のcDNAと、結腸直腸癌組織のmRNAとの間のサブトラクションハイブリダイゼーションで、結腸直腸癌に関する因子のスクリーニングで成された(Cao, J. 他(1997) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123:447-451)。ST13は、ヒト結腸直腸癌で下方制御される。
【００９３】
von Hippel-Lindau (フォン・ヒッペル・リンドウ、VHL)腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、網膜および中枢神経系の血管芽腫、明細胞腎癌、および褐色細胞腫に関わる(Hoffman, M. 他 (2001) Hum. Mol. Genet. 10:1019-1027; Kamada, M. (2001) Cancer Res.61:4184-4189）。腫瘍進行は、VHL遺伝子の欠損または不活化に関連付けられる。VHLはトランスフォーミング成長因子α、GLUT-1グルコース輸送体、および血管内皮成長因子の発現を調節する。VHLタンパクは、elongin B、elongin C、Cul2およびRbx1と会合して複合体を形成し、転写アクチベーターである低酸素誘導因子(HIF)を調節する。HIFは血管新生に関わる遺伝子（例えば血管内皮成長因子と血小板由来成長因子B）を誘導する。HIFの制御の喪失はVHLの欠損に起因し、その結果、血管新生ペプチドの過剰な産生を生じる。VHLは、血管新生の阻害、細胞周期制御、フィブロネクチンマトリックスアセンブリ、細胞接着、並びにタンパク分解において役割を果たしうる。
【００９４】
腫瘍抑制遺伝子の突然変異は多くの癌の一般的特徴であり、しばしば、腫瘍の発生機序と進行との決定的ステップに影響するようである。したがって、Chang, F. 他(1995; J. Clin. Oncol. 13: 1009-1022) は、この遺伝子または発現されたタンパク質に対する抗体の何れかを、1)癌のリスクの高い患者のスクリーニング、2)従来の方法によって行われる診断を補助するため、3)個々の癌患者の予後の評価に用いることが可能であることを示唆する。また、Hamada, K 他(1996; Cancer Res.56:3047-3054)は、アデノウイルスベクターを介しての、子宮頚癌細胞へのp53の導入を、子宮頚癌の実験的治療として試験中である。
【００９５】
PRドメイン遺伝子は最近、ヒト腫瘍化で役割を果たすことが認識された。PRドメイン遺伝子は通常、2つのタンパク質産物、つまり、PRドメインを持つPRプラス産物とPRドメインを持たないPRマイナス産物を産生する。癌細胞では、PRプラスは破壊または過剰発現され、PRマイナスは存在または過剰発現する。これら2種のタンパク質の量の不均衡は、悪性疾患の重要な一因の様である(Jiang, G.L.および S. Huang(2000) Histol. Histopathol. 15:109-117)。
【００９６】
ヒトにおける多くの腫瘍疾患は、不適切な遺伝子転写によって起こり得る。悪性の細胞成長は、腫瘍促進遺伝子の過剰な発現又は、腫瘍抑制遺伝子の不十分な発現によって起こり得る（Cleary, M. L. (1992) Cancer Surv. 15:89-104）。染色体転座によっても、或る遺伝子のコード配列を別の無関係遺伝子の調節領域と融合させる、キメラ座（chimeric loci）が生じ得る。或る重要なクラスの転写調節因子が、Znフィンガー蛋白である。 Znフィンガーモチーフは亜鉛イオンに結合する。このモチーフは一般に、周期的に配置されたシステイン残基とヒスチジン残基からなる約３０アミノ酸のタンデムリピート群を持つ。この配列パターンの例には C2H2タイプ、 C4-タイプおよび C3HC4タイプの亜鉛フィンガー と PHD ドメインがある (Lewin, B. (1990) Genes IV, Oxford University Press, New York, NY, および Cell Press, Cambridge, MA、554-570ページ; Aasland, R.、他(1995) Trends Biochem. Sci. 20:56-59)。臨床的に関連するZnフィンガータンパク質の一つがWT1であるが、これはウィルムス腫瘍を持つ子供において不活性化されている腫瘍抑制タンパク質である。大細胞リンパ腫で重要な役割を果たすオンコジーンbcl-6もZnフィンガー蛋白質である(Papavassiliou, A.G. (1995) N. Engl. J. Med. 332:45-47)。
【００９７】
腫瘍応答タンパク質
癌(別称は新形成)の特徴は、継続的で無制御な細胞増殖である。癌は三つのカテゴリー、つまり、癌、肉腫および白血病に分けられる。癌腫は柔らかい上皮細胞の悪性成長であり、周辺組織を浸潤し、転移性腫瘍を生じうる。肉腫は、上皮起源のものや、結合組織に起因するものがある。白血病は造血組織の進行性悪性疾患であり、特徴は、白血球とその前駆体との増殖であり、骨髄性(顆粒球または単球に由来)或いはリンパ球性(リンパ球に由来)に分類されうる。腫瘍化とは、腫瘍の発端からの成長の進行を指す。悪性細胞は、起源の組織内の正常な細胞に極めて類似のものや、未分化(低分化)なものがある。腫瘍細胞は、核が無いか、１個の大きな多形核を持ちうる。未分化細胞は、無秩序な塊に成長しうる。塊は血管化が乏しく、その結果、大きな領域が虚血壊死となっている。分化した新生物性細胞は、起源の組織と同じタンパク質を分泌しうる。癌は成長し、周辺組織に浸潤し、侵襲し、破壊する。これは、体腔または体表への直接播種によって、リンパ性転移によって、または血行性転移によって成される。癌は、主要な公衆保健の関心事であり続けており、現行の予防策と治療とは、大半の患者の要求を満たしていない。腫瘍化の新形成プロセスの理解は、予後的および診断的重要性を持つ分子マーカー群の同定によって補助されうる。
【００９８】
癌治療の現行の形態としては、免疫抑制剤の使用を含む(Morisaki, T. 他(2000) Anticancer Res.3363-3373、Geoerger, B. 他(2001) Cancer Res.61:1527-1532）。 細胞シグナリングに関わるタンパク質の同定は、また特に、免疫抑制剤の受容体として作用するタンパク質の同定は、抗腫瘍剤の開発を促進しうる。例えばイムノフィリンは、原核生物と真核生物との双方に見られる保存されたタンパク質の1ファミリーであり、免疫抑制剤に、異なる程度の特異性で結合する。このようなimmunophilicタンパク質の1グループが、ペプチジル-プロリルシス−トランス異性化酵素(EC 5.2.1.8)ファミリー（PPIアーゼ、rotamase）である。初めにブタ腎臓皮質から単離されたこれら酵素は、タンパク折り畳みの加速を、オリゴペプチド内のプロリンイミドペプチド結合のシス-トランス異性化を触媒することによって行う(Fischer, G. および Schmid, F.X. (1990) Biochemistry 29: 2205-2212)。イムノフィリンファミリーには、シクロフィリン（例えばペプチジル-プロリル異性化酵素A、即ちPPIA）とFK結合タンパク(即ちFKBP)とのサブファミリーを含む。シクロフィリンは多機能レセプター蛋白であり、これは、シグナル伝達活性(例えばシクロスポリンが媒介する伝達)に関わる。各ファミリーのPPIアーゼドメインは、種の間で高度に保存される。構造的には異なるが、これら多機能レセプター蛋白は、多数のシグナル伝達系路に関わる。また、折り畳みイベントと輸送イベントとに関連付けられている。
【００９９】
イムノフィリンタンパク質であるシクロフィリンは、免疫抑制剤であるシクロスポリンAと結合する。FKBPは別のイムノフィリンであり、FK506(またはラパマイシン)と結合する。ラパマイシンは免疫抑制剤であり、細胞を成長のG1期で停止させ、アポトーシスを誘発する。シクロフィリン同様、このマクロライド抗生物質(放線菌(Streptomyces tsukubaensis)によって産生される)の作用は、遍在性で主にサイトゾル性のイムノフィリン受容体に結合して成される。これらイムノフィリン／免疫抑制剤複合体(例えばシクロフィリンA／シクロスポリンA(CypA/CsA)、およびFKBP12/FK506)は、その治療成績の達成を、ホスファターゼであるカルシニューリン(カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼであり、T細胞活性化に関与)を阻害して行う(Hamilton, G.S. および Steiner, J.P. (1998) J. Med. Chem. 41: 5119-5143)。ネズミfkbp51遺伝子の豊富な発現は、免疫組織(例えば胸腺およびTリンパ球)に見られる(Baughman, G. 他(1995) Molec. Cell. Biol. 15: 4395-4402)。FKBP12/ラパマイシン指示型免疫抑制は、TOR(酵母)またはFRAP(FKBP12-ラパマイシン会合タンパク、哺乳類細胞内)に結合して起きる。これらはラパマイシンのキナーゼ標的であり、正常な細胞成長パターンの維持に必須である。機能障害性のあるTORシグナリル伝達は、種々のヒト疾患(癌など)に関連付けられている(Metcalfe, S.M. 他(1997) Oncogene 15:1635-1642; Emami, S. 他(2001) FASEB J. 15:351-361)。また、自己免疫にも関連付けられている(Damoiseaux, J.G. 他(1996) Transplantation 62:994-1001)。
【０１００】
数種のシクロフィリンイソ酵素が同定されている。例えばシクロフィリンB、シクロフィリンC、ミトコンドリアのマトリクスシクロフィリン、細菌のサイトゾルおよびペリプラズムPPIアーゼ、並びに、ナチュラルキラー細胞シクロフィリン関連タンパク(シクロフィリン型PPIアーゼドメインを持ち、推定上の腫瘍認識複合体であり、ナチュラルキラー(NK)細胞の機能に関与)を含む。これら細胞は、ウイルス感染細胞や癌化細胞を溶解することにより、生得的な細胞免疫応答に関与する。NK細胞の特異的標的細胞は、主要組織適合複合体(MHC)クラスI遺伝子の発現を喪失(腫瘍化時に一般的に発生)した細胞であり、この標的化によって、細胞に腫瘍成長減弱の可能性を与える。150-kDaの分子の同定が、ヒトNK細胞の表面で成されている。この分子が持つ或るドメインは、シクロフィリン/ペプチジル-プロリルシス-トランス異性化酵素に高度に相同である。このシクロフィリン型タンパクは、推定上の腫瘍認識複合体であるNK腫瘍認識配列(NK-TR：NK tumor recognition sequence )の成分でありうる(Anderson, S.K. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:542-546)。NKTR腫瘍認識配列は、腫瘍細胞と、大顆粒リンパ球（LGL）との間の認識を媒介する。LGLは白血球の亜集団であり、活性化した細胞障害性T細胞とナチュラルキラー細胞とからなり、腫瘍標的を破壊できる。NKTR遺伝子のタンパク産物はLGLの表面に見られ、腫瘍標的への結合を促進する。最近、マウスNktr遺伝子とプロモーター領域とが、9番染色体に位置づけられた。この遺伝子は、NK細胞特異的150-kDaタンパク質(NK-TR)をコードする。これは、シクロフィリン他の腫瘍応答タンパク質に相同である(Simons-Evelyn, M.他(1997) Genomics 40:94-100)。
【０１０１】
腫瘍化組織と相互作用する他のタンパクとしては、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子(TNF)を含む。TNFファミリーのサイトカインの産生はリンパ球とマクロファージとが行い、TNFは、癌化した（腫瘍）内皮細胞の溶解を生じうる。内皮タンパク1(Edp1)が、TNFαによって内皮細胞で転写的に活性化されるヒト遺伝子として同定されている。また、TNFα誘導可能Edp1遺伝子が、マウスで同定されている(Swift, S. 他(1998) Biochim. Biophys. Acta 1442: 394-398)。
【０１０２】
クリスタリンは、脊椎動物の眼の水晶体の安定な、長期生存性の構造タンパク質である。これらの構造および相互作用は水晶体の透明性に関与している。タンパク質への小さい変化の漸進的蓄積によって老化による白内障を生じる。この水晶体は二つのスーパファミリ（αおよびβγクリスタリン）から形成される。この両方のスーパファミリのタンパク質は１つの塩基性ベータシートドメイン折り畳みを有し、2つ挿入グリークキー（intercalating Greek keys）からできたベータガンマドメインを有する。アルファ、ベータおよびガンマの三つのタイプのクリスタリンタンパク質は、各々種々のサブユニット群からなる( Slingsby, C. および Clout, N.J.(1999) Eye 13:395402; Carver, J.A. (1999) Prog. Retin. Eye Res. 18:431462; および Graw, J. (1997) Biol. Chem. 378:13311348)。いくつかのクリスタリンは眼の外で発見されている。ベータガンマクリスタリン スーパファミリの非水晶体メンバーであるAIM1は、ヒトの悪性黒色腫における腫瘍形成能の制御に関連する。AIM1 は主に非水晶体の役割りを持つベータガンマスーパファミリの哺乳類メンバーである。AIM1 は６番染色体上の悪性黒色腫の推定抑制因子のある候補であり、おそらくは細胞骨格との相互作用によってその作用を及ぼすと考えられる(Ray, M.E. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94:3229-3234)。
【０１０３】
精子形成関連因子 (SPAF) は早期の精子形成および悪性変換に特異的なAAAタンパク質(多様な活性と関連するATP分解酵素)である。SPAF は精細管の基底区画における精原細胞と初期精母細胞に発現される(Liu, Y. 他(2000) Oncogene 19:15791588)。
【０１０４】
DICE1 はヒト染色体13q14上の癌抑制部位（tumor suppressor locus）であり、これはマウスEGF リピート膜貫通タンパク質DBI-1のカルボキシ末端の半分に類似の100kDタンパク質をコードする。DICE1タンパク質は、多様な胎児組織と成人組織で発現される。DBI1 はインスリン様成長因子１(IGFI) に対する分裂促進的応答を妨げ、足場依存性成長に関与していると考えられる。DICE1 タンパク質の発現は、分析された多くの非小細胞肺癌において減少しており、検出できない(Wieland, I. (1999) Oncogene 18:45304537)。
【０１０５】
Disintegrins (ディスインテグリン)は、糖タンパク質Iib-IIIa 複合体に発現される血小板受容体とのフィブリノーゲンの相互作用を阻害するタンパク質である。これらは血小板表面上のインテグリン糖タンパク質IIb-IIIa 受容体に結合することによって作用し、ADP,トロンビン、血小板活性化因子およびコラーゲンによって誘発される凝集を阻害する。ディスインテグリンは約７０のアミノ酸残基のペプチドであり、これはジスルフィド結合に関与する多くのシステインを含んでいる(Williams, J. 他 (1990) Biochim. Biophys. Acta 1039:81-89; Dennis, M.S. 他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2471-2475)。
【０１０６】
発現プロファイル作成
マイクロアレイは、生体分析で用いられる分析ツ−ルである。マイクロアレイは複数の分子をを有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、そして/あるいは抗体のマイクロアレイが開発されており、その種々の用途には遺伝子シークエンシング、遺伝子発現のモニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、薬剤発見、コンビナトリアルケミストリがある。
【０１０７】
特にマイクロアレイの使用として見出された1つの分野は、遺伝子発現分析である。 アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【０１０８】
例えば、マイクロアレイ分析を用いて、白血病細胞と較べた正常リンパ球でのポリヌクレオチドの相対的発現レベルを測定することができる。ジャーカット細胞はヒト白血病における遺伝子発現を研究するために広く用いられている急性T細胞白血病細胞株である。ジャーカット細胞のPMA(プロテインキナーゼC依存性経路の広範囲活性化因子)とイオノマイシン(カルシウムの細胞への流入を可能にするカルシウムイオノフォア)で処理すると、主要シグナル伝達経路の2つを活性化する。この主要シグナル伝達経路は哺乳類細胞が環境と相互作用し、また至適B細胞活性化中に誘発される二次的シグナル伝達現象の型を模倣するために用いる。ジャーカット細胞のPMAおよびイオノマイシンによる処理の前後のポリヌクレオチドの発現レベルをモニターすることは、T細胞の活性化に関与するｃDNAの同定に役立つ。
【０１０９】
肺癌
肺癌は米国における癌死亡の主要原因であり、毎年10万人以上の男性および5万人以上の女性がこの影響を受けている。肺癌と診断された患者の殆ど90%が喫煙者である。タバコの煙には暴露された気管支上皮において発癌物質代謝酵素および共有結合性DNA付加体形成を誘発する有害物質がたくさん含まれている。気管支上皮をタバコの煙に曝露すると組織形態が変化するようであり、それが癌の前兆であると考えられている。大部分の肺癌は胸膜、脳、骨、心膜、および肝臓に移転する。手術、放射線療法、あるいは化学療法を行うかの決定は、腫瘍組織学、成長因子またはホルモン応答および阻害剤または薬物への感受性に基づいてなされる。現在の治療では大部分の患者が診断の一年以内に死亡する。肺癌の早期診断、および同定、病期および治療に対する系統的アプローチは患者への結果をポジティブなものにし得る。
【０１１０】
肺癌は、過形成から侵襲性癌への一連の形態学的に固有の段階を通して進行する。悪性の肺癌は四つの組織病理学的なクラスからなる２つのグループに分かれる。非小細胞肺癌（Ｎon Small Cell Lung Carcinoma：NSCLC）群は扁平上皮細胞癌、腺癌および大細胞癌を含み、すべての肺癌症例の約70%を占める。腺癌は通常、末梢気道に生じ、ムチン分泌腺を形成する。扁平上皮細胞癌は一般に、近位気道に発症する。扁平上皮細胞癌の組織形成は慢性炎症と、気管支上皮の損傷に関連し、扁平〔上皮〕化生につながる。肺小細胞癌（Small Cell Lung Carcinoma ：SCLC) 群は肺癌症例の約20%を占める。SCLCは一般的に近位の気道に発症し、副腎皮質刺激ホルモンおよび抗利尿ホルモンの不適切な産生などの多くの腫瘍随伴症候群を示す。
【０１１１】
肺癌細胞は多くの遺伝的病変を蓄積し、その多くは、細胞学的に明らかな染色体異常を伴う。肺癌に随伴する染色体欠失の頻度が高いことはこの疾患の病因において複数の癌抑制遺伝子座の関与を示し得る。３番染色体の短腕の欠失は症例の90%以上に見られ、肺癌につながる最も早期の遺伝子病変の一つを示す。染色体の９pおよび17pの短腕における欠失もまた一般的である。 その他のしばしば見られる遺伝的病変にはテロメラーゼの過剰発現、Kras やcmycなどの発癌遺伝子の活性化、またRB、 p53 および CDKN2のような癌抑制遺伝子の不活性化がある。
【０１１２】
肺癌において差次的に制御される遺伝子が種々の方法によって同定されている。
【０１１３】
mRNAディファレンシャルディスプレイ技術を用いて、Manda, R.他 (1999; Genomics 51:5-14) は正常気管支上皮細胞に比べて肺癌細胞株に差次的に発現される５つの遺伝子を同定した。既知の遺伝子の内で、肺サーファクタント アポプロテインAおよびアルファ２マクログロブリンは下方制御され、他方、nm23H1は上方制御された。Petersen, S. 他(2000; Int J. Cancer, 86:512-517) はサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて、肺腫瘍由来細胞系に差次的に発現された552のクローンを同定した。その中の205は既知の遺伝子を示した。既知の遺伝子の間で、トロンボスポンジン1、フィブロネクチン、細胞間接着分子1およびサイトケラチン6と18は肺癌において差次的に発現されることが以前に観察されていた。Wang, T. 他(2000; Oncogene 19:1519-1528) はマイクロアレイ解析とサブトラクティブハイブリダイゼーションを併用して正常肺上皮と比べて扁平細胞癌に差次的に過剰発現された17の遺伝子を同定した。彼らが同定した既知の遺伝子の中には、ケラチンアイソフォーム6、KOC、SPRC、IGFb2, コネキシン 26、 plakofillin 1 およびサイトケラチン 13があった。
【０１１４】
乳癌
180,000例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(Gish, K. (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率は極めて高い(97％)。これに対して、病期が進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752）。
【０１１５】
2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が女性乳癌の大きな素因となることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし、このタイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約5％〜9％であり、大多数の乳癌の原因は非遺伝性突然変異であり、乳腺上皮細胞での変異である。
【０１１６】
上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている(Khazaie, K. 他(1993) Cancer and Metastasis Rev. 12:255-274とその中の参照文献に、この分野が概説されている）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方制御と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇するので、EGFRが腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それはEGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリー（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu, HER-3およびHER-4）およびそれらのリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, S. S. 他(1994) Am. J. Clin. Pathol. 102:S13-S24)。別の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzled protein mRNA（乳腺腫瘍では下方調節される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方調節）、およびCaN19（S100蛋白ファミリーのメンバーであり、このファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方調節される）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int. J. Cancer 78:95-99; Chen, L. 他(1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix, W. et al (1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R. 他(1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213:51-64;およびLee, S. W. 他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2504-2508)。
【０１１７】
種々の病期のヒト乳癌の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を、長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin.Cancer Res.4:2931-2938）。こうしたモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、悪性転換の種々の病期で比較する場合である。
【０１１８】
前立腺癌
前立腺癌は50歳以上の男性に多い悪性疾患であり、罹患率は年齢と共に増える。米国では毎年、約13万2千の新規診断前立腺癌症例があり、3万3千人が前立腺癌で死亡する。
【０１１９】
前立腺に癌細胞が生じると、テストステロンの刺激で、より速く成長する。したがって精巣を除去すれば、癌の急速な成長と転移との双方を、間接的に低減できる。95パーセント以上の前立腺癌は、起源が前立腺腺房の腺癌である。残る5％の分類は扁平上皮細胞癌と移行上皮細胞癌とがあり、どちらも前立腺管または前立腺の他の部位に生じる。
【０１２０】
大抵の癌と同様、前立腺癌の発達は多段階で進行し、最終的な結果は攻撃的な転移性表現型である。腫瘍進行の初期段階には正常な管腔上皮および/または基底上皮細胞の過剰増殖を伴い、これが過形成となり早期腫瘍に進む。早期腫瘍は前立腺に限局するが、最終的に、特に骨、脳、または肺へ転移する場合がある。これら腫瘍の約80％はアンドロゲン治療に依然として応答する。この重要なホルモンは前立腺上皮細胞の成長を制御する。しかし最も進行した状態の癌成長はアンドロゲン非依存的になり、現在この病状に既知の治療法は無い。
【０１２１】
前立腺の一次診断マーカーは前立腺特異抗原(PSA)である。PSAは組織特異的セリンプロテアーゼであり、ほぼ限定的に前立腺上皮細胞が産生する。PSA量は前立腺上皮細胞の数量と相関するので、PSAレベルは異常な前立腺成長の優れた指標である。前立腺癌男性のPSAレベルは早期に線形的に上昇した後、指数関数的に上昇し、診断がつく。しかしPSAレベルはまた炎症やアンドロゲンその他の成長因子などの因子にも影響されるので、一部の科学者は依然、PSAレベルの変化は個々の前立腺癌症例の検出に有用でないとする。
【０１２２】
現在の癌研究領域は前立腺癌の更なる有望なマーカーと潜在的治療標的を提供する。数種の成長因子は、腫瘍の発生、成長、進行に重要な役割を果たすことを示している。成長因子である上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)および腫瘍成長因子α(TGFα)は正常および過剰増殖の前立腺上皮細胞の成長に、特に早期の腫瘍発生および腫瘍進行に重要であり、また、これら細胞のシグナル経路に様々に影響する(Lin J 他(1999) Cancer Res. 59:2891-2897; Putz T 他(1999) Cancer Res 59:227-233)。TGFβファミリーの成長因子は一般にヒト癌で発現レベルが上昇し、高レベル発現は多くの場合、進行した病期の悪性腫瘍と患者の不良な生存度とに相関する(Gold LI (1999) Crit Rev Oncog 10:303-360)。最後に、ヒト細胞株にはアンドロゲン依存期の前立腺癌を示す株(LNCap)とアンドロゲン非依存性でホルモン不応期の前立腺癌株(PC3とDU-145)があり、前立腺癌進行に伴う遺伝子発現パターンや、これら発現した遺伝子への細胞治療（cell treatments）の効果の研究に有用との実証がある(Chung TD (1999) Prostate 15:199-207)。
【０１２３】
白血病
白血病は四つの主なカテゴリーに分類され、そのすべてが多能性の幹細胞の悪性変換に関与する。急性白血病（急性リンパ芽球性白血病(ALL) および急性骨髄性白血病(AML)の両者）は血液中の未熟細胞の存在によって特徴付けられる。慢性白血病（慢性リンパ性白血病(CLL)および慢性骨髄性白血病(CML)の両者）は、成熟し分化した細胞に関連するが、各々の細胞タイプの比率は異常である。例えば、CLL患者は通常B細胞リンパ球のクローン増殖を有する。CML患者はしばしば、血液、骨髄および他の臓器においてすべての段階の成熟度の顆粒球を有する。B細胞特異モノクローナル抗体およびT細胞特異モノクローナル抗体は組織学的分析および診断ツールとして役立つ。正常な造血骨髄が悪性細胞によって置き換わるにつれて疾患は進行する。ある症例においては原因は遺伝性であるとされるが、また他の場合には、化学的、あるいは放射線的に誘発された場合もある。
【０１２４】
加齢および老化
加齢プロセスまたは老化の研究は、多数の特徴的な細胞性変化と分子変化とを示している(Fauci 他(1998) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY, 37ページ)。これら特徴としては、増加した染色体構造異常、DNA架橋、DNAの一本鎖切断の発生、DNAメチル化の喪失、およびテロメア領域の分解を含む。これらDNA変化に加え、蛋白の翻訳後変容が増し、これには脱アミド化、酸化、架橋、および非酵素的糖付加を含む。尚一層の分子変化の発生が、加齢細胞のミトコンドリアに、構造の劣化を通して起こる。これらの変化は最終的に、身体の各器官の機能低下に寄与する。
アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、アミロイドβペプチドを含有する、老人斑と神経原線維変化との形成である。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。アルツハイマーの病理の早期には、生理変化が帯状皮質で見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。
【０１２５】
樹状細胞分化において制御される遺伝子
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロフィールを試験するときは、アレイは次のような試験を行うプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、ハウスキーピング機能を行うか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの試験である。
【０１２６】
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、細胞発生時の系統差の特徴化に関連し、疾患の、診断、予後診断、および治療を向上させる。例えば、自己免疫患者由来の樹状細胞に発現されるレベルと配列との双方を、健常者の樹状細胞に発現されるレベルおよび配列と比較しうる。
【０１２７】
樹状細胞(DC)は抗原提示細胞(APC)であり、一次免疫応答で主要な役割を果たす理由は、DCが抗原を未刺激（naive）T細胞に提示する独特の能力にある。またDCは、抗原との初回接触後の免疫応答を維持し調節する別々のサブセットへ分化する。DCサブセットとしては、特定のTヘルパー1(Th1)応答またはTヘルパー2(Th2)応答を優先的に誘導するDCや、B細胞応答を調節するDCがある。また免疫応答を操作する為にDCを使用することが増えている。免疫応答を操作する目的は、異常な自己免疫応答の下方制御、または、ワクチン接種ないし腫瘍特異応答の増強である。
【０１２８】
DCは、特定の分化状態と相関して、機能的に特化している。CD34+骨髄性細胞は骨髄に見られ、今のところ不明瞭なシグナルに応答してCD14+ CD11c+単球へ成熟する。生得的応答、即ち抗原非特異的応答は、まず、単球が非リンパ組織へ循環し、細菌由来マイトジェンであるリポ多糖(LPS)およびウイルスに応答したときに起きる。抗原との、こうした直接遭遇はプロ炎症性サイトカインの分泌を生じ、侵入する病原体の防衛の第一線で、ナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび好酸球をこれらのサイトカインが誘引し制御する。単球は次にDCへ成熟し、これがエンドサイトーシスと抗原受容体取込とを介して抗原を非常に効率的に捕獲する。抗原プロセシングと抗原提示とが活性化と成熟DCへの分化を誘起し、この成熟DCがMHCクラスII分子を細胞表面で発現しT細胞を効率的に活性化し、抗原特異的なT細胞応答とB細胞応答とを惹起する。次に、T細胞がCD40リガンド‐CD40相互作用を介してDCを活性化し、これは共刺激分子であるCD80とCD86との発現を刺激する。CD86は、最も強力にT細胞応答を増幅する。CD40を介したDCのT細胞との相互作用はまた炎症サイトカイン（例えばTNFαやIL-1）の産生をも刺激する。TNF受容体ファミリーのメンバーであるRANKと、RANKリガンドであり活性化したT細胞上で発現されるTRANCEとの結合は、アポトーシスを阻害してDCの生存を増強し、したがってT細胞活性化を増強する。単球の成熟と成熟DCへの分化とは、抗原非特異的生得的免疫反応を、抗原特異的適応的免疫反応に連結する。
【０１２９】
単球がin vivoにおいて未熟樹状細胞に分化することによる過程は十分明らかにされていない。in vitroで単球を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とインターロイキン(IL)でインキュベートすると、in vivoで見られた未熟樹状細胞と同等の機能的および形態学的特徴を示す細胞を生じる。さらに、未熟樹状細胞をin vitroで腫瘍壊死因子α(TNF-?a)、CD40 リガンド、 LPSまたは単球馴化培地(ならし培養液)でインキュベートすると、未刺激(na・e)T細胞の強力な活性化因子である成熟樹状細胞を生じる。 in vitroにおいてDCを操作できること、および少数のDCとわずかの抗原で効果的な免疫応答を組み込める能力は、癌、エイズおよび感染症のような疾患の免疫療法の可能性や、ワクチン効力の向上につながる。腎細胞癌や黒色腫のような特定の癌の自然寛解は免疫系が腫瘍抗原に応答し、腫瘍を除去できることを示す。しかし、腫瘍は多くの手段、例えば、IL-10、マクロファージコロニー刺激因子、IL-6および血管内皮成長因子などによって免疫監視を免れる。なお、これらの因子はすべて、DC活性を抑制し、腫瘍組織の耐容能を促進する。腫瘍抗原を負荷したDCの腫瘍への送達によって、腫瘍特異的拒否を動物モデルにおいて誘発することができる。同様に、病原体は、抗原のプロセッシングおよび提示経路を変えることによって、または抗原提示細胞の成熟化を妨げることによって、免疫監視を免れることができる。耐性を生じるのではなく、DCは複雑感染症のカポシ（Kaposi）ウイルスやサイトメガロウイルスなどの潜伏型ウイルスを宿すことによって感染を複雑にし得る。HIV-1 および麻疹ウイルス粒子はDCにおいて効率的に産生される。腫瘍、あるいは感染病原体に対するワクチンは、腫瘍抗原または弱毒化されたウイルス粒子または成分を負荷されたDCの全身的投与、または局所的投与によって改善され得るであろう。
【０１３０】
キラー抑制因子調節分子である、ケモカイン、ケモカイン受容体およびタンパク質分解酵素の発現がESTの配列決定を行うことによってDCにおいて同定されている。この研究を続けることによって、新しいリンパ球結合分子および、抗原プロセッシング分子、膜貫通産物や分泌産物、およびDCの特殊な機能の説明に役立ち、免疫系の操作を可能にし得る転写因子が明らかにされ得る。
【０１３１】
脂肪細胞の成熟化
脂肪組織の主要な機能は、脂肪を摂食時に貯蔵し空腹時に放出する能力である。白色脂肪組織は空腹の際の主なエネルギー貯蔵であり、その貯蔵エネルギーはエネルギー欠乏時に動員される。脂肪組織はインスリンの主要な標的組織の一つであり、脂肪生成とインスリン耐性は、インスリン非依存型真性糖尿病(NIDDM)であるII型糖尿病に関連する。細胞学的に前脂肪細胞からの成熟脂肪細胞への変換は核の周りへの脂肪小滴の堆積を特徴とする。in vivoでの変換過程はチアゾリジンジオンおよび他のPPAR・アゴニストによって誘発され得る(Adams 他(1997) J Clin Invest 100:3149-3153) 。また、これらはインスリン感受性亢進や、血漿グルコースや血圧の低下を生じる。
【０１３２】
NIDDMは、過敏性の急性期免疫応答を有する個人が正常細胞のシグナル伝達や修復を行うことが出来なくなった結果生じ得ることをPickup とCrook (1998; Diabetologia 41:1241-8) が示唆している。この過程の各段階は長期的生活様式や環境とよく相関しており、これには以下が含まれる。1)ブドウ糖高度刺激によるインスリンおよびサイトカインの産生、2)脂肪細胞の分化時の組織再構成への種々のサイトカイの影響と、そのシグナル伝達経路への影響、および3)サイトカインが産生され続けられ、細胞外基質成分(ECM)が再利用されず、ホメオスターシスが時宜を得て回復されない場合の組織損傷の発生。多くのサイトカインおよびそれらが相互作用する受容体がこの過程に関連していると考えられている。これらのサイトカインには腫瘍壊死因子、結合組織成長因子、トランスフォーミング成長因子β、インターロイキン(IL)-13およびその受容体が含まれる。腫瘍壊死因子は、そのインスリン受容体のインスリン刺激性チロシンリン酸化を阻害することによってインスリン耐性に寄与する。これは次に、インスリン受容体が正常なシグナル伝達過程に関与するのを妨げる(Skolnik およびMarcusohn (1996) Cytokine Growth Factor Rev 7:161-173; Hotamisligil (1999) J Intern med 245:621-625)。結合組織成長因子はmesenglial 基質の構築を媒介する(Murphy 他(2000) J Biol Chem 274:5830-5834)。トランスフォーミング成長因子βは腎臓のmesenglial 基質の構築を媒介し、重要な細胞内カルシウムチャネルであるイノシトール三リン酸受容体と相互作用して血管機能に作用する(Sharma および McGowan (2000) Cytokine Growth Factor Rev 11:115-123)。
【０１３３】
IL-13およびIL-4は多くの重複する生物学的性質を共有する免疫調節サイトカインである。これらは両者とも、B細胞の増殖を促進し (McKenzie 他(1993) Proc Natl Acad Sci 90:3735-3739)、また生殖細胞系列Cεの転写発現を誘発し、未刺激naive B細胞をIgEやIgG4の合成に切り替えるように誘導する( Punnomen 他 (1993) Proc Natl Acad Sci 90:3730-3734)。同様にIL-13 と IL-4 受容体の異なったアイソフォームは相互作用して四つのタイプのIL-13受容体複合体を形成する。場合によっては、IL-13はIL-4受容体α鎖(Rα)とIL-13Rαで構成される受容体複合体を利用する。IL-13のシグナル伝達における各々の鎖の特定の役割りは不明であるが、IL-13Rα1 で形質移入されたBa/F3 細胞はIL-13に対して分裂促進的応答を示すが、マウスのIL-13Rα2 で形質移入された細胞は分裂促進的応答を示さない。さらに、可溶性IL-13Rα2/Fc 融合タンパク質はIL-13に対する分裂促進的応答を遮断する(Donaldson 他 (1998) J Immunol 161:2317-2324)。これは、 IL-13Rα2 がIL-13のドミナントネガティブ阻害因子として、あるいは、デコイ受容体として働き得ることを示唆する。しかし、結腸癌細胞系では、受容体複合体はインスリン受容体基質-1のチロシンリン酸化と関連する増殖抑制を示した。1)受容体複合体のどのアイソフォームが細胞増殖を促進し、どのアイソフォームが細胞増殖を阻害するか、また2)これが細胞タイプや、組織タイプによって変化するかどうかを確立するために、さらに研究を進める必要があることは明らかである。
【０１３４】
ほとんどの脂肪細胞の研究はマウス細胞株を用いて行われている。しかし、最近は、マウスの前脂肪細胞分化を刺激する培養条件はヒト前脂肪細胞を誘発する条件と異なることが示されている。既に知られているこれらの種属間の遺伝的相違に加えて、2倍体のヒト初代細胞は異数体のマウス細胞とは異なった応答をする。アテローム性動脈硬化症、それに関連する冠状動脈疾患、脳卒中は、先進国におけるもっとも一般的な死の原因を代表する。特定の主な危険因子は同定されているが、この複雑な疾患の原因を解明し、看護する完全な分子的性質決定は、まだ達成されていない。アテローム性血管硬化病変部の成長と退化の分子の性質決定には、成長、安定、溶解、破裂、そして最も致死的な閉塞性血管血栓の誘発を含む病変部の特徴に寄与する遺伝子の同定を必要とする。血管病変には主に血管内皮および周囲平滑筋組織が関与する。
【０１３５】
アテローム性動脈硬化症の発症は循環するリポタンパク質の存在によって誘発されることがわかっている。コレステロールに富んだ低密度リポタンパク質(LDL)等のリポタンパク質は、血管内膜の細胞外空間に蓄積して、修飾を受ける。LDL (Ox-LDL) の酸化は循環抗酸化防御の作用がより弱くなっている内皮下空間において最も激しい。単核食細胞は脈管内膜に入り、マクロファージに分化して、Ox-LDL等の修飾した脂質を取り込む。Ox-LDL の取り込み時に、マクロファージはサイトカイン(腫瘍壊死因子α(TNF-α)や、インターロイキン-1(IL-1)等)、および成長因子(M-CSF、 VEGF およびPDGF-BB等)を産生し、これらがさらに平滑筋細胞増殖と、血管内皮による細胞外基質のようなアテローム発生を変調する細胞内現象をさらに誘発する。さらに、これらのマクロファージは、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)とIL-8とICAM-1とを含む、炎症と組織分化に関連する、内皮と平滑筋組織の遺伝子を活性化させ得る。
【０１３６】
血管内皮は三つの従来の止血の相互作用成分、つまり、血管、血小板および血漿の凝固・線溶系だけでなく、自然の続発症である炎症と組織修復にも影響を与える。内皮動態の二つの主な様態は区別することができ、抗血栓性状態と血栓性（prothrombotic）状態として最もよく定義されえる。生理的条件において、内皮は血管拡張(一酸化窒素(NO)、PGI2、アデノシン、過分極因子（hyperpolarising factor）の形成)を媒介し、血小板の接着と活性化(アデノシン、NOおよびPGI2の生成、ADPの除去)を妨げ、トロンビン形成(組織因子経路抑制因子、トロンボモジュリンによるタンパク質Cの活性化、抗トロンビンIIIの活性化)をブロックし、また、フィブリン沈着(t-およびscuplasminogen 活性化因子の産生)を緩和する。炎症性白血球の接着および遊出は、例えば、NOやIL-10によって弱力化され、またおよび酸素遊離基は効率的に除去される(尿酸塩、NO、グルタチオン、SOD)。
【０１３７】
内皮が虚血後再灌流、急性および慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および慢性動脈高血圧に物理的に破壊されるか、あるいは機能的に乱される時には、まったく反対の作用が伴う。この血栓性で炎症誘発性の状態は血管収縮、血小板や白血球の活性化と接着(例えば、フォンウィルブランド因子、血小板活性化因子、P-セレクチン、ICAM1、 IL8、 MCP1および TNF-αの外面化（externalisation）、発現および上方制御)、トロンビン形成の促進、血管壁における凝固とフィブリン沈着）および血小板と白血球の共凝集体、血小板CD40-リガンドの内皮、単球およびB細胞のCD40への付着による更なる炎症性相互作用を特徴とする。トロンビン形成と炎症刺激は、後の組織修復のための準備をするため、機能障害の血管内皮の凝血促進（procoagulatory）、血栓性作用を限定する目的で、そのような内皮の反応を完全に停止することは、臨床処置の目的にはなり得ない(概説はBecker 他. (2000) Z Kardiol 89:160-167等を参照されたい)。
【０１３８】
腫瘍壊死因子（TNF）αは免疫調節と炎症応答とを媒介する多面的(pleiotropic)サイトカインである。TNFα関連サイトカイン類は、部分的に重なる細胞応答を生じる。例えば分化、増殖、核因子κB (NFκB)活性化および細胞死を、受容体モノマーの凝集を誘起して生じる(Smith, C.A. 他(1994) Cell 76:959-962)。TNFαが誘起する細胞応答は、種々の細胞表面受容体(TNFR)とTNFαとの相互作用を通じて開始される。NF-κBは、損傷や感染への応答また生理的プロセスに関与する遺伝子を誘発する中枢の役割を伴う転写因子である。NF-κB の活性化には或る阻害性タンパク質であるIKBのリン酸化とその後の分解が伴い、この過程に関与する近位キナーゼ（proximal kinase）とアダプター分子の多くが解明されている。さらに、IL-1とTNF-αの細胞膜から核へのNF-κB 活性化経路が現在わかっている(Bowie および O'Neill (2000) Biochem Pharmacol 59:1323)。
【０１３９】
単球化学誘引物質プロテイン-1 (MCP1) は、単球の遊走を誘発することによってアテローム性動脈硬化症の病原性において重要な役割を果たしていることが知られている。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をTNF-αで処理すると、未処理細胞に較べてMCP1 の細胞分泌が119倍増加した。インスリン感作薬であるトログリタゾンはこのMCP-1分泌におけるTNF-α誘導性増加を有意に抑制し、mRNA レベルを減少した(Ohta 他(2000) Diabetes Res Clin Pract 48:171176)。
【０１４０】
血管の平滑筋細胞(SMC)のコンフルエントな培養をTNFα処理すると、コラゲナーゼ消化可能タンパク(CDP)と非コラーゲン性タンパク(NCP)との双方への[3H]プロリンの取込が抑制される。TNFαによる、こうした抑制は、コンフルエントなウシ大動脈内皮細胞とヒト線維芽細胞IMR-90とでは見られない。TNFαがコラーゲンIV型とV型との相対比率を低下させることから、TNFαがSMCによるコラーゲン合成を細胞密度依存的に調整し、したがってアテローム硬化病変の形成を変化させうると示唆される(Hiraga 他 (2000) Life Sci 66:235244)。
【０１４１】
ヒト冠状動脈平滑筋細胞(CASMC) はヒト冠状動脈の中膜(中間の筋層)から単離された初代細胞である。血管平滑筋細胞は血管生物での重要性が増加しているモデルである。血管緊張の調節、およびその結果起こる種々の組織への酸素供給における明らかな役割りに加えて、炎症状態における血管平滑筋細胞の動態はアテローム性動脈硬化と再狭窄の発症の重要な要因であることが現在周知である。
【０１４２】
ヒトの大動脈内皮細胞(HAEC)は、ヒトの大動脈の内皮細胞に由来する初代細胞である。HAECはヒト血管生物学における内皮の役割りを、in vitro で調べるための実験的モデルとして使われている。血管内皮の活性化は、広範な生理的過程また病態生理的過程の双方、例えば血管緊張調節、凝血および血栓症、アテローム硬化、並びに炎症の、中心的なイベントであると考えられる。
【０１４３】
したがって、CASMC およびHAEC 細胞培養をTNFαで処理する際に差次的に発現される血管組織遺伝子はアテローム動脈硬化過程のマーカーであることが当然予期され得る。
マイクロアレイ分析の生物薬理学的ツール
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)はヒト臍静脈の内皮から由来する初代細胞株である。HUVEC はヒト内皮細胞のin vitroでの機能的生物学を研究するために使われている。血管緊張制御、凝固および血栓症、アテローム性動脈硬化症および炎症などの生理学的、病態生理学的過程において血管内皮の活性化が観察される。
【０１４４】
腫瘍壊死因子α(TNF-α ) は複数のシグナル伝達経路の活性化によって炎症応答の媒介において中心的役割りを果たす多面的サイトカインである。TNF-α は活性化リンパ球、マクロファージおよびその他の白血球によって産生され、内皮細胞を活性化する。
【０１４５】
PMAはプロテインキナーゼC(PKC)のアゴニストである。PKCはカルシウム活性化、リン脂質依存性セリンおよびチロシン特異的キナーゼであり、これは活性化されると、広範囲の二次的標的をリン酸化する。TNF-αは細胞質ゾルからPKCを膜に転移させ、PKCは膜で多様な標的をリン酸化する。
【０１４６】
インターロイキン1β(IL-β)は急性炎症性応答に関連するサイトカインであり、発熱、代謝調節、および骨の再造形のような過程に関与する。免疫系の細胞(単球、樹状細胞、NK細胞、血小板および好中球)および体細胞(骨芽細胞、ニューロン、シュワン細胞、オリゴデンドログリア(乏突起膠細胞)、および副腎皮質細胞)は共に、IL-1βを産出することができる。IL-1βは、単球でのそれ自体の産生、内皮細胞での接着分子とケモカインの産生、IL-12と共にNK細胞によるインターフェロンγ(IFN-γ)産生を誘発する。IL-1は一本鎖プロ分子として産生され、その機能を得るためのプロ分子の切断は特殊化されたプロテアーゼ-IL-1変換酵素（ICE）によって行わなければならない。インターロイキン10(IL-10)はCD4+ T 細胞クローンといくつかのCD8+ T 細胞クローンによって産生される。ヒトＢ細胞、EBV形質転換リンパ芽球腫細胞系および単球もまた活性化されるとIL-10を産生し得る。IL-10は種々の細胞タイプに免疫刺激的作用か、または免疫抑制的作用のどちらかの作用を及ぼす多面的サイトカインである。これはマクロファージ機能の強力な免疫抑制物質である。IL-10は、特にクラスIIMHC発現の下方制御によって、単球の付属的機能および抗原提示能力をin vitroで阻害する。したがって、IL-10はマウスのTh1クローンのみならず、ヒトのTh0-様T細胞、 Th1-様T細胞、およびTh2- 様T細胞でも単球/マクロファージ依存性、抗原特異的増殖を阻害できる。IL-10はまた、ヒトPBMNC および NKによる単球/マクロファージ依存性、抗原刺激性サイトカイン生合成(特にIFN-g)をも阻害することができる。さらに、IL-10 は、単球またはマクロファージの活性およびその結果生じる細胞毒性作用の強力なインヒビターである。これはTNF-a、 IL-1、 IL-6および IL-10などの多くのサイトカインの産生を抑制し、また活性化単球／マクロファージによるスーパーオキシドアニオン、活性酸素反応中間体および活性窒素反応中間体の合成を抑制することができる。IL-10 は免疫刺激性サイトカインとしてB細胞に作用して、B細胞の生存度、細胞増殖、Ig分泌およびクラスIIMHCの発現を亢進し得る。Bリンパ球の他に、IL-10 はまた、細胞毒性T細胞発生のエンハンサーであるとともに、胸腺細胞および肥満細胞の増殖共刺激物質でもある。
【０１４７】
チアゾリジンジオンまたはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ (PPAR-γ) アゴニストは新しいクラスの抗糖尿病薬であり、これは、II型糖尿病患者において、インスリン感受性を改善し、また血漿中ブドウ糖および血圧を下げる。これらの薬剤はオーファン核受容体に結合し、活性化し、これらの中いくつかはヒト脂肪細胞分化を誘発し得る。
【０１４８】
癌などの細胞増殖異常、発生または発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症性疾患、生殖器疾患、および胎盤の障害の診断・治療・予防のために核酸およびタンパク質を含めた新規の組成物が必要である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０１４９】
本発明の種々の実施態様は、総称して「CGDD」、個別にはそれぞれ「CGDD-1」、「CGDD-2」、「CGDD-3」、「CGDD-4」、「CGDD-5」、「CGDD-6」、「CGDD-7」、「CGDD-8」、「CGDD-9」、「CGDD-10」、「CGDD-11」、「CGDD-12」、「CGDD-13」、「CGDD-14」、「CGDD-15」、「CGDD-16」、「CGDD-17」、「CGDD-18」、「CGDD-19」、「CGDD-20」、「CGDD-21」、「CGDD-22」、「CGDD-23」、「CGDD-24」、「CGDD-25」、「CGDD-26」、および「CGDD-27」と呼ぶ、細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質である、精製されたポリペプチドを提供し、また、これらのタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを用いる、疾患と病状との検出、診断、および治療の方法を提供する。実施例はまた、効力、用量、毒性および薬理の決定などの薬物開発過程に利用するために、細胞成長、分化および細胞死に関連する精製されたタンパク質および/またはそれらのコードするポリヌクレオチドを利用する方法をも提供する。関連する実施例によって、疾患および病態の調査および病原性を調べるために精製された、細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質またはそれらのコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
【０１５０】
或る実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-27とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施様態は、SEQ ID NO:1-27のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドを提供する。
【０１５１】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:28-54からなる群から選択される。
【０１５２】
更に別の実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。しかし別の実施様態は、組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換生物体を提供する。
【０１５３】
別の実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、(a)組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、(b)そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有する。
【０１５４】
更に別の実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【０１５５】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施様態では、ポリヌクレオチドは少なくとも約20、30、40、60、80、あるいは100の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【０１５６】
また別の実施様態は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで標的ポリヌクレオチドは、(ａ)SEQ ID NO：28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO：28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される。検出方法は、(a)サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(ｂ)該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程を含む。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。関連する或る実施様態では、方法にはハイブリダイゼーション複合体の量を検出することが含まれ得る。別の実施様態では、プローブは少なくとも約20、30、40、60、80、あるいは100の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【０１５７】
更にまた別の実施様態は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで標的ポリヌクレオチドは、(ａ)SEQ ID NO：28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO：28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(b)増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出する過程を含む。関連する或る実施様態では、検出方法には増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量を検出することが含まれ得る。
【０１５８】
別の実施様態は、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群れから選択される。一実施態様では、この組成物はSEQ ID NO:1-27からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有し得る。別の実施様態は、機能的CGDDの発現の低下や異常に関連した疾患や症状の治療方法や、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１５９】
また別の実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(a)該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施様態は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤を含む、或る組成物を提供する。更に他の実施例は、機能的CGDDの発現の低下に関連した疾患や症状の治療方法を提供し、また、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【０１６０】
さらにまた別の実施様態は、(a)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（a）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施様態は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤を含む、或る組成物を提供する。更に他の実施例は、機能的CGDDの過剰発現に関連した疾患や症状の治療方法を提供し、また、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【０１６１】
もう１つの実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【０１６２】
さらにもう１つの実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1-27を有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-27を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）SEQ ID NO:1-27を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-27を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【０１６３】
更に別の実施様態は、SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(a)この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(b)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(c)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１６４】
別の実施様態は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(a)核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程、(b)処理済み生体サンプルの核酸をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも90％の同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも28の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:28-54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６５】
（本発明の記載について）
タンパク質、核酸および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、機器、材料および方法に本発明の実施様態が限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施様態を説明する目的で用いたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１６６】
補足請求および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【０１６７】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の実施様態に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１６８】
（定義）
用語「CGDD」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたCGDDのアミノ酸配列を指す。
【０１６９】
用語「アゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を強化、或いは模倣する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物を挙げることができるが、これらはCGDDと直接相互作用することによって、或いはCGDDが関与する生物学的経路の構成成分に作用することによって、CGDDの活性を調節する。
【０１７０】
「対立遺伝子変異体」は、CGDDをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変容したmRNAまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【０１７１】
CGDDをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換がありながら、CGDDと同じポリペプチド、あるいはCGDDの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、CGDDをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異体群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、CGDDをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なCGDDとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCGDD の活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【０１７２】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【０１７３】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）技術または当分野でよく知られている他の核酸増幅技術を用いて実行される。
【０１７４】
用語「アンタゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、CGDD と直接相互作用すること、あるいはCGDD が関与する生物学的経路の各成分に作用することによってCGDD の活性をモジュレートする、抗体などのタンパク質、anticalin、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。CGDDポリペプチド群と結合する抗体類の作製には、免疫抗原として、無傷ポリペプチド群を用いることができ、または、当該の小ペプチド群を有する断片群を用い得る。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、所望によりキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【０１７５】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１７６】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する(例えば、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法)、米国特許第5,270,163号に記述)。これは、大規模な組合せライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基(例えば、リボヌクレオチドの2'-OH 基が2'-F または 2'-NH2で置換されている)を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い寿命など、望む性質を改善しうる。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【０１７７】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【０１７８】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【０１７９】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考DNA分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考DNA分子のセンス鎖を意味しうる。
【０１８０】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え、または合成CGDD、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１８１】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」と対を形成する。
【０１８２】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。 Compositions comprising polynucleotides encoding CGDD or fragments of CGDD may be employed as hybridization probes.これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１８３】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（GCG, Madison, WI）か、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１８４】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
Figure 2005502335
【０１８５】
保存アミノ酸置換では通常、(a）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、(b)置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または(c)側鎖の大部分を保持する。
【０１８６】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１８７】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドの、少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって修飾されたポリペプチドである。
【０１８８】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１８９】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１９０】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって、新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１９１】
「断片」は、CGDD の又はCGDD をコードする或るポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１９２】
SEQ ID NO:28-54の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:28-54を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:28-54のある断片は、本発明の例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術の１つ以上の実施様態、またはSEQ ID NO:28-54を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:28-54の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:28-54の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１９３】
SEQ ID NO:1-27の断片はSEQ ID NO:28-54の断片によってコードされている。SEQ ID NO：:1-27の断片はSEQ ID NO:1-27を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1-27の断片は、SEQ ID NO:1-27を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-27の断片および断片に対応するSEQ ID NO:1-27の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき、本明細書に記載されている、あるいは当分野で知られている１つ以上の分析方法を用いて当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１９４】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１９５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１９６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、当分野で知られているあるいは本明細書に記載されている１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用いて決定し得る。例えば、一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G. 他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「percent similarity(類似率)」として一致率を報告する。
【０１９７】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及び他のパラメータをデフォルト設定に設定して用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１９８】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１９９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０２００】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０２０１】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０２０２】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０２０３】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０２０４】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０２０５】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０２０６】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。許容条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０２０７】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０２０８】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０２０９】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０２１０】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはポリヌクレオチド配列の変化を指す。
【０２１１】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０２１２】
用語「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、CGDDのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、CGDDの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０２１３】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
【０２１４】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０２１５】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、CGDDの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、CGDDのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０２１６】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０２１７】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０２１８】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。CGDDの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CGDDの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０２１９】
「プローブ」とは、同一核酸、対立遺伝子核酸、または関連核酸の検出に用いる、CGDDやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０２２０】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０２２１】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Sambrook, J. 他(1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、Ausubel, F.M. 他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第４版, John Wiley & Sons, New York NY)、及び Innis, M. 他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０２２２】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０２２３】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０２２４】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０２２５】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０２２６】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０２２７】
DNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０２２８】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CGDD、CGDDをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０２２９】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０２３０】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０２３１】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０２３２】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０２３３】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０２３４】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０２３５】
ここで用いる「遺伝形質転換生物体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換生物体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他(1989)などの参考文献に記載されている。
【０２３６】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病状または病状性向を示し得る。
【０２３７】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、85%、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０２３８】
（発明）
本発明の様々な実施様態は、新規のヒトの細胞増殖、分化および細胞死関連タンパク質（CGDD）群と、CGDDをコードするポリヌクレオチド群および、これらの組成を、癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、および胎盤障害の診断、治療並びに予防に利用する方法に基づく。
【０２３９】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチドおよびポリペプチド実施様態の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列に相当する物理的な完全長クローンのIncyte ID 番号を示す。完全長のクローンは列３に示すポリペプチド配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０２４０】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO :）と最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０２４１】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０２４２】
表２および３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質であることを確立している。
【０２４３】
例えば、SEQ ID NO:2はヒトロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質前駆体(GenBank ID g4091819) とG11残基からA548残基まで51％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.3e-161であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2はまた、ロイシンリッチリピートドメインを有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。
【０２４４】
また他の例として、SEQ ID NO:3はマウスのイロコイ（Iroquois）クラスのホメオボックスタンパク質 IRX2 (GenBank ID g9965418) とＭ１残基からL378残基まで90％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.5e-190であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3はまた、1つのホメオボックスドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIF、PRODOM、およびPROFILESCANの解析ととDOMOのデータベースのBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:3がホメオドメイン含有タンパク質である、さらに確証的な証拠を提供する。
【０２４５】
また他の例として、SEQ ID NO:6はヒトの非水晶体βγ-クリスタリン様タンパク質(GenBank ID g2072425) とQ87残基 からT1723残基までで99％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:6はまた、１つのβ/γクリスタリンドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。MOTIFS解析およびその他のBLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:6がβγ-クリスタリン様タンパク質であることを更に確証する証拠を提供する。
【０２４６】
他の例として、SEQ ID NO:9 はマウスSPAF(精子形成関連因子、AAAファミリ) (GenBank ID g4105619) とM1残基からK56残基まで53%、またG55残基からG535残基まで84%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは6.4e-218であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:9もまた、様々な細胞活性(AAA)に関連するATP分解酵素ファミリドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS及びMOTIF解析よりのデータは、SEQ ID NO:9がAAAファミリタンパク質であることをさらに確証する証拠を提供する。
【０２４７】
他の例として、SEQ ID NO:14 は、ラットCPG2(候補可塑性関連遺伝子)タンパク質(GenBank ID g1177322) とM501残基からI1440残基まで85%同一であることが、 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された。このラットCPG2は、とりわけ出産後の皮質発達に関与している(Nedivi, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (5), 20482053) （表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:14はまた、１つのカルポニン相同性(CH)ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。MOTIFS 、PROFILESCAN解析および追加のBLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:14がCPG2 タンパク質であることを更に確証する証拠を提供する。
【０２４８】
また他の例として、SEQ ID NO:17はマウス転移関連タンパク質1 (GenBank ID g15077051) ）とM1残基からD686残基まで95％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:17はまた、BAHドメイン、 ELM2ドメイン、 GATA亜鉛フィンガードメインおよび Myb様DNA結合ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLAST-PRODOM、 BLAST-DOMOおよびMOTIFS解析からのデータはSEQ ID:17が細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質であることをさらに確証する証拠を提供する。
【０２４９】
他の例でSEQ ID NO:21は、M1残基からF652残基まで、ヒトのOS-9 前駆体 (GenBank ID g1322234) と97％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。BLIMPS、 BLASTおよびMOTIFS解析からのデータはSEQ ID:21が細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質であることをさらに確証する証拠を提供する。
【０２５０】
他の例でSEQ ID NO:25は、M1残基からT533残基まで、ヒトのOS-9 (GenBank ID g2780783) と99％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.5e-290であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:25はさらにOS-9タンパク質であるタンパク質と相同性を有することがPROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。BLAST解析から得られたデータによって、SEQ ID NO:25がOS-9である更に確証的な証拠が得られる。
【０２５１】
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4-5、SEQ ID NO:7-8、SEQ ID NO:10-13、SEQ ID NO:15-16、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:22-24およびSEQ ID NO:26-27 は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-27の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０２５２】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチドの具体例は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（5'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置、また、例えばSEQ ID NO:8-14を同定するため、或いはSEQ ID NO:8-14と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０２５３】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０２５４】
あるいは、接頭コードは手作業で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を同定する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
Figure 2005502335
【０２５５】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０２５６】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記のポリヌクレオチドをアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２５７】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型((SNP) を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列３はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列４はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はSNPが存在するEST配列内の位置(EST SNP)を示し、列６は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列７はEST配列内に存在する対立遺伝子を示す。列8および列9はSNP部位に存在する2つの対立遺伝子を示す。列10はESTに存在する対立遺伝子に基づいてSNP部位に含まれるコドンによってコードされるアミノ酸を示す。列11〜14は四つの異なったヒト母集団における対立遺伝子1の発生頻度を示す。n/d(検出されない)の項目は母集団における対立遺伝子１の発生頻度が低すぎて検出されなかったことを示し、また、n/a(利用不可)はその母集団において対立遺伝子の発生頻度が決定されなかったことを示す。
【０２５８】
本発明にはCGDD変異体も含まれる。好適なCGDD変異体は、CGDDの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有し、かつ該CGDDアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列である。
【０２５９】
特定の実施態様において、本発明は、CGDDをコードする、SEQ ID NO:28-54からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ NO ID:28-54のポリヌクレオチド配列は、配列表に示すように等価RNA配列を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０２６０】
本発明はまた、CGDDをコードするポリヌクレオチドの変異体を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:28-54からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:28-54からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、CGDDの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０２６１】
更に或いは別法では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体は、CGDDをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はCGDDをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分(複数)を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、CGDDをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体の幾つかの部分には、CGDDをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID NO:51 の配列を含むポリヌクレオチドとSEQ ID NO:38の配列を含むポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体であり、またSEQ ID NO:52 の配列を含むポリヌクレオチド、SEQ ID NO:53の配列を含むポリヌクレオチド、SEQ ID NO:54 の配列を含むポリヌクレオチドおよびSEQ ID NO:48の配列を含むポリヌクレオチドとは互いにスプライス変異体である。上記のスプライス変異体は何れも、CGDDの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。 CGDDをコードする種々のポリヌクレオチド配列が遺伝暗号の縮重によって作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。天然CGDDのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に、これらの組合せが成される。このような全ての変異は明確に開示されていると考慮されたい。
【０２６２】
CGDD とその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然CGDD のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するCGDD 或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、CGDDおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０２６３】
本発明にはまた、CGDD とその誘導体とをコードする、ポリヌクレオチド群またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成ポリヌクレオチドを任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてCGDD またはその任意の断片をコードする或るポリヌクレオチドに突然変異を誘導し得る。
【０２６４】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:28-54に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(Wahl, G.MおよびS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507-511)。 アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２６５】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する(Ausubel 他、前出、第7章; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY、856-853ページ）。
【０２６６】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、CGDD をコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322）。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186）。 第3の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111119）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で既知である(Parker, J.D 他(1991) Nucleic Acids Res.19:30553060）。 更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０２６７】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、遺伝子群の5'領域を有する配列をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２６８】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２６９】
本発明の別の実施態様では、CGDDをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を、CGDD、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号に固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリヌクレオチドをコードする別のポリヌクレオチドが作られ、これらの配列をCGDDの発現に利用可能である。
【０２７０】
種々の目的で、CGDDをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０２７１】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA, 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、CGDDの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所与の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、管理され制御可能な方法で、最大化させることができる。
【０２７２】
別の実施態様では、CGDD をコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232)。あるいは、CGDD 自体またはその断片を当分野で既知の化学的方法を用いて合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY55-60ページ; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。CGDDのアミノ酸配列、または任意のその一部は更に、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組合せることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０２７３】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Chiez, R.M.及び F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ）。
【０２７４】
生物学的に活性なCGDDを発現させるために、CGDDをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、ベクター内およびCGDDをコードするポリヌクレオチドにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特異的な開始シグナル類を用いて、CGDDをコードするポリヌクレオチド群の、より効率的な翻訳を達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。CGDD をコードするポリヌクレオチド配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125162)。
【０２７５】
当業者に周知の方法を用いて、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製し得る。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある(Sambrook, J.他(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4, 8, および 16-17章; Ausubel他、前出、1, 3および15章)。
【０２７６】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CGDDをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系等がある(Sambrook、前出、 Ausubel 他、前出、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509; Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ、Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(Di Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5:350-356; Yu, M.他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317:813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31:219-226; Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０２７７】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、CGDDをコードするポリヌクレオチド群の使用目的に応じて選択できる。例えばCGDD をコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。CGDD をコードするポリヌクレオチドをこのベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509 ）。CGDDが多量に、例えば抗体の産生などに必要な場合は、CGDDの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０２７８】
CGDDの産生には酵母の発現系を使用できる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(Ausubel 他、前出; Bitter, G.A. 他、(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
【０２７９】
CGDDの発現には植物系も用い得る。CGDD をコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RUBISCO の小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(Coruzzi, G. 他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; および Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85105）。 これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ）。
【０２８０】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCGDD をコードするポリヌクレオチドを連結し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、宿主細胞にCGDD を発現する感染ウイルスを得ることが可能である（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２８１】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。
【０２８２】
CGDDの、細胞株における安定した発現は、哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のために望ましい。例えば、CGDD をコードするポリヌクレオチドを細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２８３】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他 (1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570、Colbere-Garapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている（Hartman, S.C.及び R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０２８４】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、CGDD をコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CGDD をコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、CGDDをコードする１配列とタンデムに、或るマーカー遺伝子を、単一プロモーターの制御下で配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２８５】
一般に、CGDDをコードするポリヌクレオチドを含み且つCGDDを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーションと、PCR増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０２８６】
CGDDの発現の検出及び計測のための、特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる免疫学的な方法は、当分野で既知である。このような技法の例には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS、フローサイトメトリー）などがある。CGDD上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である(Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV、Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ)。
【０２８７】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CGDDをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、CGDDをコードするポリヌクレオチド群、またはその任意の断片群を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングできる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２８８】
CGDD をコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。CGDDをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのCGDDの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２８９】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２９０】
本発明の別の実施態様では、CGDD をコードする、天然ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを或る異種配列に結合させることにより、上記した任意の宿主系内で、融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCGDDタンパク質は、CGDDの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、CGDDをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、CGDDが、精製後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel他(前出、10および16章)に記載がある。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２９１】
別の実施態様では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射標識CGDD を合成しうる。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２９２】
本発明のCGDDまたはその断片を用いて、CGDDに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。1つ以上の試験化合物をCGDDへの特異的な結合についてスクリーニングすることができる。種々の実施例において、CGDDに対する特異結合について、1、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 50、 100 または 200 の試験化合物をスクリーンすることができる。試験化合物の例として、抗体、アンティカリン(anticalins)、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０２９３】
関連する実施例において、CGDD 、CGDD の変異体、あるいはCGDD および／または１つ以上のCGDD 変異体とのある組み合わせへの試験化合物（抗体等）の結合/をスクリーニングするために、CGDD 変異体を用いることができる。ある実施例においては、SEQ ID NO:1-27の配列の正確な配列を有するCGDDではなく、CGDDの変異体に結合する化合物のスクリーニングにCGDDの変異体を用いることができる。このようなスクリーニングを行うために使うCGDD変異体はCGDDに約50%から約99%の範囲で配列同一性を有し得る。また、種々の実施例で60%、70%、75%、80%、85%、90%および95%の配列同一性を有することができる。
【０２９４】
或る実施態様でCGDDへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、GCRECの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである (Coligan, J.E. 他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体CGDD の天然リガンドでありうる (Howard, A.D. 他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２９５】
別の実施態様でCGDD への特異結合スクリーニングで同定した化合物は、CGDD が結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なCGDD受容体の場合や、シグナルを伝播できないCGDDおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A.およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260、Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol.22:328-336）。 該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２９６】
一実施例においては、類似または異なる特異性を有する2つ以上の抗体のCGDD、CGDDの断片、またはCGDDの変異体への特異的結合についてスクリーニングし得る。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、CGDDの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、CGDDの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。他の実施態様においては、CGDD産生の増加、減少あるいはその他の異常産生を伴う特定疾患または状態を優先的に診断できるように抗体の結合特異性を選ぶことができる。
【０２９７】
１つの実施態様で、anticalinを、CGDDまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。anticalinはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリンのタンパク質構造には、８つの逆平行ベータストランドを持つβバレルが含まれ得り、それらのストランドはバレルの開放末端に4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２９８】
一実施態様では、CGDD に特異的に結合、刺激、あるいは阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でCGDD を発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。CGDDを発現する細胞、またはCGDDを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、結合や、CGDDまたは該化合物の何れかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２９９】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の、あるいは固体支持物に固定されたCGDDと混合するステップと、CGDDとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０３００】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。もう一つの関連する実施様態においては、ポリペプチド化合物（たとえばリガンド）に1つ以上のアミノ酸置換を行うことにより、天然受容体への結合能力を改善または改変することができる(Cunningham, B.C.およびJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他 (1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０３０１】
CGDDまたはその断片、あるいはCGDDの変異体を用いて、CGDDの活性を変調する化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、CGDDが少なくとも１つの試験化合物と混合される、CGDD活性が許容される諸条件下で或るアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのCGDDの活性を試験化合物不在下でのCGDDの活性と比較する。試験化合物の存在下でのCGDDの活性の変化は、CGDDの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、CGDDの活性に適した条件下で、CGDDを有するin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。CGDDの活性を調節する試験化合物は、これらアッセイの何れにおいても間接的に調節する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０３０２】
別の実施例では、CGDDまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換される。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330)。 形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０３０３】
CGDDをコードするポリヌクレオチド類はまた、in vitroで、ヒト胚盤胞由来のES細胞において操作し得る。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０３０４】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。CGDDをコードするポリヌクレオチドの或る領域を、ノックイン技術を用いて動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。または、CGDDを例えば乳汁内に分泌するなど過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０３０５】
（治療）
CGDDの領域群と細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質との間には、例えば配列及びモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。さらに、CGDD の発現は骨腫瘍、気管支、脳、脳腫瘍、乳房、子宮内膜、上皮細胞、肺、卵巣、卵巣腫瘍、小腸、脊髄および甲状腺組織、並びに乳房線維嚢胞病、患部小脳および大動脈組織、非刺激性星状細胞および腎上皮組織から由来した形質転換胚細胞系(293-EBNA) に密接に関連している。さらに、CGDD を発現する組織の例が、表６および実施例11にも見られる。このように、CGDDは、癌などの細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、および胎盤障害で役割を果たすと考えられる。CGDDの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を低下させることが望ましい。CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０３０６】
従って一実施態様において、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にCGDDまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、胎盤障害が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、および外傷が含まれる。生殖障害には、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（cystsphaeochromocytomas）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）を含む。胎盤障害には、子癇前症、絨毛癌、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤梗塞やmaternal floor infarction、癒着胎盤、侵入胎盤(increate)および穿通胎盤、絨毛膜外性胎盤（extrachorial placentas）、絨毛血管腫（chorangioma）、絨毛血管分布過多（chorangiosis）、慢性絨毛炎（villitis）、胎盤絨毛浮腫（placental villous endema）、終末絨毛広範性線維症（widespread fibrosis of the terminal villi）、絨毛間腔血栓(intervillous thrombi)、出血性血管炎、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、非免疫性胎児水腫を含む。
【０３０７】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CGDDまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０３０８】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたCGDDを有する組成物を好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０３０９】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CGDDの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０３１０】
更なる実施態様では、CGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にCGDDのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症の疾患、生殖障害、および胎盤障害が含まれる。一実施態様では、CGDDと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或るいはCGDDを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０３１１】
別の実施態様では、CGDDをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防も可能である。
【０３１２】
他の実施態様において、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補的配列、またはベクタは他の適切な治療剤と併用して投与し得る。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０３１３】
CGDDのアンタゴニストは、当分野で一般に既知の方法を用いて製造し得る。具体的には、精製CGDDを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、CGDDと特異結合するものを同定し得る。CGDDへの抗体も、当分野で周知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０３１４】
CGDD、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって、抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトなどを含む種々の宿主が免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０３１５】
CGDDに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。CGDDアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０３１６】
CGDDに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120）。
【０３１７】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るために用いられる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。または、CGDD特異的一本鎖抗体を、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して生成し得る。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０３１８】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837、Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０３１９】
CGDDに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる (Huse, W.D. 他(1989) Science 246:1275-1281)。
【０３２０】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合試験に対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、CGDDとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性CGDDエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０３２１】
CGDDに対する抗体の親和性を、ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて算定する。CGDD抗体複合体のモル濃度を平衡状態の下で遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる結合定数Kaが親和性を表す。CGDDエピトープ多数に対してポリクローナル抗体類は親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、CGDDに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定CGDDエピトープに対してモノクローナル抗体は単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。CGDD-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイには、Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤を用いるのが好ましい。Ka値が10６〜10７L/molの低親和性抗体医薬は、CGDDが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC、Liddell, J. E.およびCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０３２２】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、CGDD抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（Catty、前出、Coligan 他、前出）。
【０３２３】
本発明の別の実施態様では、GCRECをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。ある態様では、CGDDをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CGDD をコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ 等を参照）。
【０３２４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475、Scanlon, K.J.他(1995) 9(13):1288-1296)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. 及び W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Boado, R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:2730-2736）。
【０３２５】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを、本発明の別の実施態様では、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。CGDDの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCGDDを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０３２６】
本発明の更なる実施例では、CGDDの欠損による疾患や障害を、CGDDをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってCGDD欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、および(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. および W.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０３２７】
CGDDの発現に有効であり得る発現ベクターの例として、限定するものではないがpcDNA 3.1、EpiTag、pRcCMV2、pREP、pVAX、pCRII-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、pCMV-Script、pCMV-Tag、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）およびPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）が挙げられる。CGDDを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するCGDDをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０３２８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E. 他(1982) EMBO J. 1:841-845)。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０３２９】
本発明の別の実施態様では、CGDDの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でCGDDをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０３３０】
或る実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDD の発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にCGDD をコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544） 並びに、Verma, I.M. および N. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)。
【０３３１】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDD の発現に関して１以上の遺伝子異常を持つ標的細胞に、CGDD をコードするポリヌクレオチド類を送達する。CGDDを単純疱疹ウイルス（HSV）が向性を持つ中枢神経細胞に導入するには、HSV系ベクターの利用が特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res.169:385395）。 HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999; J. Virol. 73:519532)、Xu, H. 他(1994; Dev. Biol. 163:152161)。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なったセグメント群を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０３３２】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてCGDD をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、CGDDをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCGDDをコードするRNAが産生され、高レベルでCGDDが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。CGDDの、様々なタイプの細胞への導入を、αウイルスの広い宿主域が可能にする。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０３３３】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するため有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.他(1994) in Huber, B.E.およびB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページを参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０３３４】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、CGDDをコードするRNA分子のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０３３５】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０３３６】
相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のために当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、CGDDをコードするDNA分子のin vitroおよびin vivo転写によってRNA分子を作成し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０３３７】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするために、RNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を加える。
【０３３８】
CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法が、本発明の更なる実施態様に含まれる。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現の改変に効果的な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、CGDDの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においてはCGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においてはCGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０３３９】
特異ポリヌクレオチドの発現改変における有効性に対して、少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。CGDDをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するにはCGDDをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組合せライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０３４０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０３４１】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０３４２】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。CGDD、CGDDの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどが、このような組成物を構成しうる。
【０３４３】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０３４４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０３４５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０３４６】
CGDDを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。または、CGDDまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０３４７】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０３４８】
治療有効量は例えばCGDDやその断片、CGDDの抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど、症状や容態を回復させる活性処方成分の量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０３４９】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の全身の健康状態、患者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０３５０】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０３５１】
（診断）
別の実施態様では、CGDDに特異的に結合する抗体を、CGDDの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、CGDDやそのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。CGDDの診断アッセイには、抗体及び標識を用いて、ヒトの体液において、或いは細胞や組織の抽出物において、CGDDを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０３５２】
CGDDを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が当分野では周知であり、変容した、あるいは異常なレベルのCGDDの発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的CGDD発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験体から採取した体液または細胞抽出物とCGDDに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。CGDDの、被験体、対照および、生検組織からの疾患サンプルでの発現量を、標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０３５３】
本発明の別の実施態様では、CGDD をコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用い得る。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。CGDDの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を、これらのポリヌクレオチドを用いて検出し定量し得る。CGDDの存在の有無、更には過剰な発現をこの診断アッセイを用いて判定し、治療時のCGDDレベルの調節を監視する。
【０３５４】
一態様では、CGDD または近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチドを検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを、CGDD をコードする核酸配列の同定に用いうる。CGDDをコードする天然配列のみをプローブが同定するか、または対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかは、プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られているか、またはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかという、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーションのまたは増幅のストリンジェンシーとによって決まることになる。
【０３５５】
CGDDをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性をもプローブ類は持ち得る他、関連する配列群の検出に利用され得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:28-54の配列や、CGDD遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０３５６】
CGDD をコードするポリヌクレオチドに特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法としては、CGDD またはCGDD 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブ作製用ベクターにクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
CGDD をコードするポリヌクレオチドを用いて、CGDD の発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、胎盤障害が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、および外傷が含まれる。生殖障害には、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（cystsphaeochromocytomas）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）を含む。胎盤障害には、子癇前症、絨毛癌、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤梗塞やmaternal floor infarction、癒着胎盤、侵入胎盤(increate)および穿通胎盤、絨毛膜外性胎盤（extrachorial placentas）、絨毛血管腫（chorangioma）、絨毛血管分布過多（chorangiosis）、慢性絨毛炎（villitis）、胎盤絨毛浮腫（placental villous endema）、終末絨毛広範性線維症（widespread fibrosis of the terminal villi）、絨毛間腔血栓(intervillous thrombi)、出血性血管炎、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、非免疫性胎児水腫を含む。CGDD をコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、および、変容したCGDD 発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３５７】
或る特定の態様では、CGDD をコードするヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。CGDD をコードする配列に相補的なポリヌクレオチドは、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のCGDD をコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
CGDDの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験体から抽出された体液あるいは細胞とCGDDをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３５８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３５９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３６０】
CGDDをコードする配列群から設計したオリゴヌクレオチド群の更なる診断的利用には、PCRの利用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーはCGDDをコードするポリヌクレオチドの断片や、CGDDをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を好適には含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０３６１】
或る特定態様で、CGDD をコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。SSCPでは、CGDD をコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いDNAを増幅する。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰによって、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異が生じる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、また統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３６２】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば、少なくとも16の一般的ＳＮＰが非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンでの変異体（MBL2）は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することがわかっている。ＳＮＰはまた、生命を脅かす毒性等の薬剤への患者の反応に影響する遺伝変異体の同定という薬理ゲノミックスにおいても有用性がある。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の発生率が高くなるが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換えおよび選択の研究に有用であると共に、集団の起源と移動の調査にも有用である (Taylor, J.G. 他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.およびZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３６３】
CGDD の発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C. 他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
更に別の実施様態では、本明細書に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。大多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０３６４】
CGDDやその断片群、CGDDに特異的な抗体類を、別の実施態様では、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０３６５】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０３６６】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３６７】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.およびN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素への遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より2000年2月29日に発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３６８】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３６９】
別の実施態様は、本明細書に開示するポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、目的のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３７０】
CGDD特異抗体でCGDD発現レベルを定量することによってもプロテオームのプロファイルを作成し得る。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３７１】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０３７２】
別の実施様態では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３７３】
別の実施様態では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０３７４】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する(例えばBrennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他.(1997) 米国特許第5,605,662号)。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、Schena, M 編集 （1999、DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, London）に記載されている。
【０３７５】
CGDDをコードする核酸配列を用いて、本発明の別の実施態様では、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127134; Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149154).一度マッピングすると、核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限酵素断片長多型（RFLP）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357）。
【０３７６】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他 (1995) in Meyers, supra, pp.965-968).遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。CGDDをコードする遺伝子の物理地図上の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０３７７】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニング、またはその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３７８】
CGDD、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、本発明の別の実施態様では、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。CGDDと試験する薬剤との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３７９】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他（1984）PCT出願WO84/03564）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。CGDDやその断片と反応してから試験用化合物を洗浄する。結合CGDDを次に当分野で周知の方法で検出する。精製CGDDはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３８０】
CGDDと特異結合可能な中和抗体がCGDDとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを別の実施態様で用いうる。CGDDと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在をも、この方法で抗体を用いて検出できる。
【０３８１】
CGDDをコードするヌクレオチド配列を、別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０３８２】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３８３】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/311.017 、第60/313.070号、第60/313.071号、第60/314.678号、第60/316.692号、第60/317.913号、第60/322.182号、60/342.761号、第60/340.747号及び第60/369.129号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３８４】
１ cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３８５】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３８６】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で公知の推奨される方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel、他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３８７】
2 cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN２蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３８８】
3 シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、標準ABIプロトコル及び塩基呼び出し(base calling)ソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 7章）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３８９】
IncyteのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、および、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART(Schultz. J. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244)。 （HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するようにアセンブリした。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア(MiraiBio, Alameda CA)および LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列間の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって指定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０３９０】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は全体を引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３９１】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:28-54のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３９２】
4 ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定の細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質は、先ず公共のゲノム配列データベース（例えばgbpriやgbhtg）に対しGenscan遺伝子同定プログラムを実行して同定した。Genscanは、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶアセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質をコードするかを判定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質について問合せて分析した。潜在的な細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質はまた、既に細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質としてアノテーションが付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３９３】
5 ｃDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（ Stitched Sequence ）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ以上のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列上に或る区間が存在する場合、この３つの区間は全て等しいと考えられた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０３９４】
ストレッチ配列（ Stretched Sequence ）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載したようにアセンブリされた部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３９５】
６ CGDD をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:28-54をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:28-54 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３９６】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 もっとも、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３９７】
7 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(Sambrook 他,前出, 7章; Ausubel 他、前出, 4章)。
BLASTを適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３９８】
【数１】
Figure 2005502335
【０３９９】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０４００】
或いは、CGDD をコードするポリヌクレオチドを、それらが由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。CGDDをコードするcDNAの疾患特異的な発現を、得られるパーセンテージが反映する。cDNA配列群およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０４０１】
８ CGDD をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチドもまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０４０２】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０４０３】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２ +と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。
【０４０４】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０４０５】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０４０６】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、 15 秒、ステップ 3: 60℃、 1 分、ステップ 4: 72℃、 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステップ6: 72℃、5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０４０７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０４０８】
９ CGDD をコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型性の同定
一塩基多型性（SNP）として知られる一般的なＤＮＡ配列変異体は、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:28-54において同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにしてアセンブリし、これによって遺伝子内のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０４０９】
異なる4つのヒト集団のＳＮＰ部位における対立遺伝子頻度を分析するために、高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いる質量分析によって、更なる特徴付けのためにいくつかのＳＮＰが選択された。白人母集団は、ユタ州の83人、フランス人4人、ベネズエラ３人およびアーミッシュ派２人を含む92人(男性46人、女性46人)で構成された。アフリカ人母集団はすべてアフリカ系アメリカ人である194人( 男性97人、 女性97人)からなる。ヒスパニック母集団はすべてメキシコ系ヒスパニックの324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア人母集団は126人(男性64人、女性62人)からなり、親の内訳は中国人43%、日本人31%、コリアン13%、ベトナム人5%およびその他のアジア人8%と報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質分散を示さなかったSNPは他の三つの母集団においてさらに検査しなかった。
【０４１０】
１０ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:28-54から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０４１１】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０４１２】
11 マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ無孔の固体とするべきである（Schena ,M., ed. (1999) DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, Londoに記載されている)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31を参照)。
【０４１３】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０４１４】
組織または細胞サンプルの調製
全RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、200ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用いて析出させたエタノール、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100％エタノールである。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、14μl 5×SSC／0.2％ SDS中で再懸濁する。
【０４１５】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートを持つベクター含有細菌細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０４１６】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、０.１％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０４１７】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０４１８】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０４１９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC、0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において各々45℃で10分間、3度洗浄して乾燥させる。
【０４２０】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０４２１】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０４２２】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を、ハイブリダイズする種の重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、較正するcDNAのサンプルを２つの蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０４２３】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０４２４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。発現の変化が少なくともほぼ２倍、シグナルとバックグラウンドの割合が少なくとも2.5、および少なくとも40%のエレメントのスポットサイズを示すアレイエレメントは、差次的発現されるものとGEMTOOLS プログラム (Incyte Genomics)を用いて同定された。
【０４２５】
発現
例えば、マイクロアレイ実験に基づくと、SEQ ID NO:28 は癌細胞と正常細胞で差次的に発現された。SEQ ID NO:28 はマイクロアレイ分析で確認されたように差次的発現を示した。乳房腫瘍の組織学的および分子的評価が示しているところでは、乳癌の発達の進展が経る多段階プロセスにおいて、前癌状態の乳腺上皮細胞は、腫瘍形成につながる比較的確定した一連の事象を経験する。腫瘍の進行の種々の段階において二つのヒト乳房腫瘍細胞株 (MCF-7 と BT20) からのｃDNAの発現を、非悪性乳房上皮細胞株のHMEC (Clonetics, San Diego, CA)と比較して測定するために、比較実験デザインが用いられた。全ての培養細胞は供給業者の推奨事項に従って繁殖させ、70〜80％コンフルエントまで成長させてからRNA単離を行った。
【０４２６】
SEQ ID NO:28 の発現は、69才の女性の胸水から単離された非悪性乳房腺癌細胞株である、MCF-7細胞において少なくとも2倍減少した。MCF-7 は乳房上皮の特性、例えば、細胞質内エストロゲン受容体を介してエストラジオールを処理する機能や培養でドームを形成する能力などの特性を保持していた。SEQ ID NO:28 の発現は、74才の女性から単離された腫瘍塊の薄切片から遊出させた細胞から in vitro で生じた乳房癌細胞株であるBT20細胞においても少なくとも二倍の減少が見られた。これらの実験はテストされた乳房腫瘍細胞株でSEQ ID NO:28の発現が有意に低下していることを示し、SEQ ID NO:1とSEQ ID NO:28 が乳癌の診断マーカーとして、あるいは治療標的として有用であることをさらに確立している。
【０４２７】
たとえば、SEQ ID NO:30 は、肺癌患者の肺組織で、同じドナーのマッチした微視的正常組織と比較して、差次的発現を示したが、これはマイクロアレイ分析で判定した。CGDD-3 の発現は癌性肺組織において少なくとも2倍減少した。別の例でSEQ ID NO:30 は乳癌患者の乳房組織と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示したが、これはマイクロアレイ分析で判定した。CGDD-3 の発現は癌性乳房組織において少なくとも2倍減少した。SEQ ID NO:30 はアルツハイマー病患者の脳帯状回と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。CGDD-3 の発現は、アルツハイマー病の帯状組織において少なくとも2倍増加した。したがって、SEQ ID NO:30 は、肺癌や乳癌などの細胞増殖異常、並びに、アルツハイマー病などの神経疾患の病期判定および診断試験に有用である。
【０４２８】
SEQ ID NO:33 はマイクロアレイ分析で確認されたように差次的発現を示した。BT-20細胞は、74才の女性から単離された腫瘍塊の薄切片から遊出させた細胞群からin vitroで得た乳癌細胞系株である。BT-20細胞を強力な分裂促進因子である上皮細胞成長因子(EGF)で処理すると、SEQ ID NO:33 の発現は少なくとも二倍下方制御されることが明らかになった。さらに、正常ドナーから単離された初代上皮細胞系(HMEC 細胞)とBT-20、MCF7(69才女性の胸水から単離された非悪性乳房腺癌細胞株)、MDA-mb-231 (ヌードマイスで不十分に分化された腺癌を形成する51才女性の胸水から単離された乳房腫瘍細胞株)、Sk-BR-3 (43才の女性の悪性胸水から単離された乳房腺癌細胞株)およびT-47D(浸潤性乳管癌の54才女性から得た乳癌細胞株)細胞との比較において、また、SEQ ID NO:33 は、HMEC細胞系に較べて癌性乳房細胞株の各々において少なくとも二倍下方制御されることを示した。さらに、SEQ ID NO:33 の発現は正常ドナーの初代前立腺上皮細胞に較べて、３つの前立腺腫瘍細胞系の中、２つにおいてもまた下方制御されることがわかった。これらの実験はSEQ ID NO:6 をコードするSEQ ID NO:33が、テストした乳房腫瘍細胞株や前立腺腫瘍細胞株においてかなり発現が少ないことを示す、さらに、乳癌および前立腺癌の病期判定、診断マーカーあるいは、治療標的としての、SEQ ID NO:6と SEQ ID NO:33 の利用性が確立される。 別の例でSEQ ID NO:42は差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。乳房腫瘍の組織学的および分子的評価が示しているところでは、乳癌の発達の進展が経る多段階プロセスにおいて、前癌状態の乳腺上皮細胞は、腫瘍形成につながる比較的確定した一連の事象を経験する。早期の腫瘍発達イベントとして導管過形成がある。急速な新生物成長中の細胞は次第に浸潤性の癌に進行し、肺、骨、そして潜在的には他の臓器へ転移するようになる。腫瘍進行と悪性転換との過程に影響しうる変数としては、遺伝因子、環境因子、成長因子、及びホルモンがある。この過程の複雑さに基づいて、悪性転換の過程を受けるヒト乳腺上皮細胞集団を研究し、特定進行段階と、表現型と分子との特徴を関連付けることが重要である。
【０４２９】
この実験では、初代のヒト乳房上皮細胞(HMEC)を腫瘍進行の種々の段階における乳癌細胞株と比較した。すべての細胞は、供給業者の推奨する培養液中で70〜80%のコンフルエンスまでに増殖させて、RNAを収集した。MCF7 は非乳腺癌細胞株であり、或る69才の女性の胸水から単離された。MCF-7 は乳房上皮の特性、例えば、細胞質内エストロゲン受容体を介してエストラジオールを処理する機能や培養でドームを形成する能力などの特性を保持していた。Ｔ-47Dは、乳房の浸潤性管癌を有する54才の女性から得た胸水から単離された乳癌細胞株である。Sk-BR-3は乳腺癌細胞株であり、或る43才の女性の悪性胸水から単離された。これはヌードマウスに注入した場合、不十分に分化された腺癌を形成する。SEQ ID NO:42 の遺伝子発現は、HMEC 細胞に比べて乳癌株で少なくとも2倍減少していた。
【０４３０】
別の実験において、SEQ ID NO:42 の発現プロファイルを種々の乳癌細胞株において評価したが、これは非悪性乳房上皮細胞株、MCF-10A (乳房乳腺細胞株、すなわち、乳房線維嚢胞病の36才の女性から単離された腔管性（luminal ductal）の特性を有する)と較べて行った。細胞はRNA収集前に無血清TCH 限定培地で70%-80%のコンフルエンスにまで増殖した。SEQ ID NO:42の発現は次の細胞株において少なくとも2倍減少していた。すなわち、MCF7とBT-20（或る74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出させた細胞群からin vitroで得た乳癌細胞株）である。
【０４３１】
他の例において、SEQ ID NO:42 の遺伝子発現プロフィールをMCF-10A細胞と比較して、種々の乳癌細胞株で評価した。これらの細胞株はすべてRNAを収集する前に、化学的に成分が明らかな無血清H14 培地で70-80%のコンフルエンスまで増殖させた。これらの条件において、SEQ ID NO:42 の発現はMCF-10A 細胞に較べてT-47D 細胞では少なくとも二倍減少した。
【０４３２】
他の例において、SEQ ID:45はステロイドでの処理に応答して差次的に発現した。ステロイドは、コレステロール、胆汁酸、ビタミンD、ホルモン等の脂質可溶性分子の１クラスであり、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン（cyclopentanoperhydro-phenanthrene）に基づく共通の4リング構造を共有し、広範囲な機能を果たす。例えば、コレステロールは膜流動性を制御する細胞膜の1成分である。それは脂質を可溶化して、消化中に小腸で吸収を促進する胆汁酸の前駆体でもある。ビタミンDは小腸におけるカルシウムの吸収を調節し、血漿におけるカルシウムの濃度を制御する。副腎皮質、卵巣、精巣によって生成されるステロイドホルモンには、グルココルチコイド、電解質コルチコイド、アンドロゲン、エストロゲンが含まれる。それらは核内の特定の遺伝子の転写を調節する細胞内受容体に結合することにより、多様な生体プロセスを制御する。例えばグルココルチコイドは、肝臓における糖新生の調節により血糖濃度、脂肪組織のリポリシスの促進により脂肪酸の血中濃度を上昇させ、中枢神経内のカテコールアミンへの感度を調節し、炎症を減少する。主要な電解質コルチコイドであるアルドステロンは副腎皮質により生成され、ナトリウムイオン再吸収を促進するよう腎臓の遠位尿細管の細胞に作用する。精巣内のライディヒの間細胞により生成されるアンドロゲンには、思春期の変化すなわち精子の生成と第二次性徴の維持を誘発する男性ホルモンテストステロン等がある。女性ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンは、卵巣そしてさらに妊娠中に胎盤と胎児の副腎皮質により生成される。エストロゲンは、女性生殖プロセスと第二次性徴を調節する。プロゲステロンは、月経周期と妊娠中の子宮内膜における変化を調節する。
【０４３３】
ステロイドホルモンは、避妊法、また怪我や関節炎、喘息、自己免疫障害等の疾患での抗炎症治療において広範囲に利用されている。天然のプロゲスチンであるプロゲステロンは、無月経、異常子宮出血を治療するために、または避妊薬として主に使用される。内因性のプロゲステロンは、エストロゲンに初回刺激された子宮の内膜内の受精卵着床に備えた分泌作用の誘導と妊娠維持を担う。それは黄体形成ホルモン(LH）に応答して黄体から分泌される。外因性のプロゲスチンの主要な避妊効果には、LHのmidcycle surge(月経中期サージ)の抑制が関係する。細胞レベルでプロゲスチンは自由に拡散して標的細胞に入っていき、プロゲステロン受容体に結合する。標的細胞には、女性の生殖管、乳腺、視床下部、下垂体がある。いったん受容体に結合すると、プロゲスチンは視床下部からのゴナドトロピン放出ホルモンの放出の頻度を遅くし、排卵前LHサージを鈍くする。それにより卵胞成熟と排卵を防ぐ。プロゲステロンには、最小限のエストロゲンとアンドロゲンの作用がある。プロゲステロンは、肝臓でプレグナンジオールに代謝され、グルクロン酸と抱合する。
【０４３４】
6α-メチル-17-ヒドロキシプロゲステロンとしても知られるメドロキシプロゲステロン(MAH)は、プロゲステロンよりも約15倍も大きな薬理学的作用を有する合成プロゲスチンである。MAHは腎臓癌と子宮内膜癌、無月経、異常子宮出血および、ホルモン失調と関連する子宮内膜症の治療のために使用される。MAHは呼吸中枢刺激作用を有し、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患あるいは炭酸過剰症によって引き起こされる、血液の低酸素化の症例に使用されている。
【０４３５】
コルチコステロイドは炎症を緩和して、免疫応答を抑制するために使用される。コルチコステロイドは、炎症反応を仲介するサイトカインの調節により、好酸球、好塩基球、気道上皮性細胞機能を阻害する。コルチコステロイドは、炎症部位で白血球侵入を阻害し、炎症反応のメディエーターの機能において干渉し、さらに体液の免疫応答を抑制する。コルチコステロイドは、アレルギー、喘息、関節炎、皮膚病を治療するために使用される。ベクロメタゾンは、ステロイド依存性喘息を治療、アレルギーまたは非アレルギー（血管運動性）鼻炎に付随する症状を緩和、あるいは外科的切除に続く再発性鼻ポリープを予防するために使用される合成グルココルチコイドである。鼻腔内ベクロメタゾンの抗炎症作用および血管収縮作用は、ヒドロコルチゾンによるものより5000倍強力である。ブデソニドは、アレルギー性鼻炎または喘息に付随する症状を制御するために使用されるコルチコステロイドである。ブデソニドは、全身作用は弱いが強い局所抗炎症作用を有する。デキサメタゾンは、抗炎症組成物または免疫抑制組成物において使用される合成グルココルチコイドである。喘息の症状を予防するために吸入薬においても使用される中枢神経系に到達する強力な能力のために、デキサメタゾンは脳水腫を調節するために通常選択される治療である。デキサメタゾンは、ヒドロコルチゾンより約20〜30倍、そしてプレドニゾンより5〜7倍強力である。プレドニゾンは肝臓で代謝されて、活性型であるプレドニゾロン（抗炎症特性を有するグルココルチコイド）になる。プレドニゾンはヒドロコルチゾンより約4倍強力であり、そしてプレドニゾンの作用持続時間はヒドロコルチゾンとデキサメタゾンの中間である。プレドニゾンは、同種移植の拒絶反応、喘息、全身性紅斑性狼瘡、関節炎、潰瘍性大腸炎、その他の炎症症状を治療するために使用される。ベタメタゾンは抗炎症作用と免疫抑制作用を有する合成グルココルチコイドであり、乾癬と、水虫や白癬等の真菌感染症を治療するために使用される。
【０４３６】
コルチコステロイドの抗炎症作用は、リポコルチンと総称されるホスホリパーゼA2抑制タンパク質に関係すると考えられる。逆にリポコルチンは、前駆体分子アラキドン酸の放出を阻害することによりプロスタグランジン、ロイコトリエン等炎症の強力な媒介物の生合成を制御する。提案されている作用の機序には、減少したIgE合成、白血球上で増加したβ-アドレナリン受容体の数、減少したアラキドン酸代謝が含まれる。慢性気管支喘息等の即時型アレルギー反応中、アレルゲンは肥満細胞の表面上のIgE抗体を架橋しするが、それによってこれらの細胞の化学走化性物質の放出が誘発される。従って肥満細胞の流入と活性化が、喘息患者の炎症と口腔粘膜の過剰刺激感受性に部分的に関与している。この炎症は、コルチコステロイドの投与によって遅れ得る。
【０４３７】
肝臓代謝とホルモン除去機構への影響は、薬剤の薬力学を理解するために重要である。ヒトC3A肝臓細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝臓腫瘍を患う15歳の男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中の初代ヒト肝細胞の多くの特徴を有する。すなわち、i)インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体の発現、ii)α-フェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、iii)アンモニアの尿素とグルタミンへの変換、iv)芳香アミノ酸代謝、v)グルコースとインシュリンの無い培地での増殖、である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am J Physiol 272:G408-G416)。
【０４３８】
次の条件下で、SEQ ID:45は未処理のC3A細胞に較べて、薬物処理において少なくとも２倍増加した。すなわち、（1)メドロキシプロゲステロン(MAH)の用量10μMで1時間処理と3時間処理、ベクロメタゾンの用量1μMで3時間処理と用量10μMで1時間と3時間の処理、ブデソニドの用量１μMと10μMで１時間と３時間の処理および用量100μMで１時間と６時間の処理、そして最後にベタメサゾンの用量10μMで１時間の処理と用量100μMで１時間、３時間および6時間の処理、である。
【０４３９】
これらの実験はSEQ ID NO:42 とSEQ ID NO:45の有意な差次的発現プロフィールを示し、さらに、細胞増殖、分化または細胞死に関連するタンパク質類が関与する疾患の診断マーカー、や、病期判定のツールとして、あるいは、治療標的として、SEQ ID NO:42 とSEQ ID NO:45を利用できることを確証する。
【０４４０】
他の例において、SEQ ID:49は、マイクロアレイ技術を用いると差次的に発現されていた。 肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。NSCLCを全部合わせると全症例中の約70％になり、SCLCは約18％である。肺癌の発生と進行に関する分子生物学および細胞生物学的理解は不完全である。3番染色体での欠失は肺癌に一般的であり、この領域に腫瘍抑制遺伝子の存在を示すと思われる。K-rasの活性化突然変異は肺癌で一般的に見られ、この疾患の1つのマウスモデルの基礎である。正常肺を同じドナーの肺腫瘍に較べて種々の実験を行った。SEQ ID NO:49の発現は肺腫瘍サンプルにおいて少なくとも2倍減少していた。
【０４４１】
卵巣癌の主なものは上皮細胞から由来しており、上皮卵巣癌の患者の70%は疾患の後期段階にある。その結果、この疾患に対する長期的生存率は極めて低い。卵巣癌の早期マーカを同定できれば、生存率を大きく増加できるであろう。卵巣癌につながる分子的現象は十分理解されていない。わかっている異常のいくつかにはp53の突然変異とミクロサテライトの不安定性がある正常卵巣を卵巣腫瘍と比較すると遺伝子発現パターンが異なっていると考えられるため、これらの組織の遺伝子発現を調べて、卵巣癌のマーカーの可能性があるものを同定した。SEQ ID NO:49 の発現は、同じドナーの正常肺組織に比べると卵巣腫瘍組織において少なくとも2倍の増加があった。
【０４４２】
これらの実験によって、様々な条件におけるSEQ ID:22の有意な差次的発現は更に、SEQ ID:49が診断的マーカー、病期判定のツールとして、あるいは癌の治療標的として利用できることを証明できる。
【０４４３】
１２ 相補的ポリヌクレオチド
CGDDをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然CGDDの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。CGDDのコーディング配列とOligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）とを用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。CGDDをコードする転写物にリボソームが結合するのを阻害するよう相補的なオリゴヌクレオチドを設計すると、翻訳を阻害する。
【０４４４】
１３ CGDDの発現
CGDDの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。CGDDを細菌内で発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNAの転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターに、cDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。CGDDを抗生物質耐性細菌に発現させるには、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発する。CGDDの真核細胞での発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。CGDDをコードするcDNAとバキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる(Engelhard, E.K 他、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945)。
【０４４５】
CGDDは殆どの発現系で、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。CGDDから、精製後にGST部分を、特異的に操作した諸部位においてタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、Ausubel他(前出、10および16章)に記載がある。CGDDをこれらの方法で精製し直接用いて、以下の実施例１７、１８及び１９の、適用可能なアッセイを行い得る。
【０４４６】
１４ 機能的アッセイ
CGDD機能は、CGDDをコードする配列群の、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの発現によって算定する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現させる強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORT（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen,）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０４４７】
CGDDの遺伝子発現への影響は、CGDDをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率よく分離できる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、これら細胞から、当業者に周知の方法で精製できる。CGDDと目的の他の遺伝子群とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０４４８】
１５ CGDDに特異的な抗体の作製
CGDDの実質的精製を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０４４９】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてCGDD アミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel 他、11章）。
【０４５０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、FMOC 化学法を用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel 他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗CGDD活性を検査するには例えば、ペプチドまたはCGDDを基板に結合し、1％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０４５１】
１６ 特異的抗体を用いる天然CGDD の精製
天然CGDDや組換えCGDDをCGDDに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗CGDD 抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０４５２】
CGDDを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CGDDを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCGDDとの結合を切るような条件で（例えば、或るpH２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させCGDDを収集する。
【０４５３】
１７ CGDDと相互作用する分子の同定
CGDDまたは生物学的に活性なその断片を、125I ボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識CGDDと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたCGDD複合体を有する全てのウェルをアッセイする。CGDD濃度を様々に変えて得たデータでCGDDの数量、候補分子との親和性および会合についての値を計算する。
【０４５４】
別法では、CGDD と相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０４５５】
CGDDはまた、ハイスループット型の酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の2大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を判定できる（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０４５６】
１８ CGDD 活性の実証
CGDD活性を実証するために、最終分化や細胞周期進行の誘導の測定を、CGDDが哺乳動物細胞培養系において生理的に高まったレベルで発現する際に行う。cDNAを高いレベルで発現させる強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしてはPCMV SPORT（Life Technologies, Gaithersburg, MD）およびPCR 3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、好適には内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP) (Clontech, Palo Alto, CA)、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。フローサイトメトリーは、細胞周期進行か最終分化に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジン取込量の低下によって計測されるDNA合成の上方または下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および、フルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０４５７】
CGDD 活性のin vitroアッセイは或いは、アンチセンスCGDD RNAを過剰発現する正常なヒト線維芽細胞の形質転換を測定する(Garkavtsev, I. および Riabowol, K. (1997) Mol.Cell Biol.17:2014-2019). CGDDをコードするcDNAをpLNCXレトロウイルスベクターにサブクローニングし、アンチセンスCGDD RNAの発現を可能にする。結果として得た構成物を、狭宿主性(ecotropic)BOSC23ウイルスパッケージング細胞株に形質移入する。BOSC23培養上澄みが含むウイルスを用いて、アンホトロピックCAK8ウイルスパッケージング細胞株を感染させる。CAK8培養上澄みが含むウイルスを用いて、正常なヒト線維芽細胞(Hs68)を感染させる。感染細胞を次の形質転換細胞の定量化できる特徴的性質について評価する。すなわち、免疫不全マウスに注入された場合の接触阻害の喪失に関連する培養中の高密度増殖、懸濁液中または軟寒天での増殖、コロニーまたは集塊の形成、血清必要条件の低下、および腫瘍誘発能について評価する。CGDDの活性は、Hs68細胞の形質転換の程度に比例する。
【０４５８】
CGDDの発現は或いは、哺乳動物細胞株で、CGDDをコードする真核生物発現ベクターで細胞を形質転換させて成し得る。真核生物発現ベクターは市販されており、これらベクターを細胞に導入する技術は当業者に周知である。CGDDの細胞局在をアッセイするには、細胞の分画をJiang H. P. 他 (1992; Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7856-7860)の記載のように行う。簡潔には、低速遠心法でペレット化した細胞の再懸濁を、バッファ中(10 mM TRIS-HCl、pH 7.4/ 10 mM NaCl/ 3 mM MgCl2/ 5 mM EDTAに10 μg/mlアプロチニン、10 μg/mlロイペプチン、10 μg/mlペプスタチンA、0.2 mMフッ化フェニルメチルスルホニル含有)で行い、ホモジナイズする。ホモジェネートの遠心分離を600×ｇで5分間おこなう。その上澄みを100,000×gで60分間、超遠心して、粒子画分とサイトゾル画分の分離を行う。核画分を得るため、600×gペレットの、蔗糖溶液での再懸濁(0.25 M蔗糖/ 10 mM TRIS-HCl, pH 7.4/ 2 mM MgCl2)を行い、再遠心を600×gで行う。各画分からの等量のタンパク質をSDS/10%ポリアクリルアミドゲルにかけ、膜にブロットする。ウェスタンブロット分析を行い、これにはCGDD抗血清を用いる。、核画分での対応するバンドの強度を他の画分の強度に比較して、CGDDの局在性を査定する。別法では、細胞画分でのCGDDの存在を、CGDDに特異的な蛍光抗体を用いて、蛍光顕微鏡で検査する。
【０４５９】
CGDD活性は、in vitro結合アッセイで、その関連するRasスーパーファミリー蛋白と相互作用する能力として実証され得る。候補Rasスーパーファミリー蛋白はグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-Sepharose上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。100 mM NaCl、2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.2 mM DTT、100μM AMP-PNP、および10μM GDPを含む20ｍM Trisバッファー(pH 8.0)、30℃で20分間インキュベーションして、GDPでRasスーパーファミリー蛋白を負荷する。CGDDはバキュロウイルス系でFLAG融合タンパク質として発現される。CGDD-FLAG融合タンパク質を含むこれらのバキュロウイルス細胞の抽出物は、GSTビーズでプレクリアし、次にGST-Rasスーパーファミリー融合タンパク質とインキュベーションする。形成された複合体は、グルタチオン-Sepharoseによって沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロットされ、市販の抗FLAG抗体でプローブされる。CGDD活性は、複合体中に検出されるCGDD-FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０４６０】
または、LiおよびCohen (Li, L. および S.N. Cohen (1995) Cell 85:319-329)が実証したように、遺伝子の5'端へのアンチセンス配列を設計し、この配列を転写するベクターでNIH 3T3細胞に形質移入して、CGDDの腫瘍化抑制能の測定を成しうる。内因性遺伝子を抑制すると、形質転換した線維芽細胞は、ヌードマウスに導入すれば転移性腫瘍を形成できる細胞塊を産生しうる。
【０４６１】
CGDD活性のアッセイは或いは、注入CGDDの、母性転写物の分解への効果を測定する。Swissアルビノマウスからの卵母細胞の収集、注入、培養の手順は、Stutz 他(前出)に記載がある。母性RNAの分解の、対照卵母細胞に比しての低下が、CGDD活性を示す。CGDD活性の測定は或いは、精製CGDDがRNAアーゼに結合する能力として、実施例１７に記載のアッセイで測定するように成される。
【０４６２】
別法では、CGDD活性のアッセイは、CGDD発現プラスミドで形質移入したCOS細胞におけるシンシチウム形成を、2成分融合(two-component fusion)アッセイ(前出Miに記載)で測定する。このアッセイが利用する事実は、ヒトのインターロイキン12 (IL-12)がヘテロダイマーであり、その構成サブユニットの分子量が35 kD (p35) と40 kD (p40)であることである。p35の遺伝子を持つ発現プラスミドで形質移入したCOS細胞を、p40とCGDDとの遺伝子を持つ発現プラスミドを同時移入したCOS細胞と混ぜる。IL-12活性の、結果として得た馴化培地でのレベルが、このアッセイのCGDD活性に相当する。合胞体形成はまた、光顕で測定しうる(Mi 他、前出)。
【０４６３】
CGDD活性の別のアッセイは、スイスマウス3T3細胞における新規開始DNA合成の量として細胞増殖を測定する。CGDDをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを当分野で公知の方法を用いて、静止状態の3T3培養細胞に移入する。一過性に形質移入された細胞は次に、[3H]チミジンまたは放射性DNA前駆体([α32P]ATP等)の存在下でインキュベートされる。適用可能な場合には、様々な量のCGDDリガンドが、形質移入された細胞に加えられる。酸によって沈殿され得るDNAへの[3H]チミジンの取込は適切な時間間隔で測定され、その取込量は新規に合成されたDNAの量とCGDD活性に正比例する。
【０４６４】
CGDD活性を、或いはサイクリン-ユビキチンライゲーションアッセイにより測定する(Townsley, F.M. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2362-2367)。反応液は10 μlの容量中に、40 mMのTris.HCl (pH 7.6)、5 mMのMg Cl2、0.5 mMのATP、10 mMのホスホクレアチン、50 μgのクレアチン・ホスホキナーゼ/ml、1 mg還元カルボキシメチル化ウシ血清アルブミン/ml、50 μM ユビキチン、1 μMのユビキチンアルデヒド、1〜2 pmol 125I-標識化サイクリンB、1 pmol E1、1 μMのオカダ酸、M期分画1Aのタンパク質10 μg (活性E3-Cを含み本質的にE2-Cを含まない)と可変量CGDDを含む。反応液を18℃で６０分間インキュベートする。次にSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法によりサンプルを分離する。形成された125I-サイクリン-ユビキチンの量をPHOSPHORIMAGER分析で定量する。サイクリン-ユビキチン形成の量は反応物中のCGDDの活性に比例する。
【０４６５】
あるいは、CGDD 活性試験は [α32P]ATPのような放射標識ヌクレオチドを用いて、DNA 合成時のDNAへの放射標識の取込み量、または、アポトーシスを伴うDNAの断片化を測定する。CGDDをコードするcDNAを持つプラスミドで、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物細胞に形質移入する。次に細胞のインキュベートを、放射標識ヌクレオチドと共に、種々の時間長で行う。染色体DNAを収集し、放射能の検出にシンチレーションカウンターを用いる。放射ラベルの、染色体DNAへの取込は、細胞周期の刺激の程度に比例する。CGDDのアポトーシス促進を判定するには、染色体DNAを上記のように収集し、分析にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、当分野で周知の方法で行う。DNA断片化は定量のため非移入対照細胞と比較し、これがCGDDのアポトーシス活性に比例する。
【０４６６】
CGDDのシクロフィリン活性の別法での測定には、キモトリプシン共役アッセイを用い、シス〜トランス相互転換の速度を測定する(Fischer, G., Bang, H., および Mech, C. (1984) Biomed. Biochim. Acta 43: 1101-1111)。キモトリプシンを用いてXaa-Proペプチド結合でのトランス基質切断活性を推計する。ここでシス〜トランス異性化の速度定数を得るには、緩徐相での基質水解の速度定数を測定する。サンプルのインキュベートを免疫抑制剤CsAかFK506の有無の中で行い、反応開始にはキモトリプシンを添加し、蛍光反応を測定する。酵素的速度定数を求める式は kapp = kH20 + kenzであり、ここでは一次速度式が示され、1単位のPPIase活性の定義は kenz (s-1)である。
【０４６７】
あるいは、CGDDのシクロフィリン活性は免疫抑制剤シクロスポリンに対する立体特異的結合の親和性を測定する定量的イムノアッセイによってモニターされる(Quesniaux, V.F. 他(1987) Eur. J. Immunol. 17: 1359-1365)。このアッセイでは、シクロフィリン-シクロスポリン複合体を固相にコートし、結合の検出に、抗シクロフィリンウサギ抗血清を抗グロブリン-酵素抱合体で増強して用いる。
【０４６８】
或いはCGDDの活性は、エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いた気相で、FKBPと免疫抑制剤との非共有結合の測定の為に開発された或る結合アッセイによりモニターされる(Trepanier, D.J., 他(1999) Ther.Drug Monit.21:274-280)。エレクトロスプレーイオン化でイオンを発生するには、強い電場の存在下で、高電荷の液滴の極細スプレーを発生させる。液滴のサイズが小さいほど、表面の電荷密度が高い。イオンは静電気的に質量分析器に誘導され、ここで反対電荷のイオンの発生が、空間的に分離したソースで成された後、毛細管注入口へ掃引され、ここでイオン流が合流され、反応が起きる。結合したCGDD/免疫抑制剤複合体と未結合のCGDD/免疫抑制剤複合体の荷電状態を比較することによって、相関的結合親和性が確立され、in vitro 結合および免疫抑制活性と関連づけられる。
【０４６９】
19 CGDD 分泌活性
或る高処理アッセイを用いて、真核細胞内に分泌されるポリペプチドを同定しうる。このようなアッセイの1例では、ポリペプチド発現ライブラリを作製するため、5'に偏向したcDNAを、或るリーダーのないβラクタマーゼ遺伝子の5'末端に融合する。βラクタマーゼは便利な遺伝子レポーターである。理由は、この酵素が高い信号／ノイズ比と、低い内因性バックグラウンド活性とを示し、他のタンパク質に融合しても活性を保持するからである。或る2重プロモーター系によって、βラクタマーゼ融合ポリペプチドの発現を、細菌又は真核細胞でなしうる。これにはlacまたはCMVプロモーターを各々用いる。
【０４７０】
ライブラリは先ず細菌(大腸菌など)に形質転換され、真核生物系で分泌されうる融合ポリペプチドをコードするライブラリメンバーが同定される。哺乳類シグナル配列は、βラクタマーゼ融合ポリペプチドが細菌のペリプラズムへ移動するよう指示する。ペリプラズムでこれはカルベニシリンへの抗生物質耐性を授ける。カルベニシリン選択された細菌の単離を固体培地で行い、個々のクローンを液体培地で成長させ、生じた培養物を用いてライブラリメンバープラスミドDNAを単離する。
【０４７１】
哺乳類細胞、例えば、293細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)(( Life Technologies, Rockville, MD)で補充された、フェノールレッドを含まないDMEの100μl中で約40,000細胞/ウエルの密度で96ウエルの組織培養プレートに播種する。翌日、カルベニシリン耐性細菌から単離された精製プラスミドDNAを、15μｌのOPTI-MEM I 培養液で、移入される細胞の各ウエルの量を25μlまで希釈する。別のプレートにおいて1 μl のLF2000 試薬(Life Technologies) を25 μl/ウエルのOPTI-MEM Iに希釈する。次に25μlの希釈LF2000試薬は25μlの希釈DNAと合わせて、少し混合し、室温で20分間インキュベートする。生じたDNA-LF2000試薬複合体を次に、直接、293細胞の各ウェルに加える。細胞の形質移入はまた、適切な対照プラスミド(野生型βラクタマーゼ、リーダーのないβラクタマーゼ、又は例えばCD4融合したリーダーのないβラクタマーゼのいずれかを発現するプラスミド)で行う。
【０４７２】
形質移入の24時間後に、約90μlの細胞培養液を37℃にて10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中100_M ニトロセフィン (Calbiochem, San Diego, CA) と0.5 mM のオレイン酸(Sigma Corp. St. Louis, MO) でアッセイした。ニトロセフィンはβラクタマーゼの基質であり、加水分解されると黄色から赤へ顕著に変色する。βラクタマーゼ活性のモニターを、20分間、マイクロタイタープレートリーダーにおいて486nmで行う。486nmでの色吸収の増加が、形質移入した細胞培地でのβラクタマーゼ融合ポリペプチドの分泌に一致する。これは、融合ポリペプチドにおける真核生物シグナル配列の存在の結果である。対応するライブラリメンバープラスミドDNAのポリヌクレオチド配列分析を次に用いて、シグナル配列をコードするcDNAを同定する(米国特許出願09/803,317号（ファイル日は2001年3月9日）に記載されている)。例えば、このアッセイを用いてSEQ ID NO:14 は分泌タンパク質であることが示された。
【０４７３】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、本発明の記載した組成物、方法およびシステムの種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明が新規であり、有用なタンパク質およびそのコードするポリヌクレオチドを提供することは高く評価されるであろう。また、これらは薬物発見および疾患および症状の検出、診断および治療にこれらの組成物を使用する方法に用いられ得る。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。また、本発明をこのような実施態様の説明によって、開示した形態だけに網羅されるか、あるいは、制限されるものと見なされるべきでもない。さらに、一実施態様の要素は他の実施態様の一つ以上の要素と容易に組み合わされ得る。このような組合わせによって本発明の範囲内で多数の実施態様が形成され得る。本発明の範囲は下記の請求項およびそれに相当するものによって定義することを意図するものである。
【０４７４】
(表の簡単な説明)
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチドおよびポリペプチド実施様態の命名の概略である。
【０４７５】
表２は、本発明のポリペプチド実施例のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４７６】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリペプチド実施様態の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０４７７】
表４は、ポリヌクレオチド実施様態をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチドの選択した断片と共に示す。
【０４７８】
表５は、ポリヌクレオチド実施様態の代表的なcDNAライブラリを示す。
【０４７９】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０４８０】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０４８１】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０４８２】
【表１−１】
Figure 2005502335
【０４８３】
【表１−２】
Figure 2005502335
【０４８４】
【表２−１】
Figure 2005502335
【０４８５】
【表２−２】
Figure 2005502335
【０４８６】
【表２−３】
Figure 2005502335
【０４８７】
【表２−４】
Figure 2005502335
【０４８８】
【表２−５】
Figure 2005502335
【０４８９】
【表３−１】
Figure 2005502335
【０４９０】
【表３−２】
Figure 2005502335
【０４９１】
【表３−３】
Figure 2005502335
【０４９２】
【表３−４】
Figure 2005502335
【０４９３】
【表３−５】
Figure 2005502335
【０４９４】
【表３−６】
Figure 2005502335
【０４９５】
【表３−７】
Figure 2005502335
【０４９６】
【表３−８】
Figure 2005502335
【０４９７】
【表３−９】
Figure 2005502335
【０４９８】
【表３−１０】
Figure 2005502335
【０４９９】
【表３−１１】
Figure 2005502335
【０５００】
【表３−１２】
Figure 2005502335
【０５０１】
【表３−１３】
Figure 2005502335
【０５０２】
【表３−１４】
Figure 2005502335
【０５０３】
【表３−１５】
Figure 2005502335
【０５０４】
【表３−１６】
Figure 2005502335
【０５０５】
【表３−１７】
Figure 2005502335
【０５０６】
【表３−１８】
Figure 2005502335
【０５０７】
【表３−１９】
Figure 2005502335
【０５０８】
【表４−１】
Figure 2005502335
【０５０９】
【表４−２】
Figure 2005502335
【０５１０】
【表４−３】
Figure 2005502335
【０５１１】
【表４−４】
Figure 2005502335
【０５１２】
【表４−５】
Figure 2005502335
【０５１３】
【表４−６】
Figure 2005502335
【０５１４】
【表４−７】
Figure 2005502335
【０５１５】
【表４−８】
Figure 2005502335
【０５１６】
【表４−９】
Figure 2005502335
【０５１７】
【表４−１０】
Figure 2005502335
【０５１８】
【表４−１１】
Figure 2005502335
【０５１９】
【表４−１２】
Figure 2005502335
【０５２０】
【表４−１３】
Figure 2005502335
【０５２１】
【表４−１４】
Figure 2005502335
【０５２２】
【表４−１５】
Figure 2005502335
【０５２３】
【表５】
Figure 2005502335
【０５２４】
【表６−１】
Figure 2005502335
【０５２５】
【表６−２】
Figure 2005502335
【０５２６】
【表６−３】
Figure 2005502335
【０５２７】
【表６−４】
Figure 2005502335
【０５２８】
【表６−５】
Figure 2005502335
【０５２９】
【表６−６】
Figure 2005502335
【０５３０】
【表７−１】
Figure 2005502335
【０５３１】
【表７−２】
Figure 2005502335
【０５３２】
【表８−１】
Figure 2005502335
【０５３３】
【表８−２】
Figure 2005502335
【０５３４】
【表８−３】
Figure 2005502335

Claims (109)

  1. 以下の（ａ）乃至（i）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
    （ａ） SEQ ID NO:1-27（配列番号１乃至２７）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｂ） SEQ ID NO:2-5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9-10、 SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:14-15、SEQ ID NO:18-19、 SEQ ID NO:22-23および SEQ ID NO:27からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｃ） SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも98％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｄ） SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｅ） SEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｆ） SEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:16からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも9５％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    (ｇ) SEQ ID NO：20、SEQ ID NO:24およびSEQ ID NO:26からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９4％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
    (h) SEQ ID NO：1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および
    (i) SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
  2. SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  3. 請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  4. 請求項2に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  5. SEQ ID NO:28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
  8. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
  9. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
    （ａ） 前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
    （ｂ） そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
  10. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
  12. 以下の（ａ）乃至（i）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
    （ａ） SEQ ID NO:28-54からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｂ） SEQ ID NO:28-37、 SEQ ID NO:39-51および SEQ ID NO:54からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｃ） SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
    （ｄ） SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９4％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
    （ｅ） (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｆ） （ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    (ｇ) （c）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｈ） （d）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （i） （ａ）〜（h）のRNA等価物
  13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  14. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ） 前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
    （ｂ） 前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含む方法。
  15. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
  16. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ） ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
    （ｂ） 前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
  17. 請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
  18. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
  19. 機能的CGDDの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項17に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  20. 請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ） 前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
  21. 請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
  22. 機能的CGDDの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項21に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  23. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ） 前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
  24. 請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
  25. 機能的CGDDの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項24に記載の組成物の投与を含む治療方法。
  26. 請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
    （ｂ） 請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
  27. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
    （ｂ） 請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
    （ｃ） 試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
  28. 請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
    （ｃ） 可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
  29. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
    （ａ） 核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
    （ｂ） 処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
    （ｃ） ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
    （ｄ） 前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
  30. 生物学的サンプル中のCGDDの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
    （ａ） 前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
    （ｂ） 前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
  31. 請求項11に記載の抗体であって、
    （ａ） キメラ抗体
    （ｂ） 単鎖抗体
    （ｃ） Fab断片
    （ｄ） F（ab'）2 断片
    （ｅ） ヒト化抗体のいずれかである抗体。
  32. 請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
  33. CGDDの被検者での発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  34. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
  35. CGDDの被検者での発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  36. 請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
    （ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ） 前記動物から抗体を単離する過程と、
    （ｃ） 前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
  37. 請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
  38. 請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
  39. 請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
    （ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ） 前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
    （ｃ） 前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
    （ｄ） 前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
    （ｅ） SEQ ID NO：1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
  40. 請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
  41. 請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
  42. Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
  43. 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
  44. SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
    （ａ） 請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
    （ｂ） 特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
  45. SEQ ID NO:1-27 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ） 請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
    （ｂ） 前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-27からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
  46. マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
  47. ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
    （ａ） サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
    （ｂ） ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
    （ｃ） サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
  48. 或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
  49. 請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  50. 請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  51. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  52. 請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
  53. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有する或るヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを更に有することを特徴とするアレイ。
  54. 請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが前記のヌクレオチド分子の少なくとも１つと前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
  55. 請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
  56. SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  57. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  58. SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  59. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  60. SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  61. SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  62. SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  63. SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  64. SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  65. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  66. SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  67. SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  68. SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  69. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  70. SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  71. SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  72. SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  73. SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  74. SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  75. SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  76. SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  77. SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  78. SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  79. SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  80. SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  81. SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  82. SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  83. SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  84. SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  85. SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  86. SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  87. SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  88. SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  89. SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  90. SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  91. SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  92. SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  93. SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  94. SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  95. SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  96. SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  97. SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  98. SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  99. SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  100. SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  101. SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  102. SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  103. SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  104. SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  105. SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  106. SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  107. SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  108. SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  109. SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
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