JP2005500048A - 電気泳動用の緩衝液およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
シービング処方物を含む緩衝組成物またはシービング処方物を含まない緩衝組成物は、図に示されるようなキャピラリー電気泳動系とともに使用される場合に、有用である。この緩衝組成物は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯ、ならびに必要に応じてキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含有し得る。キャピラリー電気泳動系を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルを分離する方法もまた、記載されている。本発明の教示は、とりわけ、電気泳動機器（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス）の性能を改善する、緩衝組成物および／またはシービング（ゲル）処方物を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明の教示は、緩衝組成物および生物学的分子（例えば、核酸）の電気泳動に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
電気泳動は、一般に、サイズまたは長さに従って、生物学的分子（例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、タンパク質など）を分離するために使用される。
【０００３】
ＤＮＡ塩基配列決定およびフラグメント分析は、電気泳動分離の最も有用な実施形態の中の１つである。ＤＮＡ塩基配列決定において、例えば、ＤＮＡ配列決定産物は変性され、そして得られる一本鎖ＤＮＡサンプルが、分離用の電気泳動ゲルに適用される。
【０００４】
不運にも、分離するのが困難な特定の配列に関する配列決定誤差に直面することは、珍しくはない。１つのこのような問題は、「コンプレッション」と呼ばれ、一本鎖フラグメントがそれ自体にアニールして、特定の位置にて「ヘアピン」構造が形成する場合に、生じる。以下の概略図は、一般に、このような発生を例示している：
【０００５】
【化１】
これにより、フラグメントは、その長さから予測されるよりも速く、ゲルを通って移動し得、これにより、一緒に非常に近接して移動し、しばしば互いに重複するバンドを生じ得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明の教示は、とりわけ、電気泳動機器（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス）の性能を改善する、緩衝組成物および／またはシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）（ゲル）処方物を提供する。
【０００７】
種々の局面は、核酸の電気泳動用の緩衝組成物を提供する。この緩衝液は、例えば、電気泳動（ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝液であり得る。
【０００８】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ならびに（ｉｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー。例えば、この組成物は、カチオンとしてＢｉｓ−Ｔｒｉｓを、そしてアニオンとしてＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有し得る。種々の実施形態は、金属キレート剤としてＥＤＴＡをさらに含む。
【０００９】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、またはアスパラギン；および（ｉｉ）式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の組成物（ここで、ｍは、１〜３の整数（例えば、１）であり、そしてｎは、１〜４の整数（例えば、２）である）。
【００１０】
この組成物は、金属−キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含有し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、この組成物は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）を実質的に含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態において、この組成物は、７より高いｐＨ（例えば、７．５以上）を有する。いくつかの実施形態において、この組成物は、８未満のｐＨを有する。
【００１３】
種々の局面において、本発明の教示は、核酸の電気泳動用の分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ−ｇｅｌ）組成物を提供する。
【００１４】
種々の実施形態において、この分離ゲル組成物は、以下を含有する：（ａ）有機ポリマー、（ｂ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ならびに（ｃ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー。例えば、この組成物は、Ｂｉｓ−ＴｒｉｓおよびＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有し得る。
【００１５】
種々の実施形態において、この組成物は、界面活性剤を実質的に含まない（例えば、ＳＤＳを含まない）。
【００１６】
いくつかの実施形態において、この組成物は、７よりも高いｐＨ（例えば、７．５以上）を有する。種々の実施形態において、この組成物は、８未満のｐＨを有する。
【００１７】
本発明の教示のさらなる局面は、サンプルを分離するための装置に関する。
【００１８】
種々の実施形態において、装置は、以下を備える：アノード緩衝液（アノード液）チャンバ；カソード緩衝液（カソード液）チャンバ；アノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバとの間に延び、かつこのアノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバとを連絡する、電気泳動チャネル（例えば、管腔を有するキャピラリー管）；ならびに、アノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバおよびチャネルにおいて保持されるＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、連続緩衝液系。
【００１９】
種々の実施形態において、この連続緩衝液系は、ＴＡＰＳおよびＴＡＰＳＯのうちの一方または両方をさらに含み得る。例えば、この緩衝液系は、ＴＡＰＳをさらに含み得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、この装置は、チャネルにおいて保持されるシービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な（液体状態の）媒体）をさらに備え得る。
【００２１】
本発明の教示のなおさらなる局面は、核酸の電気泳動を行う方法に関する。
【００２２】
このような方法の種々の実施形態は、以下の工程を包含する：緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程（ここで、この緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む）；分析されるべき核酸を含むサンプルをこのチャネルに加える工程；および、電気泳動によってこのサンプルを分離する工程。
【００２３】
本発明の教示の方法の種々の実施形態は、以下の工程を包含する：（ａ）緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程（ここで、この緩衝液は、式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の化合物を含み、ここで、ｍは、１〜３の整数（例えば、１）であり、そしてｎは、１〜４の整数（例えば、２）である）；（ｂ）分析されるべき核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むサンプルをチャネルに加える工程；ならびに、（ｃ）電気泳動によってこのサンプルを分離する工程。
【００２４】
種々の実施形態において、本発明の教示の方法は、以下の工程を包含する：緩衝液をゲルに導入する工程（ここで、この緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む）；分析されるべき核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むサンプルを、このゲル上に適用する工程；およびこのゲルを横切る起電力の電位差を適用し、それによってこのサンプルを分離する工程。
【００２５】
種々の実施形態において、この分離工程は、７よりも高いｐＨ（例えば、７．５以上）にて行われる。いくつかの実施形態において、この分離工程は、８未満のｐＨで行われる。
【００２６】
本発明の教示は、温度制御されない（例えば、加熱装置内に配置されていない）低温領域（ｃｏｌｄ ｚｏｎｅ）（例えば、少なくとも３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍまたはそれよりも長い領域）を有するチャネル（例えば、キャピラリー管、または溝付きプレート）に関して、特に有用であり得る。
【００２７】
（種々の実施形態の説明）
ここで、種々の非限定的な、例示的な実施形態に対する参照がなされる。このような実施形態は、本発明の教示を限定することを意図しないことが理解される。対照的に、本発明の教示は、当業者によって理解されるような、代替物、改変物、および等価物を包含することが意図される。
【００２８】
一般には、本発明の教示は、とりわけ、電気泳動による分離を容易にする、組成物および方法を提供する（例えば、増加された分解能を提供する）。
【００２９】
実施形態は、例えば、電気泳動機器（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス）の性能を改善する、電気泳動緩衝液および／またはシービング処方物（例えば、ゲルまたは流動可能な（液体状態の）媒体）を提供する。しかし、本発明の教示は、ＣＥデバイスに限定されない。種々の実施形態において、本発明の教示は、電流が通過し得る電解質含有緩衝液を含有する組成物を提供する。
【００３０】
種々の実施形態に従って、本発明の教示は、電気泳動用の緩衝液を提供し、この緩衝液は、カチオンによる電荷が、サンプルのポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）に対して、負電荷を遮断するのを（例えば、立体的に）妨げるように配置されたカチオンを含む。このようなカチオンは、変性されたＤＮＡの再生を防止するのを補助し得ことが見出されている。このような効果は、温度制御のための手段（例えば、加熱アセンブリ）を備えていない領域を有する電気泳動装置において、特に有用であり得る。温度制御手段を欠いた領域は、しばしば、「低温領域」と呼ばれる。
【００３１】
「低温領域」は、例えば、電気泳動の間、周囲温度または周囲温度近辺である領域であり得る。特定の市販のシーケンサーは、１つ以上の低温領域を有し得る。例えば、いくつかの構成において、ＡＢＩ ３１０機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、第一の低温領域および第二の低温領域を備え得、第一の低温領域は、キャピラリーの注入端部から機器のオーブンまで延びる６．６ｃｍの領域によって規定され、第二の低温領域は、オーブンから検出器まで延びる３．８ｃｍの領域によって規定される。いくつかの構成において、ＡＢＩ ３１００機器は、それぞれ４．８ｃｍと４．５ｃｍの、同様に位置された低温領域を備え得る。本発明の教示は、例えば、とりわけ、このようなシーケンサーに関して有用であり得る。
【００３２】
本発明の教示の緩衝液のいくつかの実施形態は、カチオンとして、弱塩基性のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス［２−ヒドロエチル］イミノ−トリス［ヒドロキシメチルメタン］）を含む。水溶液中で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分子は、陽子を受け取って、共役酸形態（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ＋）を生じる。
【００３３】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、不活性であり、容易に調製され、かつ市販の供給源から容易に利用可能である（Ｍｏｒｔｉｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｃｌｉｎ．，Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．１５６９（１９７７）；およびＬｅｗｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４ ４９５（１９６６）を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から購入され得る。
【００３４】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、（ｉｉ）ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパン−スルホン酸）、および必要に応じて、（ｉｉｉ）キレート剤。本明細書中で提供されるいくつかの処方物は、以下を含有する：（ｉ）１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、（ｉｉ）１００ｍＭ ＴＡＰＳ、および（ｉｉｉ）１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８）。
【００３５】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、ＴＡＰＳまたはＴＡＰＳＯと１〜２ｍＭのＥＤＴＡを１：１の比で、５０〜２００ｍＭ（例えば、１００ｍＭ）のＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含有する。いくつかの実施形態において、緩衝組成物は、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＴＡＰＳＯ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する。
【００３６】
本明細書中に記載される種々の処方物において、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）は、ＴＡＰＳで置換され得るか、またはそれに加えて含まれ得る。さらに、アスパラギンが、緩衝液中において、ＴＡＰＳで置換され得る。
【００３７】
種々の実施形態において、以下を含む分子が、緩衝組成物中に含まれる：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２（ここで、ｍ＝１、２、３、．．．ｍ（整数）、ｎ＝１、２、３、．．．ｎ（整数）（例えば、ｍ＝１〜３でｎ＝１〜４であるか、または例えば、ｍ＝１でｎ＝２である））。
【００３８】
本発明の教示は、電気泳動用の、ゲルまたは流動可能な分離媒体組成物を一部提供する。種々の実施形態において、分離ゲル組成物は、以下含有する：（ａ）１種以上の有機ポリマー、および（ｂ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ。いくつかの実施形態において、本発明の教示に従うゲル組成物は、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバーをさらに含有する。種々の実施形態において、このゲル組成物は、ＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有する。
【００３９】
種々の実施形態に従って、緩衝組成物は、シービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な分離媒体）（例えば、米国特許第５，１２６，０２１号、およびＷＯ ０２／２４３１３（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）において記載されるシービング媒体）に含まれる。
【００４０】
本発明の教示に従う組成物としては、例えば、シービング成分および表面相互作用成分（例えば、ＷＯ ０２／２４３１３（本明細書中で参考として援用される）において記載されるようなもの）が挙げられ得る。
【００４１】
種々の実施形態において、この組成物のシービング成分は、１種以上の非架橋アクリルアミドポリマーを含む。非架橋アクリルアミドポリマーとしては、例えば、直鎖状ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ））、分枝鎖ポリマー、および星状ポリマーが挙げられ得る。
【００４２】
種々の実施形態において、この組成物の表面相互作用成分は、１種以上の無電荷でかつ非架橋性の水溶性シリカ吸着ポリマーを含む。このような成分は、以下の参考文献に記載されるような、種々の化学分類に属し得る：Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９８２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｆｒａｎｋｓ編、Ｗａｔｅｒ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３）；など。本発明の教示の、無電荷の水溶性シリカ吸着ポリマーとしては、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド、Ｎ−一置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、この表面相互作用成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）を含む。
【００４３】
種々の実施形態において、本発明の教示の組成物のポリマーは、ポリビニルラクタム（例えば、ポリビニルピロリドン）；Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド；およびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される。
【００４４】
本発明の教示の組成物中に含まれ得る種々のポリマーとしては、以下において開示されるポリマーが挙げられるがこれらの限定されない：米国特許第５，５５２，０２８号、同第５，５６７，２９２号、同第６，３８７，２３４号；ＷＯ ０２／２４３１３；Ｈ．Ｈｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００２、２３、１４２１−１４２８；およびＭ．Ｎ．Ａｌｂａｒｇｈｏｕｔｈｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００１、２２、７３７−７４７；Ｌｉｇｕｏ Ｓｏｎｇら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００１，２２，７２９−７３６；Ｄｅｈａｉ Ｌｉａｎｇら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００，２１，３６００−３６０８（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【００４５】
キャピラリー電気泳動は、例えば、任意の適切なキャピラリー（例えば、溶融シリカキャピラリー管、あるいはガラス製プレートもしくはプラスチック製プレート、または先端部に形成された溝）を使用して、実施され得る。種々の実施形態は、例えば、細長管の使用を企図しており、この管の各々は、例えば、約１０〜５００ミクロンの範囲内（例えば、約１００ミクロン以下）の内径を有する。必要に応じて、各管は、その長さに沿って、その外面を不透明なポリイミドコーティングでコーティングされて、破損が防止され得る。いくつかの実施形態において、分離は、キャピラリー管に緩衝液のみを充填することによって行われるが、他の場合においては、同様に、シービング媒体（例えば、ポリマーまたはゲル）が加えられる。例示的なプロセスにおいて、サンプルは、キャピラリー管の入口端部に導入されて、電場が適用される。電場の影響下で、サンプルが分離され、これによって、個々の成分は、このキャピラリー管の長さの下方に移動される。キャピラリー管の出口端部または出口端部近辺において、不透明なポリイミドコーティングの小領域が除去されて、光検出領域が形成され得る。個々の成分は、例えば、蛍光吸光度または紫外線吸光度を使用して、検出され得る。
【００４６】
作動可能なキャピラリー電気泳動デバイスの共通の特徴の詳細は、多数の任意の利用可能な刊行物（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｍ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）（本明細書中で参考として援用される））において見出され得る。
【００４７】
種々の実施形態に従って、本発明の教示に従う緩衝液は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０配列決定装置またはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する、核酸の電気泳動分離において用いられる。
【００４８】
種々の実施形態において、本発明の教示に従う緩衝液は、「連続緩衝液系」で用いられる。この系は、選択されたｐＨおよびイオン強度の同じ緩衝液が、シービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な媒体）ならびにアノード緩衝液チャンバおよびカソード緩衝液チャンバ中で使用される系である。例えば、図１は、ＣＥデバイスを示しており、このデバイスは、カソード緩衝液レザバ１２、アノード緩衝液レザバ１４、ならびにこのカソード緩衝液レザバとアノード緩衝液レザバとの間に延びるキャピラリー管１６によって規定されるチャネルを備える。シービング媒体は、このチャネル内に保持され得る。連続緩衝液系は、本発明の教示の緩衝組成物を、アノード緩衝液レザバとカソード緩衝液レザバの両方、およびチャネルに含めることによって、提供され得る。このチャネルに充填されたサンプルは、適切な電源２０によって、このチャネルを横切る起電力の電位を適用することによって分離され得る。このサンプルの分離された成分は、適切な検出器／データ収集アセンブリ２２によって検出され得る。
【００４９】
種々の実施形態において、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＴＡＰＳ緩衝組成物は、ＣＥ装置のカソード緩衝液チャンバとアノード緩衝液チャンバの両方、およびこの装置の１つ以上のキャピラリーに保持されるシービング媒体（例えば、分離ゲルまたは流動可能な媒体）に含まれる。次いで、１種以上のポリヌクレオチド含有サンプルが、この装置を使用して分離され得、そのようにして調製され得る。
【００５０】
種々の実施形態において、核酸含有サンプルの分離は、少なくともｐＨ７、７よりも高いｐＨ、および／または少なくともｐＨ７．５にて実施される。いくつかの実施形態において、分離は、ｐＨ８以下で実施される。
【００５１】
以下の例は、例示目的のみとして意図され、いかなる様式においても、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
本発明の教示に従う緩衝液を、以下のように処方した：１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス［２−ヒドロエチル］イミノ−トリス［ヒドロキシメチルメタン］）、１００ｍＭ ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパン−スルホン酸）、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８）。
【００５３】
１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、金属によるキャピラリーコーティングに対する破損をなくすかまたは軽減した。
【００５４】
（実施例２）
低温度で誘導されたＤＮＡバンドの幅を、ＮａＴＡＰＳ（トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル−アミノ−プロパンスルホン酸ナトリウム塩）電気泳動緩衝液を用いるよりも、ＴｒｉｓＴＡＰＳを用いて観察した。カチオンであるＴｒｉｓおよびＮａが、電気泳動の間に、ＤＮＡバンドの幅にどのように影響を及ぼすかを理解するために、ＤＮＡ分離およびＤＮＡ移動度を、電気泳動緩衝液（この緩衝液は、異なる金属カチオン：Ｌｉ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、およびＣｓ；ならびに有機緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴｒｉｓＢｉｓｐｒｏｐａｎｅ、イミダゾール、アルギニン、アンモニウム、およびテトラペンチルアンモニウムを含む）を用いて、キャピラリー電気泳動の間に試験した。本明細書中で、ＧＳ７００ ２５０ヌクレオチド（ｎｔ）フラグメント、または単に２５０ｎｔフラグメントと呼ばれるフラグメント（これは、低いＤＮＡ変性条件下にて、異常に電気泳動を生じる推定ＤＮＡ二次構造を有する）のサイズは、キャピラリー電気泳動の間の電気泳動緩衝液として、Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＴＡＰを用いて、その推定されたサイズ（２５０ｎｔ）近辺で電気泳動したことに留意のこと。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分子構造の試験から、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、ＤＮＡ骨格に対して、陰イオンを遮断するのを立体的に妨げ、それによって電気泳動の間に再生する能力が低下され得ると考えられる。
【００５５】
（実施例３）
本発明の教示の緩衝液が電気泳動の間の核酸の変性を改善する能力を、以下のアッセイにおいて観察した：
（実施例３（Ａ））
１つのアッセイは、本発明の緩衝液がＧＳ７００ ２５０ヌクレオチド（ｎｔ）フラグメントの異常な移動度（この異常な移動度は、ＤＮＡ二次構造に起因すると考えられる）を低下させる能力を測定した。このアッセイからの結果を、表Ｉに報告する。ＰＯＰ３７ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０機器によって、７０℃にて電気泳動させる間、電気泳動緩衝液としてＴｒｉｓＴＡＰＳを用いると、２５０ｎｔのフラグメントは、２４４．５ｎｔのように移動し、そしてポリマー処方物中においてさらなる１Ｍの尿素を用いると、２５０ｎｔのフラグメントは、２４５．５ｎｔのように移動した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（さらなる尿素なし）を使用した場合、２５０ｎｔのフラグメントは、２４７．５ｎｔのフラグメントのように移動し、これは、さらなる１Ｍの尿素をポリマーに加えることによって得られるよりも、正確な２５０ｎｔにより近づいた。
【００５６】
（表Ｉ）
【００５７】
［表１］
＊ポリマー処方物に加えられたさらなる尿素
（実施例３（Ｂ））
第二に、４塩基コンプレッションであるＣＧＣＣの強度率を低下させる能力を、測定した。組成物に隣接したＣ末端フラグメントの間隔を測定し、次いで、正常な空間からの、このコンプレッション中のＣヌクレオチドの偏差を、算出した。完全に正常な空間または非コンプレッションは、結果として「０」偏差となる。ＤＮＡの変性が少なくなれば、コンプレッションはより増大し、それによって、正常からの３Ｃヌクレオチドの偏差は、より大きくなる。表ＩＩは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いた最小偏差、および余分な１Ｍの尿素を加えるよりも、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に変更するほうが、再度さらなる変性が見られることを示している。
【００５８】
（表ＩＩ）
【００５９】
［表２−１］
【００６０】
［表２−２］
＊このポリマーは、さらなる１Ｍの尿素を用いて処方された。
【００６１】
本発明の教示の種々の実施形態は、例えば、ＤＮＡのキャピラリー電気泳動において（特に、ＤＮＡ変性の増加が所望される場合に）有用な電気泳動緩衝液を提供することが、理解される。本発明の教示の実施形態は、電気泳動の間に、ＤＮＡ分解能および電気泳動速度の有意な損失なしに、増加したＤＮＡ変性を提供し得、これは、通常、余分な化学変性剤（例えば、尿素または２−ピロリジノン）を用いて観察される。
【００６２】
必要に応じて、本明細書中に記載される組成物および方法は、コンプレッションを軽減するかまたは最小にすることを目的とした他の方法と組み合わせて利用され得る。例えば、１つの方法は、相補的な鎖でしばしば見出されない二次構造に寄与する因子として、他の鎖の配列決定に関する。コンプレッションを排除するための別のストラテジーは、塩基対の量を低下させる試みにおいて、ゲル中に有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよび／または尿素）を含ませることである。なおさらなるストラテジーは、ＩＴＰまたは７−デアザ−ｄＧＴＰをＧＴＰで置換することによって、産物鎖における二次構造の安定性を低下させることである。また、水素結合を破壊するために、熱が使用され得、それによって、変性されたＤＮＡおよびＲＮＡが生じ得る。
【００６３】
本発明の教示は、種々の用途、方法、および組成物を参照して記載されているが、種々の変化および改変が、その精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。前出の例は、本発明の教示をさらに例示するために提供されており、限定として解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、種々の実施形態において有用なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイスの概略図である。
【０００１】
（分野）
本発明の教示は、緩衝組成物および生物学的分子（例えば、核酸）の電気泳動に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
電気泳動は、一般に、サイズまたは長さに従って、生物学的分子（例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、タンパク質など）を分離するために使用される。
【０００３】
ＤＮＡ塩基配列決定およびフラグメント分析は、電気泳動分離の最も有用な実施形態の中の１つである。ＤＮＡ塩基配列決定において、例えば、ＤＮＡ配列決定産物は変性され、そして得られる一本鎖ＤＮＡサンプルが、分離用の電気泳動ゲルに適用される。
【０００４】
不運にも、分離するのが困難な特定の配列に関する配列決定誤差に直面することは、珍しくはない。１つのこのような問題は、「コンプレッション」と呼ばれ、一本鎖フラグメントがそれ自体にアニールして、特定の位置にて「ヘアピン」構造が形成する場合に、生じる。以下の概略図は、一般に、このような発生を例示している：
【０００５】
【化１】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明の教示は、とりわけ、電気泳動機器（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス）の性能を改善する、緩衝組成物および／またはシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）（ゲル）処方物を提供する。
【０００７】
種々の局面は、核酸の電気泳動用の緩衝組成物を提供する。この緩衝液は、例えば、電気泳動（ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝液であり得る。
【０００８】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ならびに（ｉｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー。例えば、この組成物は、カチオンとしてＢｉｓ−Ｔｒｉｓを、そしてアニオンとしてＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有し得る。種々の実施形態は、金属キレート剤としてＥＤＴＡをさらに含む。
【０００９】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、またはアスパラギン；および（ｉｉ）式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の組成物（ここで、ｍは、１〜３の整数（例えば、１）であり、そしてｎは、１〜４の整数（例えば、２）である）。
【００１０】
この組成物は、金属−キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含有し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、この組成物は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）を実質的に含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態において、この組成物は、７より高いｐＨ（例えば、７．５以上）を有する。いくつかの実施形態において、この組成物は、８未満のｐＨを有する。
【００１３】
種々の局面において、本発明の教示は、核酸の電気泳動用の分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ−ｇｅｌ）組成物を提供する。
【００１４】
種々の実施形態において、この分離ゲル組成物は、以下を含有する：（ａ）有機ポリマー、（ｂ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ならびに（ｃ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー。例えば、この組成物は、Ｂｉｓ−ＴｒｉｓおよびＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有し得る。
【００１５】
種々の実施形態において、この組成物は、界面活性剤を実質的に含まない（例えば、ＳＤＳを含まない）。
【００１６】
いくつかの実施形態において、この組成物は、７よりも高いｐＨ（例えば、７．５以上）を有する。種々の実施形態において、この組成物は、８未満のｐＨを有する。
【００１７】
本発明の教示のさらなる局面は、サンプルを分離するための装置に関する。
【００１８】
種々の実施形態において、装置は、以下を備える：アノード緩衝液（アノード液）チャンバ；カソード緩衝液（カソード液）チャンバ；アノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバとの間に延び、かつこのアノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバとを連絡する、電気泳動チャネル（例えば、管腔を有するキャピラリー管）；ならびに、アノード緩衝液チャンバとカソード緩衝液チャンバおよびチャネルにおいて保持されるＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、連続緩衝液系。
【００１９】
種々の実施形態において、この連続緩衝液系は、ＴＡＰＳおよびＴＡＰＳＯのうちの一方または両方をさらに含み得る。例えば、この緩衝液系は、ＴＡＰＳをさらに含み得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、この装置は、チャネルにおいて保持されるシービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な（液体状態の）媒体）をさらに備え得る。
【００２１】
本発明の教示のなおさらなる局面は、核酸の電気泳動を行う方法に関する。
【００２２】
このような方法の種々の実施形態は、以下の工程を包含する：緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程（ここで、この緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む）；分析されるべき核酸を含むサンプルをこのチャネルに加える工程；および、電気泳動によってこのサンプルを分離する工程。
【００２３】
本発明の教示の方法の種々の実施形態は、以下の工程を包含する：（ａ）緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程（ここで、この緩衝液は、式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の化合物を含み、ここで、ｍは、１〜３の整数（例えば、１）であり、そしてｎは、１〜４の整数（例えば、２）である）；（ｂ）分析されるべき核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むサンプルをチャネルに加える工程；ならびに、（ｃ）電気泳動によってこのサンプルを分離する工程。
【００２４】
種々の実施形態において、本発明の教示の方法は、以下の工程を包含する：緩衝液をゲルに導入する工程（ここで、この緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む）；分析されるべき核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むサンプルを、このゲル上に適用する工程；およびこのゲルを横切る起電力の電位差を適用し、それによってこのサンプルを分離する工程。
【００２５】
種々の実施形態において、この分離工程は、７よりも高いｐＨ（例えば、７．５以上）にて行われる。いくつかの実施形態において、この分離工程は、８未満のｐＨで行われる。
【００２６】
本発明の教示は、温度制御されない（例えば、加熱装置内に配置されていない）低温領域（ｃｏｌｄ ｚｏｎｅ）（例えば、少なくとも３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍまたはそれよりも長い領域）を有するチャネル（例えば、キャピラリー管、または溝付きプレート）に関して、特に有用であり得る。
【００２７】
（種々の実施形態の説明）
ここで、種々の非限定的な、例示的な実施形態に対する参照がなされる。このような実施形態は、本発明の教示を限定することを意図しないことが理解される。対照的に、本発明の教示は、当業者によって理解されるような、代替物、改変物、および等価物を包含することが意図される。
【００２８】
一般には、本発明の教示は、とりわけ、電気泳動による分離を容易にする、組成物および方法を提供する（例えば、増加された分解能を提供する）。
【００２９】
実施形態は、例えば、電気泳動機器（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス）の性能を改善する、電気泳動緩衝液および／またはシービング処方物（例えば、ゲルまたは流動可能な（液体状態の）媒体）を提供する。しかし、本発明の教示は、ＣＥデバイスに限定されない。種々の実施形態において、本発明の教示は、電流が通過し得る電解質含有緩衝液を含有する組成物を提供する。
【００３０】
種々の実施形態に従って、本発明の教示は、電気泳動用の緩衝液を提供し、この緩衝液は、カチオンによる電荷が、サンプルのポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）に対して、負電荷を遮断するのを（例えば、立体的に）妨げるように配置されたカチオンを含む。このようなカチオンは、変性されたＤＮＡの再生を防止するのを補助し得ことが見出されている。このような効果は、温度制御のための手段（例えば、加熱アセンブリ）を備えていない領域を有する電気泳動装置において、特に有用であり得る。温度制御手段を欠いた領域は、しばしば、「低温領域」と呼ばれる。
【００３１】
「低温領域」は、例えば、電気泳動の間、周囲温度または周囲温度近辺である領域であり得る。特定の市販のシーケンサーは、１つ以上の低温領域を有し得る。例えば、いくつかの構成において、ＡＢＩ ３１０機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、第一の低温領域および第二の低温領域を備え得、第一の低温領域は、キャピラリーの注入端部から機器のオーブンまで延びる６．６ｃｍの領域によって規定され、第二の低温領域は、オーブンから検出器まで延びる３．８ｃｍの領域によって規定される。いくつかの構成において、ＡＢＩ ３１００機器は、それぞれ４．８ｃｍと４．５ｃｍの、同様に位置された低温領域を備え得る。本発明の教示は、例えば、とりわけ、このようなシーケンサーに関して有用であり得る。
【００３２】
本発明の教示の緩衝液のいくつかの実施形態は、カチオンとして、弱塩基性のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス［２−ヒドロエチル］イミノ−トリス［ヒドロキシメチルメタン］）を含む。水溶液中で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分子は、陽子を受け取って、共役酸形態（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ＋）を生じる。
【００３３】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、不活性であり、容易に調製され、かつ市販の供給源から容易に利用可能である（Ｍｏｒｔｉｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｃｌｉｎ．，Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．１５６９（１９７７）；およびＬｅｗｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４ ４９５（１９６６）を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から購入され得る。
【００３４】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、以下を含有する：（ｉ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、（ｉｉ）ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパン−スルホン酸）、および必要に応じて、（ｉｉｉ）キレート剤。本明細書中で提供されるいくつかの処方物は、以下を含有する：（ｉ）１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、（ｉｉ）１００ｍＭ ＴＡＰＳ、および（ｉｉｉ）１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８）。
【００３５】
種々の実施形態において、緩衝組成物は、ＴＡＰＳまたはＴＡＰＳＯと１〜２ｍＭのＥＤＴＡを１：１の比で、５０〜２００ｍＭ（例えば、１００ｍＭ）のＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含有する。いくつかの実施形態において、緩衝組成物は、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＴＡＰＳＯ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する。
【００３６】
本明細書中に記載される種々の処方物において、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）は、ＴＡＰＳで置換され得るか、またはそれに加えて含まれ得る。さらに、アスパラギンが、緩衝液中において、ＴＡＰＳで置換され得る。
【００３７】
種々の実施形態において、以下を含む分子が、緩衝組成物中に含まれる：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２（ここで、ｍ＝１、２、３、．．．ｍ（整数）、ｎ＝１、２、３、．．．ｎ（整数）（例えば、ｍ＝１〜３でｎ＝１〜４であるか、または例えば、ｍ＝１でｎ＝２である））。
【００３８】
本発明の教示は、電気泳動用の、ゲルまたは流動可能な分離媒体組成物を一部提供する。種々の実施形態において、分離ゲル組成物は、以下含有する：（ａ）１種以上の有機ポリマー、および（ｂ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ。いくつかの実施形態において、本発明の教示に従うゲル組成物は、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバーをさらに含有する。種々の実施形態において、このゲル組成物は、ＴＡＰＳおよび／またはＴＡＰＳＯを含有する。
【００３９】
種々の実施形態に従って、緩衝組成物は、シービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な分離媒体）（例えば、米国特許第５，１２６，０２１号、およびＷＯ ０２／２４３１３（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）において記載されるシービング媒体）に含まれる。
【００４０】
本発明の教示に従う組成物としては、例えば、シービング成分および表面相互作用成分（例えば、ＷＯ ０２／２４３１３（本明細書中で参考として援用される）において記載されるようなもの）が挙げられ得る。
【００４１】
種々の実施形態において、この組成物のシービング成分は、１種以上の非架橋アクリルアミドポリマーを含む。非架橋アクリルアミドポリマーとしては、例えば、直鎖状ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ））、分枝鎖ポリマー、および星状ポリマーが挙げられ得る。
【００４２】
種々の実施形態において、この組成物の表面相互作用成分は、１種以上の無電荷でかつ非架橋性の水溶性シリカ吸着ポリマーを含む。このような成分は、以下の参考文献に記載されるような、種々の化学分類に属し得る：Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９８２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｆｒａｎｋｓ編、Ｗａｔｅｒ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３）；など。本発明の教示の、無電荷の水溶性シリカ吸着ポリマーとしては、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド、Ｎ−一置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、この表面相互作用成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）を含む。
【００４３】
種々の実施形態において、本発明の教示の組成物のポリマーは、ポリビニルラクタム（例えば、ポリビニルピロリドン）；Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミド；およびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される。
【００４４】
本発明の教示の組成物中に含まれ得る種々のポリマーとしては、以下において開示されるポリマーが挙げられるがこれらの限定されない：米国特許第５，５５２，０２８号、同第５，５６７，２９２号、同第６，３８７，２３４号；ＷＯ ０２／２４３１３；Ｈ．Ｈｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００２、２３、１４２１−１４２８；およびＭ．Ｎ．Ａｌｂａｒｇｈｏｕｔｈｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００１、２２、７３７−７４７；Ｌｉｇｕｏ Ｓｏｎｇら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００１，２２，７２９−７３６；Ｄｅｈａｉ Ｌｉａｎｇら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００，２１，３６００−３６０８（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【００４５】
キャピラリー電気泳動は、例えば、任意の適切なキャピラリー（例えば、溶融シリカキャピラリー管、あるいはガラス製プレートもしくはプラスチック製プレート、または先端部に形成された溝）を使用して、実施され得る。種々の実施形態は、例えば、細長管の使用を企図しており、この管の各々は、例えば、約１０〜５００ミクロンの範囲内（例えば、約１００ミクロン以下）の内径を有する。必要に応じて、各管は、その長さに沿って、その外面を不透明なポリイミドコーティングでコーティングされて、破損が防止され得る。いくつかの実施形態において、分離は、キャピラリー管に緩衝液のみを充填することによって行われるが、他の場合においては、同様に、シービング媒体（例えば、ポリマーまたはゲル）が加えられる。例示的なプロセスにおいて、サンプルは、キャピラリー管の入口端部に導入されて、電場が適用される。電場の影響下で、サンプルが分離され、これによって、個々の成分は、このキャピラリー管の長さの下方に移動される。キャピラリー管の出口端部または出口端部近辺において、不透明なポリイミドコーティングの小領域が除去されて、光検出領域が形成され得る。個々の成分は、例えば、蛍光吸光度または紫外線吸光度を使用して、検出され得る。
【００４６】
作動可能なキャピラリー電気泳動デバイスの共通の特徴の詳細は、多数の任意の利用可能な刊行物（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｍ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）（本明細書中で参考として援用される））において見出され得る。
【００４７】
種々の実施形態に従って、本発明の教示に従う緩衝液は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０配列決定装置またはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する、核酸の電気泳動分離において用いられる。
【００４８】
種々の実施形態において、本発明の教示に従う緩衝液は、「連続緩衝液系」で用いられる。この系は、選択されたｐＨおよびイオン強度の同じ緩衝液が、シービング媒体（例えば、ゲルまたは流動可能な媒体）ならびにアノード緩衝液チャンバおよびカソード緩衝液チャンバ中で使用される系である。例えば、図１は、ＣＥデバイスを示しており、このデバイスは、カソード緩衝液レザバ１２、アノード緩衝液レザバ１４、ならびにこのカソード緩衝液レザバとアノード緩衝液レザバとの間に延びるキャピラリー管１６によって規定されるチャネルを備える。シービング媒体は、このチャネル内に保持され得る。連続緩衝液系は、本発明の教示の緩衝組成物を、アノード緩衝液レザバとカソード緩衝液レザバの両方、およびチャネルに含めることによって、提供され得る。このチャネルに充填されたサンプルは、適切な電源２０によって、このチャネルを横切る起電力の電位を適用することによって分離され得る。このサンプルの分離された成分は、適切な検出器／データ収集アセンブリ２２によって検出され得る。
【００４９】
種々の実施形態において、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＴＡＰＳ緩衝組成物は、ＣＥ装置のカソード緩衝液チャンバとアノード緩衝液チャンバの両方、およびこの装置の１つ以上のキャピラリーに保持されるシービング媒体（例えば、分離ゲルまたは流動可能な媒体）に含まれる。次いで、１種以上のポリヌクレオチド含有サンプルが、この装置を使用して分離され得、そのようにして調製され得る。
【００５０】
種々の実施形態において、核酸含有サンプルの分離は、少なくともｐＨ７、７よりも高いｐＨ、および／または少なくともｐＨ７．５にて実施される。いくつかの実施形態において、分離は、ｐＨ８以下で実施される。
【００５１】
以下の例は、例示目的のみとして意図され、いかなる様式においても、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
本発明の教示に従う緩衝液を、以下のように処方した：１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス［２−ヒドロエチル］イミノ−トリス［ヒドロキシメチルメタン］）、１００ｍＭ ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパン−スルホン酸）、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８）。
【００５３】
１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、金属によるキャピラリーコーティングに対する破損をなくすかまたは軽減した。
【００５４】
（実施例２）
低温度で誘導されたＤＮＡバンドの幅を、ＮａＴＡＰＳ（トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル−アミノ−プロパンスルホン酸ナトリウム塩）電気泳動緩衝液を用いるよりも、ＴｒｉｓＴＡＰＳを用いて観察した。カチオンであるＴｒｉｓおよびＮａが、電気泳動の間に、ＤＮＡバンドの幅にどのように影響を及ぼすかを理解するために、ＤＮＡ分離およびＤＮＡ移動度を、電気泳動緩衝液（この緩衝液は、異なる金属カチオン：Ｌｉ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、およびＣｓ；ならびに有機緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴｒｉｓＢｉｓｐｒｏｐａｎｅ、イミダゾール、アルギニン、アンモニウム、およびテトラペンチルアンモニウムを含む）を用いて、キャピラリー電気泳動の間に試験した。本明細書中で、ＧＳ７００ ２５０ヌクレオチド（ｎｔ）フラグメント、または単に２５０ｎｔフラグメントと呼ばれるフラグメント（これは、低いＤＮＡ変性条件下にて、異常に電気泳動を生じる推定ＤＮＡ二次構造を有する）のサイズは、キャピラリー電気泳動の間の電気泳動緩衝液として、Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＴＡＰを用いて、その推定されたサイズ（２５０ｎｔ）近辺で電気泳動したことに留意のこと。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分子構造の試験から、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは、ＤＮＡ骨格に対して、陰イオンを遮断するのを立体的に妨げ、それによって電気泳動の間に再生する能力が低下され得ると考えられる。
【００５５】
（実施例３）
本発明の教示の緩衝液が電気泳動の間の核酸の変性を改善する能力を、以下のアッセイにおいて観察した：
（実施例３（Ａ））
１つのアッセイは、本発明の緩衝液がＧＳ７００ ２５０ヌクレオチド（ｎｔ）フラグメントの異常な移動度（この異常な移動度は、ＤＮＡ二次構造に起因すると考えられる）を低下させる能力を測定した。このアッセイからの結果を、表Ｉに報告する。ＰＯＰ３７ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０機器によって、７０℃にて電気泳動させる間、電気泳動緩衝液としてＴｒｉｓＴＡＰＳを用いると、２５０ｎｔのフラグメントは、２４４．５ｎｔのように移動し、そしてポリマー処方物中においてさらなる１Ｍの尿素を用いると、２５０ｎｔのフラグメントは、２４５．５ｎｔのように移動した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（さらなる尿素なし）を使用した場合、２５０ｎｔのフラグメントは、２４７．５ｎｔのフラグメントのように移動し、これは、さらなる１Ｍの尿素をポリマーに加えることによって得られるよりも、正確な２５０ｎｔにより近づいた。
【００５６】
（表Ｉ）
【００５７】
［表１］
（実施例３（Ｂ））
第二に、４塩基コンプレッションであるＣＧＣＣの強度率を低下させる能力を、測定した。組成物に隣接したＣ末端フラグメントの間隔を測定し、次いで、正常な空間からの、このコンプレッション中のＣヌクレオチドの偏差を、算出した。完全に正常な空間または非コンプレッションは、結果として「０」偏差となる。ＤＮＡの変性が少なくなれば、コンプレッションはより増大し、それによって、正常からの３Ｃヌクレオチドの偏差は、より大きくなる。表ＩＩは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いた最小偏差、および余分な１Ｍの尿素を加えるよりも、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に変更するほうが、再度さらなる変性が見られることを示している。
【００５８】
（表ＩＩ）
【００５９】
［表２−１］
［表２−２］
【００６１】
本発明の教示の種々の実施形態は、例えば、ＤＮＡのキャピラリー電気泳動において（特に、ＤＮＡ変性の増加が所望される場合に）有用な電気泳動緩衝液を提供することが、理解される。本発明の教示の実施形態は、電気泳動の間に、ＤＮＡ分解能および電気泳動速度の有意な損失なしに、増加したＤＮＡ変性を提供し得、これは、通常、余分な化学変性剤（例えば、尿素または２−ピロリジノン）を用いて観察される。
【００６２】
必要に応じて、本明細書中に記載される組成物および方法は、コンプレッションを軽減するかまたは最小にすることを目的とした他の方法と組み合わせて利用され得る。例えば、１つの方法は、相補的な鎖でしばしば見出されない二次構造に寄与する因子として、他の鎖の配列決定に関する。コンプレッションを排除するための別のストラテジーは、塩基対の量を低下させる試みにおいて、ゲル中に有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよび／または尿素）を含ませることである。なおさらなるストラテジーは、ＩＴＰまたは７−デアザ−ｄＧＴＰをＧＴＰで置換することによって、産物鎖における二次構造の安定性を低下させることである。また、水素結合を破壊するために、熱が使用され得、それによって、変性されたＤＮＡおよびＲＮＡが生じ得る。
【００６３】
本発明の教示は、種々の用途、方法、および組成物を参照して記載されているが、種々の変化および改変が、その精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。前出の例は、本発明の教示をさらに例示するために提供されており、限定として解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、種々の実施形態において有用なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイスの概略図である。
Claims (33)
- 核酸の電気泳動用の緩衝組成物であって、該緩衝組成物は、以下：
（ｉ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ならびに、
（ｉｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー、
を含有する、組成物。 - ＴＡＰＳまたはＴＡＰＳＯを含有する、請求項１に記載の組成物。
- ＴＡＰＳを含有する、請求項１に記載の組成物。
- 金属キレート剤をさらに含有する、請求項３に記載の組成物。
- 前記金属キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、請求項４に記載の組成物。
- 前記組成物が、実質的に界面活性剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
- ７より高いｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
- ７．５以上のｐＨを有する、請求項７に記載の組成物。
- 核酸の電気泳動用の緩衝組成物であって、該緩衝組成物は、以下：
（ｉ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、またはアスパラギン；および、
（ｉｉ）式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の化合物、
を含有し、ここで：
ｍは、１〜３の整数であり、そしてｎは、１〜４の整数である、組成物。 - ｍが１であり、そしてｎが２である、請求項９に記載の組成物。
- 金属キレート剤をさらに含有する、請求項９に記載の組成物。
- 前記金属キレート剤が、ＥＤＴＡである、請求項１１に記載の組成物。
- 前記組成物が、実質的に変性剤を含まない、請求項９に記載の組成物。
- ７よりも高いｐＨを有する、請求項９に記載の組成物。
- ７．５以上のｐＨを有する、請求項１４に記載の組成物。
- 核酸の電気泳動用の分離ゲル組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）有機ポリマー；
（ｂ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ならびに、
（ｃ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、およびアスパラギンの群の１種以上のメンバー、
を含有する、組成物。 - 前記組成物が、実質的に変性剤を含まない、請求項１６に記載の組成物。
- ＴＡＰＳまたはＴＡＰＳＯを含有する、請求項１６に記載の組成物。
- ＴＡＰＳを含有する、請求項１６に記載の組成物。
- 請求項１６に記載の組成物であって、前記有機ポリマーは、シービング成分および表面相互作用成分を含み、該シービング成分は、非架橋アクリルアミドポリマーを含み、該表面相互作用成分は、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される、１種以上の非架橋ポリマーを含む、組成物。
- ７よりも高いｐＨを有する、請求項１６に記載の組成物。
- ７．５以上のｐＨを有する、請求項２１に記載の組成物。
- サンプルを分離するための装置であって、該装置は、以下：
アノード緩衝液チャンバ；
カソード緩衝液チャンバ；
該アノード緩衝液チャンバと該カソード緩衝液チャンバとの間に延び、かつ該アノード緩衝液チャンバと該カソード緩衝液チャンバとを連絡する、電気泳動チャネル；ならびに、
該アノード緩衝液チャンバと該カソード緩衝液チャンバおよび該チャネルにおいて保持されるＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、連続緩衝液系、
を備える、装置。 - 前記連続緩衝液系が、ＴＡＰＳおよびＴＡＰＳＯのうちの一方または両方をさらに含む、請求項２３に記載の装置。
- 前記チャネルにおいて保持されるシービング媒体をさらに備える、請求項２３に記載の装置。
- 核酸の電気泳動を行う方法であって、該方法は、以下：
緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程であって、該緩衝液が、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、工程；
分析されるべき核酸を含むサンプルを該チャネルに加える工程；および、
電気泳動によって該サンプルを分離する工程、
を包含する、方法。 - 前記チャネルが、キャピラリー管によって規定される、請求項２６に記載の方法。
- 前記分離工程が、７よりも高いｐＨにて行われる、請求項２６に記載の方法。
- 核酸分子の電気泳動を行う方法であって、該方法は、以下：
（ａ）緩衝液を電気泳動チャネルに加える工程であって、該緩衝液は、式：［ＨＯ（ＣＨ２）ｍ］３Ｃ−Ｎ［（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ］２の化合物を含み、ここで、ｍは、１〜３の整数であり、そしてｎは、１〜４の整数である、工程；
（ｂ）分析されるべき核酸を含むサンプルを該チャネルに加える工程；ならびに、
（ｃ）電気泳動によって該サンプルを分離する工程、
を包含する、方法。 - 前記チャネルが、キャピラリー管によって規定される、請求項２９に記載の方法。
- 前記分離工程が、７よりも高いｐＨにて行われる、請求項２９に記載の方法。
- 核酸の電気泳動のための方法であって、該方法は、以下：
緩衝液をゲルに導入する工程であって、該緩衝液が、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、工程；
分析されるべき核酸を含むサンプルを、該ゲル上に適用する工程；および、
該ゲルを横切る起電力の電位差を適用し、それによって該サンプルが分離される工程、
を包含する、方法。 - 前記ゲルが、キャピラリー管によって規定されるチャネルにおいて支持される、請求項３２に記載の方法。
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