JP2005348694A - Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same - Google Patents

Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same Download PDF

Info

Publication number
JP2005348694A
JP2005348694A JP2004175641A JP2004175641A JP2005348694A JP 2005348694 A JP2005348694 A JP 2005348694A JP 2004175641 A JP2004175641 A JP 2004175641A JP 2004175641 A JP2004175641 A JP 2004175641A JP 2005348694 A JP2005348694 A JP 2005348694A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
enterotoxin
protein
present
vaccine
binding site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2004175641A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Akio Nakane
明夫 中根
Dong-Liang Hu
東良 胡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hirosaki University NUC
Original Assignee
Hirosaki University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hirosaki University NUC filed Critical Hirosaki University NUC
Priority to JP2004175641A priority Critical patent/JP2005348694A/en
Priority to PCT/JP2005/011216 priority patent/WO2005121342A1/en
Publication of JP2005348694A publication Critical patent/JP2005348694A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new vaccine against Staphylococcus aureus. <P>SOLUTION: The vaccine comprises protein as an immunogen that is an enterotoxin C variant of Staphylococcus aureus, has variation in a T-cell receptor binding site and a main histocompatibility antigen II binding site, is hereby deleted in super antigen activity and keeps immunogenicity of enterotoxin C. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、無毒化されたタンパク質性ワクチンに関し、さらに詳しくは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のエンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの無毒性変異体、及び当該変異体タンパク質を含んで成るワクチンに関する。   The present invention relates to a detoxified proteinaceous vaccine, and more particularly to a non-toxic mutant of Staphylococcus aureus enterotoxin C, and a vaccine comprising the mutant protein.

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、病院感染及び日和見感染の重要な病原菌である。また、生活習慣病のリスクを上昇させる一因となっている。MRSAは生体表層部及び深部において常在性を示し、他の多くの病原性細菌と比べて、宿主感染防御が有効に働かず、特に糖尿病患者および高齢者において慢性化・反復感染しやすい。MRSAに対する治療のために抗生物質が使用されているが、近年、多剤耐性菌株が続出し、MRSAに対する治療はますます困難になっている。   Staphylococcus aureus, especially methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), is an important pathogen of hospital infections and opportunistic infections. It also contributes to an increased risk of lifestyle-related diseases. MRSA is resident in the surface layer and in the deep part of the living body, and does not effectively protect against host infection, compared to many other pathogenic bacteria, and is particularly susceptible to chronic and recurrent infections in diabetic patients and the elderly. Antibiotics have been used to treat MRSA, but in recent years, multidrug-resistant strains have continued and the treatment of MRSA has become increasingly difficult.

これまで、ブドウ球菌感染に対するワクチンの開発については、死菌ワクチン、トキソイドワクチン、莢膜ワクチンなどについて研究が行なわれてきた。しかしながら、死菌ワクチンは十分な獲得防御免疫を誘導せず、トキソイドワクチンは化学的不活性化工程を介して調製されるため生成物の特徴付けが困難である。不活性化された毒素は活性をもつ毒素に戻る可能性が否定できない。また、トキソイドの調製に使用する野生型毒素をブドウ球菌から精製するのは非常に煩雑であり、収量が低く、そのうえ、不活性化のために使用される化学物質の多くが毒性を示す。これらの理由から、今までの研究は満足な成果が得られず、ブドウ球菌に対するワクチンはまだ、実用化されていない。   To date, research has been conducted on the development of vaccines against staphylococcal infections, including killed vaccines, toxoid vaccines, and capsular vaccines. However, killed vaccines do not induce sufficient acquired protective immunity and toxoid vaccines are prepared through a chemical inactivation process, making product characterization difficult. There is an undeniable possibility that an inactivated toxin returns to an active toxin. Also, the purification of wild-type toxins used to prepare toxoids from staphylococci is very cumbersome, yields are low, and many of the chemicals used for inactivation are toxic. For these reasons, satisfactory results have not been obtained so far, and vaccines against staphylococci have not yet been put into practical use.

黄色ブドウ球菌が産生する菌体外タンパク質毒素であるエンテロトキシンはスーパー抗原活性を有し、重要な病原因子であることが知られている。黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原は、食中毒、毒素性ショック症候群、炎症性疾患である川崎病症候群と関連があることが知られている。MRSAの病院感染、ウシ乳房炎等の動物感染症に対する無毒・安全なワクチンの開発が、特に臨床及び食料品の生産現場において求められている。
しかしながら、スーパー抗原活性の喪失により上記の毒性を有さず、且つブドウ球菌に対する免疫原性を十分に維持しているワクチンは知られていない。 Enterotoxin, an extracellular protein toxin produced by Staphylococcus aureus, has superantigen activity and is known to be an important virulence factor. Superantigens produced by Staphylococcus aureus are known to be associated with food poisoning, toxic shock syndrome, and Kawasaki disease syndrome, which is an inflammatory disease. The development of non-toxic and safe vaccines against MRSA hospital infections and animal infections such as bovine mastitis is particularly demanded in clinical and food production sites.
However, there is no known vaccine that does not have the above-mentioned toxicity due to the loss of superantigen activity and sufficiently maintains immunogenicity against staphylococci.

従って、本発明は、スーパー抗原活性の喪失により上記の毒性を有さず、且つブドウ球菌に対する免疫原性を十分に維持しているワクチンを提供しようとするものである。   Accordingly, the present invention seeks to provide a vaccine that does not have the above-mentioned toxicity due to the loss of superantigen activity, and that sufficiently maintains immunogenicity against staphylococci.

本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討の結果、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンＣのＴ細胞受容体結合部位および主要組織適合性抗原複合体（MHC）クラスII結合部位に変異を導入することによりスーパー抗原活性を欠損または低下せしめることが出来、これによりエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しながら、エンテロトキシンＣの毒性を低減せしめることが出来ることを見出し、本発明を完成した。   As a result of various studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors introduce mutations into the T cell receptor binding site and major histocompatibility complex (MHC) class II binding site of Staphylococcus aureus enterotoxin C. Thus, the inventors have found that the superantigen activity can be reduced or decreased, and that the toxicity of enterotoxin C can be reduced while maintaining the immunogenicity of enterotoxin C, and the present invention has been completed.

従って、本発明は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの変異体であって、Ｔ−細胞受容体結合部位及び主要組織適合性抗原クラスII結合部位に変異を有し、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質を提供する。このようなタンパク質の具体例として、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAsp及び94位のTyrが他のアミノ酸により置換されており、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質が挙げられる。   Accordingly, the present invention is a variant of Staphylococcus aureus enterotoxin C having mutations in the T-cell receptor binding site and the major histocompatibility antigen class II binding site. Provided are proteins lacking superantigen activity and maintaining the immunogenicity of enterotoxin C. As a specific example of such a protein, Asp at position 23 and Tyr at position 94 of staphylococcal enterotoxin C having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids, thereby increasing the superantigen activity. Examples thereof include proteins that are deficient and maintain the immunogenicity of enterotoxin C.

より具体的な例として、本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているエンテロトキシンＣ免疫原性タンパク質を提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質を含んで成るブドウ球菌に対するワクチンを提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、上記の核酸を含んで成るベクターを提供する。本発明はまた、上記のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質の製造方法において、上記の宿主細胞を培養し、そして培養物から当該タンパク質を採取することを特徴とする方法を提供する。 As a more specific example, in the present invention, Asp at position 23 of Staphylococcal enterotoxin C having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Ala, and Tyr at position 94 is substituted with Ala. Enterotoxin C immunogenic proteins are provided.
The present invention further provides a vaccine against staphylococci comprising the above protein.
The present invention further provides a nucleic acid encoding the above protein. The present invention also provides a vector comprising the above-described nucleic acid. The present invention also provides a host cell transformed with the above vector.
The present invention further provides a method for culturing the above-described host cell and collecting the protein from the culture in the above-described method for producing a protein.

黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンには、Ａ〜Ｒが知られており、本発明はエンテロトキシンＣに関する。本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の基礎となる生来のエンテロトキシンＣをコードする核酸、例えばDNAは、黄色ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌のFRI株（Bergdoll博士．Bergdoll.MS. 1983.Enterotoxins, in C.S.F.Easton and C.Adlam(ed), Staphylococci and Staphylococcal infections.Academic Press, United Kingdom.）から、常法に従ってクローニングすることが出来る。一例として、エンテロトキシンＣは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、例えば配列番号：１に記載の塩基配列を有する核酸によりコードされている。   A to R are known as Staphylococcus aureus enterotoxins, and the present invention relates to enterotoxin C. The nucleic acid, eg DNA, encoding the native enterotoxin C underlying the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention is S. aureus, for example the FRI strain of S. aureus (Dr. Bergdoll. Bergdoll. MS. 1983. Enterotoxins, in CSFEaston and C. Adlam (ed), Staphylococci and Staphylococcal infections. Academic Press, United Kingdom.). As an example, enterotoxin C has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and is encoded by a nucleic acid having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, for example.

しかしながら、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の元になるエンテロトキシンＣは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するもののみならず、対立遺伝子変異、その他の天然変異、あるいは人工的変異誘発により、配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加・挿入、及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ生来のエンテロトキシンＣの活性を有するタンパク質も含む。   However, enterotoxin C, which is the origin of the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention, is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but also by allelic variation, other natural mutation, or artificial mutagenesis The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence modified by deletion, addition / insertion, and / or substitution with other amino acids of one to several amino acids, and the native enterotoxin C Also includes proteins having activity.

生来のエンテロトキシンＣをコードする核酸はまた、配列番号：１に示す塩基は配列から設計されたプローブ、又はプライマー対を用いて、黄色ブドウ球菌のDNAからクローニングすることが出来る。従って、本願発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の基礎になる生来のエンテロトキシンＣには、高ストリンジエント条件下で、配列番号：１に記載の塩基配列を有する核酸又はその断片、好ましくは15塩基以上の長さを有する断片にハイブリダイズする核酸にコードされており、且つ生来のエンテロトキシンＣの活性、即ちスーパー抗原活性及びエンテロトキシンＣ免疫原性を有するタンパク質も含まれる。   The nucleic acid encoding native enterotoxin C can also be cloned from S. aureus DNA using probes or primer pairs designed from the sequence shown in SEQ ID NO: 1. Accordingly, the native enterotoxin C that forms the basis of the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention includes a nucleic acid having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, preferably 15 under high stringent conditions. Also included are proteins that are encoded by nucleic acids that hybridize to fragments that are longer than the base and that have native enterotoxin C activity, ie, superantigen activity and enterotoxin C immunogenicity.

エンテロトキシンＣは、その分子中にＴ細胞受容体に対する結合部位（配列番号：２に示すアミノ酸配列中、アミノ酸番号20及び23）及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位（配列番号：２に示すアミノ酸配列中、アミノ酸番号90、94及び103）を含み、これによりＴ細胞受容体と主要組織適合性抗原クラスIIとの間の相互作用を介在し、これによりＴ細胞が腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、インターフェロン−γ（IFN-γ）、インターロイキン−２（IL-2）、インターロイキン−６（IL-6）を分泌し、エンテロトキシンＣのスーパー抗原活性が惹起される。   Enterotoxin C contains in its molecule a binding site for the T cell receptor (amino acid numbers 20 and 23 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) and a binding site for major histocompatibility antigen class II (shown in SEQ ID NO: 2). In the amino acid sequence, amino acid numbers 90, 94 and 103), thereby mediating the interaction between the T cell receptor and the major histocompatibility antigen class II, whereby the T cell is tumor necrosis factor-α ( TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), and interleukin-6 (IL-6) are secreted, and the enterotoxin C superantigen activity is induced.

本発明によれば、エンテロトキシンＣ分子中のＴ細胞受容体に対する結合部位及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位中に変異を導入することにより、エンテロトキシンＣの免疫原性を維持しながら、スーパー抗原活性を欠損又は低下せしめることが出来る。変異部位としては、上記の結合部位の範囲内で選択することが出来、具体例としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、Ｔ細胞に対する結合部位内に存在する23位のAsp、及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位内に存在する94位のTyrが挙げられる。   According to the present invention, by introducing mutations in the binding site for the T cell receptor and the binding site for major histocompatibility antigen class II in the enterotoxin C molecule, while maintaining the immunogenicity of enterotoxin C, Antigen activity can be deficient or decreased. The mutation site can be selected within the range of the above-mentioned binding site. As a specific example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Asp at position 23 present in the binding site for T cells, and Examples include Tyr at position 94 present in the binding site for major histocompatibility antigen class II.

変異の種類としては、上記の特定の部位の欠失、又は他のアミノ酸による置換が挙げられる。例えば、配列番号：２における23位のAspは、Asp以外のアミノ酸により置換することが出来、94位のTyrはTyr以外のアミノ酸により置換することが出来る。好ましくは、中性アミノ酸、例えばAla、Val、Leu、Ileなどを挙げることが出来、特にAlaが好ましい。変異の導入は、常法に従って、例えば部位特定点変異誘発法により行なうことが出来る。   Examples of the type of mutation include deletion of the above specific site or substitution with other amino acids. For example, Asp at position 23 in SEQ ID NO: 2 can be substituted with an amino acid other than Asp, and Tyr at position 94 can be substituted with an amino acid other than Tyr. Preferred examples include neutral amino acids such as Ala, Val, Leu, and Ile, and Ala is particularly preferred. Mutation can be introduced by a conventional method, for example, by site-specific point mutagenesis.

本発明の、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、生来のエンテロトキシンＣをコードするDNAに、上記のようにした変異を導入した後、変異したDNAを適当な発現用ベクターに挿入し、このベクターにより宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養し、培養物からエンテロトキシンＣ無毒性変異体を採取することにより得ることができる。宿主としては、原核生物細胞、例えば細菌細胞、典型的には大腸菌細胞、真核微生物細胞、例えば真菌細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞、などを使用することが出来、酵母としてはサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母が挙げられ、糸状菌としては、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌が挙げられる。更に、高等真核細胞として、培養された植物細胞や動物の培養細胞が挙げられる。これらの宿主細胞に使用は常用技術であり、本願発明の特徴を構成するものではない。   The non-toxic mutant of Staphylococcus aureus enterotoxin C of the present invention introduces the mutation as described above into DNA encoding native enterotoxin C, and then inserts the mutated DNA into an appropriate expression vector. The vector can be obtained by transforming a host cell with this vector, culturing the transformant, and collecting an enterotoxin C non-toxic mutant from the culture. As the host, prokaryotic cells such as bacterial cells, typically E. coli cells, eukaryotic microbial cells such as fungal cells such as yeast cells or filamentous fungi cells, etc. can be used. As yeast, Saccharomyces is used. ) Genus yeast, and examples of filamentous fungi include filamentous fungi of the genus Aspergillus. Furthermore, examples of higher eukaryotic cells include cultured plant cells and cultured animal cells. Use in these host cells is a routine technique and does not constitute a feature of the present invention.

本発明の発現ベクターは、少なくとも、エンテロトキシンＣの無毒性変異体をコードするDNA及び当該DNAの発現を制御する制御配列を含んで成る。プロモーターなどの制御配列は、宿主細胞に依存して選択することが出来、常用のプロモーターなどを適宜使用することが出来る。
また、発現ベクターの構築、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行なうことが出来る。 The expression vector of the present invention comprises at least a DNA encoding a non-toxic mutant of enterotoxin C and a control sequence that controls the expression of the DNA. A control sequence such as a promoter can be selected depending on the host cell, and a conventional promoter or the like can be appropriately used.
In addition, the construction of an expression vector and the transformation of a host with the expression vector can be performed according to conventional methods.

エンテロトキシンＣ無毒性変異体の製造のための宿主細胞の培養は、宿主の種類やプロモーターの種類等に依存して、常法に従って行なうことが出来る。培養物からの、目的エンテロトキシンＣ無毒性変異体の採取は、タンパク質の回収・精製に用いる常法に従って行なうことができる。例えば、大腸菌宿主等の培養により生産されたエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、宿主培養物から当該変異体タンパク質を含む溶液を得た後、SDS-PAGE、および抗エンテロトキシンＣ抗体とのゲル内沈降反応により、高純度の、免疫原性を有し、且つスーパー抗原活性が欠損し、又は低下したエンテロトキシンＣ無毒性変異体を得ることができる。   Culturing host cells for the production of enterotoxin C non-toxic mutants can be performed according to conventional methods, depending on the type of host, the type of promoter, and the like. Collection of the desired enterotoxin C non-toxic mutant from the culture can be performed according to a conventional method used for protein recovery and purification. For example, enterotoxin C non-toxic mutant produced by culturing Escherichia coli host or the like is obtained by obtaining a solution containing the mutant protein from the host culture, followed by SDS-PAGE and in-gel precipitation reaction with anti-enterotoxin C antibody. By this, enterotoxin C non-toxic mutant having high purity, immunogenicity and lacking or reduced superantigen activity can be obtained.

本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、スーパー抗原活性が欠損または低下しており、このことは、当該変異体の存在下及び非存在下で、例えば脾細胞を培養し、培養上清中のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、インターフェロン−γ（IFN-γ）、インターロイキン−２（IL-2）、インターロイキン−６（IL-6）等を測定し、エンテロトキシンＣの変異体の存否による上記のサイトカインの差（サイトカインの産生量が、前記エンテロトキシンＣ変異体の非存在下に比べて存在下において減少すること）により確認することが出来る。実施例２の結果を示す図１から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣの変異体の存在下でインターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子−αの産生が低下し、スーパー抗原活性の阻害が確認された。   The enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention is deficient or reduced in superantigen activity, which means that, for example, splenocytes are cultured in the presence and absence of the mutant, Cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6) are measured, and enterotoxin C It can be confirmed by the difference in the above cytokines depending on the presence or absence of the mutant (the amount of cytokine production decreases in the presence compared to the absence of the enterotoxin C mutant). As is apparent from FIG. 1 showing the results of Example 2, the production of interferon-γ and tumor necrosis factor-α was reduced in the presence of the mutant of enterotoxin C of the present invention, and inhibition of superantigen activity was confirmed. .

本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、エンテロトキシンＣの免疫原性を有し、黄色ブドウ球菌の感染に対するワクチン効果を有する。このことを確認するため、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているもの；本明細書、特に実施例において、「dmSEC」と称する場合がある）、23位のAspのみをAlaにより置換したエンドトキシンＣ変異体（本明細書、特に実施例において「mSEC」と称する）、組換え生産された生来のエンドトキシンＣ（本明細書、特に実施例において、「rSEC」と称する場合がある）、アジュバントとして機能するコレラトキシン（CTと称する場合がある）のみ、及びリン酸緩衝液のみ（PBSと称する）、を用いて、次の実験を行った。   The enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention has the immunogenicity of enterotoxin C, and has a vaccine effect against S. aureus infection. In order to confirm this, the enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention (in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, Asp at position 23 is substituted with Ala, and Tyr at position 94 is replaced with Ala. Endotoxin C mutant in which only Asp at position 23 is replaced by Ala (in this specification, particularly in the examples, referred to as “mSEC”). ), Recombinantly produced native endotoxin C (sometimes referred to herein as “rSEC”), only cholera toxin (sometimes referred to as CT) that functions as an adjuvant, and phosphorus The following experiment was performed using only acid buffer (referred to as PBS).

（Ａ）マウスの感染生存試験
（ａ）20 μg/マウスのdmSECのみ［dmSEC］；（ｂ）20 μg/マウスのdmSECと、アジュバントとしてのCT［dmSEC＋CT］；及び（ｃ）CTのみ、をBALB/cマウスに経鼻投与し、更に２週間後及び４週間後に追加経鼻免疫を行なった。２回目の追加免疫の１週間後、黄色ブドウ球菌（MRSA臨床分離株、SEC生産株）を致死量（生菌として5000万個/マウス）を経静脈感染させた。実施例３のＡの結果示す図２から明らかな通り、コレラトキシン（CT）のみに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ（dmSEC）の場合、黄色ブドウ球菌に感染されたマウスの生存率が上昇し、特にエンテロトキシンＣ（dmSEC）のアジュバントとしてコレラトキシン（CT）を用いた場合［dmSEC＋CT］、生存率は大きく上昇した。 (A) Mice infection survival test (a) 20 μg / mouse dmSEC only [dmSEC]; (b) 20 μg / mouse dmSEC and adjuvant CT [dmSEC + CT]; and (c) CT only BALB The mice were administered nasally, and further nasal immunization was performed after 2 weeks and 4 weeks. One week after the second boost, S. aureus (MRSA clinical isolate, SEC production strain) was intravenously infected with a lethal dose (50 million cells / mouse as a live cell). As is apparent from FIG. 2 showing the results of Example 3A, in the case of enterotoxin C (dmSEC) of the present invention, the survival rate of mice infected with Staphylococcus aureus increased compared to cholera toxin (CT) alone. In particular, when cholera toxin (CT) was used as an adjuvant for enterotoxin C (dmSEC) [dmSEC + CT], the survival rate was greatly increased.

（Ｂ）細菌残留試験
上記（Ａ）の方法において、黄色ブドウ球菌を感染させた後３日目にマウスを失血死させ、脾臓、肝臓及び腎臓に存在する菌数を、寒天平板上のコロニー数（CFU）として求めた。実施例３のＢの結果を示す図３から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）をコレラトキシン（CT）とともに投与した場合、脾臓及び肝臓において、黄色ブドウ球菌の数は有意に低下した。 (B) Bacterial residue test In the method of (A) above, mice were bloodlessly killed on the third day after infection with Staphylococcus aureus, and the number of bacteria present in the spleen, liver, and kidney was determined by the number of colonies on the agar plate. (CFU). As is apparent from FIG. 3 showing the results of Example 3B, when the enterotoxin C non-toxic mutant (dmSEC) of the present invention was administered together with cholera toxin (CT), the number of Staphylococcus aureus in the spleen and liver was Significantly decreased.

（Ｃ）各種抗体の生成
上記の実験において、５から６週間後のマウスの血清中の各種の抗エンテロトキシンＣ抗体を、組換えエンテロトキシンＣを抗原として用いて、ELISAにより測定した。実施例３のＣの結果を示す図４から明らかな通り、殆どの抗体について、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体（dmSEC）を投与した場合と、生来の組換えエンテロトキシンＣを投与した場合とで、抗体の産生レベルはほぼ同じであり、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体において、エンテロトキシンＣに対する免疫原性が維持されていることが確認された。 (C) Production of various antibodies In the above experiments, various anti-enterotoxin C antibodies in the serum of mice after 5 to 6 weeks were measured by ELISA using recombinant enterotoxin C as an antigen. As is apparent from FIG. 4 showing the results of C in Example 3, for most antibodies, when the enterotoxin C non-toxic mutant (dmSEC) of the present invention was administered, and when native recombinant enterotoxin C was administered The antibody production levels were almost the same, and it was confirmed that the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention maintained the immunogenicity against enterotoxin C.

上記の通り、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、スーパー抗原活性が欠失又は低下しており、そのため毒性が無く又は低下しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているため黄色ブドウ球菌の感染に対してワクチン活性を有し、従って、MRSAの病院感染、ウシの乳房炎、その他黄色ブドウ球菌の感染に関する疾患の予防又は治療剤として有用である。
本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、常法に従って、常用の医薬キャリヤーと配合することにより、ワクチン製剤に製剤化することが出来る。ワクチン製剤は通常、非経口的に、例えば注射により投与される。 As described above, the enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention has a deletion or a decrease in superantigen activity, and therefore has no or a decrease in toxicity, and maintains the immunogenicity of enterotoxin C. Therefore, it has vaccine activity against Staphylococcus aureus infection and is therefore useful as a preventive or therapeutic agent for MRSA hospital infection, bovine mastitis, and other diseases related to Staphylococcus aureus infection.
The non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention can be formulated into a vaccine preparation by blending with a conventional pharmaceutical carrier according to a conventional method. Vaccine formulations are usually administered parenterally, for example by injection.

次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
実施例１. エンテロトキシンＣの無毒性変異体の調製
１．エンテロトキシンＣ（SEC）をコードするDNAのクローニング
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）FRI 361株（Bergdoll, MS. 1983, Enterotoxins, in C.S.F.Easton and C.Adlam(ed), Staphylococci and Staphylococcal infections. Academic Press, United Kindom.）から、常法により（Betley.M.J.and Mekalanos, J.J. 1988. J.Bacteriol.170:34-41.）sec２遺伝子を含むゲノムDNAを分離した。遺伝子組換えSEC（rSEC）発現ベクターを構築するため、sec2遺伝子を、プライマー（（プライマーの塩基配列5'-CCCCGGATTCGAGAGCCAACCAGACCCTACG（配列番号：３；及び5'-CCCCGAATTCTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG）（配列番号：４）を用いてPCR法により増幅し、大腸菌ベクターpGEM3Zf(+)にサブクローニングした。次に、sec2遺伝子をBam HI及びEco RIにより切り出し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（glutation S-transferase；GST）発現ベクターpGEX-6P-1に導入し、発現ベクター（pKC2X1）を構築した。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1. Preparation of a non-toxic mutant of enterotoxin C Cloning of DNA encoding enterotoxin C (SEC) Staphylococcus aureus FRI 361 strain (Bergdoll, MS. 1983, Enterotoxins, in CSFEaston and C. Adlam (ed), Staphylococci and Staphylococcal infections. Academic Press, United Kindom ), A genomic DNA containing sec2 gene was isolated by a conventional method (Betley. MJand Mekalanos, JJ 1988. J. Bacteriol. 170: 34-41.). In order to construct a recombinant SEC (rSEC) expression vector, the sec2 gene was used with primers ((primer base sequence 5′-CCCCGGATTCGAGAGCCAACCAGACCCTACG (SEQ ID NO: 3; and 5′-CCCCGAATTCTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG) (SEQ ID NO: 4)). Amplified by PCR and subcloned into the E. coli vector pGEM3Zf (+) Next, the sec2 gene was excised with Bam HI and Eco RI, and into the glutathione S-transferase (GST) expression vector pGEX-6P-1. This was introduced to construct an expression vector (pKC2X1).

２．エンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）の調製
前記のベクターpKC2X1から、エンテロトキシンＣ分子のＮ末端から23位のAsp（Ｔ細胞受容体への結合部位に含まれる）及び94位のTyr（MHCクラスIIの結合部位に含まれる）をそれぞれAlaで置換するため、23位のAspのコドンATTをAlaのコドンGCTに変え、そして94位のTyrのコドンTATをAlaのコドンGCTに変えた。変異を導入したDNA断片を含む発現ベクター（pGXmSECとpGXdmSEC）を構築した。次に、この発現ベクターにより大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換体pGXmSEC/DH52とpGXdmSEC/DH52を得た。
この形質転換体を、アンピシリンを含む2×YTA培地で培養し、菌体から抽出したタンパク質を、GST精製モジュールにより精製した。 2. Preparation of enterotoxin C non-toxic mutant (dmSEC) From the above vector pKC2X1, Asp (included in the binding site to T cell receptor) at position 23 from the N-terminus of enterotoxin C molecule and Tyr at position 94 (MHC class II) In order to substitute each with Ala, the Asp codon ATT at position 23 was changed to the codon GCT of Ala, and the Tyr codon TAT at position 94 was changed to the codon GCT of Ala. Expression vectors (pGXmSEC and pGXdmSEC) containing the DNA fragment into which the mutation was introduced were constructed. Next, E. coli DH5α strain was transformed with this expression vector to obtain transformants pGXmSEC / DH52 and pGXdmSEC / DH52.
This transformant was cultured in a 2 × YTA medium containing ampicillin, and the protein extracted from the cells was purified by the GST purification module.

実施例２. スーパー抗原活性の低下
BALB/cマウスの脾細胞を調製し、100万個/mlとなるように、10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁し、これに、（ａ）本発明のエンテロトキシンＣ変異体（dmSEC）、（ｂ）エンドトキシンＣの23位のAspをAlaに置換したのみの変異体（mSEC）、及び組換え産生された生来のエンテロトキシン（rSEC）を、種々の濃度で添加し、二酸化炭素培養装置中で72時間インキュベートし、培養上清中のインターフェロン−γ（IFN-γ）及び腫瘍壊死因子−α（TNF-α）をELISAにより測定した。結果を図１に示す。 Example 2. Reduction of superantigen activity
BALB / c mouse spleen cells were prepared and suspended in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum so as to be 1 million cells / ml, and (a) the enterotoxin C mutant (dmSEC of the present invention) ), (B) Variant (mSEC) in which Asp at position 23 of endotoxin C is simply replaced with Ala, and native enterotoxin (rSEC) produced recombinantly are added at various concentrations, and a carbon dioxide culture apparatus And incubated for 72 hours, and interferon-γ (IFN-γ) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the culture supernatant were measured by ELISA. The results are shown in FIG.

この図から明らかな通り、rSECは濃度依存的にIFN-γの産生を誘導するのに対して、dmSECはIFN-γの産生を殆ど誘導しなかった。また、TNF-αの誘導量も、rSECに比べてdmSECの方が有意に低かった。脾細胞の培養におけるIFN-γやTNF-αなどのサイトカインの産生誘導はスーパー抗原活性の指標となるので、実施例２の結果を示す図２は、生来のエンテロトキシンＣに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ変異体のスーパー抗原活性は有意に低下していることを示している。   As is clear from this figure, rSEC induced IFN-γ production in a concentration-dependent manner, whereas dmSEC hardly induced IFN-γ production. In addition, the induced amount of TNF-α was also significantly lower in dmSEC than in rSEC. Since production of cytokines such as IFN-γ and TNF-α in spleen cell culture is an indicator of superantigen activity, FIG. 2 showing the results of Example 2 shows the results of the present invention compared to native enterotoxin C. This shows that the superantigen activity of the enterotoxin C mutant is significantly reduced.

実施例３. エンテロトキシンＣの免疫原活性の維持
本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、エンテロトキシンＣの免疫原性を有し、黄色ブドウ球菌の感染に対するワクチン効果を有する。このことを確認するため、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されておるもの；本明細書、特に実施例において、「dmSEC」と称する場合がある）、23位のAspのみをAlaにより置換したエンテロトキシンＣ変異体（本明細書、特に実施例において「mSEC」と称する）、組換え生産された生来のエンテロトキシンＣ（本明細書、特に実施例において、「rSEC」と称する場合がある）、アジュバントとして機能するコレラトキシン（CTと称する場合がある）のみ、及びリン酸緩衝液のみ（PBSと称する）、を用いて、次の実験を行った。 Example 3 Maintenance of Enterotoxin C Immunogenic Activity The enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention has the immunogenicity of enterotoxin C and has a vaccine effect against S. aureus infection. In order to confirm this, the enterotoxin C non-toxic mutant of the present invention (in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, Asp at position 23 is substituted with Ala, and Tyr at position 94 is replaced with Ala. In the present specification, particularly in the examples, it may be referred to as “dmSEC”), enterotoxin C mutant in which only Asp at position 23 is replaced by Ala (in this specification, particularly in the examples, “mSEC”) ), Recombinantly produced native enterotoxin C (sometimes referred to herein as “rSEC”), only cholera toxin (sometimes referred to as CT) that functions as an adjuvant, and phosphorus The following experiment was performed using only acid buffer (referred to as PBS).

（Ａ）マウスの感染生存試験
（ａ）20 μg/マウスのdmSECのみ［dmSEC］；（ｂ）20 μg/マウスのdmSECと、アジュバントとしてのCT［dmSEC＋CT］；及び（ｃ）CTのみ、をBALB/cマウスに経鼻投与し、更に２週間後及び４週間後に追加経鼻免疫を行なった。２回目の追加免疫の１週間後、黄色ブドウ球菌（MRSA臨床分離株、SEC産生株）を致死量（生菌として5000万個/マウス）を経尾静脈感染させ、その後15日間のマウスの生存状態を観察した。図２から明らかな通り、コレラトキシン（CT）のみに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ（dmSEC）の場合、黄色ブドウ球菌に感染されたマウスの生存率が上昇し、特にエンテロトキシンＣ（dmSEC）のアジュバントとしてコレラトキシン（CT）を用いた場合［dmSEC＋CT］、生存率は大きく上昇した。これにより、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体が黄色ブドウ球菌に対するワクチンとして有効であることが確認された。 (A) Mice infection survival test (a) 20 μg / mouse dmSEC only [dmSEC]; (b) 20 μg / mouse dmSEC and adjuvant CT [dmSEC + CT]; and (c) CT only BALB The mice were administered nasally, and further nasal immunization was performed after 2 weeks and 4 weeks. One week after the second boost, S. aureus (MRSA clinical isolate, SEC-producing strain) was infected with a lethal dose (50 million cells / mouse as live bacteria) via the tail vein, and the mice survived for 15 days. The condition was observed. As is clear from FIG. 2, in the case of the enterotoxin C (dmSEC) of the present invention, the survival rate of mice infected with Staphylococcus aureus is increased compared to cholera toxin (CT) alone, and in particular, the enterotoxin C (dmSEC) When cholera toxin (CT) was used as an adjuvant [dmSEC + CT], the survival rate increased significantly. This confirmed that the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention was effective as a vaccine against S. aureus.

（Ｂ）細菌残留試験
上記（Ａ）の方法において、黄色ブドウ球菌を感染させた後３日目にマウスを失血死させ、脾臓、肝臓及び腎臓に存在する菌数を、寒天平板上のコロニー数（CFU）として求めた。図３から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）をコレラトキシン（CT）とともに投与した場合、脾臓及び肝臓において、黄色ブドウ球菌の数は有意に低下した。 (B) Bacterial residue test In the method of (A) above, mice were bloodlessly killed on the third day after infection with Staphylococcus aureus, and the number of bacteria present in the spleen, liver, and kidney was determined by the number of colonies on the agar plate. (CFU). As is clear from FIG. 3, when the enterotoxin C non-toxic mutant (dmSEC) of the present invention was administered together with cholera toxin (CT), the number of S. aureus was significantly reduced in the spleen and liver.

（Ｃ）各種抗体の生成
上記の実験において、５から６週間後のマウスの血清中の各種の抗エンテロトキシンＣ抗体を、組換えエンテロトキシンＣを抗原として用いて、ELISAにより測定した。図４から明らかな通り、測定した殆どの抗体について、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体（dmSEC）を投与した場合と、生来の組換えエンテロトキシンＣを投与した場合とで、抗体の産生レベルはほぼ同じであり、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体において、エンテロトキシンＣに対する免疫原性が維持されていることが確認された。 (C) Production of various antibodies In the above experiments, various anti-enterotoxin C antibodies in the serum of mice after 5 to 6 weeks were measured by ELISA using recombinant enterotoxin C as an antigen. As is clear from FIG. 4, for most of the antibodies measured, the level of antibody production in the case where the enterotoxin C non-toxic mutant (dmSEC) of the present invention was administered and in the case where the native recombinant enterotoxin C was administered. Are substantially the same, and it was confirmed that the non-toxic mutant of enterotoxin C of the present invention maintained immunogenicity against enterotoxin C.

図１は、脾細胞の培養における、各種形態のエンテロトキシンＣの添加と、産生されるIFN-γ（図１のＡ）及びTNF-α（図１のＢ）との関係を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the relationship between addition of various forms of enterotoxin C and IFN-γ (A in FIG. 1) and TNF-α (B in FIG. 1) produced in splenocyte culture. 図２は、各種被験体により免疫されたマウスに黄色ブドウ球菌を接種した後のマウスの生存率の経過を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the progress of the survival rate of mice after inoculating S. aureus into mice immunized with various subjects. 図３は、各種被験体により免疫されたマウスに黄色ブドウ球菌を接種した後に、マウスの各器官に存在する黄色ブドウ球菌の数を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the number of Staphylococcus aureus present in each organ of a mouse after inoculating mice immunized with various subjects with Staphylococcus aureus. 図４は、各種被験体により免疫されたマウスの血清に生成する各種抗体の量を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the amounts of various antibodies produced in the serum of mice immunized with various subjects.

Claims (9)

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの変異体であって、Ｔ−細胞受容体結合部位及び主要組織適合性抗原II結合部位に変異を有し、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンエロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質。   A mutant of Staphylococcus aureus enterotoxin C, which has mutations in the T-cell receptor binding site and the major histocompatibility antigen II binding site, thereby lacking superantigen activity. And a protein that maintains the immunogenicity of enterotoxin C. 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAsp及び94位のTyrが他のアミノ酸により置換されており、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質。   The Asp at position 23 and Tyr at position 94 of staphylococcal enterotoxin C having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids, thereby lacking superantigen activity, and enterotoxin C A protein that maintains immunogenicity. 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているエンテロトキシンＣ免疫原性タンパク質。   Enterotoxin C immunogenic protein wherein Asp at position 23 of Staphylococcal enterotoxin C having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Ala and Tyr at position 94 is substituted with Ala. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を含んで成るブドウ球菌に対するワクチン。   A vaccine against staphylococci comprising the protein according to any one of claims 1 to 3. MRSAの病院感染、ウシ乳房炎等の動物感染症等に有効な請求項４記載のワクチン。   The vaccine according to claim 4, which is effective for MRSA hospital infections, animal infections such as bovine mastitis, and the like. 請求項２又は３に記載のタンパク質をコードする核酸。   A nucleic acid encoding the protein according to claim 2 or 3. 請求項６に記載の核酸を含んで成るベクター。   A vector comprising the nucleic acid according to claim 6. 請求項７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。   A host cell transformed with the vector according to claim 7. 請求項２又は３に記載のタンパク質の製造方法において、請求項７に記載の宿主細胞を培養し、そして培養物から当該タンパク質を採取することを特徴とする方法。   The method for producing a protein according to claim 2 or 3, wherein the host cell according to claim 7 is cultured, and the protein is collected from the culture.
JP2004175641A 2004-06-14 2004-06-14 Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same Pending JP2005348694A (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004175641A JP2005348694A (en) 2004-06-14 2004-06-14 Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same
PCT/JP2005/011216 WO2005121342A1 (en) 2004-06-14 2005-06-14 Recombinant enterotoxin c and vaccine with the use of the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004175641A JP2005348694A (en) 2004-06-14 2004-06-14 Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005348694A true JP2005348694A (en) 2005-12-22

Family

ID=35503068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004175641A Pending JP2005348694A (en) 2004-06-14 2004-06-14 Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2005348694A (en)
WO (1) WO2005121342A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597612B (en) * 2008-06-06 2011-05-11 中国科学院沈阳应用生态研究所 SEC2 mutant gene with increased activity of super-antigen and preparation method thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000009154A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 Walter Reed Army Institute Of Research Bacterial superantigen vaccines
AU2002327795A1 (en) * 2001-10-09 2003-04-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Methods and compositions for production and purification of recombinant staphylococcal enterotoxin b (rseb)

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005121342A1 (en) 2005-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005254774B2 (en) Preparation of protective antigen from bacillus anthracis
EP1725575B1 (en) Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus
US20070243205A1 (en) Polypeptides for Inducing a Protective Immune Response Against Staphylococcus Aureus
US20070172498A1 (en) Polypeptides for inducing a protective immune response against staphyloococcus aureus
US6870042B1 (en) Mutants of streptococcal toxin A and methods of use
US7935354B2 (en) Generation of new BCG vaccine strains protecting against the establishment of latent Mycobacterium tuberculosis infection and reactivation from the latent or persistent state
US7201912B2 (en) Recombinant immunogenic compositions and methods for protecting against lethal infections from Bacillus anthracis
EP0948624B1 (en) Mutants of streptococcal toxin a and methods of use
EP1240332B1 (en) Streptococcus pyogenes virulence genes and proteins and their use
JP6401148B2 (en) Antigens and antigen combinations
WO2004006857A2 (en) Glanders/meliodosis vaccines
JP2005348694A (en) Recombinant enterotoxin c and vaccine using the same
US8440427B2 (en) Preparation of protective antigen
US6391313B1 (en) Multi-component vaccine to protect against disease caused by Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis
JP2023512344A (en) Staphylococcal exotoxin protective vaccine
JP2011116659A (en) Medicine for swine atrophic rhinitis comprising recombinant dermonecrotic toxoid
JP5547657B2 (en) Heterologous protection against Pasteurella multocida by extracts of P. multocida fur cells and their outer membrane proteins
CN111172177B (en) Cra4S1 gene, protein coded by same and application thereof
RU2529359C2 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pPA-OPRF-ETA CODING SYNTHESIS OF RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, STRAIN Escherichia coli PA-OPRF-ETA PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa AND METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa
CA2206575A1 (en) Live attenuated rtx-producing bacteria of the family pasteurellaceae
US20220296696A1 (en) Immunogenic Antigens
JP2010521965A (en) Polypeptide that elicits a protective immune response against Staphylococcus epidermidis
JP2014511873A (en) Combination vaccine
NZ543976A (en) Immunogenic human TNF alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation
BREHM et al. Patent 2570508 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060221

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20060221

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20060316

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060404

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060605

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20060704