JP2005343885A - Drug carbon nanohorn composite and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
この出願の発明は、薬物伝送システム等に有用な、薬物カーボンナノホーン複合体とその製造方法に関するものである。 The invention of this application relates to a drug carbon nanohorn complex useful for a drug transmission system and the like, and a method for producing the same.
近年、様々な無機物が薬物伝送システムにおける薬物の担体として活用することが検討されてきている。このような担体として、特にナノ粒子が注目されており、これまでにも、たとえばヒドロキシアパタイト結晶やシリカをベースとしたナノ粒子等が報告されている。 In recent years, utilization of various inorganic substances as drug carriers in drug delivery systems has been studied. Nanoparticles are attracting particular attention as such carriers, and hitherto, for example, nanoparticles based on hydroxyapatite crystals or silica have been reported.
このような状況において、機能性のナノ粒子としてのカーボンナノ粒子への関心が高まっている。フラーレンやカーボンナノチューブ、カーボンナノホーン等である。 In such a situation, interest in carbon nanoparticles as functional nanoparticles is increasing. Fullerenes, carbon nanotubes, carbon nanohorns, and the like.
このうちのカーボンナノホーン（CNH）は、カーボンナノチューブ生成の研究中に新しいタイプのカーボンナノ粒子としてこの出願の発明者らによって発見された（非特許文献１）。この粒子は、たとえばその直径が約80nmで、大半が円錐キャップ（ホーン）のついたチューブ状のナノ炭素材料が球状に凝集したものであることが拡大透過電子顕微鏡（TEM）像により明らかになっている。個々のホーンは単層のグラファイトシートでできており、完全に閉鎖しており、直径の平均値は2〜3mmと、一般的なカーボンナノチューブの1.4nmよりもはるかに大きい。 Among these, carbon nanohorn (CNH) was discovered by the inventors of this application as a new type of carbon nanoparticle during the study of carbon nanotube production (Non-patent Document 1). Magnified Transmission Electron Microscope (TEM) images reveal that the particles are, for example, about 80 nm in diameter and mostly spherical aggregates of tubular nanocarbon materials with conical caps (horns). ing. Each horn is made of a single-layer graphite sheet, completely closed, with an average diameter of 2-3 mm, much larger than the typical carbon nanotubes of 1.4 nm.
また、酸化処理の結果、ホーンの先端または側壁面には穴があき、各種分子が当該穴を通過しホーン内の空間に入り得ることが確認されている（非特許文献２）。これによって、ホーンの内壁をおよび内部空間を物質の捕捉サイトとして利用できるようになるため、酸化処理されていないカーボンナノホーンに比べて表面積が大幅に増大する。実際、N2ガスは酸化処理された単層カーボンナノホーン（SWNHox）の個々のホーンの隙間だけでなく、ホーンの空洞にも吸着もしくは内包される。ホーンの側面および先端の穴の直径は、SWNHoxのTEM像によりそれぞれ1.58nmおよび1.17nmと測定されている。そして、この酸化処理により、SWNHoxの穴の縁には、カルボキシル基やキニン基のような酸素官能基も付加される（非特許文献３−４）。 In addition, as a result of the oxidation treatment, it has been confirmed that there is a hole in the tip or side wall surface of the horn, and various molecules can pass through the hole and enter the space in the horn (Non-Patent Document 2). As a result, the inner wall of the horn and the inner space can be used as a material capturing site, so that the surface area is greatly increased compared to the carbon nanohorn that has not been oxidized. In fact, N2 gas is adsorbed or contained not only in the gaps between individual horns of oxidized single-walled carbon nanohorns (SWNHox) but also in the horn cavities. The diameters of the holes on the side and tip of the horn are measured as 1.58 nm and 1.17 nm, respectively, by SWNHox TEM images. By this oxidation treatment, oxygen functional groups such as a carboxyl group and a quinine group are also added to the edge of the hole of SWNHox (Non-patent Documents 3-4).
一方、発明者らは、液体相のフラーレン（C60）が、先端および側壁の開口を通じ
て酸化処理された単層カーボンナノチューブに取り込まれることも報告している（非特許文献５）。
この出願の発明者は、カーボンナノホーン（CNH）とその酸化開孔体（CNHox）についてのこれまでの知見を踏まえ、薬物伝送システムにおける新しい薬物担体としてこれらを活用することを課題とし、検討を進めてきた。すなわち、この出願の発明は、新しい薬物担体として薬物の吸着もしくは内包の特性と放出特性、特に徐放性の良好なカーボンナノホーン複合体とその製造方法を提供することを課題としている。 The inventor of this application, based on the knowledge of carbon nanohorn (CNH) and its oxidized pores (CNHox), has been working on using them as new drug carriers in drug delivery systems. I came. That is, an object of the invention of this application is to provide a carbon nanohorn complex having good drug adsorption or encapsulation characteristics and release characteristics, particularly sustained release characteristics, and a method for producing the same as a new drug carrier.
この出願は、上記の課題を解決するものとして以下の発明を提供する。
〔１〕酸化開孔されたカーボンナノホーンにステロイド系薬物または金属含有の薬物が吸着もしくは内包されていることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔２〕リン酸緩衝食塩水中で前記薬物の徐放性を示すことを特徴とする上記の薬物カーボンナノホーン複合体。
〔３〕薬物が、融点３００℃以下の化合物であることを特徴とする上記の薬物カーボンナノホーン複合体。
〔４〕ステロイド系薬物が、デキソメタゾンまたはそのエステル誘導体であることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔５〕金属含有の薬物がシスプラチンであることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔６〕上記のいずれかの薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法であって、酸化開孔されたカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
〔７〕上記の薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法において、酸化開孔されたカーボンナノホーンを予め水素雰囲気下２００〜１８００℃の範囲で熱処理し、その後このカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
This application provides the following invention to solve the above-mentioned problems.
[1] A drug carbon nanohorn complex characterized in that a steroidal drug or a metal-containing drug is adsorbed or encapsulated in carbon nanohorn that has been oxidized and opened.
[2] The drug carbon nanohorn complex as described above, which exhibits sustained release of the drug in phosphate buffered saline.
[3] The drug carbon nanohorn complex described above, wherein the drug is a compound having a melting point of 300 ° C. or lower.
[4] A drug carbon nanohorn complex, wherein the steroidal drug is dexamethasone or an ester derivative thereof.
[5] A drug carbon nanohorn complex, wherein the metal-containing drug is cisplatin.
[6] A method of producing a drug carbon nanohorn complex according to any one of the above, characterized in that the carbon nanohorn having been oxidized and pores and the drug are mixed in a mixed solvent of a polar solvent and water. A method for producing a carbon nanohorn composite.
[7] In the above method for producing a drug carbon nanohorn complex, the oxidized carbon nanohorn is preheated in a range of 200 to 1800 ° C. in a hydrogen atmosphere, and then the carbon nanohorn and the drug are mixed with a polar solvent and water. A method for producing a drug carbon nanohorn complex comprising mixing in a solvent mixture.
この出願の発明によれば、薬物伝送システムにおける薬物の担体として活用することができる、薬物の吸着もしくは内包特性と放出特性、特に徐放性の良好な、新しいカーボンナノホーン複合体とその簡便な製造方法が提供される。 According to the invention of this application, a novel carbon nanohorn complex that can be used as a drug carrier in a drug transmission system and that has good drug adsorption or inclusion characteristics and release characteristics, particularly good sustained release, and its simple production A method is provided.
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。 The invention of this application has the features as described above, and an embodiment thereof will be described below.
この出願の発明の薬物カーボンナノホーン複合体においては、「薬物」とは、医薬もしくは動物薬等を指す。そして、これらは、いわゆるステロイド系の薬物であるか、あるいは金属含有の薬物である。このような薬物は、この出願の発明では、酸化開孔されたカーボンナノホーンに吸着もしくは内包されている。 In the drug carbon nanohorn complex of the invention of this application, the “drug” refers to a drug, an animal drug, or the like. These are so-called steroidal drugs or metal-containing drugs. In the invention of this application, such a drug is adsorbed or encapsulated in carbon nanohorns that have been oxidized and opened.
ここで酸化開孔されたカーボンナノホーンとは、この出願の発明者らが開発してきた方法に従って、凝集体としてのカーボンナノホーンを酸化処理することで開孔されたものを意味している。 Here, the carbon nanohorn that has been oxidized and opened means the one that has been opened by oxidizing the carbon nanohorn as an aggregate according to the method developed by the inventors of this application.
酸化処理時の条件の選択によって、開孔の度合、たとえばその数や大きさ、表面性状を変化させ、薬物の吸着もしくは内包の特性や放出能を制御することが可能になる。 By selecting the conditions during the oxidation treatment, it is possible to change the degree of opening, for example, the number and size of the pores, and the surface properties, and to control the drug adsorption or encapsulation characteristics and release ability.
また、薬物の放出能の制御は、酸化開孔されたカーボンナノホーンに薬物を吸着もしくは内包させる前に、予めこのカーボンナノホーンを水素雰囲気下２００℃以上の温度で熱処理することによっても可能である。２００℃未満の場合にはその効果が十分でないことがあるため好ましくない。この熱処理温度の上限としては、放出能の制御ができれば特に限定されるものではないが、実際上１８００℃程度が考慮される。 The drug release ability can also be controlled by heat-treating the carbon nanohorn in advance in a hydrogen atmosphere at a temperature of 200 ° C. or higher before adsorbing or encapsulating the drug in the oxidized and opened carbon nanohorn. When the temperature is lower than 200 ° C., the effect may not be sufficient. The upper limit of the heat treatment temperature is not particularly limited as long as the release ability can be controlled, but in practice, about 1800 ° C. is considered.
薬物の吸着もしくは内包のための手段としては、酸化開孔されたカーボンナノホーンと薬物とを液相において混合することにより実現される。この場合の液相溶媒としては適宜選択することができ、アルコールや、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等の極性溶媒と水との混合溶媒がより好適なものとして考慮される。特にアルコール、なかでもエタノールと水との２０〜８０／８０〜２０（体積比）の混合溶媒を用いて、たとえば５℃〜３０℃程度の温度において混合することが考慮される。 The means for adsorbing or encapsulating the drug is realized by mixing carbon nanohorns that have undergone oxidation pores and the drug in the liquid phase. The liquid phase solvent in this case can be selected as appropriate, and a mixed solvent of alcohol and a polar solvent such as DMF, DMSO, and acetonitrile and water is considered as a more preferable one. In particular, it is considered to mix at a temperature of about 5 ° C. to 30 ° C., for example, using a mixed solvent of alcohol, especially ethanol and water, 20 to 80/80 to 20 (volume ratio).
たとえば、この出願の発明においては、酸化開孔されたカーボンナノホーン：CNHoxは、抗炎症薬であるデキサメタゾン（DEX）を吸着もしくは内包し、エタノールとH2Oの1：1の混合物中で193mg/gの最大結合能をもつ。DEX-CNHox複合体は、37℃で、リン酸緩衝食塩水（PBS）中でDEXの徐放性を示す。マウス骨芽MCT3T-E1細胞をDEX-CNHoxで処理すると、MC3T3-E1細胞のアルカリホスファターゼの発現が加速されたが、これはDEXが細胞に及ぼす本質的な作用であり、複合体化したことによって毒性を生じることはなかった。これらの知見より、CNHoxが生体適合性薬物担体として有用であることが初めて示唆される。 For example, in the invention of this application, oxidized pore-opened carbon nanohorn: CNHox adsorbs or encapsulates dexamethasone (DEX), an anti-inflammatory drug, and is 193 mg / g in a 1: 1 mixture of ethanol and H2O. Has maximum binding capacity. The DEX-CNHox complex exhibits sustained release of DEX in phosphate buffered saline (PBS) at 37 ° C. Treatment of mouse osteoblast MCT3T-E1 cells with DEX-CNHox accelerated the expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 cells, which is an essential effect of DEX on the cells, due to complexation. There was no toxicity. These findings suggest for the first time that CNHox is useful as a biocompatible drug carrier.
酸化開孔されたカーボンナノホーンに薬物が吸着もしくは内包されたこの出願の発明の複合体においては、薬物は、その融点として３００℃以下のものがより好適である。またステロイド系薬物としては、デキソメタゾンまたはそのエステル誘導体が、金属含有薬物としては、抗ガン剤として知られているシスプラチンが代表的な具体例として例示される。 In the composite of the invention of this application in which a drug is adsorbed or encapsulated in carbon nanohorns that have been oxidized and opened, the drug preferably has a melting point of 300 ° C. or lower. Typical examples of steroidal drugs include dexamethasone or ester derivatives thereof, and examples of metal-containing drugs include cisplatin known as an anticancer agent.
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって発明が限定されることはない。 Therefore, an example will be shown below and will be described in more detail. Of course, the invention is not limited by the following examples.
＜実施例１＞
＜材料および方法＞
１）材料
CNH凝集体（CNH）および酸化多孔性生成物（CNHox）は、前記の報告（非特許文献１−２）に従って生成させた。簡単に述べると、CNHの酸化は、純酸素を流しながら（760Torr）石英チューブ中、580℃、10分間で行った。
<Example 1>
<Materials and methods>
1) Material
CNH aggregates (CNH) and oxidized porous products (CNHox) were produced according to the above report (Non-patent Document 1-2). Briefly, the oxidation of CNH was performed in a quartz tube at 580 ° C. for 10 minutes while flowing pure oxygen (760 Torr).
デキサメタゾン（DEX）、β-グリセロリン酸、アスコルビン酸、およびSIGMA FAST（登録商標）p-ニトロフェニルリン酸錠セットは、Sigma社より入手した。エタノールはWakoより入手した。［1,2,4-3H］デキサメタゾンは、Amersham Bioscience社より購入した。
遺伝子組み換えヒト骨形態形成蛋白-4（rhBMP-4）は、Genzyme/TECHNE社より入手した。
蛋白質量定量キット（Dc Protein Assay Kit）はBio-Rad社より入手した。ウシ胎児血清（FBS）は、JRH Bioscience社より購入した。α-最少必須培地（α-MEM）、Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水（PBS）、およびトリプシン-EDTA（0.05％トリプシン、0.53mM EDTA-4Na）は、Invitrogen社より入手した。ペニシリンおよびストレプトマイシンは、それぞれ萬有製薬および明治製菓より購入した。正常細胞培養皿はIWAKI社より購入した。
２）DEXのCNHoxへの吸着もしくは内包
CNHox（100μg/ml）およびDEX（1000μg/ml）は、エタノール/H2O（50/50）に混合し、この混合物を室温で一夜インキュベートした。混合物を15,000rpｍで5分間遠心分離し、上清を捨てて、デキサメタゾン-CNHox複合体（DEX-CNHox）を残渣として得た。DEX-CNHoxをさらに真空中で一夜乾燥させ、以下のバイオアッセイに供した。3H-標識DEXを、DEXがCNHoxに最大限吸着もしくは内包されるのに必要な浸漬時間、CNHoxおよびCNHのDEXへの最大結合能および親和性を求めるために、また以下に述べるin vitro放出実験用に3H-標識DEX-CNHoxを調製するために用いた。
３）熱重量分析（TGA）
逐次熱重量分析（sequential thermogravimetric analysis）を、Hi-Res TGA 2950 Thermogravimetric analyzer（TA Instruments）を用いて、10℃/分の速度で室温から1000℃まで、100cm3/分の純酸素ガス流量下で実施した。
４）DEXが結合したCNHoxのin vitroでの放出
3H標識DEX-CNHoxは、PBS（0.005wt％）に分散させ、37℃でインキュベートした。適当な時間に、この懸濁液を15,000rpmで5分間遠心分離し、LS6500シンチレーションカウンター（Beckman）を用いて放出された3H-DEX量を測定するために、上清分画を入れた。累積放出実験の場合は、上清の残りを新鮮なPBSで置換して0.005wt％懸濁液とした。3H標識DEX-CNHoxを撹拌装置で速やかに混合して再度分散させ、次の測定まで37℃でインキュベートした。
５）細胞培養
マウス骨芽細胞株（MC3T3-E1）は、T. Imamura博士（癌研究所、財団法人癌研究会）から提供されたものであり、このMC3T3-E1細胞は、α-MEMにおいて、10％FBS、100μg/mlペニシリンおよび100 U/mlストレプトマイシンを用いて維持し、5％CO2および95％空気の加湿した大気中で37℃で連続的に培養し、3〜4日毎に継代した。
６）ALP活性
MC3T3-E1細胞を26,000細胞/cm2で、24穴プレートに入れ、増殖させてコンフルエントな状態にした。次に、培地をα-MEM、5％FBS、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、50μMアスコルビン酸、10mM β-グリセロリン酸、および20ng/ml rhBMP-4からなる分化誘導培地に代え、CNHoxまたはDEX-CNHox（0.2、1、2、10、20μg/ｍl）と組み合わせた。培養物を、さらに10日間インキュベートし、分化誘導培地で培地を3〜4日毎に新しくしたが、細胞に付着したCNHoxまたはDEX-CNHoxを吸引しないように注意を払った。
Dexamethasone (DEX), β-glycerophosphate, ascorbic acid, and SIGMA FAST® p-nitrophenyl phosphate tablet set were obtained from Sigma. Ethanol was obtained from Wako. [1,2,4-3H] dexamethasone was purchased from Amersham Bioscience.
Recombinant human bone morphogenetic protein-4 (rhBMP-4) was obtained from Genzyme / TECHNE.
A protein mass determination kit (Dc Protein Assay Kit) was obtained from Bio-Rad. Fetal bovine serum (FBS) was purchased from JRH Bioscience. α-minimal essential medium (α-MEM), Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), and trypsin-EDTA (0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA-4Na) were obtained from Invitrogen. Penicillin and streptomycin were purchased from Ariyu Pharmaceutical and Meiji Seika, respectively. Normal cell culture dishes were purchased from IWAKI.
2) Adsorption or inclusion of DEX on CNHox
CNHox (100 μg / ml) and DEX (1000 μg / ml) were mixed in ethanol / H 2 O (50/50) and the mixture was incubated overnight at room temperature. The mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and dexamethasone-CNHox complex (DEX-CNHox) was obtained as a residue. DEX-CNHox was further dried in vacuum overnight and subjected to the following bioassay. 3 H-labeled DEX is released in vitro for the purpose of determining the immersion time, maximum binding capacity and affinity of CNHox and CNH to DEX for maximum DEX adsorption or inclusion in CNHox, and as described below. Used to prepare 3 H-labeled DEX-CNHox for experiments.
3) Thermogravimetric analysis (TGA)
Sequential thermogravimetric analysis using Hi-Res TGA 2950 Thermogravimetric analyzer (TA Instruments) from room temperature to 1000 ° C at a rate of 10 ° C / min under a pure oxygen gas flow rate of 100 cm 3 / min Carried out.
4) In vitro release of CNHox bound to DEX
3H-labeled DEX-CNHox was dispersed in PBS (0.005 wt%) and incubated at 37 ° C. At an appropriate time, the suspension was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes and the supernatant fraction was added to measure the amount of 3H-DEX released using an LS6500 scintillation counter (Beckman). In the case of cumulative release experiments, the remaining supernatant was replaced with fresh PBS to make a 0.005 wt% suspension. 3 H-labeled DEX-CNHox was quickly mixed with a stirrer and dispersed again, and incubated at 37 ° C. until the next measurement.
5) Cell culture The mouse osteoblast cell line (MC3T3-E1) was provided by Dr. T. Imamura (Cancer Research Institute, Cancer Research Foundation), and this MC3T3-E1 cell is Maintained with 10% FBS, 100 μg / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin, continuously cultured at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 and 95% air, passaged every 3-4 days did.
6) ALP activity
MC3T3-E1 cells were placed in a 24-well plate at 26,000 cells / cm 2 and grown to confluence. Next, the medium was replaced with a differentiation induction medium consisting of α-MEM, 5% FBS, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 50 μM ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate, and 20 ng / ml rhBMP-4. Or combined with DEX-CNHox (0.2, 1, 2, 10, 20 μg / ml). The cultures were further incubated for 10 days and the medium was renewed with differentiation-inducing medium every 3-4 days, but care was taken not to aspirate CNHox or DEX-CNHox attached to the cells.
ALP活性の測定には、培地を除去して、細胞を3回TBS（20mM Tris pH7.4、150mM NaCl）で洗浄した。その後、細胞をかきおとして0.2％ Triton X-100を含有するTBS 250μlに氷上で収集し、氷上で5分間超音波処理をした。細胞溶解産物を15,000rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清のアリコートをALPおよび蛋白分析用に取り出した。この上清（50μl）を製造業者の方法にしたがってp-ニトロリン酸と混合し、10分間で放出されたp-ニトロフェノールの量を、モデル550マイクロプレートリーダー（Bio-Rad）を用いて分光光度法（405nm）により測定した。上清の蛋白濃度は、蛋白質量定量キット（Dc Protein Assay Kit）を用いてローリー法により測定した。ALP活性は、p-ニトロフェノール量と総蛋白濃度の比として算出した。
＜結果＞
＜１＞デキサメタゾン（DEX）の酸化単層カーボンナノホーンへの吸着もしくは内包（CNHox）
CNHox上清とDEX溶液を、エタノール/H2O（50/50）に混合し、この混合物を室温で一夜インキュベートした。得られた固体分画を、熱重量質量分析（TGA）に入れた。図１にDEXで処理したCNHox（DEX-CNHox）のTGAプロフィールを示したが、これは100μg/ml CNHoxと1000μg/ml DEXの初期濃度下で調製したものと、CNHoxの場合のものである。5段階のDEX-CNHoxの重量減少が、210、290、330、470および610℃付近でみられた。210および610℃付近の重量減少は、それぞれ溶媒の蒸発およびCNHoxの分解が原因であった。290、330および470℃付近の重量減少は、DEX-CNHoxに特有で、対応する吸熱ピークは純粋なDEXのものとほぼ等しかったことから、DEXがCNHoxに吸着もしくは内包されたことが明確に立証された。CNHoxに吸着もしくは内包されたDEXの総量は、CNHox 1gにつき約150mgであった。
For measurement of ALP activity, the medium was removed and the cells were washed 3 times with TBS (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl). The cells were then scraped and collected on ice in 250 μl of TBS containing 0.2% Triton X-100 and sonicated for 5 minutes on ice. Cell lysates were centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes and aliquots of supernatants were removed for ALP and protein analysis. This supernatant (50 μl) was mixed with p-nitrophosphate according to the manufacturer's method and the amount of p-nitrophenol released in 10 minutes was measured spectrophotometrically using a model 550 microplate reader (Bio-Rad) Measured by the method (405 nm). The protein concentration in the supernatant was measured by the Raleigh method using a protein mass determination kit (Dc Protein Assay Kit). ALP activity was calculated as the ratio of the amount of p-nitrophenol to the total protein concentration.
<Result>
<1> Adsorption or inclusion of dexamethasone (DEX) on oxidized single-walled carbon nanohorn (CNHox)
CNHox supernatant and DEX solution were mixed in ethanol / H2O (50/50) and the mixture was incubated overnight at room temperature. The resulting solid fraction was subjected to thermogravimetric mass spectrometry (TGA). FIG. 1 shows the TGA profile of CNHox treated with DEX (DEX-CNHox), which was prepared at initial concentrations of 100 μg / ml CNHox and 1000 μg / ml DEX and for CNHox. Five stages of DEX-CNHox weight loss were observed around 210, 290, 330, 470 and 610 ° C. The weight loss around 210 and 610 ° C was attributed to solvent evaporation and CNHox decomposition, respectively. The weight loss around 290, 330 and 470 ° C is typical of DEX-CNHox, and the corresponding endothermic peak was almost equal to that of pure DEX, clearly demonstrating that DEX was adsorbed or encapsulated in CNHox. It was done. The total amount of DEX adsorbed or encapsulated in CNHox was about 150 mg per 1 g of CNHox.
吸着もしくは内包をさらに詳細に評価するために、3H-標識DEXを用いた。浸漬時間の関数としてのCNHoxに吸着もしくは内包されたDEXの量は、インキュベーションの数分以内に飽和した。このように速やかな飽和は、シスプラチンのヒドロキシアパタイト結晶への吸着もしくは内包でもみられた。浸漬時間を減らし、不完全な吸着もしくは内包を避けるために、CNHoxをこの後DEX溶液で最低1時間含浸した。 3 H-labeled DEX was used to evaluate adsorption or inclusion in more detail. The amount of DEX adsorbed or encapsulated in CNHox as a function of immersion time was saturated within minutes of incubation. Such rapid saturation was also observed by adsorption or inclusion of cisplatin on hydroxyapatite crystals. To reduce soaking time and avoid incomplete adsorption or inclusion, CNHox was then impregnated with DEX solution for a minimum of 1 hour.
溶液中に残っている濃度の関数としての吸着もしくは内包されたDEXの量を、エタノール/H2O（50/50）において検討した。図２は、CNHoxまたはCNH（0.1mg/ml）と種々の濃度の3H-標識DEXを含有するDEXをエタノール/H2O（50/50）中で混合した後、一夜インキュベートし、この混合物を遠心分離してDEXを吸着もしくは内包したカーボンナノホーンを残渣として得た後に、CNHoxまたはCNHへのDEXの吸着もしくは内包を、液体シンチレーションカウンターを用いて定量した結果を示したものである。 The amount of adsorbed or encapsulated DEX as a function of concentration remaining in the solution was studied in ethanol / H 2 O (50/50). FIG. 2 shows that CNHox or CNH (0.1 mg / ml) and DEX containing various concentrations of 3 H-labeled DEX were mixed in ethanol / H 2 O (50/50) and then incubated overnight. The results of quantifying the adsorption or encapsulation of DEX on CNHox or CNH using a liquid scintillation counter are obtained after centrifuging and obtaining carbon nanohorns that adsorb or encapsulate DEX as a residue.
図中の黒四角はCNHoxを、黒丸はCNHの場合を示している。 The black squares in the figure indicate CNHox, and the black circles indicate CNH.
この図２に示すように、CNHoxに吸着もしくは内包されるDEXの量は、平衡状態にある溶液中のDEX濃度が増すにつれて増加し、その後上昇がゆるやかになりプラトーとなる。DEXの取り込みは、Langmuirの吸着等温モデルにより表すことができ、以下の関係により定義される：A＝m［S］/（κ+［S］）。A項は吸着量（mg/g）、［S］は平衡濃度（mol/L）、κおよびｍは吸着の親和性および吸着能を反映する定数である。エタノール/H2O（50/50）中のCNHoxのDEXに対する解離定数および最大結合能は、それぞれ2.50×10-4M-1および193mg/gと算出されたのに対して、CNHは2.76×10-3M-1および160mg/gであった。CNHoxのDEXに対する親和性はCNHよりもはるかに強く、CNHoxの最大結合能はCNHと比較して増加が小さいことが分かった。CNHoxのホーンの内側がカーブしていること、およびグラファイトシートの外側が酸化されていることが、以下に示すように、CNHと比較して、CNHoxのDEXに対する親和性が高い原因であると予想される。すなわち、カーボンナノチューブの場合のカーブした内側表面に非常に近い分子で予想されるように、SWNTの内側表面は、開放された先端から侵入した吸着もしくは内包分子に対して、平らなグラファイトのシートよりも強い結合エネルギーを示した。この特性は、CNHoxの内側表面に応用でき、おそらくCNHoxのDEXに対する親和性を増すことになると思われる。一方、CNHは、吸着もしくは内包に利用できる内側表面そのものはもっていない。 As shown in FIG. 2, the amount of DEX adsorbed or encapsulated in CNHox increases as the DEX concentration in the solution in an equilibrium state increases, and then the rise gradually becomes a plateau. DEX incorporation can be represented by the Langmuir adsorption isotherm model and is defined by the following relationship: A = m [S] / (κ + [S]). The term A is the amount of adsorption (mg / g), [S] is the equilibrium concentration (mol / L), and κ and m are constants that reflect the affinity and ability of adsorption. The dissociation constant and maximum binding capacity of CNHox for DEX in ethanol / H 2 O (50/50) were calculated to be 2.50 × 10 −4 M-1 and 193 mg / g, respectively, whereas CNH was 2.76 × 10 6 -3 M -1 and 160 mg / g. It was found that the affinity of CNHox for DEX was much stronger than CNH, and the maximum binding capacity of CNHox was small compared to CNH. It is expected that the inside of the CNHox horn is curved and the outside of the graphite sheet is oxidized, as shown below, due to the higher affinity of CNHox for DEX compared to CNH. Is done. That is, as expected with molecules very close to the curved inner surface in the case of carbon nanotubes, the inner surface of SWNT is less than a flat graphite sheet against adsorbed or encapsulated molecules penetrating from the open tip. Also showed strong binding energy. This property can be applied to the inner surface of CNHox, possibly increasing the affinity of CNHox for DEX. On the other hand, CNH does not have an inner surface that can be used for adsorption or encapsulation.
CNHおよびSWNTの穴が開くための酸化過程の間に、グラファイトシートの外側表面は種々の酸素官能基、たとえばカルボキシル基、カルボニル基、およびヒドロキシル基などで修飾される（非特許文献３−４）ことが報告されており、また、Arakiらは、ビスフェノールA（2つのヒドロキシル基をもつ疎水性内分泌攪乱物質）が吸着もしくは内包した酸化活性炭（同じように酸化したグラファイトシート）は、酸素官能基をもたない還元した活性炭よりも親和性が高いことを観察している(J.Sur.Sci.Jpn.,23,437-442)。結合は基本的にビスフェノールAと酸化活性炭のグラファイトシートの間の疎水性相互作用により制御されるが、ビスフェノールAのヒドロキシル基と酸化活性炭の外側表面の酸素官能基との間に、H-結合の親和性に及ぼす相互作用があることが示唆されている。そしてDEXのむ場合には疎水性で、CNHoxの酸素官能基とH-結合を形成するヒドロキシル基、カルボニル基およびフッ化物基を含有し、CNHoxの外側表面を酸化することによっても、DEXの親和性を高めることができている。してみると、CNHoxのDEXに対する親和性に影響を及ぼすことができるこれらの2つの要因を考慮することで、CNHoxは適切に修飾することにより薬物に対する親和性を制御できることが留意される。
＜２＞in vitroにおけるDEX-CNHox複合体からのDEXの放出
臨床的有用性を得る際に、薬物担体に薬物の制御放出は不可欠である。37℃でPBS（pH7.4）中におけるDEX-CNHoxからDEXの放出率を図３に示した。すなわち、図３は、37℃でのPBS中DEX-CNHoxからのDEXの累積放出率を示した図であり、3H-標識DEXを用いて調製したDEX-CNHoxは、PBS中に5wt％で分散させた後、37℃でインキュベートし、放出されたPBS中DEXを、液体シンチレーションカウンターを用いて各表示時刻に交換したPBSとともに測定した結果である。各表示時刻までに放出されたDEXの総量は、DEX-CNHox中の総DEXの割合（％）で表した。この図３においては、DEXはPBS中の複合体からゆっくりと放出されることに留意することができる。最初に放出された量は、ほぼインキュベーション時間に比例しており、徐々に放出量が低下してプラトーに達した。DEX-CNHox複合体の最初の量の合計52％が、2週間の終わりまでに放出された。ユニークなCNHoxの表面特性が、DEX-CNHoxからのDEXの制御放出に寄与していると考えられる。
During the oxidation process to open CNH and SWNT holes, the outer surface of the graphite sheet is modified with various oxygen functional groups such as carboxyl, carbonyl, and hydroxyl groups (Non-Patent Documents 3-4). Araki et al. Reported that oxidized activated carbon (similarly oxidized graphite sheet) adsorbed or encapsulated by bisphenol A (hydrophobic endocrine disrupter with two hydroxyl groups) has oxygen functional groups. It has been observed that it has a higher affinity than non-reduced activated carbon (J.Sur.Sci.Jpn., 23,437-442). The binding is basically controlled by the hydrophobic interaction between the graphite sheet of bisphenol A and the oxidized activated carbon, but the H-bonding between the hydroxyl group of bisphenol A and the oxygen functional group on the outer surface of the oxidized activated carbon. It has been suggested that there is an interaction on affinity. And in the case of DEX, it is hydrophobic and contains hydroxyl groups, carbonyl groups and fluoride groups that form H-bonds with the oxygen functional group of CNHox, and by oxidizing the outer surface of CNHox, the affinity of DEX Can improve the sex. In light of this, it is noted that CNHox can control its affinity for drugs by appropriate modification, taking into account these two factors that can affect the affinity of CNHox for DEX.
<2> Release of DEX from DEX-CNHox complex in vitro In obtaining clinical usefulness, controlled release of a drug in a drug carrier is indispensable. The release rate of DEX from DEX-CNHox in PBS (pH 7.4) at 37 ° C. is shown in FIG. That is, FIG. 3 is a graph showing the cumulative release rate of DEX from DEX-CNHox in PBS at 37 ° C. DEX-CNHox prepared using 3H-labeled DEX was dispersed at 5 wt% in PBS. It is the result of having been incubated at 37 ° C., and measuring the released DEX in PBS together with PBS exchanged at each display time using a liquid scintillation counter. The total amount of DEX released by each display time was expressed as a percentage (%) of the total DEX in DEX-CNHox. In this FIG. 3, it can be noted that DEX is slowly released from the complex in PBS. The amount initially released was approximately proportional to the incubation time, and the amount released gradually decreased and reached a plateau. A total of 52% of the initial amount of DEX-CNHox complex was released by the end of 2 weeks. The unique surface properties of CNHox are thought to contribute to the controlled release of DEX from DEX-CNHox.
また、37℃でPBS中でDEX-CNHoxを3日間PBSを交換せずにインキュベートしたとき、DEX-CNHoxに結合していたDEXの14％が放出された。この値は、最初の3日間に5回 PBSを交換した累積放出実験でみられた24％よりも低かった（図３）ことから、PBS中のDEX-CNHoxからのDEXの放出の動態は、PBS中のDEXの溶解度（25℃で10mg/100ml H2O）にも影響を受けている可能性がある。
＜３＞in vitroにおけるDEX-CNHox複合体の生物学的活性
次に、DEX-CNHoxのin vitroでの生物学的活性を骨芽MC3T3-E1細胞を用いて検討した。DEXはアルカリホスファターゼ（ALP）（骨形成中の分化マーカーのひとつ）の発現を誘導することが知られている合成糖質コルチコイドである。MC3T3-E1細胞は、骨芽分化および骨形成の強力なプロモータである（20〜22）骨形態形成蛋白（BMP）-2存在下でDEXで処理することによりALPの発現を増大させることが報告されている。図４は、DEX-CNHoxおよびCNHoxがアルカリホスファターゼ（ALP）活性に及ぼす影響を示した図である。
When DEX-CNHox was incubated in PBS at 37 ° C. for 3 days without changing the PBS, 14% of DEX bound to DEX-CNHox was released. This value was lower than the 24% seen in a cumulative release experiment with 5 PBS changes during the first 3 days (Figure 3), so the kinetics of DEX release from DEX-CNHox in PBS was It may also be affected by the solubility of DEX in PBS (10mg / 100ml H 2 O at 25 ° C).
<3> Biological activity of DEX-CNHox complex in vitro Next, in vitro biological activity of DEX-CNHox was examined using osteoblast MC3T3-E1 cells. DEX is a synthetic glucocorticoid known to induce the expression of alkaline phosphatase (ALP), one of the differentiation markers during bone formation. MC3T3-E1 cells are potent promoters of osteoblast differentiation and osteogenesis (20-22), reported to increase ALP expression by treatment with DEX in the presence of bone morphogenetic protein (BMP) -2 Has been. FIG. 4 shows the influence of DEX-CNHox and CNHox on alkaline phosphatase (ALP) activity.
細胞は、5％FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mM β-グリセロリン酸、および20ng/ml rhBMP-4に、DEX（0.01、0.05、0.1、0.5、1μM）、CNHoxまたはDEX-CNHox（0.2、1、2、10、20μg/ml）のいずれかを組み合わせたものを含有するα-MEM中で10日間培養した。培地はCNHoxおよびDEX-CNHoxを追加せずに3〜4日毎に交換した。ALP活性は、p-ニトロフェニルリン酸を用いて測定し、蛋白濃度について正規化し、相対ALP活性を−倍誘導として示した。この図４に示すように、0.05μM以上のDEXを加えてALP活性を上昇させることにより、我々の培養条件でのMC3T3-E1細胞に対するDEXの生物学的活性を確認した。 Cells are 5% FBS, 50 μg / ml ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate, and 20 ng / ml rhBMP-4, DEX (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 μM), CNHox or DEX-CNHox (0.2, 1 , 2, 10, and 20 μg / ml) were cultured for 10 days in α-MEM containing a combination thereof. The medium was changed every 3-4 days without adding CNHox and DEX-CNHox. ALP activity was measured using p-nitrophenyl phosphate, normalized for protein concentration, and relative ALP activity expressed as -fold induction. As shown in FIG. 4, the biological activity of DEX against MC3T3-E1 cells under our culture conditions was confirmed by increasing ALP activity by adding 0.05 μM or more of DEX.
2μg/mlを超えるDEX-CNHoxで処理することにより、ALP活性が明らかに増大した（図４）。これとは対照的に、CNHoxには、ALP活性に及ぼす有意な影響はなかった。これらの結果から、DEX-CNHoxはDEXの本質的な生物学的活性を示したのに対して、CNHox自体はMC3T3-E1細胞のALP発現に及ぼす作用を阻害しなかったことが明確に立証された。さらに、CNHoxの最大用量（20μg/ml）でさえ細胞毒性はみられなかった。
＜実施例２＞
単層カーボンナノホーン凝集体(CNH)を、酸素ガスを用いて、760Torr、570〜580℃の
温度において15分間加熱した。
Treatment with DEX-CNHox above 2 μg / ml clearly increased ALP activity (FIG. 4). In contrast, CNHox had no significant effect on ALP activity. These results clearly demonstrate that DEX-CNHox showed the essential biological activity of DEX, whereas CNHox itself did not inhibit its effect on ALP expression in MC3T3-E1 cells. It was. Furthermore, even the highest dose of CNHox (20 μg / ml) was not cytotoxic.
<Example 2>
Single-walled carbon nanohorn aggregates (CNH) were heated with oxygen gas at a temperature of 760 Torr, 570-580 ° C. for 15 minutes.
得られた酸化開孔されたカーボンナノホーン(CNHox)を水（１mg／ml）中に分散した。一方、シスプラチン（CDDP）粉末（シグマ社）をDMSO、DMFの各々に20mg／mlで溶解した。得られた溶液を、上記のCNHox-H2O分散液に30℃〜100℃の温度において滴下した。 The resulting oxidized pore-opened carbon nanohorn (CNHox) was dispersed in water (1 mg / ml). On the other hand, cisplatin (CDDP) powder (Sigma) was dissolved in DMSO and DMF at 20 mg / ml. The resulting solution was added dropwise to the above CNHox-H 2 O dispersion at a temperature of 30 ° C. to 100 ° C.
CDDPとCNHoxとの複合体が得られた。この複合体は、濾別した後に130℃の温度で３時間乾燥した。 A complex of CDDP and CNHox was obtained. The composite was filtered and dried at a temperature of 130 ° C. for 3 hours.
図５は、この複合体についてのHR-TEM像であり、図６は、その高解像度像である。黒色の粒はCDDPを示しており、CDDPがカーボンナノホーンに内包吸着もしくは内包されていることがわかる。図７はＸ線解析の結果を示したものであって、下がCDDPを、上がCDDP-CNHoxの場合を示し、ｄ＝6.3オングストロームにCDDPの検出ピークが示されている。
＜実施例３＞
単層カーボンナノホーン凝集体(CNH)を、酸素ガスを用いて、760Torr、570〜580℃の
温度において15分間加熱した。
FIG. 5 is an HR-TEM image of this complex, and FIG. 6 is a high-resolution image thereof. The black particles indicate CDDP, and it can be seen that CDDP is encapsulated or encapsulated in carbon nanohorns. FIG. 7 shows the results of X-ray analysis. The bottom shows CDDP, the top shows CDDP-CNHox, and the detection peak of CDDP is shown at d = 6.3 angstroms.
<Example 3>
Single-walled carbon nanohorn aggregates (CNH) were heated with oxygen gas at a temperature of 760 Torr, 570-580 ° C. for 15 minutes.
得られた酸化開孔されたカーボンナノホーン(CNHox)1mgをCDDP/DMF溶液（１mg/10mL）に混合した後、DMFを完全に蒸発させてCDDPとCNHoxとの複合体を得た。得られたCDDP-CNHox複合体は、約0.24 mg/mgであった。
＜１＞CDDPのCNHoxへの吸着もしくは内包
図８は、この複合体についてのHR-TEM像であり、図９は、その高解像度像である。黒色の粒はCDDPを示しており、CDDPがカーボンナノホーンに内包吸着もしくは内包されていることがわかる。
1 mg of the obtained carbon nanohorn (CNHox) with oxidized pores was mixed with a CDDP / DMF solution (1 mg / 10 mL), and then DMF was completely evaporated to obtain a complex of CDDP and CNHox. The obtained CDDP-CNHox complex was about 0.24 mg / mg.
<1> Adsorption or inclusion of CDDP on CNHox FIG. 8 is an HR-TEM image of this complex, and FIG. 9 is a high-resolution image thereof. The black particles indicate CDDP, and it can be seen that CDDP is encapsulated or encapsulated in carbon nanohorns.
上記のCDDP-CNHox複合体を生理食塩水に１０時間浸漬すると、内包されたCDDPクラスターが生理食塩水中に放出された。図１０は、CDDP-CNHox複合体からCDDPクラスターが放出したカーボンナノホーンについてのHR-TEM像であり、図１１は、その高解像度像である。図８、９で観察された黒色の粒（CDDP）がカーボンナノホーン内に観察されなかった。 When the CDDP-CNHox complex was immersed in physiological saline for 10 hours, the encapsulated CDDP clusters were released into the physiological saline. FIG. 10 is an HR-TEM image of a carbon nanohorn released by a CDDP cluster from a CDDP-CNHox complex, and FIG. 11 is a high-resolution image thereof. The black particles (CDDP) observed in FIGS. 8 and 9 were not observed in the carbon nanohorn.
CDDPが内包されずにCNHの外側にある場合、Ｘ線回折で確認することができる。酸化開孔されていないCNHを用いたときや過剰のCDDPを用いたときには、CNHあるいはCNHoxの外側でCDDPが結晶をつくるためである。図１２はそのＸ線回折結果を示したもので、図中のａはDMFから析出したCDDPを示し、ｂはCNHを用いたときを、ｃは過剰のCDDPを用いたときを示す。これらは、図中の矢印で表されるCDDP特有のピーク強度が大きい。一方、適量のCDDPを用いたとき（ｄ、ｅ）は効率よくCDDPが内包され、矢印で示したCDDPに特徴的なピークの強度は弱くピーク幅も狭い。これは、内包されたCDDPクラスターサイズが小さいためと推測される。 When CDDP is not encapsulated but outside CNH, it can be confirmed by X-ray diffraction. This is because CDDP forms crystals on the outside of CNH or CNHox when CNH that is not oxidized and used or when excess CDDP is used. FIG. 12 shows the X-ray diffraction results. In the figure, a indicates CDDP precipitated from DMF, b indicates when CNH is used, and c indicates when excess CDDP is used. These have large peak intensities peculiar to CDDP represented by arrows in the figure. On the other hand, when an appropriate amount of CDDP is used (d, e), CDDP is efficiently included, and the peak intensity characteristic of CDDP indicated by the arrow is weak and the peak width is narrow. This is presumed to be due to the small size of the encapsulated CDDP cluster.
図１３は、CDDP-CNHox複合体からCDDPが生理食塩水中に放出された量を測定した結果である。生理食塩水に浸漬する時間が長くなるにしたがって放出される量が増加していくのがわかる。CNHoxを１２００℃で１時間水素中で処理してからCDDPを内包させたものでは、放出が比較的早いのに対して、CNHoxをそのまま用いた場合には放出速度が著しく遅くなり徐放効果が顕著であった。内包CDDPがすべて放出されると1350ppb（点線）に達する。
＜２＞がん細胞の生存率のin vitro試験
CNHoxから放出されるCDDPの効果を、WST-1アッセイによって検討した。CDDP-CNHox粉末を、ヒト由来肺ガン細胞NCI-H460に加えた。CDDPは、ヒトの肺ガンに対して効果を発揮する薬物である。この細胞は、5%ウシ胎児血清(FBS)含有のRPMI-1640培養液で、CO2および湿気を含み温度37℃の環境下での培養し、これにCDDP-CNHoxを加えた場合、CDDPを加えた場合、およびCNHoxを加えた場合について、それぞれ検討した。NCI-H460細胞は、4000細胞／ウエルになるように播種して、43時間培養した。また、2500細胞／ウエルになるように播種した場合は、67時間の培養をした（CDDP-CNHox、CDDPの薬物添加は無し）。そして、薬物添加によってH460細胞が死滅することを確認した。H460細胞の死滅した量は、H460細胞の生存を示すformazan（青色色素）の吸光度からその発光強度の減少を観察することで推定した。また、光学顕微鏡を用いてNH460細胞を直接観察した。
FIG. 13 shows the results of measuring the amount of CDDP released from the CDDP-CNHox complex into physiological saline. It can be seen that the amount released increases as the time of immersion in physiological saline increases. When CNHox was treated in hydrogen at 1200 ° C for 1 hour and then encapsulated with CDDP, the release was relatively fast, whereas when CNHox was used as it was, the release rate was remarkably slow and the sustained release effect was effective. It was remarkable. When all the encapsulated CDDP is released, it reaches 1350ppb (dotted line).
<2> In vitro test of cancer cell viability
The effect of CDDP released from CNHox was examined by WST-1 assay. CDDP-CNHox powder was added to human-derived lung cancer cells NCI-H460. CDDP is a drug that exerts an effect on human lung cancer. These cells are cultured in RPMI-1640 medium containing 5% fetal bovine serum (FBS) in an environment containing CO 2 and moisture at a temperature of 37 ° C. When CDDP-CNHox is added to this, CDDP is added. The case where it added and the case where CNHox was added were each examined. NCI-H460 cells were seeded at 4000 cells / well and cultured for 43 hours. Moreover, when seed | inoculating so that it might become 2500 cells / well, it culture | cultivated for 67 hours (there is no drug addition of CDDP-CNHox and CDDP). Then, it was confirmed that H460 cells were killed by the drug addition. The amount of H460 cells killed was estimated by observing a decrease in the emission intensity from the absorbance of formazan (blue dye) indicating the survival of H460 cells. In addition, NH460 cells were directly observed using an optical microscope.
図１４は、薬物添加によるNCI-H460細胞の生存率の結果を示した図である（（ａ）は培養時間が46時間、（ｂ）は培養時間が72時間）。図中のA群はCDDPを加えた場合の結果を示しており、加えた量が増えるに従いNCI-H460細胞の生存率が低下した。つまり、加えた量に従いNCI-H460細胞がアポトーシスにより死ぬ効率が高かった。図中のB群はCNHoxを加えた場合の結果で、C群はCDDP-CNHoxを加えた場合の結果を示している。この結果によれば、B群ではその加えた量が増えるに従いNCI-H460細胞の生存率の低下は認められなかったが、C群ではA群と同様にNCI-H460細胞の生存率の低下がみられた。 FIG. 14 is a graph showing the results of survival rate of NCI-H460 cells by drug addition ((a) culture time is 46 hours, (b) culture time is 72 hours). Group A in the figure shows the results when CDDP was added, and the survival rate of NCI-H460 cells decreased as the added amount increased. In other words, according to the amount added, the efficiency with which NCI-H460 cells die by apoptosis was high. Group B in the figure shows the results when CNHox was added, and Group C shows the results when CDDP-CNHox was added. According to this result, there was no decrease in the survival rate of NCI-H460 cells in the B group as the added amount increased, but the decrease in the survival rate of the NCI-H460 cells in the C group was the same as in the A group. It was seen.
以上の結果を光学顕微鏡で確認した。この結果を図１５、図１６に示す。 The above results were confirmed with an optical microscope. The results are shown in FIGS.
図１５は46時間細胞培養後の結果であり、（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合の結果を示す。（ｃ）は（ａ）（ｂ）に比べてNCI-H460細胞が少ないことが確認された。図１６は72時間細胞培養後の結果であり、（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合の結果を示す。（ｃ）は（ａ）（ｂ）の結果に比べてNCI-H460細胞の数が著しく少ないことが確認された。これはNCI-H460細胞の増殖が抑えられたことを示している。 FIG. 15 shows the results after 46 hours of cell culture. (A) without drug addition, (b) with CNHox added, (c) with CDDP-CNHox (CDDP 3.8 μM contained) The results are shown. It was confirmed that (C) had fewer NCI-H460 cells than (a) and (b). FIG. 16 shows the results after 72 hours of cell culture, (a) without drug addition, (b) with CNHox added, and (c) with CDDP-CNHox (containing CDDP 3.8 μM). The results are shown. In (c), it was confirmed that the number of NCI-H460 cells was remarkably smaller than the results of (a) and (b). This indicates that the growth of NCI-H460 cells was suppressed.
Claims (7)
In the method for producing a drug carbon nanohorn complex according to claim 6, the oxidized carbon nanohorn is heat-treated in advance in a hydrogen atmosphere in a range of 200 to 1800 ° C, and then the carbon nanohorn and the drug are mixed with a polar solvent and water. A method for producing a drug carbon nanohorn complex comprising mixing in a mixed solvent of
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