JP2005341929A - STAT3、NF−κBp65、およびp300複合体の形成を阻害する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
STAT3、NF−κBp65、およびp300複合体の形成を阻害する化合物のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体解離調製物と被験化合物を接触させ、溶液の塩濃度をSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体が形成される塩濃度に下げ、STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体検出用オリゴヌクレオチドプローブを用いて該複合体の形成の有無を検出することにより該被験化合物がSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体の形成を阻害するか否かを試験する。
【選択図】なし
Description
(a)溶液中のSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体解離調製物を被験化合物と接触させ、
(b)溶液の塩濃度をSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体が形成される塩濃度に下げ、
(c)STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体検出用オリゴヌクレオチドプローブを用いて該複合体の形成の有無を検出する工程を含むスクリーニング方法に関するものである。
(発明の効果)
1)IL-6+IL-1刺激による炎症反応の発生メカニズムにおけるSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体の形成の重要性:急性炎症タンパクの一つであるSAA1のプロモーター領域を用いた実験。
STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体形成阻害化合物のスクリーニング方法。
1)STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体解離調製物の調製
2)STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体検出用オリゴヌクレオチドプローブの作製
2−1)STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体と結合するオリゴヌクレオチドの検討
簡単には、実施例2、1)で得られたHepG2細胞からの核抽出物200μgに、反応液(10mM Tris-Cl (pH7.5)、1mM EDTA、4%グリセロール、5mMジチオスレイトール、60mM NaCl、100ng/μlウシ血清アルブミン、600ng/μl ポリ(dI-dC))、及び1μgの5’末端をビオチンラベルしたオリゴヌクレオチドを加え、最終的に500μlの量に調整し、25℃、30分間反応させた。反応させたサンプルにstreptavidin-Dynabeads (Dynal) 50μlを加え4℃、30分間反応させた。次にオリゴヌクレオチドと反応させたDynabeadsをマグネットで回収し、反応液で洗浄し、蛋白を抽出し、それぞれの特異抗体を用いウエスタンブロッティングで解析した。
複合体を形成しているタンパク質は巨大であることが予想されたので、DNAとの結合には十分な長さのオリゴヌクレオチドが必要と考えさらに検討を行ったところ、124塩基の長さのオリゴヌクレオチド断片SAA1(-196〜-73)を用いたとき、STAT3、NF-κB p65のバンドが明らかに検出された(図7)。つまり、STAT3が、単独で直接的にDNAに結合する場合と異なり、他の転写因子と複合体を形成することによりDNAに結合する場合は、結合様式が異なることが示された。
3)ビオチン化オリゴヌクレオチドSAA1(-196〜-73)によるSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体阻害物質のスクリーニング
3−1)スクリーニングの手順
3−2)本発明のスクリーニング法の対象となる化合物
つまり、このスクリーニング法で、従来、DNA結合に関与せず、役割が不明であったSTAT3のセリンのリン酸化の働きの一つが複合体の形成に必要であることが示されただけでなく、複合体の形成を阻害する上での標的になることが示された。
以上のことから、本スクリーニング法により、複合体の形成を阻害する化合物を簡便に検索することができると思われる。
Claims (2)
- STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体の形成を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
(a)溶液中のSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体解離調製物を被験化合物と接触させ、
(b)溶液の塩濃度をSTAT3、NF-κB p65、およびp300複合体が形成される塩濃度に下げ、
(c)STAT3、NF-κB p65、およびp300複合体検出用オリゴヌクレオチドプローブを用いて該複合体の形成の有無を検出する工程を含むスクリーニング方法。 - 該化合物が抗炎症作用を有する請求項1記載のスクリーニング方法。
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WO2003099781A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | METHODS FOR THE IDENTIFICATION OF IKKα FUNCTION AND OTHER GENES USEFUL FOR TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES |
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