JP2005304393A - A170 gene knockout mouse as insulin-resistant disease model, and method using the knockout mouse - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インスリン抵抗性疾患モデルのノックアウトマウス、及び該ノックアウトマウスを用いた方法に関する。より詳細には、インスリン抵抗性疾患モデルとしてのＡ１７０遺伝子ノックアウトマウス、及び該ノックアウトマウスを用いたスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to an insulin resistant disease model knockout mouse and a method using the knockout mouse. More specifically, the present invention relates to an A170 gene knockout mouse as an insulin resistance disease model and a screening method using the knockout mouse.
インスリン抵抗性疾患とは、インスリン抵抗性の上昇によって引き起こされる疾患のことをいい、２型糖尿病、高脂血症・脂肪肝、肥満、高血圧症、動脈硬化症等の成人病は、インスリン抵抗性疾患と深い関連性を持つ。即ち、インスリン抵抗性の上昇は、２型糖尿病、高脂血症・脂肪肝、肥満等を引き起こし、また、インスリン抵抗性上昇に伴う代償性の高インスリン血症は、高血圧症等の誘因となる。さらに、それらの病態が複合的に連関して、動脈硬化症等が誘発される場合もある（非特許文献１参照）。 Insulin resistance disease refers to a disease caused by an increase in insulin resistance, and adult diseases such as type 2 diabetes, hyperlipidemia / fatty liver, obesity, hypertension, arteriosclerosis are insulin resistance. Deeply related to the disease. That is, an increase in insulin resistance causes type 2 diabetes, hyperlipidemia / fatty liver, obesity, etc., and compensatory hyperinsulinemia accompanying an increase in insulin resistance is an incentive for hypertension and the like. . Furthermore, these pathological conditions are combined and arteriosclerosis etc. may be induced (refer nonpatent literature 1).
これらの病態の作用機序の解析、治療薬の開発等を目的として、疾患モデルマウス（ノックアウトマウス）が多く開発されている。例えば、糖尿病モデルマウスは、糖尿病に関連があると考えられる遺伝子を欠損させることにより作製し、該遺伝子の機能解析や糖尿病治療薬のスクリーニング等に用いられている。非特許文献２には、主な糖尿病モデルマウスが列記されている。 Many disease model mice (knockout mice) have been developed for the purpose of analyzing the mechanism of action of these pathologies and developing therapeutic agents. For example, a diabetes model mouse is prepared by deleting a gene that is considered to be related to diabetes, and is used for functional analysis of the gene, screening for a therapeutic drug for diabetes, and the like. Non-Patent Document 2 lists major diabetes model mice.
ここで、本発明に係るＡ１７０遺伝子についての公知技術を以下に説明する。 Here, known techniques for the A170 gene according to the present invention will be described below.
Ａ１７０遺伝子とは、ヒトのｐ６２をコードする遺伝子、ラットのＺＩＰをコードする遺伝子、ＯＳＦ−６と名付けられた骨関連タンパク質をコードする遺伝子等と相同性を示すマウスの遺伝子で（非特許文献３、特許文献１参照）、現在のところ、骨代謝と関連する病変（ページェット病等）との関連が強く示唆されている（特許文献１、非特許文献４参照）。そして、非特許文献４では、ページェット病の解析を目的として、ｐ６２不活性化マウスの作出が行われている。 The A170 gene is a gene encoding human p62, a gene encoding rat ZIP, a gene encoding a bone-related protein named OSF-6, and the like (Non-patent Document 3). At present, there is a strong suggestion of a relationship with bone metabolism-related lesions (Paget disease and the like) (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 4). In Non-Patent Document 4, a p62 inactivated mouse is produced for the purpose of analyzing Paget's disease.
一方、非特許文献５には、Ａ１７０と相同性を示すＺＩＰが、Ｇｒｂ１４と結合してインスリン・シグナルを制御することが記載されているが、Ａ１７０とインスリン抵抗性疾患との具体的な関わり又は作用機序は、現在のところ知られていない。
上記した、従来の糖尿病モデルマウスは、糖尿病と関連する遺伝子の機能解析等には有用であったが、ヒトとマウスとの間で、病態・表現型が異なる場合が多かった。 Although the above-mentioned conventional diabetes model mice were useful for functional analysis of genes related to diabetes, etc., pathological conditions and phenotypes were often different between humans and mice.
即ち、ヒトの糖尿病等インスリン抵抗性疾患は、食物摂取量の増大、高脂血症・脂肪肝、肥満、代償性高インスリン血症による高血圧、動脈硬化等を併発する場合が多いのに対し、そのような病態を併発する糖尿病モデルマウスは作出されていなかった。そのため、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同じ病態を示すモデルマウスの作出が課題となっていた。 That is, insulin resistance diseases such as diabetes in humans are often accompanied by increased food intake, hyperlipidemia / fatty liver, obesity, hypertension due to compensatory hyperinsulinemia, arteriosclerosis, etc. No diabetic model mice with such pathological conditions have been created. Therefore, the creation of a model mouse that exhibits the same pathological condition as human insulin resistant disease has been an issue.
従って、本発明は、食物摂取量の増大、高脂血症・脂肪肝、肥満、高インスリン血症等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すインスリン抵抗性疾患モデルマウスを提供すること、及び、該モデルマウスを用いたスクリーニング方法を提供することを主な目的とする。 Accordingly, the present invention provides an insulin resistance disease model mouse that exhibits the same pathology as human insulin resistance disease such as increased food intake, hyperlipidemia / fatty liver, obesity, hyperinsulinemia and the like. The main object is to provide a screening method using the model mouse.
本発明者は、ページェット病等の骨代謝疾患モデルとして、独自に、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作出を行った（非特許文献６参照）。その結果、意外にも、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスが、インスリン抵抗性を示すことを新規に見出した。 The present inventor independently created an A170 gene knockout mouse as a bone metabolic disease model such as Paget's disease (see Non-Patent Document 6). As a result, it was surprisingly found that the A170 gene knockout mouse exhibits insulin resistance.
そこで、本発明では、インスリン抵抗性疾患モデルとしてのＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスを提供する。 Therefore, the present invention provides an A170 gene knockout mouse as an insulin resistance disease model.
本発明は、Ａ１７０遺伝子とインスリン抵抗性疾患との間の具体的な相関関係を強く示唆するものであり、インスリン抵抗性疾患の発症機序を明らかにする上で、重要な知見を与える発明である。 The present invention strongly suggests a specific correlation between the A170 gene and an insulin resistant disease, and is an invention that gives important knowledge in clarifying the pathogenesis of an insulin resistant disease. is there.
即ち、本発明は、Ａ１７０遺伝子と相同性を示すヒトのｐ６２遺伝子が、骨代謝疾患だけではなく、ヒトのインスリン抵抗性疾患の発症因子としても、非常に重要な役割を果たしている可能性を強く示唆している点で、重要性が高い。 That is, the present invention strongly suggests that the human p62 gene showing homology to the A170 gene plays a very important role not only as a bone metabolic disease but also as a pathogenic factor of human insulin resistance disease. It is very important in terms of suggestion.
また、本発明に係るＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、インスリン抵抗性だけでなく、血中インスリン濃度の上昇、血中総コレステロール値・トリグリセリド値の上昇、体重増加（肥満）、食物摂取量の増加、脂肪肝等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示す点で、従来の糖尿病モデルマウス等よりも、有利性がある。 In addition, the A170 gene knockout mouse according to the present invention has not only insulin resistance but also increased blood insulin concentration, increased blood total cholesterol and triglyceride levels, increased body weight (obesity), increased food intake, fat It is more advantageous than conventional diabetes model mice and the like in that it exhibits the same pathology as human insulin resistant diseases such as liver.
即ち、従来のモデルマウスは、発現する病態（表現型）がヒトのインスリン抵抗性疾患とは必ずしも一致しなかったため、欠損させた遺伝子の機能解析等には適しているが、インスリン抵抗性疾患自体の病態解析、治療剤の開発等には、適用しにくい面があった。それに対し、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスはヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すため、該疾患関連遺伝子の機能解析だけでなく、インスリン抵抗性疾患自体の病態解析、発症機序の解明、治療剤の開発等に応用することができる。 That is, the conventional model mouse is suitable for functional analysis of the deleted gene because the pathological condition (phenotype) expressed does not necessarily match that of human insulin resistant disease, but the insulin resistant disease itself However, it has been difficult to apply to pathological analysis and development of therapeutic agents. On the other hand, since the A170 gene knockout mouse exhibits a pathological condition similar to that of human insulin-resistant disease, not only the functional analysis of the disease-related gene but also the pathological analysis of the insulin-resistant disease itself, elucidation of the onset mechanism, therapeutic agent It can be applied to the development of
なお、Ａ１７０遺伝子の塩基配列を配列番号１に、Ａ１７０のアミノ酸配列を配列番号２に示した。配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているｃＤＮＡの塩基配列で、翻訳される領域は、３４番目から１３６２番目までの領域である。 The base sequence of the A170 gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of A170 is shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the cDNA nucleotide sequence registered in NCBI GeneBank, and the region to be translated is the region from the 34th to the 1362th region.
次に、本発明では、前記発明に基づき、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを用いた、インスリン抵抗性疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。 Next, the present invention provides a screening method for an insulin resistance disease therapeutic agent using A170 gene knockout mice based on the above invention.
本発明に係るＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、インスリン抵抗性だけでなく、血中インスリン濃度の上昇、血中総コレステロール値・トリグリセリド値の上昇、体重増加、食物摂取量の増加、脂肪肝等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すため、該ノックアウトマウスに候補物質を投与することにより、これらの病態を改善する物質を探索することができる。 The A170 gene knockout mouse according to the present invention has not only insulin resistance but also increased blood insulin concentration, increased blood total cholesterol and triglyceride levels, increased body weight, increased food intake, fatty liver, etc. Since a disease state similar to that of an insulin resistant disease is exhibited, a substance that improves these disease states can be searched for by administering a candidate substance to the knockout mouse.
なお、本発明において、インスリン抵抗性疾患とは、インスリン抵抗性を示す疾患をいい、２型糖尿病をはじめ、高インスリン血症、高脂血症、脂肪肝、高血圧、動脈硬化症等、インスリン抵抗性と病態との間に関連性がある疾患を包含する。 In the present invention, the insulin resistance disease refers to a disease showing insulin resistance, including type 2 diabetes, hyperinsulinemia, hyperlipidemia, fatty liver, hypertension, arteriosclerosis, etc. Includes diseases that have a relationship between sex and pathology.
本発明に係るノックアウトマウスは、インスリン抵抗性疾患の疾患モデルとすることができる。 The knockout mouse according to the present invention can be used as a disease model of insulin resistance disease.
＜Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作製＞
Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作製は、通常用いられているジーンターゲティング法により行った。具体的な手順は、以下のとおりに行った。
<Preparation of A170 gene knockout mouse>
The A170 gene knockout mouse was produced by a commonly used gene targeting method. The specific procedure was performed as follows.
まず、ターゲッティングベクターに組み込むＤＮＡの調製を行った。ＢＡＣ／１２９ＳｖＪゲノムライブラリーより、Ａ１７０遺伝子（Ａ１７０遺伝子上流からＡ１７０遺伝子のエクソン８まで）を含むクローン数個をスクリーニングした。そして、スクリーニングにより得たクローンをもとにして、Ａ１７０遺伝子をコードするＤＮＡを調製した後、Ａ１７０遺伝子のエクソン１からエクソン４をコードする領域を、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）に置換して、目的のＤＮＡを作製した。 First, DNA to be incorporated into a targeting vector was prepared. Several clones containing A170 gene (from upstream of A170 gene to exon 8 of A170 gene) were screened from the BAC / 129SvJ genomic library. Then, after preparing DNA encoding A170 gene based on the clone obtained by screening, the region encoding exon 1 to exon 4 of A170 gene was replaced with neomycin resistance gene (Neo r ), The target DNA was prepared.
なお、図１は、ターゲッティングベクターに組み込むＤＮＡの構成を示したものであり、図１中、数字１〜８はＡ１７０遺伝子のエクソン１〜エクソン８を、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を示している。Ｎｅｏｒの両端には、解糖系の酵素ＰＧＫ（ポリグリセリン酸キナーゼ）のプロモータとポリＡ末端が取り付けられており、ネオマイシン耐性遺伝子が常時発現するようにしてある。 Incidentally, FIG. 1 is a view showing the structure of a DNA incorporated into the targeting vector, in FIG. 1, numeral 1-8 exon 1 exon 8 of A170 gene, Neo r represents the neomycin resistance gene. The ends of the neo r, promoter and poly A end is attached enzyme PGK glycolytic (poly acid kinase), the neomycin resistance gene are to be expressed at all times.
次に、ターゲッティングベクターの作製を行った。ターゲッティングベクターの作製には、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社製のベクターパック「ｐＧＴ−Ｎ２８」を用いた。添付プロトコルに従って、「ｐＧＴ−Ｎ２８」に、制限酵素的に目的のＤＮＡを組み込み、ターゲッティングベクターを作製した。 Next, a targeting vector was prepared. For the preparation of the targeting vector, a vector pack “pGT-N28” manufactured by New England Bio Labs was used. According to the attached protocol, the target DNA was incorporated into “pGT-N28” in a restriction enzyme manner to prepare a targeting vector.
次に、エレクトロポレーション法を用いて、マウスＥＳ細胞に、作製したターゲッティングベクターを導入した。マウスＥＳ細胞は、１２９Ｓｖ／Ｂ６由来のものを用いた。 Next, the prepared targeting vector was introduced into mouse ES cells using electroporation. Mouse ES cells derived from 129Sv / B6 were used.
作製したターゲッティングベクターにはネオマイシン耐性遺伝子が含まれているため、ネオマイシン添加条件下でマウスＥＳ細胞を培養することにより、相同的組換えの起こったマウスＥＳ細胞を選抜することができた。このマウスＥＳ細胞は、相同的組換えにより、Ａ１７０遺伝子のエクソン１からエクソン４をコードする領域が欠損している。 Since the prepared targeting vector contains a neomycin resistance gene, it was possible to select mouse ES cells in which homologous recombination occurred by culturing mouse ES cells under the conditions of neomycin addition. This mouse ES cell lacks the region encoding exon 1 to exon 4 of the A170 gene due to homologous recombination.
次に、相同的組換えの起こったＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採取したブラストシストに注入してキメラ胚を作製し、そのキメラ胚を、偽妊娠雌マウス（レシピエントマウス）の子宮に移植した。そして、偽妊娠雌マウスに出産させ、キメラマウスを得た。なお、キメラマウスの判定は毛色で行い、野鼠色の部分は注入したＥＳ細胞由来、黒色部分はＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採取したブラストシストの細胞由来であると判断した。 Next, ES cells in which homologous recombination has occurred are injected into blast cysts collected from C57BL / 6N mice to produce chimeric embryos, and the chimeric embryos are placed in the uterus of pseudopregnant female mice (recipient mice). Transplanted. Then, a pseudo-pregnant female mouse was born to obtain a chimeric mouse. The chimera mice were determined by their hair color, and the wild-colored portion was derived from the injected ES cells, and the black portion was determined to be derived from the blastcyst cells collected from the C57BL / 6N mice.
次に、該キメラマウスを交配し、Ｆ１マウスを作製し、さらにＦ１マウス同士を交配してＦ２マウスを作製し、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを完成させた。なお、作製したＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、メンデルの法則に従い、野生型（Ａ１７０＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０＋／−）、ホモ型（Ａ１７０−／−）が１：２：１の割合で生まれた。また、作製したノックアウトマウスの生殖性も維持されていた。 Next, the chimeric mice were mated to produce F1 mice, and F1 mice were further mated to produce F2 mice, thereby completing A170 gene knockout mice. The prepared A170 gene knockout mice were born at a ratio of 1: 2: 1 wild type (A170 + / +), heterozygous (A170 +/−), and homozygous (A170 − / −) according to Mendel's law. . In addition, the reproductivity of the prepared knockout mice was maintained.
＜作製したノックアウトマウスに対するグルコース付加試験、インスリン付加試験＞
グルコース負荷試験は、次の通り行った。実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスを１８時間絶食させた後、１ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内投与し、１５分、３０分、６０分、１２０分後に血糖値を測定した。結果を図２に示す。図２中、横軸（Ｔｉｍｅ）は時間（ｍｉｎ）を、縦軸（Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示している。
<Glucose addition test and insulin addition test for prepared knockout mice>
The glucose tolerance test was performed as follows. After wild-type (A170 gene + / +), heterozygous (A170 gene +/-), and homozygous (A170 gene-/-) mice prepared in Example 1 were fasted for 18 hours, 1 g / kg Glucose was intraperitoneally administered, and blood glucose levels were measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The results are shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis (Time) represents time (min), and the vertical axis (Blood Glucose) represents blood glucose level (mg / dl).
インスリン負荷試験は、次の通り行った。実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスに、０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内投与し、１５分、３０分、６０分、１２０分後に血糖値を測定した。結果を図３に示す。図３中、横軸（Ｔｉｍｅ）は時間（ｍｉｎ）を、縦軸（Ｇｌｕｃｏｓｅ）は測定時の血糖値を投与時の血糖値で割った値（％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｖａｌｕｅ）を示している。 The insulin tolerance test was performed as follows. Wild type (A170 gene + / +), heterozygous (A170 gene +/-), and homozygous (A170 gene-/-) mice prepared in Example 1 were intraperitoneally injected with 0.75 U / kg insulin. The blood glucose level was measured 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes after administration. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the horizontal axis (Time) indicates time (min), and the vertical axis (Glucose) indicates a value (% of initial value) obtained by dividing the blood glucose level at the time of measurement by the blood glucose level at the time of administration.
図２に示すとおり、グルコース負荷試験では、野生型・ヘテロ型のマウスとホモ型マウス（ノックアウトマウス）との間で、１５分後の測定値には有意差が見られたものの、その他の時間では、有意差が見られなかった。一方、図３のインスリン負荷試験では、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型・ヘテロ型のマウスと比較し、明らかに血糖値の低下が少なかった。 As shown in FIG. 2, in the glucose tolerance test, there was a significant difference in the measured value after 15 minutes between the wild-type / hetero-type mouse and the homozygous mouse (knockout mouse), but at other times There was no significant difference. On the other hand, in the insulin tolerance test of FIG. 3, the homozygous mice (knockout mice) clearly had a lower blood glucose level than the wild-type and heterozygous mice.
以上の結果は、本発明に係るノックアウトマウスのインスリン抵抗性が有意に上昇していることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、インスリン抵抗性疾患モデルとして有効である。 The above results indicate that the insulin resistance of the knockout mouse according to the present invention is significantly increased. Therefore, the knockout mouse according to the present invention is effective as an insulin resistance disease model.
＜作製したノックアウトマウスの血中インスリン濃度の測定＞
実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスについて、通常飼育時と２４時間絶食後の血中インスリン濃度を測定した。なお、図４中、「ｆｅｄ」は通常に餌を与えた個体を、「２４ｆａｓｔｅｄ」は２４時間絶食させた個体を示している。また、縦軸（Ｉｎｓｕｌｉｎ）は血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示している。
<Measurement of blood insulin concentration of the prepared knockout mouse>
About the wild-type (A170 gene + / +), heterozygous (A170 gene +/-), and homozygous (A170 gene-/-) mice prepared in Example 1, blood after normal breeding and 24-hour fasting Medium insulin concentration was measured. In FIG. 4, “fed” indicates an individual that is normally fed, and “24 fasted” indicates an individual that has been fasted for 24 hours. The vertical axis (Insulin) indicates the blood insulin concentration (ng / ml).
その結果、図４に示すとおり、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型・ヘテロ型のマウスと比較し、通常飼育時・２４時間絶食後ともに、明らかに血中インスリン濃度が上昇していた。 As a result, as shown in FIG. 4, homozygous mice (knockout mice) clearly had elevated blood insulin concentrations both during normal breeding and after 24 hours of fasting compared to wild-type and heterozygous mice. .
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、ヒトのインスリン抵抗性疾患の病態と同様に、高インスリン血症をも引き起こしていることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様に高インスリン血症をも引き起こしている点で、従来のインスリン抵抗性疾患モデルマウスよりも有利性がある。 This result shows that the knockout mouse according to the present invention causes hyperinsulinemia as well as the pathology of human insulin resistance disease. Therefore, the knockout mouse according to the present invention is more advantageous than the conventional insulin resistance disease model mouse in that it causes hyperinsulinemia as well as human insulin resistance disease.
＜作製したノックアウトマウスの血中総コレステロール及びトリグリセリドの測定＞
実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）の３５週齢マウスについて、通常飼育時と２４時間絶食後の血中総コレステロール及びトリグリセリドを測定した。血中総コレステロールの測定値を図５に、トリグリセリドの測定値を図６に示す。なお、図５、図６中の、「ｆｅｄ」は通常に餌を与えた個体を、「２４ｆａｓｔｅｄ」は２４時間絶食させた個体を示している。また、図５の縦軸（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）は血中総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）を、図６の縦軸（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）はトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）を示している。
<Measurement of total cholesterol and triglycerides in blood of prepared knockout mice>
Measurement of total cholesterol and triglycerides in blood of normal-type (A170 gene + / +) and homo-type (A170 gene-/-) 35-week-old mice prepared in Example 1 at normal breeding and after 24-hour fasting did. The measured value of blood total cholesterol is shown in FIG. 5, and the measured value of triglyceride is shown in FIG. In FIG. 5 and FIG. 6, “fed” indicates an individual that is normally fed and “24fasted” indicates an individual that has been fasted for 24 hours. In addition, the vertical axis (Total Chosterol) in FIG. 5 represents blood total cholesterol (mg / dl), and the vertical axis (Triglyceride) in FIG. 6 represents triglyceride (mg / dl).
その結果、図５、図６に示すとおり、通常飼育時では、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型マウスと比較し、有意に血中総コレステロール値・トリグリセリド値ともに上昇していた。但し、絶食時には、有意な差は見られなかった。 As a result, as shown in FIGS. 5 and 6, homozygous mice (knockout mice) were significantly elevated in blood total cholesterol level and triglyceride level in comparison with wild type mice during normal breeding. However, no significant difference was observed during fasting.
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、ヒトのインスリン抵抗性疾患の病態と同様に、高脂血症をも引き起こしていることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様に高脂血症をも引き起こす可能性がある点で、従来のインスリン抵抗性疾患モデルマウスよりも有利性がある。 This result indicates that the knockout mouse according to the present invention causes hyperlipidemia as well as the pathology of human insulin resistance disease. Therefore, the knockout mouse according to the present invention is more advantageous than the conventional insulin resistance disease model mouse in that it can cause hyperlipidemia as well as human insulin resistance disease.
＜作製したノックアウトマウスの体重増加と食物摂取量＞
実施例１で作製したノックアウトマウスを通常の飼育条件下で飼育し、体重及び食物摂取量を観察した。
<Weight gain and food intake of prepared knockout mice>
The knockout mouse produced in Example 1 was bred under normal breeding conditions, and body weight and food intake were observed.
図７は野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスの体重の経時的変化を示した表である。横軸（ａｇｅ）はマウスの週齢を、縦軸（Ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）は体重（ｇ）を示している。 FIG. 7 is a table showing changes over time in the body weight of wild type (A170 gene + / +), heterozygous (A170 gene +/−), and homozygous (A170 gene − / −) mice. The horizontal axis (age) represents the age of the mouse, and the vertical axis (Body weight) represents the body weight (g).
図７に示すとおり、野生型とヘテロ型のマウスは、ほとんど体重の差はなかったのに対し、ホモ型のノックアウトマウスは、野生型・ヘテロ型と比較して有意に体重増加が見られた。 As shown in FIG. 7, there was almost no difference in body weight between the wild type and heterozygous mice, whereas the homozygous knockout mice showed a significant increase in body weight compared to the wild type and heterozygous mice. .
図８の図面代用写真は、３５週齢の同腹の雄マウスである。上のマウス（３５ ｗｅｅｋｓ Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）は野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、下のマウス（３５ ｗｅｅｋｓ Ａ１７０ ＫＯ）はノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）である。 The drawing-substituting photograph of FIG. 8 is a 35-week-old littermate male mouse. The upper mouse (35 weeks Wild type) is a wild type (A170 gene + / +), and the lower mouse (35 weeks A170 KO) is a knockout mouse (A170 gene − / −).
図８に示すとおり、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、外見上、明らかに肥満化した。 As shown in FIG. 8, the A170 gene knockout mice apparently became obese.
図９は、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスの食物摂取量の経時的変化を示した表である。横軸（ａｇｅ）はマウスの週齢を、縦軸（Ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ）は食物摂取量（ｇ／ｄａｙ）を示している。 FIG. 9 is a table showing changes over time in food intake of wild type (A170 gene + / +), heterozygous (A170 gene +/−), and homozygous (A170 gene − / −) mice. The horizontal axis (age) represents the age of the mouse, and the vertical axis (Food intake) represents the food intake (g / day).
図９に示すとおり、野生型とヘテロ型のマウスは、ほとんど食物摂取量の増加は観察されなかったのに対し、ホモ型のノックアウトマウスは、野生型・ヘテロ型と比較して有意に食物摂取量の増加が見られた。 As shown in FIG. 9, wild type and heterozygous mice showed almost no increase in food intake, whereas homozygous knockout mice significantly increased food intake compared to wild type and heterozygous mice. There was an increase in quantity.
以上の結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、食物摂取量に関し、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すことを明らかにしている。従来の糖尿病疾患モデルマウス等は、肥満化・食物摂取量の増加等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を必ずしも示さなかった。それに対し、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示す点で、有利性がある。 The above results clarify that the knockout mouse according to the present invention shows a pathological condition similar to that of human insulin resistance disease regarding food intake. Conventional diabetic disease model mice and the like did not necessarily show the same pathology as human insulin resistance diseases such as obesity and increased food intake. On the other hand, the knockout mouse according to the present invention is advantageous in that it exhibits a pathological condition similar to that of human insulin resistance disease.
＜作製したノックアウトマウスと脂肪肝との相関＞
実施例１で作製したノックアウトマウスを通常の飼育条件下で飼育し、４２週齢（図１１の顕微鏡所見は４０週齢）となった時点で、解剖して肝臓を観察した。
<Correlation between prepared knockout mice and fatty liver>
The knockout mouse produced in Example 1 was bred under normal breeding conditions, and when it became 42 weeks old (microscopic findings in FIG. 11 are 40 weeks old), it was dissected and the liver was observed.
図１０の図面代用写真は、野生型マウス（Ａ１７０遺伝子＋／＋）及びノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）の肝臓肉眼所見である。図１０中、左側の写真（４２ ｗｅｅｋｓ ＷＴ ｆｅｍａｌｅ）は野生型マウスの肉眼所見、右側の写真（４２ ｗｅｅｋｓ Ａ１７０ＫＯ ｆｅｍａｌｅ）はノックアウトマウスの肉眼所見を示す。また、図１１は、野生型マウス（Ａ１７０遺伝子＋／＋）及びノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）の肝臓顕微鏡写真である。左側の写真（ＷＴ）は野生型マウスの顕微鏡写真、右側の写真（Ａ１７０ＫＯ）はノックアウトマウスの顕微鏡写真である。図１１の顕微鏡写真は、オイルレッド染色により脂肪を赤く染色した切片である。 The drawing-substituting photographs in FIG. 10 are macroscopic findings of livers of wild type mice (A170 gene + / +) and knockout mice (A170 gene − / −). In FIG. 10, the left photograph (42 weeks WT female) shows the macroscopic findings of wild-type mice, and the right photograph (42 weeks A170KO female) shows the gross findings of knockout mice. FIG. 11 shows liver micrographs of wild-type mice (A170 gene + / +) and knockout mice (A170 gene − / −). The photo on the left (WT) is a photomicrograph of a wild type mouse, and the photo on the right (A170KO) is a photomicrograph of a knockout mouse. The micrograph in FIG. 11 is a section in which fat is stained red by oil red staining.
図１０中、野生型マウスとノックアウトマウスを比較すると、ノックアウトマウスの肝臓は、明らかに黄赤色に変色しており、脂肪肝の所見である。また、図１１の顕微鏡写真でも、ノックアウトマウスでは赤色に染色された部分が多く観察され、脂肪肝であると判断できる。 In FIG. 10, when the wild-type mouse and the knockout mouse are compared, the liver of the knockout mouse is clearly discolored yellowish red, which is a finding of fatty liver. Also, in the micrograph of FIG. 11, in the knockout mouse, many red stained portions are observed and it can be determined that the liver is fatty liver.
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、脂肪肝を併発する点で、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すことを明らかにしている。従来の糖尿病疾患モデルマウス等は、脂肪肝の病態を必ずしも併発していなかった。それに対し、本発明に係るノックアウトマウスは、脂肪肝を併発しており、ヒトのインスリン抵抗性疾患と極めて類似した病態を示している点で、有利性がある。 This result clarifies that the knockout mouse according to the present invention exhibits a pathological condition similar to that of human insulin-resistant disease in that it causes fatty liver. Conventional diabetic disease model mice and the like did not always have fatty liver pathology. On the other hand, the knockout mouse according to the present invention is advantageous in that it is accompanied by fatty liver and exhibits a pathology very similar to human insulin resistance disease.
本発明に係るノックアウトマウスは、２型糖尿病等インスリン抵抗性疾患モデルとして、産業上有用である。本発明に係る方法は、創薬、機能性食品の開発等に貢献する可能性があるため、産業上有用である。 The knockout mouse according to the present invention is industrially useful as an insulin resistance disease model such as type 2 diabetes. The method according to the present invention is industrially useful because it may contribute to drug discovery, development of functional foods, and the like.
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