【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光試薬およびそれを用いた二本鎖核酸の検出方法に関する。更に詳細には、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬、並びに該蛍光試薬を用いた二本鎖核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNA塩基対間に平行挿入（インターカレート）する化合物は、インターカレーターと呼ばれている。このインターカレート部位を分子内に複数個有するポリインターカレーターは新しい薬剤の開発や優れたDNA蛍光染色剤の観点から研究がなされている（Wakelin,L.P.G., Med. Res. Rev., 1986, 6, 275-340; Glazer,A.N.et al., Nature, 1992, 359, 859-861）。しかしながら、通常、研究はビスインターカレーターに限られており、そのDNAに対する結合定数もそれほど向上されていない（Wakelin,L.P.G., Med. Res. Rev., 1986, 6, 275-340; Wirth,M.et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939）。これは、ビスインターカレーターの二つのインターカレート部位がDNAに立体的に無理がないようにインターカレートされるようにリンカー鎖を配置させるような分子設計が難しいためである。この困難さは、二つ以上のポリインターカレーターにおいてはもっと顕著である（Wirth,M.et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939）。
【０００３】
エチジウムホモダイマーやアクリジンホモダイマーなどは蛍光染色試薬としてのビスインターカレーターの成功例である（Markovis,J.et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264; Le Pecq,J.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 2915-2919）。DNAに効果的に結合するビス体以上のポリインターカレーターの例としては、アントラキノン部分と二つのアクリジン部位からなるトリスインターカレターなどが知られている（Takenaka,S.et al., Supramol. Chem., 1993, 2, 41-46; Lokey.R.S.,et al., J. Am. Chem. Sic., 1997, 119, 7202-7210）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかながら、これらのポリインターカレーターの場合にも、DNAに対する結合能は十分ではなく、また蛍光染色試薬としての蛍光強度も十分に満足のいくものではない。
通常、ポリインターカレーターは水溶液中では、分子内スタッキング構造を取っており、そのために蛍光が消光される。従って、ポリインターカレーターがDNA二重らせんにポリインターカレートすることにより、分子内消光から解消され蛍光の復帰が起こると期待される。特に、ポリイターカレーターがDNA二重らせんに結合すると蛍光増強を示すものであれば、更に効果的な蛍光増大を示す蛍光染色試薬が得られると期待される。しかしながら、通常、ポリインターカレーターにおける分子内スタッキングは、そのDNA二重らせんへの結合能の低下を引き起こす。従って、ポリインターカレーターの分子内設計が、効果的な蛍光増大を示す蛍光染色試薬を得るためには極めて重要である。
従って、本発明の目的は、蛍光試薬が二本鎖核酸と接触すると該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間に効果的にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度に検出できる、蛍光試薬を提供することにある。
更に本発明の他の目的は、上記蛍光試薬を用いた二本鎖DNAの検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記した目的を達成することのできる蛍光試薬を得ることを目的として鋭意研究した結果、リジンなどのα−アミノ酸残基からなるペプチドに適当な間隔で蛍光性インターカレート基を置換させたものが、上記目的を極めて有効に達成できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
従って、本発明は、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬に関する。
更に本発明の目的は、検体中の二本鎖核酸を検出する方法であって、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体に上記蛍光試薬を接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強により、検体中の二本鎖核酸を検出する方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光試薬は、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光試薬である。
本発明の蛍光試薬としては、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基が、蛍光試薬であるα−アミノ酸残基からなるペプチド分子において、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに存在するものが好ましい。即ち、蛍光性インターカレート基は、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに置換されているのが好ましい。この場合には、蛍光性インターカレート基が、二本鎖核酸の塩基対間に効果的にインターカレートして、蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が効果的に解消して蛍光強度が著しく増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で検出することができる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドは、全α−アミノ酸残基数が、4から40個、特に4から25個であるペプチドが好ましい。更には全α−アミノ酸残基数が4から16個、特には4から10個であるペプチドが好ましい。
【０００８】
本発明において、蛍光性インターカレート基としては、蛍光を発することができかつ二本鎖DNAもしくは二本鎖RNAの塩基対の間に平行して挿入し得るものであればいずれの基であってもよい。かかる蛍光性インターカレータ基としては、例えば、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基、置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基、置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基などが挙げられる。
【０００９】
ここで言う置換基としては、例えば、塩素、フッ素、臭素などのハロゲン原子；メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基; メトキシ、エトキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどの炭素原子数1から6のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；アセチルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなどの炭素原子数2から7のアシルオキシ基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアルキル基が1つもしくは2つ置換されていてもよい炭素原子数1から6のアミノアルキル基などが挙げられる。これらの置換基は、アクリジン骨格、エチジウム骨格、チアゾールオレンジ骨格またはオキサゾールイエロー骨格のいずれの位置に置換されていてもよく、また2つ以上の複数の置換基がこれらの骨格に置換されていてもよい。また、アクリジン骨格、エチジウム骨格、チアゾールオレンジ骨格またはオキサゾールイエロー骨格には、本発明の蛍光試薬であるペプチドを構成するα−アミノ酸残基に結合するための官能基を有していてもよく、このような官能基としては、例えば、-CO-、-NH-、-SO2-、-PO2-、-S-、-N(NH)NH-、これらの官能基が炭素原子数1から6のアルキレン基の末端もしくは側鎖に結合した基などが挙げられる。
【００１０】
上記した置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基、置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基、置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基の具体的な例として以下のものが挙げられる。
【００１１】
置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基
【化３】
置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基
【化４】
置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基
【化５】
置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基
【化６】
【００１２】
より具体的には、本発明の蛍光試薬は、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が好ましい。
【化７】
（式中、Xは蛍光性インターカレート基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光性インターカレート基であってもよく、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
【００１３】
式Ｉにおいて、Xは上記した蛍光性インターカレート基を表す。式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるインターカレート基であっても同じインターカレート基であってもよい。Yはα-アミノ酸を構成する2価の基（結合手を2つ持つ）を表し、Zはα−アミノ酸を構成する1価の基（結合手を1つ持つ）を表す。即ち、Yはα−アミノ酸から-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zは１価の基を表す。具体的には、Yは-A-W-で表わされる基であり、ここで、Aはメチレン、エチレン、プロピレン、メチルメチレンなどの炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す。ZはA-W-Hで表される基である。これらのYおよびZは、α−アミノ酸である、例えばアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどから-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成するそれぞれ2価の基あるいは1価の基を表す。式IにおけるそれぞれのYおよびZは、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい。式Ｉのペプチドにおいて、ｎは1から8の整数を表す。好ましくはnは1から5、特に好ましくは、nは1から3の整数である。
【００１４】
本発明の蛍光試薬であるペプチド並びに式Ｉのペプチドは、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩であってもよい。N末端が置換された誘導体としては、例えば、ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；メトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルなどの炭素原子数2から7のアルコキシカルボニル基等がN末端のアミノ基に置換された誘導体などが挙げられる。C末端が置換された誘導体としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアミノアルキル基；アミノ基等がC末端のカルボニル基に置換された誘導体などが挙げられる。本発明の蛍光試薬であるペプチドの塩並びに式Ｉのペプチドの塩あるいはそれらのペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体の塩としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸等との酸付加塩が挙げられる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドカルボキシル基並びに式Ｉのペプチドのカルボキシル基とのナトリウム塩、カリウム塩なども挙げられる。
【００１５】
本発明の式Ｉのペプチドの特に好ましい例としては、以下の式ＩＩで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が挙げられる。
【化８】
【００１６】
本発明の蛍光試薬であるペプチドの合成は、α−アミノ酸および蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸の両者のアミノ基保護誘導体もしくはカルボキシ保護誘導体を、合成しようとするペプチドに対応させて、順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。これらの合成法はそれ自体周知であり、周知の合成法を利用できる。あるいはα−アミノ酸の保護誘導体を反応させてペプチドを合成した後に、蛍光性インターカレート基を導入する反応を行って、本発明の蛍光試薬であるペプチドを合成することもできる。これらの合成に用いるアミノ基もしくはカルボキシ基の保護基としては、上記したペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体について例示した官能基が挙げられる。
【００１７】
本発明の式Iのペプチドは、下記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体と下記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体とを用いて、周知のペプチド合成反応を行うことによって合成することができる。
【００１８】
【化９】
ペプチド合成は、上記したと同様に、両者の保護誘導体を順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。上記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸および上記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体としては、上記した保護基で保護されたものが挙げられる。上記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸は、下記式Vで表されるα-アミノ酸と下記式VIで表される蛍光性インターカレーター誘導体(式VIにおいてDは、ハロゲン原子などの反応性基を表す)とを反応させることにより得ることができる。
【００１９】
【化１０】
式IVまたはVのα-アミノ酸としては、上記したアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどが挙げられる。
かくして式Iのペプチドを得ることができる。式IのペプチドのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩は、式Iのペプチドの合成の段階で得ることもでき、また式Iのペプチドを合成した後に、それ自体周知の方法で得ることもできる。
式Iで表されるペプチド以外の本発明の蛍光試薬であるペプチドも、式Iのペプチドと同様に合成することができる。
【００２０】
本発明の蛍光試薬は、二本鎖DNA、二本鎖RNAなどの二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で選択的に検出することができる。
本発明の蛍光試薬を用いて、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体中の二本鎖核酸を検出するには、該蛍光試薬を検体と接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強度を測定することにより検出できる。蛍光試薬と検体を接触させる際の具体的条件、蛍光強度の具体的方法等は、それ自体周知の方法を採用することができる。本発明の蛍光試薬は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイでのDNA検索に適用できる。即ち、サンプルDNAをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに固定されたプローブNDAに反応させて、二本鎖DNA形成させ、この二本鎖DNAを本発明の蛍光試薬で高感度でかつ選択的に検出することができる。従って、本発明の蛍光試薬によれば、従来必要とされたサンプルDNAごとにラベル化試薬でラベル化する必要がなくなり、ラベル化剤の導入による二本鎖DNA形成能の低下が引き起こされたり、遺伝子の変異や多型の診断に誤った結果を導くこともない。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
テトラキスアクリジニルペプチドの合成
以下に示す、メトキシ基と塩素原子が置換されたアクリジン骨格がインターカレータ基として置換されたリシン残基を含むテトラキスアクリジニルペプチド(TAP)を固相合成法により合成した。
【化１１】
【００２３】
1. Fmoc-Lys(Acr)-OH の合成
【化１２】
a)方法
50mlのビーカーにフェノール30gを入れ80℃まで加熱溶解させた。これに6-クロロ-2-メトキシ-9-フェノキシアクリジン4.54g(13.5mmol)を加え完全に溶解させた。その後、55〜65℃で、Fmoc-Lys-OH 4.42g(12.0mmol)を加えて2時間攪拌した。それからしばらく放冷し、300mlのエーテルを攪拌しながら注いだ。得られた沈殿物を吸引濾過し、減圧乾燥させた。
【００２４】
b)結果
性状：黄色固体
収量：7.57g(収率：92%)
1H-NMR、MALDI TOF MASS（質量分析）により同定した結果、目的化合物の分子量610.11に相当するピークが610.80に検出された。
【００２５】
2.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)- 樹脂の合成（ TAP の伸長反応）
a)方法
リアクションベッセルにFmoc-NH SAL 樹脂 200mgを入れ、カートリッジ1、4、7、10にFmoc-Lys(Acr)-OH 0.33gを入れ、カートリッジ2、3、5、6、8、9にFmoc-Lys(Boc)-OHを入れた。後は、PE Applied Biosystems社の431Aペプチドシンセサイザーにて合成を行った。Fmoc法でN末端はアセチル化した。
b)結果
性状：黄色固体
収量：0.5003g
【００２６】
3.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)-(Lys(Boc)) 2 -Lys(Acr)- 樹脂のレジンからの切り出し及び側鎖の脱保護
a)方法
50mlのナス型フラスコに上記の2の実験操作で合成したレジン0.50gを入れ、これにm-クレゾール0.10ml、チオアニソール0.60ml、トリフルオロ酢酸4.3mlを加えて室温で1時間攪拌した。その後、TFAを減圧留去し、氷浴下でエーテル20mlを加えた。超音波照射後、しばらく放置し上澄み液を取り除いた。それから酢酸エチル20mlを加えて超音波照射後、しばらく放置した。吸引ろ過しエーテルで洗浄した。その後、減圧乾燥させた。
b)結果
性状：黄色固体であり、極めて高い水溶性を示した。
収量：0.3181g
【００２７】
4.HPLC による純度チェック及び精製
TAPの純度チェックを以下の条件下で行った。
検出波長：210nmカラム：Inertsil ODS
試料注入溶媒：超純水 流速：1ml/min
溶離液A:0.1%TFA水溶液
溶離液B:70%アセトニトリル/0.1%TFA溶液
グラジエント条件
【表１】
TAPのHPLCチャートを図１に示した。同定はTOF MASSにより行った。得られたTOF MASSのデータを図２に示した。TOF MASSの結果、目的化合物の分子量2307.51に相当するピークが2309.03に検出された。
【００２８】
参考例１
モノマー体の合成
下記反応スキームで表される方法に従って、モノマー体であるAc-Lys(Acr)-OCH3 を合成した。
【化１３】
a)方法
20mlのビーカー中で、フェノール5.03gを80℃まで加熱し、これにフェノキシアクリジン0.7567g(2.25mmol)を加え完全に溶解させた。これを60℃まで冷却し、これに少量ずつAc-Lys-OH 0.3766g(2.00mmol)を40分かけて完全に溶解させた。それから1時間55〜60℃で攪拌した。しばらく放冷した後、エーテル50mlを攪拌しながら注いだ。得られた黄色沈殿物を吸引ろ過し、減圧乾燥させた。その粗生成物0.8757gを200mlのナス型フラスコに入れ、これに無水メタノール100mlを加えた。この懸濁溶液を攪拌しながら、乾燥塩化水素ガスを吹き込んだ。溶液が透明になった時点で、氷浴中で冷却し、さらに飽和するまで塩化水素ガスを吹き込んだ。その後、室温で4時間攪拌した。それから、溶媒をエバポレーターで減圧留去し、真空ポンプで減圧乾燥させた。その後、無水メタノール-無水エーテルで、再結晶した。得られた黄色沈殿物は、吸引ろ過し減圧乾燥させた。
【００２９】
b)結果
性状：黄色沈殿物
収量：0.6329g（収量：74%）
【００３０】
実施例２
テトラキスアクリジニルペプチドの物性測定
a) 実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドの吸収スペクトルは、参考例１で合成されたそのモノマー体よりも16％の淡色効果を示し、蛍光がほとんど見られないことから分子内のアクリジン同士がスタッキングしているものと考えられた。また、テトラキスアクリジニルペプチドとモノマー体の円二色性（CD）スペクトルを以下の条件で測定した。
テトラキスアクリジニルペプチド＝モノマー体＝ 6.5μM
緩衝液：10mM MES、1mM EDTA(pH6.25)、0.2M NaCl、25℃
得られたCDスペクトルを図３に示した。モノマー体のCDスペクトルは何もシグナルを示さなかったのに対し、テトラキスアクリジニルペプチドは、260nmと290 nmにそれぞれに負と正の大きなコットン効果を示した。この領域は、9−アミノアクリジンの長軸方向の電子遷移に対応することを考えれば、テトラキスアクリジニルペプチドに存在する4つのアクリジン基同士がスタッキングすることによりらせん状構造を有しているものと考えられた。このときのらせん構造を図４に模式的に示した。
【００３１】
b) テトラキスアクリジニルペプチドに各種量の[poly(dA-dT)]2を添加して、吸収スペクトルを測定した。測定条件は以下の通りであった。
テトラキスアクリジニルペプチド＝0.7μM
モノマー体＝ 0〜3.68μM
緩衝液：10mM MES、1mM EDTA(pH6.25)、0.2M NaCl、25℃
得られた吸収スペクトルを図５に示した。図５から分かるように、[poly(dA-dT)]2添加に伴って大きな淡色効果と若干のレッドシフトが見られた。この変化は等吸収点をもって変化したので、単一様式によりテトラキスアクリジニルペプチドは、DNA二重らせんに結合していると考えられた。
【００３２】
c) そこで、この変化を利用してScatchard解析を行なって結合定数（K）と座位数（n）を算出した。仔牛胸腺DNAに対して0.2M NaCl 存在下においてさえK=2.0×108 M-1 (n=5)とモノマー体に比べ1000倍の結合能を有していた。また、 [poly(dG-dC)]2に対してもテトラキスアクリジニルペプチドの結合定数を算出すると[poly(dA-dT)]2と同程度の極めて強い結合能を有していた。各配列に対するテトラキスアクリジニルペプチドの結合能の違いは見られなかった。テトラキスアクリジニルペプチドの結合定数は、従来のDNA高感度検出試薬であるエチジウムホモダイマー（EthD）（Markovis,J.et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264）やアクリジンホモダイマー（AcrD）（Le Pecq,J-B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1975,72,2915-2919）よりもそれぞれ10倍、20倍強いものであった。プラスミドDNA溶液の粘度に与えるテトラキスアクリジニルペプチドの添加効果から既知の手法に従ってテトラキスアクリジニルペプチドの結合によるDNA二重らせんの巻き戻し角を算出した。その結果、64゜とモノマー体の4倍の値となった。これらのことはテトラキスアクリジニルペプチドが効果的にテトラインターカレートしていることを示している。
このようなテトラキスアクリジニルペプチドの効率の良いDNA二重らせんへのテトラインターカレートは、溶液中で見られたテトラキスアクリジニルペプチドのらせん構造が、DNA二重らせんにうまくフィットしていることと、テトラキスアクリジニルペプチドの2つのアクリジン基間に存在する2つのリジン側鎖が、DNA溝の両側に存在するリン酸とうまく相互作用しているためと予想された。
【００３３】
d) テトラキスアクリジニルペプチド（1）の溶液に、[poly(dA-dT)]2（二本鎖DNA）またはpolydT（一本鎖DNA）を加えたときの蛍光変化を調べた。対照としてアクリジンホモダイマー（AcrD）についても調べた。測定条件は以下の通りであった。
テトラキスアクリジニルペプチド＝1.6μM、
AcrD＝1.6μM
緩衝液：10mM MES, 1mM EDTA(pH6.25), 0.2M NaCl, 25℃
得られた結果を図６に示す。図６から分かるように、二本鎖DNA（poly[d(A-T)]2）添加に伴って最終的には蛍光強度が1600倍と従来にない蛍光増強が見られた。このような極めて大きな蛍光増加はこれまでに例を見ない。同条件下、AcrDは、数十倍の蛍光増加であった。また、一本鎖DNA（polydT）を加えた場合は、ほとんど蛍光変化は見られなかった。この結果からもテトラキスアクリジニルペプチドが二本鎖DNAを選択的に検出する蛍光試薬として有用であることが示された。
【００３４】
【発明の効果】
以上に説明した通り、本発明の蛍光試薬は、二本鎖DNA、二本鎖RNAなどの二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で選択的に検出することができる。
本発明の蛍光試薬は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイでのDNA検索に適用できる。即ち、サンプルDNAをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに固定されたプローブNDAに反応させて、二本鎖DNA形成させ、この二本鎖DNAを本発明の蛍光試薬で高感度でかつ選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドのHPLCチャートを示す。
【図２】図２は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドのTOF MASS のデータを示す。
【図３】図３は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドと参考例１で合成したモノマー体の円二色性（CD）スペクトルを示す。
【図４】図４は、本発明の蛍光試薬の代表例であるテトラキスアクリジニルペプチドに存在する4つの蛍光性インターカレート基であるアクリジン基同士がスタッキングすることによりらせん状構造を有しており、更にこれが二本鎖DNAと反応すると、アクリジン基がインターカレートする様子を示す模式図である。
【図５】図５は、テトラキスアクリジニルペプチドに各種量の[poly(dA-dT)]2を添加して測定した吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、テトラキスアクリジニルペプチド（1）の溶液に[poly(dA-dT)]2またはpolydT、あるいは対照としのアクリジンホモダイマー（AcrD）を添加したときの蛍光強度の変化を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescent reagent and a method for detecting a double-stranded nucleic acid using the same. More specifically, it is a fluorescent reagent for a peptide comprising an α-amino acid residue containing two or more α-amino acid residues substituted with a fluorescent intercalating group, which is brought into contact with a double-stranded nucleic acid. Fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule intercalate between the base pairs of the double-stranded nucleic acid, quenching due to stacking of fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule is eliminated, and fluorescence intensity The present invention relates to a fluorescent reagent for detecting a double-stranded nucleic acid containing a fluorescent intercalating group, which can detect a double-stranded nucleic acid, and a method for detecting a double-stranded nucleic acid using the fluorescent reagent .
[0002]
[Prior art]
Compounds that intercalate (intercalate) between DNA base pairs are called intercalators. Polyintercalators with multiple intercalating sites in the molecule have been studied from the viewpoint of the development of new drugs and excellent DNA fluorescent stains (Wakelin, LPG, Med. Res. Rev., 1986, 6 , 275-340; Glazer, ANet al., Nature, 1992, 359, 859-861). However, studies are usually limited to bisintercalators and their binding constants for DNA have not been significantly improved (Wakelin, LPG, Med. Res. Rev., 1986, 6, 275-340; Wirth, M. et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939). This is because it is difficult to design a molecule in which the linker chain is arranged so that the two intercalating sites of the bisintercalator are intercalated so that the DNA is not sterically unreasonable. This difficulty is more pronounced in two or more polyintercalators (Wirth, M. et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939).
[0003]
Ethidium homodimers and acridine homodimers are examples of successful bisintercalators as fluorescent staining reagents (Markovis, J. et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264; Le Pecq, J. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 2915-2919). Tris intercalator consisting of an anthraquinone moiety and two acridine sites is known as an example of a polyintercalator of bis-form or more that binds effectively to DNA (Takenaka, S. et al., Supramol. Chem). , 1993, 2, 41-46; Lokey. RS, et al., J. Am. Chem. Sic., 1997, 119, 7202-7210).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, even in the case of these polyintercalators, the ability to bind to DNA is not sufficient, and the fluorescence intensity as a fluorescent staining reagent is not sufficiently satisfactory.
Usually, a polyintercalator has an intramolecular stacking structure in an aqueous solution, so that the fluorescence is quenched. Therefore, it is expected that when the polyintercalator polyintercalates into the DNA double helix, it is eliminated from the intramolecular quenching and the fluorescence is restored. In particular, if a polyitacalator exhibits fluorescence enhancement when bound to a DNA double helix, a fluorescent staining reagent exhibiting more effective fluorescence enhancement is expected. However, usually, intramolecular stacking in a polyintercalator causes a decrease in its ability to bind to a DNA double helix. Therefore, the intramolecular design of the polyintercalator is extremely important for obtaining a fluorescent staining reagent exhibiting effective fluorescence enhancement.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method in which when a fluorescent reagent comes into contact with a double-stranded nucleic acid, a fluorescent intercalating group in the fluorescent reagent molecule is effectively intercalated between base pairs of the double-stranded nucleic acid, An object of the present invention is to provide a fluorescent reagent that eliminates quenching due to stacking of fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule and enhances the fluorescence intensity, thereby detecting double-stranded nucleic acid with high sensitivity.
Still another object of the present invention is to provide a method for detecting double-stranded DNA using the fluorescent reagent.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research for the purpose of obtaining a fluorescent reagent capable of achieving the above-mentioned object, the present inventors have found that a fluorescent intercalating group is attached to a peptide comprising an α-amino acid residue such as lysine at an appropriate interval. The inventors have found that the above-described object can be achieved very effectively by the substitution, and have completed the present invention.
[0006]
Therefore, the present invention provides a fluorescent reagent for a peptide comprising an α-amino acid residue containing two or more α-amino acid residues substituted with a fluorescent intercalating group, which is brought into contact with a double-stranded nucleic acid. The fluorescent intercalating group in the fluorescent reagent molecule intercalates between the base pairs of the double-stranded nucleic acid, and quenching due to stacking of the fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule is eliminated, resulting in fluorescence. The present invention relates to a fluorescent reagent for detecting a double-stranded nucleic acid containing a fluorescent intercalating group, which can increase the intensity and thereby detect a double-stranded nucleic acid.
A further object of the present invention is a method for detecting a double-stranded nucleic acid in a specimen, wherein the fluorescent reagent is brought into contact with a specimen suspected of containing the double-stranded nucleic acid, and the fluorescence intensity of the fluorescent reagent is increased. Relates to a method for detecting a double-stranded nucleic acid in a sample.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The fluorescent reagent of the present invention is a peptide fluorescent reagent comprising an α-amino acid residue containing two or more α-amino acid residues substituted with a fluorescent intercalating group, and is in contact with a double-stranded nucleic acid. As a result, the fluorescent intercalating group in the fluorescent reagent molecule intercalates between the base pairs of the double-stranded nucleic acid, and quenching due to stacking of the fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule is eliminated. It is a fluorescent reagent that enhances fluorescence intensity and thereby can detect double-stranded nucleic acids.
The fluorescent reagent of the present invention includes 2 to 10 α-amino acid residues substituted with a fluorescent intercalating group in peptide molecules consisting of α-amino acid residues that are fluorescent reagents, and further 2 to 5 Those which exist every two, especially every two α-amino acid residues are preferred. That is, the fluorescent intercalating group is preferably substituted every 2 to 10, more preferably 2 to 5, especially 2 α-amino acid residues. In this case, the fluorescent intercalating group effectively intercalates between the base pairs of the double-stranded nucleic acid, and quenching by stacking the fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule is effective. Thus, the fluorescence intensity is remarkably enhanced, so that double-stranded nucleic acid can be detected with high sensitivity. In addition, the peptide which is the fluorescent reagent of the present invention is preferably a peptide having a total α-amino acid residue number of 4 to 40, particularly 4 to 25. Furthermore, peptides having a total number of α-amino acid residues of 4 to 16, particularly 4 to 10 are preferred.
[0008]
In the present invention, the fluorescent intercalating group is any group as long as it can emit fluorescence and can be inserted in parallel between base pairs of double-stranded DNA or double-stranded RNA. May be. Examples of such a fluorescent intercalator group include a group having an acridine skeleton which may have a substituent, a group having an ethidium skeleton which may have a substituent, and a substituent. Examples thereof include a group having a thiazole orange skeleton and a group having an oxazole yellow skeleton which may have a substituent.
[0009]
Examples of the substituent herein include halogen atoms such as chlorine, fluorine and bromine; and carbon atoms which may be substituted with halogen atoms such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and trifluoromethyl. Alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms; alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, butoxy, pentoxy, hexoxy; acyl groups having 1 to 7 carbon atoms such as formyl, acetyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl; acetyloxy Acyloxy groups having 2 to 7 carbon atoms such as butanoyloxy, pentanoyloxy, hexanoyloxy; aminomethyl, aminoethyl, aminopropyl, methylaminomethyl, dimethylamimethyl, dimethylaminopropyl, dimethylaminobutyl, etc. Alkyl group having 1 to 6 carbon atoms Such as one or two optionally substituted from a good carbon atoms 1 6 aminoalkyl group can be mentioned. These substituents may be substituted at any position of the acridine skeleton, ethidium skeleton, thiazole orange skeleton or oxazole yellow skeleton, and two or more plural substituents may be substituted on these skeletons. Good. The acridine skeleton, ethidium skeleton, thiazole orange skeleton or oxazole yellow skeleton may have a functional group for binding to the α-amino acid residue constituting the peptide which is the fluorescent reagent of the present invention. Examples of such functional groups include -CO-, -NH-, -SO 2- , -PO 2- , -S-, -N (NH) NH-, and these functional groups have 1 to 6 carbon atoms. And a group bonded to the terminal or side chain of the alkylene group.
[0010]
A group having an acridine skeleton optionally having substituents, a group having an ethidium skeleton optionally having substituents, a group having a thiazole orange skeleton optionally having substituents, a substituent Specific examples of the group having an oxazole yellow skeleton that may have the following include the following.
[0011]
A group having an acridine skeleton which may have a substituent
A group having an ethidium skeleton which may have a substituent
A group having a thiazole orange skeleton which may have a substituent
A group having an oxazole yellow skeleton which may have a substituent
[0012]
More specifically, the fluorescent reagent of the present invention is preferably a peptide represented by the following formula I, a derivative thereof substituted at its N-terminal or C-terminal, or a salt thereof.
[Chemical 7]
(Wherein X represents a fluorescent intercalating group, Y represents a divalent group constituting an α-amino acid, Z represents a monovalent group constituting an α-amino acid, and n represents 1 to 8) Provided that each X in formula I may be different or the same fluorescent intercalating group, and each Y and Z in formula I may be the same even if they are different from each other. May be).
[0013]
In formula I, X represents a fluorescent intercalating group as described above. Each X in formula I may be a different intercalating group or the same intercalating group. Y represents a divalent group (having two bonds) constituting an α-amino acid, and Z represents a monovalent group (having one bond) constituting an α-amino acid. That is, Y represents a divalent group constituting the remaining α-amino acid obtained by removing —CH (NH 2 ) COOH from an α-amino acid, and Z represents a monovalent group. Specifically, Y is a group represented by -AW-, wherein A represents a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms such as methylene, ethylene, propylene, methylmethylene, and the like. Single bond, NH, CO, CONH, NHCO, O, S or HNC (NH) NH. Z is a group represented by AWH. These Y and Z are α-amino acids, for example, alanine, lysine, norlysine, aspartic acid, glutamine, serine, cysteine, etc., constituting the remaining α-amino acids after removing -CH (NH 2 ) COOH. Represents a divalent group or a monovalent group. Each Y and Z in Formula I may be different from each other or the same. In the peptide of formula I, n represents an integer from 1 to 8. Preferably n is an integer from 1 to 5, particularly preferably n is an integer from 1 to 3.
[0014]
The peptide which is a fluorescent reagent of the present invention as well as the peptide of formula I may be a derivative thereof substituted at its N-terminus or C-terminus, or a salt thereof. Examples of derivatives substituted at the N-terminus include acyl groups having 1 to 7 carbon atoms such as formyl, acetyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl; methoxycarbonyl, butoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, hexyloxy Examples thereof include derivatives in which an alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms such as carbonyl is substituted with an N-terminal amino group. Derivatives substituted at the C-terminus include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with halogen atoms such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, trifluoromethyl; aminomethyl, amino Aminoalkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, such as ethyl, aminopropyl, methylaminomethyl, dimethylaminomethyl, dimethylaminopropyl, dimethylaminobutyl; derivatives in which the amino group or the like is substituted with a C-terminal carbonyl group It is done. Examples of the salt of the peptide which is the fluorescent reagent of the present invention and the salt of the peptide of the formula I or the derivative substituted at the N-terminus or C-terminus of these peptides include acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, malic acid, etc. Organic acids; acid addition salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and phosphoric acid. Moreover, the sodium salt, potassium salt, etc. with the peptide carboxyl group which is the fluorescent reagent of this invention, and the carboxyl group of the peptide of Formula I are also mentioned.
[0015]
Particularly preferred examples of the peptide of formula I of the present invention include the peptide represented by the following formula II, a derivative thereof substituted at the N-terminus or C-terminus thereof, or a salt thereof.
[Chemical 8]
[0016]
In the synthesis of the peptide which is the fluorescent reagent of the present invention, the amino group-protected derivative or the carboxy-protected derivative of both the α-amino acid and the α-amino acid substituted with the fluorescent intercalating group are made to correspond to the peptide to be synthesized. Thus, they can be sequentially linked by peptide bonds, synthesized by a well-known solid phase method or liquid phase method, and synthesized by a peptide synthesizer. These synthesis methods are known per se, and known synthesis methods can be used. Alternatively, a peptide that is a fluorescent reagent of the present invention can be synthesized by reacting a protected derivative of an α-amino acid and then synthesizing a peptide, followed by a reaction for introducing a fluorescent intercalating group. Examples of the protecting group for the amino group or carboxy group used in these syntheses include the functional groups exemplified for the derivatives in which the N-terminus or C-terminus of the peptide is substituted.
[0017]
The peptide of formula I of the present invention uses an amino group or carbonyl group protected derivative of a fluorescent intercalate group-substituted α-amino acid of formula III below and an amino group or carbonyl group protected derivative of an α-amino acid of formula IV below. The peptide can be synthesized by performing a well-known peptide synthesis reaction.
[0018]
[Chemical 9]
In the same manner as described above, peptide synthesis can be performed by sequentially linking both protected derivatives by peptide bonds, or by a well-known solid phase method or liquid phase method, and by a peptide synthesizer. You can also. Examples of the fluorescent intercalate group-substituted α-amino acid of the above formula III and the amino group or carbonyl group-protected derivative of the α-amino acid of the above formula IV include those protected with the above-described protecting group. The fluorescent intercalating group-substituted α-amino acid of the above formula III is an α-amino acid represented by the following formula V and a fluorescent intercalator derivative represented by the following formula VI (in formula VI, D represents a halogen atom, etc. Which represents a reactive group).
[0019]
[Chemical Formula 10]
Examples of the α-amino acid of formula IV or V include alanine, lysine, norlysine, aspartic acid, glutamine, serine, cysteine and the like described above.
A peptide of formula I can thus be obtained. A derivative thereof or a salt thereof in which the N-terminus or C-terminus of the peptide of formula I is substituted can also be obtained in the step of synthesizing the peptide of formula I, and is well known per se after the synthesis of the peptide of formula I. It can also be obtained by the method.
Peptides that are fluorescent reagents of the present invention other than the peptide represented by formula I can be synthesized in the same manner as the peptide of formula I.
[0020]
When the fluorescent reagent of the present invention is brought into contact with a double-stranded nucleic acid such as double-stranded DNA or double-stranded RNA, the fluorescent intercalating group in the fluorescent reagent molecule is intercalated between the base pairs of the double-stranded nucleic acid. The fluorescence intensity is enhanced by eliminating the quenching due to the stacking of the fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule, and thereby the double-stranded nucleic acid can be selectively detected with high sensitivity. .
In order to detect double-stranded nucleic acid in a specimen suspected of containing double-stranded nucleic acid using the fluorescent reagent of the present invention, the fluorescent reagent is brought into contact with the specimen to increase the fluorescence intensity of the fluorescent reagent. It can be detected by measuring the degree. As specific conditions for bringing the fluorescent reagent into contact with the specimen, specific methods of fluorescence intensity, etc., methods known per se can be employed. The fluorescent reagent of the present invention can be applied to DNA search using a DNA chip or a DNA microarray. That is, sample DNA is reacted with a probe NDA immobilized on a DNA chip or DNA microarray to form double-stranded DNA, and this double-stranded DNA is selectively detected with high sensitivity by the fluorescent reagent of the present invention. Can do. Therefore, according to the fluorescent reagent of the present invention, there is no need to label with a labeling reagent for each sample DNA conventionally required, causing a decrease in the ability to form double-stranded DNA by introducing a labeling agent, It does not lead to false results in the diagnosis of gene mutations or polymorphisms.
[0021]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0022]
Example 1
Synthesis of tetrakisacridinyl peptide Tetrakisacridinyl peptide (TAP) containing a lysine residue substituted with an acridine skeleton substituted with a methoxy group and a chlorine atom as an intercalator group is shown in solid phase. It was synthesized by a synthesis method.
Embedded image
[0023]
1. Synthesis of Fmoc-Lys (Acr) -OH
a) Method
30 g of phenol was placed in a 50 ml beaker and dissolved by heating to 80 ° C. To this, 4.54 g (13.5 mmol) of 6-chloro-2-methoxy-9-phenoxyacridine was added and completely dissolved. Thereafter, at 55 to 65 ° C., 4.42 g (12.0 mmol) of Fmoc-Lys-OH was added and stirred for 2 hours. Then it was allowed to cool for a while and 300 ml of ether was poured with stirring. The resulting precipitate was filtered with suction and dried under reduced pressure.
[0024]
b) Result properties: Yellow solid Yield: 7.57 g (Yield: 92%)
As a result of identification by 1 H-NMR and MALDI TOF MASS (mass spectrometry), a peak corresponding to the molecular weight 610.11 of the target compound was detected at 610.80.
[0025]
2. Ac-Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - resin Synthesis ( TAP elongation reaction)
a) Method Put 200 mg of Fmoc-NH SAL resin in the reaction vessel, put 0.33 g of Fmoc-Lys (Acr) -OH in cartridges 1, 4, 7, 10 and put them in cartridges 2, 3, 5, 6, 8, 9. Fmoc-Lys (Boc) -OH was added. Thereafter, synthesis was performed using a 431A peptide synthesizer manufactured by PE Applied Biosystems. N-terminal was acetylated by Fmoc method.
b) Result properties: yellow solid Yield: 0.5003g
[0026]
3. Ac-Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - resin Resin excision and side chain deprotection
a) Method
To a 50 ml eggplant-shaped flask, 0.50 g of the resin synthesized in the above-described experimental operation 2 was added, and m-cresol 0.10 ml, thioanisole 0.60 ml, and trifluoroacetic acid 4.3 ml were added and stirred at room temperature for 1 hour. Thereafter, TFA was distilled off under reduced pressure, and 20 ml of ether was added in an ice bath. After the ultrasonic irradiation, the supernatant was removed by leaving for a while. Then, 20 ml of ethyl acetate was added and left for a while after ultrasonic irradiation. Suction filtered and washed with ether. Then, it was made to dry under reduced pressure.
b) Result properties: yellow solid, very high water solubility.
Yield: 0.3181g
[0027]
4. Purity check and purification by HPLC
The purity check of TAP was performed under the following conditions.
Detection wavelength: 210nm Column: Inertsil ODS
Sample injection solvent: Ultrapure water Flow rate: 1 ml / min
Eluent A: 0.1% TFA aqueous solution Eluent B: 70% acetonitrile / 0.1% TFA solution gradient conditions [Table 1]
The HPLC chart of TAP is shown in FIG. Identification was performed by TOF MASS. The obtained TOF MASS data is shown in FIG. As a result of TOF MASS, a peak corresponding to the molecular weight of 2307.51 of the target compound was detected at 2309.03.
[0028]
Reference example 1
Synthesis of monomer body According to the method represented by the following reaction scheme, Ac-Lys (Acr) -OCH 3 as a monomer body was synthesized.
Embedded image
a) Method
In a 20 ml beaker, 5.03 g of phenol was heated to 80 ° C., and 0.7567 g (2.25 mmol) of phenoxyacridine was added and completely dissolved. This was cooled to 60 ° C., and 0.3766 g (2.00 mmol) of Ac-Lys-OH was completely dissolved therein over 40 minutes. Then it was stirred at 55-60 ° C. for 1 hour. After cooling for a while, 50 ml of ether was poured with stirring. The resulting yellow precipitate was suction filtered and dried under reduced pressure. 0.8757 g of the crude product was placed in a 200 ml eggplant type flask, and 100 ml of anhydrous methanol was added thereto. Dry hydrogen chloride gas was blown into the suspension while stirring. When the solution became clear, it was cooled in an ice bath and blown with hydrogen chloride gas until further saturated. Then, it stirred at room temperature for 4 hours. Then, the solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator and dried under reduced pressure with a vacuum pump. Thereafter, recrystallization was performed with anhydrous methanol-anhydrous ether. The resulting yellow precipitate was suction filtered and dried under reduced pressure.
[0029]
b) Result properties: Yellow precipitate Yield: 0.6329 g (Yield: 74%)
[0030]
Example 2
Measurement of physical properties of tetrakisacridinyl peptide
a) The absorption spectrum of the tetrakisacridinyl peptide synthesized in Example 1 is 16% lighter than that of the monomer synthesized in Reference Example 1, and almost no fluorescence is observed. It was thought that they were stacking each other. Moreover, the circular dichroism (CD) spectrum of the tetrakisacridinyl peptide and the monomeric body was measured under the following conditions.
Tetrakisacridinyl peptide = monomer body = 6.5 μM
Buffer: 10 mM MES, 1 mM EDTA (pH 6.25), 0.2 M NaCl, 25 ° C
The obtained CD spectrum is shown in FIG. The CD spectrum of the monomeric body showed no signal, whereas the tetrakisacridinyl peptide showed a large negative and positive cotton effect at 260 nm and 290 nm, respectively. This region has a helical structure by stacking four acridine groups present in the tetrakisacridinyl peptide, considering that it corresponds to the electronic transition in the long axis direction of 9-aminoacridine It was considered. The spiral structure at this time is schematically shown in FIG.
[0031]
b) Various amounts of [poly (dA-dT)] 2 were added to the tetrakisacridinyl peptide, and the absorption spectrum was measured. The measurement conditions were as follows.
Tetrakisacridinyl peptide = 0.7μM
Monomer body = 0-3.68 μM
Buffer: 10 mM MES, 1 mM EDTA (pH 6.25), 0.2 M NaCl, 25 ° C
The obtained absorption spectrum is shown in FIG. As can be seen from FIG. 5, a large light color effect and a slight red shift were observed with the addition of [poly (dA-dT)] 2 . Since this change changed with the isosbestic point, it was considered that the tetrakisacridinyl peptide was bound to the DNA double helix in a single manner.
[0032]
c) Therefore, Scatchard analysis was performed using this change to calculate the coupling constant (K) and the number of loci (n). Even in the presence of 0.2 M NaCl, calf thymus DNA had a binding capacity of K = 2.0 × 10 8 M −1 (n = 5), 1000 times that of the monomeric body. In addition, when the binding constant of tetrakisacridinyl peptide was calculated for [poly (dG-dC)] 2 , it had extremely strong binding ability comparable to [poly (dA-dT)] 2 . There was no difference in the binding ability of the tetrakisacridinyl peptide to each sequence. The binding constant of tetrakisacridinyl peptide is determined by the conventional DNA sensitive detection reagent ethidium homodimer (EthD) (Markovis, J. et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264) and acridine homodimer ( AcrD) (Le Pecq, JB. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 2915-2919) were 10 times and 20 times stronger, respectively. The unwinding angle of the DNA double helix due to the binding of the tetrakisacridinyl peptide was calculated from the effect of addition of the tetrakisacridinyl peptide on the viscosity of the plasmid DNA solution according to a known method. As a result, the value was 64 °, which was four times that of the monomer body. These facts indicate that the tetrakisacridinyl peptide is effectively tetraintercalated.
This tetrakisacridinyl peptide has a tetrahedral intercalate into an efficient DNA double helix, and the helical structure of the tetrakisacridinyl peptide found in solution fits well into the DNA double helix. It was also expected that the two lysine side chains present between the two acridine groups of the tetrakisacridinyl peptide interact well with the phosphates present on both sides of the DNA groove.
[0033]
d) The fluorescence change when [poly (dA-dT)] 2 (double-stranded DNA) or polydT (single-stranded DNA) was added to the tetrakisacridinyl peptide (1) solution was examined. Acridine homodimer (AcrD) was also examined as a control. The measurement conditions were as follows.
Tetrakisacridinyl peptide = 1.6 μM,
AcrD = 1.6μM
Buffer: 10 mM MES, 1 mM EDTA (pH 6.25), 0.2 M NaCl, 25 ° C
The obtained result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 6, with the addition of double-stranded DNA (poly [d (AT)] 2 ), the fluorescence intensity finally increased by 1600 times, which was an unprecedented fluorescence enhancement. Such an extremely large increase in fluorescence is unprecedented. Under the same conditions, AcrD increased fluorescence several tens of times. In addition, when single-stranded DNA (polydT) was added, almost no change in fluorescence was observed. This result also showed that the tetrakisacridinyl peptide is useful as a fluorescent reagent for selectively detecting double-stranded DNA.
[0034]
【The invention's effect】
As described above, the fluorescent reagent of the present invention is in contact with a double-stranded nucleic acid such as a double-stranded DNA or double-stranded RNA, whereby the fluorescent intercalating group in the fluorescent reagent molecule is a double-stranded nucleic acid. Intercalation between the base pairs of the fluorescent reagent molecule eliminates quenching due to stacking of fluorescent intercalating groups in the fluorescent reagent molecule and enhances the fluorescence intensity, thereby making it possible to selectively select double-stranded nucleic acids with high sensitivity. Can be detected.
The fluorescent reagent of the present invention can be applied to DNA search using a DNA chip or a DNA microarray. That is, sample DNA is reacted with a probe NDA immobilized on a DNA chip or DNA microarray to form double-stranded DNA, and this double-stranded DNA is selectively detected with high sensitivity by the fluorescent reagent of the present invention. Can do.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an HPLC chart of the tetrakisacridinyl peptide synthesized in Example 1. FIG.
FIG. 2 shows TOF MASS data of the tetrakisacridinyl peptide synthesized in Example 1.
FIG. 3 shows circular dichroism (CD) spectra of the tetrakisacridinyl peptide synthesized in Example 1 and the monomeric body synthesized in Reference Example 1.
FIG. 4 shows a helical structure formed by stacking acridine groups that are four fluorescent intercalating groups present in a tetrakisacridinyl peptide, which is a representative example of the fluorescent reagent of the present invention. FIG. 2 is a schematic diagram showing how an acridine group intercalates when it reacts with double-stranded DNA.
FIG. 5 shows absorption spectra measured by adding various amounts of [poly (dA-dT)] 2 to a tetrakisacridinyl peptide.
FIG. 6 shows changes in fluorescence intensity when [poly (dA-dT)] 2 or polydT or acridine homodimer (AcrD) as a control is added to a solution of tetrakisacridinyl peptide (1). Show.
