JP2005278750A

JP2005278750A - ダイオキシン類を酵素を用いて分解する方法

Info

Publication number: JP2005278750A
Application number: JP2004094325A
Authority: JP
Inventors: Sadayori Hoshina; 定頼保科
Original assignee: MARIUSU KK
Current assignee: MARIUSU KK
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2005-10-13

Abstract

【課題】ダイオキシン類を分解する際の最適の諸条件に関する。
【解決手段】、Bacillus midousuji菌から膜分画を得る。その膜分画とダイオキシン類の各異性体（17異性体）を酵母抽出液を添加した Soybean-Casein Digest Broth中に加える。各試料毎に温度、反応時間、水素イオン濃度、重金属類の量、ダイオキシン類の各変異体の量を変化させた。その結果温度、反応時間、水素イオン濃度などで効果的にダイオキシン類を分解できる条件を設定できた。

Description

本発明は、ダイオキシン類の分解方法に関するものである。

従前ダイオキシン類（ダイオキシン、ダイオキシンの変異体、ｃｏ−ＰＣＢなど）を分解する技術としては、対象物を約４００度で数時間過熱して分解するものがある。しかしこの方法によれば分解した塩素など化学物質が揮発し、揮発した化学物質が周囲の環境に悪影響を与える可能性があった。またこの方法によれば揮発した塩素を金属ナトリウムで吸着しなければならず、ダイオキシンの分解には１トンあたり１５万円から２０万円ほどの費用がかかった。特開２００３−１９０９１７号は廃棄物を６００度から１０００度ないし５００度から１０００度に加熱するが、かような高温度状態をつくり維持することはエネルギーが必要である。また、酵素を使用してダイオキシン類を分解する方法を用いた場合、いろいろな酵素ごとに反応時間や温度、水素イオン濃度などによってダイオキシン類の分解率にばらつきがあった。
特開２００３−１９０９１７号公報保科定頼ら著「平成１４年度ダイオキシン類汚染水質・土壌の微生物による直接浄化システムに関する調査研究報告書」財団法人エンジニアリング振興協会発行２００３年

解決しようとする問題点は、酵素を用いてダイオキシン類を分解する方法として、反応時間、温度、水素イオン濃度などをいかなる数値に設定すれば効率よくダイオキシン類を分解できるかである。

Bacillus midousuji菌の膜分画に含まれる酵素とダイオキシン類を混ぜて、温度、反応時間、水素イオン濃度、重金属の量、ダイオキシン類の濃度を変えその依存性を検討した。

ダイオキシン類と酵素を反応させてダイオキシン類を分解する場合いかなる条件を設定すれば良いかが分かりその効果は大きい。

現在ダイオキシン類は人類の脅威となっているが、本発明によればBacillus midousuji菌の膜分画に含まれる酵素を用いて、温度、水素イオン濃度などの諸条件を効果的な値に設定してダイオキシン類を効率よく分解できる。

本発明では菌株としてBacillus midousuji（本菌はSH2Bと称しかつATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物である）を使用する。グリセンリンで保存した菌株をSoybean-Casein Digest Broth（BBL^TM Tripticase^TM Soy Broth）寒天平板培地上に白金耳で接種し、65℃で3時間培養したものを新鮮培養菌株とした。新鮮培養菌株を小型定量白金耳で１白金耳採取し、Soybean-Casein Digest Brothの３wt％と酵母抽出沫０．３wt％を加えたものを液体培地(TSB/YE)とした。

この液体培地15mLを50mLのコニカルチューブに用意し、全量を懸濁しながら接種した。円盤式回転培養装置（TAITEC製）にコニカルチューブを車軸状に装着し、65℃、20rpmの回転数で転倒混和を2時間継続して新鮮培養菌液を調整した。15mLの新鮮培養菌液と500mLの液体培地を3Lのフラスコに接種し、65℃、190rpmの回転数で「8の字」水平回転を行い（TAITEC製）、3時間培養した（BECKMANN製）。培養終了後直ぐに氷冷し、4℃、20分間、4300Gで高速遠心を行った。菌体沈査を氷冷4倍希釈の液体培地に再懸濁し、50mLのコニカルチューブに回収した．これを4℃、10分間、6000rpmの回転数で高速遠心して集菌して菌体沈査を得た（SAKUMA製）。

菌体沈査を15mLの氷冷4倍希釈の液体培地に再懸濁し、20kHz、150Wで氷冷しながら2分間の超音波破砕を4回行った（日本精機製作所製）。これを4℃、10分間、6000rpmの回転数で高速遠心を行い、未処理菌体沈査と上清を得た（SAKUMA製）。上清を4mLずつ超遠心器用試験管にとり、4℃、30分間、150000Gの超遠心を行った（HITACHI製）。沈査の上層部からSH2B菌体膜分画を回収した。

本発明における実験では4塩素化以上のダイオキシン類混合液に対するSH2B薗体膜分画に含まれる酵素による分解能力を検討した。検討事項としては濃度依存性、温度依存性、水素イオン濃度（pH）依存性、重金属耐性を調べSH2B菌体膜分画の有するダイオキシン類の分解能力を調べた。本実験で使用したダイオキシン類はdibenzo−P−dioxinの異性体7種とdibenzo−franの異性体10種の合計17種（以下、「17異性体」と称する。）である。具体的な異性体は各表に記載した。dibenzo−P−dioxinの異性体7種とdibenzo−franの異性体10種の混合化合物をPCDD／DF混合化合物と称する。

表１は温度依存性に関する実験結果である。膜分画に含まれる酵素によるPCDD／DF混合化合物の分解をみるのにSH2B菌体膜分画をとり、反応時間を3日間に固定して、温度を変えて基質濃度の減少をみた。誘導物質としては17異性体を1000pg含むPCDD／DF混合化合物を500mLの0．3%Yeast Extract 加Tripticase Soy Broth（TSB／YE）に加え、65℃、3時間培養後、膜画分を取り出した。その結果約1000pgのPCDD／DF混合化合物を含んだ膜画分が得られた。17異性体が500p gのPCDD／DF混合化合物を添加した4倍希釈培地（1／4（TSB／YE））を500mL用意し、膜分画を全量加えた。よく混ぜて、100mLづつ5つに分け、コントロール、4℃、20℃、30℃、65℃の試料に分けて反応を開始した。反応時の水素イオン濃度をpH7、反応時間を3日間に固定し、反応は密栓したガラス瓶を静置して行った。コントロールは0時間でconc HClを添加し、水素イオン濃度をpH7，温度を65℃に固定し3日間反応させた。ダイオキシン類の測定にはガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーを使用した。

0時間でconc HClを添加し65℃で反応させたコントロールのダイオキシン類の濃度がトータルで19,400pgであった。温度が65℃の試料は反応によりダイオキシン類が微生物分解され13,010pg、33％の減少が見られた。塩素化数が小さいダイオキシン類の分解が良好であることが見られた。30℃での反応は雑菌が迷入したため、見かけ上、ダイオキシンの減少が見られたが、ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー測定時の反応液からのダイオキシン類抽出、精製操作時のサンプリング誤差が考えられるので、結果の解釈は保留した。4℃、20℃での微生物分解反応は認められなかった。

表２は分解反応時間の影響に関する実験結果である。膜分画に含まれる酵素のPCDD／DF混合化合物の分解をみるのにSH2B菌体膜分画をとり、反応温度を65℃に固定し、反応時間を変えて基質濃度の減少をみた。誘導物質として17異性体を1000pg含むPCDD／DF混合化合物を500mLの0.3％ Yeast Extract 加Tripticase Soy Broth（TSB／YE）、65℃、3時間培養後、膜画分を取り出した。この結果約1000pgのPCDD／DF混合化合物を含んだ膜画分が得られた。17異性体が500pgのPCDD／DF混合化合物を添加した4倍希釈培地（1／4（TSB／YE））を500mL用意し、膜分画を全量加えた。よく混ぜて、100mLづつ4つに分け、コントロール、1日，2日，7日間の試料に分けて反応を開始した。反応時の水素イオン濃度をpH7，反応温度を65℃に固定し、反応は密栓したガラス瓶を静直して行った。コントロールは0時間でconc HClを添加し、水素イオン濃度をpH7，温度を65℃に設定し3日間反応させた。ダイオキシン類の測定にはガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーを使用した。

0時間でconc HClを添加し温度65℃で3日間反応させたコントロールのダイオキシン類の濃度がトータルで18,710pgであった。65℃で1日反応させるとダイオキシン類の量が14,360pg（23％減）に減少した。2日では12,240pg（35％減）、7日では7,305pg（61％減）に減少した。膜分画に含まれる酵素が耐熱性であると考えられる。ダイオキシン類の減少の傾向などから14日以内程度で分解がほとんど終了すると考えられる。

表３は分解反応時の水素イオン濃度（pH）の影響に関する実験結果である。膜分画に含まれる酵素のPCDD／DF混合化合物の分解をみるのにSH2B菌体膜分画をとり、反応温度を65℃に固定し、反応時間を3日間に固定して分解反応液の水素イオン濃度（pH）を変えて基質濃度の減少をみた。誘導物質として17異性体を1000pg含むPCDD／DF混合化合物を500mLの0.3％ Yeast Extract 加Tripticase Soy Broth（TSB／YE）に加え、65℃、3時間培養後、膜画分を取り出した。その結果約500pgのPCDD／DF混合化合物を含んだ膜画分が得られた。17異性体が500pgのPCDD／DF混合化合物を添加した4倍希釈培地（1／4（TSB／YE））を500mL用意し、よく混ぜて、100mLづつ4つに分け、17異性体を500pg含むPCDD／DF混合化合物を加えた4倍希釈TSB／YE液を500mL用意し、膜分画を全量加えた。よく混ぜて、100mLづつ5つに分け、コントロール、pH3，pH11，pH13の試料に分けて反応を開始した。反応温度を65℃、反応時間を3日間とし、反応は密栓したガラス瓶を静置して行った。コントロールは0時間でconc HClを添加し、反応時の水素イオン濃度をpH7，温度を65℃に設定し3日間で反応させた。ダイオキシン類の測定にはガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーを使用した。

0時間でconc HClを添加し水素イオン濃度をpH7で温度を65℃で3日間反応させたコントロールのダイオキシン類の濃度がトータルで9,350pgであった。水素イオン濃度をpH3〜13に変化させた場合に、pH3で2,295pg（73％減）、pH11で1,446pg（83％減）、pH13で927pg（89％減）に減少した。このことから、膜分画に含まれる酵素の活性はpHがアルカリ側であるpH7以上で高い成績が得られた。ただし、塩素化数が小さいダイオキシン類ではpHに影響を受けずに酵素分解が認められた。

表４は菌体膜分画を用いた分解反応に影響をする重金属濃度に関する実験結果である。膜酵素をとってPCDD／DF混合化合物の分解をみるのに65℃、3時間培養を行い、膜画分を取り出した。17異性体が500pgのPCDD／DF混合化合物を加えた4倍希釈培TSB／YE液を500mL用意し、膜分画を全量加える。よく混ぜて、100mLづつ5つに分け、重金属キット（関東化学製、ICP Multi-element Standard Solution 4、Ag Al B Ba Bi Ca Cd Co Cr Cu Fe Ga In K Li Mg Mn Na Ni Pb Sr Tl Zn 各1000mg/l）の濃度をコントロール、1ppm、10ppm、100ppmの試料に分けて反応を開始する。コントロールは0時間でconc HClを添加し、水素イオン濃度をpH7，温度を65℃に設定し3日間反応させた。反応は密栓したガラス瓶を静置して行った。コントロールは0時間でconc HClを添加し、温度を4℃で保存した。ダイオキシン類の測定にはガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーを使用した。

4℃で3日間静置した対照のダイオキシン類の濃度がトータルで10,730pgであった。1ppmの重金属を含ませた酵素分解系ではダイオキシン類の量が7,420pgに減少したことから重金属による酵素阻害が見られなかった。重金属を10ppm加えた系では9,610pgでありコントロールの成績との差がほとんど見られなかった。重金属を100ppm加えた系では膜分画に含まれる酵素活性は見られなかった。

本発明の原理として以下の様に推測した。化１に蛍光基質を有する物質の化学式（以下、「Ａ物質１」という。）を示す。

化２に１酸素架橋開裂を有する物質の化学式（以下、「Ｂ物質２」という。）を示す。

化３にエーテル結合開裂後の物質の化学式（以下、「Ｃ物質３」という。名称エスクレチン）を示す。

Ａ物質１は蛍光性質を有していない。Ｂ物質２は蛍光性質を有しており所定の波長で発光する。Ｃ物質３も蛍光性質を有しており所定の波長で発光する。化４に２、３、７、８−ＴＣＤＤの化学式を示す。

Ａ物質１は２、３、７、８−ＴＣＤＤと比較して７、８の部位にメチル基等を有するベンゼン環が結合している点を除いて同じ化学構造をしている。非特許文献１２９ページ以下ではＡ物質１を擬似的に２、３、７、８−ＴＣＤＤに見立ててBacillus midousujiを使用して化学反応を起こさせ、１酸素架橋開裂やエーテル結合が開裂して各々Ｂ物質２やＣ物質３が生じた場合、その蛍光を観測して擬似的２、３、７、８−ＴＣＤＤが分解し無毒化されるかを実験している。

図１にグルタチオンによるＡ物質１の代謝を推測した図を示す（非特許文献１の４４ページ）。
化５にグルタチオンの化学式を示す。

Bacillus midousujiを使用した結果Ｂ物質２、Ｃ物質３が生じてＡ物質１が分解され無毒化されるが、この現象の原理はＡ物質１の酸素原子に隣接するアンギュラー位に硫黄原子Ｓが入り、親水化することによって１酸素架橋開裂が生じエーテル結合が開裂していくと推測されている。グルタチオンは硫黄原子Ｓを有する化学構造を持つが、かかる硫黄原子Ｓがダイオキシン類のベンゼン環のアンギュラー位に入り親水化することで無毒化する。その後１酸素架橋開裂が生じエーテル結合が開裂すると推測される。そして、試料の温度を上げることによって化学反応が円滑に進行し擬似的な２、３、７、８−ＴＣＤＤであるＡ物質１が分解され無毒化されるものと推測される。また、ダイオキシン類における分子の塩素原子に硫黄原子が置換することによって無毒化される場合があると推測される。グルタチオンを含む酵母抽出液のほかグルタチオンを含むビール酵母を溶かした混合物、システイン、メチオニン、硫化鉄を使用しても硫黄元素Ｓがエーテル結合を担う酸素原子を排除し置換することで１酸素架橋開裂が生じエーテル結合が開裂すると推測される。

本発明との関連で特願２００４−２２２５２号がある。特願２００４−２２２５２号ではダイオキシン類に硫黄元素供給源であるグルタチオン、酵母抽出液等を加えて温度幅を８０度から１００度に設定した。本発明ではダイオキシン類に硫黄元素供給源であるグルタチオン等を加えさらにBacillus midousuji菌から得られた膜分画に含まれる酵素を加え Soybean-Casein Digest Broth中で低温幅でのダイオキシン類の分解などを実現した。

ダイオキシン類を効果的に分解する際に設定する温度等の諸条件を事前に知ることができ装置の耐久性や品質の規格の設定などが予見でき、ダイオキシン類を効果的に分解もできその意義は大きい。

グルタチオンによるＡ物質１の代謝を推測した図

符号の説明

１Ａ物質
２Ｂ物質
３Ｃ物質

Claims

Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素とグルタチオンとダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、温度を２１℃から８０℃に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素とグルタチオンとダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、反応時間を１４日以内に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素とグルタチオンとダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、水素イオン濃度をｐＨ７以上に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素とグルタチオンとダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、重金属類の濃度を１０ｐｐｍ以下に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と酵母抽出液とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、温度を２１℃から８０℃に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と酵母抽出液とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、反応時間を１４日以内に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と酵母抽出液とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、水素イオン濃度をｐＨ７以上に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と酵母抽出液とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、重金属類の濃度を１０ｐｐｍ以下に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と硫黄元素供給源とダイオキシン類Soybean-Casein Digest Broth中でを混ぜて、温度を２１℃から８０℃に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と硫黄元素供給源とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、反応時間を１４日以内に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と硫黄元素供給源とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、水素イオン濃度をｐＨ７以上に設定してダイオキシン類を分解する方法。
Bacillus midousuji菌体（ATCC受託番号第202050号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異体株の生物学的純粋培養物）の膜分画に含まれる酵素と硫黄元素供給源とダイオキシン類をSoybean-Casein Digest Broth中で混ぜて、重金属類の濃度を１０ｐｐｍ以下に設定してダイオキシン類を分解する方法。