JP2005270082A - Glucose dehydrogenase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素(PQQGDH)の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。 The present invention relates to the production of glucose dehydrogenase (PQQGDH) using pyrroloquinoline quinone as a coenzyme and its use in the determination of glucose.
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ(GOD)あるいはグルコース6リン酸脱水素酵素(G6PDH)を用いる酵素法により定量されていた。しかし、GODを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。G6PDHは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素であるNAD(P)を添加しなければならない。 Blood glucose concentration is an important marker of diabetes. In fermentation production using microorganisms, the glucose concentration is quantified to monitor the process. Conventionally, glucose has been quantified by an enzymatic method using glucose oxidase (GOD) or glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). However, in the method using GOD, it is necessary to add catalase or peroxidase to the assay system in order to quantify hydrogen peroxide generated during the glucose oxidation reaction. G6PDH has been used for glucose determination based on spectroscopic techniques, but NAD (P), a coenzyme, must be added to the reaction system.
そこで、これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてPQQGDHの応用が注目されている。PQQGDHは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。 Therefore, the application of PQQGDH has attracted attention as a new enzyme that replaces the enzyme that has been used in conventional glucose enzyme determination methods. PQQGDH is a glucose dehydrogenase that uses pyrroloquinoline quinone as a coenzyme, and catalyzes a reaction in which glucose is oxidized to produce gluconolactone.
PQQGDHには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性PQQGDHは、分子量約87kDaのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。例えば、AM.Cleton−Jansen et al.,J.Bacteriol.(1990)172,6308−6315を参照されたい。一方、水溶性PQQGDHはAcinetobacter calcoaceticusのいくつかの株においてその存在が確認されており(Biosci.Biotech.Biochem.(1995),59(8),1548−1555)、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている(Mol.Gen.Genet.(1989),217:430−436)。A.calcoaceticus由来水溶性PQQGDHは、分子量約50kDaのホモダイマーである。他のPQQ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロジーがほとんどない。 PQQGDH is known to have a membrane-bound enzyme and a water-soluble enzyme. Membrane-bound PQQGDH is a single peptide protein having a molecular weight of about 87 kDa and is widely found in various gram-negative bacteria. For example, AM. Cleton-Jansen et al. , J .; Bacteriol. (1990) 172, 6308-6315. On the other hand, water-soluble PQQGDH has been confirmed in several strains of Acinetobacter calcaceticus (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59 (8), 1548-1555), and its amino acid sequence has been cloned. (Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430-436). A. Calcoaceticus-derived water-soluble PQQGDH is a homodimer having a molecular weight of about 50 kDa. There is almost no homology on the primary structure of the protein with other PQQ enzymes.
最近、Acinetobacter calcoaceticus由来の水溶性PQQGDHのX線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった。(A.Oubrie et al.,J.Mol.Biol.,289,319−333(1999);A.Oubrie et al.,The EMBO Journal,18(19)5187−5194(1999);A.Oubrie et al.PNAS,96(21),11787−11791(1999))。これらの論文によれば、水溶性PQQGDHは6つのW−モチーフから構成されるβプロペラ蛋白質であることが明かとなった。 Recently, the results of X-ray crystal structure analysis of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus have been reported, and the higher-order structure of the enzyme including the active center has been clarified. (A. Oubrie et al., J. Mol. Biol., 289, 319-333 (1999); A. Oubrie et al., The EMBO Journal, 18 (19) 5187-5194 (1999); al., PNAS, 96 (21), 11787-11791 (1999)). These papers revealed that water-soluble PQQGDH is a β-propeller protein composed of six W-motifs.
PQQGDHはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびPQQGDHは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。しかしながらPQQGDHはグルコースに対する選択性が低いことが問題であった。 Since PQQGDH has high oxidative activity on glucose, and PQQGDH is a coenzyme-linked enzyme, it does not require oxygen as an electron acceptor. Application to the field is expected. However, PQQGDH has a problem of low selectivity for glucose.
したがって本発明は、グルコースに対する選択性が高い改変型水溶性PQQGDHを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a modified water-soluble PQQGDH having high selectivity for glucose.
本発明者は水溶性PQQGDHを遺伝子工学的に改良してそのグルコースに対する選択性を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型PQQGDHを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶性PQQGDHの特定の領域においてアミノ酸変異を導入することにより、グルコースに対する選択性が高い酵素を得ることに成功した。 As a result of earnest research to develop modified PQQGDH that can be applied to clinical tests and food analysis by improving genetic engineering of water-soluble PQQGDH, the present inventor has conducted research on water-soluble PQQGDH. By introducing amino acid mutations in specific regions, we succeeded in obtaining enzymes with high selectivity for glucose.
すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース脱水素酵素を提供する。本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対して高い選択性を有する。好ましくは本発明の改変型PQQGDHは、グルコースに対する反応性と比べて、ラクトースあるいはマルトースに対する反応性が野生型より低下している。より好ましくは、グルコースに対する反応性を100%とした場合、マルトースに対する活性が40%以下であり、より好ましくは30%以下であり、さらに好ましくは20%以下である。 That is, the present invention provides a water-soluble glucose dehydrogenase using pyrroloquinoline quinone as a coenzyme, wherein one or more amino acid residues of a natural water-soluble glucose dehydrogenase are substituted with other amino acid residues. And a modified glucose dehydrogenase having high selectivity for glucose compared to the natural water-soluble glucose dehydrogenase. The modified glucose dehydrogenase of the present invention has a high selectivity for glucose compared to natural water-soluble glucose dehydrogenase. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is less reactive to lactose or maltose than the wild type compared to the reactivity to glucose. More preferably, when the reactivity to glucose is 100%, the activity against maltose is 40% or less, more preferably 30% or less, and further preferably 20% or less.
本発明の1つの態様においては、本発明の改変型グルコース脱水素酵素において、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHの第186残基から第206残基の領域または他の種における同等の領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基(すなわち天然に存在するPQQグルコース脱水素酵素中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基)で置換されている。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを1として番号付けする。 In one embodiment of the present invention, in the modified glucose dehydrogenase of the present invention, 1 or more in the region from residue 186 to residue 206 of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus or an equivalent region in other species These amino acid residues are substituted with other amino acid residues (that is, amino acid residues different from the corresponding amino acid residues in the naturally occurring PQQ glucose dehydrogenase). In the present specification, amino acid positions are numbered with 1 as the starting methionine.
本明細書においてアミノ酸残基の位置または領域に関して用いる場合、「同等の」との用語は、構造上類似するが同一ではない2以上の蛋白質において、あるアミノ酸残基または領域が等価の生物学的または生化学的機能を有することを表す。例えば、Acinetobacter calcoaceticus以外の生物に由来する水溶性PQQGDHにおいて、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHと80%以上の相同性を有する蛋白質でかつグルコース脱水素酵素活性を有する酵素において第186残基から206残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考えられる場合、該領域は「Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHの第186残基から206残基の領域と同等の領域」と言われる。さらに、該領域の第8番目のアミノ酸残基は「Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHの第193残基と同等の位置のアミノ酸残基」と言われる。 As used herein with respect to amino acid residue positions or regions, the term “equivalent” refers to biologically equivalent amino acid residues or regions in two or more proteins that are structurally similar but not identical. Or it represents having a biochemical function. For example, in water-soluble PQQGDH derived from organisms other than Acinetobacter calcaceticus, residues 186 to 206 in an enzyme having 80% or more homology with Acinetobacter calcaceticus-derived water-soluble PQQGDH and glucose dehydrogenase activity And a region having high amino acid sequence similarity, and it is reasonably considered that the region plays the same role in the protein as seen from the secondary structure of the protein, the region is expressed as “Acinetobacter calcoaceticus-derived water The region equivalent to the region from residue 186 to residue 206 of sex PQQGDH ”. Further, the eighth amino acid residue in the region is said to be “an amino acid residue at a position equivalent to the 193 residue of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus”.
好ましくは、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHの193番目のロイシン残基、または他の種における同等の位置のアミノ酸残基が中性あるいは酸性の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている。 Preferably, the modified glucose dehydrogenase of the present invention has a neutral or acidic side chain at the 193th leucine residue of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus or an amino acid residue at an equivalent position in other species Substituted with an amino acid residue.
さらに好ましくは、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、配列番号1で表されるアミノ酸配列の193番目のロイシン残基がグルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、トレオニン、グルタミン、あるいはアスパラギン残基に置換されている。 More preferably, in the modified glucose dehydrogenase of the present invention, the 193rd leucine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid, aspartic acid, histidine, tyrosine, threonine, glutamine, or asparagine residue. Has been replaced.
また別の観点においては、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、配列:
Gly−Arg−Asn−Xaa1−Xaa2−Ala−Tyr−Leu
(式中、Xaa1、Xaa2、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Xaa1がGlnであるときXaa2はGlu,Asp,His,Tyr,Thr,GlnあるいはAsnである)を含む。In another aspect, the modified glucose dehydrogenase of the present invention has the sequence:
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(Where Xaa1, Xaa2 are any natural amino acid residue, provided that when Xaa1 is Gln, Xaa2 is Glu, Asp, His, Tyr, Thr, Gln or Asn).
本発明はまた、上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。 The present invention also provides a gene encoding the above-mentioned modified glucose dehydrogenase, a vector containing the gene and a transformant containing the gene, and a glucose assay kit and glucose sensor containing the modified glucose dehydrogenase of the present invention. I will provide a.
本発明の改変型グルコース脱水素酵素の酵素蛋白質はグルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高選択的かつ高感度の測定に応用することができる。 Since the enzyme protein of the modified glucose dehydrogenase of the present invention exhibits high selectivity for glucose and has high oxidation activity for glucose, it can be used for highly selective and sensitive measurement of glucose. Can be applied.
改変型PQQGDHの構造Structure of modified PQQGDH
本発明の好ましい改変型グルコース脱水素酵素においては、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHの第186残基から第206残基の領域または他の種における同等の領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明の改変型PQQGDHは、配列番号1で表されるアミノ酸配列の193番目のロイシン残基がグルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、トレオニン、グルタミン、あるいはアスパラギン残基で置換されている。 In the preferred modified glucose dehydrogenase of the present invention, one or more amino acid residues in the region of residues 186 to 206 of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus or the equivalent region in other species Of amino acid residues. Preferably, in the modified PQQGDH of the present invention, the 193rd leucine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid, aspartic acid, histidine, tyrosine, threonine, glutamine, or asparagine residue. .
また別の観点においては、本発明の改変型PQQGDHは、配列:
Gly−Arg−Asn−Xaa1−Xaa2−Ala−Tyr−Leu
(式中、Xaa1、Xaa2、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Xaa1がGlnであるときXaa2はGlu,Asp,His,Tyr,Thr,GlnあるいはAsnである)を含む。In another aspect, the modified PQQGDH of the present invention has the sequence:
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(Where Xaa1, Xaa2 are any natural amino acid residue, provided that when Xaa1 is Gln, Xaa2 is Glu, Asp, His, Tyr, Thr, Gln or Asn).
改変型PQQGDHの製造方法
Acinetobacter calcoaceticus由来の天然の水溶性PQQGDHをコードする遺伝子の配列は配列番号2で規定される。本発明の改変型PQQGDHをコードする遺伝子は、天然の水溶性PQQGDHをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、Sambrookら,”Molecular Cloning;ALaboratory Manual”,第2版,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。 Method for Producing Modified PQQGDH The sequence of the gene encoding natural water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcaceticus is defined by SEQ ID NO: 2. In the gene encoding the modified PQQGDH of the present invention, the base sequence encoding the amino acid residue to be substituted in the gene encoding natural water-soluble PQQGDH is replaced with the base sequence encoding the desired amino acid residue. Can be constructed. Various methods for such site-specific base sequence substitution are known in the art, for example, Sambrook et al., “Molecular Cloning; Laboratory Manual”, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. , New York.
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター(例えばプラスミド)に挿入し、これを適当な宿主(例えば大腸菌)に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。 The mutant gene thus obtained is inserted into a gene expression vector (for example, a plasmid) and transformed into a suitable host (for example, E. coli). Many vectors and host systems for expressing foreign proteins are known in the art, and various hosts such as bacteria, yeast, and cultured cells can be used as the host.
本発明の改変型PQQGDHにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。 In the modified PQQGDH of the present invention, as long as it has a desired glucose dehydrogenase activity, a part of another amino acid residue may be deleted or substituted, and another amino acid residue may be added. Good. Various methods for such site-specific base sequence substitution are well known in the art.
さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶性PQQGDHについても、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、Acinetobacter calcoaceticus由来の水溶性PQQGDHの第186残基から第206残基の領域にと同等の領域を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコース選択性の向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。 Furthermore, the person skilled in the art also compares the primary structure of proteins in water-soluble PQQGDH derived from other bacteria in parallel or the secondary structure predicted based on the primary structure of the enzyme. Can easily recognize a region equivalent to the region from residue 186 to residue 206 of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus, and according to the present invention, amino acid residues in this region can be By substituting with an amino acid residue, a modified glucose dehydrogenase with improved glucose selectivity can be obtained. These modified glucose dehydrogenases are also within the scope of the present invention.
上述のようにして得られた、改変型PQQGDHを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、PQQGDHを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したPQQGDHを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、HPLCなどにより精製することにより、本発明の改変型PQQGDHを調製する。 The transformant expressing the modified PQQGDH obtained as described above is cultured, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or the like, and then the cells are crushed with a French press or the like, or osmotic The periplasmic enzyme is released into the medium by shock. This can be ultracentrifuged to obtain a water-soluble fraction containing PQQGDH. Alternatively, the expressed PQQGDH can be secreted into the culture medium by using an appropriate host vector system. The modified PQQGDH of the present invention is prepared by purifying the obtained water-soluble fraction by ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC or the like.
酵素活性の測定方法
本発明のPQQGDHは、PQQを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、PQQGDHによるグルコースの酸化にともなって還元されるPQQの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、PMS(フェナジンメトサルフェート)−DCIP(2,6−ジクロロフェノールインドフェノール)、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。 Method for Measuring Enzyme Activity PQQGDH of the present invention has an action of catalyzing a reaction in which glucose is oxidized to produce gluconolactone using PQQ as a coenzyme. In the measurement of enzyme activity, the amount of PQQ that is reduced with the oxidation of glucose by PQQGDH can be quantified by a color reaction of the redox dye. Examples of the color reagent include PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol), potassium ferricyanide, ferrocene, and the like.
グルコースに対する選択性
本発明のPQQGDHのグルコースに対する選択性は、基質としてガラクトース、およびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。 Selectivity for glucose The selectivity of PQQGDH of the present invention for glucose is determined by measuring the enzyme activity as described above using various sugars such as galactose and maltose as substrates, and the relative activity to the activity when glucose is used as a substrate. It can be evaluated by examining.
本発明の改変型PQQGDHは野生型酵素と比較して、グルコースに対する選択性が向上しており、特にマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する反応性が高い。したがって、本改変型酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、種々の糖が存在する試料においても高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。 The modified PQQGDH of the present invention has improved selectivity for glucose compared to the wild-type enzyme, and in particular has higher reactivity to glucose compared to reactivity to maltose. Therefore, an assay kit or enzyme sensor prepared using this modified enzyme has the advantage of high selectivity for glucose measurement, and can detect glucose with high sensitivity even in samples containing various sugars.
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型PQQGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型PQQGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型PQQGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型PQQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型PQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。 Glucose Assay Kit The present invention also features a glucose assay kit comprising a modified PQQGDH according to the present invention. The glucose assay kit of the present invention comprises a modified PQQGDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit contains, in addition to the modified PQQGDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, a glucose standard solution for creating a calibration curve, and directions for use. The modified PQQGDH according to the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is provided in the form of a holo, but can be provided in the form of an apoenzyme and can be holoed at the time of use.
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型PQQGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型PQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、PQQを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型PQQGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。 Glucose Sensor The present invention also features a glucose sensor that uses a modified PQQGDH according to the present invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with a representative electron mediator, or a combination thereof may be used. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holo form, but may be immobilized in the form of an apoenzyme and the PQQ provided as a separate layer or in solution. Typically, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、PQQおよびCaCl2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型PQQGDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。The glucose concentration can be measured as follows. The buffer is placed in a thermostatic cell, and PQQ and CaCl 2 and mediator are added to maintain a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used. As the working electrode, an electrode on which the modified PQQGDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
実施例1
改変型酵素PQQGDH遺伝子の構築
配列番号2に示されるAcinetobacter calcoaceticus由来PQQGDHの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。プラスミドpGB2は、ベクターpTrc99A(ファルマシア社製)のマルチクローニング部位に、Acinetobacter calcoaceticus由来PQQGDHをコードする構造遺伝子を挿入したものである。常法に従って部位特異的変異法により193番目のロイシン残基をコードする塩基配列をグルタミン酸残基をコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異はプラスミドpGB2を用いて行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を表1に示す。
Construction of Modified Enzyme PQQGDH Gene Mutation was introduced based on the structural gene of Acinetobacter calcoaceticus-derived PQQGDH shown in SEQ ID NO: 2. The plasmid pGB2 is obtained by inserting a structural gene encoding PQQGDH derived from Acinetobacter calcaceticus into the multiple cloning site of the vector pTrc99A (Pharmacia). The base sequence encoding the 193rd leucine residue was replaced with the base sequence encoding a glutamic acid residue by site-directed mutagenesis according to a conventional method. Site-directed mutagenesis was performed using plasmid pGB2. Table 1 shows the sequences of the synthetic oligonucleotide target primers used for the mutation.
ベクタープラスミドpKF18k(宝酒造(株))にAcinetobacter calcoaceticus由来PQQGDHをコードする遺伝子の一部を含むKpn I−Hind III断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート50fmolと宝酒造(株)製Mutan(登録商標)−Express Kmキットに付属のセレクションプライマー5pmol、リン酸化したターゲットプライマー50pmolを全体(20μl)の1/10量の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、100℃、3分間の熱処理でプラスミドを変性させ、1本鎖にした。セレクションプライマーはpKF18kのカナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを5分間氷上に置き、プライマーをアニーリングさせた。これに3μlの同キットエクステンションバッファー、1μlのT4 DNAリガーゼ、1μlのT4 DNAポリメラーゼおよび5μlの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。これをDNAのミスマッチ修復能欠損株であるE.coli BMH71−18mutSに形質転換し、一晩振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。 A vector plasmid pKF18k (Takara Shuzo Co., Ltd.) was incorporated with a Kpn I-Hind III fragment containing a part of the gene encoding PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus and used as a template. 50 fmol of this template was mixed with 5 pmol of the selection primer attached to Mutan (registered trademark) -Express Km kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. and 50 pmol of the phosphorylated target primer together with an annealing buffer of 1/10 of the total (20 μl) of the same kit. The plasmid was denatured by heat treatment at 100 ° C. for 3 minutes to form a single strand. The selection primer is for reverting the double amber mutation on the kanamycin resistance gene of pKF18k. This was placed on ice for 5 minutes to anneal the primer. To this was added 3 μl of the same kit extension buffer, 1 μl of T4 DNA ligase, 1 μl of T4 DNA polymerase and 5 μl of sterile water to synthesize complementary strands. This is the strain E. deficient in mismatch repair ability of DNA. E. coli BMH71-18mutS was transformed with shaking culture overnight to amplify the plasmid.
次に、ここから抽出したプラスミドをE.coli MV1184に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミドpGB2上の野生型PQQGDHをコードする遺伝子のKpnI−HindIII断片と入れ替え、改変型PQQGDHの遺伝子を構築した。 Next, the plasmid extracted from this was transformed into E. coli. E. coli MV1184 was transformed and a plasmid was extracted from the colony. These plasmids were sequenced to confirm the introduction of the intended mutation. This fragment was replaced with the KpnI-HindIII fragment of the gene encoding wild type PQQGDH on the plasmid pGB2 to construct a modified PQQGDH gene.
実施例2
改変型酵素の調製
野生型または改変型PQQGDHをコードする遺伝子を、E.coli用の発現ベクターであるpTrc99A(ファルマシア社)のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドをE.coliDH5α株に形質転換した。これを450mlのL培地(アンピシリン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml含有)で坂ロフラスコを用いて37℃で一晩振とう培養し、1mM CaCl2、500μMPQQを含む71のL培地に植菌した。培養開始後約3時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度0.3mMになるように添加し、その後1.5時間培養した。培養液から遠心分離(5000×g、10分、4℃)で菌体を回収し、この菌体を0.85%NaCl溶液で2回洗浄した。集菌した菌体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離(10000×g、15分、4℃)で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠心分離(160500×g(40000r.p.m.)、90分、4℃)し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以下の実施例において用いた。 Example 2
Preparation of Modified Enzyme The gene encoding wild type or modified PQQGDH was transformed into E. coli. The plasmid constructed by inserting it into the multicloning site of pTrc99A (Pharmacia), an expression vector for E. coli, was E. coli. E. coli DH5α strain was transformed. This was cultured in 450 ml of L medium (containing 50 μg / ml of ampicillin and 30 μg / ml of chloramphenicol) with shaking overnight at 37 ° C., and planted in 71 L medium containing 1 mM CaCl 2 and 500 μMPQQ. Fungus. About 3 hours after the start of the culture, isopropylthiogalactoside was added to a final concentration of 0.3 mM, and then cultured for 1.5 hours. The cells were collected from the culture solution by centrifugation (5000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), and the cells were washed twice with a 0.85% NaCl solution. The collected cells were crushed with a French press, and unbroken cells were removed by centrifugation (10000 × g, 15 minutes, 4 ° C.). The supernatant was ultracentrifuged (160500 × g (40000 rpm), 90 minutes, 4 ° C.) to obtain a water-soluble fraction. This was used in the following examples as a crudely purified enzyme preparation.
実施例3
酵素活性の測定
実施例2で得られた野生型および各改変型PQQGDHの粗精製酵素標品をそれぞれ1μMPQQ、1mM CaCl2存在下で1時間以上ホロ化した。これを187μlずつ分注し、3μlの活性試薬(6mMDCIP48μl,600mMPMS 8μl,10mMリン酸緩衝液pH7.0 16μl)および各濃度のD−グルコース溶液10μlを加え、酵素活性を測定した。 Example 3
Measurement of enzyme activity The crude enzyme preparations of wild type and each modified PQQGDH obtained in Example 2 were holoed for 1 hour or more in the presence of 1 μMPQQ and 1 mM CaCl 2 , respectively. 187 μl of this was dispensed, 3 μl of active reagent (6 mM DCIP 48 μl, 600 mM PMS 8 μl, 10 mM phosphate buffer pH 7.0 16 μl) and 10 μl of D-glucose solution of each concentration were added, and the enzyme activity was measured.
酵素活性の測定は、室温において、10mM MOPS−NaOH緩衝液(pH7.0)中においてPMS(フェナジンメトサルフェート)−DCIP(2,6−ジクロロフェノールインドフェノール)を用い、DCIPの600nmの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活性を1ユニットとした。また、DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数は16.3mM−1とした。The enzyme activity was measured by using PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol) in 10 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0) at room temperature, and measuring the absorbance change of DCIP at 600 nm. Tracking was performed using a spectrophotometer, and the rate of decrease in absorbance was defined as the enzyme reaction rate. At this time, the enzyme activity that reduces 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 unit. The molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM- 1 .
基質濃度対酵素活性のプロットから、Kmを求めた。その結果グルコースに対して48mMであり、ガラクトースに対して18mMであり、マルトースに対して20mMであった。 Km was determined from a plot of substrate concentration versus enzyme activity. As a result, it was 48 mM for glucose, 18 mM for galactose, and 20 mM for maltose.
実施例4
基質特異性の評価
各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調べた。実施例2で得られた野生型および各改変型PQQGDHの粗精製酵素標品をそれぞれ1μMPQQ、1mM CaCl2存在下で1時間以上ホロ化した。これを187μlずつ分注し、3μlの活性試薬(6mM DCIP,600mM PMS,10mMリン酸緩衝液pH7.0を含む)および基質を加えた。基質として、種々の濃度のグルコースまたは他の糖を加えそれぞれの酵素活性を検討した。値はグルコースを基質としたときの活性を100%とし、これに対する相対活性で表した。その結果、図1から求められる値としてグルコースを100%とした場合、マルトースに対しては5%であり、本発明の酵素はマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する高い反応性を示した。 Example 4
Evaluation of substrate specificity Substrate specificity was examined for crude enzyme preparations of each modified enzyme. The wild-type and modified PQQGDH crude purified enzyme preparations obtained in Example 2 were holoed for 1 hour or more in the presence of 1 μMPQQ and 1 mM CaCl 2 , respectively. This was dispensed in 187 μl aliquots, and 3 μl of active reagent (containing 6 mM DCIP, 600 mM PMS, 10 mM phosphate buffer pH 7.0) and substrate were added. Various concentrations of glucose or other sugars were added as substrates, and the respective enzyme activities were examined. The value was expressed as a relative activity with respect to 100% of the activity when glucose was used as a substrate. As a result, when glucose was set to 100% as a value obtained from FIG. 1, it was 5% for maltose, and the enzyme of the present invention showed higher reactivity to glucose compared to reactivity to maltose.
実施例6
酵素センサーの作製および評価
5ユニットのLeu193Glu改変型酵素にカーボンペースト20mgを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約40mg充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を1%のグルタルアルデヒドを含む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で30分間処理した後、20mMリジンを含む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で1時間以上平衡化させた。電極は4℃で保存した。 Example 6
Preparation and Evaluation of Enzyme Sensor 20 mg of carbon paste was added to 5 units of Leu193Glu modified enzyme and freeze-dried. After this was mixed well, it was filled only on the surface of the carbon paste electrode already filled with about 40 mg of carbon paste, and was polished on a filter paper. This electrode was treated in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 1% glutaraldehyde for 30 minutes at room temperature, and then treated in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 20 mM lysine for 20 minutes at room temperature. To block glutaraldehyde. This electrode was equilibrated in a 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) at room temperature for 1 hour or longer. The electrode was stored at 4 ° C.
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型PQQGDHを固定化した酵素センサーを用いて、0.1mM−5mMの範囲でグルコースを選択的に定量できた。 The glucose concentration was measured using the prepared enzyme sensor. Glucose could be selectively quantified in the range of 0.1 mM to 5 mM using the enzyme sensor to which the modified PQQGDH of the present invention was immobilized.
Claims (10)
Gly−Arg−Asn−Xaa1−Xaa2−Ala−Tyr−Leu
(式中、Xaa1、Xaa2、は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、Xaa1がGlnであるときXaa2はGlu,Asp,His,Tyr,Thr,GlnあるいはAsnである)
を含むことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。In glucose dehydrogenase using pyrroloquinoline quinone as a coenzyme, the sequence Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(In the formula, Xaa1 and Xaa2 are any natural amino acid residues, provided that when Xaa1 is Gln, Xaa2 is Glu, Asp, His, Tyr, Thr, Gln or Asn)
A modified glucose dehydrogenase comprising:
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Cited By (3)
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2004
- 2004-03-24 JP JP2004124826A patent/JP2005270082A/en not_active Withdrawn
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