JP2001346587A - Glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity - Google Patents
Glucose dehydrogenase excellent in substrate specificityInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン(PQQ)を補酵素とするグルコース脱水素酵素(G
DH)の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型PQQGDHに関する。本発明の改変
型PQQGDHは、臨床検査や食品分析などにおけるグ
ルコースの定量に有用である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a glucose dehydrogenase (G) having pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a coenzyme.
DH), wherein the specific amino acid residue is replaced with another amino acid residue. The modified PQQGDH of the present invention is useful for glucose quantification in clinical tests, food analysis, and the like.
【0002】[0002]
【従来の技術】PQQGDHは、ピロロキノリンキノン
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。2. Description of the Related Art PQQGDH is a glucose dehydrogenase using pyrroloquinoline quinone as a coenzyme, and catalyzes a reaction of oxidizing glucose to produce gluconolactone.
【0003】PQQGDHには、膜結合性酵素と水溶性
酵素があることが知られている。膜結合性PQQGDH
は、分子量約87kDaのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。例えば、AM. Cleton−Jansen e
t al., J. Bacteriol. (199
0) 172, 6308−6315を参照されたい。
一方、水溶性PQQGDHはAcinetobacter calcoaceti
cusのいくつかの株においてその存在が確認されており
(Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59(8), 1548-15
55)、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列
が明らかにされている(Mol. Gen. Genet.(1989), 217:
430-436)。A.calcoaceticus由来水溶性PQQGDH
は、分子量約50kDaのホモダイマーである。他のP
QQ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロジーがほと
んどない。[0003] It is known that PQQGDH includes a membrane-bound enzyme and a water-soluble enzyme. Membrane-bound PQQGDH
Is a single peptide protein having a molecular weight of about 87 kDa, and is widely found in various Gram-negative bacteria. For example, AM. Cleton-Jansen
t al. , J. et al. Bacteriol. (199
0) 172, 6308-6315.
On the other hand, water-soluble PQQGDH is Acinetobacter calcoaceti
Its presence has been confirmed in several strains of C. cus (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59 (8), 1548-15).
55), and its structural gene has been cloned and its amino acid sequence has been determined (Mol. Gen. Genet. (1989), 217:
430-436). A. calcoaceticus-derived water-soluble PQQGDH
Is a homodimer with a molecular weight of about 50 kDa. Other P
The QQ enzyme has almost no homology on the primary structure of the protein.
【0004】最近、本酵素のX線結晶構造解析の結果が
報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が
明らかとなった。(A.Oubrie et al., J.Mol.Biol., 28
9, 319-333(1999); A. Oubrie et al., The EMBO Journ
al, 18(19) 5187-5194 (1999); A. Oubrie et al. PNA
S, 96(21), 11787-11791 (1999))。これらの論文によ
れば、水溶性PQQGDHは6つのW−モチーフから構
成されるβプロペラ蛋白質であることが明かとなった。[0004] Recently, the results of X-ray crystal structure analysis of the present enzyme have been reported, and the higher order structure of the present enzyme including the active center has been revealed. (A. Oubrie et al., J. Mol. Biol., 28
9, 319-333 (1999); A. Oubrie et al., The EMBO Journ
al, 18 (19) 5187-5194 (1999); A. Oubrie et al. PNA
S, 96 (21), 11787-11791 (1999)). According to these articles, it was revealed that water-soluble PQQGDH is a β-propeller protein composed of six W-motifs.
【0005】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマ
ーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ
(GOD)あるいはグルコース6リン酸脱水素酵素(G
6PDH)を用いる酵素法により定量されていた。しか
し、GODを用いる方法ではグルコース酸化反応にとも
ない発生する過酸化水素を定量するため、カタラーゼあ
るいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要が
あった。またGODを用いるバイオセンサーの開発も進
められてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存
することから高濃度のグルコース試料には適さないこ
と、あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じ
る可能性があった。一方、G6PDHは分光学的手法に
基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補
酵素であるNAD(P)を添加しなければならないとい
う煩雑性があった。そこで、これまでのグルコース酵素
定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素とし
てPQQGDHの応用が注目されている。PQQGDH
はグルコースに対して高い酸化活性を有していること、
およびPQQGDHは補酵素結合型の酵素であるため電
子受容体として酸素を必要としないことから、グルコー
スセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野へ
の応用が期待されている。しかしながらPQQGDHは
グルコースに対する選択性が低いことが問題であった。[0005] Blood glucose concentration is an extremely important indicator for clinical diagnosis as an important marker of diabetes. In addition, quantification of glucose concentration in fermentation production using microorganisms is an important item in process monitoring. Conventionally, glucose is glucose oxidase (GOD) or glucose 6-phosphate dehydrogenase (G
6PDH) by the enzymatic method. However, in the method using GOD, it was necessary to add catalase or peroxidase to the assay system in order to quantify hydrogen peroxide generated during the glucose oxidation reaction. Biosensors using GOD have also been developed, but the reaction depends on the concentration of dissolved oxygen in the aqueous solution, making it unsuitable for high-concentration glucose samples. There was a possibility. On the other hand, G6PDH has been used for glucose quantification based on a spectroscopic technique, but has the trouble that NAD (P) as a coenzyme must be added to the reaction system. Therefore, application of PQQGDH has attracted attention as a new enzyme that replaces the enzyme used in the conventional glucose enzyme quantification method. PQQGDH
Has a high oxidizing activity on glucose,
Since PQQGDH is a coenzyme-linked enzyme and does not require oxygen as an electron acceptor, it is expected to be applied to assay fields such as glucose sensor recognition elements. However, PQQGDH had a problem of low selectivity for glucose.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明はグ
ルコースに対する改良された選択性を有する水溶性PQ
QGDHを提供することを目的とする。本発明は特に、
血中グルコース濃度測定の感度を増加させるために、グ
ルコースに対する反応性と比較してラクトースあるいは
マルトースに対する反応性が低い水溶性PQQGDHを
提供することを目的とする。Accordingly, the present invention provides a water soluble PQ having improved selectivity for glucose.
It aims to provide QGDH. The present invention, in particular,
An object of the present invention is to provide a water-soluble PQQGDH having a lower reactivity to lactose or maltose as compared with a reactivity to glucose in order to increase the sensitivity of measuring blood glucose concentration.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は従来の水溶性
PQQGDHを改良してそのグルコースに対する選択性
を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型P
QQGDHを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶
性PQQGDHの特定の領域においてアミノ酸変異を導
入することにより、グルコースに対する選択性がきわめ
て高い酵素を得ることに成功した。すなわち、本発明
は、Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性PQQG
DHの167番目のアスパラギン酸残基に相当するアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているPQQG
DHを提供する。本発明のPQQGDHは、天然の水溶
性PQQGDHと比較してグルコースに対して選択性が
向上していることを特徴とする。好ましくは本発明の改
変型PQQGDHは、グルコースに対する反応性と比べ
て、ラクトースあるいはマルトースに対する反応性が野
生型より低下している。より好ましくは、グルコースに
対する反応性を100%とした場合、ラクトースあるい
はマルトースに対する活性が50%以下であり、より好
ましくは40%以下であり、さらに好ましくは30%以
下である。Means for Solving the Problems The present inventor has improved the conventional water-soluble PQQGDH to increase its selectivity for glucose, and has modified P-QQGDH applicable to clinical tests and food analysis.
As a result of intensive studies to develop QQGDH, an enzyme having extremely high selectivity for glucose was successfully obtained by introducing an amino acid mutation in a specific region of water-soluble PQQGDH. That is, the present invention relates to a water-soluble PQQG derived from Acinetobacter calcoaceticus.
PQQG wherein the amino acid residue corresponding to the aspartic acid residue at position 167 of DH is substituted with another amino acid residue
Provide DH. The PQQGDH of the present invention is characterized by having improved selectivity for glucose as compared with natural water-soluble PQQGDH. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention has a lower reactivity to lactose or maltose than to the wild type as compared to the reactivity to glucose. More preferably, when the reactivity to glucose is 100%, the activity for lactose or maltose is 50% or less, more preferably 40% or less, and further preferably 30% or less.
【0008】本明細書においてアミノ酸残基または領域
に関して用いる場合、「相当する」との用語は、構造上
類似するが同一ではない2以上の蛋白質において、ある
アミノ酸残基または領域が等価の機能を有することを表
す。例えば、Acinetobactercalcoaceticus 以外の生物
に由来する水溶性PQQGDHにおいて、Acinetobacte
r calcoaceticus 由来水溶性PQQGDHの第164残
基から170残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領
域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がそ
の蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考
えられる場合、該領域は「Acinetobacter calcoaceticu
s 由来水溶性PQQGDHの164残基から170残基
の領域に相当する」と言われる。さらに、該領域の第4
番目のアミノ酸残基は「Acinetobacter calcoaceticus
由来水溶性PQQGDHの第167残基に相当する」と
言われる。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置
は、開始メチオニンを1として番号付けする。[0008] As used herein with respect to amino acid residues or regions, the term "corresponding" refers to the function of a given amino acid residue or region in two or more proteins that are structurally similar but not identical to each other. To have For example, in water-soluble PQQGDH derived from organisms other than Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacte
It is assumed that there is a region having a high amino acid sequence similarity to the region from residues 164 to 170 of water-soluble PQQGDH derived from R. calcoaceticus, and that the region plays the same role in the protein in view of the secondary structure of the protein. If reasonably conceivable, the region may be "Acinetobacter calcoaceticu
s-derived water-soluble PQQGDH, corresponding to the region from residue 164 to residue 170 ". Further, the fourth of the region
The second amino acid residue is `` Acinetobacter calcoaceticus
It corresponds to residue 167 of the derived water-soluble PQQGDH. " In the present specification, amino acid positions are numbered with starting methionine as 1.
【0009】好ましくは、本発明のPQQGDHは、配
列番号1で表されるアミノ酸配列の167番目のアスパ
ラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。Preferably, in the PQQGDH of the present invention, the aspartic acid residue at position 167 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid residue.
【0010】また別の観点においては、本発明のPQQ
GDHは、配列: Ser Gln His Xaa Lys Ser Ser (式中、XaaはAsp以外の任意の天然アミノ酸残基であ
る)を含む。In another aspect, the present invention provides a PQQ
GDH comprises the sequence: Ser Gln His Xaa Lys Ser Ser, where Xaa is any natural amino acid residue other than Asp.
【0011】本発明はまた、上述のPQQGDHをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子
を含む形質転換体、および本発明のPQQGDHの製造
方法、ならびに本発明のPQQGDHを含むグルコース
アッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。The present invention also provides a gene encoding the above-mentioned PQQGDH, a vector containing the gene, a transformant containing the gene, a method for producing the PQQGDH of the present invention, a glucose assay kit containing the PQQGDH of the present invention, Provide a glucose sensor.
【0012】本発明のPQQGDHの酵素蛋白質はグル
コースに対して高い選択性を示すため、グルコースの高
感度かつ高選択的な測定に応用できる。Since the enzyme protein of PQQGDH of the present invention has high selectivity for glucose, it can be applied to highly sensitive and highly selective measurement of glucose.
【0013】[0013]
【発明の実施の形態】改変型PQQGDHの構造 水溶性PQQGDHをコードする遺伝子のコーディング
領域中にエラープローンPCR法によりランダムに変異
を導入し、アミノ酸残基の変異が導入された水溶性PQ
QGDHのライブラリーを構築した。これを大腸菌に形
質転換し、PQQGDHの活性についてスクリーニング
して、100mM濃度のグルコースに対する活性が野生
型PQQGDHと同等であるが、100mMのマルトー
スに対する活性が野生型PQQGDHより低下したPQ
QGDHを発現する多数のクローンを得た。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Structure of Modified PQQGDH Mutations are randomly introduced into the coding region of a gene encoding water-soluble PQQGDH by error-prone PCR, and a water-soluble PQ having mutations in amino acid residues is introduced.
A library of QGDH was constructed. This was transformed into Escherichia coli and screened for PQQGDH activity, and the PQ activity at 100 mM glucose was equivalent to wild-type PQQGDH, but the activity at 100 mM maltose was lower than wild-type PQQGDH.
A number of clones expressing QGDH were obtained.
【0014】これらのクローンの一つについて遺伝子配
列を解析したところ、第167番目のAspがGluに
置換されていることが判明した。さらにこの残基をグリ
シン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、リジン、アス
パラギン、グルタミン、バリン、システイン、セリンあ
るいはトリプトファン残基に置換したところ、いずれの
残基に置換しても野生型水溶性PQQGDHよりもグル
コースに対する選択性が向上した変異酵素が得られた。Analysis of the gene sequence of one of these clones revealed that the 167th Asp was replaced by Glu. Further, when this residue was replaced with glycine, histidine, tyrosine, alanine, lysine, asparagine, glutamine, valine, cysteine, serine or tryptophan residue, any of the residues could be replaced by glucose rather than wild-type water-soluble PQQGDH. A mutant enzyme with improved selectivity for was obtained.
【0015】本発明の改変型PQQGDHにおいては、
所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、
さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されて
いてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていても
よい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々
の方法が当該技術分野において知られており、例えば、
Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory Manua
l”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New Yorkに記載されている。In the modified PQQGDH of the present invention,
As long as it has the desired glucose dehydrogenase activity,
Further, a part of another amino acid residue may be deleted or substituted, or another amino acid residue may be added. Various methods for such site-specific nucleotide sequence substitution are known in the art, for example,
Sambrook et al., “Molecular Cloning; A Laboratory Manua
l ”, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New York.
【0016】さらに、当業者は、他の細菌に由来する水
溶性PQQGDHについても、蛋白質の一次構造を並列
して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもと
に予測された二次構造を比較することにより、Acinetob
acter calcoaceticus由来の水溶性PQQGDHの第1
67番目のアスパラギン酸に相当する残基を容易に認識
することができ、本発明にしたがって、かかるアミノ酸
残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコ
ースに対する選択性が向上した改変型PQQGDHを得
ることができる。これらの改変型PQQGDHも本発明
の範囲内である。改変型PQQGDHの製造方法 Acinetobacter calcoaceticus由来の天然の水溶性PQ
QGDHをコードする遺伝子の配列は配列番号2で規定
される。Furthermore, those skilled in the art will also compare the primary structure of water-soluble PQQGDH derived from another bacterium in parallel with the primary structure of the protein or the secondary structure predicted based on the primary structure of the enzyme. By comparison, Acinetob
The first of water-soluble PQQGDH derived from acter calcoaceticus
A modified PQQGDH having improved selectivity for glucose by easily recognizing the residue corresponding to the 67th aspartic acid, and replacing such amino acid residue with another amino acid residue according to the present invention. Can be obtained. These modified PQQGDHs are also within the scope of the present invention. Process for producing modified PQQGDH Natural water-soluble PQ derived from Acinetobacter calcoaceticus
The sequence of the gene encoding QGDH is defined in SEQ ID NO: 2.
【0017】本発明の改変型PQQGDHをコードする
遺伝子は、天然の水溶性PQQGDHをコードする遺伝
子において、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列
を、変異すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列に置
換することにより構築することができる。In the gene encoding the modified PQQGDH of the present invention, the nucleotide sequence encoding the desired amino acid residue in the gene encoding the natural water-soluble PQQGDH is replaced with the nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated. It can be constructed by substitution.
【0018】このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発
現用のベクター(例えばプラスミド)に挿入し、これを
適当な宿主(例えば大腸菌)に形質転換する。外来性蛋
白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該
技術分野において知られており、宿主としては例えば、
細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることが
できる。The mutant gene thus obtained is inserted into a vector for gene expression (eg, a plasmid), and transformed into a suitable host (eg, Escherichia coli). Many vector-host systems for expressing foreign proteins are known in the art, and hosts include, for example,
Various things such as bacteria, yeast, and cultured cells can be used.
【0019】ランダム変異を導入する場合には、標的と
する領域においてエラープローンPCR法によりランダ
ムに変異を導入し、該領域に変異が導入された変異水溶
性PQQGDH遺伝子ライブラリーを構築する。When introducing a random mutation, a mutation is randomly introduced into a target region by an error-prone PCR method, and a mutant water-soluble PQQGDH gene library having a mutation introduced into the region is constructed.
【0020】これを大腸菌に形質転換し、PQQGDH
のグルコースに対する選択性について各クローンをスク
リーニングする。水溶性PQQGDHは大腸菌において
発現させたときにペリプラズム空間に分泌されるため、
菌体そのものを用いて容易に酵素活性の検定を行うこと
ができる。このライブラリーを色素としてPMS−DC
IPを加え、PQQGDHの活性を目視により判定し
て、100mM濃度のグルコースに対する活性が野生型
PQQGDHと同等であるが、100mMのマルトース
に対する活性が野生型PQQGDHより低下したPQQ
GDHを発現するクローンを選択し、遺伝子配列を解析
してその変異を確認する。This was transformed into Escherichia coli, and PQQGDH
Each clone is screened for its selectivity for glucose. Since water-soluble PQQGDH is secreted into the periplasmic space when expressed in E. coli,
Enzyme activity can be easily assayed using the cells themselves. Using this library as a dye, PMS-DC
The activity of PQQGDH was visually determined by adding IP, and the activity of glucose at 100 mM concentration was equivalent to that of wild-type PQQGDH, but the activity of 100 mM maltose was lower than that of wild-type PQQGDH.
A clone expressing GDH is selected, and the gene sequence is analyzed to confirm the mutation.
【0021】上述のようにして得られた、改変型PQQ
GDHを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、PQQGDHを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したPQQGDHを培養液中に分泌させるこ
ともできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、H
PLCなどにより精製することにより、本発明の改変型
PQQGDHを調製する。酵素活性の測定方法 本発明のPQQGDHは、PQQを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。The modified PQQ obtained as described above
After the transformant expressing GDH is cultured and the cells are collected from the culture by centrifugation or the like, the cells are disrupted by a French press or the like, or the periplasmic enzyme is released into the medium by osmotic shock. This is ultracentrifuged to obtain a water-soluble fraction containing PQQGDH. Alternatively, the expressed PQQGDH can be secreted into the culture medium by using an appropriate host vector system. The obtained water-soluble fraction was subjected to ion exchange chromatography, affinity chromatography, H
The purified PQQGDH of the present invention is prepared by purification by PLC or the like. Method for Measuring Enzyme Activity The PQQGDH of the present invention has a function of catalyzing a reaction of oxidizing glucose to produce gluconolactone using PQQ as a coenzyme.
【0022】酵素活性の測定は、PQQGDHによるグ
ルコースの酸化にともなって還元されるPQQの量を酸
化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈
色試薬としては、例えば、PMS(フェナジンメトサル
フェート)−DCIP(2,6−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール)、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ンなどを用いることができる。選択性の評価方法 本発明のPQQGDHのグルコースに対する選択性は、
基質として、2−デオキシ−D−グルコース、マンノー
ス、アロース、3−o−メチル−D−グルコース、ガラ
クトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等
の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グ
ルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調
べることにより評価することができる。グルコースアッセイキット 本発明はまた、本発明に従う改変型PQQGDHを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型PQQG
DHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型PQQGDHに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型P
QQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型PQQGD
Hはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。グルコースセンサー 本発明はまた、本発明に従う改変型PQQGDHを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型PQQGDHはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、PQQを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型PQQGDHをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドをブロッキングする。The enzyme activity can be measured by quantifying the amount of PQQ reduced by the oxidation of glucose by PQQGDH by a color reaction of a redox dye. As the coloring reagent, for example, PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol), potassium ferricyanide, ferrocene and the like can be used. Selectivity evaluation method The selectivity of glucose of PQQGDH of the present invention is as follows:
As a substrate, enzyme activity was measured as described above using various sugars such as 2-deoxy-D-glucose, mannose, allose, 3-o-methyl-D-glucose, galactose, xylose, lactose and maltose, It can be evaluated by examining the relative activity to the activity when glucose is used as a substrate. Glucose Assay Kit The present invention also features a glucose assay kit comprising a modified PQQGDH according to the present invention. The glucose assay kit of the present invention comprises the modified PQQG according to the present invention.
DH is included in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit contains, in addition to the modified PQQGDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, glucose standard solutions for preparing calibration curves, and guidelines for use. Modified P according to the invention
QQGDH can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the modified PQQGD of the present invention
Although H is provided in a holo-form, it can also be provided in the form of an apoenzyme and holo-formated at the time of use. Glucose Sensor The present invention also features a glucose sensor using the modified PQQGDH according to the present invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on the electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of enclosing in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, and a redox polymer. It may be fixed in a polymer together with a representative electron mediator or adsorbed and fixed on an electrode, or may be used in combination. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holated form, but it can also be immobilized in the form of an apoenzyme, providing PQQ as a separate layer or in solution. Typically, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
【0023】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、PQQ
およびCaCl2、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型PQQ
GDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電
極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。The measurement of the glucose concentration can be performed as follows. Put buffer solution in thermostat cell,
And CaCl 2 , and a mediator are added and maintained at a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate and the like can be used. The modified PQQ of the present invention as a working electrode
A GDH-immobilized electrode is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in the current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
【0024】[0024]
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
【0025】実施例1 変異PQQGDH遺伝子ライブラリの構築およびスクリ
ーニング プラスミドpGB2は、ベクターpTrc99A(ファ
ルマシア社製)のマルチクローニング部位に、Acinetob
acter calcoaceticus由来PQQGDHをコードする構
造遺伝子を挿入したものである(図1)。このプラスミ
ドをテンプレートとして、エラープローンPCR法によ
り種々の領域中にランダムに変異を導入した。PCR反
応は、表1に示す組成の溶液中で、94℃3分間、次
に、94℃3分間、50℃2分間、および72℃2分間
を30サイクル、最後に72℃で10分間の条件で行っ
た。Example 1 Construction and Screening of Mutant PQQGDH Gene Library Plasmid pGB2 was inserted into the vector pTrc99A (manufactured by Pharmacia) at the multiple cloning site of Acinetob.
It is one into which a structural gene encoding PQQGDH derived from acter calcoaceticus has been inserted (FIG. 1). Using this plasmid as a template, mutations were randomly introduced into various regions by error-prone PCR. The PCR reaction was carried out in a solution having the composition shown in Table 1 at 94 ° C. for 3 minutes, then at 30 cycles of 94 ° C. for 3 minutes, 50 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes, and finally for 10 minutes at 72 ° C. I went in.
【0026】[0026]
【表1】 TaqDNAポリメラーゼ(5U/μl) 0.5μl テンプレートDNA 1.0μl フォワードプライマーABF 4.0μl リバースプライマーABR 4.0μl 10× Taqポリメラーゼバッファー 10.0μl 1M β−メルカプトエタノール 1.0μl DMSO 10.0μl 5mM MnCl2 10.0μl 10mM dGTP 2.0μl 2mM dATP 2.0μl 10mM dCTP 2.0μl 10mM dTTP 2.0μlH2O 51.5μl 100.0μl 得られた変異水溶性PQQGDHのライブラリーを大腸
菌に形質転換し、形成された各コロニーをマイクロタイ
タープレートに移した。コロニーを別のプレートにレプ
リカし、片方のプレートにはグルコース濃度100mM
およびPMS−DCIPを加え、他方のプレートには1
00mMマルトースおよびPMS−DCIPを加え、双
方のPQQGDHの活性を目視で判定した。2枚のプレ
ートでグルコースの示す活性よりもマルトースに対する
活性が大幅に低下したクローンが多数得られた。Table 1 Taq DNA polymerase (5 U / μl) 0.5 μl template DNA 1.0 μl forward primer ABF 4.0 μl reverse primer ABR 4.0 μl 10 × Taq polymerase buffer 10.0 μl 1M β-mercaptoethanol 1.0 μl DMSO 10. 0μl 5mM MnCl 2 10.0μl 10mM dGTP 2.0μl 2mM dATP 2.0μl 10mM dCTP 2.0μl 10mM dTTP 2.0μl H 2 O 51.5μl 100.0μl resulting transformed the library of mutated soluble PQQGDH in E. coli Converted and each formed colony was transferred to a microtiter plate. Replicate the colony to another plate, and add glucose concentration of 100 mM to one plate.
And PMS-DCIP and add 1 to the other plate
00 mM maltose and PMS-DCIP were added, and the activity of both PQQGDH was determined visually. Many clones were obtained in which the activity on maltose was significantly lower than the activity exhibited by glucose on the two plates.
【0027】このうち1つのクローンを任意に選び、遺
伝子配列を解析したところ、167番目のアスパラギン
酸がグルタミン酸に変異していたことがわかった。One of the clones was arbitrarily selected and the gene sequence was analyzed. As a result, it was found that the aspartic acid at position 167 was mutated to glutamic acid.
【0028】実施例2 改変型PQQGDH遺伝子の構築 配列番号2に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来PQQGDHの構造遺伝子をもとに、配列: 5'-CC TGA CTG ATG GTG TTT TGA TGA AGG-3' (配列番
号:4) のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを合成し、
167番目のアスパラギン酸をグリシンに置換した。部
位特異的変異はプラスミドpGB2を用いて、図2に示
す方法により行った。Example 2 Construction of Modified PQQGDH Gene Based on the structural gene of PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus shown in SEQ ID NO: 2, the sequence: 5'-CC TGA CTG ATG GTG TTT TGA TGA AGG-3 '(SEQ ID NO: : 4) synthesizing the oligonucleotide target primer of
The aspartic acid at position 167 was replaced with glycine. The site-specific mutation was performed using the plasmid pGB2 according to the method shown in FIG.
【0029】ベクタープラスミドpKF18k(宝酒造
(株))にAcinetobacter calcoaceticus 由来PQQG
DHをコードする遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断
片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプ
レート50fmolと宝酒造(株)製Mutan(登録
商標)−Express Kmキットに付属のセレクシ
ョンプライマー5pmol、リン酸化したターゲットプ
ライマー50pmolを全体(20μl)の1/10量
の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、
100℃、3分間の熱処理でプラスミドを変性させ、1
本鎖にした。セレクションプライマーはpKF18kの
カナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を
復帰させるためのものである。これを5分間氷上に置
き、プライマーをアニーリングさせた。これに3μlの
同キットエクステンションバッファー、1μlのT4
DNAリガーゼ、1μlのT4 DNAポリメラーゼお
よび5μlの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。The vector plasmid pKF18k (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used for PQQG derived from Acinetobacter calcoaceticus.
A Kpn I-Hind III fragment containing a part of the gene encoding DH was incorporated and used as a template. 50 pmol of this template, 5 pmol of the selection primer attached to the Mutan (registered trademark) -Express Km kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. and 50 pmol of the phosphorylated target primer were mixed together with 1/10 of the total (20 μl) of the annealing buffer of the same kit. ,
The plasmid was denatured by heat treatment at 100 ° C for 3 minutes.
It became a main chain. The selection primer is for reversing the double amber mutation on the kanamycin resistance gene of pKF18k. This was placed on ice for 5 minutes to allow the primer to anneal. To this, 3 μl of the same kit extension buffer and 1 μl of T4
DNA ligase, 1 μl of T4 DNA polymerase and 5 μl of sterile water were added to synthesize a complementary strand.
【0030】これをDNAのミスマッチ修復能欠損株で
あるE.coli BMH71−18mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。This was transformed into E. coli BMH71-18mutS, which is a strain deficient in mismatch repair ability of DNA, and the plasmid was amplified by shaking culture overnight.
【0031】次に、ここから抽出したプラスミドをE.co
li MV1184に形質転換し、そのコロニーからプラ
スミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについて
シークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認し
た。この断片を、プラスミドpGB2上の野生型PQQ
GDHをコードする遺伝子のKpn I-Hind III断片と入れ
替え、改変型PQQGDHの遺伝子を構築した。Next, the plasmid extracted therefrom was placed in E.co.
liMV1184, and plasmids were extracted from the colonies. These plasmids were sequenced to confirm the introduction of the desired mutation. This fragment was cloned into wild-type PQQ on plasmid pGB2.
The KDH I-Hind III fragment of the gene encoding GDH was replaced to construct a modified PQQGDH gene.
【0032】同様にして、Asp167Ala、Asp167His、Asp1
67Lys、Asp167Asn、Asp167Gln、Asp167Val、Asp167Ty
r、Asp167Cys、Asp167Ser、Asp167Trpの各変異を有する
改変型PQQGDHの遺伝子を構築した。Similarly, Asp167Ala, Asp167His, Asp1
67Lys, Asp167Asn, Asp167Gln, Asp167Val, Asp167Ty
A modified PQQGDH gene having each mutation of r, Asp167Cys, Asp167Ser, and Asp167Trp was constructed.
【0033】実施例3 改変型PQQGDHの調製 野生型または改変型PQQGDHをコードする遺伝子
を、E.coli用の発現ベクターであるpTrc99
A(ファルマシア社)のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドをE.coli DH5α株に形
質転換した。これを450mlのL培地(アンピシリン
50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml
含有)で坂口フラスコを用いて37℃で一晩振とう培養
し、1mMCaCl2、500μMPQQを含む71の
L培地に植菌した。培養開始後約3時間でイソプロピル
チオガラクトシドを終濃度0.3mMになるように添加
し、その後1.5時間培養した。培養液から遠心分離
(5000×g、10分、4℃)で菌体を回収し、この菌体
を0.85%NaCl溶液で2回洗浄した。集菌した菌
体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離(10000×g、
15分、4℃)で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠
心分離(160500×g(40000r.p.m.)、90分、4℃)
し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以
下の実施例において用いた。Example 3 Preparation of Modified PQQGDH A gene encoding a wild-type or modified PQQGDH was pTrc99, an expression vector for E. coli
A (Pharmacia) was inserted into the multiple cloning site, and the constructed plasmid was transformed into E. coli DH5α strain. This was added to 450 ml of L medium (ampicillin 50 μg / ml, chloramphenicol 30 μg / ml).
Was shaken at 37 ° C. overnight using a Sakaguchi flask, and inoculated into 71 L medium containing 1 mM CaCl 2 and 500 μMPQQ. About 3 hours after the start of the culture, isopropylthiogalactoside was added to a final concentration of 0.3 mM, and then the cells were cultured for 1.5 hours. The cells were recovered from the culture by centrifugation (5000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), and the cells were washed twice with a 0.85% NaCl solution. The collected cells are crushed by a French press and centrifuged (10000 xg,
(15 minutes, 4 ° C.) to remove unbroken cells. Ultracentrifugation of the supernatant (160500 × g (40000 rpm), 90 minutes, 4 ° C.)
Thus, a water-soluble fraction was obtained. This was used in the following examples as a crude purified enzyme preparation.
【0034】さらに、こうして得た水溶性画分を10m
Mリン酸緩衝液pH7.0で一晩透析した。透析したサ
ンプルを10mMリン酸緩衝液pH7.0で平衡化した
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムTSKg
el CM−TOYOPEARL 650M(東ソー株
式会社)に吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩
衝液pH7.0、750mlで洗浄した後、0−0.2
M NaClを含む10mMリン酸緩衝液pH7.0を
用い、酵素を溶出させた。流速は5ml/minで行っ
た。GDH活性を有する画分を回収し、10mM MO
PS−NaOH緩衝液(pH7.0)で一晩透析した。
このようにして電気泳動的に均一な改変型PQQGDH
蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例
において用いた。Further, the water-soluble fraction thus obtained was
Dialyzed overnight against M phosphate buffer pH 7.0. TSKg packed column for cation exchange chromatography in which the dialyzed sample was equilibrated with 10 mM phosphate buffer pH 7.0.
el CM-TOYOPEARL 650M (Tosoh Corporation). The column was washed with 750 ml of 10 mM phosphate buffer pH 7.0, and then washed with 0-0.2
The enzyme was eluted using 10 mM phosphate buffer pH 7.0 containing M NaCl. The flow rate was 5 ml / min. The fraction having GDH activity was collected and 10 mM MO
It was dialyzed overnight against a PS-NaOH buffer (pH 7.0).
The electrophoretically uniform modified PQQGDH thus obtained
The protein was obtained. This was used as a purified enzyme preparation in the following Examples.
【0035】実施例4 酵素活性の測定 酵素活性の測定は、室温において、10mM MOPS
−NaOH緩衝液(pH7.0)中においてPMS(フ
ェナジンメトサルフェート)−DCIP(2,6−ジク
ロロフェノールインドフェノール)を用い、DCIPの
600nmの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、
その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このと
き、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活
性を1ユニットとした。また、DCIPのpH7.0に
おけるモル吸光係数は16.3mM-1とした。Example 4 Measurement of Enzyme Activity Enzyme activity was measured at room temperature with 10 mM MOPS.
Using PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol) in a NaOH buffer (pH 7.0), and tracking the change in the absorbance of DCIP at 600 nm using a spectrophotometer;
The rate of decrease in the absorbance was defined as the reaction rate of the enzyme. At this time, the enzyme activity for reducing 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 unit. The molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM −1 .
【0036】実施例5 グルコースに対する選択性の評価 各改変型PQQGDHの粗精製酵素標品について基質特
異性を調べた。実施例3で得られた野生型および各改変
型PQQGDHの粗精製酵素標品をそれぞれ1μMPQ
Q、1mM CaCl2存在下で1時間以上ホロ化し
た。これを187μlずつ分注し、3μlの活性試薬
(6mM DCIP,600mM PMS,10mMリ
ン酸緩衝液pH7.0を含む)および基質を加えた。基
質として、それぞれ終濃度100mMとなるように40
0mMのグルコース、ラクトースおよびマルトースを1
0μl加え、室温で30分間インキュベートして、実施
例4と同様に酵素活性を測定した。値はグルコースを基
質としたときの活性を100とし、これれに対する相対
活性で表した。表2に示されるように、本発明の改変型
PQQGDHはいずれもラクトースまたはマルトースと
比較してグルコースに対する高い選択性を示した。Example 5 Evaluation of Selectivity for Glucose Substrate specificity of each crude purified enzyme preparation of modified PQQGDH was examined. The crude enzyme preparations of the wild type and each of the modified PQQGDH obtained in Example 3 were each 1 μMPQ
Q, holiation was performed for 1 hour or more in the presence of 1 mM CaCl 2 . This was dispensed in 187 μl portions, and 3 μl of the active reagent (containing 6 mM DCIP, 600 mM PMS, 10 mM phosphate buffer pH 7.0) and the substrate were added. As a substrate, adjust the final concentration to 100 mM.
0 mM glucose, lactose and maltose in 1
0 μl was added, the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes, and the enzyme activity was measured as in Example 4. The value was expressed as a relative activity with respect to the activity when glucose was used as a substrate, which was defined as 100. As shown in Table 2, all of the modified PQQGDHs of the present invention showed higher selectivity for glucose than lactose or maltose.
【0037】[0037]
【表2】 グルコース ラクトース マルトース 野生型 100% 54% 58% Asp167Gly 100% 21% 0% Asp167His 100% 86% 0% Asp167Tyr 100% 57% 17% Asp167Ala 100% 68% 13% Asp167Glu 100% 32% 10% Asp167Lys 100% 54% 16% Asp167Asn 100% 62% 14% Asp167Gln 100% 59% 53% Asp167Val 100% 4% 36% Asp167Cys 100% 57% 22% Asp167Ser 100% 66% 15% Asp167Trp 100% 61% 15% 実施例6 精製酵素標品のグルコースに対する親和性の評価 実施例3で得られた野生型PQQGDHおよびAsp167Gl
u改変型PQQGDHの粗精製酵素標品を用いて、実施
例5と同様にそれぞれ1μMPQQ、1mMCaCl2
存在下で1時間以上ホロ化した。これを187μlずつ
分注し、3μlの活性試薬(6mMDCIP48μl,
600mMPMS 8μl,10mMリン酸緩衝液pH
7.0 16μl)および各濃度のD−グルコース溶液
10μlを加え、実施例4に示す方法により室温で酵素
活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、
KmおよびVmaxを求めた。野生型PQQGDHのグ
ルコースに対するKm値は約25mMであった。これに
対し、Asp167Glu改変型PQQGDHのKm値は約55
mMであった。また、野生型PQQGDHの活性を10
0%としたときのAsp167Gluの比活性は90%以上であ
った。[Table 2] Glucose lactose maltose wild type 100% 54% 58% Asp167Gly 100% 21% 0% Asp167His 100% 86% 0% Asp167Tyr 100% 57% 17% Asp167Ala 100% 68% 13% Asp167Glu 100% 32% 10% Asp167Lys 100% 54% 16% Asp167Asn 100% 62% 14% Asp167Gln 100% 59% 53% Asp167Val 100% 4% 36% Asp167Cys 100% 57% 22% Asp167Ser 100% 66% 15% Asp167Trp 100% 61% 15% Implementation Example 6 Evaluation of affinity of purified enzyme preparation for glucose Wild-type PQQGDH and Asp167Gl obtained in Example 3
u Using a crude enzyme preparation of modified PQQGDH, 1 μMPQQ, 1 mM CaCl 2
Hollowed for over 1 hour in the presence. This was dispensed in 187 μl portions, and 3 μl of the active reagent (48 μl of 6 mM DCIP,
8 μl of 600 mM PMS, 10 mM phosphate buffer pH
7.0 16 μl) and 10 μl of each concentration of D-glucose solution were added, and the enzyme activity was measured at room temperature by the method described in Example 4. From a plot of substrate concentration versus enzyme activity,
Km and Vmax were determined. The Km value for glucose of wild-type PQQGDH was about 25 mM. In contrast, the Km value of Asp167Glu modified PQQGDH is about 55
mM. The activity of wild-type PQQGDH was 10
The specific activity of Asp167Glu at 0% was 90% or more.
【0038】実施例7 グルコースのアッセイ 改変型PQQGDHを用いてグルコースをアッセイし
た。Asp167Glu改変型PQQGDHを、1μMPQQ、
1mM CaCl2存在下で1時間以上ホロ化し、各種
濃度のグルコースおよび5μMPQQ、10mM Ca
Cl2存在下で酵素活性を測定した。方法は実施例4に
記載の酵素活性の測定法に準じ、DCIPの600nm
の吸光度の変化を指標とした。図3に示されるように、
Asp167Glu改変型PQQGDHを用いて、1−500m
Mの範囲でグルコースの定量を行うことができた。Example 7 Glucose Assay Glucose was assayed using the modified PQQGDH. Asp167Glu modified PQQGDH, 1 μMPQQ,
In the presence of 1 mM CaCl 2, holation was performed for 1 hour or more, and glucose at various concentrations and 5 μMPQQ, 10 mM Ca
Cl Enzyme activity was measured 2 presence. The method was based on the method for measuring the enzyme activity described in Example 4, and the DCIP was measured at 600 nm.
The change in absorbance was used as an index. As shown in FIG.
Using Asp167Glu modified PQQGDH, 1-500 m
Glucose could be quantified in the M range.
【0039】実施例8 酵素センサーの作製および評価 5ユニットのAsp167Glu改変型PQQGDHにカーボン
ペースト20mgを加えて凍結乾燥させた。これをよく
混合した後、既にカーボンペーストが約40mg充填さ
れたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上
で研磨した。この電極を1%のグルタルアルデヒドを含
む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で
30分間処理した後、20mMリジンを含む10mM
MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で20分間処理
してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極
を10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で
1時間以上平衡化させた。電極は4℃で保存した。Example 8 Preparation and Evaluation of Enzyme Sensor 20 mg of carbon paste was added to 5 units of Asp167Glu modified PQQGDH, followed by freeze-drying. After this was mixed well, only the surface of the carbon paste electrode already filled with about 40 mg of carbon paste was filled and polished on filter paper. This electrode was treated in a 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 1% glutaraldehyde at room temperature for 30 minutes, and then treated with a 10 mM MOPS buffer containing 20 mM lysine.
Glutaraldehyde was blocked by treatment in MOPS buffer (pH 7.0) at room temperature for 20 minutes. The electrode was equilibrated in a 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) at room temperature for 1 hour or more. The electrodes were stored at 4 ° C.
【0040】作製した酵素センサーを用いてグルコース
濃度の測定を行った。図4に示されるように、本発明の
改変型PQQGDHを固定化した酵素センサーを用い
て、5mM−100mMの範囲でグルコースの定量を行
うことができる。The glucose concentration was measured using the produced enzyme sensor. As shown in FIG. 4, glucose can be quantified in the range of 5 mM to 100 mM using the enzyme sensor on which the modified PQQGDH of the present invention is immobilized.
【0041】[0041]
【発明の効果】改変型PQQGDHはグルコースに対す
る選択性が高いことから、本酵素を用いてアッセイキッ
トあるいは酵素センサーを作成すると、従来の天然型の
PQQGDHを用いた場合に比べ、より高い選択性を得
ることができる。The modified PQQGDH has high selectivity for glucose. Therefore, when an assay kit or an enzyme sensor is prepared using this enzyme, a higher selectivity is obtained as compared with the case where conventional natural PQQGDH is used. Obtainable.
【0042】[0042]
【配列表】 Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> 001224 <160> 4 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 4 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 3 Ser Gln His Xaa Lys Ser Ser 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 4 cctgactgat ggtgttttga tgaagg[Sequence Listing] Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> 001224 <160> 4 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys LeuAsp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus < 400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtac a tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc g tattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 4 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 3 Ser Gln His Xaa Lys Ser Ser 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 4 cctgactgat ggtgttttga tgaagg
【図1】 図1は、本発明において用いたプラスミドp
GB2の構造を示す。FIG. 1 shows the plasmid p used in the present invention.
1 shows the structure of GB2.
【図2】 図2は、本発明の改変型PQQGDHをコー
ドする突然変異遺伝子を作成する方法を示す。FIG. 2 shows a method for preparing a mutant gene encoding the modified PQQGDH of the present invention.
【図3】 図3は、本発明の改変型PQQGDHのsv
プロットを示す。FIG. 3 shows sv of the modified PQQGDH of the present invention.
Show the plot.
【図4】 図4は、本発明の改変型PQQGDHを用い
るグルコースのアッセイを示す。FIG. 4 shows an assay for glucose using the modified PQQGDH of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 9/04 C12Q 1/32 C12Q 1/00 1/54 1/32 G01N 33/66 C 1/54 (C12N 1/21 G01N 33/66 C12R 1:01) //(C12N 1/21 (C12N 9/04 C12R 1:01) C12R 1:01) (C12N 9/04 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:01) 5/00 A Fターム(参考) 2G045 AA13 BB20 BB60 CA25 CA26 DA31 FA26 FA29 FB01 FB04 FB06 FB11 GC10 GC12 GC20 4B024 AA11 BA08 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ68 QR04 QR82 QS02 QS28 QS36 QS39 QX01 QX05 4B065 AA04Y AA26X AC14 BA02 CA28 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 9/04 C12Q 1/32 C12Q 1/00 1/54 1/32 G01N 33/66 C 1/54 ( C12N 1/21 G01N 33/66 C12R 1:01) // (C12N 1/21 (C12N 9/04 C12R 1:01) C12R 1:01) (C12N 9/04 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:01) 5/00 A F-term (reference) 2G045 AA13 BB20 BB60 CA25 CA26 DA31 FA26 FA29 FB01 FB04 FB06 FB11 GC10 GC12 GC20 4B024 AA11 BA08 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ68 QR04 QR82 QS02 QS28 QS36 QS39 QX01 QX05 4B065 AA04Y AA26X AC14 BA02 CA28 CA46
Claims (13)
性PQQGDHの167番目のアスパラギン酸残基に相
当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されてい
るPQQGDH。1. PQQGDH wherein the amino acid residue corresponding to the aspartic acid residue at position 167 of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus is substituted with another amino acid residue.
67番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置
換されているPQQGDH。2. An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
PQQGDH in which the aspartic acid residue at position 67 has been substituted with another amino acid residue.
ある、請求項1または2に記載のPQQGDH。3. The PQQGDH according to claim 1, wherein the other amino acid residue is glutamic acid.
中、XaaはAsp以外の任意の天然アミノ酸残基である)を
含む、PQQGDH。4. A PQQGDH comprising the sequence: Ser Gln His Xaa Lys Ser Ser, wherein Xaa is any natural amino acid residue other than Asp.
GDH。5. The PQQ of claim 3, wherein Xaa is Glu.
GDH.
ースに対する高い選択性を有する、請求項1−5のいず
れかに記載のPQQGDH。6. The PQQGDH according to claim 1, which has a higher selectivity for glucose compared to wild-type PQQGDH.
GDHをコードする遺伝子。7. The PQQ according to claim 1, wherein:
Gene encoding GDH.
ー。8. A vector containing the gene according to claim 7.
体。9. A transformant containing the gene according to claim 7.
組み込まれている、請求項12記載の形質転換体。10. The transformant according to claim 12, wherein the gene according to claim 7 is integrated into a main chromosome.
し、菌体から水溶性画分を調製することを含む、水溶性
PQQGDHの製造方法。11. A method for producing water-soluble PQQGDH, comprising culturing the transformant according to claim 9, and preparing a water-soluble fraction from the cells.
QGDHを含むグルコースアッセイキット。12. The PQ according to claim 1,
A glucose assay kit containing QGDH.
QGDHを含むグルコースセンサー。13. The PQ according to claim 1,
Glucose sensor containing QGDH.
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